TY - THES A1 - Kobabe, Svenja T1 - Charakterisierung der mikrobiellen Lebensgemeinschaft eines sibirischen Permafrostbodens T1 - Characterisation of microbial community composition of a Siberian tundra soil N2 - Die vorliegende Arbeit wurde im Rahmen des multidisziplinären Deutsch-Russischen Verbundprojektes "Laptev See 2000" erstellt. Die dargestellten bodenkundlichen und mikro-biologischen Untersuchungen verfolgten das Ziel die mikrobielle Lebensgemeinschaft eines Permafrostbodens im sibirischen Lena Delta zu charakterisieren, wobei den methanogenen Archaea besondere Beachtung zukam. Die Probennahme wurde im August 2001 im zentralen Lenadelta, auf der Insel Samoylov durchgeführt. Das Delta liegt im Bereich des kontinuierlichen Permafrostes, was bedeutet, dass nur eine flache saisonale Auftauschicht während der Sommermonate auftaut. Das untersuchte Bodenprofil lag im Zentrum eines für die Landschaft repräsentativen Low Center Polygons. Zum Zeitpunkt der Beprobung betrug die Auftautiefe des untersuchten Bodens 45 cm.. Der Wasserstand lag zum Untersuchungszeitpunkt 18 cm unter der Geländeoberfläche, so dass alle tiefer liegenden Horizonte durch anaerobe Verhältnisse charakterisiert waren. Die Untersuchung der bodenkundlichen Parameter ergab unter anderem eine mit zunehmender Tiefe abnehmende Konzentration von Kohlenstoff und Stickstoff, sowie eine Abnahme von Temperatur und Wurzeldichte. Um die Auswirkungen der sich mit der Tiefe verändernden Bodeneigenschaften auf die Mikroorganismen zu ermitteln, wurden die Mikroorganismenpopulationen der verschiedenen Bodentiefen mit Hilfe der Fluoreszenz in situ Hybridisierung hinsichtlich ihrer Anzahl, Aktivität und Zusammensetzung beschrieben. Für die Charakterisierung des physiologischen Profils dieser Gemeinschaften, bezüglich der von ihr umsetzbaren Kohlenstoffverbindungen, wurden BIOLOG Mikrotiterplatten unter den in situ Bedingungen angepassten Bedingungen eingesetzt. Die sich im Profil verändernden Bodenparameter, vor allem die abnehmende Substratversorgung, die geringe Temperatur und die anaeroben Verhältnisse in den unteren Bodenschichten führten zu einer Veränderung der Mikroorganismenpopulation im Bodenprofil. So nahm von oben nach unten die Gesamtanzahl der ermittelten Mikroorganismen von 23,0 × 108 auf 1,2 × 108 Zellen g-1 ab. Gleichzeitig sank der Anteil der aktiven Zellen von 59% auf 33%. Das bedeutet, dass im Bereich von 0-5 cm 35mal mehr aktive Zellen g-1 als im Bereich von 40-45 cm gefunden wurden. Durch den Einsatz spezieller rRNS-Sonden konn-te zusätzlich eine Abnahme der Diversität mit zunehmender Bodentiefe nachgewiesen werden. Die geringere Aktivität der Population in den unteren Horizonten sowie die Unterschiede in der Zusammensetzung wirkten sich auf den Abbau der organischen Substanz aus. So wur-den die mit Hilfe der BIOLOG Mikrotiterplatten angebotenen Substanzen in größerer Tiefe langsamer und unvollständiger abgebaut. Insbesondere in den oberen 5 cm konnten einige der angebotenen Polymere und Kohlehydrate deutlich besser als im restlichen Profil umge-setzt werden. Das außerdem unter anaeroben Versuchsbedingungen diese Substrate deutlich schlechter umgesetzt wurden, kann so interpretiert werden, dass die konstant anaeroben Bedingungen in den unteren Horizonten ein Auftreten der Arten, die diese Substrate umset-zen, erschweren. Die in den oberen, aeroben Bodenabschnitten wesentlich höheren Zellzahlen und Aktivitäten und die dadurch schnellere C-Umsetzung führen auch zu einer besseren Substratversorgung der methanogenen Archaea in den makroskopisch aeroben Horizonten. Die erhöhte Substratverfügbarkeit erklärt die Tatsache, dass im Bereich von 0-5 cm die meisten methanogenen Archaea gefunden wurden, obwohl sich dieser Bereich zum Zeitpunkt der Probennahme oberhalb des wassergesättigten Bodenbereichs befand. Trotz der aeroben Bedingungen in, liegt im Bereich von 5 10 cm die für die methanogenen Archaea am besten geeignete Kombination aus Substratangebot und anaeroben Nischen vor. Hinzu kommt, dass in diesen Tiefen die Sommertemperaturen etwas höher liegen als in den tieferen Horizonten, was wiederum die Aktivität positiv beeinflusst. Bei zusammenfassender Betrachtung der Untersuchungsergebnisse von Anzahl, Aktivität, Zusammensetzung und Leistung der gesamten, aber im besonderen auch der methanogenen Mikroorganismenpopulation wird deutlich, dass in dem untersuchten Bodenprofil unter ökologischen Gesichtspunkten die oberen 15-20 cm den für den C-Umsatz relevantesten Bereich darstellen. Das Zusammenspiel wichtiger Bodenparameter wie Bodentemperatur, Wasserstand, Nährstoffversorgung und Durchwurzelung führt dazu, dass in dem untersuchten Tundraboden in den oberen 15-20 cm eine wesentlich größere und diversere Anzahl an Mikroorganismen existiert, die für einen schnelleren und umfassenderen Kohlenstoffumsatz in diesem Bereich des active layers sorgt. N2 - The soil characteristics and the bacterial community of the active layer (0-45 cm) of a permafrost affected tundra soil were analysed. The composition of the bacterial community was investigated by fluorescence in situ hybridisation (FISH) while BIOLOG Ecoplates were used to characterize microbial communities by determining the ability of the communities to oxidize various carbon sources. Arctic tundra soils contain large amounts of organic carbon, accumulated in thick soil layers and are known as a major sink of atmospheric CO2. These soils are totally frozen throughout the year and only a thin active layer is unfrozen and shows biological activity during the short summer. To improve the understanding of how the carbon fluxes in the active layer are controlled, detailed analysis of composition, functionality and interaction of soil microorganisms was done. The FISH analyses of the active layer showed large variations in absolute cell numbers and in the composition of the active microbial community between the different horizons, which is caused by the different environmental conditions (e.g. soil temperature, amount of organic matter, aeration) in this vertically structured ecosystem. Results obtained by universal protein stain 5-(4,6-dichlorotriazin-2-yl)aminofluorescein (DTAF) showed an exponential decrease of total cell counts from the top to the bottom of the active layer (2.3 × 109 to 1.2 × 108 cells per g dry soil). By using FISH, up to 59% of the DTAF-detected cells could be detected in the surface horizon, and up to 84% of these FISH-detected cells could be affiliated to a known phylogenetic group. With increasing depth the amount of FISH-detectable cells decreased as well as the diversity of ascertained phylogenetic groups. The turnover of substrates offered on the BIOLOG Ecoplates was slower and less complete in the deeper soil horizons. Especially in the upper 5 cm the turnover of some of the polymeric substances and some carbohydrates was much better than in deeper parts of the soil. The interaction of important soil parameters (water table, nutrient availability, roots) leads to a larger and more diverse community in the upper 20 cm of the soil, which again cause a faster and more complete turnover in this part of the active layer. KW - Mikrobiologie KW - Angewandte Mikrobiologie KW - Bodenmikrobiologie KW - Methanemission KW - Dauerfrostboden KW - Sibirien KW - Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung KW - Len KW - Microbiology KW - Soil KW - methane KW - Siberia Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-5467 ER - TY - THES A1 - Marschan, Xenia T1 - Mikroarray-basierte Detektion von mRNA aus Zellen mittels On-Chip-PCR T1 - Microarray based detection of cellular mRNA by On-Chip-PCR N2 - Bei konventionellen Mikroarray-Experimenten zur Genexpressionsanalyse wird fluoreszenz- oder radioaktiv-markierte cDNA oder RNA mit immobilisierten Proben hybridisiert. Für ein gut detektierbares und auswertbares Ergebnis werden jedoch pro Array mindestens 15 - 20 µg Hybridisierungstarget benötigt. Dazu müssen entweder 15 - 20 µg RNA direkt durch Reverse Transkription in markierte cDNA umgeschrieben werden oder bei Vorhandensein von weniger Startmaterial die RNA amplifiziert werden (Standard- Affymetrix-Protokolle, Klur et al. 2004). Oft sind damit zeit- und kostenintensive Probenpräparationen verbunden und das Ergebnis ist nicht immer reproduzierbar. Obwohl es inzwischen einige Protokolle gibt, die dieses Problem zu lösen versuchen (Zhang et al. 2001, Iscove et al. 2002, McClintick et al. 2003, Stirewalt et al. 2004), eine optimale, leicht handbare und reproduzierbare Methode gibt es weiterhin nicht, weshalb in dieser Arbeit ein weiterer Lösungsansatz gesucht wurde. In der vorgestellten Arbeit werden zwei einfache Methoden beschrieben, mit denen Gene aus geringen RNA-Mengen nachgewiesen werden können: erstens die On Chip- RT-PCR mit cDNA als Matrize und zweitens diese Methode als One-Step-Reaktion mit RNA als Matrize. Beide Methoden beruhen auf dem Prinzip der PCR an immobilisierten Primern auf einer Chipoberfläche. Diese Möglichkeit der exponentiellen Amplifikation ist reproduzierbar und sensitiv. In Experimenten zur Etablierung des On-Chip-PCR-Systems wurden für die Immobilisierung der Primer verschiedene Kopplungsmethoden verwendet. Die affine Kopplung über Biotin- Streptavidin erwies sich als geeignet. Die On-Chip-Reaktion an kovalent gebundenen Primern wurde für amino-modifizierte Primer auf Epoxy-Oberflächen sowie für EDC-Kopplung auf silanisierten Oberflächen gezeigt. Für die letztgenannte Methode wurde die On-Chip-PCR optimiert, dass Spottingkonzentrationen der Primer von 5 - 10µM schon ausreichend sind. Der Einsatz von fluoreszenz-markierten Primern während der PCR ermöglicht eine unmittelbare Auswertung nach der Synthese ohne zusätzliche Detektionsschritte. In dieser Arbeit konnte außerdem mit der vorgestellten Methode der simultane Nachweis zweier Gene gezeigt werden. Die Methode kann noch als Multiplex-Analyse ausgebaut werden, um so mehrere Gene in gleichzeitig einem Ansatz nachweisen zu können. Die Ergebnisse der Versuche mit Matrizen aus unterschiedlichen Zelltypen deuten darauf hin, dass die On-Chip-RT-PCR eine weitere optimale Methode für den Nachweis von gering exprimierten Genen bietet. N2 - The detection of low quantities of mRNA is often difficult and methods like microarray analysis require large amount of starting material or have to be amplified before application. The reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) is often the chosen method to detect specific RNA sequences on account of its high sensitivity. The solid phase amplification technology by On-Chip-PCR provides a combination of amplification of rare target material and its on chip detection in one step. In this report a novel application for the On-Chip-PCR technology is described. It was suitable to identify mRNA sequences and genes, respectively. For this approach we amplified cDNA sequences using immobilized specific primers and fluorescent labeled primers. They were used for genes coding subunits of the mouse muscle acetylcholine receptor (Chrna1, Chrnb1, Chrnd) and the genes coding for myogenin (Myog), muscle creatine kinase (Ckmm) and Atpase (Atp2a2). The cDNA templates were synthesized before the On-Chip application by Reverse Transcription from mRNA. For this application only at most 500 pg of total-RNA preparation was sufficient for detectable results and no pre-amplification steps were needed. Furthermore the handling of RT-PCR could be minimized by using a One-step- RT-PCR protocol. This method used immobilized primers on glassy supports detecting specific mRNA sequences from 5 pg or less of total RNA preparations. Moreover to the detection of low quantities of RNA preparation, low abundant genes could be detected by this method. KW - Polymerase-Kettenreaktion KW - Microarray KW - Messenger-RNS KW - Genexpression KW - On-Chip-PCR KW - mRNA KW - Reverse Transkription KW - RT-PCR KW - On-Chip-PCR KW - mRNA KW - Reverse Transcription KW - RT-PCR Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-5457 ER - TY - THES A1 - Himmel, Mirko T1 - Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen und der in vivo Phosphorylierung des Sarkomerproteins Myomesin T1 - Analysis of Protein-Protein Interactions and in vivo Phosphorylation of the Sarcomeric Protein Myomesin N2 - Für ein tiefergehendes Verständnis von Entwicklung und Funktion der quergestreiften Muskulatur ist eine Betrachtung der am Aufbau der Myofibrillen, den kontraktilen Organellen, beteiligten Proteine essentiell. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit Myomesin, einem Protein der sarkomeren M-Bande. Zunächst wurde die cDNA des humanen Myomesins vollständig kloniert, sequenziert und nachfolgend die komplette Größe der aminoterminalen Kopfdomäne bestimmt. Es konnte gezeigt werden, daß Myomesin in vitro mit den Domänen 1 und 12 an Myosin bindet. Die muskelspezifische Isoform der Kreatinkinase bindet an die Domänen 7 und 8. Stimulations- und Inhibitionsexperimente belegen, daß Myomesin an Serin 618 in vivo durch die Proteinkinase A phosphoryliert wird und daß diese Phosphorylierung durch Aktivierung beta2-adrenerger Rezeptoren stimulierbar ist. In Muskelgewebeproben von Patienten, die an der Hypertrophen Kardiomyopathie, einer genetisch bedingten Herzmuskelkrankheit, erkrankt sind, konnte mit einem neu hergestellten phosphorylierungsabhängigen Antikörper eine Verminderung der Menge phosphorylierten Myomesins nachgewiesen werden. Mögliche Ursachen werden diskutiert. Myomesin bildet Dimere, wie durch hefegenetische und biochemische Experimente gezeigt werden konnte. Die Dimerisierung von Myomesin könnte eine zentrale Rolle für den Einbau der Myosinfilamente in die naszierende Myofibrille haben. Anhand der gewonnenen Daten wurde ein verbessertes Modell der zentralen M-Bande erstellt. N2 - A deep understanding of the development and function of the sarcomeric muscle depends on the careful study of proteins involved in the assembly of myofibrills, the contractile organelles in cross-striated muscle. This thesis deals with the sarcomeric M-band protein myomesin. First, the complete cDNA of human myomesin was cloned, sequenced, and subsequently the size of the aminoterminal head domain of myomesin was determined. Myomesin binds to myosin in vitro via domains 1 and 12. Musclespecific creatine kinase is binding to the domains 7 and 8 of myomesin. Stimulation and inhibition experiments revealed, that serin 618 in human myomesin is phosphorylated in vivo by protein kinase A and that this phosphorylation can be stimulated by activation of beta2-adrenergic receptors. In muscle tissue of patients showing symptoms of the hypertrophic cardiomyopathy, a cardiac disease caused by genetic defects, the amount of phosphorylated myomesin was lowered as detected by a phosphospecific antibody which was established new. Myomesin dimerizes as shown by yeast two hybrid and biochemical experiments. Myomesin dimerization could be a central point in myofibrillogenesis, when myosin filaments were incorporated in nascent myofibrills. Taking all the data together, an improved model of the central M-band was developed. KW - Proteine KW - Myofibrille KW - Sarkomer KW - Phosphorylierung KW - M-Bandenmodell KW - PKA KW - M-band model KW - PKA Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-5153 ER - TY - THES A1 - Baufeld, Ralf T1 - GIS-gestützte Prognose der Biotopentwicklung auf Grundlage von Biotoptypen- und Vegetationserhebungen auf geplanten Rückdeichungsflächen an der Mittleren Elbe in Sachsen-Anhalt T1 - GIS supported forecast of biotope development based on investigations of biotopes and vegetation on planned areas for setting back dykes at the Middle Elbe in Saxony-Anhalt N2 - Durch die anthropogene Nutzung sind viele Auen in Mitteleuropa verändert worden, wobei insbesondere die Retentionsflächen stark verringert wurden. Während Auen seit längerem im Fokus der wissenschaftlichen Bearbeitung stehen, gibt es bisher große Wissensdefizite in der Frage der Auenreaktivierungen. Zum einen sind derartige Projekte bisher kaum verwirklicht und zum anderen ist ein langfristiges Monitoring notwendig, um die Anpassung von Biozönosen an die veränderten Standortbedingungen beobachten zu können. Um die Folgen derartiger Eingriffe zu analysieren, bieten sich computergestützte Modellierungen der Landschaftsentwicklung an, wie sie in der vorliegenden Arbeit verwirklicht wurden. Ziel der Arbeit war, mit Hilfe eines Geografischen Informationssystems (GIS) das Entwicklungspotenzial der Landschaft bei verschiedenen Rückdeichungsvarianten auf der Ebene der Biotoptypen darzustellen. Dabei ging es nicht um die Erstellung eines allgemein gültigen Auenmodells sondern um die Erarbeitung eines Modells für einen konkreten Anwendungsfall. Der erarbeitete Ansatz sollte zudem für die landschaftsplanerische Praxis geeignet sein. Als Beispielgebiete wurden Flächen an der Mittleren Elbe bei Rogätz und Sandau, beide im nördlichen Teil von Sachsen-Anhalt, ausgewählt. Die vorliegende Arbeit gliedert sich in zwei Teile. Im ersten Teil werden Erhebungen und Auswertungen als Grundlage der Modellentwicklung dargestellt. Dazu wurden die Biotoptypen der Beispielgebiete flächendeckend erhoben und mit punktuellen Vegetationserhebungen ergänzt. Aus dem Forschungsprojekt "Rückgewinnung von Retentionsflächen und Altauenreaktivierung an der Mittleren Elbe in Sachsen-Anhalt" des Bundesministeriums für Bildung und Forschung (BMBF) standen standortökologische Daten der Hydrologie und Bodenkunde zur Verfügung. Ziel der Auswertung war, Schlüsselfaktoren für Hydrologie und Bodenbedingungen innerhalb der rezenten Aue zu identifizieren, die zur Ausprägung bestimmter Biotoptypen führen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde ein Modell für Biotoptypenpotenziale auf den geplanten Rück–deichungsflächen entwickelt. Das Modell bearbeitet die Datenbank der verwendeten GIS-Dateien, die auf Daten zum Bestand beruht und um solche der Prognose der Standortökologie (Hydrologie und Boden) im Rückdeichungsfalle aus dem BMBF-Projekt erweitert wurde. Weitere Voraussetzung für die Modellierung war die Erarbeitung von Leitbildern, in denen unterschiedliche Nutzungsszenarios für die Landschaft nach Deichrückverlegung hypothetisch festgelegt wurden. Insbesondere die Nutzungsintensität wurde variiert, von einer Variante intensiver land- und forstwirtschaftlicher Nutzung über sogenannte integrierte Entwicklungsziele aus dem BMBF-Projekt bis hin zu einer Variante der Naturschutznutzung. Zusätzlich wurde eine zukünftige Potentielle Natürliche Vegetation modelliert. Eine Überprüfung des Modell fand für den Raum der rezenten Aue in der intensiven Nutzungsvariante statt, die der gegenwärtigen Nutzung am nächsten kommt. Werden Informationen des Bestandsbiotoptyps als Korrekturgröße