TY - THES A1 - Ahmad Abadi, Mohammad T1 - Development and application of novel genetic transformation technologies in maize (Zea mays L.) T1 - Entwicklung und Anwendung neuer genetischer Transformationstechnologien im Mais (Zea Mays L.) N2 - Plant genetic engineering approaches are of pivotal importance to both basic and applied research. However, rapid commercialization of genetically engineered crops, especially maize, raises several ecological and environmental concerns largely related to transgene flow via pollination. In most crops, the plastid genome is inherited uniparentally in a maternal manner. Consequently, a trait introduced into the plastid genome would not be transferred to the sexually compatible relatives of the crops via pollination. Thus, beside its several other advantages, plastid transformation provides transgene containment, and therefore, is an environmentally friendly approach for genetic engineering of crop plants. Reliable in vitro regeneration systems allowing repeated rounds of regeneration are of utmost importance to development of plastid transformation technologies in higher plants. While being the world’s major food crops, cereals are among the most difficult-to-handle plants in tissue culture which severely limits genetic engineering approaches. In maize, immature zygotic embryos provide the predominantly used material for establishing regeneration-competent cell or callus cultures for genetic transformation experiments. The procedures involved are demanding, laborious and time consuming and depend on greenhouse facilities. In one part of this work, a novel tissue culture and plant regeneration system was developed that uses maize leaf tissue and thus is independent of zygotic embryos and greenhouse facilities. Also, protocols were established for (i) the efficient induction of regeneration-competent callus from maize leaves in the dark, (ii) inducing highly regenerable callus in the light, and (iii) the use of leaf-derived callus for the generation of stably transformed maize plants. Furthermore, several selection methods were tested for developing a plastid transformation system in maize. However, stable plastid transformed maize plants could not be yet recovered. Possible explanations as well as suggestions for future attempts towards developing plastid transformation in maize are discussed. Nevertheless, these results represent a first essential step towards developing chloroplast transformation technology for maize, a method that requires multiple rounds of plant regeneration and selection to obtain genetically stable transgenic plants. In order to apply the newly developed transformation system towards metabolic engineering of carotenoid biosynthesis, the daffodil phytoene synthase (PSY) gene was integrated into the maize genome. The results illustrate that expression of a recombinant PSY significantly increases carotenoid levels in leaves. The beta-carotene (pro-vitamin A) amounts in leaves of transgenic plants were increased by ~21% in comparison to the wild-type. These results represent evidence for maize to have significant potential to accumulate higher amounts of carotenoids, especially beta-carotene, through transgenic expression of phytoene synthases. Finally, progresses were made towards developing transformation technologies in Peperomia (Piperaceae) by establishing an efficient leaf-based regeneration system. Also, factors determining plastid size and number in Peperomia, whose species display great interspecific variation in chloroplast size and number per cell, were investigated. The results suggest that organelle size and number are regulated in a tissue-specific manner rather than in dependency on the plastid type. Investigating plastid morphology in Peperomia species with giant chloroplasts, plasmatic connections between chloroplasts (stromules) were observed under the light microscope and in the absence of tissue fixation or GFP overexpression demonstrating the relevance of these structures in vivo. Furthermore, bacteria-like microorganisms were discovered within Peperomia cells, suggesting that this genus provides an interesting model not only for studying plastid biology but also for investigating plant-microbe interactions. N2 - Pflanzliche Gentechnik spielt sowohl in der Grundlagenforschung als auch der Biotechnologie eine große Rolle. Allerdings bringt die landwirtschaftliche Nutzung gentechnisch veränderter Pflanzen (GM) ökologische Umweltrisiken mit sich, wie z.B. die Kreuzung GM Pflanzen mit sexuell kompatiblen Verwandten durch Fremdbestäubung. Gegenüber den Kerntransformanden haben Plastidtransformanden für die biotechnologische Nutzung große Vorteile, unter anderem da die Vererbung des Plastidgenoms bei höheren Angiospermen ausschließlich maternal geschieht. Somit kann ein Gentransfer transplastomischer Pflanzen über Pollen ausgeschlossen werden. Zuverlässige in-vitro-Regenerationssysteme, die wiederholte Regenerationsrunden erlauben, sind von großem Wert für die Etablierung der Plastidentransformationstechnologie. Trotz Sein die Hauptgetreidenahrungsmittel der Welt, Zerealie Pflanzen gehören zu schwierigsten in der Gewebekultur zu handeln, die Annäherungen der genetischen Technik streng begrenzt. Im Mais werden hauptsächlich junge zygotische Embryonen für die Herstellung der Regenerations-kompetenten Kalluskulturen benutzt. Der Arbeitsaufwand dafür ist hoch und die Prozedur schwierig und von den Gewächshausbedingungen abhängig. Im Rahmen dieser Arbeit wurden neue Gewebekultursysteme für Mais etabliert, welches junge Blattgewebe nutzt und somit unabhängig von Embryonen und Gewächshaus ist. Weiterhin wurden die aus Blättern gebildeten Kalluskulturen für die Generierung der genetisch veränderten Maispflanzen benutzt. Ebenso wurden verschiedene Selektionsmethoden für die Entwicklung eines Plastidentransformationssystems in Mais getestet. Jedoch konnten keine transplastomischen Maispflanzen erhalten werden. Sowohl die möglichen Ursachen als auch Vorschläge für weiterführende Versuche diesbezüglich werden im Rahmen dieser Arbeit diskutiert. Dennoch stellt diese Arbeit den ersten wesentlichen Schritt für die Entwicklung eines Plastidentransformationssystems in Mais vor. In einem zweiten Teil dieses Projekts wird die erfolgreiche Integration der Narzissen Phytoene Synthase in das Maisgenom durch das neu entwickelte nukleäre Transformationssystem gezeigt. Dadurch konnte eine signifikante Steigerung um 17% des Gesamtcarotinoid- und 21% des Beta-Carotengehalts in Maisblättern beobachtet werden. Schließlich wurden Fortschritte für die Entwicklung eines Transformationssystems für Peperomia (Piperaceae) durch die Etablierung eines Regenerationssystems aus Blättern gemacht. Außerdem wurden Faktoren, die die Plastidengröße und –zahl bestimmen, untersucht. Diese Ergebnisse geben Hinweise darauf, dass die Organellengröße und –zahl eher gewebespezifisch als in Abhängigkeit vom Plastidentyp reguliert wird. KW - Mais KW - genetische Manipulation KW - Regeneratin KW - Plastid KW - Maize KW - Genetic transformation KW - Regeneration KW - Plastid Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-14572 ER - TY - THES A1 - Arana-Ceballos, Fernando Alberto T1 - Biochemical and physiological studies of Arabidopsis thaliana Diacylglycerol Kinase 7 (AtDGK7) T1 - Biochemische physiologische Studien an der Arabidopsis thaliana Diazylglyzerol Kinase 7 (AtDGK7) N2 - A family of diacylglycerol kinases (DGK) phosphorylates the substrate diacylglycerol (DAG) to generate phosphatidic acid (PA) . Both molecules, DAG and PA, are involved in signal transduction pathways. In the model plant Arabidopsis thaliana, seven candidate genes (named AtDGK1 to AtDGK7) code for putative DGK isoforms. Here I report the molecular cloning and characterization of AtDGK7. Biochemical, molecular and physiological experiments of AtDGK7 and their corresponding enzyme are analyzed. Information from Genevestigator says that AtDGK7 gene is expressed in seedlings and adult Arabidopsis plants, especially in flowers. The AtDGK7 gene encodes the smallest functional DGK predicted in higher plants; but also, has an alternative coding sequence containing an extended AtDGK7 open reading frame, confirmed by PCR and submitted to the GenBank database (under the accession number DQ350135). The new cDNA has an extension of 439 nucleotides coding for 118 additional amino acids The former AtDGK7 enzyme has a predicted molecular mass of ~41 kDa and its activity is affected by pH and detergents. The DGK inhibitor R59022 also affects AtDGK7 activity, although at higher concentrations (i.e. IC50 ~380 µM). The AtDGK7 enzyme also shows a Michaelis-Menten type saturation curve for 1,2-DOG. Calculated Km and Vmax were 36 µM 1,2-DOG and 0.18 pmol PA min-1 mg of protein-1, respectively, under the assay conditions. Former protein AtDGK7 are able to phosphorylate different DAG analogs that are typically found in plants. The new deduced AtDGK7 protein harbors the catalytic DGKc and accessory domains DGKa, instead the truncated one as the former AtDGK7 protein (Gomez-Merino et al., 2005). N2 - Wachstum und Entwicklung sind die Kennzeichen lebender Systeme. Diese Prozesse unterliegen einer strengen Regulation im Organismus. Diacylglycerol (DAG) und Phosphatidsäure (PA) sind wesentliche Elemente in der Signalübertragung in Organismen. In Säugetieren kann DAG auf drei verschiedenen Wegen metabolisiert werden, die Entstehung von PA durch Phosphorylierung der freien Hydroxyl-Gruppe von DAG ist jedoch der am häufigsten vorkommende Stoffwechselweg. Die enzymatische Umsetzung dieser Reaktion wird von der Familie der Diacylglycerol-Kinasen (DGKs) katalysiert. Molekulare und biochemische Untersuchungen konnten die Anwesenheit von DGKs in Drosophila melanogaster, Arabidopsis thaliana und jüngst auch in Dictyostelium discoideum zeigen. In der vorliegenden Arbeit wird die Klonierung und Charakterisierung von AtDGK7 aus Arabidopsis thaliana präsentiert, einem Vertreter des pflanzlichen DGK-Clusters II. Das Transkript von AtDGK7 findet sich in der gesamten Pflanze, jedoch sind die Transkriptmengen in Blüten und jungem Gewebe stark erhöht. Rekombinant hergestelltes AtDGK7 ist katalytisch aktiv und akzeptiert DAG-ähnliche Moleküle mit mindestens einer ungesättigten Fettsäure als bevorzugtes Substrat. AtDGK2, ein weiteres Mitglied der DGK-Familie, und AtDGK7 metabolisieren Substrate, welche in Pflanzen physiologisch relevant sind. Das als DGK-Inhibitor beschriebene Molekül 6-{2-{4-[(4-fluorophenyl)phenylmethylene]-1-piperidinyl}ethyl}-7-methyl-5H-thiazolo(3,2-a)pyrimidine-5-one (R59022) inhibiert bei Konzentrationen von 50-100 µM rekombinant hergestelltes AtDGK2 in vitro. In ähnlichen Konzentrationen eingesetzt modifiziert R59022 das Wurzelwachstum. Dies weist darauf hin, dass DGKs in Entwicklungsprozessen eine Rolle spielen. In in vitro Experimenten wurde AtDGK7 von R59022 allerdings erst in Konzentrationen über 100 µM inhibiert. Ferner wird in der vorliegenden Arbeit die erfolgreiche Klonierung einer cDNA beschrieben, die für AtDGK7 aus A. thaliana kodiert und welche im Vergleich zu der bereits bekannten cDNA um 439 bp länger ist. Expressionsanalysen mit Hilfe eines Promotor-ß-glucuronidase (GUS) Fusions-Produktes zeigten die Aktivität von AtDGK7 in vielen Geweben, vor allem aber in Schließzellen, im Konnektiv-Gewebe der Antheren, sowie besonders in den Spitzen der Seitenwurzeln. Physiologische Untersuchungen unter abiotischem Stress (Verwendung verschiedener Konzentrationen von Stickstoff, Saccharose, Auxin und Inhibitoren von Auxin-Transportern) wurden mit AtDGK7 T-DNA-Insertionslinien sowie mit den Promotor-GUS-Linien durchgeführt. AtDGK7 T-DNA-Insertionslinien zeigten eine starke Inhibierung des Seitenwurzel-Wachstums unter limitierenden Stickstoff- und/oder Saccharose-Konzentrationen. In einigen der T-DNA-Insertionslinien inhibierte die Zugabe eines Inhibitors für Auxin-Transport (TIBA; 2,3,5-triiodobenzoic acid) die Bildung von Haupt- und Seitenwurzeln fast vollständig. Die Inhibition des Wurzelwachstums in den T-DNA-Insertionslinien konnte teilweise durch die Zugabe von 50nM NAA (α-naphtalene acetic acid) revertiert werden. Aus den vorliegenden Ergebnissen wird die Hypothese abgeleitet, dass AtDGK7 im Zusammenspiel mit Auxin in Signaltransduktionsprozessen eine Rolle spielt, welche das Wachstum und die Entwicklung in Pflanzen regulieren. KW - AtDGK gene KW - Diacylglycerol KW - Phosphatidsäure KW - Diacylglycerol-Kinasen KW - Signaltransduktionsprozesse KW - AtDGK genes KW - auxin KW - diacylglycerol KW - phosphatidic acid KW - signaling Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-13729 ER - TY - THES A1 - Tschöpe, Okka T1 - Managing open habitats for species conservation : the role of wild ungulate grazing, small-scale disturbances, and scale T1 - Offenlandmanagement für den Artenschutz : die Bedeutung von Wildtierbeweidung, kleinräumigen Störungen und der Maßstabsebene N2 - During the last decades, the global change of the environment has caused a dramatic loss of habitats and species. In Central Europe, open habitats are particularly affected. The main objective of this thesis was to experimentally test the suitability of wild megaherbivore grazing as a conservation tool to manage open habitats. We studied the effect of wild ungulates in a 160 ha game preserve in NE Germany in three successional stages (i) Corynephorus canescens-dominated grassland, (ii) ruderal tall forb vegetation dominated by Tanacetum vulgare and (iii) Pinus sylvestris-pioneer forest over three years. Our results demonstrate that wild megaherbivores considerably affected species composition and delayed successional pathways in open habitats. Grazing effects differed considerably between successional stages: species richness was higher in grazed ruderal and pioneer forest plots, but not in the Corynephorus sites. Species composition changed significantly in the Corynephorus and ruderal sites. Grazed ruderal sites had turned into sites with very short vegetation dominated by Agrostis spp. and the moss Brachythecium albicans, most species did not flower. Woody plant cover was significantly affected only in the pioneer forest sites. Young pine trees were severely damaged and tree height was considerably reduced, leading to a “Pinus-macchie”-appearance. Ecological patterns and processes are known to vary with spatial scale. Since grazing by megaherbivores has a strong spatial component, the scale of monitoring success of grazing may largely differ among and within different systems. Thus, the second aim of this thesis was to test whether grazing effects are consistent over different spatial scales, and to give recommendations for appropriate monitoring scales. For this purpose, we studied grazing effects on plant community structure using multi-scale plots that included three nested spatial scales (0.25 m2, 4 m2, and 40 m2). Over all vegetation types, the scale of observation directly affected grazing effects on woody plant cover and on floristic similarity, but not on the proportion of open soil and species richness. Grazing effects manifested at small scales regarding floristic similarity in pioneer forest and ruderal sites and regarding species richness in ruderal sites. The direction of scale-effects on similarity differed between vegetation types: Grazing effects on floristic similarity in the Corynephorus sites were significantly higher at the medium and large scale, while in the pioneer forest sites they were significantly higher at the smallest scale. Disturbances initiate vegetation changes by creating gaps and affecting colonization and extinction rates. The third intention of the thesis was to investigate the effect of small-scale disturbances on the species-level. In a sowing experiment, we studied early establishment probabilities of Corynephorus canescens, a key species of open sandy habitats. Applying two different regimes of mechanical ground disturbance (disturbed and undisturbed) in the three successional stages mentioned above, we focused on the interactive effects of small-scale disturbances, successional stage and year-to-year variation. Disturbance led to higher emergence in a humid and to lower emergence in a very dry year. Apparently, when soil moisture was sufficient, the main factor limiting C. canescens establishment was competition, while in the dry year water became the limiting factor. Survival rates were not affected by disturbance. In humid years, C. canescens emerged in higher numbers in open successional stages while in the dry year, emergence rates were higher in late stages, suggesting an important role of late successional stages for the persistence of C. canescens. We conclude that wild ungulate grazing is a useful tool to slow down succession and to preserve a species-rich, open landscape, because it does not only create disturbances, thereby supporting early successional stages, but at the same time efficiently controls woody plant cover. However, wild ungulate grazing considerably changed the overall appearance of the landscape. Additional measures like shifting exclosures might be necessary to allow vulnerable species to flower and reproduce. We further conclude that studying grazing impacts on a range of scales is crucial, since different parameters are affected at different spatial scales. Larger scales are suitable for assessing grazing impact on structural parameters like the proportion of open soil or woody plant cover, whereas species richness and floristic similarity are affected at smaller scales. Our results further indicate that the optimal strategy for promoting C. canescens is to apply disturbances just before seed dispersal and not during dry years. Further, at the landscape scale, facilitation by late successional species may be an important mechanism for the persistence of protected pioneer species. N2 - Der globale Wandel führte in den letzten Jahrzehnten zu einem