TY - THES
A1 - Kobabe, Svenja
T1 - Charakterisierung der mikrobiellen Lebensgemeinschaft eines sibirischen Permafrostbodens
T1 - Characterisation of microbial community composition of a Siberian tundra soil
N2 - Die vorliegende Arbeit wurde im Rahmen des multidisziplinären Deutsch-Russischen Verbundprojektes "Laptev See 2000" erstellt. Die dargestellten bodenkundlichen und mikro-biologischen Untersuchungen verfolgten das Ziel die mikrobielle Lebensgemeinschaft eines Permafrostbodens im sibirischen Lena Delta zu charakterisieren, wobei den methanogenen Archaea besondere Beachtung zukam. Die Probennahme wurde im August 2001 im zentralen Lenadelta, auf der Insel Samoylov durchgeführt. Das Delta liegt im Bereich des kontinuierlichen Permafrostes, was bedeutet, dass nur eine flache saisonale Auftauschicht während der Sommermonate auftaut. Das untersuchte Bodenprofil lag im Zentrum eines für die Landschaft repräsentativen Low Center Polygons. Zum Zeitpunkt der Beprobung betrug die Auftautiefe des untersuchten Bodens 45 cm.. Der Wasserstand lag zum Untersuchungszeitpunkt 18 cm unter der Geländeoberfläche, so dass alle tiefer liegenden Horizonte durch anaerobe Verhältnisse charakterisiert waren. Die Untersuchung der bodenkundlichen Parameter ergab unter anderem eine mit zunehmender Tiefe abnehmende Konzentration von Kohlenstoff und Stickstoff, sowie eine Abnahme von Temperatur und Wurzeldichte. Um die Auswirkungen der sich mit der Tiefe verändernden Bodeneigenschaften auf die Mikroorganismen zu ermitteln, wurden die Mikroorganismenpopulationen der verschiedenen Bodentiefen mit Hilfe der Fluoreszenz in situ Hybridisierung hinsichtlich ihrer Anzahl, Aktivität und Zusammensetzung beschrieben. Für die Charakterisierung des physiologischen Profils dieser Gemeinschaften, bezüglich der von ihr umsetzbaren Kohlenstoffverbindungen, wurden BIOLOG Mikrotiterplatten unter den in situ Bedingungen angepassten Bedingungen eingesetzt. Die sich im Profil verändernden Bodenparameter, vor allem die abnehmende Substratversorgung, die geringe Temperatur und die anaeroben Verhältnisse in den unteren Bodenschichten führten zu einer Veränderung der Mikroorganismenpopulation im Bodenprofil. So nahm von oben nach unten die Gesamtanzahl der ermittelten Mikroorganismen von 23,0 × 108 auf 1,2 × 108 Zellen g-1 ab. Gleichzeitig sank der Anteil der aktiven Zellen von 59% auf 33%. Das bedeutet, dass im Bereich von 0-5 cm 35mal mehr aktive Zellen g-1 als im Bereich von 40-45 cm gefunden wurden. Durch den Einsatz spezieller rRNS-Sonden konn-te zusätzlich eine Abnahme der Diversität mit zunehmender Bodentiefe nachgewiesen werden. Die geringere Aktivität der Population in den unteren Horizonten sowie die Unterschiede in der Zusammensetzung wirkten sich auf den Abbau der organischen Substanz aus. So wur-den die mit Hilfe der BIOLOG Mikrotiterplatten angebotenen Substanzen in größerer Tiefe langsamer und unvollständiger abgebaut. Insbesondere in den oberen 5 cm konnten einige der angebotenen Polymere und Kohlehydrate deutlich besser als im restlichen Profil umge-setzt werden. Das außerdem unter anaeroben Versuchsbedingungen diese Substrate deutlich schlechter umgesetzt wurden, kann so interpretiert werden, dass die konstant anaeroben Bedingungen in den unteren Horizonten ein Auftreten der Arten, die diese Substrate umset-zen, erschweren. Die in den oberen, aeroben Bodenabschnitten wesentlich höheren Zellzahlen und Aktivitäten und die dadurch schnellere C-Umsetzung führen auch zu einer besseren Substratversorgung der methanogenen Archaea in den makroskopisch aeroben Horizonten. Die erhöhte Substratverfügbarkeit erklärt die Tatsache, dass im Bereich von 0-5 cm die meisten methanogenen Archaea gefunden wurden, obwohl sich dieser Bereich zum Zeitpunkt der Probennahme oberhalb des wassergesättigten Bodenbereichs befand. Trotz der aeroben Bedingungen in, liegt im Bereich von 5 10 cm die für die methanogenen Archaea am besten geeignete Kombination aus Substratangebot und anaeroben Nischen vor. Hinzu kommt, dass in diesen Tiefen die Sommertemperaturen etwas höher liegen als in den tieferen Horizonten, was wiederum die Aktivität positiv beeinflusst. Bei zusammenfassender Betrachtung der Untersuchungsergebnisse von Anzahl, Aktivität, Zusammensetzung und Leistung der gesamten, aber im besonderen auch der methanogenen Mikroorganismenpopulation wird deutlich, dass in dem untersuchten Bodenprofil unter ökologischen Gesichtspunkten die oberen 15-20 cm den für den C-Umsatz relevantesten Bereich darstellen. Das Zusammenspiel wichtiger Bodenparameter wie Bodentemperatur, Wasserstand, Nährstoffversorgung und Durchwurzelung führt dazu, dass in dem untersuchten Tundraboden in den oberen 15-20 cm eine wesentlich größere und diversere Anzahl an Mikroorganismen existiert, die für einen schnelleren und umfassenderen Kohlenstoffumsatz in diesem Bereich des active layers sorgt.
