TY - THES A1 - Dehm, Daniel T1 - Development of concepts for the genomic mining of novel secondary metabolites in symbiotic cyanobacteria N2 - Naturstoffe sind seit der goldenen Ära der Antibiotika von immer größerem Interesse, sowohl für die Grundlagenforschung als auch die Angewandten Wissenschaften, da sie die Hauptquelle für neuartige Pharmazeutika mit starken antibiotischen, anti-entzündlichen und Antitumor-Aktivitäten darstellen. Neben den technologischen Fortschritten im Bereich der Hochdurchsatz Genomsequenzierung und dem verbesserten Verständnis des modularen Aufbaus der Biosynthesewege von Sekundärmetaboliten, kam es auch zu einem Wechsel vom labor-gestützten Screening aktiver Zellextrakte hin zum Algorithmen-basierten in silico Screening nach neuen Naturstoff-Biosyntheseclustern. Obwohl die steigende Zahl verfügbarer Genomsequenzen zeigte, dass nicht-ribosomale Peptid-Synthetasen (NRPS), Polyketid-Synthasen (PKS), und ribosomal synthetisierte und posttranslational modifizierte Peptide (RiPPs) ubiquitär in allen Sparten des Lebens gefunden werden können, so zeigen einige Phyla wie Actinobakterien oder Cyanobakterien eine besonders hohe Dichte an Sekundärmetabolitclustern. Der fakultativ symbiotische, N2-fixierende Modellorganismus N. punctiforme PCC73102 ist ein terrestrisches typ-IV Cyanobakterium, welches nicht nur einen besonders hohen Anteil seines Genoms der Produktion von Sekundärmetaboliten widmet, sondern zusätzlich noch genetisch modifizierbar ist. Eine AntiSMASH Analyse des Genoms zeigte, dass N. punctiforme insgesamt sechzehn potentielle Sekundärmetabolitcluster besitzt, von denen aber bis heute nur zweien ein spezifisches Produkt zugewiesen werden konnte. Das macht N. punctiforme zu einem perfekten Testorganismus für die Entwicklung eines neuartigen kombinatorischen Genomic Mining Ansatzes zur Detektion von bislang unbeschriebenen Naturstoffen. Der neuartige Ansatz, der im Rahmen dieser Studie entwickelt wurde, stellt eine Kombination aus Genomic Mining, unabhängigen Monitoring-Techniken sowie modifizierten Kultivierungsbedingungen dar und führte nicht nur zu neuen Erkenntnissen im Bereich cyanobakterieller Naturstoffsynthese, sondern letztlich auch zur Entdeckung eines neuen, von N. punctiforme produzierten, Naturstoffs. Die Herstellung und Untersuchung einer Reporterstamm Bibliothek, bestehend aus je einem CFP-produzierenden Transkriptionsreporter für jedes der sechzehn Sekundärmetabolitcluster von N. punctiforme, zeigte, dass im Gegensatz zur Erwartung nicht alle Biosynthesecluster für die man kein Produkt nachweisen kann auch nicht exprimiert werden. Stattdessen konnten klar definierbare Expressionsmuster beschrieben werden, was deutlich machte, dass die Naturstoffproduktion einer engen Regulation unterliegt und nur ein kleiner Teil der Biosynthesecluster unter Standardbedingungen tatsächlich still sind. Darüber hinaus führte die Erhöhung der Lichtintensität sowie der Kohlenstoffdioxid-Verfügbarkeit zusammen mit der Kultivierung von N. punctiforme zu extrem hohen Zelldichten zu einer starken Erhöhung der gesamten metabolischen Aktivität des Organismus. Nähere Untersuchungen der Zellextrakte dieser hoch-dichte Kultivierungen führten letztlich zur Entdeckung einer neuartigen Gruppe von Microviridinen mit verlängerter Peptidsequenz, welche Microviridin N3-N9 genannt wurden. Sowohl die Kultivierung der Transkriptionsreporter als auch die RTqPCR-basierte Untersuchung der Transkriptionslevel der verschiedenen Biosynthesecluster zeigten, dass die hoch-Zelldichte Kultivierung von N. punctiforme zu einer Aktivierung von 50% der vorhandenen Sekundärmetabolitcluster führt. Im Gegensatz zu dieser sehr breit-gefächerten Aktivierung, führt die Co-Kultivierung von N. punctiforme in chemischen oder physischen Kontakt zu einer N-gehungerten Wirtspflanze (Blasia pusilla) zu einer sehr spezifischen Aktivierung der RIPP4 und RiPP3 Biosynthesecluster. Obwohl dieser Effekt mittels verschiedener unabhängiger Methoden bestätigt werden konnte und trotz intensiver