drastischen Habitat- und Artenschwund, von dem in Mitteleuropa offene Lebensräume besonders betroffen sind. Hauptziel dieser Arbeit war es, experimentell zu untersuchen, ob Wildtierbeweidung eine geeignete Methode für das Offenlandmanagement ist. Der Wildtiereffekt wurde über drei Jahre in einem 160 ha großen Wildtiergehege im NO Deutschlands in drei Sukzessionsstadien untersucht: (i) Corynephorus canescens-dominierte Kurzgrasrasen, (ii) durch Tanacetum vulgare dominierte ruderale Staudenfluren und (iii) Pinus sylvestris-Vorwälder. Wildtierbeweidung beeinflusste die Artenzusammensetzung entscheidend und verzögerte die Sukzession, wobei sich die Beweidungseffekte zwischen den Sukzessionsstadien unterschieden. Die Artenzahl war in den beweideten Ruderal- und Vorwaldflächen deutlich höher als in den unbeweideten, nicht jedoch in den Corynephorus-Flächen. Die Artenzusammensetzung wurde in den Corynephorus- und den Ruderal-Flächen verändert. Ruderal-Flächen entwickelten sich durch die Beweidung zu einem durch Agrostis spp. dominierten Vegetationstyp mit niedriger Vegetationshöhe, in dem die meisten Arten nicht zur Blüte kamen. Die Gehölzdeckung wurde in den beweideten Vorwaldflächen signifikant reduziert. Junge Kiefern wurden stark geschädigt und in ihrer Wuchshöher reduziert. Analyse und Interpretation einer Untersuchung sind abhängig vom Beobachtungsmaßstab. Das zweite Ziel dieser Arbeit war es, zu testen, ob Beweidungseffekte über verschiedene räumliche Skalen konsistent sind, sowie Empfehlungen für geeignete Monitoring-Maßstäbe zu geben. Der Effekt von Wildtierbeweidung auf die Vegetation dreier Sukzessionsstadien wurde mittels genesteter Dauerflächen untersucht (0.25 m2, 4 m2, 40 m2). Über alle Vegetationstypen zusammen beeinflusste der Beobachtungsmaßstab den Beweidungseffekt auf die Gehölzdeckung sowie auf die floristische Ähnlichkeit, aber nicht auf den Anteil offenen Bodens und die Artenzahl. Betrachtet man die Vegetationstypen getrennt, so zeigte sich der Beweidungseffekt auf kleinen Skalen in den Vorwaldflächen und den ruderalen Flächen hinsichtlich der Ähnlichkeit und in den ruderalen Flächen hinsichtlich der Artenzahl. Die Richtung der Skaleneffekte auf die floristische Ähnlichkeit unterschied sich zwischen den Vegetationstypen: Während sich beweidete und unbeweidete Corynephorus-Flächen auf der mittleren und der großen Skala signifikant voneinander unterschieden, war dies im Kiefernvorwald auf der kleinsten Skala der Fall. Störungen führen zu Vegetationsveränderungen, die die Einwanderungs- und Aussterberaten von Arten beeinflussen. Das dritte Ziel dieser Arbeit war es, den Effekt kleinräumiger Störungen auf der Art-Ebene zu untersuchen sowie deren Interaktion mit dem Sukzessionsstadium und der jährlichen Variabilität. In einem Aussaatexperiment wurde das Etablierungsverhalten von Corynephorus canescens, einer Schlüsselart sandiger Offenhabitate, in drei Sukzessionsstadien und unter zwei Störungsregimes (gestört vs. ungestört) untersucht. In einem feuchten Jahr führten Störungen zu höheren, in einem trockenen Jahr dagegen zu niedrigeren Keimraten. Solange die Bodenfeuchtigkeit hoch genug war, war Konkurrenz der wichtigste limitierende Faktor für die Etablierung von C. canescens, während im trockenen Jahr Wasser zum entscheidenden Faktor wurde. Auf die Überlebensraten hatten Störungen keinen Einfluss. In feuchten Jahren waren die Keimraten in offenen Sukzessionsstadien höher, während sie im trockenen Jahr im späten Sukzessionsstadium höher waren. Spätere Sukzessionsstadien können also für die Persistenz von C. canescens eine wichtige Rolle spielen. Da Wildtierbeweidung sowohl Störungen verursacht und dadurch frühe Sukzessionsstadien fördert, als auch die Gehölzdeckung reduziert, ist sie eine besonders geeignete Maßnahme, um artenreiche, offene Landschaften zu erhalten. Sie kann jedoch zu teilweise drastischen Veränderungen der Landschaft führen, so dass zusätzliche Maßnahmen wie wechselnde Auskoppelungen notwendig sein können, um ein reiches Mosaik verschiedener Sukzessionsstadien mit einer hohen Gesamtartenzahl zu erhalten. Weiterhin ist die Untersuchung von Beweidungseffekten auf verschiedenen Maßstabsebenen von großer Bedeutung, da verschiedene Parameter auf unterschiedlichen Skalen beeinflusst werden. Größere Skalen sind geeignet, um den Beweidungseinfluss auf Strukturparameter wie den Anteil offenen Bodens oder der Gehölzdeckung zu erfassen, während für die Erfassung der Veränderung des Artenreichtums und der floristischen Ähnlichkeit kleinere Skalen besser geeignet sind. Unsere Ergebnisse zeigen außerdem, dass kleinräumige Störungen die Keimung von C. canescens fördern, wobei Störungen direkt vor der Samenausbreitung und nicht in trockenen Jahren durchgeführt werden sollten. Auf Landschaftsebene kann die Förderung durch Arten späterer Sukzessionsstadien ein wichtiger Mechanismus für die Persistenz geschützter Pionierarten sein. KW - Diversität KW - Sukzession KW - Etablierung KW - Corynephorus canescens KW - Maßstabsabhängigkeit KW - diversity KW - succession KW - establishment KW - Corynephorus canescens KW - scale dependence Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-13218 ER - TY - THES A1 - Bieniawska, Zuzanna T1 - Functional analysis of the sucrose synthase gene family in Arabidopsis thaliana T1 - Funktionelle Analyse der Saccharose Synthase Genfamilie in Arabidopsis thaliana N2 - Sucrose synthase (Susy) is a key enzyme of sucrose metabolism, catalysing the reversible conversion of sucrose and UDP to UDP-glucose and fructose. Therefore, its activity, localization and function have been studied in various plant species. It has been shown that Susy can play a role in supplying energy in companion cells for phloem loading (Fu and Park, 1995), provides substrates for starch synthesis (Zrenner et al., 1995), and supplies UDP-glucose for cell wall synthesis (Haigler et al., 2001). Analysis of the Arabidopsis genome identifies six Susy isoforms. The expression of these isoforms was investigated using promoter-reporter gene constructs (GUS) and real time RT-PCR. Although these isoforms are closely related at the protein level they have radically different spatial and temporal patterns of expression in the plant with no two isoforms showing the same distribution. More than one isoform is expressed in all organs examined. Some of them have high but specific expression in particular organs or developmental stages whilst others are constantly expressed throughout the whole plant and across various stages of development. The in planta function of the six Susy isoforms were explored through analysis of T-DNA insertion mutants and RNAi lines. Plants without the expression of individual isoforms show no differences in growth and development, and are not significantly different from wild type plants in soluble sugars, starch and cellulose contents under all growth conditions investigated. Analysis of T-DNA insertion mutant lacking Sus3 isoform that was exclusively expressed in stomata cells only had a minor influence on guard cell osmoregulation and/or bioenergetics. Although none of the sucrose synthases appear to be essential for normal growth under our standard growth conditions, they may be necessary for growth under stress conditions. Different isoforms of sucrose synthase respond differently to various abiotic stresses. It has been shown that oxygen deprivation up regulates Sus1 and Sus4 and increases total Susy activity. However, the analysis of the plants with reduced expression of both Sus1 and Sus4 revealed no obvious effects on plant performance under oxygen deprivation. Low temperature up regulates Sus1 expression but the loss of this isoform has no effect on the freezing tolerance of non acclimated and cold acclimated plants. These data provide a comprehensive overview of the expression of this gene family which supports some of the previously reported roles for Susy and indicates the involvement of specific isoforms in metabolism and/or signalling. N2 - Saccharose spielt eine zentrale Rolle in höheren Pflanzen. Es zählt zu den wichtigsten Kohlenhydraten und wird als Nährstoff, Speicherstoff (z.B. in Zuckerrüben, Zuckerrohr, Mohrrüben) oder auch als potentielles Signalmolekül verwendet. Saccharose ist eines der primären Endprodukte der Photosynthese in den grünen Blättern der Pflanzen, kann aber auch in nicht-photosynthetisch aktiven Geweben (z.B. in keimenden Samen) synthetisiert und verstoffwechselt werden. Die Saccharosesynthase (Susy) stellt ein Schlüsselenzym im Saccharosestoffwechsel dar. Es katalysiert die reversible Umwandlung von Saccharose zu UDP-Glukose und Fruktose. Die Aktivität, die Lokalisierung und die Funktionen der Susy wurden bereits in verschiedenen Pflanzenarten untersucht. Dabei hatte sich herausgestellt, daß die Susy eine wichtige Rolle in der Bereitstellung von Energie für Transportprozesse spielt. Außerdem stellt Susy die Substrate für die Stärkesynthese in Speichergeweben, sowie fast alle Substrate für die Zellwandsynthese bereit. Eine Untersuchung des Genoms von Arabidopsis thaliana ergab, daß die Ackerschmalwand sechs Isoformen der Susy besitzt. Die Expression dieser Isoformen wurde mittels Echtzeit RT-PCR analysiert. Obwohl die verschiedenen Isoformen auf Proteinebene in ihrer Sequenz sehr ähnlich sind, zeigen sie Unterschiede in ihrem zeitlichen und räumlichen Auftreten innerhalb der Pflanze. Einige der Isoformen sind hoch exprimiert in speziellen Organen oder Entwicklungsstufen der Pflanze. Andere hingegen sind gleichmäßig in der ganzen Pflanze und über verschiedene Entwicklungsstufen hinaus exprimiert. In allen untersuchten Organen der Pflanze ist mehr als eine Isoform exprimiert. Um die spezifische Funktion der einzelnen Isoformen aufzuklären, wurden für alle sechs Saccharosesynthasen Mutanten-Linien isoliert und analysiert. Alle Pflanzen, bei denen die Expression einer bestimmten Isoform fehlte, zeigten im Vergleich zu Wildtyppflanzen keine signifikanten Unterschiede in Wachstum und Entwicklung. Des Weiteren waren die Gehalte an Stärke, Saccharose und Zellulose in Blättern und Wurzeln im Vergleich zu Wildtyppflanzen unverändert. Mutanten, denen die ausschließlich in Schließzellen lokalisierte Isoform Sus3 fehlte, zeigten nur geringe Veränderungen in der Osmoregulation und/oder der Bioenergetik der Schließzellen. Daraus kann gefolgert werden, dass in dem Ackerunkraut Arabidopsis keine der Saccharosesynthasen essentiell für normales Wachstum unter Standardbedingungen ist. Es ist jedoch möglich, dass Saccharosesynthasen unter Stressbedingungen benötigt werden. Es war bereits bekannt, dass einzelne Isoformen der Susy auf Stress reagieren und in ihrer Expression verändert sind. Es konnte gezeigt werden, daß Sauerstoffmangel zu einer Erhöhung der Expression der Isoformen Sus1 und Sus4 und zu einer Zunahme der Susy Gesamtaktivität führt. Die Analyse von Pflanzen mit reduzierter Expression von Sus1 und Sus4 zeigte jedoch, dass Sauerstoffmangel keinen offensichtlichen Einfluss auf das Wachstum dieser Pflanzen hat. Niedrige Temperaturen führen zu einer Erhöhung der Sus1 Expression, aber auch ein Verlust dieser Isoform hat keinen Einfluss auf die Gefriertoleranz von normalen oder an Kälte akklimatisierten Pflanzen. Diese Ergebnisse bieten einen umfassenden Einblick in die Expression der Genfamilie der Saccharosesynthase; sie untermauern die genannten Funktionen der Saccharosesynthase und weisen auf eine mögliche Beteiligung mehrerer Isoformen am Saccharosestoffwechsel und/oder der Signaltransduktion hin. KW - Saccharose Synthase KW - Genfamilie KW - Ackerschmalwand KW - sucrose synthase KW - gene family KW - Arabidopsis thaliana Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-13132 ER - TY - THES A1 - Treplin, Simone T1 - Inference of phylogenetic relationships in passerine birds (Aves: Passeriformes) using new molecular markers T1 - Neue molekulare Marker für die Phylogenie der Sperlingsvögel (Aves: Passeriformes) N2 - The aim of this study was to provide deeper insights in passerine phylogenetic relationships using new molecular markers. The monophyly of the largest avian order Passeriformes (~59% of all living birds) and the division into its suborders suboscines and oscines are well established. Phylogenetic relationships within the group have been extremely puzzling, as most of the evolutionary lineages originated through rapid radiation. Numerous studies have hypothesised conflicting passerine phylogenies and have repeatedly stimulated further research with new markers. In the present study, I used three different approaches to contribute to the ongoing phylogenetic debate in Passeriformes. I investigated the recently introduced gene ZENK for its phylogenetic utility for passerine systematics in combination and comparison to three already established nuclear markers. My phylogenetic analyses of a comprehensive data set yielded highly resolved, consistent and strongly supported trees. I was able to show the high utility of ZENK for elucidating phylogenetic relationships within Passeriformes. For the second and third approach, I used chicken repeat 1 (CR1) retrotransposons as phylogenetic markers. I presented two specific CR1 insertions as apomorphic characters, whose presence/absence pattern significantly contributed to the resolution of a particular phylogenetic uncertainty, namely the position of the rockfowl species Picathartes spp. in the passerine tree. Based on my results, I suggest a closer relationship of these birds to crows, ravens, jays, and allies. For the third approach, I showed that CR1 sequences contain phylogenetic signal and investigated their applicability in more detail. In this context, I screened for CR1 elements in different passerine birds, used sequences of several loci to construct phylogenetic trees, and evaluated their reliability. I was able to corroborate existing hypotheses and provide strong evidence for some new hypotheses, e.g. I suggest a revision of the taxa Corvidae and Corvinae as vireos are closer related to crows, ravens, and allies. The subdivision of the Passerida into three superfamilies, Sylvioidea, Passeroidea, and Muscicapoidea was strongly supported. I found evidence for a split within Sylvioidea into two clades, one consisting of tits and the other comprising warblers, bulbuls, laughingthrushes, whitethroats, and allies. Whereas Passeridae appear to be paraphyletic, monophyly of weavers and estrild finches as a separate clade was strongly supported. The sister taxon relationships of dippers and the thrushes/flycatcher/chat assemblage was corroborated and I suggest a closer relationship of waxwings and kinglets to wrens, tree-creepers, and nuthatches. N2 - Das Ziel dieser Arbeit war es, mittels neuer molekularer Marker zusätzliche Informationen über die phylogenetischen Verwandtschaftsverhältnisse der Sperlingsvögel (Passeriformes) zu erhalten. Die Monophylie der Passeriformes, der größten Vogelgruppe (~59% aller lebenden Arten), sowie ihrer Unterteilung in Suboscines und Oscines sind gut belegt. Die phylogenetischen Verwandtschaftsverhältnisse innerhalb dieser Gruppen sind jedoch seit jeher sehr schwer zu entschlüsseln, da sich die meisten Linien durch eine schnelle Radiation entwickelten. Zahlreiche Studien haben verschiedene Hypothesen zur Phylogenie der Sperlingsvögel aufgestellt und damit die Suche nach neuen Markern initiiert. In meiner Untersuchung habe ich drei verschiedene Ansätze benutzt, um zur Klärung der Phylogenie beizutragen. Ich untersuchte das kürzlich als Marker eingeführte ZENK-Gen im Hinblick auf seinen Nutzen in der Systematik der Sperlingsvögel in Kombination und im Vergleich zu drei bereits etablierten nukleären Markern. Meine phylogenetischen Analysen eines umfassenden Datensatzes ergaben hoch aufgelöste, konsistente und stark unterstütze Stammbäume, so dass ich den hohen Nutzwert des ZENK-Gens für die Klärung phylogenetischer Verwandtschaftsverhältnisse der Passeriformes zeigen konnte. Für den zweiten und dritten Ansatz habe ich Chicken Repeat 1 (CR1) Retrotransposons als phylogenetische Marker benutzt. Anhand zweier spezifischer CR1 Insertionen als apomorphe Merkmale und deren Insertionsmuster in verschiedenen Sperlingsvögeln konnte ich die phylogenetische Position der afrikanischen Felshüpfer, Picathartes spp., klären. Aufgrund meiner Ergebnisse schließe ich auf eine engere Verwandtschaft der Felshüpfer zu den Rabenvögeln. Durch meinen dritten Ansatz konnte ich nachweisen, dass CR1-Sequenzen phylogenetische Informationen enthalten, und untersuchte detailliert deren Anwendung als Marker. Dafür habe ich in verschiedenen Sperlingsvögeln nach CR1 Elementen gesucht und mit einigen dieser Sequenzen Stammbäume berechnet, um die Verlässlichkeit der Marker zu überprüfen. Durch meine Untersuchungen konnte ich existierende Hypothesen stützen und zusätzlich starke Hinweise auf neue Hypothesen finden. Beispielsweise schlage ich eine Revision der Taxa Corvidae und Corvinae vor, da Vireos eng mit den Rabenvögeln verwandt sind. Die Unterteilung der Passerida in die drei Unterfamilien Sylvioidea, Passeroidea und Muscicapoidea konnte deutlich bestätigt werden. Ich habe Hinweise auf eine Trennung der Sylvioidea in zwei taxonomische Gruppen erhalten, einer bestehend aus Meisen und Verwandten und der andere aus Grasmücken, Bülbüls, Häherlingen, Brillenvögeln und Verwandten. Während die Passeridae paraphyletisch sind, wurde die Monophylie der Weber und Astrilden als ein eigenes Taxon unterstützt. Das Schwestergruppenverhältnis zwischen Wasseramseln und dem Drossel/Fliegenschnäpper/Schmätzer-Taxon wurde ebenfalls bestätigt. Außerdem habe ich Hinweise auf eine nähere Verwandtschaft zwischen Seidenschwänzen und Goldhähnchen zu Zaunkönigen, Baumläufern und Kleibern gefunden. KW - Passeriformes KW - Phylogenie KW - ZENK KW - Retrotransposon KW - Chicken Repeat KW - Passeriformes KW - phylogeny KW - ZENK KW - retrotransposon KW - chicken repeat 1 Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-11230 ER - TY - THES A1 - Bölling, Christian T1 - Comprehensive metabolite analysis in Chlamydomonas reinhardtii : method development and application to the study of environmental and genetic perturbations T1 - Multiparallele Metabolitenanalyse in Chlamydomonas reinhardtii N2 - This study introduces a method for multiparallel analysis of small organic compounds in the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii, one of the premier model organisms in cell biology. The comprehensive study of the changes of metabolite composition, or metabolomics, in response to environmental, genetic or developmental signals is an important complement of other functional genomic techniques in the effort to develop an understanding of how genes, proteins and metabolites are all integrated into a seamless and dynamic network to sustain cellular functions. The sample preparation protocol was optimized to quickly inactivate enzymatic activity, achieve maximum extraction capacity and process large sample quantities. As a result of the rapid sampling, extraction and analysis by gas chromatography coupled to time-of-flight mass spectrometry (GC-TOF) more than 800 analytes from a single sample can be measured, of which over a 100 could be positively identified. As part of the analysis of GC-TOF raw data, aliquot ratio analysis to systematically remove artifact signals and tools for the use of principal component analysis (PCA) on metabolomic datasets are proposed. Cells subjected to nitrogen (N), phosphorus (P), sulfur (S) or iron (Fe) depleted growth conditions develop highly distinctive metabolite profiles with metabolites implicated in many different processes being affected in their concentration during adaptation to nutrient deprivation. Metabolite profiling allowed characterization of both specific and general responses to nutrient deprivation at the metabolite level. Modulation of the substrates for N-assimilation and the oxidative pentose phosphate pathway indicated a priority for maintaining the capability for immediate activation of N assimilation even under conditions of decreased metabolic activity and arrested growth, while the rise in 4-hydroxyproline in S deprived cells could be related to enhanced degradation of proteins of the cell wall. The adaptation to sulfur deficiency was analyzed with greater temporal resolution and responses of wild-type cells were compared with mutant cells deficient in SAC1, an important regulator of the sulfur deficiency response. Whereas concurrent metabolite depletion and accumulation occurs during adaptation to S deprivation in wild-type cells, the sac1 mutant strain is characterized by a massive incapability to sustain many processes that normally lead to transient or permanent accumulation of the levels of certain metabolites or recovery of metabolite levels after initial down-regulation. For most of the steps in arginine biosynthesis in Chlamydomonas mutants have been isolated that are deficient in the respective enzyme activities. Three strains deficient in the activities of N-acetylglutamate-5-phosphate reductase (arg1), N2 acetylornithine-aminotransferase (arg9), and argininosuccinate lyase (arg2), respectively, were analyzed with regard to activation of endogenous arginine biosynthesis after withdrawal of externally supplied arginine. Enzymatic blocks in the arginine biosynthetic pathway could be characterized by precursor accumulation, like the amassment of argininosuccinate in arg2 cells, and depletion of intermediates occurring downstream of the enzymatic block, e.g. N2-acetylornithine, ornithine, and argininosuccinate depletion in arg9 cells. The unexpected finding of substantial levels of the arginine pathway intermediates N-acetylornithine, citrulline, and argininosuccinate downstream the enzymatic block in arg1 cells provided an explanation for the residual growth capacity of these cells in the absence of external arginine sources. The presence of these compounds, together with the unusual accumulation of N-Acetylglutamate, the first intermediate that commits the glutamate backbone to ornithine and arginine biosynthesis, in arg1 cells suggests that alternative pathways, possibly involving the activity of ornithine aminotransferase, may be active when the default reaction sequence to produce ornithine via acetylation of glutamate is disabled. N2 - Entwicklung und Anwendung von Methoden zur multiparallelen Analyse von Metaboliten in der einzelligen Grünalge Chlamydomonas reinhardtii, einem der wichtigsten Modellorganismen der Zellbiologie, sind Gegenstand dieser Arbeit. Metabolomanalyse, die umfassende Analyse von Veränderungen der Konzentrationen von Stoffwechselprodukten durch Umweltreize oder genetische und entwicklungsbedingte Signale, ist ein wichtiges Komplement anderer Genomanalysemethoden, um die Integration von Genen, Proteinen und Metaboliten in ein nahtloses und dynamisches Netzwerk zur Aufrechterhaltung der Lebensfunktionen eines Organismus zu verstehen. Die Methode wurde im Hinblick auf schnelle Inaktivierung enzymatischer Aktivität, Maximierung der Extraktionskapazität und Behandlung großer Probenmengen optimiert. Im Ergebnis der Probenaufarbeitung, Extraktion und Analyse mittels Gaschromatographie und Time-Of-Flight-Massenspektrometrie konnten mehr als 800 analytische Signale in Einzelproben dargestellt werden, von denen über 100 identifiziert werden konnten. Die Arbeit stellt methodische Innovationen zur systematischen Erkennung von Artefakten in GC-MS Chromatogrammen und Werkzeuge zur Anwendung der Hauptkomponentenanalyse auf Metabolom-Daten vor. Zellen unter Stickstoff- (N), Phosphor- (P), Schwefel- (S), oder Eisen- (Fe) Mangel zeigen deutliche Unterschiede in ihrer Metabolitenausstattung. Die Anpassung an die einzelnen Nährstoffmangelsituationen ist durch spezifische Änderungen einer Reihe von Metaboliten zentraler Prozesse des Primärstoffwechsels gekennzeichnet. Die Konzentrationsänderungen von Substraten für die Stickstoffassimilation und den oxidativen Pentosephosphatweg deuten darauf hin, dass die Fähigkeit zur schnellen Aktivierung der N-Assimilation auch unter Bedingungen herabgesetzter Stoffwechsel- und Wachstumsaktivität aufrechterhalten wird. Die Akkumulation von 4-Hydroxyprolin unter Schwefelmangel könnte im Zusammenhang stehen mit der Degradation von Proteinen der Chlamydomonas-Zellwand, deren wesentlicher Bestandteil hydroxyprolinreiche Glykoproteine sind und die unter Schwefelmangel aktiv umgebaut wird. Die Anpassung an Schwefelmangel wurde mit größerer zeitlicher Auflösung in Wildtyp-Zellen und Zellen des sac1-Stammes untersucht. SAC1 ist ein zentraler Regulator der Schwefelmangelantwort in Chlamydomonas. Zeitgleiche Ab- und Zunahme von Metaboliten ist ein charakteristisches Element der Anpassung an Schwefelmangel in Wildtypzellen. Die Reaktion von SAC1-Mutanten auf Schwefelmangel ist durch weit reichenden Verlust zur Steuerung von Prozessen gekennzeichnet, die normalerweise zur vorübergehenden oder dauerhaften Anreicherung bestimmter Metabolite führen. Die Verfügbarkeit von Chlamydomonas-Stämmen mit fehlender Enzymaktivität für fast jeden der Schritte der Argininbiosynthese eröffnet die Möglichkeit, das Potential der Metabolitenanalyse zur Untersuchung der Regulation der Aminosäurebiosynthese in photosynthetischen Eukaryoten zur Anwendung zu bringen. Drei Stämme, mit fehlender Aktivität für N-Acetylglutamat-5-phosphat Reduktase (arg1), N2 Acetylornithin-Aminotransferase (arg9) beziehungsweise Argininosuccinat Lyase (arg2) wurden in Bezug auf die Aktivierung ihrer endogenen Argininbiosynthese nach Entzug externer Argininquellen analysiert. Die einzelnen enzymatischen Blocks konnten durch Precursor-Anreicherung, wie die Anhäufung von Argininosuccinat in arg2-Zellen, und Erschöpfung von Intermediaten nachgelagerter Reaktionen, beispielsweise die deutliche Abnahme von N2-Acetylornithin, Ornithin und Argininosuccinat in arg9-Zellen charakterisiert werden. Das unerwartete Vorhandensein von zum Teil das Wildtyp-Niveau überschreitender Mengen von N2-Acetylornithin, Citrullin und Argininosuccinat, die Produkte bzw. Substrate dem enzymatischen Block nachgelagerter Reaktionen in arg1-Zellen sind, bot eine Erklärung für eine noch vorhandene Restkapazität zum Wachstum des arg1-Stamms auch ohne äußere Arginingabe. Der Nachweis dieser Verbindungen sowie die ungewöhnliche Anreicherung von N-Acetylglutamat, der ersten Verbindung, die das Glutamat-Gerüst für die Ornithin- und Argininsynthese bindet, in arg1-Zellen könnte auf alternative Reaktionen, möglicherweise unter Beteiligung von Ornithin-Aminotransferase, zur Synthese von Ornithin hindeuten, die in Erscheinung treten, wenn die Synthesekette nach Acetylierung von Glutamat blockiert ist. KW - Chlamydomonas KW - Metabolite KW - Schwefel KW - Argininbiosynthese KW - Stoffwechsel KW - Chlamydomonas KW - metabolite profiling KW - metabolomics KW - sulfur KW - arginine biosynthesis Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-11329 ER - TY - THES A1 - Mungur, Rajsree T1 - Spatio-temporal analysis of florigenic signals in Arabidopsis thaliana, Sinapis alba and Brassica napus T1 - Zeitabhängige Analyse von blühinduzierenden Signalen in Arabidopsis thaliana, Sinapis alba und Brassica napus N2 - Daylength is one of several parameters controlling flowering time in many plant species. The day length is perceived in leaves, but how the floral signal is transduced to the shoot apex via the phloem to induce flowering remains to be elucidated. This study aimed at the identification of new candidates involved in the induction of flowering by employing three plant species, Arabidopsis thaliana, Sinapis alba and Brassica napus in combination with transcript profiling by Affymetrix chip hybridization, metabolite profiling by gas chromatography – mass spectrometry and targeted protein analysis using antibodies. All analyses were performed on tissue-specific samples and focused on phloem sap or phloem exudates. To find common transcript and metabolite candidates potentially associated with the floral transition, two independent induction systems in Arabidopsis were used: a photoextension system, whereby plants received fourteen additional hours of light, and a parallel dexamethasone-inducible system, which was centered on the induction of the known flowering gene CONSTANS (CO). Identification of signals preceding the CO cascade was possible using the light extension regime, while downstream events dependent on CO activation were compared in both systems. Altogether, a number of interesting transcript and metabolite candidates were identified in both systems with some degree of overlap. Sinapis alba was used to investigate the universality of the floral signals between species. Comparisons of metabolite data revealed a few common candidates that may prove interesting for further studies. In addition, a targeted approach was carried out to investigate the presence of the Flowering Locus T (FT) protein during different stages of flower development using an antibody. Interesting changes in the sizes of antigens from rape phloem were seen and appeared consistent in Arabidopsis and to a lesser extent in Sinapis. Overall, the broad surveying approaches for transcripts and metabolites used in this study revealed several new potential candidates involved in the induction and/or regulation of flowering. As far as the protein work, additional experiments will reveal the link between FT and floral induction as well as its role in maintaining the floral state using the abovementioned plant species. N2 - Die Tageslänge ist in vielen Pflanzenarten einer der Parameter, welche die Blütenbildung kontrollieren. Die Tageslänge wird in Blättern gemessen, aber wie das blühinduzierende Signal über das Phloem in den Apex übertragen wird ist bisher nicht aufgeklärt. Die vorliegende Arbeit hatte das Ziel neue Kandidaten zu identifizieren, die an der Blühinduktion beteiligt sind. Dazu wurden die drei Pflanzenarten Arabidopsis thaliana, Sinapis alba und Brassica napus auf der Ebene von Transkripten durch Affymetrix Chip Hybridisierungen, Metaboliten durch Gaschromatographie-Massenspektrometrie und ausgesuchten Proteinen durch Antikörper analysiert. Alle Untersuchungen wurden an gewebespezifischen Proben vorgenommen und waren auf Phloemsaft bzw. Phloemexsudate fokussiert. Um gemeinsame Transkript- und Metabolitkandidaten zu ermitteln, welche mit der Blühinduktion in Zusammenhang stehen, wurden zwei unabhängige Induktionssysteme in Arabidopsis verwendet: Ein Photoextensions-System, in dem die Pflanzen vierzehn zusätzlichen Stunden Licht ausgesetzt wurden und ein paralleles Dexamethason-induzierbares System, das die gezielte Aktivierung des bekannten blühinduzierenden Gens CONSTANS (CO) ermöglicht. Die Identifikation von CO-vorgelagerten Signalen war in dem Photoextensions-System möglich, während der CO-Aktivierung nachgelagerte Ereignisse in beiden Systemen verglichen werden konnten. Zusammengenommen konnten mit beiden Systemen eine Reihe von interessanten Transkript- und Metabolitkandidaten ermittelt werden, welche auch teilweise überlappten. Anschließend wurde Sinapis alba verwendet, um die Universalität der blühinduzierenden Signale in verschiedenen Pflanzenarten zu untersuchen. Vergleiche der Metabolitendaten ergaben ein paar gemeinsame Kandidaten, welche für weitergehende Untersuchungen interessant sein könnten. Zusätzlich wurden mittels Antikörpern gezielte Untersuchungen bezüglich der Präsenz des Flowering Locus T (FT) Proteins während verschiedener Stadien der Blütenentwicklung durchgeführt. Diese Untersuchungen zeigten interessante Änderungen der Größe des Antigens in Raps Phloemsaft, welche auch in Arabidopsis und in geringerem Maße in Sinapis sichtbar waren. Zusammengefasst resultierten die umfassenden Transkript- und Metabolitenmessungen, die in dieser Arbeit verwendet wurden, in einer Reihe von neuen möglichen Kandidaten, welche an der Induktion und/oder Regulation der Blütenbildung beteiligt sein könnten. Bezüglich des Proteins FT sind zusätzliche Experimente notwendig, um seine Rolle bei der Blühinduktion bzw. bei der Aufrechterhaltung des blühenden Zustandes aufzudecken. KW - Florigen KW - Florigen Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-9861 ER - TY - THES A1 - Feulner, Philine T1 - Adaptive radiation, speciation, and reproductive isolation in African weakly electric fish : (Genus Campylomormyrus, Mormyridae, Teleostei) T1 - Adaptive Radiation, Artbildung und reproduktive Isolation bei schwach elektrischen Fischen Afrikas : (Genus Campylomormyrus, Mormyridae, Teleostei) N2 - The ultimate aim of this study is to better understand the relevance of weak electricity in the adaptive radiation of the African mormyrid fish. The chosen model taxon, the genus Campylomormyrus, exhibits a wide diversity of electric organ discharge (EOD) waveform types. Their EOD is age, sex, and species specific and is an important character for discriminating among species that are otherwise cryptic. After having established a complementary set of molecular markers, I examined the radiation of Campylomormyrus by a combined approach of molecular data (sequence data from the mitochondrial cytochrome b and the nuclear S7 ribosomal protein gene, as well as 18 microsatellite loci, especially developed for the genus Campylomormyrus), observation of ontogeny and diversification of EOD waveform, and morphometric analysis of relevant morphological traits. I built up the first convincing phylogenetic hypothesis for the genus Campylomormyrus. Taking advantage of microsatellite data, the identified phylogenetic clades proved to be reproductively isolated biological species. This way I detected at least six species occurring in sympatry near Brazzaville/Kinshasa (Congo Basin). By combining molecular data and EOD analyses, I could show that there are three cryptic species, characterised by their own adult EOD types, hidden under a common juvenile EOD form. In addition, I confirmed that adult male EOD is species-specific and is more different among closely related species than among more distantly related ones. This result and the observation that the EOD changes with maturity suggest its function as a reproductive isolation mechanism. As a result of my morphometric shape analysis, I could assign species types to the identified reproductively isolated groups to produce a sound taxonomy of the group. Besides this, I could also identify morphological traits relevant for the divergences between the identified species. Among them, the variations I found in the shape of the trunk-like snout, suggest the presence of different trophic specializations; therefore, this trait might have been involved in the ecological radiation of the group. In conclusion, I provided a convincing scenario envisioning an adaptive radiation of weakly electric fish triggered by sexual selection via assortative mating due to differences in EOD characteristics, but caused by a divergent selection of morphological traits correlated with the feeding ecology. N2 - Das übergreifende Ziel dieser Arbeit ist das bessere Verständnis der Bedeutung der schwachen Elektrizität für die adaptive Radiation der Mormyriden Afrikas. Das gewählte Modell-Taxon, die Mormyriden-Gattung Campylomormyrus, zeigt eine große Vielfalt an elektrischen Entladungsformen. Diese Entladungsformen sind alters-, geschlechts-, sowie artspezifisch und ein wichtiges Unterscheidungskriterium von ansonsten kryptischen Arten. Ich untersuchte die Radiation der Gattung Campylomormyrus anhand eines kombinierten Ansatzes aus molekularen Daten (Sequenzdaten des mitochondrialen Cytochrom b Gens und des nukleären S7 ribosomalen Protein-Gens, sowie 18 Mikrosatelliten, speziell von mir entwickelt für die Gattung Campylomormyrus), Beobachtungen der Ontogenie und der Diversifikation der Entladungsform, sowie morphometrische Auswertungen der Gestalt relevanter morphologischer