N2 - The soil characteristics and the bacterial community of the active layer (0-45 cm) of a permafrost affected tundra soil were analysed. The composition of the bacterial community was investigated by fluorescence in situ hybridisation (FISH) while BIOLOG Ecoplates were used to characterize microbial communities by determining the ability of the communities to oxidize various carbon sources. Arctic tundra soils contain large amounts of organic carbon, accumulated in thick soil layers and are known as a major sink of atmospheric CO2. These soils are totally frozen throughout the year and only a thin active layer is unfrozen and shows biological activity during the short summer. To improve the understanding of how the carbon fluxes in the active layer are controlled, detailed analysis of composition, functionality and interaction of soil microorganisms was done. The FISH analyses of the active layer showed large variations in absolute cell numbers and in the composition of the active microbial community between the different horizons, which is caused by the different environmental conditions (e.g. soil temperature, amount of organic matter, aeration) in this vertically structured ecosystem. Results obtained by universal protein stain 5-(4,6-dichlorotriazin-2-yl)aminofluorescein (DTAF) showed an exponential decrease of total cell counts from the top to the bottom of the active layer (2.3 × 109 to 1.2 × 108 cells per g dry soil). By using FISH, up to 59% of the DTAF-detected cells could be detected in the surface horizon, and up to 84% of these FISH-detected cells could be affiliated to a known phylogenetic group. With increasing depth the amount of FISH-detectable cells decreased as well as the diversity of ascertained phylogenetic groups. The turnover of substrates offered on the BIOLOG Ecoplates was slower and less complete in the deeper soil horizons. Especially in the upper 5 cm the turnover of some of the polymeric substances and some carbohydrates was much better than in deeper parts of the soil. The interaction of important soil parameters (water table, nutrient availability, roots) leads to a larger and more diverse community in the upper 20 cm of the soil, which again cause a faster and more complete turnover in this part of the active layer.
KW - Mikrobiologie
KW - Angewandte Mikrobiologie
KW - Bodenmikrobiologie
KW - Methanemission
KW - Dauerfrostboden
KW - Sibirien
KW - Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung
KW - Len
KW - Microbiology
KW - Soil
KW - methane
KW - Siberia
Y1 - 2005
U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-5467
ER -
TY - THES
A1 - Marschan, Xenia
T1 - Mikroarray-basierte Detektion von mRNA aus Zellen mittels On-Chip-PCR
T1 - Microarray based detection of cellular mRNA by On-Chip-PCR
N2 - Bei konventionellen Mikroarray-Experimenten zur Genexpressionsanalyse wird fluoreszenz- oder radioaktiv-markierte cDNA oder RNA mit immobilisierten Proben hybridisiert. Für ein gut detektierbares und auswertbares Ergebnis werden jedoch pro Array mindestens 15 - 20 µg Hybridisierungstarget benötigt. Dazu müssen entweder 15 - 20 µg RNA direkt durch Reverse Transkription in markierte cDNA umgeschrieben werden oder bei Vorhandensein von weniger Startmaterial die RNA amplifiziert werden (Standard- Affymetrix-Protokolle, Klur et al. 2004). Oft sind damit zeit- und kostenintensive Probenpräparationen verbunden und das Ergebnis ist nicht immer reproduzierbar. Obwohl es inzwischen einige Protokolle gibt, die dieses Problem zu lösen versuchen (Zhang et al. 2001, Iscove et al. 2002, McClintick et al. 2003, Stirewalt et al. 2004), eine optimale, leicht handbare und reproduzierbare Methode gibt es weiterhin nicht, weshalb in dieser Arbeit ein weiterer Lösungsansatz gesucht wurde. In der vorgestellten Arbeit werden zwei einfache Methoden beschrieben, mit denen Gene aus geringen RNA-Mengen nachgewiesen werden können: erstens die On Chip- RT-PCR mit cDNA als Matrize und zweitens diese Methode als One-Step-Reaktion mit RNA als Matrize. Beide Methoden beruhen auf dem Prinzip der PCR an immobilisierten Primern auf einer Chipoberfläche. Diese Möglichkeit der exponentiellen Amplifikation ist reproduzierbar und sensitiv. In Experimenten zur Etablierung des On-Chip-PCR-Systems wurden für die Immobilisierung der Primer verschiedene Kopplungsmethoden verwendet. Die affine Kopplung über Biotin- Streptavidin erwies sich als geeignet. Die On-Chip-Reaktion an kovalent gebundenen Primern wurde für amino-modifizierte Primer auf Epoxy-Oberflächen sowie für EDC-Kopplung auf silanisierten Oberflächen gezeigt. Für die letztgenannte Methode wurde die On-Chip-PCR optimiert, dass Spottingkonzentrationen der Primer von 5 - 10µM schon ausreichend sind. Der Einsatz von fluoreszenz-markierten Primern während der PCR ermöglicht eine unmittelbare Auswertung nach der Synthese ohne zusätzliche Detektionsschritte. In dieser Arbeit konnte außerdem mit der vorgestellten Methode der simultane Nachweis zweier Gene gezeigt werden. Die Methode kann noch als Multiplex-Analyse ausgebaut werden, um so mehrere Gene in gleichzeitig einem Ansatz nachweisen zu können. Die Ergebnisse der Versuche mit Matrizen aus unterschiedlichen Zelltypen deuten darauf hin, dass die On-Chip-RT-PCR eine weitere optimale Methode für den Nachweis von gering exprimierten Genen bietet.
