TY - THES A1 - Stanke, Sandra T1 - AC electrokinetic immobilization of influenza viruses and antibodies on nanoelectrode arrays for on-chip immunoassays T1 - AC elektrokinetische Immobilisierung von Influenzaviren und Antikörpern auf Nanoelektrodenarrays für on-Chip Immunoassays N2 - In the present thesis, AC electrokinetic forces, like dielectrophoresis and AC electroosmosis, were demonstrated as a simple and fast method to functionalize the surface of nanoelectrodes with submicrometer sized biological objects. These nanoelectrodes have a cylindrical shape with a diameter of 500 nm arranged in an array of 6256 electrodes. Due to its medical relevance influenza virus as well as anti-influenza antibodies were chosen as a model organism. Common methods to bring antibodies or proteins to biosensor surfaces are complex and time-consuming. In the present work, it was demonstrated that by applying AC electric fields influenza viruses and antibodies can be immobilized onto the nanoelectrodes within seconds without any prior chemical modification of neither the surface nor the immobilized biological object. The distribution of these immobilized objects is not uniform over the entire array, it exhibits a decreasing gradient from the outer row to the inner ones. Different causes for this gradient have been discussed, such as the vortex-shaped fluid motion above the nanoelectrodes generated by, among others, electrothermal fluid flow. It was demonstrated that parts of the accumulated material are permanently immobilized to the electrodes. This is a unique characteristic of the presented system since in the literature the AC electrokinetic immobilization is almost entirely presented as a method just for temporary immobilization. The spatial distribution of the immobilized viral material or the anti-influenza antibodies at the electrodes was observed by either the combination of fluorescence microscopy and deconvolution or by super-resolution microscopy (STED). On-chip immunoassays were performed to examine the suitability of the functionalized electrodes as a potential affinity-based biosensor. Two approaches were pursued: A) the influenza virus as the bio-receptor or B) the influenza virus as the analyte. Different sources of error were eliminated by ELISA and passivation experiments. Hence, the activity of the immobilized object was inspected by incubation with the analyte. This resulted in the successful detection of anti-influenza antibodies by the immobilized viral material. On the other hand, a detection of influenza virus particles by the immobilized anti-influenza antibodies was not possible. The latter might be due to lost activity or wrong orientation of the antibodies. Thus, further examinations on the activity of by AC electric fields immobilized antibodies should follow. When combined with microfluidics and an electrical read-out system, the functionalized chips possess the potential to serve as a rapid, portable, and cost-effective point-of-care (POC) device. This device can be utilized as a basis for diverse applications in diagnosing and treating influenza, as well as various other pathogens. N2 - In der vorliegenden Arbeit wurden AC elektrokinetische Kräfte, wie die Dielektrophorese und die AC Elektroosmose, als einfache und schnelle Methode zur Funktionalisierung der Oberfläche von Nanoelektroden mit biologischen Objekten in Submikrometergröße demonstriert. Diese Nanoelektroden haben eine zylindrische Form mit einem Durchmesser von 500 nm und sind in einem Array aus 6256 Elektroden angeordnet. Aufgrund ihrer medizinischen Relevanz wurden Influenzaviren sowie anti-Influenza Antikörper als Modellorganismus ausgewählt. Gängige Methoden, um Antikörper oder Proteine auf Biosensoroberflächen zu bringen, sind komplex und zeitaufwändig. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass durch die Anwendung elektrischer Wechselfelder Influenzaviren und Antikörper innerhalb von Sekunden auf den Nanoelektroden immobilisiert werden können, ohne dass zuvor eine chemische Modifikation der Oberfläche noch des immobilisierten biologischen Objekts erforderlich ist. Die Verteilung dieser immobilisierten Objekte ist über das gesamte Array ungleichmäßig. Es kommt zur Ausbildung eines Gradienten, welcher von der äußeren zur den inneren Reihen hin abnimmt. Verschiedene Ursachen für diesen Gradienten wurden diskutiert, beispielsweise der Vortex-förmige Flüssigkeitsstrom über den Nanoelektroden, der unter anderem durch elektrothermische Flüssigkeitsbewegung erzeugt wird. Es wurde gezeigt, dass Teile des akkumulierten Materials dauerhaft an den Elektroden immobilisiert sind. Dies ist ein Alleinstellungsmerkmal des vorgestellten Systems, da in der Literatur die AC elektrokinetische Immobilisierung fast ausschließlich als Methode nur zur temporären Immobilisierung dargestellt wird. Die räumliche Verteilung des immobilisierten Virusmaterials bzw. der anti-Influenza Antikörper an den Elektroden wurde entweder durch die Kombination aus Fluoreszenzmikroskopie und Dekonvolution oder durch super-resolution Mikroskopie (STED) betrachtet. Es wurden On-Chip-Immunoassays durchgeführt, um die Eignung der funktionalisierten Elektroden für einen potenziellen affinitätsbasierten Biosensor zu untersuchen. Dabei wurden zwei Ansätze verfolgt: A) Influenzaviren als Biorezeptor oder B) Influenzavirus als Analyt. Verschiedene Fehlerquellen wurden mittels ELISA und Passivierungsexperimente eliminiert. Infolgedessen wurde die Aktivität der immobilisierten Objekte durch Inkubation mit dem Analyten überprüft. Dies führte zum erfolgreichen Nachweis von anti-Influenza Antikörpern mittels immobilisiertem Virusmaterial. Andererseits war ein Nachweis von Influenzaviruspartikeln durch die immobilisierten anti-Influenza Antikörper nicht möglich. Letzteres könnte auf einen Aktivitätsverlust oder eine falsche Ausrichtung der Antikörper zurückzuführen sein. Daher sollten weitere Untersuchungen zur Aktivität von durch elektrische Wechselfelder immobilisierte Antikörper folgen. In Kombination mit Mikrofluidik und einem elektrischen Auslesesystem besitzen die funktionalisierten Chips das Potenzial, als schnelle, tragbare und kostengünstige Point-of-Care-Einheit (POC) zu dienen. Dieses Einheit kann als Grundlage für vielfältige Anwendungen bei der Diagnose und Behandlung von Influenza und verschiedenen anderen Krankheitserregern genutzt werden. KW - AC electrokinetics KW - AC Elektrokinetik KW - AC electroosmosis KW - AC Elektroosmosis KW - dielectrophoresis KW - Dielektrophorese KW - virus KW - Virus KW - influenza KW - Influenza KW - antibody KW - Antikörper KW - nanoelectrodes KW - Nanoelektroden KW - lab-on-chip KW - lab-on-chip KW - LOC KW - LOC KW - point-of-care KW - point-of-care KW - POC KW - POC KW - immunoassay KW - Immunoassay Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-617165 ER - TY - THES A1 - Rolo, David T1 - Assembly of photosystem I in thylakoid membranes T1 - Die Assemblierung des Photosystems I in der Thylakoidmembran N2 - The light reactions of photosynthesis are carried out by a series of multiprotein complexes embedded in thylakoid membranes. Among them, photosystem I (PSI), acting as plastocyanin-ferderoxin oxidoreductase, catalyzes the final reaction. Together with light-harvesting antenna I, PSI forms a high-molecular-weight supercomplex of ~600 kDa, consisting of eighteen subunits and nearly two hundred co-factors. Assembly of the various components into a functional thylakoid membrane complex requires precise coordination, which is provided by the assembly machinery. Although this includes a small number of proteins (PSI assembly factors) that have been shown to play a role in the formation of PSI, the process as a whole, as well as the intricacy of its members, remains largely unexplored. In the present work, two approaches were used to find candidate PSI assembly factors. First, EnsembleNet was used to select proteins thought to be functionally related to known PSI assembly factors in Arabidopsis thaliana (approach I), and second, co-immunoprecipitation (Co-IP) of tagged PSI assembly factors in Nicotiana tabacum was performed (approach II). Here, the novel PSI assembly factors designated CO-EXPRESSED WITH PSI ASSEMBLY 1 (CEPA1) and Ycf4-INTERACTING PROTEIN 1 (Y4IP1) were identified. A. thaliana null mutants for CEPA1 and Y4IP1 showed a growth phenotype and pale leaves compared with the wild type. Biophysical experiments using pulse amplitude modulation (PAM) revealed insufficient electron transport on the PSII acceptor side. Biochemical analyses revealed that both CEPA1 and Y4IP1 are specifically involved in PSI accumulation in A. thaliana at the post-translational level but are not essential. Consistent with their roles as factors in the assembly of a thylakoid membrane protein complex, the two proteins localize to thylakoid membranes. Remarkably, cepa1 y4ip1 double mutants exhibited lethal phenotypes in early developmental stages under photoautotrophic growth. Finally, co-IP and native gel experiments supported a possible role for CEPA1 and Y4IP1 in mediating PSI assembly in conjunction with other PSI assembly factors (e.g., PPD1- and PSA3-CEPA1 and Ycf4-Y4IP1). The fact that CEPA1 and Y4IP1 are found exclusively in green algae and higher plants suggests eukaryote-specific functions. Although the specific mechanisms need further investigation, CEPA1 and Y4IP1 are two novel assembly factors that contribute to PSI formation. N2 - Die Lichtreaktionen der Photosynthese werden von einer Reihe von Multiproteinkomplexen durchgeführt, die in Thylakoidmembranen eingebettet sind. Hier katalysiert das Photosystem I (PSI), das als Plastocyanin-Ferderoxin-Oxidoreduktase fungiert, die letzte Reaktion. Zusammen mit der lichtsammelnden Antenne I bildet PSI einen hochmolekularen Superkomplex von etwa 600 kDa, der aus achtzehn Untereinheiten und fast zweihundert Co-Faktoren besteht. Der Zusammenbau der verschiedenen Komponenten zu einem funktionsfähigen Thylakoidmembrankomplex erfordert eine präzise Koordination, die durch den Assemblierungsapparat gewährleistet wird. Obwohl dieser eine kleine Anzahl von Proteinen (PSI-Assemblierungsfaktoren) umfasst, die nachweislich eine Rolle bei der Bildung des PSI spielen, ist der Prozess als Ganzes sowie die Komplexität seiner Mitglieder noch weitgehend unerforscht. