TY - THES
A1 - Freiberg, Alexander
T1 - Das "Leucine-Rich Repeat" im Invasionsprotein Internalin B : Stabilität und Faltung eines Solenoidproteins
T1 - The leucine-rich repeat from internalin B : stability and folding of a solenoid protein
N2 - Für das Verständnis der Strukturbildung bei Proteinen ist es wichtig, allgemein geltende Prinzipien der Stabilität und Faltung zu verstehen. Bisher wurde viel Arbeit in die Erörterung von Gesetzmäßigkeiten zu den Faltungseigenschaften von globulären Proteinen investiert. Die große Proteinklasse der solenoiden Proteine, zu denen z. B. Leucine-Rich Repeat- (LRR-) oder Ankyrin-Proteine gehören, wurde dahingegen noch wenig untersucht. Die Proteine dieser Klasse sind durch einen stapelförmigen Aufbau von sich wiederholenden typischen Sequenzeinheiten gekennzeichnet, was in der Ausbildung einer elongierten Tertiärstruktur resultiert. In der vorliegenden Arbeit sollte versucht werden, die Stabilität und Faltung eines LRR-Proteins mittels verschiedener biophysikalischer Methoden zu charakterisieren. Als Untersuchungsobjekt diente die für die Infektion ausreichende zentrale LRR-Domäne des Invasionsproteins Internalin B (InlB241) des Bakteriums Listeria monocytogenes. Des weiteren sollten die Integrität und die Stabilitäts- und Faltungseigenschaften der sogenannten Internalin-Domäne (InlB321) untersucht werden. Hierbei handelt es sich um die bei allen Mitgliedern der Internalinfamilie vorkommende Domäne, welche aus einer direkten Fusion des C-terminalen Endes der LRR-Domäne mit einer Immunglobulin (Ig)-ähnlichen Domäne besteht. Von beiden Konstrukten konnte eine vollständige thermodynamische Charakterisierung, mit Hilfe von chemisch- bzw. thermisch-induzierten Faltungs- und Entfaltungsübergängen durchgeführt werden. Sowohl InlB241 als auch InlB321 zeigen einen reversiblen und kooperativen Verlauf der chemisch-induzierten Gleichgewichtsübergänge, was die Anwendung eines Zweizustandsmodells zur Beschreibung der Daten erlaubte. Die zusätzliche Ig-ähnliche Domäne im InlB321 resultierte im Vergleich zum InlB241 in einer Erhöhung der freien Enthalpie der Entfaltung (8.8 kcal/mol im Vergleich zu 4.7 kcal/mol). Diese Stabilitätszunahme äußerte sich sowohl in einer Verschiebung des Übergangsmittelpunktes zu höheren Guanidiniumchlorid-Konzentrationen als auch in einer Erhöhung der Kooperativität des Gleichgewichtsübergangs (9.7 kcal/mol/M im Vergleich zu 7.1 kcal/mol/M). Diese Beobachtungen zeigen dass die einzelnen Sequenzeinheiten der LRR-Domäne nicht unabhängig voneinander falten und dass die Ig-ähnliche Domäne, obwohl sie nicht direkt mit dem Wirtszellrezeptor während der Invasion interagiert, eine kritische Rolle für die in vivo Stabilität des Internalin B spielt. Des weiteren spiegelt die Kooperativität des Übergangs die Integrität der Internalin-Domäne wieder und deutet darauf hin, dass bei beiden Proteinen keine Intermediate vorliegen. Kinetische Messungen über Tryptophanfluoreszenz und Fern-UV Circulardichroismus deuteten auf die Existenz eines relativ stabilen Intermediates auf dem Faltungsweg der LRR-Domäne hin. Faltungskinetiken aus einem in pH 2 denaturierten Zustand zeigten ein reversibles Verhalten und verliefen über ein Intermediat. Eine Erhöhung der Salzkonzentration des sauer-denaturierten Proteins führte zu einer Kompaktierung der entfalteten Struktur und resultierte im Übergang zu einem alternativ gefalteten Zustand. Bei der Internalin-Domäne deuteten kinetische Messungen des Fluoreszenz- und Fern-UV Circulardichroismus-Signals während der Entfaltung möglicherweise auf die Präsenz von zwei Prozessen hin. Der erste langsame Entfaltungsprozess kurz nach dem Übergangsmittelpunkt zeigte eine starke Abhängigkeit von der Temperatur, während der zweite schnellere Prozess der Entfaltung stärker von der Guanidiniumchlorid-Konzentration abhing. Renaturierungskinetiken zeigten das Auftreten von mindestens einem Faltungsintermediat. Kinetische Daten aus Doppelsprungexperimenten lieferten für die Erklärung der langsamen Faltungsphase zunächst keinen Hinweis auf dass Vorliegen einer Prolinisomerisierungsreaktion. Die vollständige Amplitude während der Renaturierung konnte nicht detektiert werden, weswegen von einer zweiten schnellen Phase im Submillisekundenbereich ausgegangen werden kann. Die Ergebnisse der Faltungskinetiken zeigen, dass die InlB-Konstrukte als Modelle für die Untersuchung der Faltung von Solenoidproteinen verwendet werden können.
