TY - THES A1 - Wettstein, Christoph T1 - Cytochrome c-DNA and cytochrome c-enzyme interactions for the construction of analytical signal chains N2 - Electron transfer (ET) reactions play a crucial role in the metabolic pathways of all organisms. In biotechnological approaches, the redox properties of the protein cytochrome c (cyt c), which acts as an electron shuttle in the respiratory chain, was utilized to engineer ET chains on electrode surfaces. With the help of the biopolymer DNA, the redox protein assembles into electro active multilayer (ML) systems, providing a biocompatible matrix for the entrapment of proteins. In this study the characteristics of the cyt c and DNA interaction were defined on the molecular level for the first time and the binding sites of DNA on cyt c were identified. Persistent cyt c/DNA complexes were formed in solution under the assembly conditions of ML architectures, i.e. pH 5.0 and low ionic strength. At pH 7.0, no agglomerates were formed, permitting the characterization of the NMR spectroscopy. Using transverse relaxation-optimized spectroscopy (TROSY)-heteronuclear single quantum coherence (HSQC) experiments, DNAs’ binding sites on the protein were identified. In particular, negatively charged AA residues, which are known interaction sites in cyt c/protein binding were identified as the main contact points of cyt c and DNA. Moreover, the sophisticated task of arranging proteins on electrode surfaces to create functional ET chains was addressed. Therefore, two different enzyme types, the flavin dependent fructose dehydrogenase (FDH) and the pyrroloquinoline quinone dependent glucose dehydrogenase (PQQ-GDH), were tested as reaction partners of freely diffusing cyt c and cyt c immobilized on electrodes in mono- and MLs. The characterisation of the ET processes was performed by means of electrochemistry and the protein deposition was monitored by microgravimetric measurements. FDH and PQQ-GDH were found to be generally suitable for combination with the cyt c/DNA ML system, since both enzymes interact with cyt c in solution and in the immobilized state. The immobilization of FDH and cyt c was achieved with the enzyme on top of a cyt c monolayer electrode without the help of a polyelectrolyte. Combining FDH with the cyt c/DNA ML system did not succeed, yet. However, the basic conditions for this protein-protein interaction were defined. PQQ-GDH was successfully coupled with the ML system, demonstrating that that the cyt c/DNA ML system provides a suitable interface for enzymes and that the creation of signal chains, based on the idea of co-immobilized proteins is feasible. Future work may be directed to the investigation of cyt c/DNA interaction under the precise conditions of ML assembly. Therefore, solid state NMR or X-ray crystallography may be required. Based on the results of this study, the combination of FDH with the ML system should be addressed. Moreover, alternative types of enzymes may be tested as catalytic component of the ML assembly, aiming on the development of innovative biosensor applications. N2 - In den Energiegewinnungsprozessen der Zellen spielen biochemische Reaktion, die auf Elektronentransfer (ET) basieren, eine wichtige Rolle. So sind die Proteinkomplexe der Atmungskette, welche an der inneren Membran der Mitochondrien abläuft, über eine ET-Kette miteinander verbunden. In biotechnologischen Anwendungen wird dieses Phänomen genutzt um Proteine auf der Oberfläche von Elektroden als funktionierende ET-Ketten zu arrangieren. Dabei kann der ET innerhalb dieser Kaskaden als elektrischer Strom gemessen und als Signal betrachtet werden. Dies ermöglicht die Anwendung von proteinmodifizierten Elektroden als Biosensoren und Biobrennstoffzellen. Ein geeigneter Baustein für den Aufbau vielschichtiger ET-Systeme ist das kleine, eisenhaltige Protein Cytochrom c (Cyt c), welches in der Lage ist Elektronen aufzunehmen, zu transportieren und wieder abzugeben. Als zweiter Baustein dient das lange, fadenartige Biomolekül DNA. DNA und Cyt c interagieren unter bestimmten Bedingungen aufgrund ihrer entgegengesetzten Oberflächenladungen. Dies ermöglicht den schichtweisen Aufbau stabiler Cyt c/DNA-Multischichten (MS) auf Elektrodenoberflächen, welche durch die sogenannte Layer-by-Layer (LbL) Technik aufgebaut werden. In diesen MS Systemen behält Cyt c trotz der Immobilisierung seine Beweglichkeit um die eigene Achse, wodurch der Selbstaustausch von Elektronen zwischen den Cyt c Molekülen sowie der ET zur Elektrode gewährleistet wird. Der molekulare Aufbau der Cyt c/DNA MS sowie die Interaktion zwischen den zwei biologischen Bausteine ist weitgehend unerforscht, daher wurden in der vorliegenden Studie die genauen Bedingungen der Cyt c/DNA Interaktion in Lösung untersucht. Außerdem wird