Analysebemühungen, konnte jedoch keinem der beiden Cluster ein Produkt zugeordnet werden. Diese Studie stellt die erste weitreichende, systematische Analyse eines cyanobakteriellen Sekundärmetaboloms durch einen kombinatorischen Ansatz aus Genomic Mining und unabhängigen Monitoring-Techniken dar und kann als neue strategische Herangehensweise für die Untersuchung anderer Organismen hinsichtlich ihrer Sekundärmetabolit-Produktion dienen. Obwohl es bereits gut beschriebene einzelne Sekundärmetabolite gibt, wie beispielweise den Zelldifferenzierungsfaktor PatS in Anabaena sp. PCC7120, so ist der Grad an Regulation der in dieser Studie gezeigt werden konnte bislang beispiellos und die Entschlüsselung dieser Mechanismen könnte die Entdeckung neuer Naturstoffe stark beschleunigen. Daneben lassen die Ergebnisse aber auch darauf schließen, dass die Induktion der Biosynthesewege nicht das eigentliche Problem darstellt, sondern vielmehr die verlässliche Detektion deren Produkte. Die Erarbeitung neuer Analytik-Strategien könnte somit auch einen deutlichen Einfluss auf die Geschwindigkeit der Entdeckung neuer Naturstoffe haben. N2 - Since the golden era of antibiotics natural products are of ever growing interest to both basic research and applied sciences as they are the main source of new bioactive compounds delivering lead structures for new pharmaceuticals with potent antibiotic, anti-inflammatory or anti-cancer activities. Alongside the technological advances in high-throughput genome sequencing and the better understanding of the general organization of those modular biosynthetic assembly lines of secondary metabolites, there was also a shift from wet-lab screening of active cell extracts towards algorithm-based in silico screening for new natural product biosynthesis gene clusters (BGCs). Although the increasing availability of full genome sequences revealed that such non-ribosomal peptide synthetases (NRPS), polyketide synthases (PKS) and ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides (RiPPs) can be found in all three kingdoms of life, certain phyla like actinobacteria and cyanobacteria show a very high density of these secondary metabolite BGCs. The facultative symbiotic, N2-fixing model organism N. punctiforme PCC73102 is a terrestrial type IV cyanobacterium that not only dedicates are very large fraction of its genome to secondary metabolite production but is also amenable to genetic modification. AntiSMASH analysis of the genome showed that there are sixteen potential secondary metabolite BGCs encoded in N. punctiforme, but until now there were only two compounds assigned to their respective BGC leaving the remaining fourteen orphan. This makes the organism a perfect subject for the establishment of a novel combinatorial genomic mining approach for the detection of new natural products. In the course of this study a combinatorial approach of genomic mining, independent monitoring techniques and alteration of cultivation conditions lead to new insights in cyanobacterial natural product biosynthesis and ultimately to the description of a novel compound produced by N. punctiforme. With the generation and investigation of a reporter strain library consisting of CFP-producing transcriptional reporter mutants for every predicted secondary metabolite BGC of N. punctiforme, it could be shown that natural product expression is in fact not silent for all those BGCs where no compound can be detected. Instead several distinct expression patterns could be described highlighting that secondary metabolite production is under tight regulation and only a minor fraction of these BGCs is in fact silent under standard laboratory conditions. Furthermore, increasing light intensity and carbon dioxide availability and cultivating N. punctiforme to very high cell densities had a tremendous impact on the overall metabolic activity of the organism. Investigation of high density cultivated cell extracts ultimately lead to the detection of a so far undescribed set of microviridins with unusual