N2 -
To understand the processes of protein structure formation, it is necessary to investigate protein stability and protein folding kinetics. The focus of many folding studies has been directed at small, globular proteins. The larger class of solenoid proteins, including leucine-rich repeat (LRR) and ankyrin proteins, has not been extensively investigated. These proteins contain tandem repeat motifs, and their tertiary structure consists of a regular linear array of modules that stack to form non-globular elongated or supercoiled structures. In the present work, the folding and stability of the central LRR domain of the invasion protein internalin B (InlB241) from the bacterium Listeria monocytogenes was characterized using different biophysical techniques. In addition, the integrity, stability and folding behavior of the so-called internalin-domain (InlB321) was investigated. In this single domain, which is found in all members of the internalin-family, an immunoglobulin (Ig)-like domain is directly fused to the C-terminal end of the LRR domain.
A complete thermodynamic characterization of the stability of both constructs was performed, using chemical- and temperature-induced folding and unfolding transitions. The reversible and cooperative equilibrium transition of InlB241 and InlB321 allowed the use of a two-state model for the description of the data points. The additional Ig-like domain present in InlB321 resulted in an increase of the unfolding free energy (8.8 kcal/mol compared to 4.7 kcal/mol). This resulted both, from a shift of the transition midpoint to higher denaturant concentration, and from an increase in the m-value, the denaturant dependence of the unfolding free energy (9.7 kcal/mol/M compared to 7.1 kcal/mol/M). These observations suggest that the unravelling of the individual structural repeats in the LRR region is a cooperative process and that the tight fusion with the Ig-like domain leads to a dramatically increased stability in vivo without interfering with the functionality of the protein. In addition, the cooperativity of the equilibrium transition reflects the integrity of the internalin-domain, and suggests that both InlB fragments unfold without significantly populated equilibrium intermediates.
Kinetic measurements with tryptophan fluorescence and far-UV circular dichroism are indicative for the existence of a relative stable intermediate on the folding pathway of the LRR domain. Refolding kinetics from an acid-denatured state showed a reversible behavior and passes off an intermediate. An increase in the salt concentration of the acid-denatured protein results in a transition of the unfolded structure to a compact and alternatively folded state. Unfolding kinetics of the internalin-domain measured by fluorescence and far-UV circular dichroism are indicative for the possible presence of two processes. The first slow unfolding process after the transition midpoint showed a strong dependence on temperature, whereas the second and faster unfolding process showed a stronger dependence on the denaturant concentration. Renaturation kinetics indicated the existence of at least one folding intermediate. Preliminary double-mixing experiments revealed no evidence for a rate-limiting proline isomerization reaction. It was not possible to detect the complete amplitude of the renaturation reaction, suggesting existence of a second faster phase occuring in the submillisecond range.
The results on folding kinetics prove the InlB constructs to be suitable models for the investigation of solenoid protein folding by techniques of high structural resolution.