Merkmale. Ich erstellte eine erste phylogenetische Hypothese für die Gattung Campylomormyrus. Durch meine Mikrosatellitendaten, die als unabhängiger Beweis dienten, konnte ich zeigen, dass die identifizierten phylogenetischen Gruppen reproduktiv isolierte biologische Arten sind. Auf diese Weise konnte ich mindesten sechs Arten nachweisen, die in Sympatrie nahe Brazzaville/Kinshasa (Kongo-Becken) vorkommen. Durch die Übereinstimmung von molekularen Daten und Entladungsformen konnte ich drei kryptische Arten unterscheiden, die sich hinter einheitlichen juvenilen Entladungsformen verbergen, sich aber zu verschiedenen adulten Formen entwickelten. Des Weiteren konnte ich zeigen, dass die adulten männlichen Entladungsformen artspezifisch sind und, dass der Unterschied in der Entladungsform zwischen nah verwandten Arten deutlicher ausgeprägt ist als zwischen entfernter verwandten Arten. Dieses Ergebnis und die Beobachtung, dass sich die Entladungsform bei der Geschlechtsreife ändert, weisen darauf hin, dass die Entladungsform als reproduktiver Isolationsmechanismus dient. In einer morphometrischen Gestalt-Analyse verglich ich das Typen-Material der beschriebenen Arten mit den zuvor ermittelten reproduktiv isolierten Gruppen, um auf diese Weise deren Art zu bestimmen. Überdies konnte ich maßgebliche morphologische Unterscheidungsmerkmale identifizieren. Diese äußern sich hauptsächlich in der Gestalt der rüsselartigen Schnauze, könnten daher mit einer trophischen Spezialisierung einhergehen und eine ökologische Artbildung ermöglichen. Zusammenfassend entwickelte ich, in Übereinstimmung mit anderen Untersuchungen und theoretischen Überlegungen, eine plausible Hypothese einer adaptiven Radiation der schwach-elektrischen Fische Afrikas, ausgelöst durch sexuelle Selektion. Diese wirkt durch assortative Verpaarung, basierend auf Charakteristika der elektrischen Entladungsform. Verursacht wird der Prozess der adaptiven Radiation jedoch durch divergierende Selektion morphologischer Merkmale, die in Bezug zur Nahrungsökologie stehen. KW - Phylogenie KW - Ontogenie KW - Morphologie KW - Elektrische Fische KW - Nilhechte KW - Elektrische Entladung KW - Campylomormyrus KW - Mikrosatelliten KW - Campylomormyrus KW - Microsatellite Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-9560 ER - TY - THES A1 - Gómez-Porras, Judith Lucia T1 - In silico identification of genes regulated by abscisic acid in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. T1 - In silico Identifikation von Abszisinsaeure-regulierten Genen in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. N2 - Abscisic acid (ABA) is a major plant hormone that plays an important role during plant growth and development. During vegetative growth ABA mediates (in part) responses to various environmental stresses such as cold, drought and high salinity. The response triggered by ABA includes changes in the transcript level of genes involved in stress tolerance. The aim of this project was the In silico identification of genes putatively regulated by ABA in A. thaliana. In silico predictions were combined with experimental data in order to evaluate the reliability of computational predictions. Taking advantage of the genome sequence of A. thaliana publicly available since 2000, 1 kb upstream sequences were screened for combinations of cis-elements known to be involved in the regulation of ABA-responsive genes. It was found that around 10 to 20 percent of the genes of A. thaliana might be regulated by ABA. Further analyses of the predictions revealed that certain combinations of cis-elements that confer ABA-responsiveness were significantly over-represented compared with results in random sequences and with random expectations. In addition, it was observed that other combinations that confer ABA-responsiveness in monocotyledonous species might not be functional in A. thaliana. It is proposed that ABA-responsive genes in A. thaliana show pairs of ABRE (abscisic acid responsive element) with MYB binding sites, DRE (dehydration responsive element) or with itself. The analysis of the distances between pairs of cis-elements suggested that pairs of ABREs are bound by homodimers of ABRE binding proteins. In contrast, pairs between MYB binding sites and ABRE, or DRE and ABRE showed a distance between cis-elements that suggested that the binding proteins interact through protein complexes and not directly. The comparison of computational predictions with experimental data confirmed that the regulatory mechanisms leading to the induction or repression of genes by ABA is very incompletely understood. It became evident that besides the cis-elements proposed in this study to be present in ABA-responsive genes, other known and unknown cis-elements might play an important role in the transcriptional regulation of ABA-responsive genes. For example, auxin-related cis elements, or the cis-elements recognized by the NAM-family of transcription factors (Non-Apical meristem). This work documents the use of computational and experimental approaches to analyse possible interactions between cis-elements involved in the regulation of ABA-responsive genes. The computational predictions allowed the distinction between putatively relevant combinations of cis-elements from irrelevant combinations of cis-elements in ABA-responsive genes. The comparison with experimental data allowed to identify certain cis-elements that have not been previously associated to the ABA-mediated transcriptional regulation, but that might be present in ABA-responsive genes (e.g. auxin responsive elements). Moreover, the efforts to unravel the gene regulatory network associated with the ABA-signalling pathway revealed that NAM-transcription factors and their corresponding binding sequences are important components of this network. N2 - Pflanzen reagieren auf aeußere Stresseinwirkung (z.B. Trockenheit oder Hitze) u.a. mit der Bildung bestimmter Hormone. Diese Hormone wiederum bewirken eine Vielzahl komplexer Reaktionen (z.B. im Stoffwechsel und in der Genexpression), die zum Ziel haben, die Pflanzen widerstandsfaehiger gegen die Stresssituation zu machen. Ein wichtiges Stresshormon ist die Abzisinsaeure (ABA, fuer engl. „abscisic acid“). Experimentell koennen Pflanzen durch die Gabe von ABA zu Reaktionen gezwungen werden, die normalerweise nur unter Stressbedingungen beobachtet werden. Hierzu zaehlen vor allem eine Reduktion der Spaltoeffnungen in den Blaettern, um den Wasserverlust infolge von Transpiration zu minimieren, und eine massive Umprogrammierung der Genexpression. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von ABA auf die Genexpression in der Modellpflanze Arabidopsis thaliana untersucht. Hierzu wurden bioinformatorische und experimentelle Ansaetze verknuepft. Die bioinformatorischen Ansaetze bedienten sich der bekannten Sequenz des Genoms von A. thaliana. Mit Hilfe verschiedener geeigneter Computerprogramme wurden im Genom Gene identifiziert, deren Expression potentiell durch ABA reguliert wird. Die so erhaltenen Vorhersagen der verschiedenen Programme wurden miteinander und mit eigenen als auch mit publizierten experimentellen Daten verglichen, um die Qualitaet der Vorhersagen zu beurteilen. Die wichtigste Schlussfolgerung aus den Ergebnissen dieser Arbeit ist, dass gegenwaertig bioinformatorische Ansaetze allein nicht ausreichen, um biologische Prozesse zufriedenstellend zu analysieren. In der vorliegenden Arbeit ermoeglichte erst eine Kombination aus bioinformatorischen und experimentellen Ansaetzen die Generierung neuer, abgesicherter Hypothesen zur ABA-induzierten Umprogrammierung der Genexpression. KW - Bioinformatik KW - Abszisinsäure KW - Promotoren KW - bioinformatics KW - regulation KW - ABA KW - Arabidopsis Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-7401 ER - TY - THES A1 - Schauer, Nicolas T1 - Quantitative trait loci (QTL) for metabolite accumulation and metabolic regulation : metabolite profiling of interspecific crosses of tomato T1 - Metabolomische Analyse von interspezifischen Tomaten N2 - The advent of large-scale and high-throughput technologies has recently caused a shift in focus in contemporary biology from decades of reductionism towards a more systemic view. Alongside the availability of genome sequences the exploration of organisms utilizing such approach should give rise to a more comprehensive understanding of complex systems. Domestication and intensive breeding of crop plants has led to a parallel narrowing of their genetic basis. The potential to improve crops by conventional breeding using elite cultivars is therefore rather limited and molecular technologies, such as marker assisted selection (MAS) are currently being exploited to re-introduce allelic variance from wild species. Molecular breeding strategies have mostly focused on the introduction of yield or resistance related traits to date. However given that medical research has highlighted the importance of crop compositional quality in the human diet this research field is rapidly becoming more important. Chemical composition of biological tissues can be efficiently assessed by metabolite profiling techniques, which allow the multivariate detection of metabolites of a given biological sample. Here, a GC/MS metabolite profiling approach has been applied to investigate natural variation of tomatoes with respect to the chemical composition of their fruits. The establishment of a mass spectral and retention index (MSRI) library was a prerequisite for this work in order to establish a framework for the identification of metabolites from a complex mixture. As mass spectral and retention index information is highly important for the metabolomics community this library was made publicly available. Metabolite profiling of tomato wild species revealed large differences in the chemical composition, especially of amino and organic acids, as well as on the sugar composition and secondary metabolites. Intriguingly, the analysis of a set of S. pennellii introgression lines (IL) identified 889 quantitative trait loci of compositional quality and 326 yield-associated traits. These traits are characterized by increases/decreases not only of single metabolites but also of entire metabolic pathways, thus highlighting the potential of this approach in uncovering novel aspects of metabolic regulation. Finally the biosynthetic pathway of the phenylalanine-derived fruit volatiles phenylethanol and phenylacetaldehyde was elucidated via a combination of metabolic profiling of natural variation, stable isotope tracer experiments and reverse genetic experimentation. N2 - Die Einführung von Hochdurchsatzmethoden zur Analyse von biologischen Systemen, sowie die umfangreiche Sequenzierung von Genomen haben zu einer Verlagerung der Forschung „im Detail“ zu einer ganzheitlicheren Betrachtungsweise auf Systemebene geführt. Aus einer jahrhundertlangen, intensiven Züchtung und Selektion von Nutzpflanzen resultierte gleichzeitig eine Abnahme der genetischen Varianz. Daraus resultierend sind Nutzpflanzen anfälliger gegenüber Stressfaktoren, wie Pathogenen, hohen Salzkonzentrationen oder Trockenheit, als ihre Wildarten. Das Potential konventioneller Züchtung scheint somit heute an seine Grenzen gekommen zu sein. Daher versucht man mittels moderner Molekulartechnik, wie zum Beispiel Marker-gestützte Selektion, Gene oder ganze Genombereiche von Wildarten mit hoher genetischer Variation in Nutzpflanzen einzukreuzen, vornehmlich mit dem Ziel einer Ertrags- bzw. Resistenzsteigerung. Neueste medizinische Studien belegen, dass die Ernährung eine wesentliche Rolle für die menschliche Gesundheit spielt. Besonders wichtig sind hierbei die gesundheitsfördernden Substanzen in pflanzlichen Nahrungsmitteln. Aus diesem Grund kommt der Erforschung der biochemischen Zusammensetzung von biologischen Proben eine immer größere Bedeutung zu. Diese Untersuchung kann elegant durch Metabolitenprofile, welche die multivariate Analyse komplexer biologischer Proben erlauben, durchgeführt werden. In dieser Arbeit wurde zur Untersuchung der biochemischen Zusammensetzung von Tomatenwildarten und interspezifischen S. pennellii Tomatenintrogressionslinien (IL) eine GC/MS basierte Metabolitenanalyseplattform verwendet. Hierzu war es zunächst notwendig eine Massenspektrenbibliothek, zur Annotierung von Massenspektren und Retentionsindices von, in pflanzlichen Proben vorkommenden, Metaboliten anzulegen. Die Analyse der Tomatenwildarten ergab große Unterschiede gegenüber der Kulturtomate im Hinblick auf den Gehalt an Amino- und organischen Säuren, sowie der Zuckerzusammensetzung und den Gehalt an Sekundärmetaboliten. Die darauf folgende Analyse der ILs, von den jede ein genau definiertes genomisches Segment von S. pennellii beinhaltet, bestätigte diese enorme Variation mit 889 metabolischen und 326 ertragsassozierten-Veränderungen in den ILs. Die metabolischen Veränderungen zeichneten sich durch abnehmende bzw. steigende Gehalte von einzelnen Metaboliten, aber auch durch eine koordinierte Änderung aus. In dieser Arbeit wurde weiterhin der Biosyntheseweg der Volatilenstoffe Phenylethanol und Phenylacetaldehyd mit Hilfe einer IL untersucht. Hierbei konnten durch stabile Isotopenmarkierung und eines „reverse genetics“-Ansatzes Gene bzw. Enzyme identifiziert werden, die für die Dekarboxylierung des Eduktes Phenylalanin verantwortlich sind. Diese Arbeit beschreibt erstmals die umfassende Analyse von biochemischen Komponenten auf Genombasis in Tomatenintrogressionslinien und zeigt damit ein Werkzeug auf zur Identifizierung von qualitativen biochemischen Merkmalen in der modernen molekularen Züchtung. KW - Tomate KW - Metabolit KW - GC-MS KW - Introgression KW - Frucht KW - Metabolome KW - Züchtung KW - metabolic genomics KW - Tomato KW - metabolite profiling KW - metabolome KW - breeding KW - crops KW - fruit KW - metabolite breeding KW - metabolic genomics Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-7643 ER - TY - THES A1 - Birkemeyer, Claudia Sabine T1 - Signal-metabolome interactions in plants T1 - Signalmolekuel-Metabolom Interaktionen in Pflanzen N2 - From its first use in the field of biochemistry, instrumental analysis offered a variety of invaluable tools for the comprehensive description of biological systems. Multi-selective methods that aim to cover as many endogenous compounds as possible in biological samples use different analytical platforms and include methods like gene expression profile and metabolite profile analysis. The enormous amount of data generated in application of profiling methods needs to be evaluated in a manner appropriate to the question under investigation. The new field of system biology rises to the challenge to develop strategies for collecting, processing, interpreting, and archiving this vast amount of data; to make those data available in form of databases, tools, models, and networks to the scientific community. On the background of this development a multi-selective method for the determination of phytohormones was developed and optimised, complementing the profile analyses which are already in use (Chapter I). The general feasibility of a simultaneous analysis of plant metabolites and phytohormones in one sample set-up was tested by studies on the analytical robustness of the metabolite profiling protocol. The recovery of plant metabolites proved to be satisfactory robust against variations in the extraction protocol by using common extraction procedures for phytohormones; a joint extraction of metabolites and hormones from plant tissue seems practicable (Chapter II). Quantification of compounds within the context of profiling methods requires particular scrutiny (Chapter II). In Chapter III, the potential of stable-isotope in vivo labelling as normalisation strategy for profiling data acquired with mass spectrometry is discussed. First promising results were obtained for a reproducible quantification by stable-isotope in vivo labelling, which was applied in metabolomic studies. In-parallel application of metabolite and phytohormone analysis to seedlings of the model plant Arabidopsis thaliana exposed to sulfate limitation was used to investigate the relationship between the endogenous concentration of signal elements and the ‘metabolic phenotype’ of a plant. An automated evaluation strategy was developed to process data of compounds with diverse physiological nature, such as signal elements, genes and metabolites – all which act in vivo in a conditional, time-resolved manner (Chapter IV). Final data analysis focussed on conditionality of signal-metabolome interactions. N2 - Die instrumentelle Analytik stellt mit ihrem unschätzbaren Methodenreichtum Analysenwerkzeuge zur Verfügung, die seit ihrem Einzug in die Biologie die Aufzeichnung immer komplexerer ‚Momentaufnahmen’ von biologischen Systemen ermöglichen. Konkret hervorzuheben sind dabei vor allem die sogenannten ‚Profilmethoden’. Die Anwendung von Profilmethoden zielt darauf ab, aus einer bestimmten Stoffklasse so viele zugehörige Komponenten wie nur möglich gleichzeitig zu erfassen. Für die Auswertung derart komplexer Daten müssen nun auch entsprechende Auswertungsmethoden bereit gestellt werden. Das neu entstandene Fachgebiet der Systembiologie erarbeitet deshalb Strategien zum Sammeln, Auswerten und Archivieren komplexer Daten, um dieses gesammelte Wissen in Form von Datenbanken, Modellen und Netzwerken der allgemeinen Nutzung zugänglich zu machen. Vor diesem Hintergrund wurde den vorhandenen Profilanalysen eine Methode zur Erfassung von Pflanzenhormonen hinzugefügt. Verschiedene Experimente bestätigten die Möglichkeit zur Kopplung von Pflanzenhormon- und Pflanzeninhaltsstoff(=metabolit)-Profilanalyse. In weiteren Untersuchungen wurde das Potential einer innovativen Standardisierungstechnologie für die mengenmässige Erfassung von Pflanzeninhaltsstoffen in biologischen Proben betrachtet (in vivo labelling mit stabilen Isotopen). Hormon- und