TY - THES A1 - Breuer, David T1 - The plant cytoskeleton as a transportation network T1 - Modellierung des pflanzliche Zytoskeletts als Transportnetzwerk N2 - The cytoskeleton is an essential component of living cells. It is composed of different types of protein filaments that form complex, dynamically rearranging, and interconnected networks. The cytoskeleton serves a multitude of cellular functions which further depend on the cell context. In animal cells, the cytoskeleton prominently shapes the cell's mechanical properties and movement. In plant cells, in contrast, the presence of a rigid cell wall as well as their larger sizes highlight the role of the cytoskeleton in long-distance intracellular transport. As it provides the basis for cell growth and biomass production, cytoskeletal transport in plant cells is of direct environmental and economical relevance. However, while knowledge about the molecular details of the cytoskeletal transport is growing rapidly, the organizational principles that shape these processes on a whole-cell level remain elusive. This thesis is devoted to the following question: How does the complex architecture of the plant cytoskeleton relate to its transport functionality? The answer requires a systems level perspective of plant cytoskeletal structure and transport. To this end, I combined state-of-the-art confocal microscopy, quantitative digital image analysis, and mathematically powerful, intuitively accessible graph-theoretical approaches. This thesis summarizes five of my publications that shed light on the plant cytoskeleton as a transportation network: (1) I developed network-based frameworks for accurate, automated quantification of cytoskeletal structures, applicable in, e.g., genetic or chemical screens; (2) I showed that the actin cytoskeleton displays properties of efficient transport networks, hinting at its biological design principles; (3) Using multi-objective optimization, I demonstrated that different plant cell types sustain cytoskeletal networks with cell-type specific and near-optimal organization; (4) By investigating actual transport of organelles through the cell, I showed that properties of the actin cytoskeleton are predictive of organelle flow and provided quantitative evidence for a coordination of transport at a cellular level; (5) I devised a robust, optimization-based method to identify individual cytoskeletal filaments from a given network representation, allowing the investigation of single filament properties in the network context. The developed methods were made publicly available as open-source software tools. Altogether, my findings and proposed frameworks provide quantitative, system-level insights into intracellular transport in living cells. Despite my focus on the plant cytoskeleton, the established combination of experimental and theoretical approaches is readily applicable to different organisms. Despite the necessity of detailed molecular studies, only a complementary, systemic perspective, as presented here, enables both understanding of cytoskeletal function in its evolutionary context as well as its future technological control and utilization. N2 - Das Zytoskelett ist ein notwendiger Bestandteil lebender Zellen. Es besteht aus verschiedenen Arten von Proteinfilamenten, die ihrerseits komplexe, sich dynamisch reorganisierende und miteinander verknüpfte Netzwerke bilden. Das Zytoskelett erfüllt eine Vielzahl von Funktionen in der Zelle. In Tierzellen bestimmt das Aktin-Zytoskelett maßgeblich die mechanischen Zelleigenschaften und die Zellbewegung. In Pflanzenzellen hingegen kommt dem Aktin-Zytoskelett eine besondere Bedeutung in intrazellulären Transportprozessen zu, bedingt insbesondere durch die starre pflanzliche Zellwand sowie die Zellgröße. Als wesentlicher Faktor für Zellwachstum und somit auch die Produktion von Biomasse, ist Zytoskelett-basierter Transport daher von unmittelbarer ökologischer und ökonomischer Bedeutung. Während das Wissen über die molekularen Grundlagen Zytoskelett-basierter Transportprozesse beständig wächst, sind die zugrunde liegenden Prinzipien zellweiter