N2 - The detection of low quantities of mRNA is often difficult and methods like microarray analysis require large amount of starting material or have to be amplified before application. The reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) is often the chosen method to detect specific RNA sequences on account of its high sensitivity. The solid phase amplification technology by On-Chip-PCR provides a combination of amplification of rare target material and its on chip detection in one step. In this report a novel application for the On-Chip-PCR technology is described. It was suitable to identify mRNA sequences and genes, respectively. For this approach we amplified cDNA sequences using immobilized specific primers and fluorescent labeled primers. They were used for genes coding subunits of the mouse muscle acetylcholine receptor (Chrna1, Chrnb1, Chrnd) and the genes coding for myogenin (Myog), muscle creatine kinase (Ckmm) and Atpase (Atp2a2). The cDNA templates were synthesized before the On-Chip application by Reverse Transcription from mRNA. For this application only at most 500 pg of total-RNA preparation was sufficient for detectable results and no pre-amplification steps were needed. Furthermore the handling of RT-PCR could be minimized by using a One-step- RT-PCR protocol. This method used immobilized primers on glassy supports detecting specific mRNA sequences from 5 pg or less of total RNA preparations. Moreover to the detection of low quantities of RNA preparation, low abundant genes could be detected by this method.
KW - Polymerase-Kettenreaktion
KW - Microarray
KW - Messenger-RNS
KW - Genexpression
KW - On-Chip-PCR
KW - mRNA
KW - Reverse Transkription
KW - RT-PCR
KW - On-Chip-PCR
KW - mRNA
KW - Reverse Transcription
KW - RT-PCR
Y1 - 2005
U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-5457
ER -
TY - THES
A1 - Himmel, Mirko
T1 - Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen und der in vivo Phosphorylierung des Sarkomerproteins Myomesin
T1 - Analysis of Protein-Protein Interactions and in vivo Phosphorylation of the Sarcomeric Protein Myomesin
N2 - Für ein tiefergehendes Verständnis von Entwicklung und Funktion der quergestreiften Muskulatur ist eine Betrachtung der am Aufbau der Myofibrillen, den kontraktilen Organellen, beteiligten Proteine essentiell. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit Myomesin, einem Protein der sarkomeren M-Bande. Zunächst wurde die cDNA des humanen Myomesins vollständig kloniert, sequenziert und nachfolgend die komplette Größe der aminoterminalen Kopfdomäne bestimmt. Es konnte gezeigt werden, daß Myomesin in vitro mit den Domänen 1 und 12 an Myosin bindet. Die muskelspezifische Isoform der Kreatinkinase bindet an die Domänen 7 und 8. Stimulations- und Inhibitionsexperimente belegen, daß Myomesin an Serin 618 in vivo durch die Proteinkinase A phosphoryliert wird und daß diese Phosphorylierung durch Aktivierung beta2-adrenerger Rezeptoren stimulierbar ist. In Muskelgewebeproben von Patienten, die an der Hypertrophen Kardiomyopathie, einer genetisch bedingten Herzmuskelkrankheit, erkrankt sind, konnte mit einem neu hergestellten phosphorylierungsabhängigen Antikörper eine Verminderung der Menge phosphorylierten Myomesins nachgewiesen werden. Mögliche Ursachen werden diskutiert. Myomesin bildet Dimere, wie durch hefegenetische und biochemische Experimente gezeigt werden konnte. Die Dimerisierung von Myomesin könnte eine zentrale Rolle für den Einbau der Myosinfilamente in die naszierende Myofibrille haben. Anhand der gewonnenen Daten wurde ein verbessertes Modell der zentralen M-Bande erstellt.
N2 - A deep understanding of the development and function of the sarcomeric muscle depends on the careful study of proteins involved in the assembly of myofibrills, the contractile organelles in cross-striated muscle. This thesis deals with the sarcomeric M-band protein myomesin. First, the complete cDNA of human myomesin was cloned, sequenced, and subsequently the size of the aminoterminal head domain of myomesin was determined. Myomesin binds to myosin in vitro via domains 1 and 12. Musclespecific creatine kinase is binding to the domains 7 and 8 of myomesin. Stimulation and inhibition experiments revealed, that serin 618 in human myomesin is phosphorylated in vivo by protein kinase A and that this phosphorylation can be stimulated by activation of beta2-adrenergic receptors. In muscle tissue of patients showing symptoms of the hypertrophic cardiomyopathy, a cardiac disease caused by genetic defects, the amount of phosphorylated myomesin was lowered as detected by a phosphospecific antibody which was established new. Myomesin dimerizes as shown by yeast two hybrid and biochemical experiments. Myomesin dimerization could be a central point in myofibrillogenesis, when myosin filaments were incorporated in nascent myofibrills. Taking all the data together, an improved model of the central M-band was developed.