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei Ansätze verwendet, um Kandidaten für PSI-Assemblierungsfaktoren zu finden. Erstens wurde EnsembleNet verwendet, um Proteine auszuwählen, von denen angenommen wird, dass sie funktionell mit bekannten PSI-Assemblierungsfaktoren in Arabidopsis thaliana verwandt sind (Ansatz I), und zweitens wurde eine Co-Immunopräzipitation (Co-IP) von markierten PSI-Assemblierungsfaktoren in Nicotiana tabacum durchgeführt (Ansatz II). Dabei wurden die neuartigen PSI-Assemblierungsfaktoren mit der Bezeichnung CO-EXPRESSED WITH PSI ASSEMBLY 1 (CEPA1) und Ycf4-INTERACTING PROTEIN 1 (Y4IP1) identifiziert. A. thaliana Nullmutanten für CEPA1 und Y4IP1 zeigten einen Wachstumsphänotyp und blasse Blätter im Vergleich zum Wildtyp. Biophysikalische Experimente unter Verwendung der Pulsamplitudenmodulation (PAM) zeigten einen unzureichenden Elektronentransport auf der PSII-Akzeptorseite. Biochemische Analysen ergaben, dass sowohl CEPA1 als auch Y4IP1 spezifisch an der PSI-Akkumulation in A. thaliana auf posttranslationaler Ebene beteiligt, jedoch nicht essentiell sind. Entsprechend ihrer Rolle als Faktoren für den Aufbau eines Thylakoidmembran-Proteinkomplexes sind die beiden Proteine an Thylakoidmembranen lokalisiert. Bemerkenswerterweise wiesen cepa1 y4ip1-Doppelmutanten in frühen Entwicklungsstadien unter photoautotrophem Wachstum tödliche Phänotypen auf. Schließlich untermauerten Co-IP- und native Gelexperimente eine mögliche Rolle von CEPA1 und Y4IP1 bei der Vermittlung des PSI-Aufbaus in Verbindung mit anderen PSI-Aufbaufaktoren (z. B. PPD1- und PSA3-CEPA1, und Ycf4-Y4IP1). Die Tatsache, dass CEPA1 und Y4IP1 ausschließlich in Grünalgen und höheren Pflanzen vorkommen, lässt auf eukaryontenspezifische Funktionen schließen. Obwohl die spezifischen Mechanismen noch weiter untersucht werden müssen, sind CEPA1 und Y4IP1 zwei neuartige Assemblierungsfaktoren, die zur PSI-Bildung beitragen. KW - photosynthesis KW - photosystem I KW - biogenesis KW - thylakoid membranes KW - assembly factor KW - Photosynthese KW - Photosystem I KW - Biogenese KW - Thylakoidmembran KW - Assemblierungsfaktor Y1 - 2023 ER - TY - THES A1 - Oey, Melanie T1 - Chloroplasts as bioreactors : high-yield production of active bacteriolytic protein antibiotics T1 - Chloroplasten als Bioreaktoren : hocheffiziente Produktion von aktiven, bakteriolytischen Proteinantibiotika N2 - Plants, more precisely their chloroplasts with their bacterial-like expression machinery inherited from their cyanobacterial ancestors, can potentially offer a cheap expression system for proteinaceous pharmaceuticals. This system would be easily scalable and provides appropriate safety due to chloroplasts maternal inheritance. In this work, it was shown that three phage lytic enzymes (Pal, Cpl-1 and PlyGBS) could be successfully expressed at very high levels and with high stability in tobacco chloroplasts. PlyGBS expression reached an amount of foreign protein accumulation (> 70% TSP) that has never been obtained before. Although the high expression levels of PlyGBS caused a pale green phenotype with retarded growth, presumably due to exhaustion of plastid protein synthesis capacity, development and seed production were not impaired under greenhouse conditions. Since Pal and Cpl-1 showed toxic effects when expressed in E. coli, a special plastid transformation vector (pTox) was constructed to allow DNA amplification in bacteria. The construction of the pTox transformation vector allowing a recombinase-mediated deletion of an E. coli transcription block in the chloroplast, leading to an increase of foreign protein accumulation to up to 40% of TSP for Pal and 20% of TSP for Cpl-1. High dose-dependent bactericidal efficiency was shown for all three plant-derived lytic enzymes using their pathogenic target bacteria S. pyogenes and S. pneumoniae. Confirmation of specificity was obtained for the endotoxic proteins Pal and Cpl-1 by application to E. coli cultures. These results establish tobacco chloroplasts as a new cost-efficient and convenient production platform for phage lytic enzymes and address the greatest obstacle for clinical application. The present study is the first report of lysin production in a non-bacterial system. The properties of chloroplast-produced lysins described in this work, their stability, high accumulation rate and biological activity make them highly attractive candidates for future antibiotics. N2 - Lytische Enzyme aus Bakteriophagen bieten Eigenschaften, die sie zu vielversprechenden Medikamenten im Einsatz gegen bakterielle Krankheiten machen. Obwohl sie speziell beim Einsatz gegen bakterielle Infektionen, welche durch Antibiotika resistente Erreger hervorgerufen werden, eine maßgebende Rolle spielen könnten, waren bisher die hohen Produktionskosten ein Hindernis für die medizinische Anwendung. Ein kostengünstiges und einfach zu handhabendes System, wie beispielsweise Chloroplasten in Pflanzen, würde diese lytischen Enzyme zu einer effizienten Alternative zu herkömmlichen Antibiotika machen. In dieser Arbeit wird erstmals die erfolgreiche Produktion von lytischen Enzymen in Tabak-Chloroplasten vorgestellt, welche mit einem Fremdproteingehalt von mehr als 70% des gesamtlöslichen Proteins der Pflanze eine Menge beschreibt, die bisher mit diesem Verfahren noch nicht erreicht wurde. Alle in Chloroplasten hergestellten lytischen Enzyme zeigten hohe spezifische bakteriolytische Aktivität gegen die gewählten Humanpathogene und waren innerhalb von Minuten in der Lage diese Bakterien abzutöten. Zur Herstellung von zwei lytischen Enzymen wurde in dieser Arbeit ein spezieller Shuttle-Vektor entworfen, der die Expression von toxischen Genen innerhalb von E. coli Zellen im Zuge der DNA Replikation vermeidet, jedoch die Herstellung einer ungehinderten Expression der toxischen Gene in den Chloroplasten nach Beseitigung des Selektionsmarkers erlaubte. Ein Vergleich zwischen einem herkömmlich verwendeten Transformationsvektor und dem Shuttle-Vektor mittels eines Reportergens zeigte, dass das neu entwickelte System bis zu 4 mal mehr Protein produzierte. Diese Ergebnisse zeigen das Potential von Chloroplasten als kostengünstige und leicht zu handhabende Produktionsplattform für lytische Enzyme, welche als neue Generation von Antibiotika attraktive Alternativen zu herkömmlichen Therapien bieten. KW - Phagenlysine KW - Chloroplastentransformation KW - Antibiotikaersatz KW - Antibiotikaresistenz KW - Phage lysins KW - Chloroplast transformation KW - Antibiotic alternatives KW - Antibiotic resistance Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-28950 ER - TY - THES A1 - Hoffmann, Toni T1 - Cloning and characterisation of the HMA3 gene and its promoter from Arabidopsis halleri (L.) O'Kane and Al'Shehbaz and Arabidopsis thaliana (L.) Heynhold T1 - Klonierung und Charakterisierung des HMA3 Genes und seines Promotors aus Arabidopsis halleri (L.) O'Kane und Al'Shehbaz und Arabidopsis thaliana (L.) Heynhold N2 - Being living systems unable to adjust their location to changing environmental conditions, plants display homeostatic networks that have evolved to maintain transition metal levels in a very narrow concentration range in order to avoid either deficiency or toxicity. Hence, plants possess a broad repertoire of mechanisms for the cellular uptake, compartmentation and efflux, as well as for the chelation of transition metal ions. A small number of plants are hypertolerant to one or a few specific transition metals. Some metal tolerant plants are also able to hyperaccumulate metal ions. The Brassicaceae family member Arabidopis halleri ssp. halleri (L.) O´KANE and AL´SHEHBAZ is a hyperaccumulator of zinc (Zn), and it is closely related to the non-hypertolerant and non-hyperaccumulating model plant Arabidopsis thaliana (L.) HEYNHOLD. The close relationship renders A. halleri a promising emerging model plant for the comparative investigation of the molecular mechanisms behind hypertolerance and hyperaccumulation. Among several potential candidate genes that are probably involved in mediating the zinc-hypertolerant and zinc-hyperaccumulating trait is AhHMA3. The AhHMA3 gene is highly similar to AtHMA3 (AGI number: At4g30120) in A. thaliana, and its encoded protein belongs to the P-type IB ATPase family of integral membrane transporter proteins that transport transition metals. In contrast to the low AtHMA3 transcript levels in A. thaliana, the gene was found to be constitutively highly expressed across different Zn treatments in A. halleri, especially in shoots. In this study, the cloning and