in das Modell einbezogen, konnte für viele Biotoptypen eine Trefferquote von über 90 % erreicht werden. Bei flächenmäßig weniger bedeutenden Bio–toptypen lag dieser Wert aufgrund der schmaleren Datenbasis zwischen 20 und 40 %. Als Ergebnis liegt für unterschiedliche Deichvarianten und Leitbilder in den Beispielgebieten die Landschaftsentwicklung als Biotoppotenzial vor. Als eine vereinfachte Regionalisierung der punktuellen Vegetationsdaten wurde im Modell geprüft, inwieweit die modellierten Biotopflächen der Charakteristik der pflanzensoziologischen Aufnahmen aus der rezenten Aue entsprechen. In dem Falle wurde die Pflanzengesellschaft der jeweiligen ökologisch im Rahmen der Untersuchung einheitlichen Flächeneinheit zugeordnet. Anteilig lässt sich damit die Biotopprognosefläche pflanzensoziologisch konkretisieren. Die vorliegende Arbeit gehört zu den bisher wenigen Arbeiten, die sich mit den Folgen von Auenreaktivierung auf die Entwicklung der Landschaft auseinandersetzen. Sie zeigt eine Möglichkeit auf, Prognosemodelle für Biotoptypen und Vegetation anhand begrenzter Felduntersuchungen zu entwerfen. Derartige Modelle können zum Verständnis von Eingriffen in den Naturhaushalt, wie sie die Deichrückverlegungen darstellen, beitragen und eine Folgenabschätzung unterstützen. N2 - Most of the floodplains in Central Europe are highly altered by man. In particular, recent inundation areas have been dramatically reduced. Before the Elbe-flood-disaster of the year 2002 there had already been considerations about combining flood-protection and restoration of floodplains. While research has focused on floodplains for a considerable time, knowledge on the reactivation of floodplains is still significantly lacking. Until now, only a few projects have been realized, and there has not been enough long-term moni–toring of the adaption of habitats to changing conditions. Computerized models of landscape development, as utilized in the presented work, can help to address these questions. The aim of the study was to show the potential development of the landscape on the scale of biotopes under different scenarios of floodplain expansion by application of a geographic information system (GIS). It was not intended to create a general floodplain-model. The model aimed at a specific applied case and should also be applicable for questions of landscape planning. Two areas near the villages of Sandau and Rogätz at the Middle Elbe River in the north of the German federal state of Saxony-Anhalt were selected. The presented work is divided into two parts. The first describes the sampling and evaluation of data as a basis for modeling. For this, the biotopes were mapped in total in the two study areas. Additionally, vegetation data were collected from selected sites mainly in the grassland and forest-biotopes. Hydrological and soil condition data were available through the project "Rückgewinnung von Retentionsflächen und Altauenreaktivierung an der Mittleren Elbe in Sachsen-Anhalt" of the German Ministry of Education and Science (BMBF). This part of the study aimed to identify the ecological key factors in the recent floodplain that lead to the development of the different biotopes. In the second part of the presented work a model for the potential biotopes on the expanded floodplain after setting back the dikes was developed. The model alters the GIS database and adds a potential biotope. First this database must be expanded to integrate the hydrological and soil data of the BMBF-project for the expanded floodplain. Different hypo–thetical land use scenarios were assumed and applied to the model. The three different variants of land use adapted from the BMBF-project were intensive land use, land use under conditions of nature-conservation an integration of both extremes. In the case of intensive land –use arable fields were modeled in areas which are flooded on average only every ten years or less. As a fourth scenario the potential natural vegetation was modeled. An evaluation of the model was made for the recent floodplain under intensive land use conditions, which are close to the current land use. By correcting the models results with information of the current biotope composition, many biotopes could be predicted correctly with 90 % accuracy. For biotopes which are rare in the study area the prediction rate lay between 20 and 40 %. The result of the second part of the presented work was the modeling of the potential biotopes for the different land use scenarios and the different variants of setting back the dikes. Integrated in the model was a module of a simplified regionalization of the vegetation data. It was tested whether the characteristics of the processed unit of the GIS-database fit the results of the vegetation sampling of the first part of the study. Where this was the case, the whole unit was characterized as a phytosociologic vegetation-unit. Thus, for part of the modeling area the biotope-potentials could be expanded with information on the actual vegetation. The present work is one of the few studies so far dealing with the consequences for the landscape of reactivating floodplains which are separated from rivers by dikes. It shows the possibility to use models to predict changes in biotopes and vegetation based on limited field data. Such models can help to understand the altering of nature caused by such impacts and to estimate the possible consequences. KW - Modellierung KW - Geoinformationssystem KW - Vegetation KW - Biotoptypen KW - Deichrückverlegung KW - Auenreaktivierung KW - biotopes KW - setting back dykes KW - restoration of floodplains Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-2523 ER - TY - THES A1 - Gehmlich, Katja T1 - Strukturen der Kraftübertragung im quergestreiften Muskel : Protein-Protein-Wechselwirkungen und Regulationsmechanismen T1 - Structures of force transduction in cross-striated muscle tissues : protein-protein interactions and mechanisms of their regulation N2 - Im Mittelpunkt dieser Arbeit standen Signaltransduktionsprozesse in den Strukturen der Kraftübertragung quergestreifter Muskelzellen, d. h. in den Costameren (Zell-Matrix-Kontakten) und den Glanzstreifen (Zell-Zell-Kontakten der Kardiomyozyten).Es ließ sich zeigen, dass sich die Morphologie der Zell-Matrix-Kontakte während der Differenzierung von Skelettmuskelzellen dramatisch ändert, was mit einer veränderten Proteinzusammensetzung einhergeht. Immunfluoreszenz-Analysen von Skelettmuskelzellen verschiedener Differenzierungsstadien implizieren, dass die Signalwege, welche die Dynamik der Fokalkontakte in Nichtmuskelzellen bestimmen, nur für frühe Stadien der Muskeldifferenzierung Relevanz haben können. Ausgehend von diesem Befund wurde begonnen, noch unbekannte Signalwege zu identifizieren, welche die Ausbildung von Costameren kontrollieren: In den Vorläuferstrukturen der Costamere gelang es, eine transiente Interaktion der Proteine Paxillin und Ponsin zu identifizieren. Biochemische Untersuchungen legen nahe, dass Ponsin über eine Skelettmuskel-spezifische Insertion im Carboxyterminus das Adapterprotein Nck2 in diesen Komplex rekrutiert. Es wird vorgeschlagen, dass die drei Proteine einen ternären Signalkomplex bilden, der die Umbauvorgänge der Zell-Matrix-Kontakte kontrolliert und dessen Aktivität von mitogen activated protein kinases (MAPK) reguliert wird.Die Anpassungsvorgänge der Strukturen der Kraftübertragung an pathologische Situtation (Kardiomyopathien) in der adulten quergestreiften Muskulatur wurden ausgehend von einem zweiten Protein, dem muscle LIM protein (MLP), untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass ein mutiertes MLP-Protein, das im Menschen eine hypertrophe Kardiomyopathie (HCM) auslöst, strukturelle Defekte aufweist und weniger stabil ist. Weiterhin zeigte dieses mutierte Protein eine verringerte Bindungsfähigkeit an die beiden Liganden N-RAP und alpha-Actinin. Die molekulare Grundlage der HCM-verursachenden Mutationen im MLP-Gen könnte folglich eine Veränderung der Homöostase im ternären Komplex MLP – N-RAP – alpha-Actinin sein. Die Expressionsdaten eines neu generierten monoklonalen MLP-Antikörpers deuten darauf hin, dass die Funktionen des MLP nicht nur für die Integrität des Myokards, sondern auch für die der Skelettmuskulatur notwendig sind. N2 - The cell-matrix-contacts (costameres) and cell-cell-contacts (intercalated discs of cardiomyocytes) of cross-striated muscle cells transmit mechanical forces to the exterior. On top of this mechanical function, both structures have been implied to be involved in signal transduction processes.Dramatic morphological changes in the overall structure of cell-matrix-contacts of skeletal muscle cells were revealed during differentiation. Moreover, this reorganisation was accompanied by alterations in protein composition. Immunofluorescence microscopy indicated that signalling pathways which control the dynamics of focal contacts in non-muscle cells seem to be important only for early differentiation stages of skeletal muscle cells. To explore novel signalling pathways involved in regulating the formation of costameres, signalling molecules engaged were identified. Thus, paxillin and ponsin transiently interact at the precursors of costameres during muscle development. In addition, biochemical data indicate that a skeletal muscle specific module in the carboxyterminal part of ponsin can recruit the adapter protein Nck2 to this complex. Hence, the three proteins might form a ternary signalling complex involved in controlling the reorganisation of cell-matrix-contacts. Apparently, the activity of this signalling complex is regulated by mitogen activated protein kinases (MAPK).A second approach has focussed on adaptational processes of the same structures observed in pathological situations. In particular, the role of muscle LIM protein (MLP) in hypertrophic cardiomyopathy (HCM) was investigated. It was shown that a HCM-causing mutant MLP protein fails to fold properly and that the consequent loss of stability is reflected in altered binding properties: the mutant MLP protein shows decreased binding to both N-RAP and alpha-actinin. Hence, the molecular basis for HCM-causing mutations in the MLP gene might be an altered homeostasis of the ternary complex MLP – N-RAP – alpha-actinin. Increasing evidence indicates that the functions of MLP are required not only for the integrity of the myocardium. In addition, MLP seems to have regulatory functions in skeletal muscle tissues. KW - Herzmuskelkrankheit KW - Quergestreifte Muskulatur KW - Protein-Protein-Wechselwirkung KW - Phosphorylierung KW - Costamer KW - Fokalkontakt KW - Zell-Matrix-Kontakt KW - Ponsin KW - Muscle LIM Protein (MLP) KW - protein-protein interactions KW - costamere KW - focal adhesion KW - ponsin KW - cross-striated muscle cells Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-2576 ER - TY - THES A1 - Freiberg, Alexander T1 - Das "Leucine-Rich Repeat" im Invasionsprotein Internalin B : Stabilität und Faltung eines Solenoidproteins T1 - The leucine-rich repeat from internalin B : stability and folding of a solenoid protein N2 - Für das Verständnis der Strukturbildung bei Proteinen ist es wichtig, allgemein geltende Prinzipien der Stabilität und Faltung zu verstehen. Bisher wurde viel Arbeit in die Erörterung von Gesetzmäßigkeiten zu den Faltungseigenschaften von globulären Proteinen investiert. Die große Proteinklasse der solenoiden Proteine, zu denen z. B. Leucine-Rich Repeat- (LRR-) oder Ankyrin-Proteine gehören, wurde dahingegen noch wenig untersucht. Die Proteine dieser Klasse sind durch einen stapelförmigen Aufbau von sich wiederholenden typischen Sequenzeinheiten gekennzeichnet, was in der Ausbildung einer elongierten Tertiärstruktur resultiert. In der vorliegenden Arbeit sollte versucht werden, die Stabilität und Faltung eines LRR-Proteins mittels verschiedener biophysikalischer Methoden zu charakterisieren. Als Untersuchungsobjekt diente die für die Infektion ausreichende zentrale LRR-Domäne des Invasionsproteins Internalin B (InlB241) des Bakteriums Listeria monocytogenes. Des weiteren sollten die Integrität und die Stabilitäts- und Faltungseigenschaften der sogenannten Internalin-Domäne (InlB321) untersucht werden. Hierbei handelt es sich um die bei allen Mitgliedern der Internalinfamilie vorkommende Domäne, welche aus einer direkten Fusion des C-terminalen Endes der LRR-Domäne mit einer Immunglobulin (Ig)-ähnlichen Domäne besteht. Von beiden Konstrukten konnte eine vollständige thermodynamische Charakterisierung, mit Hilfe von chemisch- bzw. thermisch-induzierten Faltungs- und Entfaltungsübergängen durchgeführt werden. Sowohl InlB241 als auch InlB321 zeigen einen reversiblen und kooperativen Verlauf der chemisch-induzierten Gleichgewichtsübergänge, was die Anwendung eines Zweizustandsmodells zur Beschreibung der Daten erlaubte. Die zusätzliche Ig-ähnliche Domäne im InlB321 resultierte im Vergleich zum InlB241 in einer Erhöhung der freien Enthalpie der Entfaltung (8.8 kcal/mol im Vergleich zu 4.7 kcal/mol). Diese Stabilitätszunahme äußerte sich sowohl in einer Verschiebung des Übergangsmittelpunktes zu höheren Guanidiniumchlorid-Konzentrationen als auch in einer Erhöhung der Kooperativität des Gleichgewichtsübergangs (9.7 kcal/mol/M im Vergleich zu 7.1 kcal/mol/M). Diese Beobachtungen zeigen dass die einzelnen Sequenzeinheiten der LRR-Domäne nicht unabhängig voneinander falten und dass die Ig-ähnliche Domäne, obwohl sie nicht direkt mit dem Wirtszellrezeptor während der Invasion interagiert, eine kritische Rolle für die in vivo Stabilität des Internalin B spielt. Des weiteren spiegelt die Kooperativität des Übergangs die Integrität der Internalin-Domäne wieder und deutet darauf hin, dass bei beiden Proteinen keine Intermediate vorliegen. Kinetische Messungen über Tryptophanfluoreszenz und Fern-UV Circulardichroismus deuteten auf die Existenz eines relativ stabilen Intermediates auf dem Faltungsweg der LRR-Domäne hin. Faltungskinetiken aus einem in pH 2 denaturierten Zustand zeigten ein reversibles Verhalten und verliefen über ein Intermediat. Eine Erhöhung der Salzkonzentration des sauer-denaturierten Proteins führte zu einer Kompaktierung der entfalteten Struktur und resultierte im Übergang zu einem alternativ gefalteten Zustand. Bei der Internalin-Domäne deuteten kinetische Messungen des Fluoreszenz- und Fern-UV Circulardichroismus-Signals während der Entfaltung möglicherweise auf die Präsenz von zwei Prozessen hin. Der erste langsame Entfaltungsprozess kurz nach dem Übergangsmittelpunkt zeigte eine starke Abhängigkeit von der Temperatur, während der zweite schnellere Prozess der Entfaltung stärker von der Guanidiniumchlorid-Konzentration abhing. Renaturierungskinetiken zeigten das Auftreten von mindestens einem Faltungsintermediat. Kinetische Daten aus Doppelsprungexperimenten lieferten für die Erklärung der langsamen Faltungsphase zunächst keinen Hinweis auf dass Vorliegen einer Prolinisomerisierungsreaktion. Die vollständige Amplitude während der Renaturierung konnte nicht detektiert werden, weswegen von einer zweiten schnellen Phase im Submillisekundenbereich ausgegangen werden kann. Die Ergebnisse der Faltungskinetiken zeigen, dass die InlB-Konstrukte als Modelle für die Untersuchung der Faltung von Solenoidproteinen verwendet werden können. N2 -

To understand the processes of protein structure formation, it is necessary to investigate protein stability and protein folding kinetics. The focus of many folding studies has been directed at small, globular proteins. The larger class of solenoid proteins, including leucine-rich repeat (LRR) and ankyrin proteins, has not been extensively investigated. These proteins contain tandem repeat motifs, and their tertiary structure consists of a regular linear array of modules that stack to form non-globular elongated or supercoiled structures. In the present work, the folding and stability of the central LRR domain of the invasion protein internalin B (InlB241) from the bacterium Listeria monocytogenes was characterized using different biophysical techniques. In addition, the integrity, stability and folding behavior of the so-called internalin-domain (InlB321) was investigated. In this single domain, which is found in all members of the internalin-family, an immunoglobulin (Ig)-like domain is directly fused to the C-terminal end of the LRR domain.

A complete thermodynamic characterization of the stability of both constructs was performed, using chemical- and temperature-induced folding and unfolding transitions. The reversible and cooperative equilibrium transition of InlB241 and InlB321 allowed the use of a two-state model for the description of the data points. The additional Ig-like domain present in InlB321 resulted in an increase of the unfolding free energy (8.8 kcal/mol compared to 4.7 kcal/mol). This resulted both, from a shift of the transition midpoint to higher denaturant concentration, and from an increase in the m-value, the denaturant dependence of the unfolding free energy (9.7 kcal/mol/M compared to 7.1 kcal/mol/M). These observations suggest that the unravelling of the individual structural repeats in the LRR region is a cooperative process and that the tight fusion with the Ig-like domain leads to a dramatically increased stability in vivo without interfering with the functionality of the protein. In addition, the cooperativity of the equilibrium transition reflects the integrity of the internalin-domain, and suggests that both InlB fragments unfold without significantly populated equilibrium intermediates.

Kinetic measurements with tryptophan fluorescence and far-UV circular dichroism are indicative for the existence of a relative stable intermediate on the folding pathway of the LRR domain. Refolding kinetics from an acid-denatured state showed a reversible behavior and passes off an intermediate. An increase in the salt concentration of the acid-denatured protein results in a transition of the unfolded structure to a compact and alternatively folded state. Unfolding kinetics of the internalin-domain measured by fluorescence and far-UV circular dichroism are indicative for the possible presence of two processes. The first slow unfolding process after the transition midpoint showed a strong dependence on temperature, whereas the second and faster unfolding process showed a stronger dependence on the denaturant concentration. Renaturation kinetics indicated the existence of at least one folding intermediate. Preliminary double-mixing experiments revealed no evidence for a rate-limiting proline isomerization reaction. It was not possible to detect the complete amplitude of the renaturation reaction, suggesting existence of a second faster phase occuring in the submillisecond range.

