TY - THES A1 - Barbirz, Stefanie T1 - Konservierte Struktur bei genetischer Mosaizität : die Tailspike Proteine dreier Phagen der Familie Podviridae T1 - Tailspike proteins of three Podoviridae : genetic mosaics with conserved hreedimensional structure N2 - Die Tailspike Proteine (TSP) der Bakteriophagen P22, Sf6 und HK620 dienen der Erkennung von Kohlenhydratstrukturen auf ihren gram-negativen Wirtsbakterien und zeigen, von den ersten 110 Aminosäuren des N-Terminus abgesehen, keine Sequenzübereinstimmung. Mit Röntgenkristallstrukturanalyse konnte gezeigt werden, dass HK620TSP und Sf6TSP ebenfalls zu einer parallelen, rechtsgängigen beta-Helix falten, wie dies schon für P22TSP bekannt war. Die Kohlenhydratbindestelle ist bei Sf6TSP im Vergleich zu P22TSP zwischen die Untereinheiten verschoben. N2 - The bacteriophages P22, Sf6 and HK620 need their tailspike proteins (TSP) for recognition of surface carbohydrates on their gram-negative host bacteria. Sequence identity is completely lacking in their C-terminal 500 to 600 amino acids. The three TSP have the same fold, an oligomeric parallel beta-helix, as shown by crystal structure analyses of HK620TSP and Sf6TSP. Compared with P22TSP, the carbohydrate binding site of Sf6TSP is located at the interface between two monomers and not on a single monomer. KW - Bakteriophagen KW - Skleroproteine KW - Helix KW - Lipopolysaccharide KW - parallele beta-Helix KW - genetisches Mosaik KW - Tailspike KW - Kohlenhydrat-Protein-Wechselwirkung KW - parallel beta-helix KW - genetic mosaicism KW - tailspike KW - carbohydrate binding site Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-6885 ER - TY - THES A1 - Andres, Dorothee T1 - Biophysical chemistry of lipopolysaccharide specific bacteriophages T1 - Biophysikalische Chemie der Lipopolysaccharid spezifischen Bakteriophagen N2 - Carbohydrate recognition is a ubiquitous principle underlying many fundamental biological processes like fertilization, embryogenesis and viral infections. But how carbohydrate specificity and affinity induce a molecular event is not well understood. One of these examples is bacteriophage P22 that binds and infects three distinct Salmonella enterica (S.) hosts. It recognizes and depolymerizes repetitive carbohydrate structures of O antigen in its host´s outer membrane lipopolysaccharide molecule. This is mediated by tailspikes, mainly β helical appendages on phage P22 short non contractile tail apparatus (podovirus). The O antigen of all three Salmonella enterica hosts is built from tetrasaccharide repeating units consisting of an identical main chain with a distinguished 3,6 dideoxyhexose substituent that is crucial for P22 tailspike recognition: tyvelose in S. Enteritidis, abequose in S. Typhimurium and paratose in S. Paratyphi. In the first study the complexes of P22 tailspike with its host’s O antigen octasaccharide were characterized. S. Paratyphi octasaccharide binds less tightly (ΔΔG≈7 kJ/mol) to the tailspike than the other two hosts. Crystal structure analysis of P22 tailspike co crystallized with S. Paratyphi octasaccharides revealed different interactions than those observed before in tailspike complexes with S. Enteritidis and S. Typhimurium octasaccharides. These different interactions occur due to a structural rearrangement in the S. Paratyphi octasaccharide. It results in an unfavorable glycosidic bond Φ/Ψ angle combination that also had occurred when the S. Paratyphi octasaccharide conformation was analyzed in an aprotic environment. Contributions of individual protein surface contacts to binding affinity were analyzed showing that conserved structural waters mediate specific recognition of all three different Salmonella host O antigens. Although different O antigen structures possess distinct binding behavior on the tailspike surface, all are recognized and