characterisation of the HMA3 gene and its promoter from Arabidopsis halleri (L.) O´KANE and AL´SHEHBAZ and Arabidopsis thaliana (L.) HEYNHOLD is described. Heterologously expressed AhHMA3 mediated enhanced tolerance to Zn and to a much lesser degree to cadmium (Cd) but not to cobalt (Co) in metal-sensitive mutant strains of budding yeast. It is demonstrated that the genome of A. halleri contains at least four copies of AhHMA3, AhHMA3-1 to AhHMA3-4. A copy-specific real-time RT-PCR indicated that an AhHMA3-1 related gene copy is the source of the constitutively high transcript level in A. halleri and not a gene copy similar to AhHMA3-2 or AhHMA3-4. In accordance with the enhanced AtHMA3mRNA transcript level in A. thaliana roots, an AtHMA3 promoter-GUS gene construct mediated GUS activity predominantly in the vascular tissues of roots and not in shoots. However, the observed AhHMA3-1 and AhHMA3-2 promoter-mediated GUS activity in A. thaliana or A. halleri plants did not reflect the constitutively high expression of AhHMA3 in shoots of A. halleri. It is suggested that other factors e. g. characteristic sequence inserts within the first intron of AhHMA3-1 might enable a constitutively high expression. Moreover, the unknown promoter of the AhHMA3-3 gene copy could be the source of the constitutively high AhHMA3 transcript levels in A. halleri. In that case, the AhHMA3-3 sequence is predicted to be highly homologous to AhHMA3-1. The lack of solid localisation data for the AhHMA3 protein prevents a clear functional assignment. The provided data suggest several possible functions of the AhHMA3 protein: Like AtHMA2 and AtHMA4 it might be localised to the plasma membrane and could contribute to the efficient translocation of Zn from root to shoot and/or to the cell-to-cell distribution of Zn in the shoot. If localised to the vacuolar membrane, then a role in maintaining a low cytoplasmic zinc concentration by vacuolar zinc sequestration is possible. In addition, AhHMA3 might be involved in the delivery of zinc ions to trichomes and mesophyll leaf cells that are major zinc storage sites in A. halleri. N2 - Pflanzen sind lebende Systeme, die nicht in der Lage sind ihren Standort sich ändernden Umweltbedingungen anzupassen. Infolgedessen weisen Pflanzen homöostatischeNetzwerke auf, welche die Mengen an intrazellulären Übergangsmetallen in einem sehr engen Konzentrationsbereich kontrollieren um somit Vergiftungs- oder Mangelerscheinungen zu vermeiden. Eine kleine Anzahl von Pflanzen ist hypertolerant gegenüber einem oder mehreren Übergangsmetallen. Einige wenige dieser metalltoleranten Pflanzen sind fähig Übergangsmetalle in beträchtlichen Mengen zu speichern, sprich zu hyperakkumulieren, ohne Vergiftungserscheinungen zu zeigen. Die Haller’sche Schaumkresse (Arabidopis halleri ssp. halleri (L.) O´KANE und AL´SHEHBAZ) aus der Familie der Kreuzblütler (Brassicaceae) ist ein solcher Hyperakkumulator für Zink (Zn). Sie ist nah verwandt mit der Modellpflanze Ackerschmalwand (Arabidopsis thaliana (L.) HEYNHOLD), die jedoch nicht-hypertolerant und nicht-hyperakkumulierend für Übergangsmetalle ist. Diese nahe Verwandtschaft erlaubt vergleichende Studien der molekularen Mechanismen, die Hypertoleranz und Hyperakkumulation zu Grunde liegen. Zu der Gruppe von Kandidatengenen, die möglicherweise von Bedeutung für die Zink-hypertoleranten und -hyperakkumulierenden Eigenschaften von A. halleri sind, gehört AhHMA3, ein Gen mit großer Ähnlichkeit zu AtHMA3 (AGI Nummer: At4g30120) aus A. thaliana. Es kodiert ein Protein aus der Familie transmembraner Übergangsmetall-Transportproteine, den P-typ IB ATPasen. Im Gegensatz zu den niedrigen AtHMA3 Transkriptmengen in A. thaliana wird das AhHMA3 Gen in A. halleri in Gegenwart verschiedener Zn Konzentrationen konstitutiv hoch exprimiert, insbesondere im Spross der Pflanze. Diese Arbeit beschreibt die Klonierung und Charakterisierung des HMA3 Gens und seines Promoters aus A. halleri und A. thaliana. Es wurde gezeigt, dass heterolog exprimiertes AhHMA3 Protein in metallsensitiven Hefestämmen eine erhöhte Toleranz gegenüber Zink und zu einem geringen Grad gegenüber Kadmium (Cd) jedoch nicht gegenüber Kobalt (Co) vermittelt.Weiterhin wurden im Genom von A. halleri mindestens vier AhHMA3 Genkopien, AhHMA3-1 bis AhHMA3-4, nachgewiesen. Eine Genkopie-spezifische Echtzeit-RT-PCR (real-time RT-PCR) deutete darauf hin, dass eine zu AhHMA3-1 und nicht zu AhHMA3-2 oder AhHMA3-4 ähnliche Genkopie die Quelle der konstitutiv hohen Transkriptmengen in A. halleri ist. In Übereinstimmung mit erhöhten mRNS Transkriptmengen inWurzeln von A. thaliana, vermittelte ein AtHMA3 Promoter-GUS (ß-Glucuronidase) Genkonstrukt GUS-Aktivität hauptsächlich in den Leitgeweben der Wurzeln jedoch nicht des Sprosses. Die vermittelte GUS-Aktivität durch Promoterfragmente von AhHMA3-1 und AhHMA3-2 in A. thaliana oder A. halleri Pflanzen spiegelte jedoch nicht die konstitutiv hohe AhHMA3 Expression im Spross von A. halleri wieder. Es wird vermutet, dass andere Faktoren die konstitutiv hohe Expression ermöglichen wie zum Beispiel die gefundenen kopiespezifischen Sequenzinsertionen innerhalb des ersten AhHMA3-1 Introns. Weiterhin ist es denkbar, dass der unbekannte Promoter der AhHMA3-3 Genkopie die Quelle der konstitutiv hohen AhHMA3 Transkriptmengen ist. In diesem Fall wird eine sehr hohe Ähnlichkeit zwischen den Sequenzen von AhHMA3-3 und der AhHMA3-1 vorhergesagt. Es konnten keine deutlichen Ergebnisse zur intrazellulären Lokalisierung gemacht werden, die eine exakte Einordnung der Funktion des AhHMA3 Proteins erlauben würden. Die bisher ermittelten Ergebnisse schlagen jedoch mehrere mögliche Funktionen für AhHMA3 vor: Ähnlich den AhHMA3 homologen Proteinen, AtHMA2 und AtHMA4, könnte AhHMA3 in der Plasmamembran der Zelle sitzen und dort zur effizienten Translokation von Zink aus der Wurzel in den Spross und/oder zur Zell-zu-Zell Verteilung von Zn im Spross beitragen. Falls AhHMA3 in der Membran der Vakuole sitzt, könnte es eine Rolle bei der Aufrechterhaltung niedriger zytoplasmatischer Zinkkonzentrationen durch vakuoläre Zinksequestrierung spielen. Zusätzlich ist es denkbar, dass AhHMA3 an der Abgabe von Zinkionen an Trichome und Blattmesophyllzellen beteiligt ist, die die Haupteinlagerungsorte für Zink in A. halleri darstellen. KW - P-Typ ATPase KW - Übergangsmetalle KW - Hyperakkumulation KW - Zink KW - HMA KW - p-type ATPase KW - transition metals KW - hyperaccumulation KW - zinc KW - HMA Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-15259 ER - TY - THES A1 - Mörbt, Nora T1 - Differential proteome analysis of human lung epithelial cells following exposure to aromatic volatile organic compounds T1 - Differentielle Proteomeanalyse humaner Lungenepithelzellen nach Exposition mit aromatischen flüchtigen Substanzen N2 - The widespread usage of products containing volatile organic compounds (VOC) has lead to a general human exposure to these chemicals in work places or homes being suspected to contribute to the growing incidence of environmental diseases. Since the causal molecular mechanisms for the development of these disorders are not completely understood, the overall objective of this thesis was to investigate VOC-mediated molecular effects on human lung cells in vitro at VOC concentrations comparable to exposure scenarios below current occupational limits. Although differential expression of single proteins in response to VOCs has been reported, effects on complex protein networks (proteome) have not been investigated. However, this information is indispensable when trying to ascertain a mechanism for VOC action on the cellular level and establishing preventive strategies. For this study, the alveolar epithelial cell line A549 has been used. This cell line, cultured in a two-phase (air/liquid) model allows the most direct exposure and had been successfully applied for the analysis of inflammatory effects in response to VOCs. Mass spectrometric identification of 266 protein spots provided the first proteomic map of A549 cell line to this extent that may foster future work with this frequently used cellular model. The distribution of three typical air contaminants, monochlorobenzene (CB), styrene and 1,2 dichlorobenzene (1,2-DCB), between gas and liquid phase of the exposure model has been analyzed by gas chromatography. The obtained VOC partitioning was in agreement with available literature data. Subsequently the adapted in vitro system has been successfully employed to characterize the effects of the aromatic compound styrene on the proteome of A549 cells (Chapter 4). Initially, the cell toxicity has been assessed in order to ensure that most of the concentrations used in the following proteomic approach were not cytotoxic. Significant changes in abundance and phosphorylation in the total soluble protein fraction of A549 cells have been detected following styrene exposure. All proteins have been identified using mass spectrometry and the main cellular functions have been assigned. Validation experiments on protein and transcript level confirmed the results of the 2-DE experiments. From the results, two main cellular pathways have been identified that were induced by styrene: the cellular oxidative stress response combined with moderate pro-apoptotic signaling. Measurement of cellular reactive oxygen species (ROS) as well as the styrene-mediated induction of oxidative stress marker proteins confirmed the hypothesis of oxidative stress