die Eignung des MS Systems zur Einbettung von Enzymen getestet. Die Bausteine des MS-Systems, Cyt c und DNA bilden in Lösung stabile Komplexe unter den Assemblierungsbedingungen der MS (d.h. pH 5.0 und geringe Salzkonzentration). Im Vergleich dazu tritt bei pH 7.0 eine schwächere Interaktion auf, die für eine Komplexbildung nicht ausreicht. Dies ermöglicht die Untersuchung der Interaktion mittels Kernspinresonanzspektroskopie (NMR, engl. nuclear magnetic resonance spectroscopy), wobei die Interaktionsstellen des DNA-Moleküls auf Cyt c bestimmt werden. Im Vergleich zu pH 7.0 wird im leicht sauren pH-Bereich (6.0) eine erhöhte Anzahl an Interaktionspunkten gefunden, was Rückschlüsse auf eine erhöhte Interaktion zulässt. Dies resultiert schließlich in der starken Bindung bei pH 5.0, die den Aufbau stabiler Cyt c/DNA-MS auf Elektrodenoberflächen ermöglicht. Darüber hinaus spielen der Salzgehalt der Lösung sowie das Konzentrationsverhältnis von Cyt c und DNA eine wichtige Rolle. Auf der Grundlage des Cyt c/DNA-MS Aufbaus sollte durch die Kopplung eines Enzymes eine Signalkette mit sensorischen Eigenschaften geschaffen werden. Das Enzym dient dabei als Erkennungselement für bestimmte Moleküle in Lösung. Durch die Reaktion des Enzyms mit dem Molekül wird ein bioelektrisches Signal generiert, das durch elektrochemische Methoden gemessen wird. Dies wurde mit zwei verschiedenen Enzymen, der Glukose Dehydrogenase (GDH) und der Fruktose Dehydrogenase (FDH), untersucht. Beide Enzyme waren in der Lage mit einer Cyt c Monoschicht zu kommunizieren und konnten mit dem redox Protein auf der Elektrodenoberfläche immobilisiert werden. GDH konnte erfolgreich mit dem Cyt c/DNA-MS System gekoppelt und die Sensoreigenschaften der so aufgebauten Elektronentransferkette charakterisiert werden. Zusammenfassend charakterisiert diese Arbeit die Bedingungen der Cyt c/DNA-Komplexbildung und gibt einen Einblick in die bisher unbekannte Interaktion zwischen Cyt c und DNA auf der molekularen Ebene. Darüber hinaus wird die Nutzbarkeit des Cyt c/DNA MS Systems zur Einbettung von Enzymen am Beispiel der GDH gezeigt und schafft somit die Grundlage für das bessere Verständnis von ET Reaktionen zwischen Proteinen auf Elektrodenoberflächen. T2 - Cytochrom c-DNA und Cytochrom c-Enzym Interaktion für den Aufbau analytischer Signalketten KW - biosensor KW - protein KW - DNA KW - enzyme KW - interaction KW - DNA KW - Biosensor KW - Enzym KW - Interaktion KW - Protein Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-78367 ER - TY - THES A1 - Koerting, Friederike Magdalena T1 - Hybrid imaging spectroscopy approaches for open pit mining T1 - Hybride Ansätze der bildgebenden Spektroskopie für offene Tagebauten BT - applications for virtual mine face geology BT - Anwendungen für die virtuelle geologische Kartierung von Abbaufronten N2 - This work develops hybrid methods of imaging spectroscopy for open pit mining and examines their feasibility compared with state-of-the-art. The material distribution within a mine face differs in the small scale and within daily assigned extraction segments. These changes can be relevant to subsequent processing steps but are not always visually identifiable prior to the extraction. Misclassifications that cause false allocations of extracted material need to be minimized in order to reduce energy-intensive material re-handling. The use of imaging spectroscopy aspires to the allocation of relevant deposit-specific materials before extraction, and allows for efficient material handling after extraction. The aim of this work is the parameterization of imaging spectroscopy for pit mining applications and the development and evaluation of a workflow for a mine face, ground- based, spectral characterization. In this work, an application-based sensor adaptation is proposed. The sensor complexity is reduced by down-sampling the spectral resolution of the system based on the samples’ spectral characteristics. This was achieved by the evaluation of existing hyperspectral outcrop analysis approaches based on laboratory sample scans from the iron quadrangle in Minas Gerais, Brazil and by the development of a spectral mine face monitoring workflow which was tested for both an operating and an inactive open pit copper mine in the Republic of Cyprus. The workflow presented here is applied to three regional data sets: 1) Iron ore samples from Brazil, (laboratory); 2) Samples and hyperspectral mine face imagery from the copper-gold-pyrite mine Apliki, Republic of Cyprus (laboratory and mine face data); and 3) Samples and hyperspectral mine face imagery from the copper-gold-pyrite deposit Three Hills, Republic of Cyprus (laboratory and mine face data). The hyperspectral laboratory dataset of fifteen Brazilian iron ore samples was used to