extended peptide sequences named Microviridin N3 – N9. Both cultivation of the transcriptional reporter mutants as well as RTqPCR-based detection of secondary metabolite BGC transcription levels revealed that in fact 50% of N. punctiforme’s natural product BGCs are upregulated under high cell density conditions. In contrast to this very broad response, co-cultivation of N. punctiforme in chemical or physical contact with a N-deprived host plant (Blasia pusilla) lead to a very specific upregulation of two natural product BGCs, namely RIPP3 and RIPP4. Although this response could be confirmed by various independent monitoring techniques and heavy analytical efforts were spent, no compound could be assigned to either of these BGCs. This study is the first in-depth systematic investigation of a cyanobacterial secondary metabolome by a combinatorial approach of genome mining and independent monitoring techniques that can serve as a new strategic approach to gain further insight into natural product synthesis of various organisms. Although there are single well described examples of secondary metabolites like the cell differentiation factor PatS in Anabaena sp. strain PCC 7120, the level and extent of regulation observed in this study is unprecedented and understanding of these mechanisms might be the key to streamline natural product discovery. However, the results of this study also highlight that induction of secondary metabolite BGCs is not the real challenge. Instead the new insights point towards analytical issues being a severe hurdle and finding reliable strategies to overcome these problems might as well drive natural product discovery. T2 - Entwicklung von Konzepten für das Genomic Mining von neuartigen Sekundärmetaboliten in symbiotischen Cyanobakterien KW - Cyanobacteria KW - Cyanobakterien KW - Natural Products KW - Naturstoffe KW - Genomic Mining KW - Secondary Metabolites KW - Sekundärmetabolite KW - Nostoc punctiforme Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-478342 ER - TY - THES A1 - Krumbholz, Julia T1 - Identification of chemical mediators that regulate the specialized metabolism in Nostoc punctiforme T1 - Identifizierung chemischer Mediatoren, die den spezialisierten Metabolismus in Nostoc punctiforme regulieren N2 - Specialized metabolites, so-called natural products, are produced by a variety of different organisms, including bacteria and fungi. Due to their wide range of different biological activities, including pharmaceutical relevant properties, microbial natural products are an important source for drug development. They are encoded by biosynthetic gene clusters (BGCs), which are a group of locally clustered genes. By screening genomic data for genes encoding typical core biosynthetic enzymes, modern bioinformatical approaches are able to predict a wide range of BGCs. To date, only a small fraction of the predicted BGCs have their associated products identified. The phylum of the cyanobacteria has been shown to be a prolific, but largely untapped source for natural products. Especially multicellular cyanobacterial genera, like Nostoc, harbor a high amount of BGCs in their genomes. A main goal of this study was to develop new concepts for the discovery of natural products in cyanobacteria. Due to its diverse setup of orphan BGCs and its amenability to genetic manipulation, Nostoc punctiforme PCC 73102 (N. punctiforme) appeared to be a promising candidate to be established as a model organism for natural product discovery in cyanobacteria. By utilizing a combination of genome-mining, bioactivity-screening, variations of culture conditions, as well as metabolic engineering, not only two new polyketides were discovered, but also first-time insights into the regulation of the specialized metabolism in N. punctiforme were gained during this study. The cultivation of N. punctiforme to very high densities by utilizing increasing light intensities and CO2 levels, led to an enhanced metabolite production, causing rather complex metabolite extracts. By