as the main molecular response mechanism. Finally, adducts of cellular proteins with the reactive styrene metabolite styrene 7,8 oxide (SO) have been identified. Especially the SO-adducts observed at both the reactive centers of thioredoxin reductase 1, which is a key element in the control of the cellular redox state, may be involved in styrene-induced ROS formation and apoptosis. A similar proteomic approach has been carried out with the halobenzenes CB and 1,2-DCB (Chapter 5). In accordance with previous findings, cell toxicity assessment showed enhanced toxicity compared to the one caused by styrene. Significant changes in abundance and phosphorylation of total soluble proteins of A549 cells have been detected following exposure to subtoxic concentrations of CB and 1,2-DCB. All proteins have been identified using mass spectrometry and the main cellular functions have been assigned. As for the styrene experiment, the results indicated two main pathways to be affected in the presence of chlorinated benzenes, cell death signaling and oxidative stress response. The strong induction of pro-apoptotic signaling has been confirmed for both treatments by detection of the cleavage of caspase 3. Likewise, the induction of redox-sensitive protein species could be correlated to an increased cellular level of ROS observed following CB treatment. Finally, common mechanisms in the cellular response to aromatic VOCs have been investigated (Chapter 6). A similar number (4.6-6.9%) of all quantified protein spots showed differential expression (p<0.05) following cell exposure to styrene, CB or 1,2-DCB. However, not more than three protein spots showed significant regulation in the same direction for all three volatile compounds: voltage-dependent anion-selective channel protein 2, peroxiredoxin 1 and elongation factor 2. However, all of these proteins are important molecular targets in stress- and cell death-related signaling pathways. N2 - Die vermehrte Verwendung von Produkten, welche flüchtige organische Substanzen (VOC - volatile organic compound) enthalten, hat eine generelle Exposition der Bevölkerung mit diesen Substanzen an Arbeitsplätzen aber auch in Wohnräumen bedingt. VOCs stehen im Verdacht, zur zunehmenden Inzidenz umweltbedingter Erkrankungen beizutragen. Da die molekularen Ursachen dieser Erkrankungen bisher noch unverstanden sind, war es ein übergeordnetes Ziel dieser Arbeit, VOC-vermittelte molekulare Effekte in menschlichen Lungenepithelzellen anhand eines in vitro Modells zu untersuchen. Dabei sollten vor allem Konzentrationen unterhalb der gültigen Arbeitsplatzgrenzwerte untersucht werden. Obwohl Effekte auf einzelne Proteine bekannt sind, wurden bisher keine Effekte der VOC-Exposition auf das komplexe Netzwerk der zellulären Proteine (Proteom) untersucht. Dieses Wissen ist essentiell, um induzierte zelluläre Mechanismen zu verstehen und Strategien zu deren Vermeidung zu entwickeln. Für die hier durchgeführten Untersuchungen wurde die Lungenepithelzelllinie A549 in einem Zweiphasenexpositionsmodell eingesetzt. Dieses ermöglichte eine möglichst direkte zelluläre Exposition und wurde bereits erfolgreich verwendet, um durch VOC hervorgerufene Entzündungseffekte zu identifizieren. Die massen-spektrometrische Identifikation von 266 Proteinflecken lieferte die erste umfassende Proteomkarte der A549 Zelllinie, welche nachfolgende Untersuchungen mit diesem häufig verwendeten Zelltyp erleichtern wird. Zusätzlich wurde die Verteilung der drei gängigen Luftkontaminanten Chlorbenzol (CB), Styrol and 1,2-Dichlorobenzol (1,2-DCB) zwischen den beiden Phasen (gas/flüssig) des Expositionsmodells gaschromatographisch bestimmt. Die Verteilung entsprach den verfügbaren Literaturdaten. Anschließend wurde das modifizierte Expositionsmodell erfolgreich eingesetzt, um styrol-vermittelte Effekte auf das Proteom der A549 Zellen zu charakterisieren (Kapitel 4). Zu Beginn erfolgte die Erfassung der Zelltoxizität der Substanz, um sicher zu stellen, daß der überwiegende Teil der späteren Expositionsexperimente mit subtoxischen Konzentrationen durchgeführt wird. Es konnte eine signifikant veränderte Expression und Phosphorylierung der löslichen Proteinfraktion der A549 Zellen als Reaktion auf die Styrolexposition festgestellt werden. Die regulierten Proteine wurden massenspektrometrisch identifiziert und ihre wichtigsten Funktionen wurden zugewiesen. Validierungsexperimente auf Protein- und auf Transkriptebene bestätigten die 2-DE Ergebnisse. Insgesamt konnte die zelluläre Reaktion durch die styrol-vermittelte Induktion zweier zentraler Mechanismen erklärt werden: oxidativer zellulärer Stress und beginnende Apoptose. Folgeexperimente wie die Messung der Menge der zellulären reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und die Induktion von redox-sensitiven Markerproteinen konnte die Hypothese eines styrol-induzierten oxidativen Milieus bestätigen. Schließlich wurden Proteinaddukte des reaktiven Styrolmetaboliten Styrol 7,8 epoxide (SO) identifiziert. Besonders die SO-Addukte, welche and den beiden aktiven Zentren der Thioredoxin Reduktase 1 gefunden wurden könnten eine wichtige Rolle bei der styrol-induzierten ROS-Bildung sowie der beginnenden Apoptose spielen. In Analogie zum Styrolexperiment wurden die Effekte der halogenierten Benzole CB und 1,2-DCB untersucht (Kapitel 5). Es konnten ebenfalls sämtliche Proteine identifiziert und die wichtigsten zellulären Funktionen zugewiesen werden. Diese Substanzen modulierten ebenfalls apoptotische Signalwege und die zelluläre Antwort auf oxidativen Streß. Der beobachtete starke pro-apoptotische Effekt konnte für beide Substanzen mit der Spaltung der Caspase 3 nachgewiesen werden. Weiterhin konnte für CB die Induktion redox-sensitiver Proteinspezies mit einem beobachteten höherem Gehalt an ROS erklärt werden. Schließlich wurden ähnliche Mechanismen der zellulären Antwort auf die Exposition mit den drei untersuchten aromatischen VOCs diskutiert (Kapitel 6). Alle getesteten VOCs verursachten eine vergleichbare differentielle Expression (p<0,05) von 4,6-6,9% aller quantifizierten Proteinspezies. Nur drei Proteinspots wurden dabei gemeinsam für alle VOCs reguliert: voltage-dependent anion-selective channel protein 2, peroxiredoxin 1 and elongation factor 2. Allerdings gehören diese drei Proteine zu wichtigen zellulären Zielstrukturen der Signalwege für Stressantwort und Zelltod. KW - VOC KW - Proteom KW - Styrol KW - chlorbenzol KW - dichlorbenzol KW - VOC KW - proteome KW - styrene KW - monochlorobenzene KW - dichlorobenzene Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-49257 ER - TY - THES A1 - Wenk, Sebastian T1 - Engineering formatotrophic growth in Escherichia coli N2 - To meet the demands of a growing world population while reducing carbon dioxide (CO2) emissions, it is necessary to capture CO2 and convert it into value-added compounds. In recent years, metabolic engineering of microbes has gained strong momentum as a strategy for the production of valuable chemicals. As common microbial feedstocks like glucose directly compete with human consumption, the one carbon (C1) compound formate was suggested as an alternative feedstock. Formate can be easily produced by various means including electrochemical reduction of CO2 and could serve as a feedstock for microbial production, hence presenting a novel entry point for CO2 to the biosphere and a storage option for excess electricity. Compared to the gaseous molecule CO2, formate is a highly soluble compound that can be easily handled and stored. It can serve as a carbon and energy source for natural formatotrophs, but these microbes are difficult to cultivate and engineer. In this work, I present the results of several projects that aim to establish efficient formatotrophic growth of E. coli – which cannot naturally grow on formate – via synthetic formate assimilation pathways. In the first study, I establish a workflow for growth-coupled metabolic engineering of E. coli. I demonstrate this approach by presenting an engineering scheme for the PFL-threonine cycle, a synthetic pathway for anaerobic formate assimilation in E. coli. The described methods are intended to create a standardized toolbox for engineers that aim to establish novel metabolic routes in E. coli and related organisms. The second chapter presents a study on the catalytic efficiency of C1-oxidizing enzymes in vivo. As formatotrophic growth requires generation of both energy and biomass from formate, the engineered E. coli strains need to be equipped with a highly efficient formate dehydrogenase, which provides reduction equivalents and ATP for formate assimilation. I engineered a strain that cannot generate reducing power and energy for cellular growth, when fed on acetate. Under this condition, the strain depends on the introduction of an enzymatic system for NADH regeneration, which could further produce ATP via oxidative phosphorylation. I show that the strain presents a valuable testing platform for C1-oxidizing enzymes by testing different NAD-dependent formate and methanol dehydrogenases in the energy auxotroph strain. Using this platform, several candidate enzymes with high in vivo activity, were identified and characterized as potential energy-generating systems for synthetic formatotrophic or methylotrophic growth in E. coli.   