Organisation bisher weitgehend unbekannt. Diese Dissertation widmet sich daher folgender Frage: Wie hängt die komplexe Architektur des pflanzlichen Zytoskeletts mit seiner intrazellulären Transportfunktion zusammen? Eine Antwort auf diese Frage erfordert eine systemische Perspektive auf Zytoskelettstruktur und -transport. Zu diesem Zweck habe ich Mikroskopiedaten mit hoher raumzeitlicher Auflösung sowie Computer-gestützte Bildanalysen und mathematische Ansätzen der Graphen- und Netzwerktheorie kombiniert. Die vorliegende Dissertation umfasst fünf meiner Publikationen, die sich einem systemischen Verständnis des pflanzlichen Zytoskeletts als Transportnetzwerk widmen: (1) Dafür habe ich Bilddaten-basierte Netzwerkmodelle entwickelt, die eine exakte und automatisierte Quantifizierung der Architektur des Zytoskeletts ermöglichen. Diese Quantifizierung kann beispielsweise in genetischen oder chemischen Versuchen genutzt werden und für eine weitere Erforschung der genetischen Grundlagen und möglicher molekularer Interaktionspartner des Zytoskeletts hilfreich sein; (2) Ich habe nachgewiesen, dass das pflanzliche Aktin-Zytoskelett Eigenschaften effizienter Transportnetzwerk aufweist und Hinweise auf seine evolutionären Organisationsprinzipien liefert; (3) Durch die mathematische Optimierung von Transportnetzwerken konnte ich zeigen, dass unterschiedliche Pflanzenzelltypen spezifische und optimierte Organisationsstrukturen des Aktin-Zytoskeletts aufweisen; (4) Durch quantitative Analyse des Transports von Organellen in Pflanzenzellen habe ich nachgewiesen, dass sich Transportmuster ausgehend von der Struktur des Aktin-Zytoskeletts vorhersagen lassen. Dabei spielen sowohl die Organisation des Zytoskeletts auf Zellebene als auch seine Geometrie eine zentrale Rolle. (5) Schließlich habe ich eine robuste, optimierungs-basierte Methode entwickelt, die es erlaubt, individuelle Filamente eines Aktin-Netzwerks zu identifizieren. Dadurch ist es möglich, die Eigenschaften einzelner Zytoskelettfilamente im zellulären Kontext zu untersuchen. Die im Zuge dieser Dissertation entwickelten Methoden wurden frei und quelloffen als Werkzeuge zur Beantwortung verwandter Fragestellung zugänglich gemacht. Insgesamt liefern die hier präsentierten Ergebnisse und entwickelten Methoden quantitative, systemische Einsichten in die Transportfunktion des Zytoskeletts. Die hier etablierte Kombination von experimentellen und theoretischen Ansätzen kann, trotz des Fokusses auf das pflanzliche Zytoskelett, direkt auf andere Organismen angewendet werden. Als Ergänzung molekularer Studien bildet ein systemischer Blickwinkel, wie er hier entwickelt wurde, die Grundlage für ein Verständnis sowohl des evolutionären Kontextes als auch zukünftiger Kontroll- und Nutzungsmöglichkeiten des pflanzlichen Zytoskeletts. KW - systems biology KW - mathematical modeling KW - cytoskeleton KW - plant science KW - graph theory KW - image analysis KW - Systembiologie KW - mathematische Modellierung KW - Zytoskelett KW - Zellbiologie KW - Graphtheorie KW - Bildanalyse Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-93583 ER - TY - THES A1 - Makower, Katharina T1 - The roles of secondary metabolites in microcystis inter-strain interactions T1 - Die Rolle von Sekundärmetaboliten in den Wechselbeziehungen zwischen Microcystis-Stämmen N2 - Among the bloom-forming and potentially harmful cyanobacteria, the genus Microcystis represents a most diverse taxon, on the genomic as well as on morphological and secondary metabolite levels. Microcystis communities are composed of a variety of diversified strains. The focus of this study lies on potential interactions between Microcystis representatives and the roles of secondary metabolites in these interaction processes. The role of secondary metabolites functioning as signaling molecules in the investigated interactions is demonstrated exemplary for the prevalent hepatotoxin microcystin. The extracellular and intracellular roles of microcystin are tested in microarray-based transcriptomic approaches. While an extracellular effect of microcystin on Microcystis transcription is confirmed and