evaluate different analysis methods and different sensor models. Nineteen commonly used methods to analyze and map hyperspectral data were compared regarding the methods’ resulting data products and the accuracy of the mapping and the analysis computation time. Four of the evaluated methods were determined for subsequent analyses to determine the best-performing algorithms: The spectral angle mapper (SAM), a support vector machine algorithm (SVM), the binary feature fitting algorithm (BFF) and the EnMap geological mapper (EnGeoMap). Next, commercially available imaging spectroscopy sensors were evaluated for their usability in open pit mining conditions. Step-wise downsampling of the data - the reduction of the number of bands with an increase of each band’s bandwidth - was performed to investigate the possible simplification and ruggedization of a sensor without a quality fall-off of the mapping results. The impact of the atmosphere visible in the spectrum between 1300–2010nm was reduced by excluding the spectral range from the data for mapping. This tested the feasibility of the method under realistic open pit data conditions. Thirteen datasets based on the different, downsampled sensors were analyzed with the four predetermined methods. The optimum sensor for spectral mine face material distinction was determined as a VNIR-SWIR sensor with 40nm bandwidths in the VNIR and 15nm bandwidths in the SWIR spectral range and excluding the atmospherically impacted bands. The Apliki mine sample dataset was used for the application of the found optimal analyses and sensors. Thirty-six samples were analyzed geochemically and mineralogically. The sample spectra were compiled to two spectral libraries, both distinguishing between seven different geochemical-spectral clusters. The reflectance dataset was downsampled to five different sensors. The five different datasets were mapped with the SAM, BFF and SVM method achieving mapping accuracies of 85-72%, 85-76% and 57-46% respectively. One mine face scan of Apliki was used for the application of the developed workflow. The mapping results were validated against the geochemistry and mineralogy of thirty-six documented field sampling points and a zonation map of the mine face which is based on sixty-six samples and field mapping. The mine face was analyzed with SAM and BFF. The analysis maps were visualized on top of a Structure-from-Motion derived 3D model of the open pit. The mapped geological units and zones correlate well with the expected zonation of the mine face. The third set of hyperspectral imagery from Three Hills was available for applying the fully-developed workflow. Geochemical sample analyses and laboratory spectral data of fifteen different samples from the Three Hills mine, Republic of Cyprus, were used to analyse a downsampled mine face scan of the open pit. Here, areas of low, medium and high ore content were identified. The developed workflow is successfully applied to the open pit mines Apliki and Three Hills and the spectral maps reflect the prevailing geological conditions. This work leads through the acquisition, preparation and processing of imaging spectroscopy data, the optimum choice of analysis methodology, and the utilization of simplified, robust sensors that meet the requirements of open pit mining conditions. It accentuates the importance of a site-specific and deposit-specific spectral library for the mine face analysis and underlines the need for geological and spectral analysis experts to successfully implement imaging spectroscopy in the field of open pit mining. N2 - In dieser Dissertation wird die Machbarkeit und Anwendung moderner und eines eigen entwickelten Hybridverfahrens in der bildgebenden Spektroskopie für den Tagebau untersucht. Die Materialverteilung innerhalb einer Abbaufront unterscheidet sich oft innerhalb eines kleinen Maßstabs und variiert zudem innerhalb täglich zugeordneter Abbausegmente. Diese Veränderungen können für nachfolgende Verarbeitungsschritte relevant sein, sind aber vor dem Abbau nicht immer visuell erkennbar. Falsche Klassifizierungen des Materials führen zu Fehlverteilungen des abgebauten Materials, die minimiert werden müssen, um den energie-intensiven Materialtransport zu reduzieren. Mit Hilfe der bildgebenden Spektroskopie wird angestrebt, relevante Lagerstättenspezifische Materialien vor der Extraktion korrekt zuzuordnen und ein effizientes Materialhandling nach der Extraktion zu ermöglichen. Ziel dieser Arbeit ist die Parametrisierung der bildgebenden Spektroskopie für den Bergbau und die Entwicklung und Evaluierung eines Workflows zur spektralen Charakterisierung von offenem Bergbau mittels bodengebundener Sensorik. Dies wurde durch die Evaluierung bestehender Ansätze zur hyperspektralen Aufschlussanalyse