In the third chapter, I present the establishment of the serine threonine cycle (STC) – a synthetic formate assimilation pathway – in E. coli. In this pathway, formate is assimilated via formate tetrahydrofolate ligase (FtfL) from Methylobacterium extorquens (M. extorquens). The carbon from formate is attached to glycine to produce serine, which is converted into pyruvate entering central metabolism. Via the natural threonine synthesis and cleavage route, glycine is regenerated and acetyl-CoA is produced as the pathway product. I engineered several selection strains that depend on different STC modules for growth and determined key enzymes that enable high flux through threonine synthesis and cleavage. I could show that expression of an auxiliary formate dehydrogenase was required to achieve growth via threonine synthesis and cleavage on pyruvate. By overexpressing most of the pathway enzymes from the genome, and applying adaptive laboratory evolution, growth on glycine and formate was achieved, indicating the activity of the complete cycle. The fourth chapter shows the establishment of the reductive glycine pathway (rGP) – a short, linear formate assimilation route – in E. coli. As in the STC, formate is assimilated via M. extorquens FtfL. The C1 from formate is condensed with CO2 via the reverse reaction of the glycine cleavage system to produce glycine. Another carbon from formate is attached to glycine to form serine, which is assimilated into central metabolism via pyruvate. The engineered E. coli strain, expressing most of the pathway genes from the genome, can grow via the rGP with formate or methanol as a sole carbon and energy source. N2 - Um den steigenden Bedarf einer wachsenden Weltbevölkerung zu decken und gleichzeitig die CO2-Emissionen zu reduzieren, ist es notwendig, CO2 aufzufangen und zu recyceln. Durch gentechnische Veränderungen von Mikroorganismen ist es möglich diese zur Produktion wertvoller organischer Verbindungen zu nutzen. Da mikrobielle Kulturen primär mit Glucose gefüttert werden und somit mit menschlicher Nahrungsversorgung konkurrieren, wurde die C1-Verbindung Formiat als alternativer bakterieller Nährstoff vorgeschlagen.. Formiat kann durch unterschiedliche Verfahren hergestellt werden, unter anderem durch elektrochemische Reduktion von CO2. Dieses Verfahren ermöglicht das Recycling von CO2 und weiterhin eine Speichermöglichkeit für überschüssige Elektrizität. Formiat ist im Vergleich zum gasförmigen CO2 gut wasserlöslich, was den Transport und die Verwendung als mikrobiellen Nährstoff erleichtert. Natürlich vorkommende formatotrophe Mikroorganismen nutzen Formiat als Kohlenstoff- und Energiequelle. Diese lassen sich allerdings meist schwierig kultivieren und genetisch verändern. In dieser Arbeit stelle ich die Ergebnisse verschiedener Projekte vor, die gemeinsam darauf abzielen, effizientes formatotrophes Wachstum von E. coli – welches natürlicherweise nicht auf Formiat wachsen kann – mittels synthetischer Formiat-Assimilierungswege zu ermöglichen. In der ersten Studie stelle ich eine Strategie für wachstumsgekoppeltes Stoffwechsel-Engineering in E. coli vor. Ich erläutere diese Strategie anhand eines Beispiels, der schrittweisen Etablierung eines synthetischen Formiat- Assimilierungswegs, des PFL-Threonin-Zyklus. Die in diesem Kapitel beschriebenen Methoden sollen einen Leitfaden für Ingenieure bereitstellen, die neue Stoffwechselwege in E. coli und verwandten Organismen etablieren wollen. Im zweiten Kapitel stelle ich eine Studie über die katalytische Effizienz von C1-oxidierenden Enzymen vor. Da formatotrophes Wachstum sowohl die Erzeugung von Energie als auch von Biomasse aus Formiat erfordert, müssen synthetisch formatotrophe E. coli Stämme mit einer hocheffizienten Formiat-Dehydrogenase ausgestattet werden, welche Reduktionsäquivalente und ATP für die Assimilierung von Formiat liefert. Um die Effizienz verschiedener Enzyme testen und vergleichen zu können, entwickelte ich einen E. coli Stamm, der aus Acetat weder Reduktionsäquivalente noch Energie für das Zellwachstum erzeugen kann. Dieser „energie-auxotrophe“ Stamm benötigt eines zusätzlichen enzymatischen Systems zur NADH-Regenerierung, um auf Acetat wachsen zu können. Ich testete verschiedene NAD-abhängige Formiat- und Methanol-Dehydrogenasen in diesem Stamm und konnte zeigen, dass Wachstum auf Acetat durch Zugabe von Formiat oder Methanol ermöglicht wurde. Dies zeigt, dass der Stamm eine zuverlässige Testplattform für C1-oxidierende Enzyme darstellt. Unter Verwendung dieser Plattform wurden mehrere Kandidatenenzyme mit hoher in vivo-Aktivität identifiziert und als Kandidatenenzyme für synthetisches formatotrophes oder methylotrophes Wachstum in E. coli charakterisiert.   Im dritten Kapitel stelle ich die Etablierung des Serin-Threonin-Zyklus (STZ) – eines synthetischen Formiat-Assimilationswegs – in E. coli vor. In diesem Stoffwechselweg wird Formiat über die Formiat-Tetrahydrofolat-Ligase (FtfL) aus Methylobacterium extorquens (M. extorquens) assimiliert. Der Kohlenstoff aus Formiat wird an Glycin gebunden, um Serin zu produzieren, welches im nächsten Schritt in Pyruvat umgewandelt wird und so in den zentralen Kohlenstoffmetabolismus gelangt. Über den natürlichen Threonin-Synthese- und Spaltweg wird Glycin regeneriert und Acetyl-CoA als Produkt des Stoffwechselwegs generiert. Ich entwickelte mehrere E. coli Selektionsstämme, deren Wachstum von verschiedenen STZ-Modulen abhängt, und konnte Schlüsselenzyme bestimmen, die einen hohen Reaktionsfluss durch die Threonin-Synthese und -Spaltung ermöglichen. Ich konnte zeigen, dass die Expression einer Formiat-Dehydrogenase erforderlich ist, um Wachstum auf Pyruvat über Threonin zu erreichen. Durch Integration und Überexpression der meisten Enzyme des STZ auf Genomebene und Anwendung adaptiver Laborevolution wurde Wachstum auf Glycin und Formiat erreicht, was bedeutet, dass der gesamte Serin-Threonin-Zyklus in E. coli aktiv ist. Das vierte Kapitel zeigt die Etablierung des reduktiven Glycinwegs (rGW) – eines kurzen, linearen Formiat-Assimilierungswegs – in E. coli. Wie im STZ wird Formiat über M. extorquens FtfL assimiliert. Dabei wird das Kohlenstoffatom aus Formiat mit CO2 über die umgekehrte Reaktion des Glycin-Spaltungssystems zu Glycin kondensiert. Ein weiteres Kohlenstoffatom aus Formiat wird an Glycin gebunden, um Serin zu bilden, welches über Pyruvat in den Zentralstoffwechsel gelangt. Durch Expression der rGW Enzyme auf Genomebene und adaptive Laborevolution wurde ein E. coli Stamm erzeugt welcher über den rGW auf Formiat oder Methanol als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle wachsen kann. KW - metabolic engineering KW - E. coli KW - formate assimilation KW - methanol assimilation KW - energy metabolism Y1 - 2020 ER - TY - THES A1 - Yishai, Oren T1 - Engineering the reductive glycine pathway in Escherichia coli Y1 - 2019 ER - TY - THES A1 - Schütte, Moritz T1 - Evolutionary fingerprints in genome-scale networks T1 - Evolutionäre Spuren in genomskaligen Netzwerken N2 - Mathematical modeling of biological phenomena has experienced increasing interest since new high-throughput technologies give access to growing amounts of molecular data. These modeling approaches are especially able to test hypotheses which are not yet experimentally accessible or guide an experimental setup. One particular attempt investigates the evolutionary dynamics responsible for today's composition of organisms. Computer simulations either propose an evolutionary mechanism and thus reproduce a recent finding or rebuild an evolutionary process in order to learn about its mechanism. The quest for evolutionary fingerprints in metabolic and gene-coexpression networks is the central topic of this cumulative thesis based on four published articles. An understanding of the actual origin of life will probably remain an insoluble problem. However, one can argue that after a first simple metabolism has evolved, the further evolution of metabolism occurred in parallel with the evolution of the sequences of the catalyzing enzymes. Indications of such a coevolution can be found when correlating the change in sequence between two enzymes with their distance on the metabolic network which is obtained from the KEGG database. We observe that there exists a small but significant correlation primarily on nearest neighbors. This indicates that enzymes catalyzing subsequent reactions tend to be descended from the same precursor. Since this correlation is relatively small one can at least assume that, if new enzymes are no "genetic children" of the previous enzymes, they certainly be descended from any of the already existing ones. Following this hypothesis, we introduce a model of enzyme-pathway coevolution. By iteratively adding enzymes, this model explores the metabolic network in a manner similar to diffusion. With implementation of an Gillespie-like algorithm we are able to introduce a tunable parameter that controls the weight of sequence similarity when choosing a new enzyme. Furthermore, this method also defines a time difference between successive evolutionary innovations in terms of a new enzyme. Overall, these simulations generate putative time-courses of the evolutionary walk on the metabolic network. By a time-series analysis, we find that the acquisition of new enzymes appears in bursts which are pronounced when the influence of the sequence similarity is higher. This behavior strongly resembles punctuated equilibrium which denotes the observation that new species tend to appear in bursts as well rather than in a gradual manner. Thus, our