The results on folding kinetics prove the InlB constructs to be suitable models for the investigation of solenoid protein folding by techniques of high structural resolution. KW - Proteinfaltung KW - thermodynamische Stabilität KW - Leucine-Rich Repeat KW - Internalin B KW - Zweizustandsmodell KW - leucine-rich repeat KW - internalin B KW - thermodynamic stability KW - protein folding KW - two-state model Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-2532 ER - TY - THES A1 - Pellengahr, Klaus T1 - Charakterisierung von ausgewählten Protein-Phosphatasen und MATE-Proteinen aus Arabidopsis thaliana T1 - Characterisation of Protein-Phosphatases and MATE-Proteins of Arabidopsis thaliana N2 - Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die Genexpression der Protein Phosphatase-gene TOPP1, TOPP2, TOPP5, STH1 und STH2 analysiert. Alle fünf ausgewählten Gene kodieren für PP des PP1/PP2A-Typs. Es wurde untersucht, ob homologen PP-Isoformen individuelle Expressionsmuster zugewiesen werden konnten. Besonderes Augenmerk richtete sich dabei auf die Expression von PP-Genen in den Schließzellen von A. thaliana. In mehreren Inhibitorstudien wurde beschrieben, dass PP1/PP2A-Proteine eine wichtige Rolle in der Signaltransduktion pflanzlicher Schließzellen spielen. Bisher konnte allerdings noch keine der entsprechenden katalytischen Untereinheiten auf molekularer Ebene identifiziert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zum ersten Mal nachgewiesen, dass mit TOPP1 ein Protein des PP1-Typs präferenziell in den Schließzellen von A. thaliana exprimiert wird. Ein Vergleich der Genexpression von TOPP1, TOPP2 und TOPP5 zeigte für die drei homologen Gene sehr Isoform-spezifische Expressionsmuster. Dies war ein deutlicher Hinweis, dass diese eng verwandten PP trotz großer Übereinstimmung auf Aminosäureebene vermutlich unterschiedliche Funktionen in planta haben. Die Untersuchung der Genexpression von STH1 und STH2 zeigte, dass die fast identischen Proteine zum Teil in unterschiedlichen Geweben vorkommen. Die Transkripte der beiden Gene, welche eine eigene Untergruppe von PP2A-verwandten Sequenzen bilden, konnten aus EF isoliert werden. Der in dieser Arbeit entwickelte Screeningansatz ermöglichte es, die sehr ähnlichen cDNA-Fragmente eindeutig voneinander zu unterscheiden. Die gefundenen Isoform-spezifischen Expressionsmuster waren ein deutlicher Hinweis auf unterschiedliche Funktionen in planta. Zur weiteren Untersuchung der PP-Funktionen in planta wurden Pflanzen mit veränderter Genaktivität von TOPP2 oder STH1 untersucht. In Pflanzen mit RNAi-vermittelter Reduktion des TOPP2-Transkriptgehalts ließ sich ein deutlich verändertes Blattwachstum beobachten. Die eingerollten oder asymmetrisch entwickelten Blätter waren vermutlich ein Hinweis, dass diese PP1-Isoform auch in A. thaliana eine Rolle bei der Zellteilung spielt. Für TOPP2-Expression in Hefen wurde diese Funktion schon nachgewiesen. Die Analyse von Insertions-mutanten mit T-DNA Insertionen in beiden STH1-Allelen waren neben den Expressions-studien ein weiterer Hinweis, dass sich STH1 nicht funktionell durch STH2 ersetzen lässt. Die Experimente in dieser Arbeit zeigten, dass das Fehlen der STH1-Genaktivität zu einem deutlichen Blattphänotyp mit gezahnten Blatträndern führte. Für STH2-Insertionsmutanten wurde dieses veränderte Wachstum nicht beschrieben. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde das Gen NIC1, welches für ein MATE-Membranprotein kodiert, identifiziert und charakterisiert. Die Sequenzierung des Genoms von A. thaliana hatte gezeigt, dass mindestens 56 MATE-Gene in dieser Pflanze vorhanden sind. Zum Zeitpunkt der Identifikation von NIC1 war keines dieser Gene charakterisiert. Außer für das MATE-Protein ERC1 aus S. cerevisiae gab es keine Studien zu eukaryotischen Mitgliedern dieser großen Familie von Membranproteinen. Anhand NIC1 wurden heterologe Expressionssysteme zur funktionellen Charakterisierung von MATE-Proteinen aus Pflanzen etabliert. Die cDNA von NIC1 wurde nach ihrer Klonierung in X. laevis Oozyten und S. cerevisiae exprimiert. In S. cerevisiae erhöhte die NIC1-Expression die Lithumtoleranz der Hefen und führte zu einer Verminderung der Natriumtoleranz. Parallele Versuche mit NIC2 und NIC4 (in den Diplomarbeiten von Blazej Dolniak und Mandy Kursawe) zeigten, dass auch diese beiden Proteine die Salztoleranz von S. cerevisiae beeinflussten. Während NIC2 die Lithium- und Natriumtoleranz erhöhte, führte NIC4-Expresion zu einer höheren Sensibilität gegenüber diesen beiden Kationen. Die unterschiedlichen Eigenschaften der drei homologen Proteine zeigten sich auch bei ihrer Expression in X. laevis Oozyten. NIC1 induzierte in den Oozyten auswärts gerichtete Chloridströme, die spannungsabhängig waren und durch mikromolare Konzentrationen der trivalenten Kationen Lanthan oder Gadolinium inhibiert werden konnten. NIC4 induzierte Barium-inhibierbare Kaliumströme, die spannungsunabhängig waren. Für NIC2 ließ sich in diesem Expressionssystem keine Aktivität detektieren. Zur Untersuchung der NIC1-Funktion in planta wurde die Genaktivität in transgenen Pflanzen lokalisiert und reduziert. Die NIC1-Genexpression war hauptsächlich in den vaskulären Geweben der Pflanze detektierbar und einer Verminderung des NIC1-Transkriptgehalts beeinflusste die Entwicklungsgeschwindigkeit der Pflanzen. Sie entwickelten sich deutlich langsamer als der parallel kultivierte Wildtyp. Der deutliche Phänotyp bei Veränderung der Genaktivität von nur einem der mindestens 56 vorhandenen MATE-Gene in A. thaliana zeigte, dass vermutlich keine weitere MATE-Isoform in der Lage ist, die Funktion von NIC1 zu übernehmen. N2 - Gene expression analysis of the protein phosphatase (PP) genes, TOPP1, TOPP2, TOPP5, STH1 and STH2, of Arabidopsis thaliana was investigated in the first part of this thesis. All five genes encode PP of subgroups PP1 or PP2A. It was determined that homologous isoforms show individual and differing expression patterns. The PP-expression in guard cells was analysed further, because previous inhibitor studies showed an important influence of PP1/PP2A on signal transduction processes in these specialised cells. The previous studies had not addressed molecular identification of the inhibited PP1-/PP2A-subunits. This work demonstrates for the first time a preferential expression of a PP1 isoform, TOPP1, in guard cells. Further analysis of TOPP1, TOPP2 and TOPP5 gene expression also revealed isoform-specific expression patterns, suggesting non-redundant functions in planta. Characterisation of the nearly identical PP2A-related genes, STH1 and STH2, also revealed individual expression patterns. An established screening approach (this work) for the identification of PP-genes from EF (epidermal fragments; a preparation enriched for guard cells) made it possible to distinguish the cDNAs of STH1 and STH2. The two genes form a subgroup of PP2A-related sequences. Differences in their expression patterns suggest that STH1 and STH2 have different functions in A. thaliana. The analysis of plants with altered gene expression of TOPP2 and STH1 gave further insights into the roles of individual PP isoforms. The RNAi-mediated reduction of TOPP2-expression led to changed morphology of leaves, which showed curling and asymmetric development. The reason for this phenotype is probably due to changes of the cell cycle in certain parts of the leaf. Previous studies have already shown that heterologously expressed TOPP2 complements yeast cell cycle mutants. The selection and characterisation of plants with insertions in both STH1-allels revealed the individual roles of STH1 and STH2 in planta. Although STH2 was not affected, plants developed an extreme phenotype with reduced growth and altered leave shape. Previous studies with STH2 loss-of-function mutants did not show this morphology. The second part of this thesis includes the identification and characterisation of a MATE (multidrug and toxic extrusion) membrane protein in plants. Described is NIC1, the first of at least 56 MATE proteins in A. thaliana. Indeed a study of the MATE protein, ERC1, of Saccharomyces cerevisiae was the only description of a eukaryotic member of this large family of membrane proteins. KW - Biologie KW - Molekularbiologie KW - molecular biology Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-2500 ER - TY - THES A1 - Schwonbeck, Susanne T1 - Analyse von Single Nucleotide Polymorphisms an Glas-Oberflächen N2 - Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung einer SNP-Genotypisierungsmethode mit auf Mikroarrays immobilisierten PCR-Produkten. Für die Analyse wurde ein faseroptischer Affinitätssensor bzw. ein Durchfluss-Biochip-Scanner mit integrierter Fluoreszenzdetektion verwendet. An den immobilisierten Analyten (PCR-Produkten) wurde eine Fluoreszenzoligonukleotidsonde hybridisiert und anschließend die Dissoziation der Sonde im Fluss verfolgt. Die Diskriminierung von Wildtyp- und Mutanten-DNA erfolgte durch die kinetische Auswertung der Dissoziationskurven sowie durch die Analyse der Fluoreszenzintensität. Die Versuche am faseroptischen Affinitätssensor zeigten, dass DNA-DNA-Hybride sowohl von Oligonukleotiden als auch von PCR-Produkten ein typisches Dissoziationsverhalten aufweisen, wobei fehlgepaarte Hybride eine signifikant schnellere Dissoziation zeigen als perfekt passende Hybride. Dieser Geschwindigkeitsunterschied lässt sich durch den Vergleich der jeweiligen kinetischen Geschwindigkeitskonstanten kD quantitativ erfassen. Da die Kopplung des Analyten an der Chipoberfläche sowie die Hybridisierungs- und Dissoziationsparameter essentiell für die Methodenentwicklung war, wurden die Parameter für ein optimales Spotting und die Immobilisierung von PCR-Produkten ermittelt. Getestet wurden die affine Kopplung von biotinylierten PCR-Produkten an Streptavidin-, Avidin- und NeutrAvidin-Oberflächen sowie die kovalente Bindung von phosphorylierten Amplifikaten mit der EDC/Methylimidazol-Methode. Die besten Ergebnisse sowohl in Spotform und -homogenität als auch im Signal/Rausch-Verhältnis wurden an NeutrAvidin-Oberflächen erreicht. Für die Etablierung der Mikroarray-Genotypisierungsmethode durch kinetische Analyse nach einem Hybridisierungsexperiment wurden Sondenlänge, Puffersystem, Spotting-Konzentration des Analyten sowie Temperatur optimiert. Das Analysensystem erlaubte es, PCR-Produkte mit einer Konzentration von 250 ng/µl in einem HEPES-EDTA-NaCl-Puffer auf mit NeutrAvidin beschichtete Glasträger zu spotten. In den anschließenden Hybridisierungs- und Dissoziationsexperimenten bei 30 °C konnte die Diskriminierung von homocygoter Wildtyp- und homocygoter Mutanten- sowie heterocygoter DNA am Beispiel von Oligonukleotid-Hybriden erreicht werden. In einer Gruppe von 24 homocygoten Patienten wurde ein Polymorphismus im SULT1A1-Gen analysiert. Sowohl durch kinetische Auswertung als auch mit der Analyse der Fluoreszenzintensität wurde der Genotyp der Proben identifiziert. Die Ergebnisse wurden mit dem Referenzverfahren, der Restriktionschnittstellenanalyse (PCR-RFLP) validiert. Lediglich ein Genotyp wurde falsch bestimmt, die Genauigkeit lag bei 96%. In einer Gruppe von 44 Patienten wurde der Genotyp eines SNP in der Adiponectin-Promotor-Region untersucht. Nach Vergleich der Analysenergebnisse mit denen eines Referenzverfahrens konnten lediglich 14 der untersuchten Genotypen bestätigt werden. Ursache für die unzureichende Genauigkeit der Methode war vor allem das schlechte Signal/Rausch-Verhältnis. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass das in dieser Arbeit entwickelte Analysesystem für die Genotypisierung von Einzelpunktmutationen geeignet ist, homocygote Patientenproben zuverlässig zu analysieren. Prinzipiell ist das auch bei heterocygoter DNA möglich. Da nach aktuellem Kenntnisstand eine SNP-Analysemethode an immobilisierten PCR-Produkten noch nicht veröffentlicht wurde, stellt das hier entwickelte Verfahren eine Alternative zu bisher bekannten Mikroarray-Verfahren dar. Als besonders vorteilhaft erweist sich der reverse Ansatz der Methode. Der hier vorgestellte Ansatz ist eine kostengünstigere und weniger hoch dimensionierte Lösung für Fragestellungen beispielsweise in der Ernährungswissenschaft, bei denen meist eine mittlere Anzahl Patienten auf nur einige wenige SNPs zu untersuchen ist. Wenn es gelingt, durch die Weiterentwicklung der Hardware bzw. weiterer Optimierung, eine Verbesserung des Signal/Rausch-Verhältnisses und damit die Diskriminierung von heterocygoter DNA zu erreichen, kann diese Methode zukünftig bei der Analyse von mittelgroßen Patientengruppen alternativ zu anderen Genotypisierungsmethoden verwendet werden. N2 - The aim of this thesis was the development of a SNP genotyping method involving PCR products immobilised on microarrays. For the analysis a fibre optic affinity biosensor and a flow-through biochip scanner were used. Fluorescent probes were hybridized with the immobilised PCR products. In order to start the dissociation process the surface was rinsed with buffer and the fluorescence intensity was measured. Two different cases were studied: First, the full-matched DNA hybrid (wildtyp single strand with complementary wildtype single strand), second the mis-matched hybrid (wildtype single strand and mutant single strand). After determinating the reaction rates (kD) as kinetic parameter the kD values of both cases were compared. The experiments showed a significant difference in the kD value of the full- and the mis-match hybrids. Therefore, mutant and wildtype DNA were discriminated by kinetic analysis of the dissociation process and analysis of the fluorescence intensity. To set up the complete analysis process the reaction parameters like coupling of the PCR products had to be optimised. Both affininty coupled (streptavidin, neutravidin, avidin - biotin) and covalent methods (EDC/methylimidazol) were carried out. Best results in spot homogeinity and spot appearance were obtained with coupling of biotinylated PCR products on neutravidin coated chip surfaces. Additionally, the length of the probe, the spotting concentration, the spotting buffer and the reaction temperature were optimised. In the optimised analysis PCR products (250 µg/µl) were spotted onto neutravidin coated surfaces. The hybridisation and dissociation processes were carried out at 30°C. A HEPES-EDTA-NaCl buffer was used for spotting, diluting of the fluorescent probe and rinsing the microarray surface. A fluorescent probe was used with 13 nucleotides in length. The mis- or full-matching base indicating the polymorphism was located in the center position of the probe. The analysis system was tested with the genomic DNA of a group of 24 homocygote individuals with a SNP in the SULT1A1 gene region. The hybridisation and dissociation processes were carried out and the reaction rates were determinated. Subsequently after the analysis in the flow-through biochip scanner the fluorescence intensity of the spots were measured. The results showed very good comparability with results of a PCR-RFLP analysis (one false genotype). Additionally, a group of 44 heterocygote DNA samples with one SNP in the adiponectin promotor region were also genotyped. Compared to a reference method only 14 genotypes were correctly determined. This was mostly due to a low signal-noise-ratio and needs to be further investigated. Besides the problem in analysing heterocygote DNA samples the developed analysis system is very useful for genotyping SNP in homocygote DNA samples. The successful analysis of heterocygote sample is principally possible and with further investigations/optimisation, a better analysis should be possible. The most important advantage of the developed method is the reverse approach of binding PCR products at the surface instead of oligonucleotides. This allows the parallel genotyping of several individuals. Other advantages include low costs and medium sized dimensions in terms of throughput. KW - Einzelbasenaustausch KW - SNP KW - Mikrochip KW - DNA-Chip KW - SULT1A1 KW - Adiponectin KW - kinetische Analyse KW - Dissoziation KW - Durchfluß-Biochip-Scanner KW - Fließsystem KW - single nucleotide polymorphisms KW - SNP KW - microarray KW - DNA KW - kinetic analysis KW - dissociation KW - SULT1A1 KW - flow-through biochip scanner Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0001853 ER - TY - THES A1 - Ringleb, Jennifer T1 - Identifikation antigener Determinanten des ZPB2 Proteins der Hauskatze und Charakterisierung ihrer kontrazeptiven und immunogenen Eigenschaften N2 - Die immunologische Kontrazeption mittels Zona pellucida (ZP) Proteinen gilt als vielversprechender Ansatz für die Reproduktionskontrolle verwilderter Haus- und Wildtierbestände. Da die Applikation von nativer ZP mit Nebenwirkungen verbunden ist, wird die Verwendung einzelner ZP Peptide als Bestandteil kontrazeptiver Vakzine als besonders aussichtsreich erachtet. Das Prinzip dieser nebenwirkungsfreien ZP Immunisierung ist die gezielte Trennung der Entzündungsreaktionen auslösenden T-Zell-Epitope der ZP von den kontrazeptiv wirkenden B-Zell-Epitopen. Niedermolekulare synthetische oder rekombinante Peptide allein sind gering immunogen und können somit keine ausreichende Immunantwort induzieren. Die Verwendung von Peptiden für die immunologische Kontrazeption erfordert daher ein „Vakzin-Design“, d. h. die gezielte Kombination der Peptide mit immunstimulierenden Substanzen (Liposomen, Carrierproteinen, Adjuvantien). Zielstellung der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung des Potentials synthetischer Peptide für die Immunokontrazeption von verwilderten Hauskatzen (Felis catus). Dazu wurden zunächst relevante B-Zell-Epitope des felinen Zona pellucida Proteins, ZPB2, identifiziert und synthetisiert. Zwei der synthetischen Peptide (P3, P6) wurden zur Herstellung von Antikörpern an BSA konjugiert und zusammen mit Freundschem Adjuvans in Ratten verimpft. Die kontrazeptive Relevanz beider Peptide sowie der Ratten Anti-Peptid Antiseren wurde im in vitro Befruchtungssystem der Hauskatze geprüft. Zur Untersuchung der Immunogenität der Peptide in der Zielspezies Hauskatze erfolgte die Entwicklung von Vakzin-Prototypen für die einmalige Applikation. Neben der Eruierung der Stärke und Dauer der Immunantwort wurde durch Verpaarung der Tiere auch das kontrazeptive Potential in vivo abgeschätzt. N2 - Immunological contraception based on zona pellucida (ZP) proteins is regarded as a promising approach for the control of reproduction in feral domestic and wild animals. Because application of native ZP caused adverse reactions, utilization of single ZP peptides as elements of contraceptive vaccines were considered to bear good prospects. The principle of this ZP immunization is based upon a systematic separation of inflammation triggering T-cell epitopes from the contraceptive B-cell epitopes. The present study evaluates the immunogenicity and contraceptive potential of synthetic feline ZPB2 peptides for immunocontraception in cats (Felis catus). First of all, relevant B-cell epitopes were identified and synthesized. In order to generate antipeptide antibodies two peptides (P3, P6) were chosen and coupled to BSA. Rats were immunized with the conjugation product combined with Freund′s complete adjuvant. The contraceptive efficacy of both peptides and of the anti-peptide antibodies generated were determined using in vitro fertilization of feline oocytes (IVF). To evaluate the peptides immunogenicity in the target species (cat), vaccine-prototypes were developed for a single application protocol. The strength and duration of the immune response was analyzed. Additionally, cats were mated to assess the contraceptive potential of the vaccines in vivo. T2 - Identifikation antigener Determinanten des ZPB2 Proteins der Hauskatze und Charakterisierung ihrer kontrazeptiven und immunogenen Eigenschaften KW - Zona pellucida KW - Peptid KW - Katze KW - Kontraception KW - zona pellucida KW - peptide KW - cat KW - contraception Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0001901 ER - TY - THES A1 - Walter, Monika T1 - Die parallele beta-Helix der Pektat-Lyase aus Bacillus subtilis : Stabilität, Faltungsmechanismus und Faltungsmutanten N2 - Die Pektat-Lyasen gehören zu einer Proteinfamilie, die meistens von pflanzenpathogenen Mikroorganismen sekretiert werden. Die Enzyme katalysieren den Abbau von Polygalakturonsäure, einem Hauptbestandteil in pflanzlichen Mittellamellen und Primärzellwänden. Der Abbau der alpha-1,4-verbrückten Galakturonsäurereste erfogt durch eine beta-Eliminierungsreaktion, dabei entsteht ein Produkt mit einer ungesättigten C4-C5 Bindung am nicht reduzierenden Ende, das durch spektroskopische Messungen beobachtet werden kann. Für die enzymatische Reaktion der Pektat-Lyasen ist Calcium nötig und das pH-Optimum der Reaktion liegt bei pH 8.5. Alle bis jetzt bekannten Strukturen der Pektat- und Pektin-Lyasen haben das gleiche Strukturmotiv - eine rechtsgängige parallele beta-Helix. Die Struktur der Pektat-Lyase aus Bacillus subtilis (BsPel) ist im Komplex mit Calcium gelöst worden. BsPel ist ein monomeres Protein mit einer ungefähren Molekularmasse von 43 kDa, das keine Disulfidbrücken enthält. Dies erlaubte sowohl eine effiziente rekombinante Expression des Wildtypproteins, als auch von destabilisierten Mutanten im Cytoplasma von E. coli. Parallele beta-Helices sind relativ große, jedoch verhältnismäßig einfach aufgebaute Proteine. Um detailliertere Informationen über die kritischen Schritte bei der in vitro-Faltung von parallelen beta-Helices zu erhalten, sollte in der vorliegenden Arbeit versucht werden, den Faltungsmechanismus dieses Proteins näher zu charakterisieren. Dabei sollte vor allem die Frage geklärt werden, welche Wechselwirkungen für die Stabilität dieses Proteins einerseits und für die Stabilität von essentiellen Faltungsintermediaten andererseits besonders wichtig sind.