connected to a specific gene cluster of another secondary metabolite in this study, the intracellularly occurring microcystin is related with several pathways of the primary metabolism. A clear correlation of a microcystin knockout and the SigE-mediated regulation of carbon metabolism is found. According to the acquired transcriptional data, a model is proposed that postulates the regulating effect of microcystin on transcriptional regulators such as the alternative sigma factor SigE, which in return captures an essential role in sugar catabolism and redox-state regulation. For the purpose of simulating community conditions as found in the field, Microcystis colonies are isolated from the eutrophic lakes near Potsdam, Germany and established as stably growing under laboratory conditions. In co-habitation simulations, the recently isolated field strain FS2 is shown to specifically induce nearly immediate aggregation reactions in the axenic lab strain Microcystis aeruginosa PCC 7806. In transcriptional studies via microarrays, the induced expression program in PCC 7806 after aggregation induction is shown to involve the reorganization of cell envelope structures, a highly altered nutrient uptake balance and the reorientation of the aggregating cells to a heterotrophic carbon utilization, e.g. via glycolysis. These transcriptional changes are discussed as mechanisms of niche adaptation and acclimation in order to prevent competition for resources. N2 - Die Gattung Microcystis stellt unter den blüten-bildenden Cyanobakterien ein Taxon besonderer Diversität dar. Dies gilt sowohl für die Genomstruktur als auch für morphologische Charakteristika und Sekundärmetabolite. Microcystis-Communities weisen eine Zusammensetzung aus einer Vielzahl von diversifizierten Stämmen auf. Das Hauptaugenmerk dieser Arbeit lag darauf, potentielle Wechselwirkungen zwischen Microcystis-Vertretern zu charakterisieren und die Rolle von Sekundärmetaboliten in Interaktions-Prozessen zu untersuchen. Die Rolle von Sekundärmetaboliten als Signalstoffe in Microcystis-Interaktionen wurde exemplarisch für das Hepatotoxin Microcystin demonstriert. Sowohl die extrazelluläre als auch die intrazellulare Funktion von Microcystin wurde anhand von Microarray-basierten Transkriptomstudien getestet. Dabei konnte eine extrazelluläre Wirkung von Microcystin bestätigt werden und mit der Transkription eines spezifischen anderen Sekundärmetaboliten in Verbindung gebracht werden. Intrazellulär vorkommendes Microcystin wurde hingegen mit verschiedenen Stoffwechselwegen des Primärstoffwechsels verknüpft. Es konnte ein deutlicher Zusammenhang zwischen einem Microcystin-Knockout und der SigE-vermittelten Regulation des Kohlenstoffmetabolismus festgestellt werden. Anhand der erworbenen Transkriptionsdaten wurde ein Modell vorgeschlagen, das eine regulierende Wirkung von Microcystin auf Transkriptionsfaktoren wie den alternativen Sigmafaktor SigE postuliert, welcher seinerseits eine zentrale Rolle in Zuckerabbauprozessen und zellulärer Redoxregulation einnimmt. Mit dem Ziel, Community-ähnliche Bedingungen zu simulieren, wurden Microcystis-Freiland-Kolonien aus eutrophen Gewässern in der Umgebung von Potsdam isoliert und ein stabiles Wachstum unter Laborbedingungen etabliert. Es konnte gezeigt werden, dass der frisch isolierte Freilandstamm FS2 spezifisch eine starke Zellaggregation in Microcystis aeruginosa PCC 7806 (einem axenischen Labortstamm) auslösen konnte. In Transkriptionsstudien mit Hilfe von Microarrays wurden Expressionsprogramme gefunden, die sowohl einen Umbau von Zellhüllstrukturen, als auch einen stark veränderten transmembranen Nährstofftransport beinhalteten. Darüber hinaus konnte in den aggregierenden PCC 7806-Zellen eine Verlagerung zu heterotrophen Kohlenstoffabbauprozessen wie der Glykolyse gefunden werden. Die transkriptionellen Veränderungen wurden als Akklimationsmechanismen zur Positionierung in ökologische Nischen diskutiert, um Konkurrenzen um Ressourcen zu vermeiden. KW - microcystis KW - microcystin KW - secondary metabolites KW - transcriptomics KW - interactions KW - Sekundärmetabolite KW - Transkriptomik