model helps to establish a better understanding of punctuated equilibrium giving a potential description at molecular level. From the time-courses we also extract a tentative order of new enzymes, metabolites, and even organisms. The consistence of this order with previous findings provides evidence for the validity of our approach. While the sequence of a gene is actually subject to mutations, its expression profile might also indirectly change through the evolutionary events in the cellular interplay. Gene coexpression data is simply accessible by microarray experiments and commonly illustrated using coexpression networks where genes are nodes and get linked once they show a significant coexpression. Since the large number of genes makes an illustration of the entire coexpression network difficult, clustering helps to show the network on a metalevel. Various clustering techniques already exist. However, we introduce a novel one which maintains control of the cluster sizes and thus assures proper visual inspection. An application of the method on Arabidopsis thaliana reveals that genes causing a severe phenotype often show a functional uniqueness in their network vicinity. This leads to 20 genes of so far unknown phenotype which are however suggested to be essential for plant growth. Of these, six indeed provoke such a severe phenotype, shown by mutant analysis. By an inspection of the degree distribution of the A.thaliana coexpression network, we identified two characteristics. The distribution deviates from the frequently observed power-law by a sharp truncation which follows after an over-representation of highly connected nodes. For a better understanding, we developed an evolutionary model which mimics the growth of a coexpression network by gene duplication which underlies a strong selection criterion, and slight mutational changes in the expression profile. Despite the simplicity of our assumption, we can reproduce the observed properties in A.thaliana as well as in E.coli and S.cerevisiae. The over-representation of high-degree nodes could be identified with mutually well connected genes of similar functional families: zinc fingers (PF00096), flagella, and ribosomes respectively. In conclusion, these four manuscripts demonstrate the usefulness of mathematical models and statistical tools as a source of new biological insight. While the clustering approach of gene coexpression data leads to the phenotypic characterization of so far unknown genes and thus supports genome annotation, our model approaches offer explanations for observed properties of the coexpression network and furthermore substantiate punctuated equilibrium as an evolutionary process by a deeper understanding of an underlying molecular mechanism. N2 - Die biologische Zelle ist ein sehr kompliziertes Gebilde. Bei ihrer Betrachtung gilt es, das Zusammenspiel von Tausenden bis Millionen von Genen, Regulatoren, Proteinen oder Molekülen zu beschreiben und zu verstehen. Durch enorme Verbesserungen experimenteller Messgeräte gelingt es mittlerweile allerdings in geringer Zeit enorme Datenmengen zu messen, seien dies z.B. die Entschlüsselung eines Genoms oder die Konzentrationen der Moleküle in einer Zelle. Die Systembiologie nimmt sich dem Problem an, aus diesem Datenmeer ein quantitatives Verständnis für die Gesamtheit der Wechselwirkungen in der Zelle zu entwickeln. Dabei stellt die mathematische Modellierung und computergestützte Analyse ein eminent wichtiges Werkzeug dar, lassen sich doch am Computer in kurzer Zeit eine Vielzahl von Fällen testen und daraus Hypothesen generieren, die experimentell verifiziert werden können. Diese Doktorarbeit beschäftigt sich damit, wie durch mathematische Modellierung Rückschlüsse auf die Evolution und deren Mechanismen geschlossen werden können. Dabei besteht die Arbeit aus zwei Teilen. Zum Einen wurde ein Modell entwickelt, dass die Evolution des Stoffwechsels nachbaut. Der zweite Teil beschäftigt sich mit der Analyse von Genexpressionsdaten, d.h. der Stärke mit der ein bestimmtes Gen in ein Protein umgewandelt, "exprimiert", wird. Der Stoffwechsel bezeichnet die Gesamtheit der chemischen Vorgänge in einem Organismus; zum Einen werden Nahrungsstoffe für den Organismus verwertbar zerlegt, zum Anderen aber auch neue Stoffe aufgebaut. Da für nahezu jede chemische Reaktion ein katalysierendes Enzym benötigt wird, ist davon auszugehen, dass sich der Stoffwechsel parallel zu den Enzymen entwickelt hat. Auf dieser Annahme basiert das entwickelte Modell zur Enzyme-Stoffwechsel-Koevolution. Von einer Anfangsmenge von Enzymen und Molekülen ausgehend, die etwa in einer primitiven Atmosphäre vorgekommen sind, werden sukzessive Enzyme und die nun katalysierbaren Reaktionen hinzugefügt, wodurch die Stoffwechselkapazität anwächst. Die Auswahl eines neuen Enzyms geschieht dabei in Abhängigkeit von der Ähnlichkeit mit bereits vorhandenen und ist so an den evolutionären Vorgang der Mutation angelehnt: je ähnlicher ein neues Enzym zu den vorhandenen ist, desto schneller kann es hinzugefügt werden. Dieser Vorgang wird wiederholt, bis der Stoffwechsel die heutige Form angenommen hat. Interessant ist vor allem der zeitliche Verlauf dieser Evolution, der mittels einer Zeitreihenanalyse untersucht wird. Dabei zeigt sich, dass neue Enzyme gebündelt in Gruppen kurzer Zeitfolge auftreten, gefolgt von Intervallen relativer Stille. Dasselbe Phänomen kennt man von der Evolution neuer Arten, die ebenfalls gebündelt auftreten, und wird Punktualismus genannt. Diese Arbeit liefert somit ein besseres Verständnis dieses Phänomens durch eine Beschreibung auf molekularer Ebene. Im zweiten Projekt werden Genexpressionsdaten von Pflanzen analysiert. Einerseits geschieht dies mit einem eigens entwickelten Cluster-Algorithmus. Hier läßt sich beobachten, dass Gene mit einer ähnlichen Funktion oft auch ein ähnliches Expressionsmuster aufweisen. Das Clustering liefert einige Genkandidaten, deren Funktion bisher unbekannt war, von denen aber nun vermutet werden konnte, dass sie enorm wichtig für das Wachstum der Pflanze sind. Durch Experimente von Pflanzen mit und ohne diese Gene zeigte sich, dass sechs neuen Genen dieses essentielle Erscheinungsbild zugeordnet werden kann. Weiterhin wurden Netzwerke der Genexpressionsdaten einer Pflanze, eines Pilzes und eines Bakteriums untersucht. In diesen Netzwerken werden zwei Gene verbunden, falls sie ein sehr ähnliches Expressionsprofil aufweisen. Nun zeigten diese Netzwerke sehr ähnliche und charakteristische Eigenschaften auf. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher ein weiteres evolutionäres Modell entwickelt, das die Expressionsprofile anhand von Duplikation, Mutation und Selektion beschreibt. Obwohl das Modell auf sehr simplen Eigenschaften beruht, spiegelt es die beobachteten Eigenschaften sehr gut wider, und es läßt sich der Schluss ziehen, dass diese als Resultat der Evolution betrachtet werden können. Die Ergebnisse dieser Arbeiten sind als Doktorarbeit in kumulativer Form bestehend aus vier veröffentlichten Artikeln vereinigt. KW - Systembiologie KW - Modellierung KW - Evolution KW - Stoffwechsel KW - Gen-Koexpression KW - Systems Biology KW - Modeling KW - Evolution KW - Metabolism KW - Gene co-expression Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-57483 ER - TY - THES A1 - Ziege, Ricardo T1 - Growth dynamics and mechanical properties of E. coli biofilms T1 - Wachstumsdynamik und mechanische Eigenschaften von E. coli Biofilmen N2 - Biofilms are complex living materials that form as bacteria get embedded in a matrix of self-produced protein and polysaccharide fibres. The formation of a network of extracellular biopolymer fibres contributes to the cohesion of the biofilm by promoting cell-cell attachment and by mediating biofilm-substrate interactions. This sessile mode of bacteria growth has been well studied by microbiologists to prevent the detrimental effects of biofilms in medical and industrial settings. Indeed, biofilms are associated with increased antibiotic resistance in bacterial infections, and they can also cause clogging of pipelines or promote bio-corrosion. However, biofilms also gained interest from biophysics due to their ability to form complex morphological patterns during growth. Recently, the emerging field of engineered living materials investigates biofilm mechanical properties at multiple length scales and leverages the tools of synthetic biology to tune the functions of their constitutive biopolymers. This doctoral thesis aims at clarifying how the morphogenesis of Escherichia coli (E. coli) biofilms is influenced by their growth dynamics and mechanical properties. To address this question, I used methods from cell mechanics and materials science. I first studied how biological activity in biofilms gives rise to non-uniform growth patterns. In a second study, I investigated how E. coli biofilm morphogenesis and its mechanical properties adapt to an environmental stimulus, namely the water content of their substrate. Finally, I estimated how the mechanical properties of E. coli biofilms are altered when the bacteria express different extracellular biopolymers. On nutritive hydrogels, micron-sized E. coli cells can build centimetre-large biofilms. During this process, bacterial proliferation and matrix production introduce mechanical stresses in the biofilm, which release through the formation of macroscopic wrinkles and delaminated buckles. To relate these