Rückfaltung von BsPel, ausgehend vom guanidiniumchlorid-denaturierten Zustand, war bei kleinen Proteinkonzentrationen und niedrigen Temperaturen vollständig möglich. GdmCl-induzierte Faltungsübergänge waren aber nicht reversibel und zeigten eine apparente Hysterese. Kinetische Messungen des Fluoreszenz- und CD-Signals im fernen UV ergaben eine extreme Denaturierungsmittelabhängigkeit der Rückfaltungsrate im Bereich des Übergangmittelpunktes. Der extreme Abfall der Rückfaltungsraten mit steigender Denaturierungsmittelkonzentration kann als kooperative Entfaltung eines essentiellen Faltungsintermediats verstanden werden. Dieses Faltungsintermediat ist temperaturlabil und kann durch den Zusatz Glycerin im Renaturierungspuffer stabilisiert werden, wobei sich die Hysterese verringert, jedoch nicht vollständig aufgehoben wird. Durch reverse Doppelsprungexperimente konnten zwei transiente Faltungsintermediate nachgewiesen werden, die auf zwei parallelen Faltungswegen liegen und beide zum nativen Zustand weiterreagieren können. Fluoreszenzemissionsspektren der beiden Intermediate zeigten, daß beide schon nativähnliche Struktur aufweisen. Kinetische Daten von Prolin-Doppelsprungexperimenten zeigten, daß Prolinisomerisierung den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt in der Reaktivierung des denaturierten Enzyms darstellt. Desweiteren konnte durch Prolin-Doppelsprungexperimenten an Mutanten mit Substitutionen im Prolinrest 281 gezeigt werden, daß die langsame Renaturierung von BsPel nicht durch die Isomerisierung der einzigen cis-Peptidbindung an Prolin 281 verursacht wird, sondern durch die Isomerisierung mehrerer trans-Proline. Die beiden beobachteten transienten Faltungsintermediate sind somit wahrscheinlich zwei Populationen von Faltungsintermediaten mit nicht-nativen X-Pro-Peptidbindungen, wobei sich die Populationen durch mindestens eine nicht-native X-Pro-Peptidbindung unterscheiden.
Der Austausch des Prolinrestes 281 gegen verschiedene Aminosäuren (Ala, Ile, Leu, Phe, Gly) führte zu einer starken Destabilisierung des nativen Proteins und daneben auch zu einer Reduktion in der Aktivität, da die Mutationsstelle in der Nähe der putativen Substratbindetasche liegt. Die Rückfaltungskinetiken der Prolinmutanten war bei 10°C annähernd gleich zum Wildtyp und die geschwindigkeitsbestimmenden Schritte der Faltung waren durch die Mutation nicht verändert. Die durch die Mutation verursachte drastische Destabilisierung des nativen Zustands führte zu einem reversiblen Entfaltungsgleichgewicht bei pH 7 und 10°C. GdmCl-induzierte Faltungsübergänge der Mutante P281A zeigten bei Messungen der Tryptophanfluoreszenzemission und der Aktivität einen kooperativen Phasenübergang mit einem Übergangsmittelpunkt bei 1.1 M GdmCl. Durch die Übereinstimmung der Faltungsübergänge bei beiden Messparametern konnten die Faltungsübergänge nach dem Zwei-Zustandsmodell ausgewertet werden. Dabei wurde eine freie Sabilisierungsenthalpie der Faltung für die Mutante von - 64.2 ± 0.4 kJ/mol und eine Kooperativität des Übergangs von - 58.2 ± 0.3 kJ/(mol·M) bestimmt.
BsPel enthält, wie die meisten monomeren rechtsgängigen parallelen beta-Helix-Proteine, einen internen Stapel wasserstoffverbrückter Asparagin-Seitenketten. Die Mehrheit der erzeugten Mutanten mit Substitutionen im Zentrum der Asn-Leiter (N271X) waren als enzymatisch aktives Protein zugänglich. Die Auswirkung der Mutation auf die Stabilität und Rückfaltung wurde an den Proteinen BsPel-N271T und BsPel-N271A näher analysiert. Dabei führte die Unterbrechung des Asparaginstapels im Inneren der beta-Helix zu keiner drastischen Destabilisierung des nativen Proteins. Allerdings führten diese Mutationen zu einem temperatur-sensitiven Faltungsphänotyp und die Hysterese im Denaturierungsübergang wurde verstärkt. Offenbar wird durch die Unterbrechung des Asparaginstapel ein essentielles, thermolabiles Faltungsintermediat destabilisiert. Der Asparaginstapel wird somit bei der Faltung sehr früh ausgebildet und ist wahrscheinlich schon im Übergangszustand vorhanden. N2 - Pectate lyases belong to a family of proteins secreted by plant pathogenic microbes. The enzymes cleave alpha-1,4 linked galacturonic acid by a beta-elimination that results in an unsaturated product, which can be quantified spectrophotometrically. Calcium is essential for the activity and the pH-optimum is near 8.5. All known structures of pectate and pectin lyases have the same structural motif - a right handed parallel beta-helix. The structure of pectate lyase from Bacillus subtilis (BsPel) has been solved in complex with calcium. It is a monomeric protein, with a molecular mass of about 43 kDa and without disulfide bonds. This allows its high-yield recombinant expression in the cytoplasm of Escherichia coli. Parallel beta-helices are relative large proteins, however with a simple folding topology. The objective of this work was to characterize the folding mechanism of BsPel. In particular we investigated the role of the interactions of certain residues in the parallel beta-helix for the stability of the native protein and the stability of essential folding intermediates. Refolding of BsPel was possible at low protein concentrations and low temperature. However, denaturation of BsPel was not freely reversible. De- and renaturation curves showed a large apparent hysteresis. Furthermore, the folding rate constant deduced from fluorescence and circulardichroism measurements showed a very strong dependence on denaturant concentrations near the midpoint of the renaturation transition. This can be explained with a cooperative unfolding of an essential folding intermediate. Upon stabilisation of the temperature-sensitive intermediate by addition of glycerol in the renaturation buffer, the hysteresis is reduced, but does not disappear. Reverse double mixing kinetic experiments have shown that two transient folding intermediates are on the folding pathway. These intermediates are on parallel pathways and both can fold to the native state. Fluorescence emission spectra have shown the native-like structure of both intermediates. Furthermore, data from proline double mixing kinetic experiments revealed that isomerization of peptidyl-prolyl bonds was responsible for the slow kinetics in the reactivation of the enzyme. However, the isomerization of the single cis-peptidyl-prolyl bond at Pro281 was not responsible for the slowest folding phase observed, but rather the isomerization of other trans-peptidyl-prolyl bonds. Thus, both transient folding intermediates observed probably represent two populations of folding intermediates with non-native X-Pro-peptide bonds. The difference of the two populations is at least one non-native X-Pro-peptide bond. Mutations of the proline 281 against various residues (Ala, Ile, Leu, Phe, Gly) resulted in a strong destabilization of the native protein. Also, the activity of the mutant proteins was strong reduced due to the position of the mutation site near the putative active center of the protein. At 10°C the kinetic folding behavior of the proline mutants was not significant changed. However, the strong destabilization of the native state in the proline mutants resulted in a reversible folding equilibrium at pH 7 and 10°C. The unfolding of the P281A mutant was reversible as determined by fluorescence emission and enzyme activity measurements. The coincidence of these detected transitions is consistent with a two-state equilibrium transition. At pH 7 and 10°C the delta G°(H2O) for folding of P281A was - 64.2 ± 0.4 kJ/mol, with a midpoint of the transition at 1.1 M GdmCl and a cooperativity of - 58.2 ± 0.3 kJ/(mol·M). BsPel has an asparagine ladder in turn 2 of the parallel beta-helix with extensive network of side-chain hydrogen bonds between the Asn residues. Such an Asn-ladder is a conserved feature of many monomeric beta-helices crystallized so far. The middle Asn residue (271) was selected and exchanged for various residues. Most of the mutants were expressed at 25°C as soluble and active proteins but with a significant reduction in yield. Mutants N271T and N271A were selected to study the stability and refolding of these proteins in comparison with the wild-type protein. The substitution in the Asn-ladder did not drastically destabilize the native protein, but caused a temperature-sensitive-folding (tsf) phenotype with an increased hysteresis in the de- and renaturation transition curves. In addition, the disruption of the Asn-ladder resulted in destabilization of an essential, thermosensitive folding intermediate. Thus, the Asn-ladder is formed very early during the folding, probably well before the transition state of folding. KW - Heubacillus ; Pectat-Lyase ; Helix KW - apparente Hysterese KW - parallele rechtsgängige beta-Helix KW - Pektat-Lyase KW - Peptidyl-Prolyl-cis-trans Isomerisierung KW - Proteinfaltung KW - temperatur-sensitive KW - apparent hysteresis KW - cis-trans isomerisation of prolyl-peptide bonds KW - parallel beta-helix KW - pectate lyase KW - protein folding KW - temperature sensitive foldi Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0000588 ER - TY - THES A1 - Trippo, Ulrike T1 - Körperbau, Körperzusammensetzung und Ernährungsgewohnheiten bei Erwachsenen in Abhängigkeit von Alter und Geschlecht N2 - Die vorliegende Arbeit ist eine aktuelle Dokumentation von Körperbau, Körperzusammensetzung und Ernährungsgewohnheiten an 708 jüngeren und älteren Männern und Frauen aus dem Bundesland Brandenburg. Der Körperbau wurde über ein 42 Längen-, Breiten-, Tiefen- und Umfangsmaße umfassendes anthropometrisches Untersuchungsprogramm bestimmt. Die Einschätzung von Gesamtkörperfettanteil und Magermasse erfolgte mit zwei Feldmethoden, der Hautfaltendickenmessung und der bioelektrischen Impedanzanalyse. Mit Hilfe eines semiquantitativen Fragebogens zu den Ernährungsgewohnheiten wurde der Lebensmittelverzehr erfasst und daraus die Energie- und Nährstoffaufnahme berechnet. Die Ergebnisse zum Körperbau zeigen im Mittel eine Abnahme der Längenmaße, jedoch eine Zunahme der Breiten-, Tiefen- und Umfangsmaße mit steigendem Erwachsenenalter. Einfache Parameter zur Beurteilung des Ernährungszustandes, wie Körpermasse und Body-Mass-Index (BMI) nehmen im Alter geschlechtsspezifisch zu. Nach den Richtlinien der WHO für den BMI gelten 55,3% der untersuchten Männern als übergewichtig, davon 10% als adipös. Von allen untersuchten Frauen sind 41,6% übergewichtig, davon sind 14,3% adipös. Der Anteil der Übergewichtigen ist zwar beim weiblichen Geschlecht geringer, aber dafür haben mehr Frauen die Grenze zur Adipositas überschritten. Für eine wissenschaftlich exakte Beurteilung des Ernährungszustandes reichen Körpermasse und BMI nicht aus, da sie die Körperzusammensetzung nicht bzw. nicht genügend berücksichtigen. Die subkutane Fettschichtdicke nimmt insbesondere am Rumpf zu, was als zusätzliches Gesundheitsrisiko gilt. Der Gesamtkörperfettanteil steigt im Erwachsenenalter abhängig von der Berechnungsmethode an. Die untersuchten Frauen sind gegenüber den Männern in allen Altersgruppen durch einen etwa ein Drittel höheren Körperfettanteil gekennzeichnet. Die tägliche Nahrungsenergieaufnahme der untersuchten Personen lässt eine abnehmende Tendenz bis zum 65. Lebensjahr erkennen. Trotz einer sinkenden Nahrungsenergieaufnahme im Alter, nimmt der BMI zu. Mögliche Ursachen hierfür werden in der Arbeit diskutiert. Der Anteil der Grundnährstoffe an der Energiebereitstellung entspricht in keiner der untersuchten Gruppen den Empfehlungen der Deutschen Gesellschaft für Ernährung. Allgemein ist der Fettkonsum zu hoch und der Kohlenhydratanteil zu gering. Das zeigt sich besonders in den beiden mittleren untersuchten Altersgruppen und bei den Männern stärker als bei den Frauen. N2 - The objective of the present study was an analysis of body build, body composition and nutritional habits. 708 young and elderly men and women of Germany (Brandenburg) have been examined. The test persons underwent a detailed anthropometric examination encompassing 42 length, breadth, depth and circumference measurements. The total body fat and lean body mass were determined by means of two field methods - skinfold thickness measurements and bioelectrical impedance analysis. Dietary intake was assessed by a semiquantitative food frequency questionnaire. The results concerning body build show on average a decrease of length measurements, however, an increase of breadths, depths and circumferences during adult age. Simple parameters for estimation of nutritional status like Body mass and Body-Mass-Index (BMI) rise during adulthood clearly depending on sex. Following the BMI-recommendations of the WHO 55.3% of men investigated are overweight out of this 10% are adipose. From all women investigated 41.6% are overweight out of this 14.6% are obese or adipose. The portion of overweight persons is certainly lower in women but on the other hand women exceed more often the limit of adiposity. For a scientifically correct assessment of the nutritional status body mass and BMI are not sufficient because body composition is not included. Subcutaneous fat layer increases in particular at the trunk. This abdominal fat distribution is an additional health risk. Total body fat increases during adult age depending on the method used. Women show in all investigated age groups a significantly higher total body fat content compared with men (about one third more). During adulthood the energy intake in men and women tends to decrease more and more. Energy intake and BMI show an inverse trend: While energy intake decreases by age, the BMI rises. Possible reasons for that were discussed. Intake of basic nutrients does not meet the recommendations of the German Association of Nutrition. In general the intake of fat is too high and the intake of carbohydrates is too low. This can be especially seen in the two middle-aged groups investigated. In men this unhealthy trend is higher than in women. KW - Körperzusammensetzung KW - BMI KW - BIA KW - Anthropometrie KW - Ernährungsgewohnheiten KW - Ernährungszustand Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0000306 ER - TY - THES A1 - Lehmann, Cathleen T1 - Untersuchungen zum Aufnahmemechanismus und intrazellulärem Transport von fusogenen und kationischen Liposomen-DNA-Komplexen für den Gentransfer N2 - Mit der vorliegenden Arbeit sollten mit Hilfe elektronenmikroskopischer Methoden verschiedene Liposomen-DNA-Komplexe zum Gentransfer charakterisiert sowie die Aufnahme und Verteilung in der Zellkultur untersucht werden. Dabei waren vor allem solche Präparationen von besonderem Interesse, die in unserer Arbeitsgruppe 'Drug Targeting' getestet oder entwickelt und verwendet wurden, wie Sendai-Virus Liposomen (HVJ-Liposomen), Virosomen sowie DAC-Chol und DOCSPER-Liposomen als Vertreter der kationischen Lipide. Im ersten Teil der Arbeit wurden fusogene Liposomen und Virosomen charakterisiert. Bei diesen Untersuchungen wurden folgende Ergebnisse erzielt: ·Sendai-Viren fusionieren mit Liposomen unterschiedlicher Lipidzusammensetzung. ·Die daraus resultierenden HVJ-Liposomen sind mit elektronenmikroskopischen Methoden identifizierbar. ·Die Spikes auf den HVJ-Liposomen besitzen fusogene Eigenschaften. ·HVJ-Liposomen eignen sich auf Grund der geringen Ausbeute sowie der geringen Transfektionseffizienz nicht zum in vitro Gentransfer. ·Virosomen stellen einen weiteren Typ fusogener Gentransfervesikel dar. ·Ihre Größe und fusogenen Eigenschaften sind abhängig von der externen Zugabe einer optimierten Lipidmischung. ·Im Innenraum der Virosomen kann mit Poly-L-Lysin vorkomplexierte DNA verkapselt werden. ·Die fusogenen Eigenschaften der Virosomen wurden mit Hilfe immunelektronenmikroskopischer Techniken und monoklonaler Antikörper gegen Hämagglutinin/Neuraminidase und das Fusionsprotein sowie mit polyklonalen Antiseren gezeigt. ·An Hand goldmarkierter DNA sind Virosomen nach der Transfektion in der Zelle nachweisbar. Da in unserer Arbeitsgruppe bevorzugt kationische Liposomen zum Gentransfer verwendet werden, wurde auch die Struktur der Liposomen untersucht und folgende Ergebnisse dokumentiert: ·Die Struktur und die Größe kationischer Liposomen werden hauptsächlich durch die Lipidzusammensetzung bestimmt. ·Die Bildung von Liposomen-DNA-Komplexen ist mit einer Größenzunahme der Komplexe gekoppelt. ·Die Anzahl gebundener Plasmide steigt mit der Größe der Lipoplexe. ·Gentransferaktive Lipopolyplexe (mit Protaminsulfat komplexierte DNA und DAC-Chol- Liposomen) sind kleiner als Lipoplexe. Ihre Struktur wird von der Zusammensetzung bestimmt. Eine weitere wichtige Frage betrifft den Weg der Gencarrier in der Zelle. Kenntnisse über diese Vorgänge sind vorteilhaft, um die einzelnen Schritte zu verstehen und möglichst gezielt zu verbessern. Bei der Untersuchung der Partikel im Hinblick auf zelluläre Barrieren beim Gentransfer konnten folgende Ergebnisse erzielt werden: ·Die Bindung der Partikel an die Zellmembran und Aufnahme sind abhängig von den eingesetzten Zellen und Komplexen sowie derInkubationszeit. ·Die Aufnahme erfolgt über endozytotische Mechanismen, wobei Lipopolyplexe schneller als Lipoplexe in die Zellen gelangen. Nicht alle gebundenen Komplexe werden aufgenommen. ·Die aufgenommenen Partikel befinden sich in Endosomen und werden ins Innere der Zelle transportiert. ·Freisetzung der DNA und Eintritt in den Zellkern über Kernporen konnte nicht beobachtet werden. ·DNA-haltige Vesikel in Kernnähe deuten auf einen weiteren Mechanismus hin (Vesikeltransfer zum Zellkern). N2 - The aim of this work is the characterisation of several liposome DNA complexes for in vitro gene transfer and uptake as well as their distribution in cultured cell lines using electron microscopy. The particles used were fusogenic liposomes made from Sendai virus, virosomes and cationic liposomes. At first fusogenic liposomes and virosomes were characterised. The results obtained are summarised below: ·Sendai virus can fuse with liposomes made from different lipid composition. ·HVJ-liposomes are detectable using electron microscopy techniques. ·The spikes from HVJ-liposomes have fusogenic properties. ·HVJ-liposomes are not suitable for in vitro gene transfer due to the low amount of fusogenic liposomes leading to low transfection efficiency. ·Virosomes, reconstituted virus envelopes, are another type