utilizing a library of CFP reporter mutant strains, each strain reporting for one of the predicted BGCs, it was shown that eight out of 15 BGCs were upregulated under high density (HD) cultivation conditions. Furthermore, it could be demonstrated that the supernatant of an HD culture can increase the expression of four of the influenced BGCs, even under conventional cultivation conditions. This led to the hypothesis that a chemical mediator encoded by one of the affected BGCs is accumulating in the HD supernatant and is able to increase the expression of other BGCs as part of a cell-density dependent regulatory circuit. To identify which of the BGCs could be a main trigger of the presumed regulatory circuit, it was tried to activate four BGCs (pks1, pks2, ripp3, ripp4) selectively by overexpression of putative pathway-specific regulatory genes that were found inside the gene clusters. Transcriptional analysis of the mutants revealed that only the mutant strain targeting the pks1 BGC, called AraC_PKS1, was able to upregulate the expression of its associated BGC. From an RNA sequencing study of the AraC_PKS1 mutant strain, it was discovered that beside pks1, the orphan BGCs ripp3 and ripp4 were also upregulated in the mutant strain. Furthermore, it was observed that secondary metabolite production in the AraC_PKS1 mutant strain is further enhanced under high-light and high-CO2 cultivation conditions. The increased production of the pks1 regulator NvlA also had an impact on other regulatory factors, including sigma factors and the RNA chaperone Hfq. Analysis of the AraC_PKS1 cell and supernatant extracts led to the discovery of two novel polyketides, nostoclide and nostovalerolactone, both encoded by the pks1 BGC. Addition of the polyketides to N. punctiforme WT demonstrated that the pks1-derived compounds are able to partly reproduce the effects on secondary metabolite production found in the AraC_PKS1 mutant strain. This indicates that both compounds are acting as extracellular signaling factors as part of a regulatory network. Since not all transcriptional effects that were found in the AraC_PKS1 mutant strain could be reproduced by the pks1 products, it can be assumed that the regulator NvlA has a global effect and is not exclusively specific to the pks1 pathway. This study was the first to use a putative pathway specific regulator for the specific activation of BGC expression in cyanobacteria. This strategy did not only lead to the detection of two novel polyketides, it also gave first-time insights into the regulatory mechanism of the specialized metabolism in N. punctiforme. This study illustrates that understanding regulatory pathways can aid in the discovery of novel natural products. The findings of this study can guide the design of new screening strategies for bioactive compounds in cyanobacteria and help to develop high-titer production platforms for cyanobacterial natural products. N2 - Sekundärmetabolite, auch Naturstoffe genannt, werden von einer Vielzahl an Organismen, darunter Bakterien und Pilzen, hergestellt. Aufgrund ihrer Vielzahl an verschiedenen Bioaktivitäten, einschließlich pharmakologisch relevanter Wirkungen, sind mikrobielle Naturstoffe eine wichtige Grundlage für die Arzneimittelentwicklung. Naturstoffe werden durch eine Ansammlung lokal gruppierter Gene, sogenannten Biosynthese-Genclustern (BGC), im Genom kodiert. Moderne bioinformatische Methoden durchsuchen Genom-Daten nach Genen, die typische biosynthetische Enzyme kodieren. Auf Grundlage dessen können verschiedenste BGCs vorhergesagt werden. Bislang konnte allerdings nur für einen kleinen Teil der vorhergesagten BGCs das dazugehörige Produkt identifiziert und charakterisiert werden. Cyanobakterien sind nachweislich eine reichhaltige, aber weitestgehend unerschlossene Quelle für Naturstoffe. Insbesondere mehrzellige Gattungen, wie Nostoc, tragen eine Vielzahl an BGCs in ihren Genomen. Ein Hauptziel dieser Studie war es, neue Konzepte für die Entdeckungen von Naturstoffen in Cyanobakterien zu