infected by phage P22. Hence, in a second study, binding measurements revealed that multivalent O antigen was able to bind with high avidity to P22 tailspike. Dissociation rates of the polymer were three times slower than for an octasaccharide fragment pointing towards high affinity for O antigen polysaccharide. Furthermore, when phage P22 was incubated with lipopolysaccharide aggregates before plating on S. Typhimurium cells, P22 infectivity became significantly reduced. Therefore, in a third study, the function of carbohydrate recognition on the infection process was characterized. It was shown that large S. Typhimurium lipopolysaccharide aggregates triggered DNA release from the phage capsid in vitro. This provides evidence that phage P22 does not use a second receptor on the Salmonella surface for infection. P22 tailspike binding and cleavage activity modulate DNA egress from the phage capsid. DNA release occurred more slowly when the phage possessed mutant tailspikes with less hydrolytic activity and was not induced if lipopolysaccharides contained tailspike shortened O antigen polymer. Furthermore, the onset of DNA release was delayed by tailspikes with reduced binding affinity. The results suggest a model for P22 infection induced by carbohydrate recognition: tailspikes position the phage on Salmonella enterica and their hydrolytic activity forces a central structural protein of the phage assembly, the plug protein, onto the host´s membrane surface. Upon membrane contact, a conformational change has to occur in the assembly to eject DNA and pilot proteins from the phage to establish infection. Earlier studies had investigated DNA ejection in vitro solely for viruses with long non contractile tails (siphovirus) recognizing protein receptors. Podovirus P22 in this work was therefore the first example for a short tailed phage with an LPS recognition organelle that can trigger DNA ejection in vitro. However, O antigen binding and cleaving tailspikes are widely distributed in the phage biosphere, for example in siphovirus 9NA. Crystal structure analysis of 9NA tailspike revealed a complete similar fold to P22 tailspike although they only share 36 % sequence identity. Moreover, 9NA tailspike possesses similar enzyme activity towards S. Typhimurium O antigen within conserved amino acids. These are responsible for a DNA ejection process from siphovirus 9NA triggered by lipopolysaccharide aggregates. 9NA expelled its DNA 30 times faster than podovirus P22 although the associated conformational change is controlled with a similar high activation barrier. The difference in DNA ejection velocity mirrors different tail morphologies and their efficiency to translate a carbohydrate recognition signal into action. N2 - Kohlenhydraterkennung ist ein fundamentales Prinzip vieler biologischer Prozesse wie z.B. Befruchtung, Embryogenese und virale Infektionen. Wie aber Kohlenhydratspezifität und –affinität in ein molekulares Ereignis übersetzt werden, ist nicht genau verstanden. Ein Beispiel für ein solches Ereignis ist die Infektion des Bakteriophage P22, der drei verschiedene Salmonella enterica (S.) Wirte besitzt. Er erkennt und depolymerisiert die repetitiven Einheiten des O Antigens im Lipopolysaccharid, das sich in der äußeren Membran seines Wirtes befindet. Dieser Schritt wird durch die Tailspikes vermittelt, β helicale Bestandteile des kurzen, nicht kontraktilen Schwanzapparates von P22 (Podovirus). Das O Antigen aller drei Salmonella enterica Wirte besteht aus sich wiederholenden Tetrasacchariden. Sie enthalten die gleiche Hauptkette aber eine spezifische 3,6 Didesoxyhexose Seitenkette, die für die P22 Tailspikeerkennung essentiell ist: Tyvelose in S. Enteritidis, Abequose in S. Typhimurium und Paratose in S. Paratyphi. Im ersten Teil der Arbeit wurde die Komplexbildung von P22 Tailspike mit O