erreicht, die auf Grundlage von Laborscans von Proben aus dem Eisernen Vierecks in Minas Gerais, Brasilien, durchgeführt wurde. Eine spektralen Abbaufrontanalyse wurde mithilfe von Daten eines aktiven und eines inaktiven Kupfer-Tagebaus in der Republik Zypern entwickelt. Der in dieser Arbeit vorgestellte Arbeitsablauf wird auf drei regionale Datensätze angewandt: 1) Eisenerzproben aus Brasilien (Labordaten); 2) Proben und hyperspektrale bildgebende Daten der Abbaufront aus dem Kupfer-Gold-Pyrit-Tagebau Apliki, Republik Zypern (Labor- und Abbaufrontdaten); und 3) Proben und hyperspektrale bildgebende Daten der Abbaufront aus der Kupfer-Gold-Pyrit-Lagerstätte Three Hills, Republik Zypern (Labor- und Abbaufrontdaten). Der hyperspektrale Labordatensatz von fünfzehn brasilianischen Eisenerzproben wurde zur Evaluierung verschiedener Analysemethoden und verschiedener Sensormodelle verwendet. Neunzehn gebräuchliche Methoden zur Analyse und Kartierung hyperspektraler Daten wurden im Hinblick auf ihre resultierenden Datenprodukte, die Genauigkeit der Kartierung und die Berechnungszeit der Analyse verglichen. Vier der evaluierten Methoden wurden für nachfolgende Analysen bestimmt: Der Spectral Angle Mapper (SAM), ein Support Vector Machine Algorithmus (SVM), der Binary Feature Fitting Algorithmus (BFF) und der EnMap Geological Mapper (EnGeoMap). Als nächstes wurden kommerziell erhältliche bildgebende Spektroskopiesensoren auf ihre Verwendbarkeit unter Tagebaubedingungen evaluiert. Ein schrittweises Reduzieren der Datenkomplexität, das sog. “downsampling” (die Verringerung der Anzahl der Bänder und gleichzeitige Erhöhung der Bandbreite jedes Bandes), wurde durchgeführt, um eine Vereinfachung der Sensorkomplexität ohne Qualitätseinbußen der Kartierungsergebnisse zu untersuchen. Der Einfluss der Atmosphäre, die im Spektrum zwischen 1300-2010nm sichtbar ist, wurde reduziert, indem der Spektralbereich aus den Daten für die Kartierung ausgeschlossen wurde. Dadurch wurde die Durchführbarkeit der Methode unter realistischen Tagebaubedingungen getestet. Dreizehn Datensätze, die auf den verschiedenen Sensoren basierten, wurden mit den vier vorher benannten Methoden analysiert. Der optimale Sensor für die spektrale Unterscheidung von Abbaufrontmaterial wurde als VNIR-SWIR-Sensor mit 40nm Bandbreite im VNIR- und 15nm Bandbreite im SWIR-Spektralbereich bestimmt, der atmosphärisch beeinflusste Spektralbereich wurde ausgeschlossen. Nun wurde der Datensatz von der Mine in Apliki verwendet, um die vorher bestimmten Analysen und Sensoren anzuwenden. Sechsunddreißig Proben wurden geochemisch und mineralogisch analysiert. Die Probenspektren wurden zu zwei Spektralbibliotheken zusammengestellt, die beide zwischen sieben verschiedenen geochemisch-spektralen Clustern unterscheiden. Die Reflexionsdaten wurden auf fünf verschiedene Sensoren heruntergerechnet. Diese fünf verschiedenen Datensätze wurden mit der SAM-, BFF- und SVM-Methode kartiert, wobei entsprechende Kartierungsgenauigkeiten von 85-72%, 85-76% bzw. 57-46% erreicht wurden. Ein Scan der Abbaufront von Apliki wurde verwendet, um den entwickelten Arbeitsablauf auf Daten unter realistische Bedingungen anzuwenden. Die Kartierungsergebnisse wurden auf der Grundlage der Feldbeprobung und einer geologischen Zonierungskarte der Abbaufront validiert. Die Abbaufront wurde mit SAM und BFF analysiert und die Analysekarten wurden auf einem von „Structure-from-Motion“ abgeleiteten 3D-Modell des Tagebaus visualisiert. Die kartographierten geologischen Einheiten und Zonen korrelierten gut mit der erwarteten Zonierung der Abbaufront. Ein dritter Datensatz stand für die Anwendung des entwickelten Arbeitsablaufs zur Verfügung. Geochemische Probenanalysen und Laborspektraldaten von fünfzehn verschiedenen Proben aus dem offenen Tagebau Three Hills in der Republik Zypern wurden zur Analyse eines Datensatzes der Abbaufron des Tagebaus verwendet. Dabei wurden Bereiche mit niedrigem, mittlerem und hohem Erzgehalt identifiziert. Der in der Arbeit entwickelte Arbeitsablauf konnte erfolgreich für die offenen Tagebaue Apliki und Three Hills angewandt werden. Die errechneten Spektralgeologischen Karten stellen die örtliche geologische Situation korrekt dar. Der entwickelte Arbeitsablauf erläutert die Erfassung, Aufbereitung und Verarbeitung von Daten aus der bildgebenden Spektroskopie und beschreibt die Wahl der Analysemethodik sowie die Verwendung robuster Sensoren, die den Anforderungen der Tagebaubedingungen entsprechen. Sie hebt die Bedeutung einer standort- und lagerstättenspezifischen Spektralbibliothek für die Analyse von Abbaufronten hervor und unterstreicht die nötige Einbindung von Experten im Bereich der Geologie und der Spektralanalyse für eine erfolgreiche Implementierung der bildgebenden Spektroskopie