of fusogenic vesicles. ·Size and morphology of virosomes depends on the addition of an optimised lipid mixture. ·PLL treated DNA is entrapped into virosomes. ·Monoclonal and polyclonal antibodies and protein A gold technique can be used for the detection of viral glycoproteins on virosomes. ·Gold labelled DNA was used to show the distribution in cultured cells. In order to characterise the structure of cationic liposomes following results were obtained: ·Size and structure depends on the lipid composition. ·The formation of liposomes leads to an increase of the size. ·Larger lipoplexes contain more DNA. ·Lipopolyplexes composed of DNA complexed with protamine sulphate and DAC- Chol liposomes are smaller than lipoplexes. Their structure depends on the composition. To improve transfection ability examination of the cellular barriers is useful. With regard to the fate of lipoplexes following results were obtained. ·Binding depends on the cell line, kind of particles and incubation time. ·Uptake occurs through endocytosis. Lipopolyplexes enter the cells faster than larger lipoplexes. ·Lipoplexes are enclosed in endosomes and were carried into the centre of the cell. ·Escape of DNA from endosomes and entry into nucleus were not visible. ·Vesicles with DNA were observed near the nucleus. There is an opportunity for another pathway to the nucleus. KW - Gentherapie KW - kationische Liposomen KW - Virosomen KW - Elektronenmikroskopie KW - gene therapy KW - cationic liposome KW - virosome KW - electron microscopy Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0001196 ER - TY - THES A1 - Pacholsky, Dirk T1 - Zell-Zell- und Zell-Matrix-Kontakte während der Muskelentwicklung N2 - Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei humane Varianten des von Wang et al., 1999, erstmals beschriebenen muskelspezifischen Proteins Xin (Huhn und Maus) über Sequenzanalyse, Immunofluoreszenzmikroskopie, Transfektionsstudien und biochemischer Analyse näher charakterisiert. Die Proteine wurden mit human Xin related proteins 1 und 2 – hXirp1 und 2 –bezeichnet. Die Xin-Proteine enthielten bisher unbekannte, sowie spezifische, repetitive Motive, die aus jeweils mindestens 16 Aminosäuren bestanden. Ihre Aminosäuresequenz, mit einer Vielzahl weiterer putativer Motivsequenzen, verwies auf eine potentielle Funktion von hXirp als Adapterprotein in Muskelzellen. Das hier näher untersuchte hXirp1 lokalisierte an den Zell-Matrix-Verbindungen der Muskel-Sehnen-Übergangszone im Skelettmuskel, sowie an den Zell-Zell-Verbindungen der Glanzstreifen im Herzmuskel. Während der Muskelentwicklung zeigte hXirp1 eine sehr frühe Expression, zusammen mit einer prägnanten Lokalisation an den Prämyofibrillen und deren Verankerungsstrukturen, die auf eine Funktion des Proteins in der Myofibrillogenese deuten. Ektopische Expressionen von hXirp1 in einer Vielzahl von Nichtmuskel-Kulturzellen zeigten wiederum eine Lokalisation des Proteins an den Zell-Matrix-Kontakten dieser Zellen. Am Beispiel von hXirp1 und 2 wurde stellvertretend für die Familie der Xin-Proteine gezeigt, daß es sich bei den repetitiven Motiven um neuartige, F-Aktin bindende Sequenzmotive handelte. Die Xin-Proteine können somit als muskelspezifische, aktinbindende, potentielle Adapterproteine bezeichnet werden, denen eine strukturelle und funktionelle Beteiligung an der Verankerung der Myofibrillen im adulten Muskel, wie auch während der Myofibrillogenese zukommt. N2 - The scope of this work was a further characterization of two human variants of the protein Xin which was reported for chicken and mouse in 1999 by Wang et al. Therefor sequence analysis, immunofluorescence microscopy, transfection studies and biochemical approaches were utilized. The proteins were named human Xin related proteins 1 und 2 – hXirp1 und 2. Xin-proteins possess specific repetitive motives consisting of a minimum of 16 amino acids each. Concerning further putative motive sequences hXirp is a potential adapter protein in the muscle cell. hXirp1 localized within the cell-matrix-contacts of the myotendinous junction in skeletal muscle as well as within the cell-cell-contacts of the intercalated disc in the cardiac muscle. During the development of muscle cells hXirp1 showed early expression as well as concise localization to premyofibrils and their anchorage structures indicating a potential role for this protein in myofibrillogenesis. Ectopic expression of hXirp1 in several non-muscle cells again revealed localization of this protein to cell-matrix contacts. Considering hXirp1 and 2 as an example for all Xin-proteins it was shown that the repetitive motives are new actin binding motives. The data indicated the Xin-proteins as muscle specific, actin binding and potential adapter proteins with implications in structure and function of anchorage of myofibrils in adult muscle and myofibrillogenesis. KW - Muskel KW - Muskel-Sehnen-Verbindung KW - Glanzstreifen KW - Xin KW - muscle KW - myotendinous junction KW - intercalated disc KW - Xin Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0001161 ER - TY - THES A1 - Neichel, Dajana T1 - Charakterisierung und in vitro - Wirkung agonistischer AT1-Rezeptor Autoantikörper bei Präeklampsie-Patienten N2 - Die Präeklampsie ist eine schwangerschaftsspezifische Bluthochdruck-Erkrankung, die im Allgemeinen nach der 20. Schwangerschaftswoche auftritt. Neben der Hypertonie sind die Proteinurie und die Ödembildung charakteristische Symptome der Präeklampsie. Obwohl heute die Pathophysiologie der Präeklampsie zum großen Teil verstanden ist, ist die Ätiologie dieser Erkrankung noch unklar. 1999 konnten wir in den Seren von Präeklampsie-Patientinnen agonistische Autoantikörper, die gegen den Angiotensin II AT1-Rezeptor gerichtet sind (AT1-AAK), nachweisen. Diese AT1-AAK gehören zur Antikörpersubklasse IgG3. Die AT1-AAK führen in Kulturen neonataler Rattenkardiomyozyten AT1-Rezeptor spezifisch zu einem positiv chronotropen Effekt. Mittels Immunpräzipitation wurde gezeigt, dass AT1-AAK spezifisch den AT1-Rezeptor präzipitieren. Kontrollproben, aus denen die AT1-AAK entfernt wurden, führen zu keiner Präzipitation des AT1-Rezeptors. Die Präzipitation des AT1-Rezeptors bleibt ebenfalls aus, wenn die AT1-AAK mit einem Peptid, welches der Aminosäuresequenz des zweiten extrazellulären Loops des humanen AT1-Rezeptors entspricht, behandelt wurden. Eine Langzeitbehandlung der Kulturen neonataler Rattenherzzellen mit AT1-AAK vermindert die funktionelle Ansprechbarkeit der Zellen auf einen erneuten AT1-Rezeptor-Stimulus. Eine veränderte AT1-Rezeptorexpression wurde nicht nachgewiesen. In guter Übereinstimmung mit den in vitro-Expressionsdaten wurde gezeigt, dass die plazentare AT1-Rezeptorexpression bei Präeklampsie-Patientinnen nicht verschieden von der plazentaren AT1-Rezeptorexpression gesunder Schwangerer mit nicht pathogen verändertem Blutdruck ist. Im Zellsystem der neonatalen Rattenherzzellen führen die AT1-AAK zur Aktivierung von Gi-Proteinen und zu verringerten intrazellulären cAMP-Spiegeln. Des Weiteren wurde gezeigt, dass die AT1-AAK in Kulturen neonataler Rattenherzzellen die Transkriptionsfaktoren AP-1 und NFkB aktivieren. Die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFkB wurde vornehmlich in den Nicht-Myozyten der Rattenherzzellkultur nachgewiesen. Generell wurde festgestellt, dass sich die AT1-AAK pharmakologisch wie der natürliche Agonist des AT1-Rezeptors, Angiotensin II, verhalten. Erste Daten dieser Arbeit deuten auf einen eventuellen Einfluss der AT1-AAK auf die Expression von Komponenten der extrazellulären Matrix bzw. assoziierter Faktoren (Kollagen III, MMP-2, TIMP-2, Colligin) hin. In allen in dieser Arbeit untersuchten Seren von klinisch diagnostizierten Präeklampsie-Patientinnen wurden agonistische AT1-AAK nachgewiesen. Wir vermuten daher, dass die AT1-AAK möglicherweise bedeutend in der Pathogenese der Präeklampsie sind. N2 - Preeclampsia is a serious, pregnancy-specific disorder that usually occurs after week 20 of gestation and is characterized by hypertension, proteinuria, and oedema. While the pathophysiology is clear, little is known about etiology of preeclampsia. In 1999, we showed that sera from preeclamptic patients contain autoantibodies directed against angiotensin II AT1 receptor (AT1-AAB). These autoantibodies are immunoglobuliens of the IgG3 subclass. AT1-AAB accelerate the beating rate of neonatal rat cardiomyocytes. The agonistic effect can be blocked with the AT1 receptor blocker losartan. Co-immunoprecipitation studies have shown that AT1-AAB specifically precipitate the AT1 receptor while control samples lacking AT1-AAB do not. The AT1 receptor could not be precipitated following neutralization of the AT1-AAB by a peptide corresponding to the AT1 receptors second extracellular loop. In further studies on neonatal rat heart cells, we showed long-term stimulation of the AT1 receptor whereby AT1-AAB down-regulated the AT1 receptor-mediated response to a second agonistic receptor-stimulation. After long-term stimulation of neonatal rat heart cells, no changes in AT1 receptor expression could be identified. Corresponding to these in vitro-expression data, no difference was seen in placental AT1 receptor expression between patients with preeclampsia and healthy pregnant women. Next, we tested if the AT1-AAB lead to activation of AT1 receptor signaling in angiotensin II fashion. In neonatal rat heart cell cultures, AT1-AAB lead to activation of Gi-protein with reduced cAMP levels. AT1-AAB are able to activate the transcription factors AP-1 and NFkB in this cell system. In all observations, the agonistic AT1-AAB behave pharmacologically in a similar fashion to angiotensin II. Initial data suggest that AT1-AAB may have an effect on extracellular matrix components (ECM). We have found AT1-AAB in all women meeting the clinical criteria of preeclampsia and, therefore, suggest that AT1-AAB may be important to the pathogenesis of the disease. KW - AT1-Rezeptor / Präeklampsie / AT1-AAK / neonatale Rattenkardiomyozyten / Autoantikörper / Angiotensin II KW - AT1 receptor / preeclampsia / AT1-AAB / neonatal rat cardiomyocytes / autoantibody / angiotensin II Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0001126 ER - TY - THES A1 - Wende, Hagen T1 - Genetische Charakterisierung des "Leukocyte Receptor Complex" und Entwicklung einer Methode zum Nachweis seiner Produkte im Einzelzellmaßstab N2 - Der "Leukocyte Receptor Complex" (LRC) ist ein DNA-Sequenzabschnitt auf dem Chromosom 19 des Menschen, der eine Länge von über 900.000 Basenpaaren umfaßt. In diesem Chromosomenabschnitt ist eine Vielzahl von Genen lokalisiert, die für die Funktion verschiedener weißer Blutzellen (Leukozyten) von entscheidender Bedeutung sind. Bei den aus diesen Genen synthetisierten Proteinen (Eiweißen) handelt es sich um Strukturen, die auf der Oberfläche dieser Zellen lokalisiert sind und zur Interaktion der Leukozyten mit ihrer Umgebung dienen. Diese auch als Rezeptoren bezeichneten Proteine können mit Oberflächenproteinen auf anderen Körperzellen wechselwirken und daraus resultierende Signale in das Innere der Blutzelle weiterleiten. In der vorliegenden Doktorarbeit wurde der LRC im Detail untersucht. Hierzu wurde zunächst der gesamte Chromosomenabschnitt aus kleineren, einander überlappenden DNA-Fragmenten rekonstruiert. Aufgrund der in diesen DNA-Fragmenten enthaltenen DNA-Sequenzen war es möglich, den gesamten Chromosomenabschnitt ähnlich einem Puzzle zusammenzusetzen. Die anschließende Analyse des LRC zeigte, daß sich dieser in drei Bereiche, sogenannte Cluster, unterteilen läßt. Diese Cluster sind dadurch gekennzeichnet, daß in ihnen jeweils nur Gene eines Rezeptortyps vorkommen. Hierbei handelt es sich um ‚immunoglobulin-like transcript′ -Gene (ILT) und ‚killer cell Ig-like receptor′-Gene (KIR). Die KIR- und ILT-Cluster werden von weiteren stammesgeschichtlich verwandten Genen unterbrochen und flankiert. Je nach Individuum können im LRC bis zu 31 solcher verwandten Rezeptorgene lokalisiert sein. Auf der Grundlage der Kartierungsdaten und von Daten des humanen Genomprojekts war es zudem möglich, evolutionäre Untersuchungen zur Entwicklung des LRC durchzuführen. Dabei wurde eine Hypothese zur Entstehung des LRC entworfen und zu anderen Spezies in Beziehung gesetzt. Im zweiten Teil der Arbeit habe ich aufbauend auf der sogenannten HRCA-Methode eine Technik entwickelt, die es erlaubt kleinste Unterschiede zwischen DNA-Sequenzen, sogenannte Einzelbasenpaaraustausche, nachzuweisen. Die entwickelte Methode kann verwendet werden, um sehr ähnliche DNA-Sequenzen, wie z.B. verschiedene KIR-Sequenzen, zu unterscheiden und ihre Menge zu bestimmen. Sie ist außerdem geeignet Mutationen, die mit bestimmten Krankheiten assoziiert sind, nachzuweisen und könnte somit in der Diagnostik Anwendung finden. N2 - The Leukocyte Receptor Complex (LRC) is a DNA region on human chromosome 19 with a length of approximately 900.000 base pairs. A number of genes, which are located in this chromosomal region, are known to be important for the function of some types of white blood cells (leukocytes). The products of theses genes are proteins, which are located on the surface of these cells and enable them to interact with their environment. These proteins are also called receptors. They can bind to cell surface proteins on other cells and transmit resulting signals into the leukocyte. During my work I analyzed the chromosomal organization of the LRC in detail. To do so, I reconstructed the whole chromosomal region from smaller overlapping DNA fragments. Due to the DNA sequences contained within these fragments it was possible to put the whole chromosomal region together like a puzzle. The following analyses of the LRC showed that it is mainly composed of three regions, so called clusters. These clusters are characterised by the presence of only one receptor family. These are the immunoglobulin-like transcripts (ILTs) and the killer cell Ig-like receptors (KIR) respectively. In the LRC the KIR- and ILT-Clusters are flanked by additional receptor genes, which are evolutionary related to KIRs and ILTs. The number of receptor genes in the LRC varies between individuals, their can be up to 31 genes on each chromosome. On the basis of the data obtained in this work as well as data from the human genome project it was also possible to draw conclusions concerning the evolutionary development of the LRC. I developed a hypothesis of the origin of the LRC and discussed this in comparison to other species. In the second part of my thesis I developed a new technique based on the so-called ’hyper-branched rolling circle amplification′ (HRCA). This technique allows the detection of small differences between two or more DNA molecules, so called ’single nucleotide polymorphisms′ (SNPs). With this newly developed method it is possible to distinguish very similar variants of a gene, e.g. two KIR sequences, and to determine their relative concentration. The method can also be used to detect mutations, which are associated with certain diseases and could therefore be used for diagnostic purposes. KW - Leukocyte Receptor Complex LRC KIR ILT FCAR Immunglobulin Evolution Immunsystem SNP HRCA KW - Leukocyte Receptor Complex LRC KIR ILT FCAR immunoglobulin evolution SNP HRCA Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0001298 ER - TY - THES A1 - Nolte, Björn T1 - Variabilität des Reviergesangs des Buchfinken (Fringilla coelebs) zur Raum-Zeit-Beschreibung von Metapopulationen N2 - Der Buchfinkengesang wurde in Potsdam in zwei Hauptpopulationen über drei Jahre aufgenommen. Jedes Individuum wurde eindeutig am individuellen Strophentypenrepertoire identifiziert. Ein weiterer Punkt der die individuelle Wiedererkennung bestätigt ist die hohe Standorttreue der adulten Männchen. Die beschriebene Methode eignet sich für die Untersuchung von gesamten Populationen, um den Wandel des Gesangs von Populationen in Raum und Zeit zu beschreiben. Die Haupterkenntnisse der Arbeit sind: - Die Gesamtanzahl der Grundstrophentypen innerhalb einer Population bleibt über Jahre konstant. - Die relative Häufigkeit jedes einzelnen Strophentyps variiert von Jahr zu Jahr und von Population zu Population. - Gesangslernen erfolgt exakt mit einem Korrektheitsgrad von mindestens 96%. - Das Song-Sharing ist innerhalb der Population hoch. Die diskutierten Mechanismen für das Song-Sharing sind: Die Lebenserwartung, das Zugverhalten, das Lernverhalten, die Etabliertheit von Strophentypen, Weibchenpräferenzen und die Reaktionen der territorialen Männchen. - Weiterhin wurde ein Modell zur kulturellen Evolution des Buchfinkengesangs programmiert, um die Rolle der Einflussfaktoren, wie Fehlerquote, Abwanderungsrate und Laufzeit zu ermitteln. Der Wandel des Dialektes erfolgt graduell in Raum und Zeit. Daher sind keine scharfen Dialektgrenzen anzutreffen. Trotz dieser Tatsache markieren die etablierten Strophentypen die Population. 