biological and mechanical phenomena, I used time-lapse fluorescence imaging to track cell and matrix surface densities through the early and late stages of E. coli biofilm growth. Colocalization of high cell and matrix densities at the periphery precede the onset of mechanical instabilities at this annular region. Early growth is detected at this outer annulus, which was analysed by adding fluorescent microspheres to the bacterial inoculum. But only when high rates of matrix production are present in the biofilm centre, does overall biofilm spreading initiate along the solid-air interface. By tracking larger fluorescent particles for a long time, I could distinguish several kinematic stages of E. coli biofilm expansion and observed a transition from non-linear to linear velocity profiles, which precedes the emergence of wrinkles at the biofilm periphery. Decomposing particle velocities to their radial and circumferential components revealed a last kinematic stage, where biofilm movement is mostly directed towards the radial delaminated buckles, which verticalize. The resulting compressive strains computed in these regions were observed to substantially deform the underlying agar substrates. The co-localization of higher cell and matrix densities towards an annular region and the succession of several kinematic stages are thus expected to promote the emergence of mechanical instabilities at the biofilm periphery. These experimental findings are predicted to advance future modelling approaches of biofilm morphogenesis. E. coli biofilm morphogenesis is further anticipated to depend on external stimuli from the environment. To clarify how the water could be used to tune biofilm material properties, we quantified E. coli biofilm growth, wrinkling dynamics and rigidity as a function of the water content of the nutritive substrates. Time-lapse microscopy and computational image analysis revealed that substrates with high water content promote biofilm spreading kinetics, while substrates with low water content promote biofilm wrinkling. The wrinkles observed on biofilm cross-sections appeared more bent on substrates with high water content, while they tended to be more vertical on substrates with low water content. Both wet and dry biomass, accumulated over 4 days of culture, were larger in biofilms cultured on substrates with high water content, despite extra porosity within the matrix layer. Finally, the micro-indentation analysis revealed that substrates with low water content supported the formation of stiffer biofilms. This study shows that E. coli biofilms respond to the water content of their substrate, which might be used for tuning their material properties in view of further applications. Biofilm material properties further depend on the composition and structure of the matrix of extracellular proteins and polysaccharides. In particular, E. coli biofilms were suggested to present tissue-like elasticity due to a dense fibre network consisting of amyloid curli and phosphoethanolamine-modified cellulose. To understand the contribution of these components to the emergent mechanical properties of E. coli biofilms, we performed micro-indentation on biofilms grown from bacteria of several strains. Besides showing higher dry masses, larger spreading diameters and slightly reduced water contents, biofilms expressing both main matrix components also presented high rigidities in the range of several hundred kPa, similar to biofilms containing only curli fibres. In contrast, a lack of amyloid curli fibres provides much higher adhesive energies and more viscoelastic fluid-like material behaviour. Therefore, the combination of amyloid curli and phosphoethanolamine-modified cellulose fibres implies the formation of a composite material whereby the amyloid curli fibres provide rigidity to E. coli biofilms, whereas the phosphoethanolamine-modified cellulose rather acts as a glue. These findings motivate further studies involving purified versions of these protein and polysaccharide components to better understand how their interactions benefit biofilm functions. All three studies depict different aspects of biofilm morphogenesis, which are interrelated. The first work reveals the correlation between non-uniform biological activities and the emergence of mechanical instabilities in the biofilm. The second work acknowledges the adaptive nature of E. coli biofilm morphogenesis and its mechanical properties to an environmental stimulus, namely water. Finally, the last study reveals the complementary role of the individual matrix components in the formation of a stable biofilm material, which not only forms complex morphologies but also functions as a protective shield for the bacteria it contains. Our experimental findings on E. coli biofilm morphogenesis and their mechanical properties can have further implications for fundamental and applied biofilm research fields. N2 - Biofilme sind komplexe lebende Materialien, die sich bilden, wenn Bakterien in eine Matrix aus selbstproduzierten Protein- und Polysaccharidfasern eingebettet werden. Die Bildung eines Netzwerks aus extrazellulären Biopolymerfasern trägt zum Zusammenhalt des Biofilms bei, indem sie die Zell-Zell-Anhaftung fördert und die Wechselwirkungen zwischen Biofilm und Substrat vermittelt. Diese sessile Form des Bakterienwachstums wurde von Mikrobiologen eingehend untersucht, um die schädlichen Auswirkungen von Biofilmen in der Medizin und Industrie zu verhindern. Biofilme werden nämlich mit einer erhöhten Antibiotikaresistenz bei bakteriellen Infektionen in Verbindung gebracht, und sie können auch zur Verstopfung von Rohrleitungen führen oder Biokorrosion fördern. Biofilme sind jedoch auch für die Biophysik von Interesse, da sie während ihres Wachstums komplexe morphologische Muster bilden können. In jüngster Zeit werden auf dem aufstrebenden Gebiet der künstlich hergestellten lebenden Materialien die mechanischen Eigenschaften von Biofilmen auf verschiedenen Längenskalen untersucht und die Werkzeuge der synthetischen Biologie genutzt, um die Funktionen ihrer konstitutiven Biopolymere zu beeinflussen. In dieser Doktorarbeit soll geklärt werden, wie die Morphogenese von Escherichia coli (E. coli)-Biofilmen durch deren Wachstumsdynamik und mechanische Eigenschaften beeinflusst wird. Um dieser Frage nachzugehen, habe ich Methoden aus der Zellmechanik und der Materialwissenschaft verwendet. Zunächst habe ich untersucht, wie die biologische Aktivität in Biofilmen zu ungleichmäßigen Wachstumsmustern führt. In einer zweiten Studie untersuchte ich, wie sich die Morphogenese von E. coli-Biofilmen und ihre mechanischen Eigenschaften an einen Umweltstimulus, nämlich den Wassergehalt des Substrats, anpassen. Schließlich habe ich abgeschätzt, wie sich die mechanischen Eigenschaften von E. coli-Biofilmen verändern, wenn die Bakterien verschiedene extrazelluläre Biopolymere exprimieren. Auf nährstoffhaltigen Hydrogelen können mikrometergroße E. coli-Zellen zentimetergroße Biofilme bilden. Während dieses Prozesses führen die bakterielle Vermehrung und die Matrixproduktion zu mechanischen Spannungen im Biofilm, die sich durch die Bildung von makroskopischen Falten und delaminierten Knicken entladen. Um diese biologischen und mechanischen Phänomene miteinander in Beziehung zu setzen, habe ich mit Hilfe von Zeitraffer-Fluoreszenzaufnahmen die Zell- und Matrixoberflächendichte in den frühen und späten Phasen des E. coli-Biofilmwachstums verfolgt. Die Kolokalisierung hoher Zell- und Matrixdichten an der Peripherie geht dem Auftreten mechanischer Instabilitäten in diesem ringförmigen Bereich voraus. An diesem äußeren Ring wird ein frühes Wachstum festgestellt, das durch Zugabe von fluoreszierenden Mikrokugeln zum bakteriellen Inokulum analysiert wurde. Aber nur wenn im Zentrum des Biofilms hohe Raten der Matrixproduktion vorhanden sind, beginnt die Ausbreitung des gesamten Biofilms entlang der Feststoff-Luft-Grenzfläche. Indem ich größere fluoreszierende Partikel über einen längeren Zeitraum verfolgte, konnte ich mehrere kinematische Stadien der E. coli-Biofilmexpansion unterscheiden und einen Übergang von nichtlinearen zu linearen Geschwindigkeitsprofilen beobachten, der dem Auftreten von Falten an der Biofilmperipherie vorausgeht. Die Zerlegung der Partikelgeschwindigkeiten in ihre radialen und umlaufenden Komponenten ergab ein letztes kinematisches Stadium, in dem die Bewegung des Biofilms hauptsächlich auf die radialen delaminierten Knicke gerichtet ist, die sich vertikalisieren. Die in diesen Regionen berechneten Druckspannungen verformen die darunter liegenden Agarsubstrate erheblich. Die gleichzeitige Ansammlung höherer Zell- und Matrixdichten in einer ringförmigen Region und die Abfolge mehrerer kinematischer Stadien dürften somit das Entstehen mechanischer Instabilitäten an der Biofilm-Peripherie fördern. Diese experimentellen Ergebnisse werden voraussichtlich zukünftige Modellierungsansätze der Biofilmmorphogenese voranbringen. Die Morphogenese des E. coli-Biofilms wird voraussichtlich auch von externen Stimuli aus der Umwelt abhängen. Um zu klären, wie das Wasser zur Einstellung der Materialeigenschaften von Biofilmen genutzt werden könnte, haben wir das Wachstum, die Faltenbildung und die Steifigkeit von E. coli-Biofilmen in Abhängigkeit vom Wassergehalt der Nährsubstrate quantifiziert. Zeitraffermikroskopie und computergestützte Bildanalyse zeigten, dass Substrate mit hohem Wassergehalt