KW - Wechselwirkungen Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-93916 ER - TY - THES A1 - Lämke, Jörn T1 - Determining the future in the past BT - analysis of the role of chromation in heat stress memory in Arabidopsis thaliana Y1 - 2015 ER - TY - THES A1 - Shahnejat-Bushehri, Sara T1 - Unravelling the role of the Arabidopsis NAC transcription factor JUNGBRUNNEN1 (JUB1) for the regulation of growth and stress responses Y1 - 2016 ER - TY - THES A1 - Paijmans, Johanna L. A. T1 - Application of hybridisation capture to investigate complete mitogenomes from ancient samples Y1 - 2015 ER - TY - THES A1 - Balk, Maria T1 - 3D structured shape-memory hydrogels with enzymatically-induced shape shifting Y1 - 2015 ER - TY - THES A1 - Bartholomäus, Alexander T1 - Analyzing Transcriptional and Translational Control in E. coli using Deep-Seq Data Y1 - 2016 ER - TY - THES A1 - Apelt, Federico T1 - Implementation of an imaging-based approach using a 3D light-field camera to analyse plant growth behaviour Y1 - 2015 ER - TY - THES A1 - Plötner, Björn T1 - F2 hybrid chlorosis in a cross between the Arabidopsis thaliana accessions Shahdara and Lovvik-5 Y1 - 2015 ER - TY - THES A1 - Laux, Eva-Maria T1 - Electric field-assisted immobilization and alignment of biomolecules T1 - Immobilisierung und Ausrichtung von Biomolekülen mit elektrischen Wechselfeldern N2 - In this dissertation, an electric field-assisted method was developed and applied to achieve immobilization and alignment of biomolecules on metal electrodes in a simple one-step experiment. Neither modifications of the biomolecule nor of the electrodes were needed. The two major electrokinetic effects that lead to molecule motion in the chosen electrode configurations used were identified as dielectrophoresis and AC electroosmotic flow. To minimize AC electroosmotic flow, a new 3D electrode configuration was designed. Thus, the influence of experimental parameters on the dielectrophoretic force and the associated molecule movement could be studied. Permanent immobilization of proteins was examined and quantified absolutely using an atomic force microscope. By measuring the volumes of the immobilized protein deposits, a maximal number of proteins contained therein was calculated. This was possible since the proteins adhered to the tungsten electrodes even after switching off the electric field. The permanent immobilization of functional proteins on surfaces or electrodes is one crucial prerequisite for the fabrication of biosensors. Furthermore, the biofunctionality of the proteins must be retained after immobilization. Due to the chemical or physical modifications on the proteins caused by immobilization, their biofunctionality is sometimes hampered. The activity of dielectrophoretically immobilized proteins, however, was proven here for an enzyme for the first time. The enzyme horseradish peroxidase was used exemplarily, and its activity was demonstrated with the oxidation of dihydrorhodamine 123, a non-fluorescent precursor of the fluorescence dye rhodamine 123. Molecular alignment and immobilization - reversible and permanent - was achieved under the influence of inhomogeneous AC electric fields. For orientational investigations, a fluorescence microscope setup, a reliable experimental procedure and an evaluation protocol were developed and validated using self-made control samples of aligned acridine orange molecules in a liquid crystal. Lambda-DNA strands were stretched and aligned temporarily between adjacent interdigitated electrodes, and the orientation of PicoGreen molecules, which intercalate into the DNA strands, was determined. Similarly, the aligned immobilization of enhanced Green Fluorescent Protein was demonstrated exploiting the protein's fluorescence and structural properties. For this protein, the angle of the chromophore with respect to the protein's geometrical axis was determined in good agreement with X-ray crystallographic data. Permanent immobilization with simultaneous alignment of the proteins was achieved along the edges, tips and on the surface of interdigitated electrodes. This was the