Antigen Octasaccharidfragmenten der drei verschiedenen Wirte untersucht. S. Paratyphi Octasaccharide binden mit einer geringeren Affinität (ΔΔG≈7 kJ/mol) an den Tailspike als die beiden anderen Wirte. Die Kristallstrukturanalyse des S. Paratyphi Octasaccharides komplexiert mit P22 Tailspike offenbarten unterschiedliche Interkationen als vorher mit S. Enteritidis und S. Typhimurium Oktasaccharidkomplexen mit Tailspike beobachtet wurden. Diese unterschiedlichen Interaktionen beruhen auf einer strukturellen Änderung in den Φ/Ψ Winkeln der glykosidischen Bindung. Die Beiträge von verschiedenen Proteinoberflächenkontakten zur Affnität wurden untersucht und zeigten, dass konservierte Wasser in der Struktur die spezifische Erkennung aller drei Salmonella Wirte vermittelt. Obwohl die verschiedenen O Antigen Strukturen unterschiedliches Bindungsverhalten auf der Tailspikeoberfläche zeigen, werden alle vom Phagen P22 erkannt und infiziert. Daher wurde in einer zweiten Studie die multivalente Bindung zwischen P22 Tailspike und O Antigen charakterisiert. Die Dissoziationskonstanten des Polymers waren drei Mal langsamer als für das Oktasaccharid allein, was auf eine hohe Affinität des O Antigens schließen lässt. Zusätzlich wurde gezeigt, dass die Aggregate des Lipopolysaccharids in der Lage sind, die Infektiösität vom P22 Phagen zu reduzieren. Ausgehend davon wurde in einer dritten Studie die Bedeutung der Kohlenhydrat Erkennung auf den Infektionsprozess untersucht. Große S. Typhimurium Lipopolysaccharide Aggregate bewirkten die DNA Freisetzung vom P22 Kapsid. Dies deutet darauf, dass der P22 Phage keinen weiteren Rezeptor für die Infektion auf der Oberflächen seines Wirtes verwendet. Zusätzlich moduliert die P22 Tailspike Aktivität den Ausstoss der DNA vom P22 Phagen: Er ist langsamer, wenn der Phage Tailspikes besitzt, die weniger hydrolytisch aktiv sind und wurde nicht induziert, wenn Lipopolysaccharid eingesetzt wurde, dass zuvor mit Tailspike hydrolysiert wurde. Darüber hinaus wurde der Start der DNA Ejektion verzögert, wenn Tailspikes mit verminderter Affinität am Phagen vorhanden waren. Die Ergebnisse führten zu einem Modell für die Infektion von P22: Tailspikes positionieren den Phagen auf Salmonella enterica und ihre Aktivität drückt ein zentrales Strukturprotein des Phagen, das Stöpselprotein, auf die Membranoberfläche. Aufgrund des Membrankontaktes findet eine Konformationsänderung statt die zur Ejektion der Pilotproteine und zur Infektion führt. Vorhergehende Studien haben bisher nur die DNA Ejektion in vitro für Viren mit langen, nicht kontraktilen Schwänzen (Siphoviren) mit Proteinrezeptoren untersucht. In dieser Arbeit wurde das erste Mal die DNA Ejektion für einen Podovirus mit LPS Erkennung in vitro gezeigt. Die O Antigen Erkennung und Spaltung durch Tailspikeproteine gibt es häufig in der Phagenbiosphere, z.B. am Siphovirus 9NA. Die Kristallstrukturanalyse von 9NA Tailspike zeigt eine komplett gleiche Struktur, obwohl beide Proteine nur zu 36% Sequenzidentität besitzen. Zusätzlich hat 9NA Tailspike ähnliche enzymatische Eigenschaften. Diese ist für den DNA Ejektionsprozess im Siphovirus 9NA verantwortlich, der auch durch LPS Agreggate induziert wird. 9NA stößt dabei seine DNA 30 Mal schneller aus als Podovirus P22 obwohl die damit verbundene Konformationsänderung mit einer ähnlich hohen Aktivierungsbarriere kontrolliert wird. Daher spiegeln die Unterschiede in der DNA Ejektionsgeschwindigkeit der verschiedenen Tailmorphologien die Effezienz wieder, mit der die spezifische Kohlenhydraterkennung in ein Signal umgewandelt wird. KW - DNA Ejektion KW - Kohlenhydrat Erkennung KW - Phagen Infektion KW - Tailspike KW - Salmonella KW - DNA ejection KW - carbohydrate recognition KW - phage infection KW - tailspike KW - salmonella Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-59261 ER -