entwickeln. Nostoc punctiforme PCC 73102 (N. punctiforme) erwies sich als besonders geeigneter Stamm für diese Aufgabe, da er eine Vielzahl weitestgehend ununtersuchter Gencluster besitzt und zugänglich für genetische Modifikationen ist. Eine Kombination aus Genome Mining, Bioaktivitäts-Screening, verschiedenen Kultivierungsbedingungen und Metabolic Engineering führte zur Entdeckung zweier neuer Polyketide und gewährte im Verlauf der Studie erstmals Einblicke in den spezialisierten Metabolismus von N. punctiforme. Die Kultivierung von N. punctiforme in sehr hohen Zelldichten, ermöglicht durch sehr hohe Lichtintensitäten und erhöhte CO2-Verfügbarkeit, führte zu einer verstärkten Metabolitproduktion und komplexen Metabolitextrakten. Unter Verwendung einer Bibliothek von CFP-Reportermutanten, bei der jede Mutante eines der vorhergesagten BGCs repräsentiert, konnte gezeigt werden, dass 8 von 15 BGCs unter Hochzelldichte-Kultivierungsbedingungen hochreguliert wurden. Zudem zeigte sich, dass der Überstand einer dichten Kultur, auch unter konventionellen Kultivierungsbedingungen, vier der regulierten BGCs beeinflussen kann. Dies lässt vermuten, dass sich unter Hochzelldichte-Kultivierungsbedingungen ein chemischer Mediator, welcher von einem der beeinflussten BGCs produziert wird, im Überstand anhäuft und die Expression anderer BGCs als Teil eines zelldichte-abhängigen Regelkreises kontrollieren kann. Um herauszufinden, welches der BGCs ein Hauptauslöser des vermuteten Regelkreises sein könnte, wurde versucht die Expression von vier BGCs (pks1, pks2, ripp3, ripp4) mittels Überexpression von potentiell biosynthese-spezifischen regulatorischen Genen zu aktivieren. Eine transkriptionelle Analyse der Mutanten ergab, dass nur der Stamm, welcher das pks1 BGC aktivieren sollte (AraC_PKS1), einen positiven Effekt auf die Expression des zu erwartenden BGCs hatte. Eine RNA-Sequenzierungsstudie ergab, dass in der AraC_PKS1 Mutante neben dem pks1 BGC auch die kryptischen BGCs ripp3 und ripp4 eine erhöhte Transkription aufwiesen. Zudem wurde beobachtet, dass sich die Sekundärmetabolitproduktion in der Mutante durch Kultivierung unter erhöhten Licht-Intensitäten und CO2-Leveln erweitern lässt. Unabhängig von den Kultivierungsbedingungen, hat die erhöhte Produktion des pks1 Regulators NvlA in der Mutante einen Einfluss auf andere regulatorische Faktoren, wie Sigma-Faktoren und das RNA-Chaperon Hfq. Die Analyse des Zell- und Überstandsextrakts der AraC_PKS1 Mutante führte zur Entdeckung zweier neuer Polyketide, Nostoclid und Nostovalerolacton, welche beide vom pks1 BGC codiert werden. Die Zugabe dieser Polyketide zum N. punctiforme Wildtyp zeigte, dass diese in der Lage sind einen Teil der Sekundärmetabolit-Effekte der AraC_PKS1 Mutante zu reproduzieren. Dies lässt darauf schließen, dass beide Polyketide als Signalstoffe innerhalb eines regulatorischen Netzwerks agieren. Da nicht alle transkriptionellen Effekte der AraC_PKS1 Mutante durch die Zugabe der pks1 Produkte reproduziert werden konnten, ist anzunehmen, dass der Regulator NvlA einen globalen Effekt hat und nicht ausschließlich die pks1 Biosynthese reguliert. Diese Studie war die erste, welche einen potentiell biosynthese-spezifischen Regulator für die gezielte Aktivierung von BGC-Expression in Cyanobakterien verwendet hat. Diese Strategie führte neben der Entdeckung zweier neuer Polyketide, zu ersten Einblicken in den regulatorischen Mechanismus, der den spezialisierten Metabolismus in N. punctiforme kontrolliert. Diese Studie veranschaulicht, dass das Verstehen regulatorischer Mechanismen für die Entdeckung neuer Naturstoffe hilfreich sein kann. Die Studien-Ergebnisse können die Entwicklung neuer Screening-Strategien für bioaktive Metabolite in Cyanobakterien anregen und können dabei helfen Hochtiter-Produktionsplattformen für cyanobakterielle Naturstoffe zu entwickeln. KW - cyanobacteria KW - natural products KW - specialized metabolites KW - gene cluster activation KW - Nostoc punctiforme KW - Cyanobakterien KW - Sekundärmetabolite KW - Naturstoffe KW - Gencluster-Aktivierung Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-540240 ER - TY - THES A1 - Ring, Christiane T1 - The role of the commensal gut bacterium Akkermansia muciniphila in acute and chronic intestinal inflammation N2 - Microbiota analyses of patients suffering from various diseases suggest a beneficial role of Akkermansia muciniphila in the maintenance of health, whereas several studies in animal models of intestinal inflammation report that this organism may aggravate inflammation. Therefore, it is important to clarify under which circumstances A. muciniphila exerts negative effects in the intestine of its host. The previously reported observation that A. muciniphila aggravates acute intestinal inflammation in the Salmonella enterica serovar Typhimurium infection mouse model colonized with a simplified human intestinal microbiota was investigated in this study. To unravel the underlying mechanism that led to the observed phenomenon, the time course of events following the infection was analyzed. In mice colonized with a simplified human intestinal microbiota, Salmonella infection induced clear signs of intestinal inflammation three days post infection. The inflammatory response was similar in mice colonized with A. muciniphila before Salmonella infection. These observations were independent of the time when colonization with the simplified human intestinal microbiota occurred, right after birth or only after weaning, and contradict the previous report. To find out whether A. muciniphila influences the development of chronic intestinal inflammation in a genetically predisposed host, mono-associated interleukin-10-deficient (Il10-/-) mice, Il10-/- mice dual-associated with A. muciniphila and colitogenic Escherichia coli NC101, as well as Il10-/- mice associated with A. muciniphila and a simplified human intestinal microbiota were compared to the respective mice without A. muciniphila. The data clearly show that in these gnotobiotic Il10-/- mice, A. muciniphila neither induces intestinal inflammation itself nor modulates it after induction by a colitogenic bacterium or by a simplified human intestinal microbiota. The experiments lead to the conclusion that the promotion of intestinal inflammation is not an intrinsic feature of this bacterium. The results of this study encourage the proposed use of A. muciniphila for the prevention or treatment of metabolic disorders. N2 - Analysen der Zusammensetzung der humanen Mikrobiota bei verschiedenen Erkrankungen deuten auf eine vorteilhafte Wirkung von Akkermansia muciniphila bei der Gesundheitserhaltung hin, während mehrere Tierstudien gezeigt haben, dass dieses Bakterium Darmentzündungen verschlimmern könnte. Deshalb ist es wichtig aufzuklären, unter welchen Umständen A. muciniphila eine negative Wirkung auf den Wirt hat. Es wurde kürzlich gezeigt, dass A. muciniphila bei Mäusen mit einer vereinfachten humanen Darmmikrobiota im Salmonella enterica serovar Typhimurium-Infektionsmodel für akute Darmentzündung einen entzündungsfördernden Effekt hat. Um den zugrundeliegenden Mechanismus aufzuklären, wurde in der vorliegenden Studie die Infektion im zeitlichen Verlauf untersucht. Die Salmonelleninfektion löste bei Mäusen mit einer vereinfachten humanen Darmmikrobiota innerhalb von drei Tagen deutliche Zeichen einer Darmentzündung aus. Die Entzündung entwickelte sich ebenso stark, wenn die Mäuse zuvor mit A. muciniphila besiedelt worden waren. Diese Beobachtungen waren unabhängig vom Zeitpunkt der Besiedlung mit der vereinfachten humanen Darmmikrobiota, entweder direkt nach der Geburt oder erst nach dem Absetzen, und widersprechen der vorangegangenen Studie. Um herauszufinden, ob A. muciniphila die Entwicklung chronischer Darmentzündungen in einem genetisch prädisponierten Wirt beeinflusst, wurden mono-assoziierte Interleukin-10-defiziente (Il10-/-) Mäuse, mit kolitogenem Escherichia coli NC101 sowie A. muciniphila dual-assoziierte Il10-/- Mäuse und Il10-/- Mäuse mit einer vereinfachten humanen