first demonstration of aligned immobilization of proteins by electric fields. Thus, the presented electric field-assisted immobilization method is promising with regard to enhanced antibody binding capacities and enzymatic activities, which is a requirement for industrial biosensor production, as well as for general interaction studies of proteins. N2 - In dieser Doktorarbeit wurde eine Methode entwickelt, mit der Biomoleküle unter dem Einfluss von elektrischen Feldern auf Metallelektroden immobilisiert und ausgerichtet werden können. Für die Immobilisierung wurden weder Modifikationen an den Biomolekülen noch an den Elektroden benötigt. Zwei elektrokinetische Effekte, die Dielektrophorese und der AC-elektroosmotische Fluss, wurden als verantwortliche Effekte für die Molekülbewegung identifiziert. Mit einer neuen 3D Elektrodenkonfiguration wurde der AC-elektroosmotische Fluss minimiert. Damit konnte der Einfluss der experimentellen Parameter auf die Dielektrophoresekraft und deren Auswirkungen auf die Moleküle untersucht werden: Die permanente Immobilisierung von Proteinen wurde mit einem Rasterkraftmikroskop quantifiziert, indem die Volumina der immobilisierten Proteinablagerungen gemessen wurden, und daraus die maximal darin enthaltene Anzahl an Proteinen berechnet wurde. Diese Art der absoluten Quantifizierung war nur möglich, da die Proteine auch nach Abschalten des elektrischen Feldes auf den Wolframelektroden hafteten. Eine solche permanente Immobilisierung funktioneller Proteine auf Elektroden oder Oberflächen im Allgemeinen ist eine wichtige Voraussetzung für die Herstellung von Biosensoren. Des Weiteren muss die Biofunktion der Proteine nach der Immobilisierung erhalten bleiben. Da die Proteine durch die Immobilisierung chemisch oder physikalisch verändert werden, ist auch ihre Biofunktion häufig eingeschränkt. In dieser Arbeit wurde erstmals der Erhalt der Aktivität dielektrophoretisch immobilisierter Enzyme gezeigt. Hierfür wurde das Enzym Meerrettichperoxidase exemplarisch verwendet, dessen Aktivität über die Oxidation von Dihydrorhodamin 123, einem nicht-fluoreszentem Vorläufer des Fluoreszenzfarbstoffes Rhodamin 123, nachgewiesen wurde. Molekulare Ausrichtung und Immobilisierung – sowohl reversibel als auch permanent – wurde unter dem Einfluss inhomogener elektrischer Wechselfelder erreicht. Für die Bestimmung der Molekülausrichtung wurde mit ein Messaufbau entwickelt, der auf einem Fluoreszenzmikroskop basiert. Der Aufbau, das Messprotokoll und die Auswertungsmethode wurden mit einer selbst hergestellten Kontrollprobe, die aus ausgerichteten Acridinorangemolekülen in einem Flüssigkristall bestand, validiert. Lambda-DNA Doppelstränge wurden zwischen benachbarten Interdigitalelektroden gestreckt und temporär ausgerichtet. Die Ausrichtung von interkalierten PicoGreen-Molekülen im rechten Winkel zur Längsachse der Doppelstränge konnte hier gezeigt werden. Zudem konnte die ausgerichtete Immobilisierung des enhanced Green Fluorescent Protein nachgewiesen werden, indem die Fluoreszenz des Proteins und seine Struktureigenschaften ausgenutzt wurden. Aus den Messungen konnte der Winkel des Chromophors relativ zur Proteinlängsachse mit guter Übereinstimmung mit Röntgenkristallstrukturdaten bestimmt werden. Eine permanente Immobilisierung mit gleichzeitiger Ausrichtung der Proteine wurde entlang der Kanten, an den Spitzen und auf der Oberfläche von Interdigitalelektroden erzielt. Damit wurde zum ersten Mal eine ausgerichtete Immobilisierung von Proteinen mit elektrischen Wechselfeldern gezeigt. Diese Methode ist vielversprechend für die Immobilisierung von Antikörpern oder Enzymen mit einheitlicher Ausrichtung und dadurch verbessertem Zugang zu den aktiven Zentren, was nicht nur für die industrielle Biosensorherstellung von Interesse ist, sondern genauso für allgemeine Wechselwirkungsstudien von Proteinen. KW - dielectrophoresis KW - electrokinetics KW - proteins KW - immobilization KW - alignment KW - Dielektrophorese KW - elektrokinetische Effekte KW - Proteine KW - Immobilisierung KW - Ausrichtung Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-90271 ER -