im Kontext des Abbaus von Material in offenen Tagebauten. KW - hyperspectral KW - imaging spectroscopy KW - porphyry copper deposit KW - Porphyrische Kupferlagerstätte KW - hyperspektral KW - Abbildende Spektroskopie KW - mine face mapping KW - Abbaufrontkartierung KW - open pit mining KW - offener Tagebau Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-499091 ER - TY - THES A1 - Fischbach, Jens T1 - Isothermale Amplifikationsmethoden für den DNA- und Pyrophosphat-abhängigen Pathogennachweis T1 - Isothermal amplification methods for DNA- and pyrophophate based pathogen detection N2 - Hintergrund: Etablierte Protein- und Nukleinsäure-basierte Methoden für den spezifischen Pathogennachweis sind nur unter standardisierten Laborbedingungen von geschultem Personal durchführbar und daher mit einem hohen Zeit- und Kostenaufwand verbunden. In der Nukleinsäure-basierten Diagnostik kann durch die Einführung der isothermalen Amplifikation eine schnelle und kostengünstige Alternative zur Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet werden. Die Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) bietet aufgrund der hohen Amplifikationseffizienz vielfältige Detektionsmöglichkeiten, die sowohl für Schnelltest- als auch für Monitoring-Anwendungen geeignet sind. Ein wesentliches Ziel dieser Arbeit war die Verbesserung der Anwendbarkeit der LAMP und die Entwicklung einer neuen Methode für den einfachen, schnellen und günstigen Nachweis von Pathogenen mittels alternativer DNA- oder Pyrophosphat-abhängiger Detektionsverfahren. Hier wurden zunächst direkte und indirekte Detektionsmethoden untersucht und darauf aufbauend ein Verfahren entwickelt, mit dem neue Metallionen-abhängige Fluoreszenzfarbstoffe für die selektive Detektion von Pyrophosphat in der LAMP und anderen enzymatischen Reaktionen identifiziert werden können. Als Alternative für die DNA-basierte Detektion in der digitalen LAMP sollten die zuvor etablierten Farbstoffe für den Pyrophosphatnachweis in einer Emulsion getestet werden. Abschließend wurde ein neuer Reaktionsmechanismus für die effiziente Generierung hochmolekularer DNA unter isothermalen Bedingungen als Alternative zur LAMP entwickelt. Ergebnisse: Für den Nachweis RNA- und DNA-basierter Phythopathogene konnte die Echtzeit- und Endpunktdetektion mit verschiedenen Farbstoffen in einem geschlossenen System etabliert werden. Hier wurde Berberin als DNA-interkalierender Fluoreszenzfarbstoff mit vergleichbarer Sensitivität zu SYBR Green und EvaGreen erfolgreich in der LAMP mit Echtzeitdetektion eingesetzt. Ein Vorteil von Berberin gegenüber den anderen Farbstoffen ist die Toleranz der DNA-Polymerase auch bei hohen Farbstoffkonzentrationen. Berberin kann daher auch in der geschlossenen LAMP-Reaktion ohne zusätzliche Anpassung der Reaktionsbedingungen für die Endpunktdetektion verwendet werden. Darüber hinaus konnte Hydroxynaphtholblau (HNB), das für den kolorimetrischen Endpunktnachweis bekannt ist, erstmals auch für die fluorimetrische Detektion der LAMP in Echtzeit eingesetzt werden. Zusätzlich konnten in der Arbeit weitere Metallionen-abhängige Farbstoffe zur indirekten Detektion der LAMP über das Pyrophosphat identifiziert werden. Dafür wurde eine iterative Methode entwickelt, mit der potenzielle Farbstoffe hinsichtlich ihrer Enzymkompatibilität und ihrer spektralen Eigenschaften bei An- oder Abwesenheit von Manganionen selektiert werden können. Mithilfe eines kombinatorischen Screenings im Mikrotiterplattenformat konnte die komplexe Konzentrationsabhängigkeit zwischen den einzelnen Komponenten für einen fluorimetrischen Verdrängungsnachweis untersucht werden. Durch die Visualisierung des Signal-Rausch-Verhältnis’ als Intensitätsmatrix (heatmap) konnten zunächst Alizarinrot S und Tetrazyklin unter simulierten Reaktionsbedingungen selektiert werden. In der anschließenden enzymatischen LAMP-Reaktion konnte insbesondere Alizarinrot S als günstiger, nicht-toxischer und robuster Fluoreszenzfarbstoff identifiziert werden und zeigte eine Pyrophosphat-abhängige Zunahme der Fluoreszenzintensität. Die zuvor etablierten Farbstoffe (HNB, Calcein und Alizarinrot S) konnten anschließend erfolgreich für die indirekte, fluorimetrische Detektion von Pyrophosphat in einer LAMP-optimierten Emulsion eingesetzt werden. Die Stabilität und Homogenität der generierten Emulsion wurde durch den Zusatz des Emulgators Poloxamer 188 verbessert. Durch die fluoreszenzmikroskopische Analyse der Emulsion war eine eindeutige Diskriminierung der positiven und negativen Tröpfchen vor allem bei Einsatz von Calcein und Alizarinrot S möglich. Aufgrund des komplexen Primer-Designs und der hohen Wahrscheinlichkeit unspezifischer Amplifikation in der LAMP wurde eine neue Bst DNA-Polymerase-abhängige isothermale Amplifikationsreaktion