KW - Proteine
KW - Myofibrille
KW - Sarkomer
KW - Phosphorylierung
KW - M-Bandenmodell
KW - PKA
KW - M-band model
KW - PKA
Y1 - 2004
U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-5153
ER -
TY - THES
A1 - Baufeld, Ralf
T1 - GIS-gestützte Prognose der Biotopentwicklung auf Grundlage von Biotoptypen- und Vegetationserhebungen auf geplanten Rückdeichungsflächen an der Mittleren Elbe in Sachsen-Anhalt
T1 - GIS supported forecast of biotope development based on investigations of biotopes and vegetation on planned areas for setting back dykes at the Middle Elbe in Saxony-Anhalt
N2 - Durch die anthropogene Nutzung sind viele Auen in Mitteleuropa verändert worden, wobei insbesondere die Retentionsflächen stark verringert wurden. Während Auen seit längerem im Fokus der wissenschaftlichen Bearbeitung stehen, gibt es bisher große Wissensdefizite in der Frage der Auenreaktivierungen. Zum einen sind derartige Projekte bisher kaum verwirklicht und zum anderen ist ein langfristiges Monitoring notwendig, um die Anpassung von Biozönosen an die veränderten Standortbedingungen beobachten zu können. Um die Folgen derartiger Eingriffe zu analysieren, bieten sich computergestützte Modellierungen der Landschaftsentwicklung an, wie sie in der vorliegenden Arbeit verwirklicht wurden. Ziel der Arbeit war, mit Hilfe eines Geografischen Informationssystems (GIS) das Entwicklungspotenzial der Landschaft bei verschiedenen Rückdeichungsvarianten auf der Ebene der Biotoptypen darzustellen. Dabei ging es nicht um die Erstellung eines allgemein gültigen Auenmodells sondern um die Erarbeitung eines Modells für einen konkreten Anwendungsfall. Der erarbeitete Ansatz sollte zudem für die landschaftsplanerische Praxis geeignet sein. Als Beispielgebiete wurden Flächen an der Mittleren Elbe bei Rogätz und Sandau, beide im nördlichen Teil von Sachsen-Anhalt, ausgewählt. Die vorliegende Arbeit gliedert sich in zwei Teile. Im ersten Teil werden Erhebungen und Auswertungen als Grundlage der Modellentwicklung dargestellt. Dazu wurden die Biotoptypen der Beispielgebiete flächendeckend erhoben und mit punktuellen Vegetationserhebungen ergänzt. Aus dem Forschungsprojekt "Rückgewinnung von Retentionsflächen und Altauenreaktivierung an der Mittleren Elbe in Sachsen-Anhalt" des Bundesministeriums für Bildung und Forschung (BMBF) standen standortökologische Daten der Hydrologie und Bodenkunde zur Verfügung. Ziel der Auswertung war, Schlüsselfaktoren für Hydrologie und Bodenbedingungen innerhalb der rezenten Aue zu identifizieren, die zur Ausprägung bestimmter Biotoptypen führen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde ein Modell für Biotoptypenpotenziale auf den geplanten Rück–deichungsflächen entwickelt. Das Modell bearbeitet die Datenbank der verwendeten GIS-Dateien, die auf Daten zum Bestand beruht und um solche der Prognose der Standortökologie (Hydrologie und Boden) im Rückdeichungsfalle aus dem BMBF-Projekt erweitert wurde. Weitere Voraussetzung für die Modellierung war die Erarbeitung von Leitbildern, in denen unterschiedliche Nutzungsszenarios für die Landschaft nach Deichrückverlegung hypothetisch festgelegt wurden. Insbesondere die Nutzungsintensität wurde variiert, von einer Variante intensiver land- und forstwirtschaftlicher Nutzung über sogenannte integrierte Entwicklungsziele aus dem BMBF-Projekt bis hin zu einer Variante der Naturschutznutzung. Zusätzlich wurde eine zukünftige Potentielle Natürliche Vegetation modelliert. Eine Überprüfung des Modell fand für den Raum der rezenten Aue in der intensiven Nutzungsvariante statt, die der gegenwärtigen Nutzung am nächsten kommt. Werden Informationen des Bestandsbiotoptyps als Korrekturgröße in das Modell einbezogen, konnte für viele Biotoptypen eine Trefferquote von über 90 % erreicht werden. Bei flächenmäßig weniger bedeutenden Bio–toptypen lag dieser Wert aufgrund der schmaleren Datenbasis zwischen 20 und 40 %. Als Ergebnis liegt für unterschiedliche Deichvarianten und Leitbilder in den Beispielgebieten die Landschaftsentwicklung als Biotoppotenzial vor. Als eine vereinfachte Regionalisierung der punktuellen Vegetationsdaten wurde im Modell geprüft, inwieweit die modellierten Biotopflächen der Charakteristik der pflanzensoziologischen Aufnahmen aus der rezenten Aue entsprechen. In dem Falle wurde die Pflanzengesellschaft der jeweiligen ökologisch im Rahmen der Untersuchung einheitlichen Flächeneinheit zugeordnet. Anteilig lässt sich damit die Biotopprognosefläche pflanzensoziologisch konkretisieren. Die vorliegende Arbeit gehört zu den bisher wenigen Arbeiten, die sich mit den Folgen von Auenreaktivierung auf die Entwicklung der Landschaft auseinandersetzen. Sie zeigt eine Möglichkeit auf, Prognosemodelle für Biotoptypen und Vegetation anhand begrenzter Felduntersuchungen zu entwerfen. Derartige Modelle können zum Verständnis von Eingriffen in den Naturhaushalt, wie sie die Deichrückverlegungen darstellen, beitragen und eine Folgenabschätzung unterstützen.