50 % der Juvenilen siedeln am Geburtsort, auf diese Weise bleibt der Dialekt erhalten und Inzest wird vermieden. -Analysiert man das Repertoire benachbarten Männchen bei isolierten Alleen, so entspricht die Gesangsangleichung in etwa dem Zufall. -Intraindividuelle Vergleiche der quantitativen Parameter des jeweiligen Strophentyps wurden saisonal und annuell durchgeführt. Saisonal konnten für einen Strophentyp ein Trend ermittelt werden. Bei jährlichen Vergleichen konnten intraindividuell ausschließlich nicht signifikante Ergebnisse ermittelt werden, wohingegen die interindividuelle Variation in zwei Fällen signifikant war. In einem Fall bestand ein Trend und in einem weiteren Fall war die Variationsunterschiede nicht signifikant. - Der Verlauf der Brutsaison lässt sich an der jährlichen Gesangsaktivität nachvollziehen. N2 - Chaffinch song was recorded in Potsdam in two major populations of chaffinches over a period of three years. Each male was identified unambiguously because of their individual song type repertoires. These are usually easy to distinguish from sonagrams as the variation is discontinuous. A further point for individual recognition is the fixed territorial behaviour of adult males. The described method is employed to examine whole populations and to observe changes with space and time in the song of a population. The major findings of the study are: - The total amount of basic song types in each population is constant over years. - The quantity of each basic song type is different and varies from year to year and from population to population. - Song copying is extremely accurate on at least 96% of occasions. - Song-type sharing is high within populations. Discussed mechanisms for song neighbourhoods are: expectation of life, semi-migratory behaviour, learning skills, establishment of song types, female choice and male vs male interaction. Furthermore a model of cultural evolution of chaffinch song was programmed to determine the role of factors like error rate, rate of emigration and running time. The changes are gradual in space and time. Hence the dialect borders are smooth. Despite this fact established song types mark the population. As every second juvenile bird settles in the population of his birth inbreeding is avoided and the dialect structure is retained. - Analysing the repertoires of neighbouring males (“next door neighbours”) in isolated avenues to examine mutual influences suggests that these have the same amount of song types in common than would be expected by chance. - Within intraindividual comparisons the quantitative parameters of the same song types remain seasonal and annual constant, whereas interindividual variations within the same song tip are statistically significant. - The breeding biology of the chaffinch can be observed by seasonal singing activity during the breeding cycle. KW - Buchfink KW - Gesangsdialekte KW - Strophentypen KW - Gesangslernen KW - Gesangsangleich KW - Gesangsaktivität KW - Chaffinch KW - Songdialects KW - song-types KW - songlearning KW - song-sharing KW - song-matching KW - singing activity Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0000882 ER - TY - THES A1 - Rietdorf, Katja T1 - Wirkungen biogener Amine auf die Erregungs-Sekretions-Kopplung in der Speicheldrüse von Periplaneta americana (L.) N2 - In der vorliegenden Arbeit habe ich wichtige Teilmechanismen der Erregungs-Sekretionskopplung in der Speicheldrüse der Schabe Periplaneta americana (L.) untersucht. Die Speicheldrüse ist von dopaminergen und serotonergen Fasern innerviert (Baumann et al., 2002). Beide Transmitter stimulieren eine unterschiedliche Reaktion der Drüse: Dopamin (DA) stimuliert die P-Zellen der Acini und die Ausführgangzellen, während Serotonin (5-HT) die P- und C-Zellen der Acini stimuliert, nicht jedoch die Ausführgangzellen. Der Endspeichel ist nach einer DA-Stimulierung proteinfrei. Dagegen enthält er nach einer 5-HT-Stimulierung Proteine, die von den C-Zellen sezerniert werden (Just & Walz, 1996). Im ersten Teil meiner Arbeit habe ich mittels Kapillarelektrophoretischer Analyse (CE-Analyse) die Elektrolytkonzentrationen im Endspeichel untersucht sowie die Raten der Flüssigkeitssekretion gemessen. Damit wollte ich klären, welche Transporter an der Sekretion des Primärspeichels und an dessen Modifikation beteiligt sind. Ausserdem wollte ich die Rolle der transportaktiven Epithelzellen der Ausführgänge für die Modifikation des Primärspeichels untersuchen. Dafür habe ich einen Vergleich der Elektrolytkonzentrationen im DA- und 5-HT-stimulierten Endspeichel durchgeführt. Der Elektrolytgehalt des DA- und 5-HT-stimulierten Endspeichels unterscheidet sich nicht signifikant voneinander. Er ist nach beiden Stimulierungen hypoosmotisch zum verwendeten Ringer. Die Ausführgangzellen werden durch DA stimuliert und modifizieren den Primärspeichel durch eine netto-Ionenreabsorption. Meine Versuche zeigen jedoch, dass auch die während einer 5-HT-Stimulierung der Drüse unstimulierten Ausführgangzellen den Primärspeichel modifizieren. In einer nachfolgenden Versuchsreihe habe ich den Einfluss von Ouabain, einem Hemmstoff der Na+-K+-ATPase, und Bumetanid, einem Hemmstoff des NKCC, auf die Raten der Flüssigkeitssekretion sowie den Elektrolytgehalt des Endspeichels untersucht. Ich habe gefunden, dass die Aktivität der Na+-K+-ATPase wichtig für die Modifikation des DA-stimulierten Primärspeichels ist. Im Gegensatz dazu ist sie für die Modifikation des 5-HT-stimulierten Primärspeichels nicht von Bedeutung. Bezüglich der Flüssigkeitssekretion habe ich keinen Einfluss der Na+-K+-ATPase-Aktivität auf die DA-stimulierten Sekretionsraten gefunden, dagegen ist die 5-HT-stimulierte Sekretionsrate in Anwesenheit von Ouabain gesteigert. Die Aktivität des NKCC ist für beide sekretorische Prozesse, die Ionen- und die Flüssigkeitssekretion, wichtig. Eine Hemmung des NKCC bewirkt eine signifikante Verringerung der Raten der Flüssigkeitssekretion nach DA- und 5-HT-Stimulierung sowie in beiden Fällen einen signifikanten Abfall der Ionenkonzentrationen im Endspeichel. Im zweiten Teil meiner Arbeit habe ich versucht, Änderungen der intrazellulären Ionenkonzentrationen in den Acinuszellen während einer DA- oder 5-HT-Stimulierung zu messen. Diese Experimente sollten mit der Methode des "ratiometric imaging" durchgeführt werden. Messungen mit dem Ca2+-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff Fura-2 zeigten keinen globalen Anstieg in der intrazellulären Ca2+-Konzentration der P-Zellen. Aufgrund von Problemen mit einer schlechten Beladung der Zellen, einer starken und sich während der Stimulierung ändernden Autofluoreszenz der Zellen sowie Änderungen im Zellvolumen wurden keine Messungen mit Na+- und K+-sensitiven Fluoreszenzfarbstoffen durchgeführt. Im dritten Teil dieser Arbeit habe ich die intrazellulären Signalwege untersucht, die zwischen einer 5-HT-Stimulierung der Drüse und der Proteinsekretion vermitteln. Dazu wurde der Proteingehalt im Endspeichel biochemisch mittels eines modifizierten Bradford Assay gemessen. Eine erstellte Dosis-Wirkungskurve zeigt, dass die Rate der Proteinsekretion von der zur Stimulierung verwendeten 5-HT-Konzentration abhängt. In einer Serie von Experimenten habe ich die intrazellulären Konzentrationen von Ca2+, cAMP und / oder cGMP erhöht und anschließend den Proteingehalt im Endspeichel gemessen. Ein Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration aktiviert nur eine geringe Rate der Proteinsekretion. Dagegen kann die Steigerung der intrazellulären cAMP-Konzentration eine stärkere Proteinsekretion aktivieren, die sich nicht signifikant von der nach 5-HT-Stimulierung unterscheidet. Die cAMP-stimulierte Proteinsekretion kann durch gleichzeitige Erhöhung der intrazellulären Ca2+-Konzentration weiter gesteigert werden. Dagegen aktivierte eine Erhöhung der intrazellulären cGMP-Konzentration die Proteinsekretion nicht. Aufgrund dieser Ergebnisse postuliere ich die Existenz eines die Adenylatcyclase aktivierenden 5-HT-Rezeptors in der Basolateralmembran der C-Zellen. N2 - The aim of this PhD-work was to investigate major mechanisms of excitation-secretion coupling in the salivary gland of the cockroach Periplaneta americana (L.). This salivary gland is innervated by dopaminergic and serotonergic fibres (Baumann et al., 2002). The two transmitters stimulate different processes in the gland: Dopamine (DA) stimulates the p-cells of the acini and the salivary duct cells, whereas 5-HT (serotonin) activates the p- and the c-cells of the acini, but not the salivary duct cells. Final saliva is completely protein-free after dopamine stimulation. It contains proteins, which are secreted by the c-cells of the acini, after a 5-HT-stimulation (Just & Walz, 1996). In the first part of my work I measured the electrolytic composition of the final saliva by capillary electrophoretic analysis and measured the rates of fluid secretion, in order to answer the following questions: 1.) Which transporters affect the production of primary saliva and its modification? 2.) What is the function of the transport-active salivary duct cells for the modification of the primary saliva? Electrolytic composition of the DA- and 5-HT-stimulated final saliva is not significantly different from each other, and is hypoosmotic to the Ringer used. Salivary duct cells are stimulated by DA and modify the primary saliva by a netto ion-reabsorption. My experiments also show that the duct cells, which are unstimulated during a 5-HT-stimulation of the gland, modify the primary saliva. In the next series of experiments I investigated the effects of ouabain, an inhibitor of the Na+-K+-ATPase, and bumetanide, an inhibitor of the NKCC on the rates of fluid secretion and the electrolytic composition of the final saliva. I found, that the activity of the Na+-K+-ATPase is important for the modification of DA-stimulated primary saliva during its flow through the stimulated duct system. In contrast, it is not important for modification of the 5-HT-stimulated primary saliva. Inhibition of the Na+-K+-ATPase does not affect rates of DA-stimulated fluid secretion, but it increases the rates of 5-HT-stimulated fluid secretion. Activity of the NKCC is important for both secretory processes: the ion and the fluid secretion. Inhibition of the NKCC results in a significant drop in the rates of fluid secretion after DA- and 5-HT-stimulation, as well as a drop in electrolytic concentrations in the saliva. In the second part of my work, I tried to measure changes in the intracellular ionic concentrations (Ca2+, Na+, and K+) within the acinar cells during a DA- or 5-HT-stimulation. The experiments should be performed by ratiometric imaging. Measurements with the Ca2+-sensitive dye Fura-2 did not show any global increase in the intracellular Ca2+-concentration in the p-cells of the acini. Problems concerning a bad loading of the cells, a strong autofluorescence which changed during the time course of the stimulation, as well as changes in the cell volume were the reason, that no measurements using Na+- or K+-sensitive dyes were performed. In the third part of my work I investigated the intracellular signalling pathways, which activate protein secretion after 5-HT-stimulation of the gland. A modified Bradford Assay was used for measuring the protein content in the final saliva. In a dose-response curve I showed that rates of protein secretion are dependent on the 5-HT-concentrations used to stimulate the glands. In another set of experiments I increased the intracellular concentrations of Ca2+, cAMP and / or cGMP, and measured the protein content in the final saliva. An increase in the intracellular Ca2+-concentration activates only a low rate of protein secretion. After an increase in the intracellular cAMP-concentration a much higher rate of protein secretion can be activated, which is not significantly different from the 5-HT stimulated rate of protein secretion. The cAMP-stimulated protein secretion can be further increased by a simultaneous rise in the intracellular Ca2+-concentration. In contrast, cGMP does not activate protein secretion. Therefore I propose the expression of an adenylyl cyclase activating 5-HT-receptor in the basolateral membrane of the protein secreting c-cells. KW - Periplaneta KW - Speicheldrüse KW - Speichel KW - ionale Zusammensetzung KW - Ionentransport KW - Proteinsekretion KW - second messenger KW - Periplaneta KW - salivary gland KW - saliva KW - ionic composition KW - ion transport KW - protein secretion KW - second messenger Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0000878 ER - TY - THES A1 - Schmidt, Peter Michael T1 - Aktivitätsmessung auf nukleinsäuremodifizierten Oberflächen N2 - Im Bereich der medizinischen Diagnostik spielen DNA-Chips eine immer wichtigere Rolle. Dabei werden Glas- oder Silikon-Oberflächen mit Tausenden von einzelsträngigen DNA-Fragmenten, sog. Sonden, bestückt, die mit den passenden DNA-Fragmenten in der zugefügten Patientenprobe verschmelzen. Die Auswertung solcher Messungen liefert die Diagnose für Krankheiten wie z.B. Krebs, Alzheimer oder für den Nachweis pathogener Erreger. Durch fortschreitende Miniaturisierung dieser Meßsysteme können bis zu 40.000 Genfragmente des Menschen in einer einzigen Messung analysiert werden. Neben den DNA-Fragmenten können Bio-Chips auch für andere biologische Komponenten wie Antikörper und Proteine eingesetzt werden, wobei bei letzteren neben der Bindung auch die Aktivität ein wichtiger Diagnoseparamter ist. Am Fraunhofer-Institut für medizinische Technik und am Lehrstuhl für Analytische Biochemie der Universität Potsdam wurden im Rahmen einer Doktorarbeit Methoden entwickelt, die es ermöglichen auf nukleinsäuremodifizierten Sensoroberflächen die Aktivität von Proteinen zu messen. Es wurden Nukleinsäuren auf Oberflächen optischer Sensoren verankert. Diese fungierten als Rezeptor für die Proteine sowie auch als Substrat für Restriktionsenzyme, die Nukleinsäuren schneiden und Polymerasen, die Nukleinsäuren synthetisieren und verlängern können. Seine Anwendung fand diese Messmethode in der Messung der Aktivität des Proteins Telomerase, das in 90% aller Tumore erhöhte Aktivität gegenüber gesunden Zellen aufweist. Die Vorteile dieses neuen Assays gegenüber älteren Methoden liegt im Verzicht auf radioaktiv-markierten Komponenten und einer deutlich verkürzten Analysezeit. Die Arbeit schliesst mit einem funktionsfähigen Nachweis der Telomeraseaktivität im Zellextrakt von gesunden und kranken Zellen. Der direkte Einfluß von Hemmstoffen auf die Aktivität konnte sichtbar gemacht werden, und steht daher bei der Entwicklung neuer Tumor-Diagnostika und Therapeutika zur Verfügung. N2 - In the field of medical diagnostic the importance of DNA chips is growing continuously. On silica surfaces hundreds of single stranded DNA fragments are immobilised which finally detect the complementary sequences in samples of patients by hybridisation. These methods enable the detection of serious diseases as cancer, Alzheimer's disease or infection by pathogens. Biomolecules as nucleic acids, antibodies and proteins can be used as receptors on the solid surfaces whereas in case of proteins not only the binding but also the activity are of high interest for medical diagnosis. In this thesis a biosensoric approach has been developed to determine the activity of nucleic-acid modifying enzymes. Optical sensors as, e.g., the grating coupler, were used to monitor the association and dissociation of unlabeled compounds on the sensor surface in real time, by virtue of evanescent-field. Furthermore sensors based on total internal reflection fluorescence measured the activity of restriction enzymes and polymerases. The general approach included the immobilisation of oligonucleotides which acted as the receptor for the enzymes as well as the substrate for the enzymatic reaction. Enzymes as EcoRI and Klenow were used to establish a model system to measure the activity of DNA-modifying enzymes on optical surfaces. As most nucleic acid detection systems use amplification steps such as polymerase chain reaction (PCR) to increase the amount of the probe the new optical systems facilitated the analysis of the enzymatic activity by measuring the DNA-synthesis or restriction directly. These systems were finally used to detect the activity of the telomerase, an enzymatic marker for the cancerous development of cells. In 90% of cancer cells the activity of telomerase is higher than in normal cells. Additionally the increase of the telomerase activity in cells induced by carcinogenic substances was detected. Furthermore no purification steps of the samples were required as all measurements were performed with crude cell extract. Also the effect of inhibitors of the telomerase could be shown in real time measurements underlining the potential of this assay for further developments of new cancer therapeutics. KW - Aktivitätsmessung KW - optische Biosensoren KW - Nukleinsäuren KW - Telomerase KW - Telomerase KW - TRAP-assay KW - fibre optic KW - G-quartettes KW - grating coupler KW - on-chip enzymatic assay Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0000797 ER - TY - THES A1 - Hahn, Robert T1 - Das Blüte-Bestäuber-Netz auf Brachflächen : biozönologische Untersuchung zur Bedeutung von Brachen in einer intensiv genutzten Agrarlandschaft N2 - In der vorliegenden Dissertation wird die Bedeutung von Brachen für Artenvielfalt und Stabilität von Blüte-Bestäuber-Nahrungsnetzen in agrarisch genutzten Landschaften anhand ausgewählter blütenbesuchender Insektengruppen (Syrphidae, Lepidoptera) untersucht. Die Freilandarbeiten fanden von 1998-2000 im Raum der Feldberger Seenlandschaft, Mecklenburg-Vorpommern, statt. Es werden die beiden Hauptnahrungsquellen Nektar und Pollen betrachtet, dabei fanden Untersuchungen zur Intensität der Blüte-Bestäuber-Interaktion auf Stilllegungsflächen, zum flächenbezogenen quantitativen Nektarangebot im Jahresverlauf, zur individuellen Pollennutzung bei Syrphiden und zur Breite und Überlappung der Nahrungsnischen bei den dominanten Arten Episyrphus balteatus, Metasyrphus corollae, Syritta pipiens und Sphaerophoria scripta statt. Im Ergebnis zeigt sich eine hohe Bedeutung der Brachflächen für die Stabilität des Blüte-Bestäuber-Netzes, während die Diversität von anderen, eher landschaftsbezogenen Faktoren abhängig ist. N2 - This dissertation examines the importance of fallow land for the diversity and stability of pollination webs in agricultural landscapes as exemplified by selected groups of anthophilous insects (syrphidae and lepidoptera). The field studies were carried out between 1998 and 2000 in the Feldberg lakeland area in the north-east German State of Mecklenburg-Western Pomerania. Observations were made of nectar and pollen as the two main sources of food. Studies were conducted into the intensity of plant-pollinator interaction in set-aside areas, the site-specific quantity of nectar available during the vegetation period and the individual pollen intake of syrphid flies. Different methods were employed to establish the breadth of the trophic niches among the predominant species (Episyrphus balteatus, Metasyrphus corollae, Syritta pipiens and Sphaerophoria scripta) and the extent to which they overlapped. The studies showed that, while fallow land is very important for the stability of plant-pollinator food webs, their diversity depends on other factors that are more closely related to the landscape. KW - Feldberger Seenlandschaft ; Agrarlandschaft ; Brache ; Samenpflanzen ; Bestäuber ; Artenreichtum KW - Brachfläche KW - Bestäubung KW - Blütenökologie KW - Blüte-Bestäuber-Interaktion KW - Nektar KW - Pollen KW - fallow land KW - pollination KW - flower ecology KW - flower-insect-interaction KW - nectar KW - pollen Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0000652 ER - TY - THES A1 - Küster, Frank T1 - Das Lektin aus der Erbse Pisum sativum : Bindungsstudien, Monomer-Dimer-Gleichgewicht und Rückfaltung aus Fragmenten N2 - Das Lektin aus Pisum sativum, der Gartenerbse, ist Teil der Familie der Leguminosenlektine. Diese Proteine haben untereinander eine hohe Sequenzhomologie, und die Struktur ihrer Monomere, ein all-ß-Motiv, ist hoch konserviert. Dagegen gibt es innerhalb der Familie eine große Vielfalt an unterschiedlichen Quartärstrukturen, die Gegenstand kristallographischer und theoretischer Arbeiten waren. Das Erbsenlektin ist ein dimeres Leguminosenlektin mit einer Besonderheit in seiner Struktur: Nach der Faltung in der Zelle wird aus einem Loop eine kurze Aminosäuresequenz herausgeschnitten, so dass sich in jeder Untereinheit zwei unabhängige Polypeptidketten befinden. Beide Ketten sind aber stark miteinander verschränkt und bilden eine gemeinsame strukturelle Domäne. Wie alle Lektine bindet Erbsenlektin komplexe Oligosaccharide, doch sind seine physiologische Rolle und der natürliche Ligand unbekannt. In dieser Arbeit wurden Versuche zur Entwicklung eines Funktionstests für Erbsenlektin durchgeführt und seine Faltung, Stabilität und Monomer-Dimer-Gleichgewicht charakterisiert. Um die spezifische Rolle der Prozessierung für Stabilität und Faltung zu untersuchen, wurde ein unprozessiertes Konstrukt in E. coli exprimiert und mit der prozessierten Form verglichen. Beide Proteine zeigen die gleiche kinetische Stabilität gegenüber chemischer Denaturierung. Sie denaturieren extrem langsam, weil nur die isolierten Untereinheiten entfalten können und das Monomer-Dimer-Gleichgewicht bei mittleren Konzentrationen an Denaturierungsmittel auf der Seite der Dimere liegt. Durch die extrem langsame Entfaltung zeigen beide Proteine eine apparente Hysterese im Gleichgewichtsübergang, und es ist nicht möglich, die thermodynamische Stabilität zu bestimmen. Die Stabilität und die Geschwindigkeit der Assoziation und Dissoziation in die prozessierten bzw. nichtprozessierten Untereinheiten sind für beide Proteine gleich. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass auch unter nicht-denaturierenden Bedingungen die Untereinheiten zwischen den Dimeren ausgetauscht werden. Die Renaturierung der unprozessierten Variante ist unter stark nativen Bedingungen zu 100 % möglich. Das prozessierte Protein dagegen renaturiert nur zu etwa 50 %, und durch die Prozessierung ist die Faltung stark verlangsamt, der Faltungsprozess ist erst nach mehreren Tagen abgeschlossen. Im Laufe der Renaturierung wird ein Intermediat populiert, in dem die längere der beiden Polypeptidketten ein Homodimer mit nativähnlicher Untereinheitenkontaktfläche bildet. Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Renaturierung ist die Assoziation der entfalteten kürzeren Kette mit diesem Dimer. N2 - The lectin from Pisum sativum (garden pea) is a member of the family of legume lectins. These proteins share a high sequence homology, and the structure of their monomers, an all-ß-motif, is highly conserved. Their quaternary structures, however, show a great diversity which has been subject to cristallographic and theoretical studies. Pea lectin is a dimeric legume lectin with a special structural feature: After folding is completed in the cell, a short amino acid sequence is cut out of a loop, resulting in two independent polypeptide chains in each subunit. Both chains are closely intertwined and form one contiguous structural domain. Like all lectins, pea lectin binds to complex oligosaccharides, but its physiological role and its natural ligand are unknown. In this study, experiments to establish a functional assay for pea lectin have been conducted, and its folding, stability and monomer-dimer-equilibrium have been characterized. To investigate the specific role of the processing for stability and folding, an unprocessed construct was expressed in E. coli and compared to the processed form. Both proteins have the same kinetic stability against chemical denaturant. They denature extremely slowly, because only the isolated subunits can unfold, and the monomer-dimer-equilibrium favors the dimer at moderate concentrations of denaturant. Due to the slow unfolding, both proteins exhibit an apparent hysteresis in the denaturation transition. Therefore it has not been possible to determine their thermodynamic stability. For both proteins, the stability and the rates of association and dissociation into processed or unprocessed subunits, respectively, are equal. Furthermore it could be shown that even under non-denaturing conditions the subunits are exchanged between dimers. Renaturation of the unprocessed variants is possible under strongly native conditions with 100 % yield. The processed protein, however, can be renatured with yields of about 50 %, and its refolding is strongly decelerated. The folding process is finished only after several days. During renaturation, an intermediate is populated, in which the longer of the two polypeptide chains forms a homodimer with a native-like subunit interface. The rate limiting step of renaturation is the association of the unfolded short chain with this dimer. KW - Leguminosenlektin KW - Faltung KW - irreversibel KW - Fragmente KW - Prozessierung KW - Assoziation KW - Saccharidbindung KW - Oligomer KW - Untereinheitenautausch KW - Isoformen KW - legume lectin KW - folding KW - irreversible KW - fragments KW - processing KW - association KW - saccharide binding KW - oligomer KW - subunit exchange KW - isoforms Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0000612 ER - TY - THES A1 - Johnen, Heiko T1 - Vergleich von rekombinanten Vaccinia- und DNA-Vektoren zur Tumorimmuntherapie im C57BL/6-Mausmodell N2 - In der vorliegenden Arbeit wurden Tumorimpfstoffe auf der Basis des Plasmid-Vektors pCI, modified vaccinia virus Ankara (MVA) und MVA-infizierten dendritischen Zellen entwickelt und durch Sequenzierung, Western blotting und durchflußzytometrische Analyse überprüft. Die in vivo Wirksamkeit der Vakzinen wurde in verschiedenen Tumormodellen in C57BL/6 Mäusen verglichen. Die auf dem eukaryotischen Expressionsvektor pCI basierende DNA-Vakzinierung induzierte einen sehr wirksamen, antigenspezifischen und langfristigen Schutz vor Muzin, CEA oder beta-Galactosidase exprimierenden Tumoren. Eine MVA-Vakzinierung bietet in den in dieser Arbeit durchgeführten Tumormodellen keinen signifikanten Schutz vor Muzin oder beta-Galactosidase exprimierenden Tumoren. Sowohl humane, als auch murine in vitro generierte dendritische Zellen lassen sich mit MVA – im Vergleich zu anderen viralen Vektoren – sehr gut infizieren. Die Expressionsrate der eingefügten Gene ist aber gering im Vergleich zur Expression in permissiven Wirtszellen des Virus (embryonale Hühnerfibroblasten). Es konnte gezeigt werden, daß eine MVA-Infektion dendritischer Zellen ähnliche Auswirkungen auf den Reifezustand humaner und muriner dendritischer Zellen hat, wie eine Infektion mit replikationskompetenten Vakzinia-Stämmen, und außerdem die Hochregulation von CD40 während der terminalen Reifung von murinen dendritischen Zellen inhibiert wird. Die während der langfristigen in vitro Kultur auf CEF-Zellen entstandenen Deletionen im MVA Genom führten zu einer starken Attenuierung und dem Verlust einiger Gene, die immunmodulatorische Proteine kodieren, jedoch nicht zu einer Verminderung des zytopathischen Effekts in dendritischen Zellen. Die geringe Expressionsrate und die beobachtete Inhibition der Expression kostimulatorischer Moleküle auf dendritischen Zellen kann für eine wenig effektive Induktion einer Immunantwort in MVA vakzinierten Tieren durch cross priming oder die direkte Infektion antigenpräsentierender Zellen verantwortlich sein. Durch die Modifikation einer Methode zur intrazellulären IFN-gamma Färbung konnten in vakzinierten Mäusen tumorantigenspezifische CTL sensitiv und quantitativ detektiert werden. Die so bestimmte CTL-Frequenz, nicht jedoch die humorale Antwort, korrelierte mit der in vivo Wirksamkeit der verschiedenen Vakzinen: DNA vakzinierte Tiere entwickeln starke tumorantigenspezifische CTL-Antworten, wohingegen in MVA-vakzinierten Tieren überwiegend gegen virale Epitope gerichtete CD4 und CD8-T-Zellen detektiert wurden. Die Wirksamkeit der pCI-DNA-Vakzine spricht für die Weiterentwicklung in weiteren präklinischen Mausmodellen, beispielsweise unter Verwendung von MUC1 oder HLA-A2 transgenen Mäusen. Die Methoden zur Detektion Tumorantigen-spezifischer CTL in 96-Loch-Mikrotiterplatten können dabei zur systematischen Suche nach im Menschen immundominanten T-Zell-Epitopen im Muzin-Molekül genutzt werden. Der durchgeführte Vergleich der auf den Vektoren pCI und MVA basierenden Vakzinen und die Analyse neuerer Publikationen führen zu dem Ergebnis, daß vor allem DNA-Vakzinen in Zukunft eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von aktiven Tumorimpfstoffen spielen werden. Rekombinante MVA-Viren, eventuell in Kombination mit DNA- oder anderen Vektoren, haben sich dagegen in zahlreichen Studien als wirksame Impfstoffe zur Kontrolle von durch Pathogene hervorgerufenen Infektionserkrankungen erwiesen. N2 - In this study, tumor vaccines based on the plasmid pCI, the attenuated vaccinia virus strain modified vaccinia virus Ankara (MVA) and MVA-infected dendritic cells were constructed and characterized by sequencing, Western blot and flow cytometric analysis. The efficiency to induce tumor immunity in vivo was compared in several C57BL/6 mouse tumor models. Naked DNA Vaccination based on the eukaryotic expression vector pCI did induce very effective, antigen-specific and long-term protection against tumor cell lines expressing mucin, CEA or beta-Gal whereas MVA vaccination did not elicit protective immunity against Mucin or beta-Gal expressing tumors. MVA does infect human or murine in vitro generated dendritic cells very efficiently compared to other viral vectors, however expression levels of the inserted antigens in dendritic cells are significantly lower than in permissive host cells (chicken embryo fibroblasts). It could be shown that the effect of MVA infection on the maturation status of dendritic cells is similar to the effects described for dendritic cells infected with replication competent vaccinia strains. In addition it was shown that the upregulation of the important costimulatory molecule CD40 through LPS stimulation is strongly inhibited in MVA infected cells. During passage in tissue culture, MVA has accumulated a number of large deletions, including a number of immunomodulatory molecules and resulting in a strong attenuation. However the strong cytopathic effect on dendritic cells is maintained. The low level of expression and the effect on dendritic cell maturation may be responsible for the failure of MVA to induce tumor immunity through either cross presentation or direct infection of antigen presenting cells. To detect and quantify tumor-antigen-specific CTL a method based on intracellular IFN-gamma staining was modified and it could be shown that the cellular – but not the humoral – response does correlate with in vivo protection: DNA but not MVA vaccines do induce high levels of tumorantigen-specific CTL whereas MVA-vaccines do induce strong and long lasting CD4 and CD8-T-cell responses against vaccinia antigens. The excellent protection induced by pCI-DNA-vaccination in different tumor models does encourage us to further investigate the elicitation of tumor immunity in MUC1 or HLA-A2 transgenic mice. In mice transgenic for human MHC-I, the IFN-gamma staining protocol could be used to systematically screen for mucin T-cell epitopes that are relevant in humans. KW - Tumorimmuntherapie KW - MVA KW - Modified Vaccinia Virus Ankara KW - Muzin KW - CEA KW - MUC1 KW - beta-Galactosidase KW - DNA-Vakzinierung KW - pCI KW - MC38 KW - tumor immunotherapy KW - MVA KW - Modified Vaccinia Virus Ankara KW - Mucin KW - MUC1 KW - beta-Galactosidase KW - CEA KW - DNA vaccine KW - pCI KW - MC38 Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0000593 ER - TY - THES A1 - Stöllner, Daniela T1 - Neue biosensorische Prinzipien für die Hämoglobin-A1c Bestimmung N2 - Hämoglobin-A1c (HbA1c) ist ein Hämoglobin (Hb)-Subtypus, der durch nicht-enzymatische Glykierung des N-terminalen Valinrestes der Hämoglobin-beta-Kette entsteht. Das gemessene Verhältnis von HbA1c zum Gesamt-Hämoglobin (5-20 % bei Diabetikern) repräsentiert den Mittelwert der Blutglucosekonzentration über einen zweimonatigen Zeitraum und stellt zur Beurteilung der diabetischen Stoffwechsellage eine Ergänzung zur Akutkontrolle der Glukosekonzentration dar. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, einen amperometrischen Biosensor für die Bestimmung des medizinisch relevanten Parameters HbA1c zu entwickeln. Durch Selektion geeigneter Bioerkennungselemente und deren Immobilisierung unter Erhalt der Bindungsfunktion für die Zielmoleküle Hämoglobin bzw. HbA1c wurden spezifische, hochaffine und regenerationsstabile Sensoroberflächen geschaffen. Für die Entwicklung des HbA1c-Biosensors wurden zwei Konzepte - Enzymsensor und Immunosensor - miteinander verglichen. Die enzymatische Umsetzung von HbA1c erfolgte mit der Fructosylamin Oxidase (FAO) aus Pichia pastoris N 1-1 unter Freisetzung von H2O2, welches sowohl optisch über eine Indikatorreaktion als auch elektrochemisch nach Einschluss der FAO in PVA-SbQ und Fixierung des Immobilisats vor einer H2O2-Elektrode nachgewiesen wurde. Die Kalibration des Enzymsensors mit der HbA1c-Modellsubstanz Fructosyl-Valin ergab Nachweisgrenzen, die ausserhalb des physiologisch relevanten HbA1c-Konzentrationsbereich lagen. Aus der Umsetzung von glykierten Peptiden mit einer nicht HbA1c analogen Aminosäurensequenz, z.B. Fructosyl-Valin-Glycin wurde zudem eine geringe HbA1c-Spezifität abgeleitet. Für den Immunosensor wurden zwei heterogene Immunoassay-Formate unter Verwendung von hochaffinen und spezifischen Antikörpern in Kombination mit Glucose Oxidase (GOD) als Markerenzym zum Nachweis von HbA1c untersucht. Beim indirekt-kompetitiven Immunoassay wurde anstelle des kompletten HbA1c-Moleküls das glykierte Pentapeptid Fructosyl-Valin-Histidin-Leucin-Threonin-Prolin (glkPP) als Kompetitor und Affinitätsligand immobilisiert und so eine regenerierfähige Oberfläche geschaffen. Beim Sandwich-Immunoassay wurde im ersten Schritt Gesamt-Hämoglobin an die mit Haptoglobin (Hp) modifizierte Festphase angereichert und im zweiten Schritt der gebundene HbA1c-Anteil nachgewiesen. Für die Konstruktion des HbA1c-Immunosensors wurden Affinitätsmatrizen durch Modifizierung von Cellulose-Dialysemembranen mit glkPP bzw. Hp hergestellt. Grundlegend studiert wurde die Aktivierung der Cellulose-Membranen mit 1,1'-Carbonyldiimidazol (CDI) und 1-Cyano-4-dimethylaminopyridintetrafluoroborat (CDAP) als Aktivierungsagenzien. Eine gerichtete Immobilisierung der Liganden wurde realisiert, indem glkPP über dessen C-Terminus (einzige Carboxylatgruppe) und Hp über dessen periodat-oxidiertem Kohlenhydratrest an die amino- oder hydrazidfunktionalisierte Membranen kovalent gekoppelt wurden. Mit dem Einsatz der glkPP- und Hp-modifizierten Membranen in der elektrochemischen Messzelle war erstmalig der biosensorische Nachweis von HbA1c möglich. Als Transduktor diente eine Pt-Elektrode, an der das von der GOD generierte H2O2 umgesetzt und ein mit der HbA1c-Konzentration korrelierendes Stromsignal erzeugt wurde. Die Immunosensoren zeigten Ansprechzeiten von 3 s. Mit dem Immunosensor auf Basis des indirekt-kompetitiven Testprinzips wurde eine Kalibrationskurve für HbA1c im Bereich von 0,25-30 µg/ml (3,9-465 nM, CV 3-9 %) mit Assayzeiten von 60 min und mit dem Immunosensor im Sandwich-Format eine Kalibrationskurve im Bereich von 0,5-5 µg/ml (7,8-78 nM; 5-50 % HbA1c vom Gesamt-Hb, CV 6-10 %, 3 h) aufgenommen. N2 - Hemoglobin-A1c (HbA1c) is a hemoglobin subtype formed by non-enzymatic reaction of glucose with the N-terminus of the beta-polypeptide chains. As it reflects the glycemic status of diabetics over the preceding 8-12 weeks, the determination of HbA1c has become an established procedure in the management of diabetes mellitus. It is measured as the percentage of total hemoglobin. Up to 5 % HbA1c are considered as normal whereas in diabetic subjects it could be elevated from 5-20 %. In addition to amperometric biosensors for glucose self monitoring which have been successfully applied in diabetes management, biosensors for HbA1c would be an useful supplement for a comprehensive diabetes control. Objective of this work was to develop and compare amperometric biosensors for determination of HbA1c based on enzymatic and immunochemical methods. For the enzyme based HbA1c assay a novel fructosamine oxidase (FAO) derived from marine yeast Pichia pastoris, strain N1-1 was utilized. It recognizes and oxidatively degrades fructosyl-valine (FV) which corresponds to the glycated N-terminus of the beta-chain of HbA1c and therefore is regarded as a model compound for HbA1c. Hydrogen peroxide which is liberated by the FAO during FV conversion was indicated optically in a horseradish peroxidase (POD) coupled reaction and electrochemically. For the biosensor the FAO was embedded in polyvinyl alcohol-stylbazole (PVA-SbQ) and fixed it in front of a Pt-electrode. So far, the measuring range of FV did not cover the clinically relevant range of HbA1c. Low specificity was assumed since enzyme activity also was obtained with glycated peptides, e.g. fructosyl-valine-glycine, not corresponding to the glycated N-terminus of the hemoglobin-beta-chain. For the immunosensor two immunoassays formats - heterogeneous sandwich and heterogeneous competitive - were tested. The assays were designed as follows: The competitive immunoassay was based on the immobilized synthetic glycated pentapeptide fructosyl-valine-histidine-leucine-threonine-proline (glkPP) utilized as HbA1c analogue. The peptide has an amino acid sequence corresponding to the N-terminus of the hemoglobin beta-chains and is capable for competition together with the HbA1c of the sample for the amount of a glucose oxidase (GOD)-labelled anti-HbA1c antibody. In the sandwich-type assay haptoglobin (Hp), a natural hemoglobin binding molecule