entwickelt. Durch die Integration einer spezifischen Linkerstruktur (abasische Stelle oder Hexaethylenglykol) zwischen zwei Primersequenzen konnte ein bifunktioneller Primer die effiziente Regenerierung der Primerbindungsstellen gewährleisten. Der neue Primer induziert nach der spezifischen Hybridisierung auf dem Templat die Rückfaltung zu einer Haarnadelstruktur und blockiert gleichzeitig die Polymeraseaktivität am Gegenstrang, wodurch eine autozyklische Amplifikation trotz konstanter Reaktionstemperatur möglich ist. Die Effizienz der „Hinge-initiated Primer dependent Amplification“ (HIP) konnte abschließend durch die Verkürzung der Distanz zwischen einem modifizierten Hinge-Primer und einem PCR-ähnlichen Primer verbessert werden. Schlussfolgerung: Die LAMP hat sich aufgrund der hohen Robustheit und Effizienz zu einer leistungsfähigen Alternative für die klassische PCR in der molekularbiologischen Diagnostik entwickelt. Unterschiedliche Detektionsverfahren verbessern die Leistungsfähigkeit der qualitativen und quantitativen LAMP für die Feldanwendungen und für die Diagnostik, da die neuen DNA- und Pyrophosphat-abhängigen Nachweismethoden in einer geschlossenen Reaktion eingesetzt werden können und so eine einfache Pathogendiagnostik ermöglichen. Die gezeigten Methoden können darüber hinaus zu einer Kostensenkung und Zeitersparnis gegenüber den herkömmlichen Methoden beitragen. Ein attraktives Ziel stellt die Weiterentwicklung der HIP für den Pathogennachweis als Alternative zur LAMP dar. Hierbei können die neuen LAMP-Detektionsverfahren ebenfalls Anwendung finden. Die Verwendung von Bst DNA-Polymerase-abhängigen Reaktionen ermöglicht darüber hinaus die Integration einer robusten isothermalen Amplifikation in mikrofluidische Systeme. Durch die Kombination der Probenvorbereitung, Amplifikation und Detektion sind zukünftige Anwendungen mit kurzer Analysezeit und geringem apparativen Aufwand insbesondere in der Pathogendiagnostik möglich. N2 - Background: Established protein- and nucleic acid-based methods for the specific pathogen detection are usually performed under standardized laboratory conditions by trained staff and are associated with long processing time and high costs. In nucleic acid-based pathogen diagnostics, the isothermal amplification can be used as a rapid and cost-effective alternative to the polymerase chain reaction (PCR). Among all isothermal techniques, the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) offers a wide range of applications for the rapid endpoint and real-time detection. A major goal of this work, was to improve the applicability of LAMP and the development of a new method to get a simple, fast and cost-effective diagnostic tool that is based on the detection of DNA and pyrophosphate. For this purpose, direct and indirect detection methods were investigated as well as additional metal ion-dependent fluorescent dyes for the selective detection of pyrophosphate in LAMP or other enzymatic reactions identified. As an alternative to the DNA-based digital LAMP, the previously established dyes were tested for the detection of pyrophosphate in emulsion. Finally, a new reaction mechanism was developed that allows the efficient generation of high molecular weight DNA under isothermal reaction conditions. Results: The detection of RNA- and DNA-based phytopathogens in closed reactions was established successfully with different dyes for real-time and endpoint detection. Berberine as DNA-intercalating fluorescent dye was used in the real-time detection of LAMP with comparable sensitivity to SYBR Green and EvaGreen for the first time. Additionally, the results revealed adequate tolerance of the Bst DNA polymerase to higher concentrations of the dye. Thus, it could be used directly in a closed LAMP reaction without any optimization. Furthermore, the magnesium indicator hydroxynaphthol blue (HNB) was used for fluorometric real-time detection in LAMP for the first time. To extend the number of indirect detection methods for the accumulating pyrophosphate in LAMP and other enzymatic reactions, new metal-ion-dependent dyes were identified. The developed platform could support the iterative process of finding new fluorescent dyes with regard to enzyme compatibility and their spectral properties in the presence or absence of manganese ions. To obtain a selective fluorometric displacement assay, the complex concentration dependence between all components was investigated successfully by the establishment of a combinatorial screening in a microtiter plate. The visualization of the calculated signal-to-noise ratio was then used to identify alizarin red S and tetracycline as promising candidates under simulated reaction conditions. By testing both dyes in the enzymatic assay, alizarin red S was confirmed