N2 - Most of the floodplains in Central Europe are highly altered by man. In particular, recent inundation areas have been dramatically reduced. Before the Elbe-flood-disaster of the year 2002 there had already been considerations about combining flood-protection and restoration of floodplains. While research has focused on floodplains for a considerable time, knowledge on the reactivation of floodplains is still significantly lacking. Until now, only a few projects have been realized, and there has not been enough long-term moni–toring of the adaption of habitats to changing conditions. Computerized models of landscape development, as utilized in the presented work, can help to address these questions. The aim of the study was to show the potential development of the landscape on the scale of biotopes under different scenarios of floodplain expansion by application of a geographic information system (GIS). It was not intended to create a general floodplain-model. The model aimed at a specific applied case and should also be applicable for questions of landscape planning. Two areas near the villages of Sandau and Rogätz at the Middle Elbe River in the north of the German federal state of Saxony-Anhalt were selected. The presented work is divided into two parts. The first describes the sampling and evaluation of data as a basis for modeling. For this, the biotopes were mapped in total in the two study areas. Additionally, vegetation data were collected from selected sites mainly in the grassland and forest-biotopes. Hydrological and soil condition data were available through the project "Rückgewinnung von Retentionsflächen und Altauenreaktivierung an der Mittleren Elbe in Sachsen-Anhalt" of the German Ministry of Education and Science (BMBF). This part of the study aimed to identify the ecological key factors in the recent floodplain that lead to the development of the different biotopes. In the second part of the presented work a model for the potential biotopes on the expanded floodplain after setting back the dikes was developed. The model alters the GIS database and adds a potential biotope. First this database must be expanded to integrate the hydrological and soil data of the BMBF-project for the expanded floodplain. Different hypo–thetical land use scenarios were assumed and applied to the model. The three different variants of land use adapted from the BMBF-project were intensive land use, land use under conditions of nature-conservation an integration of both extremes. In the case of intensive land –use arable fields were modeled in areas which are flooded on average only every ten years or less. As a fourth scenario the potential natural vegetation was modeled. An evaluation of the model was made for the recent floodplain under intensive land use conditions, which are close to the current land use. By correcting the models results with information of the current biotope composition, many biotopes could be predicted correctly with 90 % accuracy. For biotopes which are rare in the study area the prediction rate lay between 20 and 40 %. The result of the second part of the presented work was the modeling of the potential biotopes for the different land use scenarios and the different variants of setting back the dikes. Integrated in the model was a module of a simplified regionalization of the vegetation data. It was tested whether the characteristics of the processed unit of the GIS-database fit the results of the vegetation sampling of the first part of the study. Where this was the case, the whole unit was characterized as a phytosociologic vegetation-unit. Thus, for part of the modeling area the biotope-potentials could be expanded with information on the actual vegetation. The present work is one of the few studies so far dealing with the consequences for the landscape of reactivating floodplains which are separated from rivers by dikes. It shows the possibility to use models to predict changes in biotopes and vegetation based on limited field data. Such models can help to understand the altering of nature caused by such impacts and to estimate the possible consequences.
KW - Modellierung
KW - Geoinformationssystem
KW - Vegetation
KW - Biotoptypen
KW - Deichrückverlegung
KW - Auenreaktivierung
KW - biotopes
KW - setting back dykes
KW - restoration of floodplains
Y1 - 2005
U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-2523
ER -
TY - THES
A1 - Gehmlich, Katja
T1 - Strukturen der Kraftübertragung im quergestreiften Muskel : Protein-Protein-Wechselwirkungen und Regulationsmechanismen
T1 - Structures of force transduction in cross-striated muscle tissues : protein-protein interactions and mechanisms of their regulation
N2 - Im Mittelpunkt dieser Arbeit standen Signaltransduktionsprozesse in den Strukturen der Kraftübertragung quergestreifter Muskelzellen, d. h. in den Costameren (Zell-Matrix-Kontakten) und den Glanzstreifen (Zell-Zell-Kontakten der Kardiomyozyten).Es ließ sich zeigen, dass sich die Morphologie der Zell-Matrix-Kontakte während der Differenzierung von Skelettmuskelzellen dramatisch ändert, was mit einer veränderten Proteinzusammensetzung einhergeht. Immunfluoreszenz-Analysen von Skelettmuskelzellen verschiedener Differenzierungsstadien implizieren, dass die Signalwege, welche die Dynamik der Fokalkontakte in Nichtmuskelzellen bestimmen, nur für frühe Stadien der Muskeldifferenzierung Relevanz haben können. Ausgehend von diesem Befund wurde begonnen, noch unbekannte Signalwege zu identifizieren, welche die Ausbildung von Costameren kontrollieren: In den Vorläuferstrukturen der Costamere gelang es, eine transiente Interaktion der Proteine Paxillin und Ponsin zu identifizieren. Biochemische Untersuchungen legen nahe, dass Ponsin über eine Skelettmuskel-spezifische Insertion im Carboxyterminus das Adapterprotein Nck2 in diesen Komplex rekrutiert. Es wird vorgeschlagen, dass die drei Proteine einen ternären Signalkomplex bilden, der die Umbauvorgänge der Zell-Matrix-Kontakte kontrolliert und dessen Aktivität von mitogen activated protein kinases (MAPK) reguliert wird.Die Anpassungsvorgänge der Strukturen der Kraftübertragung an pathologische Situtation (Kardiomyopathien) in der adulten quergestreiften Muskulatur wurden ausgehend von einem zweiten Protein, dem muscle LIM protein (MLP), untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass ein mutiertes MLP-Protein, das im Menschen eine hypertrophe Kardiomyopathie (HCM) auslöst, strukturelle Defekte aufweist und weniger stabil ist. Weiterhin zeigte dieses mutierte Protein eine verringerte Bindungsfähigkeit an die beiden Liganden N-RAP und alpha-Actinin. Die molekulare Grundlage der HCM-verursachenden Mutationen im MLP-Gen könnte folglich eine Veränderung der Homöostase im ternären Komplex MLP – N-RAP – alpha-Actinin sein. Die Expressionsdaten eines neu generierten monoklonalen MLP-Antikörpers deuten darauf hin, dass die Funktionen des MLP nicht nur für die Integrität des Myokards, sondern auch für die der Skelettmuskulatur notwendig sind.