Metabolitprofilanalyse wurden dann parallel angewandt, um Wechselwirkungen zwischen der Konzentration von Signalkomponenten und der Ausprägung des Stoffwechsels in Keimlingen der Modellpflanze Arabidopsis thaliana zu untersuchen. Es wurde eine Prozessierungsmethode entwickelt, die es auf einfache Art und Weise erlaubt, Daten oder Komponenten verschiedenen Ursprungs wie Signalelemente, Gene und Metabolite, die in biologischen Systemen zeitlich versetzt aktiv oder verändert erscheinen, im Zusammenhang zu betrachten. Die abschließende Analyse aller Daten richtet sich auf die Abschätzung der Bedingtheit von Signal-Metabolismus Interaktionen. KW - Pflanzenhormon KW - Metabolom KW - Metabolit KW - Massenspektrometrie KW - GC-MS KW - Profilmessung KW - Profilmethode KW - Derivatisierung KW - Wissensextraktion KW - Datenbank KW - Zeatin KW - Pathwaysuche KW - Pathway Abbildung KW - Metabolitprofil KW - Signalstoffe KW - zeatin KW - pathway search KW - pathway mapping KW - metabolite profiling KW - signal compounds Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-7144 ER - TY - THES A1 - Kolasa, Anna T1 - Identification and analysis of new phloem proteins from Brassicaceae and Cucurbitaceae T1 - Identifizierung und Analyse neuer Phloemproteine aus Brassicaceen und Cucurbitaceen N2 - The major aim of this work was the identification of new phloem sap proteins and a metabolic characterisation of this transport fluid. The experiments were performed on the three plant species C. sativus, C. maxima and B. napus. To characterise the phloem samples from B. napus, a new model plant for phloem analysis, western blot tests together with metabolite profiling were performed. GC-MS metabolite profiling and enzyme assays were used for measuring metabolites in the phloem of B. napus. Results from the phloem sap measurements showed, as expected, a typical sugar distribution for apoplasmic phloem loaders with sucrose being the predominant sugar. In stem extracts, the most abundant sugar was glucose with much lower fructose and sucrose levels. With the GC-MS approach it was possible to identify a number of metabolites which showed a differential distribution when phloem and stem tissue extracts were compared. For protein identification, two different approaches were employed (i) screening expression libraries with total phloem protein specific antisera and (ii) protein separation on 2 DE gels followed by ESI-MS/MS sequence analyses. For the first approach, three different phloem protein-specific antisera were produced and expression libraries were constructed. Phloem protein antisera were tested for specificity and some attempts to estimate specific epitopes were undertaken. Screening of the libraries resulted in the identification of 14 different proteins from all investigated species. Analyses of B. napus phloem sap proteins from 2 DE with ESI-MS/MS resulted in the identification of 5 different proteins. The phloem localisation of the identified proteins was additionally confirmed by western blot tests using specific antibodies. In order to functionally characterise some selected phloem proteins from B. napus, the group of potential calcium-binding polypeptides was analysed for functional Ca+2 binding properties and several Ca+2–binding proteins could be isolated. However, their sequences could as yet not be determined. Another approach used for functional protein characterisation was the analysis of Arabidopsis T-DNA insertion mutants. Four available mutants with insertions in phloem protein-specific genes were chosen from the SALK and GABI-Kat collections and selected homozygous lines were tested for the presence of the investigated proteins. In order to verify if the product of one of the mutated gene (GRP 7) is transported through the phloem, grafting experiments were performed followed by western blot analyses. Although the employed antiserum against GRP 7 protein did not allow distinguishing between the mutant and the wild type plants, successful Arabidopsis grafting could be established as a promising method for further studies on protein translocation through the phloem. N2 - Das Hauptziel der vorliegenden Arbeit war die Identifizierung neuer Phloemsaftproteine sowie die metabolische Charakterisierung dieser Transportflüssigkeit. Die beschriebenen Experimente wurden an den vier Pflanzenarten Cucumis sativus, Curcurbita maxima, Brassica napus und Arabidopsis thaliana durchgeführt. Für die Analyse von Phloemsaftproteinen aus B. napus war zunächst wichtig, die Herkunft und Reinheit der gewonnenen Phloemproben mittels Western Blot Analysen, Bestimmungen der Zuckerkonzentration und einer metabolischen Charakterisierung mittels GC-MS zu überprüfen. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigten erwartungsgemäß die typische Zuckerzusammensetzung für apoplastische Phloembelader, mit Saccharose als vorherrschendem Zucker. In Stängelextrakten war dagegen Glukose der vorherrschende Zucker, wogegen Fruktose und Saccharose in wesentlich geringeren Mengen nachweisbar waren. Mit diesem GS-MS Ansatz war es möglich eine Vielzahl von Metaboliten zu identifizieren, die eine differentielle Verteilung in Phloemsaft und Stängelextrakt aufweisen. Ein Versuchsansatz zur Proteinanalyse war es Gene, welche Phloemproteine kodieren, zu klonieren. Zu diesem Zweck wurden Expressionsbibliotheken von C. maxima, C. sativus und B. napus konstruiert und anschließend mittels Phloemprotein-spezifischen Antiseren der entsprechenden Arten durchforstet. Des Weiteren wurden die Antiseren auf ihre Spezifität getestet und es wurden Versuche durchgeführt, um mögliche spezifische Epitope zu identifizieren. Die Durchforstung der Expressionsbibliotheken führte zur Identifizierung von 14 verschiedenen Proteinen aus den drei untersuchten Pflanzenarten. Im Rahmen einer umfassenden Charakterisierung des Phloemproteoms von B. napus mittels zwei-dimensionaler Gelelektorphorese (2 DE) und anschließender Massenspektrometrie (ESI-MS/MS), wurden insgesamt 5 neue Phloemproteine identifiziert. Die Lokalisierung dieser Proteine im Phloem wurde zusätzlich mittels Western Blot Analysen unter Verwendung spezifischer Antikörper verifiziert. Die funktionelle Analyse einiger dieser neu identifizierten Proteine wurde unter Zuhilfenahme von „knock-out“ Mutanten der Modelpflanze Arabidopsis thaliana begonnen. Das vorrangige Ziel dabei war, zu überprüfen, ob die ausgewählten Proteine tatsächlich im Phloem transportiert werden. Dazu wurden so genannte Pfropfungsversuche durchgeführt. Vier Arabidopsis Mutanten, die Insertionen in Phloemprotein-spezifischen Genen aufweisen wurden aus der SALK bzw. aus der GABI-KAT Sammlung ausgewählt und die selektierten, homozygoten Linien auf die Anwesenheit der entsprechenden Proteine hin untersucht. Um letztendlich den Transport eines der mutierten Genprodukte zu verifizieren (GRP 7), wurden Pfropfungsversuche mit anschließender Western Blot Analyse durchgeführt. Obwohl das entwickelte Antiserum gegen GRP 7 es nicht erlaubte zwischen mutierten und Wildtyp Pflanzen zu unterscheiden, konnte doch die Pfropfung von Arabidopsis Pflanzen erfolgreich etabliert werden. Somit steht nun eine Erfolg versprechende Methode zur Verfügung, um den Proteintransport durch das Phloem zu untersuchen. Eine weitere Gruppe von Phloemproteinen aus B. napus, solche mit einer potentiellen Calcium-bindenden Domäne, wurden ebenfalls funktionell auf mögliche Ca2+-bindende Eigenschaften hin untersucht, dabei konnten einige Ca2+–bindende Proteine isoliert werden, deren Sequenz bislang jedoch noch unbekannt ist. KW - Phloemproteine KW - Phloem KW - phloem KW - phloem proteins Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-6939 ER - TY - THES A1 - Zhang, Baichen T1 - Dissection of phloem transport in cucurbitaceae by metabolomic analysis T1 - Analyse des Phloemtransports bei Cucurbitaceae mittels Metabolomics N2 - This thesis aimed to investigate several fundamental and perplexing questions relating to the phloem loading and transport mechanisms of Cucurbita maxima, by combining metabolomic analysis with cell biological techniques. This putative symplastic loading species has long been used for experiments on phloem anatomy, phloem biochemistry, phloem transport physiology and phloem signalling. Symplastic loading species have been proposed to use a polymer trapping mechanism to accumulate RFO (raffinose family oligosaccharides) sugars to build up high osmotic pressure in minor veins which sustains a concentration gradient that drives mass flow. However, extensive evidence indicating a low sugar concentration in their phloem exudates is a long-known problem that conflicts with this hypothesis. Previous metabolomic analysis shows the concentration of many small molecules in phloem exudates is higher than that of leaf tissues, which indicates an active apoplastic loading step. Therefore, in the view of the phloem metabolome, a symplastic loading mechanism cannot explain how small molecules other than RFO sugars are loaded into phloem. Most studies of phloem physiology using cucurbits have neglected the possible functions of vascular architecture in phloem transport. It is well known that there are two phloem systems in cucurbits with distinctly different anatomical features: central phloem and extrafascicular phloem. However, mistaken conclusions on sources of cucurbit phloem exudation from previous reports have hindered consideration of the idea that there may be important differences between these two phloem systems. The major results are summarized as below: 1) O-linked glycans in C.maxima were structurally identified as beta-1,3 linked glucose polymers, and the composition of glycans in cucurbits was found to be species-specific. Inter-species grafting experiments proved that these glycans are phloem mobile and transported uni-directionally from scion to stock. 2) As indicated by stable isotopic labelling experiments, a considerable amount of carbon is incorporated into small metabolites in phloem exudates. However, the incorporation of carbon into RFO sugars is much faster than for other metabolites. 3) Both CO2 labelling experiments and comparative metabolomic analysis of phloem exudates and leaf tissues indicated that metabolic processes other than RFO sugar metabolism play an important role in cucurbit phloem physiology. 4) The underlying assumption that the central phloem of cucurbits continuously releases exudates after physical incision was proved wrong by rigorous experiments including direct observation by normal microscopy and combined multiple-microscopic methods. Errors in previous experimental confirmation of phloem exudation in cucurbits are critically discussed. 5) Extrafascicular phloem was proved to be functional, as indicated by phloem-mobile carboxyfluorescein tracer studies. Commissural sieve tubes interconnect phloem bundles into a complete super-symplastic network. 6) Extrafascicular phloem represents the main source of exudates following physical incision. The major transported metabolites by these extrafacicular phloem are non-sugar compounds including amino acids, O-glycans, amines. 7) Central phloem contains almost exclusively RFO sugars, the estimated amount of which is up to 1 to 2 molar. The major RFO sugar present in central phloem is stachyose. 8) Cucurbits utilize two structurally different phloem systems for transporting different group of metabolites (RFO sugars and non-RFO sugar compounds). This implies that cucurbits may use spatially separated loading mechanisms (apoplastic loading for extrafascicular phloem and symplastic loading for central phloem) for supply of nutrients to sinks. 9) Along the transport systems, RFO sugars were mainly distributed within central phloem tissues. There were only small amounts of RFO sugars present in xylem tissues (millimolar range) and trace amounts of RFO sugars in cortex and pith. The composition of small molecules in external central phloem is very different from that in internal central phloem. 10) Aggregated P-proteins were manually dissected from central phloem and analysed by both SDS-PAGE and mass spectrometry. Partial sequences of peptides were obtained by QTOF de novo sequencing from trypsin digests of three SDS-PAGE bands. None of these partial sequences shows significant homology to known cucurbit phloem proteins or other plant proteins. This proves that these central phloem proteins are a completely new group of proteins different from those in extrafascicular phloem. The extensively analysed P-proteins reported in literature to date are therefore now shown to arise from extrafascicular phloem and not central phloem, and therefore do not appear to be involved in the occlusion processes in central phloem. N2 - Phloem transportiert ein ausgedehntes Spektrum an Molekülen zwischen Pflanzenorganen, um Wachstum und Entwicklung zu koordinieren. Folglich ist eine umfassende und unvoreingenommene Metabolom-Analyse notwendig, um unser Verständnis über den Transport von Stoffwechselprodukten sowie über Phloemtransport zu vertiefen. Phloemexsudate von Kürbispflanzen werden unter Verwendung der Metabolom-Analyse analysiert. Bei diesen Pflanzen wird angenommen, dass sie symplastische Beladungswege verwenden, um Photoassmilate als Ausgangsschritt des Phloemtransportes zu konzentrieren. Zwei neue Familien Callose-verwandter Substanzen, 1,3-Overknüpfte Glycane, sowie eine Reihe anderer kleinerer Metabolite werden in den Phloemexsudaten detektiert. Metabolom-Daten und physiologische Experimente widersprechen früher berichtetem Verständnis des Phloemexsudationsprozesses in Kürbispflanzen. Folglich bestätigt sich der Phloemexsudationsprozeß durch Kombination unterschiedlicher mikroskopischer Techniken. Kürbispflanzen besitzen zwei Phloemsysteme mit eindeutigen anatomischen Eigenschaften. Es zeigt sich, daß Phloemexsudate in Kürbissen hauptsächlich vom extrafaszikulären Phloem, nicht vom zentralen Phloem, stammen. In den letzten Jahrzehnten wurde gewöhnlich mißverstanden, daß Phloemexsudate vom zentralen Phloem stammen. Die eindeutigen metabolischen Profile der unterschiedlichen Phloemsysteme, die durch Metabolom-Analysen in der räumlichen Auflösung beobachtet werden, bestätigen die unterschiedlichen physiologischen Funktionen der zwei unterschiedlichen Phloemsysteme: das zentrale Phloem transportiert hauptsächlich Zucker, während das extrafaszikuläre Phloem ein ausgedehntes Spektrum von Metaboliten transportiert. Es kann auch ein unterschiedliches metabolisches Profil kleiner Moleküle zwischen internem und externem zentralem Phloem beobachtet werden. Von Strukturproteinen des zentralen Phloems wurden auch Proben genommen und mittels Massenspektrometrie analysiert. Diese Proteine erweisen sich als neuartige Proteine, die sich zu denen im extrafaszikulären Phloem unterscheiden. Dies bestätigt ferner den Funktionsunterschied der unterschiedlichen Phloemsysteme in Kürbispflanzen. Basierend auf diesen neuartigen Entdeckungen des Phloem-Metaboloms und dem vorhergehenden Wissen über den Phloemtransport in Kürbispflanzen, wird ein neues Modell vorgeschlagen, um den Mechanismus des Phloemtransports in der symplastischen Beladung zu verstehen. KW - phloem KW - metabolomics KW - cucurbits KW - phloem proteins KW - phloem KW - symplastic loading KW - metabolomic analysis KW - p-proteins KW - phloem architecture Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-6644 ER - TY - THES A1 - Kolbe, Anna T1 - Redox-regulation of starch and lipid synthesis in leaves T1 - Redox-Regulation von Stärke- und Lipidsynthese in Blättern N2 - Post-translational redox-regulation is a well-known mechanism to regulate enzymes of the Calvin cycle, oxidative pentose phosphate cycle, NADPH export and ATP synthesis in response to light. The aim of the present thesis was to investigate whether a similar mechanism is also regulating carbon storage in leaves. Previous studies have shown that the key-regulatory enzyme of starch synthesis, ADPglucose pyrophosphorylase (AGPase) is inactivated by formation of an intermolecular disulfide bridge between the two catalytic subunits (AGPB) of the heterotetrameric holoenzyme in potato tubers, but the relevance of this mechanism to regulate starch synthesis in leaves was not investigated. The work presented in this thesis shows that AGPase is subject to post-translational redox-regulation in leaves of pea, potato and Arabidopsis in response to day night changes. Light was shown to trigger posttranslational redox-regulation of AGPase. AGPB was rapidly converted from a dimer to a monomer when isolated pea chloroplasts were illuminated and from a monomer to a dimer when preilluminated leaves were darkened. Conversion of AGPB from dimer to monomer was accompanied by an increase in activity due to changes in the kinetik properties of the enzyme. Studies with pea chloroplast extracts showed that AGPase redox-activation is mediated by thioredoxins f and m from spinach in-vitro. In a further set of experiments it was shown that sugars provide a second input leading to AGPase redox activation and increased starch synthesis and that they can act as a signal which is independent from light. External feeding of sugars such as sucrose or trehalose to Arabidopsis leaves in the dark led to conversion of AGPB from dimer to monomer and to an increase in the rate of starch synthesis, while there were no significant changes in the level of 3PGA, an allosteric activator of the enyzme, and in the NADPH/NADP+ ratio. Experiments with transgenic Arabidopsis plants with altered levels of trehalose 6-phosphate (T6P), the precursor of trehalose synthesis, provided genetic evidence that T6P rather than trehalose is leading to AGPase redox-activation. Compared to Wt, leaves expressing E.coli trehalose-phosphate synthase (TPS) in the cytosol showed increased activation of AGPase and higher starch level during the day, while trehalose-phosphate phosphatase (TPP) overexpressing leaves showed