Darmmikrobiota einschließlich A. muciniphila mit den jeweiligen Mäusen ohne A. muciniphila verglichen. Die Daten zeigen deutlich, dass A. muciniphila in diesen gnotobiotischen Il10-/- Mäusen keine Darmentzündung verursacht oder diese beeinflusst, wenn sie durch ein kolitogenes Bakterium oder eine vereinfachte humane Darmmikrobiota ausgelöst wurde. Die Studie konnte zeigen, dass die Förderung von Darmentzündungen keine intrinsische Eigenschaft von A. muciniphila ist. Dieses Ergebnis unterstützt die geplante Verwendung von A. muciniphila zur Vorbeugung und Behandlung metabolischer Erkrankungen. KW - gut microbiota KW - Akkermansia muciniphila KW - intestinal inflammation Y1 - 2018 ER - TY - THES A1 - Vandrich, Jasmina T1 - Metabolic Engineering in Halomonas elongata Y1 - 2019 ER - TY - THES A1 - Barchewitz, Tino T1 - Impact of microcystin on the non-canonical localization of RubisCO in the toxic bloom-forming cyanobacterium Microcystis aeruginosa PCC7806 T1 - Einfluss von Microcystin auf die nicht-kanonische Lokalisierung von RubisCO im toxischen Blüten-bildenden Cyanobakterium Microcystis aeruginosa PCC7806 N2 - Cyanobacteria are an abundant bacterial group and are found in a variety of ecological niches all around the globe. They can serve as a real threat for fish or mammals and can restrict the use of lakes or rivers for recreational purposes or as a source of drinking water, when they form blooms. One of the most abundant bloom-forming cyanobacteria is Microcystis aeruginosa. In the first part of the study, the role and possible dynamics of RubisCO in M. aeruginosa during high-light irradiation were examined. Its response was analyzed on the protein and peptide level via immunoblotting, immunofluorescence microscopy and with high performance liquid chromatography (HPLC). It was revealed that large amounts of RubisCO were located outside of carboxysomes under the applied high light stress. RubisCO aggregated mainly underneath the cytoplasmic membrane. There it forms a putative Calvin-Benson-Bassham (CBB) super complex together with other enzymes of photosynthesis. This complex could be part of an alternative carbon-concentrating mechanism (CCM) in M. aeruginosa, which enables a faster, and energy saving adaptation to high light stress of the whole bloom. Furthermore, the re-localization of RubisCO was delayed in the microcystin-deficient mutant ΔmcyB and RubisCO was more evenly distributed over the cell in comparison to the wild type. Since ΔmcyB is not harmed in its growth, possibly other produced cyanopeptides as aeruginosin or cyanopeptolin also play a role in the stabilization of RubisCO and the putative CBB complex, especially in the microcystin-free mutant. In the second part of this work, the possible role of microcystin as an extracellular signaling peptide during the diurnal cycle was studied. HPLC analysis showed a strong increase of extracellular microcystin in the wild type when the population entered nighttime and it resumed into the next day as well. Together with the increase of extracellular microcystin, a strong decrease of protein-bound intracellular microcystin was observed via immunoblot analysis. Interestingly, the signal of the large subunit of RubisCO (RbcL) also diminished when high amounts of microcystin were present in the surrounding medium. Microcystin addition experiments to M. aeruginosa WT and ΔmcyB cultures support this observation, since the immunoblot signal of both subunits of RubisCO and CcmK, a shell protein of carboxysomes, diminished after the addition of microcystin. In addition, the fluctuation of cyanopeptolin during the diurnal cycle indicates a more prominent role of other cyanopeptides besides microcystin as a signaling peptide, intracellularly as well as extracellularly. N2 - Cyanobakterien können weltweit in einer Vielzahl von ökologischen Nischen gefunden werden. Sie stellen eine Gefahr für Eukaryoten wie Fische oder Säugetiere dar, und können auch die Nutzung von Seen oder Flüssen zu Erholungszwecken oder als Trinkwasserquelle beeinträchtigen, wenn sie an der Wasser-Luft Interphase Blüten bilden. Einer der häufigsten blütenbildenden Cyanobakterien ist der Stamm M. aeruginosa PCC7806, welcher in Cyanobakterienblüten auf der ganzen Welt gefunden werden kann. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Funktion und mögliche Dynamiken von RubisCO während der Bildung und Aufrechterhaltung von dicht gewachsenen Blüten untersucht. Dafür wurden Schwachlicht-adaptierte M. aeruginosa Zellkulturen Starklicht ausgesetzt und deren Reaktion auf dem Protein- und Peptidlevel analysiert. Verwendete Analysemethoden waren Western Blots, Immunofluoreszenz-mikroskopie und Hochleistungsflüssigkeitschromatografie (HPLC). Es konnte aufgezeigt werden, dass unter der angewendeten Starklichtbehandlung große Mengen RubisCO außerhalb der Carboxysomen lokalisiert waren. Dabei konnte RubisCO hauptsächlich direkt unterhalb der zytoplasmatischen Membran in Form von Aggregaten nachgewiesen werden. Diese Aggregate sind möglicherweise Teil eines hypothetischen Calvin-Benson-Bassham Zyklus (CBB) Superkomplexes zusammen mit anderen Enzymen aus der Photosynthese. Dieser Komplex könnte Teil eines alternativen Kohlenstoff-Konzentrationsmechanismus in M. aeruginosa sein, welcher eine schnellere und energiesparendere Anpassung der Cyanobakterienblüte an Starklichtstress ermöglicht. Weiterhin erfolgte die Relokalisation von RubisCO in der Microcystin-freien Mutante ΔmcyB verzögert und RubisCO war homogener in der Zelle verteilt im Vergleich zum Wildtyp. Die Ergebnisse dieser Arbeit sind im Einklang mit vorherigen Publikationen zu der Funktion von Microcystin als Schutz gegen Proteinabbau in Folge der Bindung von Microcystin an das jeweilige Protein. Da ΔmcyB im Wachstum nicht eingeschränkt war, scheint es möglich, dass andere Cyanopeptoline wie Aeruginosin oder Cyanopeptolin die stabilisierende Funktion von Microcystin gegenüber RubisCO und den hypothetischen CBB Komplex übernehmen, vor allem in der Microcystin-freien Mutante. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die mögliche extrazelluläre Funktion von Microcystin untersucht. HPLC-Analysen zeigen eine starke Zunahme an extrazellulärem Microcystin im Wildtyp als die Zellkultur in die Nachtphase übergegangen ist. Dieser Trend hat sich auch in den folgenden Tag hinein fortgesetzt. Zusammen mit der Zunahme an extrazellulärem Microcystin wurde eine starke Abnahme an proteingebundenem intrazellulärem Microcystin festgestellt, anhand von Western Blot-Untersuchungen. Interessanterweise verringerte sich die Signalstärke der großen Untereinheit von RubisCO (RbcL) im selben Zeitraum im Western Blot. Microcystin Zugabe-Experimente zu M. aeruginosa WT und ΔmcyB unterstützen diese Beobachtung, da das Western Blot-Signal für sowohl beide Untereinheiten von RubisCO als auch CcmK, ein Hüllenprotein der Carboxysomen, nach der Zugabe von Microcystin stark abnahm. Zusätzlich weist die Fluktuation des Cyanopeptolin-Signals während des Tag-Nacht Zyklus auf eine wichtigere Funktion von Cyanopeptiden abseits von Microcystin hin; als Signalpeptide, sowohl intrazellulär als auch extrazellulär. Diese Dissertation gibt neue Einsichten in Adaptionsprozesse von M. aeruginosa an Starklicht-Bedingungen. Der postulierte alternative Kohlenstoff-Konzentrations-mechanismus, welcher direkt unterhalb der zytoplasmatischen Membran stattfindet, gibt M. aeruginosa einen Vorteil gegenüber anderen Cyanobakterien, welche nur den in der Literatur anerkannten Carboxysomen-basierten Kohlenstoff-Konzentrations-mechanismus besitzen. Des Weiteren stärkt die vorliegende Arbeit die Hypothese, dass die eigentliche extrazelluläre Funktion von Microcystin die eines Signalstoffes ist, und nicht die eines antibiotischen Stoffes. KW - Cyanobacteria KW - Microcystis KW - Microcystin KW - RubisCO KW - Carbon concentrating mechanism KW - Cyanobakterien KW - Microcystin KW - Microcystis KW - Carboxysomen KW - Kohlenstoff-Konzentrationsmechanismus KW - RubisCO Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-508299 ER -