as low-cost, non-toxic and robust dye for the pyrophosphate dependent increase of the fluorescence intensity. The previously established dyes (HNB, calcein and alizarin red S) were applied successfully for the indirect and fluorometric detection of pyrophosphate in a LAMP-optimized emulsion. The stability and homogeneity of the generated emulsion was increased by adding the surfactant poloxamer 188. The fluorescence microscopic analysis showed a distinct discrimination between positive and negative droplets, in particular by using calcein, HNB and alizarin red S. Additionally, a new amplification reaction that is also based on the Bst DNA polymerase was developed to prevent the complicated primer design and likelihood of unspecific amplification in LAMP. The efficient regeneration of the single stranded priming site was achieved by the integration of a specific linker (abasic site or hexaethylenglycol) between two priming sites to create a bifunctional hinge-primer. After the hybridization on the template sequence, the hinge-primer was used to induce the refolding to a hairpin structure and for blocking the polymerase activity on the reverse strand. Thus, an autocyclic amplification can be achieved at isothermal reaction conditions. Finally, the efficiency of the hinge-initiated primer dependent amplification (HIP) was improved by decreasing the distance between the modified hinge-primer and the corresponding PCR-like primer. Conclusion: Due to its robustness and efficiency, LAMP has been developed to a powerful alternative for the standardized PCR-based diagnostics in molecular biology in the past years. Different detection methods improve the performance of the qualitative and quantitative LAMP in field applications as well as in diagnostics. The new DNA and pyrophosphate based assays can be used in closed reactions and contribute to a simple pathogen detection. Furthermore, the advancements can lead to a considerable reduction of costs and time compared to conventional methods. An attractive achievement is the further optimization of the HIP as sensitive pathogen assay by using LAMP-based detection methods. The use of Bst DNA polymerasedependent reactions will allow a robust integration of the isothermal amplification in microfluidic systems. By combining sample preparation, amplification and detection in one device, powerful applications with short analysis time and low instrumental requirements are a future perspective in pathogen diagnostics. KW - isothermale Amplifikation KW - isothermal amplification KW - Pyrophosphat KW - pyrophosphate KW - DNA KW - DNA KW - Pathogen KW - pathogen KW - LAMP KW - LAMP Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-406072 ER - TY - THES A1 - Stanke, Sandra T1 - AC electrokinetic immobilization of influenza viruses and antibodies on nanoelectrode arrays for on-chip immunoassays T1 - AC elektrokinetische Immobilisierung von Influenzaviren und Antikörpern auf Nanoelektrodenarrays für on-Chip Immunoassays N2 - In the present thesis, AC electrokinetic forces, like dielectrophoresis and AC electroosmosis, were demonstrated as a simple and fast method to functionalize the surface of nanoelectrodes with submicrometer sized biological objects. These nanoelectrodes have a cylindrical shape with a diameter of 500 nm arranged in an array of 6256 electrodes. Due to its medical relevance influenza virus as well as anti-influenza antibodies were chosen as a model organism. Common methods to bring antibodies or proteins to biosensor surfaces are complex and time-consuming. In the present work, it was demonstrated that by applying AC electric fields influenza viruses and antibodies can be immobilized onto the nanoelectrodes within seconds without any prior chemical modification of neither the surface nor the immobilized biological object. The distribution of these immobilized objects is not uniform over the entire array, it exhibits a decreasing gradient from the outer row to the inner ones. Different causes for this gradient have been discussed, such as the vortex-shaped fluid motion above the nanoelectrodes generated by, among others, electrothermal fluid flow. It was demonstrated that parts of the accumulated material are permanently immobilized to the electrodes. This is a unique characteristic of the presented system since in the literature the AC electrokinetic immobilization is almost entirely presented as a method just for temporary immobilization. The spatial distribution of the immobilized viral material or the anti-influenza antibodies at the electrodes was observed by either the combination of fluorescence microscopy and deconvolution or by super-resolution microscopy (STED). On-chip immunoassays were performed to examine the suitability of the functionalized electrodes