the opposite. These changes occurred independently of changes in sugar and sugar-phosphate levels and NADPH/NADP+ ratio. External supply of sucrose to Wt and TPS-overexpressing leaves led to monomerisation of AGPB, while this response was attenuated in TPP expressing leaves, indicating that T6P is involved in the sucrose-dependent redox-activation of AGPase. To provide biochemical evidence that T6P promotes redox-activation of AGPase independently of cytosolic elements, T6P was fed to intact isolated chloroplasts for 15 min. incubation with concentrations down to 100 µM of T6P, but not with sucrose 6-phosphate, sucrose, trehalose or Pi as controls, significantly and specifically increased AGPB monomerisation and AGPase activity within 15 minutes, implying T6P as a signal reporting the cytosolic sugar status to the chloroplast. The response to T6P did not involve changes in the NADPH/NADP+ ratio consistent with T6P modulating redox-transfer to AGPase independently of changes in plastidial redox-state. Acetyl-CoA carboxylase (ACCase) is known as key-regulatory enzyme of fatty acid and lipid synthesis in plants. At the start of the present thesis there was mainly in vitro evidence in the literature showing redox-regulation of ACCase by DTT, and thioredoxins f and m. In the present thesis the in-vivo relevance of this mechanism to regulate lipid synthesis in leaves was investigated. ACCase activity measurement in leaf tissue collected at the end of the day and night in Arabidopsis leaves revealed a 3-fold higher activation state of the enzyme in the light than in the dark. Redox-activation was accompanied by change in kinetic properties of ACCase, leading to an increase affinity to its substrate acetyl-CoA . In further experiments, DTT as well as sucrose were fed to leaves, and both treatments led to a stimulation in the rate of lipid synthesis accompanied by redox-activation of ACCase and decrease in acetyl-CoA content. In a final approach, comparison of metabolic and transcript profiling after DTT feeding and after sucrose feeding to leaves provided evidence that redox-modification is an important regulatory mechanism in central metabolic pathways such as TCA cycle and amino acid synthesis, which acts independently of transcript levels. N2 - Es ist bereits seit längerem bekannt, dass viele Enzyme des Calvinzyklus, des oxidativen Pentosephosphatwegs, des NAD(P)H-Exports und der ATP-Synthese durch post-translationale Redox-Modifikation in Antwort auf Licht reguliert werden. In der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, ob ein ähnlicher Mechanismus auch die Kohlenstoffspeicherung in Blättern reguliert. Vorangegangene Studien mit Kartoffelknollen zeigten, dass das Schlüsselenzym der Stärkesynthese ADP-Glukose-Pyrophosphorylase (AGPase) durch die Bildung einer Disulfidbrücke zwischen den zwei kleinen Untereinheiten (AGPB) des tetrameren Proteins inaktiviert wird, die Bedeutung dieses Mechanismus für die Stärkesynthese in Blättern blieb jedoch bislang ungeklärt. Die vorliegenden Arbeiten zeigen, das AGPase in Erbsen-, Kartoffel- und Arabidopsis-Blättern über post-translationale Redox-Modifikation in Antwort auf Tag-Nacht Änderungen reguliert wird. Dies erfolgt über ein Licht-abhängiges Signal, da, erstens, AGPB in isolierten Chloroplasten durch Belichtung sehr schnell von Dimer zu Monomer umgewandelt wird und, zweitens, ein Abdunkeln der Blätter zu einer schnellen Umwandlung von AGPB von Monomer zu Dimer führt. Die Monomerisierung von AGPB ging mit Änderungen in den kinetischen Eigenschaften des Enzyms einher, die zu einer Aktivierung führten. Studien mit Extrakten aus Erbsenchloroplasten zeigten, dass die AGPase-Redoxaktivierung in-vitro durch die Thioredoxine f und m aus Spinat vermittelt wird. In einem weiteren experimentellen Ansatz konnte gezeigt werden, dass auch Zucker zu Redox-Aktivierung der AGPase und erhöhter Stärkesynthese in Blättern führen, und dass diese unabhängig von Licht wirken. Externe Zugabe von Zuckern wie Saccharose oder Trehalose an Arabidopsis-Blätter im Dunkeln führten zu Monomerisierung von AGPB und einer Erhöhung der Stärkesyntheserate , während die Spiegel des allosterischen Aktivators 3PGA unverändert blieben und keine Änderungen im NADPH/NADP+-Verhältnis auftraten. Experimente mit transgenen Arabidopsis-Pflanzen mit veränderten Spiegeln des Vorläufers der Trehalosesynthese, Trehalose-6-phosphat (T6P), zeigten, dass T6P und nicht Trehalose zu Redox-Aktivierung von AGPase führt. Expression einer E. coli T6P synthase (TPS) im Zytosol führte zu erhöhter Redox-Aktivierung von AGPase und erhöhter Stäreksynthese in Blättern, während die Expression einer T6P-Phosphatase (TPP) gegenteilige Änderungen bewirkte. Diese Auswirkungen erfolgten unabhängig von Änderungen in den Spiegeln von Zuckern und Zuckerphosphaten oder im NADPH/NADP+-Verhältnis. Externe Zugabe von Saccharose führte zu Monomerisierung von AGPB in Wildtyp und TPS exprimierenden Blättern, während diese Antwort in TPP exprimierenden Blättern stark abgeschwächt war. Dies zeigt, dass T6P eine wesentliche Komponente darstellt, die die Redox-Aktivierung der AGPase in Antwort auf Saccharose vermittelt. T6P wurde auch für 15 min direkt an intakte, isolierte Erbsenchloroplasten gefüttert. T6P Konzentrationen im Bereich von 100 µM bis 10 mM führten zu einem signifikanten und spezifischen Anstieg der AGPB-Monomersierung und der AGPase Aktivität. Dies zeigt, dass T6P auch ohne zytosolische Elemente die Redox-Aktivierung der AGPase stimuliert und somit ein Signal zwischen Zytosol und Plastid darstellt. Diese Antwort erfolgte ohne Änderungen im NADPH/NADP+-Verhältnis, was zeigt, dass T6P eher den Redox-Transfer zu AGPase als den Redoxzustand des Chloroplasten moduliert. Acetyl-CoA-Carboxylase (ACCase) ist als Schlüsselenzym der Fettsäure- und Lipidsynthese in Pflanzen bekannt. Zu Beginn der vorliegenden Arbeit lagen hauptsächlich in-vitro Befunde vor, die zeigten, dass ACCase durch DTT und thioredoxine f und m über Redox-Modulation reguliert wird. In der Arbeit sollte daher die in-vivo Relevanz dieses Mechanismus für die Regulation der Lipidsynthese in Blättern untersucht werden. ACCase zeigte einen höheren Redox-Aktivierungszustand in Arabidopsis-Blätter, die während des Tages im Vergleich zur Nacht geerntet wurden. Die Redox-Aktivierung der ACCase wurde von Änderungen in den kinetischen Eigenschaften begleitet und führte zu einer erhöhten Affinität des Enzymes gegenüber Acetyl-CoA als Substrat. In weiteren Versuchen wurde sowohl DTT als auch Saccharose an Blätter gefüttert, und beide Behandlungen führten zu Redox-Aktivierung von ACCase, was mit erhöhten Lipidsynthesraten und einem Rückgang des Acetyl-CoA-Spiegels einherging. KW - Redoxreaktion KW - Thioredoxine KW - ADP-Glukosepyrophosphorylase KW - Acetyl-CoA carboxylase KW - Trehalose-6-Phosphat KW - Lipid Synthese KW - Stärke Synthese KW - Lipid synthesis KW - Starch synthesis KW - thioredoxin KW - redox Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-6388 ER - TY - THES A1 - Nita, Ana-Silvia T1 - Genetic mapping and molecular characterization of tbr1 mutant in Arabidopsis thaliana T1 - Genetic mapping and molecular characterization of tbr1 mutant in Arabidopsis Thaliana N2 - Arabidopsis thaliana trichomes exhibit strong birefringence under polarized light, a characteristic of cell walls containing large amounts of highly ordered cellulose microfibrils. The tbr1 mutant of Arabidopsis lacks trichome birefringence and is deficient in secondary cell wall cellulose synthesis (Potikha and Delmer, 1995). The TBR gene was identified by recombinational mapping, candidate gene sequencing and molecular complementation using genomic cosmid clones, as well as a p35S:TBR genomic DNA construct, fully rescuing the mutant phenotype in both cases. The only mutant allele available (tbr-1) carries a substitution (G to E) in a conserved aminoacid domain of the protein. TBR gene structure was proved to have a longer size than the one found to be annotated at the time of identification in the data-base. A full cDNA clone containing the full transcript was available and also complementation experiments using different gene fragments (annotated and suggested) leaded to the result that TBR gene is indeed, longer. TBR encodes a novel plant-specific protein with predicted plasma membrane localization, therefore being consistent with idea that is required for-, or is a novel component of a functional cellulose synthase complex. TBR is part of an Arabidopsis gene/protein family, (TBL-trichome birefringence like) which, depending on homology, comprises up to 20 members, none of which has a biological or biochemical function attributed. T-DNA insertion lines in TBR gene and two close homologues have been screened by PCR, but no homozygous were found and no trichomes phenotype was identified. Promoter-GUS lines were produced for TBR, as well as for its two closest homologues (one being a segmentally duplicated gene on chromosome III), using 1.6-2 kb of promoter sequence upstream of the annotated start codons. The TBR promoter was the only one of the three that yielded trichome expression, this probably explaining the phenotype of the TBR mutant. Moreover, TBR is expressed in leaves, in growing lateral roots, and in vascular tissues of young Arabidopsis seedlings and plantlets. Later on, the expression appears in inflorescens, stems, flowers and green siliques. This expression pattern is largely overlapping with those of the two analyzed homologues and it corresponds with data of RT-PCR expression profiling performed for TBR and the two analyzed homologues in different tissues, at different developmental stages. Biochemical analysis of cell wall (leaves and trichomes), as GC and MALDI-TOF, were performed, but revealed no major differences between tbr1 and wild type plants. Scanning electron microscopy analysis and cell wall polysaccharides antibody labeling showed a clear difference in the trichomes cell wall structure between mutant plant and wild type. N2 - Genetische Kartierung und molekulare Charakterisierung der tbr-Mutante in Arabidopsis thaliana. Arabidopsis Trichome zeigen eine starke Doppelbrechung unter polarisiertem Licht, ein charakteristisches Merkmal der Sekundärzellwand, die aus großen Mengen parallel angeordneten Zellulose-Mikrofibrillen besteht. In der Arabidopsis tbr-Mutante ist die Synthese der Sekundärzellwand fehlerhaft. Die Trichome der tbr-Mutante zeigen unter polarisiertem Licht den Doppelbrechungseffekt nicht (Potikha and Delmer, 1995). TBR ist ein pflanzenspezifisches Protein, das in der Plasmamembran lokalisiert ist. Diese Tatsache lässt vermuten, dass TBR eine Rolle bei der Zellulose-Synthese spielt oder Teil des Zellulose-Synthese Komplexes ist. Die TBR Genfamilie besteht aus 20 Genen, deren biologische oder biochemische Funktion nicht bekannt ist. Das TBR Gen wurde durch „recombinational mapping“ und Sequenzierung identifiziert. Die molekulare Komplementation erfolgte unter Verwendung von Cosmidklonen und einem p35S:TBR genomischen DNA-Konstrukt und konnte den Wildtypphänotyp wieder vollständig herstellen. Die tbr-1 Mutante trägt einen Basenaustausch (G nach A) in einer hochkonservierten Aminosäuresequenz im Protein. In einer Arabidopsis T-DNA Linie mit Insertion in einem Exon konnten in einem PCR-Screen nur heterozygote Pflanzen identifiziert werden. Diese zeigten alle im polarisierten Licht den Doppelbrechungseffekt nicht. Ein möglicher Hinweis für den Phänotyp der tbr-Mutante könnte die Expressionsanalyse durch ein Promotor-GUS Konstrukt sein. Hierfür wurde eine 1,6 kb Sequenz, die upstream des TBR Startcodons liegt verwendet. Es zeigte sich, dass die Expression in den sowohl in den Trichomen zu finden war, als auch in Blättern, der Seitenwurzel und in vaskulären Gewebe junger Arabidopsis Keimlinge. In späteren Entwicklungsstadien ist eine Expression in den Stämmen, Blüten und grünen Schoten sichtbar. Diese Ergebnisse konnten durch RT-PCR Expressionsprofile und anhand der AtGenExpress Daten verifiziert werden. Zellwandanalysen durch GC und MALDI-TOF der Blätter und Trichome zeigten keine signifikanten Unterschiede zwischen der tbr-Mutante und Wildtyppflanzen. In den Pektinen der primären Zellwand konnten Unterschiede durch Immunolabeln der Zellwände festgestellt werden. Lokalisationsanalysen wurden mit Hilfe von C- und N-terminalen GFP-Konstrukten durchgeführt. Es konnte kein Signal detektiert werden. Mit Hilfe der Konstrukte konnte jedoch der Wildtyp Phänotyp wieder hergestellt werden. Es konnte also gezeigt werden, dass durch die genetische Kartierung und molekulare Charakterisierung des TBR Gens, ein an der Synthese der Zellulose beteiligtes Gen gefunden wurde. KW - tbr mutant KW - tbr mutant KW - tbr mutant Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-5992 ER - TY - THES A1 - Schäfer, Arne T1 - Characterization of ammoniumtransporters in Arabidopsis thaliana T1 - Charakterisierung der Ammoniumtransporter in Arabidopsis thaliana N2 - Nitrogen is often a limiting factor for plant growth due to its heterogenous distribution in the soil and to seasonal and diurnal changes in growth rates. In most soils, NH4+ and NO3 – are the predominant sources of inorganic nitrogen that are available for plant nutrition. In this context, plants have evolved mechanisms that enable them to optimize nitrogen acquisition, which include transporters specialized in the uptake of nitrogen and susceptible to a regulation that responds to nitrogen limiting or excess conditions. Although the average NH4+ concentrations of soils are generally 100 to 1000 times lower than those of NO3 – (Marschner, 1995), most plants preferentially take up NH4+ when both forms are present because unlike NO3– , NH4+ has not to be reduced prior to assimilation and thus requires less energy for assimilation (Bloom et al., 1992). Apart from high uptake rates in roots, high intracellular ammonium concentrations also result from quantitatively important internal breakdown of amino acids (Feng et al., 1998), and originates in high quantities during photorespiration (Mattson et al., 1997, Pearson et al., 1998). Thus, NH4+ is a key component of nitrogen metabolism for all plants and can accumulate to varying concentrations in all compartments of the cell, including the cytosol, the vacuole and in the apoplast (Wells and Miller, 2000; Nielsen and Schjoerring, 1998). Two related families of ammonium transporters (AMT1 and AMT2), containing six genes which encode transporter proteins that are specific for ammonium had been identified prior to this thesis and some genes had partially been characterised in Arabidopsis (Gazzarrini et al., 1999; Sohlenkamp et al. 2002; Kaiser et al., 2002). However, these studies were not sufficient to assign physiological functions to the individual transporters and AMT1.4 and AMT1.5 had not been studied prior to this thesis. Given this background, it was considered desirable to acquire a deeper knowledge of the physiological functions of the six Arabidopsis ammonium transporters. To this end, tissue specific expression profiles of the individual wildtype AtAMT genes were performed by quantitative real time PCR (qRT-PCR) and promoter-GUS expression. Modern approaches such as the use of T-DNA insertional mutants and RNAi hairpin constructs were employed to reduce the expression levels of AMT genes. Transcript levels were determined, and physiological, biochemical and developmental analysis such as growth tests on different media and 14C-MA and NH4+ uptake studies with the isolated insertional mutants and RNAi lines were performed to deepen the knowledge of the individual functions of the six AMTs in Arabidopsis. In addition, double mutants of the insertional mutants were created to investigate the extent in which homologous genes could compensate for lost transporter functions. The results described in this thesis show that the six AtAMT genes display a high degree of specifity in their tissue specific expression and are likely to play complementary roles in ammonium uptake into roots, in shoots, and in flowers. AtAMT1.1 is likely to be a ‘work horse’ for cellular ammonium transport and reassimilation. A major role is probably the recapture of photorespiratory NH3/NH4+ escaping from the cytosol. In roots, it is likely to transport NH4+ from the apoplast into cortical cells. AtAMT1.3 and AtAMT1.5 appear to be specialised in the acquisition of external NH4+ from the soil. Furthermore, AtAMT1.5 plays an additional role in the reassimilation of NH3/NH4+ released during the breakdown of storage proteins in the cotyledons of germinating seedlings. It was difficult to distinguish a specialisation between the transporters AtAMt1.2 and AtAMt1.1, however the root and flower specific expression patterns are different and indicate alternative functions of both. AtAMT1.4 has a very distinct expression which is restricted to the vascular bundels of leaves and to pollen only, where it is likely to be involved in the loading of NH4+ into the cells.The AtAMT2.1 expression pattern is confined to vascular bundels and meristematic active tissues in leaves where ammonium concentrations can reach very high levels. Additionally, the Vmax of AtAMT2 increases with increasing external pH, contrasting to AtAMT1.1. Thus, AtAMT2.1 it might be specialised in ammonium transport in ammonium rich environments, where the functions of other transporters are limited, enabling cells to take up NH4+ over a wide range of concentrations. The root hair expression ascribes an additional role in NH3/NH4+ acquisition where it possibly serves as a transporter that is able to acquire ammonium from basic soils where other transporters become less effective.RNAi lines showing a reduction in AtAMT gene mRNA levels and NH4+ transport kinetics, grew slower and flowering time was delayed. This indicates that NH4+ is a crucial and limiting factor for plant growth. N2 - Ammonium stellt die von Pflanzen