N2 - The cell-matrix-contacts (costameres) and cell-cell-contacts (intercalated discs of cardiomyocytes) of cross-striated muscle cells transmit mechanical forces to the exterior. On top of this mechanical function, both structures have been implied to be involved in signal transduction processes.Dramatic morphological changes in the overall structure of cell-matrix-contacts of skeletal muscle cells were revealed during differentiation. Moreover, this reorganisation was accompanied by alterations in protein composition. Immunofluorescence microscopy indicated that signalling pathways which control the dynamics of focal contacts in non-muscle cells seem to be important only for early differentiation stages of skeletal muscle cells. To explore novel signalling pathways involved in regulating the formation of costameres, signalling molecules engaged were identified. Thus, paxillin and ponsin transiently interact at the precursors of costameres during muscle development. In addition, biochemical data indicate that a skeletal muscle specific module in the carboxyterminal part of ponsin can recruit the adapter protein Nck2 to this complex. Hence, the three proteins might form a ternary signalling complex involved in controlling the reorganisation of cell-matrix-contacts. Apparently, the activity of this signalling complex is regulated by mitogen activated protein kinases (MAPK).A second approach has focussed on adaptational processes of the same structures observed in pathological situations. In particular, the role of muscle LIM protein (MLP) in hypertrophic cardiomyopathy (HCM) was investigated. It was shown that a HCM-causing mutant MLP protein fails to fold properly and that the consequent loss of stability is reflected in altered binding properties: the mutant MLP protein shows decreased binding to both N-RAP and alpha-actinin. Hence, the molecular basis for HCM-causing mutations in the MLP gene might be an altered homeostasis of the ternary complex MLP – N-RAP – alpha-actinin. Increasing evidence indicates that the functions of MLP are required not only for the integrity of the myocardium. In addition, MLP seems to have regulatory functions in skeletal muscle tissues.
KW - Herzmuskelkrankheit
KW - Quergestreifte Muskulatur
KW - Protein-Protein-Wechselwirkung
KW - Phosphorylierung
KW - Costamer
KW - Fokalkontakt
KW - Zell-Matrix-Kontakt
KW - Ponsin
KW - Muscle LIM Protein (MLP)
KW - protein-protein interactions
KW - costamere
KW - focal adhesion
KW - ponsin
KW - cross-striated muscle cells
Y1 - 2004
U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-2576
ER -
TY - THES
A1 - Freiberg, Alexander
T1 - Das "Leucine-Rich Repeat" im Invasionsprotein Internalin B : Stabilität und Faltung eines Solenoidproteins
T1 - The leucine-rich repeat from internalin B : stability and folding of a solenoid protein
N2 - Für das Verständnis der Strukturbildung bei Proteinen ist es wichtig, allgemein geltende Prinzipien der Stabilität und Faltung zu verstehen. Bisher wurde viel Arbeit in die Erörterung von Gesetzmäßigkeiten zu den Faltungseigenschaften von globulären Proteinen investiert. Die große Proteinklasse der solenoiden Proteine, zu denen z. B. Leucine-Rich Repeat- (LRR-) oder Ankyrin-Proteine gehören, wurde dahingegen noch wenig untersucht. Die Proteine dieser Klasse sind durch einen stapelförmigen Aufbau von sich wiederholenden typischen Sequenzeinheiten gekennzeichnet, was in der Ausbildung einer elongierten Tertiärstruktur resultiert. In der vorliegenden Arbeit sollte versucht werden, die Stabilität und Faltung eines LRR-Proteins mittels verschiedener biophysikalischer Methoden zu charakterisieren. Als Untersuchungsobjekt diente die für die Infektion ausreichende zentrale LRR-Domäne des Invasionsproteins Internalin B (InlB241) des Bakteriums Listeria monocytogenes. Des weiteren sollten die Integrität und die Stabilitäts- und Faltungseigenschaften der sogenannten Internalin-Domäne (InlB321) untersucht werden. Hierbei handelt es sich um die bei allen Mitgliedern der Internalinfamilie vorkommende Domäne, welche aus einer direkten Fusion des C-terminalen Endes der LRR-Domäne mit einer Immunglobulin (Ig)-ähnlichen Domäne besteht. Von beiden Konstrukten konnte eine vollständige thermodynamische Charakterisierung, mit Hilfe von chemisch- bzw. thermisch-induzierten Faltungs- und Entfaltungsübergängen durchgeführt werden. Sowohl InlB241 als auch InlB321 zeigen einen reversiblen und kooperativen Verlauf der chemisch-induzierten Gleichgewichtsübergänge, was die Anwendung eines Zweizustandsmodells zur Beschreibung der Daten erlaubte. Die zusätzliche Ig-ähnliche Domäne im InlB321 resultierte im Vergleich zum InlB241 in einer Erhöhung der freien Enthalpie der Entfaltung (8.8 kcal/mol im Vergleich zu 4.7 kcal/mol). Diese Stabilitätszunahme äußerte sich sowohl in einer Verschiebung des Übergangsmittelpunktes zu höheren Guanidiniumchlorid-Konzentrationen als auch in einer Erhöhung der Kooperativität des Gleichgewichtsübergangs (9.7 kcal/mol/M im Vergleich zu 7.1 kcal/mol/M). Diese Beobachtungen zeigen dass die einzelnen Sequenzeinheiten der LRR-Domäne nicht unabhängig voneinander falten und dass die Ig-ähnliche Domäne, obwohl sie nicht direkt mit dem Wirtszellrezeptor während der Invasion interagiert, eine kritische Rolle für die in vivo Stabilität des Internalin B spielt. Des weiteren spiegelt die Kooperativität des Übergangs die Integrität der Internalin-Domäne wieder und deutet darauf hin, dass bei beiden Proteinen keine Intermediate vorliegen. Kinetische Messungen über Tryptophanfluoreszenz und Fern-UV Circulardichroismus deuteten auf die Existenz eines relativ stabilen Intermediates auf dem Faltungsweg der LRR-Domäne hin. Faltungskinetiken aus einem in pH 2 denaturierten Zustand zeigten ein reversibles Verhalten und verliefen über ein Intermediat. Eine Erhöhung der Salzkonzentration des sauer-denaturierten Proteins führte zu einer Kompaktierung der entfalteten Struktur und resultierte im Übergang zu einem alternativ gefalteten Zustand. Bei der Internalin-Domäne deuteten kinetische Messungen des Fluoreszenz- und Fern-UV Circulardichroismus-Signals während der Entfaltung möglicherweise auf die Präsenz von zwei Prozessen hin. Der erste langsame Entfaltungsprozess kurz nach dem Übergangsmittelpunkt zeigte eine starke Abhängigkeit von der Temperatur, während der zweite schnellere Prozess der Entfaltung stärker von der Guanidiniumchlorid-Konzentration abhing. Renaturierungskinetiken zeigten das Auftreten von mindestens einem Faltungsintermediat. Kinetische Daten aus Doppelsprungexperimenten lieferten für die Erklärung der langsamen Faltungsphase zunächst keinen Hinweis auf dass Vorliegen einer Prolinisomerisierungsreaktion. Die vollständige Amplitude während der Renaturierung konnte nicht detektiert werden, weswegen von einer zweiten schnellen Phase im Submillisekundenbereich ausgegangen werden kann. Die Ergebnisse der Faltungskinetiken zeigen, dass die InlB-Konstrukte als Modelle für die Untersuchung der Faltung von Solenoidproteinen verwendet werden können.