as a potential affinity-based biosensor. Two approaches were pursued: A) the influenza virus as the bio-receptor or B) the influenza virus as the analyte. Different sources of error were eliminated by ELISA and passivation experiments. Hence, the activity of the immobilized object was inspected by incubation with the analyte. This resulted in the successful detection of anti-influenza antibodies by the immobilized viral material. On the other hand, a detection of influenza virus particles by the immobilized anti-influenza antibodies was not possible. The latter might be due to lost activity or wrong orientation of the antibodies. Thus, further examinations on the activity of by AC electric fields immobilized antibodies should follow. When combined with microfluidics and an electrical read-out system, the functionalized chips possess the potential to serve as a rapid, portable, and cost-effective point-of-care (POC) device. This device can be utilized as a basis for diverse applications in diagnosing and treating influenza, as well as various other pathogens. N2 - In der vorliegenden Arbeit wurden AC elektrokinetische Kräfte, wie die Dielektrophorese und die AC Elektroosmose, als einfache und schnelle Methode zur Funktionalisierung der Oberfläche von Nanoelektroden mit biologischen Objekten in Submikrometergröße demonstriert. Diese Nanoelektroden haben eine zylindrische Form mit einem Durchmesser von 500 nm und sind in einem Array aus 6256 Elektroden angeordnet. Aufgrund ihrer medizinischen Relevanz wurden Influenzaviren sowie anti-Influenza Antikörper als Modellorganismus ausgewählt. Gängige Methoden, um Antikörper oder Proteine auf Biosensoroberflächen zu bringen, sind komplex und zeitaufwändig. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass durch die Anwendung elektrischer Wechselfelder Influenzaviren und Antikörper innerhalb von Sekunden auf den Nanoelektroden immobilisiert werden können, ohne dass zuvor eine chemische Modifikation der Oberfläche noch des immobilisierten biologischen Objekts erforderlich ist. Die Verteilung dieser immobilisierten Objekte ist über das gesamte Array ungleichmäßig. Es kommt zur Ausbildung eines Gradienten, welcher von der äußeren zur den inneren Reihen hin abnimmt. Verschiedene Ursachen für diesen Gradienten wurden diskutiert, beispielsweise der Vortex-förmige Flüssigkeitsstrom über den Nanoelektroden, der unter anderem durch elektrothermische Flüssigkeitsbewegung erzeugt wird. Es wurde gezeigt, dass Teile des akkumulierten Materials dauerhaft an den Elektroden immobilisiert sind. Dies ist ein Alleinstellungsmerkmal des vorgestellten Systems, da in der Literatur die AC elektrokinetische Immobilisierung fast ausschließlich als Methode nur zur temporären Immobilisierung dargestellt wird. Die räumliche Verteilung des immobilisierten Virusmaterials bzw. der anti-Influenza Antikörper an den Elektroden wurde entweder durch die Kombination aus Fluoreszenzmikroskopie und Dekonvolution oder durch super-resolution Mikroskopie (STED) betrachtet. Es wurden On-Chip-Immunoassays durchgeführt, um die Eignung der funktionalisierten Elektroden für einen potenziellen affinitätsbasierten Biosensor zu untersuchen. Dabei wurden zwei Ansätze verfolgt: A) Influenzaviren als Biorezeptor oder B) Influenzavirus als Analyt. Verschiedene Fehlerquellen wurden mittels ELISA und Passivierungsexperimente eliminiert. Infolgedessen wurde die Aktivität der immobilisierten Objekte durch Inkubation mit dem Analyten überprüft. Dies führte zum erfolgreichen Nachweis von anti-Influenza Antikörpern mittels immobilisiertem Virusmaterial. Andererseits war ein Nachweis von Influenzaviruspartikeln durch die immobilisierten anti-Influenza Antikörper nicht möglich. Letzteres könnte auf einen Aktivitätsverlust oder eine falsche Ausrichtung der Antikörper zurückzuführen sein. Daher sollten weitere Untersuchungen zur Aktivität von durch elektrische Wechselfelder immobilisierte Antikörper folgen. In Kombination mit Mikrofluidik und einem elektrischen Auslesesystem besitzen die funktionalisierten Chips das Potenzial, als schnelle, tragbare und kostengünstige Point-of-Care-Einheit (POC) zu dienen. Dieses Einheit kann als Grundlage für vielfältige Anwendungen bei der Diagnose und Behandlung von Influenza und verschiedenen anderen Krankheitserregern genutzt werden. KW - AC electrokinetics KW - AC Elektrokinetik KW - AC electroosmosis KW - AC Elektroosmosis KW - dielectrophoresis KW - Dielektrophorese KW - virus KW - Virus KW - influenza KW - Influenza KW - antibody KW - Antikörper KW - nanoelectrodes KW - Nanoelektroden KW - lab-on-chip KW - lab-on-chip KW - LOC KW - LOC KW - point-of-care KW - point-of-care KW - POC KW - POC KW - immunoassay KW - Immunoassay Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-617165 ER -