bevorzugte Aufnahmeform anorganischen Stickstoffes dar. Neben dem natürlichen Vorkommen im Boden, wird Ammonium während des Aminosäurestoffwechsels und der Photorespiration innerhalb des Pflanzenkörpers freigesetzt. Um Ammonium aus diesen Quellen zu assimlieren und zwischen den einzelnen Zellen zu transportieren hat die dikotyle Samenpflanze Arabidosis thaliana sechs veschiedene Ammoniumtransporter (AMT) evolviert. Zur Charakterisierung der spezifischen Funktionen der AMts wurden Expressionsprofile der jeweiligen Gene innerhalb der Wurzeln, des Sprosses und der Blüten unter verschiedenen Nährstoffbedingungen mittels quantitativer real-time PCR (qRT-PCT) und Promotor-GUS Expression erstellt. Weiter wurde die Fähigkeit zur spezifischen Regulation der einzelnen Transportergene in Abhängikeit des Stickstoffbedarfes der Pflanze analysiert. Zur Reduktion der mRNA Level der AMTs wurden RNA-Interferenz (RNAi) Mutanten erzeugt und um den Effekt des Verlustes einzelner AMTs zu studieren wurden T-DNA Insertionsmutanten dieser Gene isoliert. Von den mutanten Linien wurden die Transkriptionsraten durch qRT-PCR bestimmt und die NH4+ Transportleistungen durch 14C-Methylammonium (14C-MA) und Ammonium-Aufnahme Experimente analysiert. Weiter wurden Wachstumsanalysen der Mutanten auf verschiedenen Nährmedien durchgeführt und ihre vegetative und generative Entwicklung charakterisiert. Von den isolierten T-DNA Insertionsmutanten wurden Doppelmutanten aller Kombinationen hergestellt und phänotypisch analysiert.Es zeigte sich, daß der an der Plasmamembran lokalisierte AtAMT1.1 in allen Organen in hohen Konzentrationen exprimiert wird und unter Stickstoffmangelbedingungen vermehrt gebildet wird. Vermutlich dient er der generellen Assimilation von internen Ammonium und dessen Transport vom Apoplasten in den Symplasten. AtAMT1.3 und AtAMT1.5 sind in den Wurzeln und hier besonders in den epidermalen Wurzelhaaren exprimiert, die unter anderem der Aufnahme externer Nährsalze dienen. Beide unterliegen starker Regulation durch den internen Stickstoffbedarf der Pflanze. Es ist zu vermuten, daß sie primär der Aufnahme von Ammonium aus dem Boden dienen. AtAMT1.2 wird überwiegend an den vaskulären Geweben und den Blattparenchymzellen exprimiert. Überlappende Expressionsmuster mit AtAMT1.1 machen es schwierig eine spezifische Funktion zu identifizieren. AtAMT1.4 wird ausschließlich im männlichen Gametophyten exprimiert und dient hier vermutlich der Versorgung des Pollen mit Nährsalzen. AtAMT2 wird u.a. in den Wurzelhaaren exprimiert. Seine steigende Affinität zu Ammonium in basischem Milieu, umgekehrt zu AtAMT1.1, läßt vermuten, daß er der Pflanze die Ammoniumaufnahme bei steigendem pH ermöglicht. Im oberirdischen Sproß ist er überwiegend in Meristemen aktiv. Die in der Ammoniumaufnahme beeinträchtigten RNAi-Linien zeigten langsames Wachstum und blühten später als der Wildtyp. Es sind die ersten beschriebenen Ammoniumtransportermutanten, die einen solchen Phänotyp zeigen. KW - Ammonium KW - Ammoniumassimilation KW - Pflanzenernährung KW - Ammonium KW - Ammoniumtransporter KW - AMT KW - AtAMT1.1 KW - AtAMT1.2 KW - AtAMT1.3 KW - AtAMT1.4 KW - AtAMT1.5 KW - ÁtAMT2 KW - ammonium KW - ammoniumtransporter KW - AMT KW - AtAMT1.1 KW - AtAMT1.2 KW - AtAMT1.3 KW - AtAMT1.4 KW - AtAMT1.5 KW - ÁtAMT2 Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-5937 ER - TY - THES A1 - Schwager, Monika T1 - Climate change, variable colony sizes and temporal autocorrelation : consequences of living in changing environments T1 - Klimawandel, variable Koloniegrößen und zeitliche Autokorrelation : Leben in einer variablen Umwelt N2 - Natural and human induced environmental changes affect populations at different time scales. If they occur in a spatial heterogeneous way, they cause spatial variation in abundance. In this thesis I addressed three topics, all related to the question, how environmental changes influence population dynamics. In the first part, I analysed the effect of positive temporal autocorrelation in environmental noise on the extinction risk of a population, using a simple population model. The effect of autocorrelation depended on the magnitude of the effect of single catastrophic events of bad environmental conditions on a population. If a population was threatened by extinction only, when bad conditions occurred repeatedly, positive autocorrelation increased extinction risk. If a population could become extinct, even if bad conditions occurred only once, positive autocorrelation decreased extinction risk. These opposing effects could be explained by two features of an autocorrelated time series. On the one hand, positive autocorrelation increased the probability of series of bad environmental conditions, implying a negative effect on populations. On the other hand, aggregation of bad years also implied longer periods with relatively good conditions. Therefore, for a given time period, the overall probability of occurrence of at least one extremely bad year was reduced in autocorrelated noise. This can imply a positive effect on populations. The results could solve a contradiction in the literature, where opposing effects of autocorrelated noise were found in very similar population models. In the second part, I compared two approaches, which are commonly used for predicting effects of climate change on future abundance and distribution of species: a "space for time approach", where predictions are based on the geographic pattern of current abundance in relation to climate, and a "population modelling approach" which is based on correlations between demographic parameters and the inter-annual variation of climate. In this case study, I compared the two approaches for predicting the effect of a shift in mean precipitation on a population of the sociable weaver Philetairus socius, a common colonially living passerine bird of semiarid savannahs of southern Africa. In the space for time approach, I compared abundance and population structure of the sociable weaver in two areas with highly different mean annual precipitation. The analysis showed no difference between the two populations. This result, as well as the wide distribution range of the species, would lead to the prediction of no sensitive response of the species to a slight shift in mean precipitation. In contrast, the population modelling approach, based on a correlation between reproductive success and rainfall, predicted a sensitive response in most model types. The inconsistency of predictions was confirmed in a cross-validation between the two approaches. I concluded that the inconsistency was caused, because the two approaches reflect different time scales. On a short time scale, the population may respond sensitively to rainfall. However, on a long time scale, or in a regional comparison, the response may be compensated or buffered by a variety of mechanisms. These may include behavioural or life history adaptations, shifts in the interactions with other species, or differences in the physical environment. The study implies that understanding, how such mechanisms work, and at what time scale they would follow climate change, is a crucial precondition for predicting ecological consequences of climate change. In the third part of the thesis, I tested why colony sizes of the sociable weaver are highly variable. The high variation of colony sizes is surprising, as in studies on coloniality it is often assumed that an optimal colony size exists, in which individual bird fitness is maximized. Following this assumption, the pattern of bird dispersal should keep colony sizes near an optimum. However, I showed by analysing data on reproductive success and survival that for the sociable weaver fitness in relation to colony size did not follow an optimum curve. Instead, positive and negative effects of living in large colonies overlaid each other in a way that fitness was generally close to one, and density dependence was low. I showed in a population model, which included an evolutionary optimisation process of dispersal that this specific shape of the fitness function could lead to a dispersal strategy, where the variation of colony sizes was maintained. N2 - Änderungen in der Umwelt - sowohl natürliche Variabilität als auch anthropogene Änderungen - beeinflussen Populationen auf verschiedenen Zeitskalen. Wenn sie räumlich heterogen wirken, verursachen sie räumliche Variabilität in der Abundanz. In dieser Dissertation habe ich drei Themen bearbeitet, die sich auf den Effekt von Änderungen in der Umwelt auf Populationsdynamiken beziehen. Im ersten Teil untersuchte ich an einem einfachen Populationsmodell den Effekt von positiver zeitlicher Autokorrelation im Umweltrauschen auf das Extinktionsrisiko einer Population. Der Effekt der Autokorrelation hing davon ab, wie empfindlich eine Population gegenüber singulären, katastrophenähnlichen Ereignissen schlechter Umweltbedingungen war. War die Population nur dann direkt bedroht, wenn eine Serie von schlechten Umweltbedingungen auftrat, erhöhte positive Autokorrelation das Extinktionsrisiko. Konnte eine Population auch dann aussterben, wenn schlechte Umweltbedingungen einzeln auftraten, verringerte positive Autokorrelation das Extinktionsrisiko. Diese unterschiedlichen Effekte konnten durch zwei Eigenschaften autokorrelierter Zeitreihen erklärt werden. Einerseits erhöht positive Autokorrelation die Wahrscheinlichkeit, daß in einer Zeitreihe Serien von schlechten Bedingungen auftreten. Andererseits führt die Aggregation von schlechten Jahren auch zu langen Zeiträumen mit relativ guten Bedingungen. Deshalb ist die Wahrscheinlichkeit, daß innerhalb eines bestimmten Zeitraums zumindest ein extrem schlechtes Jahr auftritt, geringer unter positiver Autokorrelation. Die Ergebnisse konnten einen Widerspruch in der Literatur aufklären, in dem unterschiedliche Effekte von autokorreliertem Umweltrauschen auf das Extinktionsrisiko gefunden wurden, obwohl sehr ähnliche Modelle verwendet wurden. Im zweiten Teil, verglich ich zwei Methoden, die häufig verwendet werden, um den Effekt von Klimawandel auf die zukünftige Verbreitung und Abundanz von Arten vorauszusagen: Ein "Raum-ersetzt-Zeit-Ansatz" ("space for time approach"), in dem Voraussagen aufgrund der aktuellen geographischen Verbreitung und Abundanz einer Art in Relation zum Klima getroffen werden, und ein "Populationsmodell-Ansatz", der auf Korrelationen zwischen demographischen Parametern und der jährlichen Variabilität im Klimas beruht. In einer Fallstudie verglich ich die beiden Methoden, um den Effekt einer Änderung im mittleren Niederschlag auf eine Population des Siedelwebers Philetairus socius vorauszusagen. Der Siedelweber ist eine häufige, koloniale Vogelart in semiariden Savannen im südlichen Afrika. Im "space for time approach" verglich ich zwei Populationen des Siedelwebers in Gebieten mit stark unterschiedlichem mittleren Niederschlag. Die Untersuchung zeigte keinen Unterschied zwischen den beiden Populationen. Sowohl dieses Ergebnis als auch das weite Verbreitungsgebiet des Siedelwebers implizieren keine sensitive Reaktion der Art auf eine geringfügige Änderung im mittleren Niederschlag. Im Unterschied dazu zeigte der "Populationsmodell-Ansatz", der auf einer Korrelation zwischen Niederschlag und dem Reproduktionserfolg des Siedlerwebers beruhte, eine sensitive Reaktion in den meisten der untersuchten Modelltypen. Die Inkonsistenz der Ergebnisse wurde in einer Kreuz-Validierung der beiden Ansätze bestätigt. Aus der Untersuchung folgerte ich, daß die unterschiedlichen Ergebnisse dadurch verursacht wurden, daß die beiden Methoden unterschiedliche Zeitskalen widerspiegeln. Auf einer kurzen Zeitskala reagiert die Population sensitiv auf Änderungen im Niederschlag. Auf einer großen Zeitskala oder im räumlichen Vergleich kann die sensitive Reaktion jedoch durch eine Reihe von Mechanismen gepuffert oder kompensiert werden. Diese Mechanismen können Anpassungen im Verhalten oder in der Lebensgeschichte ("life history"), Änderungen in den Interaktionen mit andern Arten oder Unterschiede in der physikalischen Umgebung beinhalten. Diese Studie zeigt, daß ein Verständnis, wie solche Mechanismen funktionieren, und auf welcher Zeitskala sie wirken, eine wesentliche Voraussetzung ist, um Prognosen über ökologische Effekte des Klimawandels treffen zu können. Im dritten Teil untersuchte ich, warum Kolonien des Siedelwebers so stark in ihrer Größe variieren. Die Variabilität der Koloniegrößen ist erstaunlich, da man in Untersuchungen zur Kolonialität bei Tieren oft davon ausgeht, daß eine optimale Koloniegröße besteht, bei der die individuelle Fitneß maximiert ist. Aufgrund dieser Annahme sollten Vögel sich so im Raum ausbreiten, daß die Koloniegrößen möglicht nahe am Optimum liegen. In dieser Arbeit konnte ich jedoch anhand von Daten zum Reproduktionserfolg und zur Überlebensrate in Relation zur Koloniegröße zeigen, daß die Funktion der Fitneß in Abhängigkeit von der Koloniegröße nicht einer Optimumskurve folgt. Statt dessen überlagern sich positive und negative Effekte der Koloniegröße so, daß die Populationswachstumsrate generell nahe eins ist, und die Dichteabhängigkeit gering ist. Auf diesen Ergebnissen aufbauend zeigte ich in einem Populationsmodell, das einen evolutionären Optimierungsprozeß der Dispersal-Strategie beinhaltet, daß die spezifische Form der Fitneßfunktion zu einer Dispersal-Strategie führen kann, bei der die hohe Variabilität der Koloniegrößen aufrecht erhalten wird. T2 - Climate change, variable colony sizes and temporal autocorrelation : consequences of living in changing environments KW - Populationsbiologie KW - Ökologie KW - Theoretische Ökologie KW - Ökologische Modelle KW - Klimawandel KW - Umweltrauschen KW - Extinktionsrisko KW - Kolonialität KW - ecological modelling KW - red noise KW - extinction risk KW - coloniality KW - climate change Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-5744 ER - TY - THES A1 - Czechowski, Tomasz T1 - Nitrogen signalling in Arabidopsis thaliana T1 - Stickstoff Signalling in Arabidopsis thaliana N2 - Nitrogen is an essential macronutrient for plants and nitrogen fertilizers are indispensable for modern agriculture. Unfortunately, we know too little about how plants regulate their use of soil nitrogen, to maximize fertilizers-N use by crops and pastures. This project took a dual approach, involving forward and reverse genetics, to identify N-regulators in plants, which may prove useful in the future to improve nitrogen-use efficiency in agriculture. To identify nitrogen-regulated transcription factor genes in Arabidopsis that may control N-use efficiency we developed a unique resource for qRT-PCR measurements on all Arabidpsis transcription factor genes. Using closely spaced, gene-specific primer pairs and SYBR® Green to monitor amplification of double-stranded DNA, transcript levels of 83% of all target genes could be measured in roots or shoots of young Arabidopsis wild-type plants. Only 4% of reactions produced non-specific PCR products, and 13% of TF transcripts were undetectable in these organs. Measurements of transcript abundance were quantitative over six orders of magnitude, with a detection limit equivalent to one transcript molecule in 1000 cells. Transcript levels for different TF genes ranged between 0.001-100 copies per cell. Real-time RT-PCR revealed 26 root-specific and 39 shoot-specific TF genes, most of which have not been identified as organ-specific previously. An enlarged and improved version of the TF qRT-PCR platform contains now primer pairs for 2256 Arabidopsis TF genes, representing 53 gene families and sub-families arrayed on six 384-well plates. Set-up of real-time PCR reactions is now fully robotized. One researcher is able to measure expression of all 2256 TF genes in a single biological sample in a just one working day. The Arabidopsis qRT-PCT platform was successfully used to identify 37 TF genes which transcriptionaly responded at the transcriptional level to N-deprivation or to nitrate per se. Most of these genes have not been characterized previously. Further selection of TF genes based on the responses of selected candidates to other macronutrients and abiotic stresses allowed to distinguish between TFs regulated (i) specifically by nitrogen (29 genes) (ii) regulated by general macronutrient or by salt and osmotic stress (6 genes), and (iii) responding to all major macronutrients and to abiotic stresses. Most of the N-regulated TF genes were also regulated by carbon. Further characterization of sixteen selected TF genes, revealed: (i) lack of transcriptional response to organic nitrogen, (ii) two major types of kinetics of induction by nitrate, (iii) specific responses for the majority of the genes to nitrate but not downstream products of nitrate assimilation. All sixteen TF genes were cloned into binary vectors for constitutive and ethanol inducible over expression, and the first generation of transgenic plants were obtained for almost all of them. Some of the plants constitutively over expressing TF genes under control of the 35S promoter revealed visible phenotypes in T1 generation. Homozygous T-DNA knock out lines were also obtained for many of the candidate TF genes. So far, one knock out line revealed a visible phenotype: retardation of flowering time. A forward genetic approach using an Arabidopsis ATNRT2.1 promoter : Luciferase reporter line, resulted in identification of eleven EMS mutant reporter lines affected in induction of ATNRT2.1 expression by nitrate. These lines could by divided in the following classes according to expression of other genes involved in primary nitrogen and carbon metabolism: (i) lines affected exclusively in nitrate transport, (ii) those affected in nitrate transport, acquisition, but also in glycolysis and oxidative pentose pathway, (iii) mutants affected moderately in nitrate transport, oxidative pentose pathway and glycolysis but not in