To understand the processes of protein structure formation, it is necessary to investigate protein stability and protein folding kinetics. The focus of many folding studies has been directed at small, globular proteins. The larger class of solenoid proteins, including leucine-rich repeat (LRR) and ankyrin proteins, has not been extensively investigated. These proteins contain tandem repeat motifs, and their tertiary structure consists of a regular linear array of modules that stack to form non-globular elongated or supercoiled structures. In the present work, the folding and stability of the central LRR domain of the invasion protein internalin B (InlB241) from the bacterium Listeria monocytogenes was characterized using different biophysical techniques. In addition, the integrity, stability and folding behavior of the so-called internalin-domain (InlB321) was investigated. In this single domain, which is found in all members of the internalin-family, an immunoglobulin (Ig)-like domain is directly fused to the C-terminal end of the LRR domain.
A complete thermodynamic characterization of the stability of both constructs was performed, using chemical- and temperature-induced folding and unfolding transitions. The reversible and cooperative equilibrium transition of InlB241 and InlB321 allowed the use of a two-state model for the description of the data points. The additional Ig-like domain present in InlB321 resulted in an increase of the unfolding free energy (8.8 kcal/mol compared to 4.7 kcal/mol). This resulted both, from a shift of the transition midpoint to higher denaturant concentration, and from an increase in the m-value, the denaturant dependence of the unfolding free energy (9.7 kcal/mol/M compared to 7.1 kcal/mol/M). These observations suggest that the unravelling of the individual structural repeats in the LRR region is a cooperative process and that the tight fusion with the Ig-like domain leads to a dramatically increased stability in vivo without interfering with the functionality of the protein. In addition, the cooperativity of the equilibrium transition reflects the integrity of the internalin-domain, and suggests that both InlB fragments unfold without significantly populated equilibrium intermediates.
Kinetic measurements with tryptophan fluorescence and far-UV circular dichroism are indicative for the existence of a relative stable intermediate on the folding pathway of the LRR domain. Refolding kinetics from an acid-denatured state showed a reversible behavior and passes off an intermediate. An increase in the salt concentration of the acid-denatured protein results in a transition of the unfolded structure to a compact and alternatively folded state. Unfolding kinetics of the internalin-domain measured by fluorescence and far-UV circular dichroism are indicative for the possible presence of two processes. The first slow unfolding process after the transition midpoint showed a strong dependence on temperature, whereas the second and faster unfolding process showed a stronger dependence on the denaturant concentration. Renaturation kinetics indicated the existence of at least one folding intermediate. Preliminary double-mixing experiments revealed no evidence for a rate-limiting proline isomerization reaction. It was not possible to detect the complete amplitude of the renaturation reaction, suggesting existence of a second faster phase occuring in the submillisecond range.
The results on folding kinetics prove the InlB constructs to be suitable models for the investigation of solenoid protein folding by techniques of high structural resolution.
Rückfaltung von BsPel, ausgehend vom guanidiniumchlorid-denaturierten Zustand, war bei kleinen Proteinkonzentrationen und niedrigen Temperaturen vollständig möglich. GdmCl-induzierte Faltungsübergänge waren aber nicht reversibel und zeigten eine apparente Hysterese. Kinetische Messungen des Fluoreszenz- und CD-Signals im fernen UV ergaben eine extreme Denaturierungsmittelabhängigkeit der Rückfaltungsrate im Bereich des Übergangmittelpunktes. Der extreme Abfall der Rückfaltungsraten mit steigender Denaturierungsmittelkonzentration kann als kooperative Entfaltung eines essentiellen Faltungsintermediats verstanden werden. Dieses Faltungsintermediat ist temperaturlabil und kann durch den Zusatz Glycerin im Renaturierungspuffer stabilisiert werden, wobei sich die Hysterese verringert, jedoch nicht vollständig aufgehoben wird. Durch reverse Doppelsprungexperimente konnten zwei transiente Faltungsintermediate nachgewiesen werden, die auf zwei parallelen Faltungswegen liegen und beide zum nativen Zustand weiterreagieren können. Fluoreszenzemissionsspektren der beiden Intermediate zeigten, daß beide schon nativähnliche Struktur aufweisen. Kinetische Daten von Prolin-Doppelsprungexperimenten zeigten, daß Prolinisomerisierung den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt in der Reaktivierung des denaturierten Enzyms darstellt. Desweiteren konnte durch Prolin-Doppelsprungexperimenten an Mutanten mit Substitutionen im Prolinrest 281 gezeigt werden, daß die langsame Renaturierung von BsPel nicht durch die Isomerisierung der einzigen cis-Peptidbindung an Prolin 281 verursacht wird, sondern durch die Isomerisierung mehrerer trans-Proline. Die beiden beobachteten transienten Faltungsintermediate sind somit wahrscheinlich zwei Populationen von Faltungsintermediaten mit nicht-nativen X-Pro-Peptidbindungen, wobei sich die Populationen durch mindestens eine nicht-native X-Pro-Peptidbindung unterscheiden.