die Ausbreitungskinetik des Biofilms fördern, während Substrate mit niedrigem Wassergehalt die Faltenbildung des Biofilms begünstigen. Die auf Biofilm-Querschnitten beobachteten Falten erschienen auf Substraten mit hohem Wassergehalt stärker gebogen, während sie auf Substraten mit niedrigem Wassergehalt eher vertikal verliefen. Sowohl die feuchte als auch die trockene Biomasse, die während der 4-tägigen Kultur akkumuliert wurde, war in Biofilmen, die auf Substraten mit hohem Wassergehalt gezüchtet wurden, größer, trotz der zusätzlichen Porosität innerhalb der Matrixschicht. Schließlich ergab die Mikroindentationsanalyse, dass Substrate mit niedrigem Wassergehalt die Bildung von steiferen Biofilmen begünstigten. Diese Studie zeigt, dass E. coli-Biofilme auf den Wassergehalt ihres Substrats reagieren, was für die Abstimmung ihrer Materialeigenschaften im Hinblick auf weitere Anwendungen genutzt werden könnte. Die Materialeigenschaften von Biofilmen hängen außerdem von der Zusammensetzung und Struktur der Matrix aus extrazellulären Proteinen und Polysacchariden ab. Insbesondere wurde vermutet, dass E. coli-Biofilme aufgrund eines dichten Fasernetzwerks aus Amyloid-Curli und Phosphoethanolamin-modifizierter Cellulose eine gewebeähnliche Elastizität aufweisen. Um den Beitrag dieser Komponenten zu den entstehenden mechanischen Eigenschaften von E. coli-Biofilmen zu verstehen, führten wir an Biofilmen, die aus Bakterien verschiedener Stämme gewachsen waren, Mikroeindrücke durch. Biofilme, die beide Hauptmatrixkomponenten enthalten, wiesen nicht nur eine höhere Trockenmasse, einen größeren Ausbreitungsdurchmesser und einen leicht verringerten Wassergehalt auf, sondern auch eine hohe Steifigkeit im Bereich von mehreren hundert kPa, ähnlich wie Biofilme, die nur Curli-Fasern enthalten. Das Fehlen von Amyloid-Curli-Fasern führt dagegen zu deutlich höheren Adhäsionsenergien und einem viskoelastischeren, flüssigkeitsähnlichen Materialverhalten. Die Kombination von Amyloid-Curli-Fasern und Phosphoethanolamin-modifizierten Cellulosefasern impliziert daher die Bildung eines Verbundmaterials, bei dem die Amyloid-Curli-Fasern den E. coli-Biofilmen Steifigkeit verleihen, während die Phosphoethanolamin-modifizierte Cellulose eher als Klebstoff wirkt. Diese Ergebnisse motivieren zu weiteren Studien mit gereinigten Versionen dieser Protein- und Polysaccharidkomponenten, um besser zu verstehen, wie ihre Interaktionen die Funktionen des Biofilms unterstützen. Alle drei Studien zeigen verschiedene Aspekte der Biofilm-Morphogenese, die miteinander verbunden sind. Die erste Arbeit zeigt den Zusammenhang zwischen ungleichmäßigen biologischen Aktivitäten und dem Auftreten mechanischer Instabilitäten im Biofilm auf. Die zweite Arbeit bestätigt die Anpassungsfähigkeit der Morphogenese des E. coli-Biofilms und seiner mechanischen Eigenschaften an einen Umweltreiz, nämlich Wasser. Die letzte Studie schließlich zeigt die komplementäre Rolle der einzelnen Matrixkomponenten bei der Bildung eines stabilen Biofilmmaterials, das nicht nur komplexe Morphologien bildet, sondern auch als Schutzschild für die darin enthaltenen Bakterien fungiert. Unsere experimentellen Erkenntnisse über die Morphogenese von E. coli-Biofilmen und ihre mechanischen Eigenschaften können weitere Auswirkungen auf grundlegende und angewandte Biofilm-Forschungsbereiche haben. KW - biofilm KW - E. coli KW - living materials KW - mechanobiology KW - E. coli KW - Biofilm KW - lebende Materialien KW - Mechanobiologie Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-559869 ER - TY - THES A1 - Martin, Benjamin T1 - Linking individual-based models and dynamic energy budget theory : lessons for ecology and ecotoxicology T1 - Individuenbasierte Modelle mit dynamischen Energiehaushalten bereichern die Ökologie und Ökotoxikologie N2 - In the context of ecological risk assessment of chemicals, individual-based population models hold great potential to increase the ecological realism of current regulatory risk assessment procedures. However, developing and parameterizing such models is time-consuming and often ad hoc. Using standardized, tested submodels of individual organisms would make individual-based modelling more efficient and coherent. In this thesis, I explored whether Dynamic Energy Budget (DEB) theory is suitable for being used as a standard submodel in individual-based models, both for ecological risk assessment and theoretical population ecology. First, I developed a generic implementation of DEB theory in an individual-based modeling (IBM) context: DEB-IBM. Using the DEB-IBM framework I tested the ability of the DEB theory to predict population-level dynamics from the properties of individuals. We used Daphnia magna as a model species, where data at the individual level was available to parameterize the model, and population-level predictions were compared against independent data from controlled population experiments. We found that DEB theory successfully predicted population growth rates and peak densities of experimental Daphnia populations in multiple experimental settings, but failed to capture the decline phase, when the available food per Daphnia was low. Further assumptions on food-dependent mortality of juveniles were needed to capture the population dynamics after the initial population peak. The resulting model then predicted, without further calibration, characteristic switches between small- and large-amplitude cycles, which have been observed for Daphnia. We conclude that cross-level tests help detecting gaps in current individual-level theories and ultimately will lead to theory development and the establishment of a generic basis for individual-based models and ecology. In addition to theoretical explorations, we tested the potential of DEB theory combined with IBMs to extrapolate effects of chemical stress from the individual to population level. For this we used information at the individual level on the effect of 3,4-dichloroanailine on Daphnia. The individual data suggested direct effects on reproduction but no significant effects on growth. Assuming such direct effects on reproduction, the model was able to accurately predict the population response to increasing concentrations of 3,4-dichloroaniline. We conclude that DEB theory combined with IBMs holds great potential for standardized ecological risk assessment based on ecological models. N2 - Für die ökologische Risikobewertung von Chemikalien sind individuenbasierte Populationsmodelle ein vielversprechendes Werkzeug um heutige Bewertungen ökologisch realistischer zu gestalten. Allerdings ist die Entwicklung und Parametrisierung derartiger Modelle zeitaufwendig und oft wenig systematisch. Standardisierte, geprüfte Untermodelle, die Einzelorganismen beschreiben, würden die individuenbasierte Modellierung effizienter und kohärenter machen. In meiner Dissertation habe ich daher untersucht, inwieweit sich die Dynamic Energy Budget-Theorie (DEB) als Standardmodell innerhalb individuenbasierter Populationsmodelle eignet, und zwar sowohl für die ökologische Risikobewertung als auch für die theoretische Populationsökologie. Zunächst habe ich eine generische Implementierung der DEB-Theorie im Rahmen individuenbasierter Modellen (IBM) erstellt: DEB-IBM. Dieses Werkzeug nutzend habe ich dann untersucht, ob es mit Hilfe der DEB-Theorie gelingt, ausgehend von den Eigenschaften und Aktivitäten einzelner Individuen, Populationsdynamik vorherzusagen. Wir nutzten dabei Daphnia magna als Modellart, für die Daten auf der Individuenebene verfügbar waren, um das Modell zu parametrisieren, sowie Populationsdaten, mit denen Modellvorhersagen verglichen werden konnten. DEB-Theorie war in der Lage, beobachtete Populationswachstumsraten sowie die maximalen Abundanzen korrekt vorherzusagen, und zwar für verschiedene Umweltbedingungen. Für Phasen des Rückgangs der Population allerdings, wenn die für die Daphnien verfügbare Nahrungsmenge gering war, kam es zu Abweichungen. Es waren deshalb zusätzliche Annahmen über nahrungsabhängige Sterblichkeit von juvenilen Daphnien erforderlich, um die gesamte Populationsdynamik korrekt vorherzusagen. Das resultierende Modell konnte dann, ohne weitere Kalibrierungen, den für Daphnien charakteristischen Wechsel zwischen Populationszyklen mit großen und kleinen Amplituden richtig vorhersagen. Wir folgern daraus, daß Ebenen übergreifende Tests dabei helfen, Lücken in aktuellen Theorien über Einzelorganismen aufzudecken Dies trägt zur Theorieentwicklung bei und liefert Grundlagen für individuenbasierte Modellierung und Ökologie. Über diese Grundlagenfragen hinaus haben wir überprüft, ob DEB-Theorie in Kombination mit IBMs es ermöglicht, den Effekt von chemischem Streß auf Individuen auf die Populationsebene zu extrapolieren. Wir nutzten Daten über die Auswirkungen von 3,4 Dichloroanalin auf einzelne Daphnien, die zeigten daß im Wesentlichen die Reproduktion, nicht aber das Wachstum beeinträchtigt ist. Mit entsprechenden Annahmen konnte unser Modell den Effekt auf Populationsebene, für den unabhängige Daten vorlagen, korrekt vorhersagen. DEB-Theorie in Kombination mit individuenbasierter Modellierung birgt somit großes Potential für einen standardisierten modellbasierten Ansatz in der ökologischen Risikobewertung von Chemikalien. KW - Ökologie KW - Ökotoxikologie KW - Populationsdynamik KW - Ecology KW - Ecotoxicology KW - population dynamics Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-67001 ER -