primary nitrate assimilation. Thus, several different N-regulatory genes may have been mutated in this set of mutants. Map-based cloning has begun to identify the genes affected in these mutants. N2 - Stickstoff ist einer der wichtigsten Makroelemente in der Natur und sein eingeschränktes Vorkommen ist häufig ein limitierender Faktor für pflanzliches Wachstum. In der Landwirtschaft eingesetzte Stickstoff-Dünger werden häufig nicht vollständig von Getreide- oder anderen kultivierten Pflanzen genutzt, sondern in die umliegenden Gewässer oder das Grundwasser ausgewaschen. Das Verständnis von pflanzlichen Signalprozessen kann helfen, Stickstoffaufnahme und -assimilation zu kontrollieren und somit den Einsatz von stickstoffhaltigen Düngemitteln in der Landwirtschaft zu reduzieren. Die meisten der in den pflanzlichen Stickstoffstoffwechsel involvierten Gene werden auf Transkriptionsebene reguliert. Dies geschieht durch sogenannte Transkriptionsfaktoren (TFs), Proteine, die von Genen anderer Genfamilien kodiert werden. Im Rahmen dieser Promotion wurde eine einzigartige und neue Ressource zur Quantifizierung der Expressionsniveaus solcher Transkriptionsfaktoren der Modellpflanze Arabidopsis thaliana entwickelt und getestet. Dabei konnte die beispiellose Robustheit, Genauigkeit und Präzision dieser PCR-basierten Methode gezeigt werden. Mit Hilfe dieses experimentellen Aufbaus wurden Transkriptionsfaktoren, potentielle Regulatoren von Genen, die in Stickstoffmetabolismus involviert sind, identifiziert und charakterisiert. Um die Funktionsweise dieser Gene besser zu verstehen, wurden transgene Pflanzen erzeugt und identifiziert, die entweder erhöhte oder chemisch induzierbare Transkription und/oder einen partiellen oder vollständigen Verlust der Aktivität dieser Gene aufweisen. Die Analyse der Transkriptionsfaktoren, die unter die Kontrolle eines induzierbaren Promoters gestellt wurden, soll helfen, die genauen Zielgene dieser TFs zu identifizieren und ihre Rolle im Stickstoffmetabolismus zu erklären. Darüber hinaus bieten sie die Chance, Hierarchieebenen innerhalb der verschiedenen TFs zu erkennen. Überexpression von Transkriptionsfaktoren kann zur Generierung von Phänotypen führen, die von direktem biotechnologischen Interesse sind, wie z.B. Pflanzen mit erhöhtem Stickstoffgehalt (Aminosäuregehalt), die besser an Situationen mit Stickstoffmangel angepasst sind. Neben diesen Transkriptionsfaktoren wurden allerdings auch Mutanten mit einem genetischen Defekt in einem der wichtigsten Gene, das für den Nitrattransport in Wurzeln von Arabidopsis verantwortlich ist, identifiziert. KW - Stickstoff KW - Schmalwand KW - Transkriptionsfaktor KW - qRT-PCR KW - Nitrogen KW - Arabidopsis KW - Transcription facotrs KW - qRT-PCR Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-5445 ER - TY - THES A1 - Dolniak, Blazej T1 - Functional characterisation of NIC2, a member of the MATE family from Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. T1 - Funktionale Charakterisierung von NIC2, einem Mitglied der MATE Familie aus Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. N2 - The multidrug and toxic compounds extrusion (MATE) family includes hundreds of functionally uncharacterised proteins from bacteria and all eukaryotic kingdoms except the animal kingdom, that function as drug/toxin::Na+ or H+ antiporters. In Arabidopsis thaliana the MATE family comprises 56 members, one of which is NIC2 (Novel Ion Carrier 2). Using heterologous expression systems including Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae, and the homologous expression system of Arabidopsis thaliana, the functional characterisation of NIC2 was performed. It has been demonstrated that NIC2 confers resistance of E. coli towards the chemically diverse compounds such as tetraethylammonium chloride (TEACl), tetramethylammonium chloride (TMACl) and a toxic analogue of indole-3-acetic acid, 5-fluoro-indole-acetic acid (F-IAA). Therefore, NIC2 may be able to transport a broad range of drug and toxic compounds. In wild-type yeast the expression of NIC2 increased the tolerance towards lithium and sodium, but not towards potassium and calcium. In A. thaliana, the overexpression of NIC2 led to strong phenotypic changes. Under normal growth condtions overexpression caused an extremely bushy phenotype with no apical dominance but an enhanced number of lateral flowering shoots. The amount of rossette leaves and flowers with accompanying siliques were also much higher than in wild-type plants and the senescence occurred earlier in the transgenic plants. In contrast, RNA interference (RNAi) used to silence NIC2 expression, induced early flower stalk development and flowering compared with wild-type plants. In additon, the main flower stalks were not able to grow vertically, but instead had a strong tendency to bend towards the ground. While NIC2 RNAi seedlings produced many lateral roots outgrowing from the primary root and the root-shoot junction, NIC2 overexpression seedlings displayed longer primary roots that were characterised by a 2 to 4 h delay in the gravitropic response. In addition, these lines exhibited an enhanced resistance to exogenously applied auxins, i.e. indole-3-acetic acid (IAA) and indole-3-butyric acid (IBA) when compared with the wild-type roots. Based on these results, it is suggested that the NIC2 overexpression and NIC2 RNAi phenotypes were due to decreased or increased levels of auxin, respectively. The ProNIC2:GUS fusion gene revealed that NIC2 is expressed in the stele of the elongation zone, in the lateral root cap, in new lateral root primordia, and in pericycle cells of the root system. In the vascular tissue of rosette leaves and inflorescence stems, the expression was observed in the xylem parenchyma cells, while in siliques it was also in vascular tissue, but as well in the dehiscence and abscission zones. The organ- and tissue-specific expression sites of NIC2 correlate with the sites of auxin action in mature Arabidopsis plants. Further experiments using ProNIC2:GUS indicated that NIC2 is an auxin-inducible gene. Additionally, during the gravitropic response when an endogenous auxin gradient across the root tip forms, the GUS activity pattern of the ProNIC2:GUS fusion gene markedly changed at the upper side of the root tip, while at the lower side stayed unchanged. Finally, at the subcellular level NIC2-GFP fusion protein localised in the peroxisomes of Nicotana tabacum BY2 protoplasts. Considering the experimental results, it is proposed that the hypothetical function of NIC2 is the efflux transport which takes part in the auxin homeostasis in plant tissues probably by removing auxin conjugates from the cytoplasm into peroxisomes. N2 - "Multidrug and Toxic Compounds Extrusion" (MATE) – Proteine sind Membranproteine, die eine Vielzahl komplexer und giftiger Substanzen transportieren können. Sie sind weit verbreitet und kommen in Bakterien und Höheren Organismen mit Ausnahme des Tierreichs vor. Insgesamt gibt es hunderte von bisher kaum untersuchten Genen dieser Familie, die eine hohe Sequenzhomologie aufweisen. In der Pflanze Arabidopsis thaliana wurden 56 Gene der MATE - Familie zugeordnet. Eines von ihnen, der "Novel Ion Carrier 2" (NIC2) wurde näher charakterisiert. Dafür wurden heterologe Expressionssysteme wie Bakterien (Escherichia coli) und Hefe (Saccharomyces cerevisiae) genutzt und transgene Pflanzen (Arabidopsis thaliana) hergestellt. Es wurde gezeigt, dass NIC2 Bakterien eine Resistenz gegenüber mehreren giftigen Stoffen verlieh. In Hefe erhöhte NIC2 die Salztoleranz gegenüber Lithium und Natrium, aber nicht gegenüber Kalium und Kalzium. Das deutet darauf hin, dass NIC2 diese Stoffe transportieren kann und so zur Entgiftung beziehungsweise erhöhter Stresstoleranz beiträgt. In Pflanzen führte die Überexpression von NIC2 zu dramatischen Änderungen im Wachstum. Die Pflanzen waren buschig ohne zentralen Blütenstand, hatten jedoch eine höhere Anzahl von Blättern und Blüten und längere Wurzeln mit einer im Vergleich zu den Wildtyppflanzen verzögerten gravitropen Antwort. In Gegensatz dazu entwickelten Pflanzen, in denen die Expression von NIC2 gehemmt wurde, früh einen zentralen Blütenstand, der allerdings nicht gerade wuchs, sondern die Tendenz hatte, sich zum Boden zu biegen. Das Wurzelsystem bestand aus einer Hauptwurzel und vielen sekundären Wurzeln und war im Vergleich zu den Wildtyppflanzen besser entwickelt. Vermutlich kann die Wuchsform auf einen veränderten Gehalt des Pflanzenhormons Auxin zurückgeführt werden. Die Expression von NIC2 wird durch Auxin induziert. Experimente, in denen die Aktivität eines Gens mit Hilfe eines Reportergens nachgewiesen wird, zeigten, dass NIC2 in Wurzeln, Blättern, Blütenstielen, Blüten und Schoten aktiv ist. Innerhalb der Zelle ist NIC2 in Peroxisomen lokalisiert. Peroxisomen sind kleine Organellen, die eine Rolle im Hormonstoffwechsel spielen können, wie z.B. im Fall von Auxinen. Die Daten sprechen dafür, dass NIC2 eine Funktion beim Auxintransport und somit bei der Auxin-Homöostase hat. KW - Ackerschmalwand KW - Auxine KW - Membranproteine KW - Arabidopsis KW - membrane protein KW - auxin Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-5372 ER - TY - THES A1 - Rossmanith, Eva T1 - Breeding biology, mating system and population dynamics of the Lesser Spotted Woodepcker (Picoides minor) : combining empirical and model investigations T1 - Zu Brutbiologie, Paarungssystem und Populationsdynamik des Kleinspechts (Picoides minor) : Verknüpfung von empirischen Untersuchungen mit ökologischer Modellierung N2 - The protection of species is one major focus in conservation biology. The basis for any management concept is the knowledge of the species autecology. In my thesis, I studied the life-history traits and population dynamics of the endangered Lesser Spotted Woodpecker (Picoides minor) in Central Europe. Here, I combine a range of approaches, from empirical investigations of a Lesser Spotted Woodpecker population in the Taunus low mountain range in Germany, the analysis of empirical data and the development of an individual-based stochastic model simulating the population dynamics. In the field studies I collected basic demographic data of reproductive success and mortality. Moreover, breeding biology and behaviour were investigated in detail. My results showed a significant decrease of the reproductive success with later timing of breeding, caused by deterioration in food supply. Moreover, mate fidelity was of benefit, since pairs composed of individuals that bred together the previous year started earlier with egg laying and obtained a higher reproductive success. Both sexes were involved in parental care, but the care was only shared equally during incubation and the early nestling stage. In the late nestling stage, parental care strategies differed between sexes: Females considerably decreased feeding rate with number of nestlings and even completely deserted small broods. Males fed their nestlings irrespective of brood size and compensated for the females absence. The organisation of parental care in the Lesser Spotted Woodpecker is discussed to provide the possibility for females to mate with two males with separate nests and indeed, polyandry was confirmed. To investigate the influence of the observed flexibility in the social mating system on the population persistence, a stochastic individual-based model simulating the population dynamics of the Lesser Spotted Woodpecker was developed, based on empirical results. However, pre-breeding survival rates could not be obtained empirically and I present in this thesis a pattern-oriented modelling approach to estimate pre-breeding survival rates by comparing simulation results with empirical pattern of population structure and reproductive success on population level. Here, I estimated the pre-breeding survival for two Lesser Spotted Woodpecker populations on different latitudes to test the reliability of the results. Finally, I used the same simulation model to investigate the effect of flexibility in the mating system on the persistence of the population. With increasing rate of polyandry in the population, the persistence increased and even low rates of polyandry had a strong influence. Even when presuming only a low polyandry rate and costs of polyandry in terms of higher mortality and lower reproductive success for the secondary male, the positive effect of polyandry on the persistence of the population was still strong. This thesis greatly helped to increase the knowledge of the autecology of an endangered woodpecker species. Beyond the relevance for the species, I could demonstrate here that in general flexibility in mating systems are buffer mechanisms and reduce the impact of environmental and demographic noise. N2 - Der Schutz von Arten ist eine der Hauptaufgaben des Naturschutzes. Für die Erstellung von Schutzkonzepten sind Informationen zur Autökologie der Zielart notwendige Voraussetzung. Der Kleinspecht (Picoides minor) ist in vielen Teilen seines Verbreitungsgebietes bestandsbedroht, das Wissen zur Biologie und Verhalten der Art ist jedoch lückenhaft. Ziel meiner Arbeit war es daher, demographische Parameter der Populationsdynamik des Kleinspechts zu erfassen, die als Grundlage für Populationsgefährdungsanalysen benötigt werden. Da Untersuchungen in Schweden eine gewisse Flexibilität im Paarungssystem des Kleinspechts zeigten, sollte darüber hinaus das Paarungssystem und sein Einfluss auf die Persistenz der Population untersucht werden. Die Arbeit umfasste eine Reihe von methodischen Ansätzen, von empirischen Untersuchungen an einer Kleinspechtpopulation im hessischen Vordertaunus über die Aufbereitung von empirischen Daten bis hin zur Entwicklung und Auswertung eines stochastischen individuenbasierten Modells zur Simulation der Populationsdynamik. Die Ergebnisse der empirischen Untersuchung zeigten eine Abnahme des Reproduktionserfolgs mit fortschreitendem Legebeginn. Die Zusammensetzung der Nestlingsnahrung ließ vermuten, dass dies durch eine Verschlechterung der Nahrungsversorgung begründet war. Paartreue war bei der Reproduktion von Vorteil, da Individuen, die schon im vorherigen Jahr zusammen gebrütet hatten, einen früheren Legebeginn und damit einen höheren Fortpflanzungserfolg aufwiesen als neu formierte Paare. Beide Geschlechter investierten in die Brutpflege, jedoch war die Aufteilung nur während der Bebrütung der Eier und in der ersten Hälfte der Nestlingsperiode gleichmäßig. In der späten Nestlingsperiode konnten geschlechtsspezifische Strategien im elterlichen Investment identifiziert werden: die Weibchen verringerten die Versorgungsrate in Abhängigkeit des Wertes der Brut - gemessen in der Zahl der Nestlinge - und gaben die Versorgung kleiner Bruten ganz auf. Die Männchen dagegen kompensierten dieses Verhalten, so dass auch von den Weibchen verlassene Bruten erfolgreich waren. Interessanterweise konnte mehrmals die Verpaarung von einem Weibchen mit zwei Männchen beobachtet werden. Das Auftreten dieses polyandrischen Paarungssystems wird in der Arbeit als Resultat der Aufteilung der Brutpflege diskutiert. Die bestätigte Flexibilität im Paarungssystem könnte Einfluss auf die Persistenz der Population haben. Die Persistenz von Populationen kann jedoch nicht empirisch gemessen werden. Daher entwickelte ich ein individuen-basiertes stochastisches Modell zur Simulation der Populationsdynamik des Kleinspechts, dass auf den empirischen Daten basiert. Allerdings fehlten Überlebensraten der ausgeflogenen Jungvögel, die im Feld nicht ermittelt werden kann. Daher testete ich hier eine Methode, die durch den Vergleich von Simulationsergebnissen mit eigenen empirischen Daten zur Populationsstruktur und zum Reproduktionserfolg auf der Ebene der Gesamtpopulation die Überlebensrate der Jungvögel abschätzt. Die Überlebensraten wurde zusätzlich für eine Population des Kleinspechtes ermittelt, deren Datengrundlage aus Freilandstudien in Schweden stammten. Durch den Vergleich der Raten für die beiden Populationen konnte die Aussagefähigkeit des Modells und die Güte der Abschätzungen untersucht werden. Im letzten Teil meiner Arbeit nutzte ich das Modell schließlich, um die Auswirkungen des Paarungssystems auf die Überlebensfähigkeit der Population zu untersuchen. Im Modell konnte ein Weibchen polyandrisch sein, wenn es gute Brutbedingungen hatte und das Geschlechterverhältnis zum Männchen hin verschoben war. Zusätzlich variierte ich die Wahrscheinlichkeit, dass unter diesen Umständen Polyandrie auftritt. Im Model wurden 3 Szenarien getestet: (i) strenge Monogamie, (ii) gelegentliche Polyandrie und (iii) gelegentliche Polyandrie unter der Annahme von Kosten für das sekundäre Männchen in Form von höherer Mortalität und geringerem Reproduktionserfolg. Es zeigte sich, dass selbst sehr geringe Polyandrieraten und die Annahme von Kosten noch einen deutlichen positiven Einfluss auf die Persistenz der Population ausüben. Die Flexibilität im Paarungssystem dient damit als Puffermechanismus gegen demographisches Rauschen und Umweltrauschen. Diese Arbeit trät dazu bei, die Autökologie des Kleinspechts besser zu verstehen und ist damit wichtige Grundlage für Schutzkonzepte in Mitteleuropa. Über die artspezifische Bedeutung hinaus, leistet die Arbeit einen Beitrag zur Untersuchung von Methoden zur Abschätzung fehlender demographischer Parameter sowie zur Identifizierung von Puffermechanismen. Eine wichtige Schlussfolgerung meiner Arbeit ist es, dass die Flexibilität artspezifischen Verhaltens in zukünftigen Populationsgefährdungsanalysen integriert werden sollte, um die Qualität von Prognosen zur Persistenz von Populationen zu verbessern. KW - Modellierung KW - Öko-Ethologie KW - Paarungssystem KW - Polyandrie KW - Mortalität KW - Reproduktionserfolg KW - pattern-oriented modelling KW - polyandry KW - survival rate KW - reproduction success Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-5328 ER -