with antibody characteristic properties, was used as bioreceptor for enrichment of total hemoglobin onto the surface. In a subsequent step the HbA1c fraction was quantified by a GOD-labelled HbA1c specific antibody. Cellulose dialysis membrane was used as the solid support for immobilization of Hp and glkPP near the sensor surface. For activation of the membrane two reagents, 1,1′-carbonyldiimidazole (CDI) and 1-cyano-4-dimethylamino pyridinium tetrafluoroborate (CDAP), were compared with respect to the degree of activation and coupling efficiency. Site-directed immobilization of Hp and glkPP was achieved by coupling Hp via its carbohydrate residue and glkPP via its C-terminus to the activated membrane using a bis-amine or bis-hydrazide spacer. The affinity membranes were placed in front of a modified Clark-type hydrogen peroxide electrode in an electrochemical measuring cell and HbA1c analysis was carried out within the stirred cell. Detection of the bound GOD-label was achieved by measurement of the electrocatalytic oxidation of hydrogen peroxide at +600 mV vs. Ag/AgCl. The indication was done in only 3 s. For the competitive principle a typical inhibition curve with a linear range between 0,25-30 µg/ml (3,9-465 nM, CV 3-9 %, 60 min per sample) HbA1c was obtained. Due to the high functional stability of the peptide multiple regeneration of the affinity surface was possible without loss of binding capacity. With the sandwich assay configuration the clinically relevant range could easily be covered (calibration curve: 5-50 % HbA1c corresponding to 7,8-78 nM, CV 6-10 %, 3 h per sample). KW - Hämoglobin A / Bestimmung / Biosensor / Amperometrie KW - Glykiertes Hämoglobin; HbA1c; Diabetes; Biosensor; Immunosensor; Enzymsensor; amperometrisch; elektrochemisch; Immunoassay; Diagnostik; Haptoglobin; KW - Glycated hemoglobin; HbA1c; diabetes; biosensor; immunosensor; enzyme sensor; electrochemical; amperometric; immunoassay; diagnostics; haptoglobin; im Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0000491 ER - TY - THES A1 - Werner, Deljana T1 - Versuche zur Gewinnung von katalytischen Antikörpern zur Hydrolyse von Arylcarbamaten und Arylharnstoffen T1 - Attempts to produce catalytic antibodies for hydrolysis of arylcarbamates and arylureas N2 - Im Rahmen dieser Arbeit gelang es, katalytische Antikörper zur Hydrolyse von Benzylphenylcarbamaten sowie zahlreiche monoklonale Antikörper gegen Haptene herzustellen. Es wurden verschiedene Hapten-Protein-Konjugate unter Verwendung unterschiedlicher Kopplungsmethoden hergestellt und charakterisiert. Zur Generierung der hydrolytisch aktiven Antikörper wurden Inzuchtmäuse mit KLH-Konjugaten von 4 Übergangszustandsanaloga (ÜZA) immunisiert. Mit Hilfe der Hybridomtechnik wurden verschiedene monoklonale Antikörper gegen diese ÜZA gewonnen. Dabei wurden sowohl verschiedene Immunisierungsschemata als auch verschiedene Inzuchtmausstämme und Fusionstechniken verwendet. Insgesamt wurden 32 monoklonale Antikörper gegen die verwendeten ÜZA selektiert. Diese Antikörper wurden in großen Mengen hergestellt und gereinigt. Zum Nachweis der Antikörper-vermittelten Katalyse wurden verschiedene Methoden entwickelt und eingesetzt, darunter immunologische Nachweismethoden mit Anti-Substrat- und Anti-Produkt-Antikörpern und eine photometrische Methode mit Dimethylaminozimtaldehyd. Der Nachweis der hydrolytischen Aktivität gelang mit Hilfe eines Enzymsensors, basierend auf immobilisierter Tyrosinase. Die Antikörper N1-BC1-D11, N1-FA7-C4, N1-FA7-D12 und R3-LG2-F9 hydrolysierten die Benzylphenylcarbamate POCc18, POCc19 und Substanz 27. Der Nachweis der hydrolytischen Aktivität dieser Antikörper gelang auch mit Hilfe der HPLC. Der katalytische Antikörper N1-BC1-D11 wurde kinetisch und thermodynamisch untersucht. Es wurde eine Michaelis-Menten-Kinetik mit Km von 210 µM, vmax von 3 mM/min und kcat von 222 min-1 beobachtet. Diese Werte korrelieren mit den Werten der wenigen bekannten Diphenylcarbamat-spaltenden Abzyme. Die Beschleunigungsrate des Antikörpers N1-BC1-D11 betrug 10. Das ÜZA Hei3 hemmte die hydrolytische Aktivität. Dies beweist, dass die Hydrolyse in der Antigenbindungsstelle stattfindet. Weiter wurde zwischen der Antikörperkonzentration und der Umsatzgeschwindigkeit eine lineare Abhängigkeit festgestellt. Die thermodynamische Gleichtgewichtsdissoziationskonstante KD des Abzyms von 2,6 nM zeugt von einer sehr guten Affinität zum ÜZA. Hydrolytisch aktiv waren nur Antikörper, die gegen das Übergangszustandsanalogon Hei3 hergestellt worden waren. Es wird vermutet, dass die Hydrolyse der Benzylphenylcarbamate über einen Additions-Eliminierungsmechanismus unter Ausbildung eines tetraedrischen Übergangszustandes verläuft, dessen analoge Verbindung Hei3 ist. Im Rahmen der Generierung von Nachweisantikörpern zur Detektion der Substratabnahme bei der Hydrolyse wurden Anti-Diuron-Antikörper hergestellt. Einer der Antikörper (B91-CG5) ist spezifisch für das Herbizid Diuron und hat einen IC50-Wert von 0,19 µg/l und eine untere Nachweisgrenze von 0,04 µg/l. Ein anderer Antikörper (B91-KF5) reagiert kreuz mit einer Palette ähnlicher Herbizide. Mit diesen Antikörpern wurde ein empfindlicher Labortest, der ein Monitoring von Diuron auf Grundlage des durch die Trinkwasserverordnung festgeschriebenen Wertes für Pflanzenschutzmittel von 0,1 µg/l erlaubt, aufgebaut. Der Effekt der Anti-Diuron-Antikörper auf die Diuron-inhibierte Photosynthese wurde in vitro und in vivo untersucht. Es wurde nachgewiesen, dass sowohl in isolierten Thylakoiden, als auch in intakten Algen eine Vorinkubation der Anti-Diuron-Antikörper mit Diuron zur Inaktivierung seiner Photosynthese-hemmenden Wirkung führt. Wurde der Elektronentransport in den isolierten Thylakoiden oder in Algen durch Diuron unterbrochen, so führte die Zugabe der Anti-Diuron-Antikörper zur Reaktivierung der Elektronenübertragung. N2 - Attempts to produce catalytic antibodies for hydrolysis of arylcarbamates and arylureas: The aim of the investigations was to produce antibodies which are able to cleave herbicides resistant to naturally occuring enzymes. Structurally similar carbamate and urea derivatives were chosen for the experiments. Phosphonate derivatives were synthesized that mimick possible transition state analogues in structure and charge. Mice were immunized with 4 different derivatives after conjugating them to carrier proteins. 32 hybridomas were established that produce monoclonal antibodies binding to these derivatives. The possible cleavage of substrates was determined by immunoassays with monoclonal antibodies against the substrate and the products and with a photometric method based on dimethylaminocinammonaldehyde. The measuring of cleavage products was succeeded by an amperometric method. The enzyme sensor was based on immobilized tyrosinase which oxidizes p-chlorophenol and phenol. The antibodies N1-BC1-D11, N1-FA7-C4, N1-FA7-D12 und R3-LG2-F9 hydrolysed the benzylphenylcarbamates POCc18, POCc19 und Substance 27. The hydrolytic activity of these antibodies was also succeeded with HPLC. The catalytic antibody N1-BC1-D11 was investigated kinetically and thermodynamically. A Michaelis-Menten-Kinetic was observed (at pH 8.0 exhibited a Km 210 µM, a vmax 3 mM/min and a kcat 222 min-1). These values are in the range of the values obtained for the antibody-catalysed hydrolysis of diphenylcarbamates. The rate enhancement of N1-BC1 was 10. The reaction was completely inhibited by stoichiometric quantities of the transition state analogue Hei3. This is consistent with the affinity of the abzyme to Hei3 of 2.6 nM, determined by BIAcore assay. Only antibodies generated against Hei3 showed hydrolytic activity. The hydrolysis of benzylphenylcarbamates presumably occurs via an addition-elimination-Mechanism involving a tetrahedral intermediate. In summary, this work presents the first example of antibody-catalysed hydrolysis of benzylphenylcarbamates. Monoclonal anti-diuron antibodies were generated that bind to the herbicide diuron with an extremely low equilibrium dissociation constant. A sensitive immunoassay with a low detection limit of 0.2 nM for diuron was established. This is the most sensitive immunological method for detection of diuron known so far. These antibodies were also used in vitro and in vivo to prevent diuron-dependent inhibition of photosynthesis or to restore photosynthesis after inhibition. In isolated thylakoids prepared from spinach leaves (Spinacia oleracea L.) the diuron-inhibited Hill reaction was reconstituted immediately following the addition of the monoclonal antibodies. In an in vivo approach the photosynthetic oxygen evolution of the cell wall deficient mutant (cw 15) of the green alga Chlamydomonas reinhardtii Dangeard was monitored. The antibodies prevented the diuron-dependent inhibition of photosynthesis and restored photosynthesis after inhibition. Transgenic plants that synthesize and accumulate these antibodies or antibody fragments and are therefore diuron-resistant can be created. KW - katalytische Antikörper KW - Arylcarbamate KW - Arylharnstoffe KW - monoklonale Antikörper KW - Haptene KW - Diuron KW - Anti-Diuron-Antikörper KW - Herbizide KW - Photosynthese KW - catalytic antibodies KW - arylcarbamates KW - arylureas KW - monoclonal antibodies KW - haptens KW - diuron KW - anti-diuron-antibodies KW - herbicides KW - photosynthesis Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0000463 ER - TY - THES A1 - Brandt, Stephan Peter T1 - Zelltyp-spezifische Mikroanalyse von Arabidopsis thaliana-Blättern N2 - Im ersten Teil der Arbeit wurden Strategien zur Analyse von Transkripten erarbeitet. Die ersten Versuche zielten darauf ab, in mit Glaskapillaren genommenen Einzelzellproben verschiedener Gewebeschichten RT-PCR durchzuführen, um spezifische Transkripte nachweisen zu können. Dies gelang für eine Reihe von Genen aus verschiedenen Pflanzenspezies. Dabei konnten sowohl Transkripte stark wie auch schwach exprimierter Gene nachgewiesen werden. Für die Erstellung von Gewebe-spezifischen Expressionsprofilen war es notwendig, die in vereinigten Zellproben enthaltene mRNA zunächst zu amplifizieren, um eine ausreichende Menge für Arrayhybridisierungen zu erhalten. Vor der Vermehrung wurde die mRNA revers transkribiert. Es wurden daran anschließend verschiedene Amplifikationsstrategien getestet: Die neben Tailing, Adapterligation und anderen PCR-basierenden Protokollen getestete Arbitrary-PCR hat sich in dieser Arbeit als einfache und einzige Methode herausgestellt, die mit so geringen cDNA-Mengen reproduzierbar arbeitet. Durch Gewebe-spezifische Array-hybridisierungen mit der so amplifizierten RNA konnten schon bekannte Expressionsmuster verschiedener Gene, vornehmlich solcher, die an der Photosynthese beteiligt sind, beobachtet werden. Es wurden aber auch eine ganze Reihe neuer offensichtlich Gewebe-spezifisch exprimierter Gene gefunden. Exemplarisch für die differentiell exprimierten Gene konnte das durch Arrayhybridisierungen gefundene Expressionsmuster der kleinen Untereinheit von Rubisco verifiziert werden. Hierzu wurden Methoden zum Gewebe-spezifischen Northernblot sowie semiquantitativer und Echtzeit-Einzelzell-RT-PCR entwickelt. Im zweiten Teil der Arbeit wurden Methoden zur Analyse von Metaboliten einschließlich anorganischer Ionen verwendet. Es stellte sich heraus, daß die multiparallele Methode der Gaschromatographie-Massenspektrometrie keine geeignete Methode für die Analyse selbst vieler vereinigter Zellinhalte ist. Daher wurde auf Kapillarelektrophorese zurückgegriffen. Eine Methode, die mit sehr kleinen Probenvolumina auskommt, eine hohe Trennung erzielt und zudem extrem geringe Detektionslimits besitzt. Die Analyse von Kohlenhydraten und Anionen erfordert eine weitere Optimierung. Über UV-Detektion konnte die K+-Konzentration in verschiedenen Geweben von A. thaliana bestimmt werden. Sie lag in Epidermis und Mesophyll mit ca. 25 mM unterhalb der für andere Pflanzenspezies (Solanum tuberosum und Hordeum vulgare) publizierten Konzentration. Weiter konnte gezeigt werden, daß zwölf freie Aminosäuren mittels einer auf Kapillarelektrophorese basierenden Methode in vereinigten Zellproben von Cucurbita maxima identifiziert werden konnten. Die Übertragung der Methode auf A. thaliana-Proben muß jedoch weiter optimiert werden, da die Sensitivität selbst bei Laser induzierter Fluoreszenz-Detektion nicht ausreichte. Im dritten und letzten Teil der Arbeit wurde eine Methode entwickelt, die die Analyse bekannter wie unbekannter Proteine in Gewebe-spezifischen Proben ermöglicht. Hierzu wurde zur Probennahme mittels mechanischer Mikrodissektion eine alternative Methode zur Laser Capture Microdissection verwendet, um aus eingebetteten Gewebeschnitten distinkte Bereiche herauszuschneiden und somit homogenes Gewebe anzureichern. Aus diesem konnten die Proteine extrahiert und über Polyacrylamidgelelektrophorese separariert werden. Banden konnten ausgeschnitten, tryptisch verdaut und massenspektrometrisch die Primärsequenz der Peptidfragmente bestimmt werden. So konnten als Hauptproteine im Mesophyll die große Untereinheit von Rubisco sowie ein Chlorophyll bindendes Protein gefunden werden. Die in dieser Arbeit entwickelten und auf die Modellpflanze Arabidopsis thaliana angewandten Einzelzellanalysetechniken erlauben es in Zukunft, physiologische Prozesse besser sowohl räumlich als auch zeitlich aufzulösen. Dies wird zu einem detaillierteren Verständnis mannigfaltiger Vorgänge wie Zell-Zell-Kommunikation, Signalweiterleitung oder Pflanzen-Pathogen-Interaktionen führen. N2 - The subject of this thesis was the analysis of single plant cells in respect to their contents of i) transcripts, ii) inorganic cations and anions, iii) metabolites like amino acids and carbohydrates as well as iv) proteins. One task was the transfer of existing methods to single cell analysis on leaf tissues of the model plant Arabisopsis thaliana L., the second one was the refinement and the development, respectively, of new protocols for the analysis of such picoliter samples. For cell type specific sampling two different complimentary methods were applied: Using micro glass capillaries specific single cell contents could be harvested from intact plants, whereas typical sample volumes were in the picoliter range. Even the sampling of inner cell types such as companion cells could be demonstrated. Using mechanical micro dissection of embedded tissue a larger amount of homogenous tissue could be collected. Because single cell samples contain only femtogram amounts of mRNA, direct detection of transcripts is impossible. Therefore, two amplification protocols were applied to the cell samples: The first procedure makes use of specifically primed RT-PCR for amplification. Several genes derived from different plants and tissues could be detected after successful RT-PCR, including high as well as low expressed genes. The second method was developed to monitor the activity of many genes in parallel using array hybridisation with filters containing the cDNA of as many as 16.000 ESTs. For this purpose, unspecific RT-PCR as it is applied in the differential display was used to amplify different transcripts in just one reaction. However, in these tissue specific array hybridisations the expression patterns of several hundreds genes could be monitored. These included known tissue specific expression patterns (of mainly photosynthesis related genes) as well as a couple of unknown expression patterns. To verify the tissue specificity of gene activity some results were reconsidered using tissue specific northern blot hybridisations and real time RT-PCR, respectively. Secondly, metabolites (including inorganic ions) were investigated: Because gas chromatography-mass spectrometry does not reveal the sensitivity which in necessary for the analysis of even multiple pooled single cell samples capillary electrophoresis was applied for these studies. This method has a high potential as it needs only small amounts of starting material, has uncomparable low detection limits and exhibits a high number of theoretical plates. The analysis of inorganic anions and carbohydrates needs further optimisations. Using UV absorption-detection potassium could be detected in different cell types whereas the concentrations in mesophyll and epidermis were found around 25 mM each. These concentrations are lower than in other species as Solanum tuberosum or Hordeum vulgare. For investigations of amino acids the cell samples were derivatized to make the use of laser induced fluorescence-detection capable. In samples derived from pumpkin (Cucurbita maxima) mesophyll twelve amino acids could be detected and identified. The transfer of this method to A. thaliana derived samples exhibited no results which may be due to the low concentration of free amino acids in these plants. Finally, a method was developed with which the existence of known and unknown proteins in tissue specific samples could be monitored. For this, mechanical micro dissection was used to: After embedding and sectioning the tissue of interest was cut out by an vibrating steel chisel to get homogenous samples. The proteins contained in these tissue pieces were extracted and separated by one dimensional SDS polyacrylamid gel electrophoresis. Several protein bands could be detected after staining with either silver or coomassie blue stain. These bands were cut out and sequenced by mass spectrometry. The large subunit of rubisco as well as one chlorophyll binding protein could be identified as the major proteins within the mesophyll. The single cell analysis methods which were developed and applied to the model plant A. thaliana in this thesis allow a better spatial as well as temporal resolution of analysis. This will lead to a more detailed understanding of physiological processes like cell to cell communication, signalling or plant-pathogen interactions. KW - Einzelzellanalytik KW - minimal invasive Probennahme KW - Array Hybridisierung KW - RT-PCR KW - Kapillarelektrophorese KW - Fluoreszeinisothiocyanat KW - mechanische Mikrodis KW - single cell analysis KW - minimal invasive sampling KW - single cell sammpling and analysis (SCSA) KW - array hybridisation KW - RT-PCR KW - capillary electrophoresis KW - fl Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0000410 ER -