Der Austausch des Prolinrestes 281 gegen verschiedene Aminosäuren (Ala, Ile, Leu, Phe, Gly) führte zu einer starken Destabilisierung des nativen Proteins und daneben auch zu einer Reduktion in der Aktivität, da die Mutationsstelle in der Nähe der putativen Substratbindetasche liegt. Die Rückfaltungskinetiken der Prolinmutanten war bei 10°C annähernd gleich zum Wildtyp und die geschwindigkeitsbestimmenden Schritte der Faltung waren durch die Mutation nicht verändert. Die durch die Mutation verursachte drastische Destabilisierung des nativen Zustands führte zu einem reversiblen Entfaltungsgleichgewicht bei pH 7 und 10°C. GdmCl-induzierte Faltungsübergänge der Mutante P281A zeigten bei Messungen der Tryptophanfluoreszenzemission und der Aktivität einen kooperativen Phasenübergang mit einem Übergangsmittelpunkt bei 1.1 M GdmCl. Durch die Übereinstimmung der Faltungsübergänge bei beiden Messparametern konnten die Faltungsübergänge nach dem Zwei-Zustandsmodell ausgewertet werden. Dabei wurde eine freie Sabilisierungsenthalpie der Faltung für die Mutante von
BsPel enthält, wie die meisten monomeren rechtsgängigen parallelen beta-Helix-Proteine, einen internen Stapel wasserstoffverbrückter Asparagin-Seitenketten. Die Mehrheit der erzeugten Mutanten mit Substitutionen im Zentrum der Asn-Leiter (N271X) waren als enzymatisch aktives Protein zugänglich. Die Auswirkung der Mutation auf die Stabilität und Rückfaltung wurde an den Proteinen BsPel-N271T und BsPel-N271A näher analysiert. Dabei führte die Unterbrechung des Asparaginstapels im Inneren der beta-Helix zu keiner drastischen Destabilisierung des nativen Proteins. Allerdings führten diese Mutationen zu einem temperatur-sensitiven Faltungsphänotyp und die Hysterese im Denaturierungsübergang wurde verstärkt. Offenbar wird durch die Unterbrechung des Asparaginstapel ein essentielles, thermolabiles Faltungsintermediat destabilisiert. Der Asparaginstapel wird somit bei der Faltung sehr früh ausgebildet und ist wahrscheinlich schon im Übergangszustand vorhanden.
N2 - Pectate lyases belong to a family of proteins secreted by plant pathogenic microbes. The enzymes cleave alpha-1,4 linked galacturonic acid by a beta-elimination that results in an unsaturated product, which can be quantified spectrophotometrically. Calcium is essential for the activity and the pH-optimum is near 8.5. All known structures of pectate and pectin lyases have the same structural motif - a right handed parallel beta-helix. The structure of pectate lyase from Bacillus subtilis (BsPel) has been solved in complex with calcium. It is a monomeric protein, with a molecular mass of about 43 kDa and without disulfide bonds. This allows its high-yield recombinant expression in the cytoplasm of Escherichia coli. Parallel beta-helices are relative large proteins, however with a simple folding topology. The objective of this work was to characterize the folding mechanism of BsPel. In particular we investigated the role of the interactions of certain residues in the parallel beta-helix for the stability of the native protein and the stability of essential folding intermediates. Refolding of BsPel was possible at low protein concentrations and low temperature. However, denaturation of BsPel was not freely reversible. De- and renaturation curves showed a large apparent hysteresis. Furthermore, the folding rate constant deduced from fluorescence and circulardichroism measurements showed a very strong dependence on denaturant concentrations near the midpoint of the renaturation transition. This can be explained with a cooperative unfolding of an essential folding intermediate. Upon stabilisation of the temperature-sensitive intermediate by addition of glycerol in the renaturation buffer, the hysteresis is reduced, but does not disappear. Reverse double mixing kinetic experiments have shown that two transient folding intermediates are on the folding pathway. These intermediates are on parallel pathways and both can fold to the native state. Fluorescence emission spectra have shown the native-like structure of both intermediates. Furthermore, data from proline double mixing kinetic experiments revealed that isomerization of peptidyl-prolyl bonds was responsible for the slow kinetics in the reactivation of the enzyme. However, the isomerization of the single cis-peptidyl-prolyl bond at Pro281 was not responsible for the slowest folding phase observed, but rather the isomerization of other trans-peptidyl-prolyl bonds. Thus, both transient folding intermediates observed probably represent two populations of folding intermediates with non-native X-Pro-peptide bonds. The difference of the two populations is at least one non-native X-Pro-peptide bond. Mutations of the proline 281 against various residues (Ala, Ile, Leu, Phe, Gly) resulted in a strong destabilization of the native protein. Also, the activity of the mutant proteins was strong reduced due to the position of the mutation site near the putative active center of the protein. At 10°C the kinetic folding behavior of the proline mutants was not significant changed. However, the strong destabilization of the native state in the proline mutants resulted in a reversible folding equilibrium at pH 7 and 10°C. The unfolding of the P281A mutant was reversible as determined by fluorescence emission and enzyme activity measurements. The coincidence of these detected transitions is consistent with a two-state equilibrium transition. At pH 7 and 10°C the delta G°(H2O) for folding of P281A was