KW - Proteinfaltung
KW - thermodynamische Stabilität
KW - Leucine-Rich Repeat
KW - Internalin B
KW - Zweizustandsmodell
KW - leucine-rich repeat
KW - internalin B
KW - thermodynamic stability
KW - protein folding
KW - two-state model
Y1 - 2004
U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-2532
ER -
TY - THES
A1 - Pellengahr, Klaus
T1 - Charakterisierung von ausgewählten Protein-Phosphatasen und MATE-Proteinen aus Arabidopsis thaliana
T1 - Characterisation of Protein-Phosphatases and MATE-Proteins of Arabidopsis thaliana
N2 - Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die Genexpression der Protein Phosphatase-gene TOPP1, TOPP2, TOPP5, STH1 und STH2 analysiert. Alle fünf ausgewählten Gene kodieren für PP des PP1/PP2A-Typs. Es wurde untersucht, ob homologen PP-Isoformen individuelle Expressionsmuster zugewiesen werden konnten. Besonderes Augenmerk richtete sich dabei auf die Expression von PP-Genen in den Schließzellen von A. thaliana. In mehreren Inhibitorstudien wurde beschrieben, dass PP1/PP2A-Proteine eine wichtige Rolle in der Signaltransduktion pflanzlicher Schließzellen spielen. Bisher konnte allerdings noch keine der entsprechenden katalytischen Untereinheiten auf molekularer Ebene identifiziert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zum ersten Mal nachgewiesen, dass mit TOPP1 ein Protein des PP1-Typs präferenziell in den Schließzellen von A. thaliana exprimiert wird. Ein Vergleich der Genexpression von TOPP1, TOPP2 und TOPP5 zeigte für die drei homologen Gene sehr Isoform-spezifische Expressionsmuster. Dies war ein deutlicher Hinweis, dass diese eng verwandten PP trotz großer Übereinstimmung auf Aminosäureebene vermutlich unterschiedliche Funktionen in planta haben. Die Untersuchung der Genexpression von STH1 und STH2 zeigte, dass die fast identischen Proteine zum Teil in unterschiedlichen Geweben vorkommen. Die Transkripte der beiden Gene, welche eine eigene Untergruppe von PP2A-verwandten Sequenzen bilden, konnten aus EF isoliert werden. Der in dieser Arbeit entwickelte Screeningansatz ermöglichte es, die sehr ähnlichen cDNA-Fragmente eindeutig voneinander zu unterscheiden. Die gefundenen Isoform-spezifischen Expressionsmuster waren ein deutlicher Hinweis auf unterschiedliche Funktionen in planta. Zur weiteren Untersuchung der PP-Funktionen in planta wurden Pflanzen mit veränderter Genaktivität von TOPP2 oder STH1 untersucht. In Pflanzen mit RNAi-vermittelter Reduktion des TOPP2-Transkriptgehalts ließ sich ein deutlich verändertes Blattwachstum beobachten. Die eingerollten oder asymmetrisch entwickelten Blätter waren vermutlich ein Hinweis, dass diese PP1-Isoform auch in A. thaliana eine Rolle bei der Zellteilung spielt. Für TOPP2-Expression in Hefen wurde diese Funktion schon nachgewiesen. Die Analyse von Insertions-mutanten mit T-DNA Insertionen in beiden STH1-Allelen waren neben den Expressions-studien ein weiterer Hinweis, dass sich STH1 nicht funktionell durch STH2 ersetzen lässt. Die Experimente in dieser Arbeit zeigten, dass das Fehlen der STH1-Genaktivität zu einem deutlichen Blattphänotyp mit gezahnten Blatträndern führte. Für STH2-Insertionsmutanten wurde dieses veränderte Wachstum nicht beschrieben. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde das Gen NIC1, welches für ein MATE-Membranprotein kodiert, identifiziert und charakterisiert. Die Sequenzierung des Genoms von A. thaliana hatte gezeigt, dass mindestens 56 MATE-Gene in dieser Pflanze vorhanden sind. Zum Zeitpunkt der Identifikation von NIC1 war keines dieser Gene charakterisiert. Außer für das MATE-Protein ERC1 aus S. cerevisiae gab es keine Studien zu eukaryotischen Mitgliedern dieser großen Familie von Membranproteinen. Anhand NIC1 wurden heterologe Expressionssysteme zur funktionellen Charakterisierung von MATE-Proteinen aus Pflanzen etabliert. Die cDNA von NIC1 wurde nach ihrer Klonierung in X. laevis Oozyten und S. cerevisiae exprimiert. In S. cerevisiae erhöhte die NIC1-Expression die Lithumtoleranz der Hefen und führte zu einer Verminderung der Natriumtoleranz. Parallele Versuche mit NIC2 und NIC4 (in den Diplomarbeiten von Blazej Dolniak und Mandy Kursawe) zeigten, dass auch diese beiden Proteine die Salztoleranz von S. cerevisiae beeinflussten. Während NIC2 die Lithium- und Natriumtoleranz erhöhte, führte NIC4-Expresion zu einer höheren Sensibilität gegenüber diesen beiden Kationen. Die unterschiedlichen Eigenschaften der drei homologen Proteine zeigten sich auch bei ihrer Expression in X. laevis Oozyten. NIC1 induzierte in den Oozyten auswärts gerichtete Chloridströme, die spannungsabhängig waren und durch mikromolare Konzentrationen der trivalenten Kationen Lanthan oder Gadolinium inhibiert werden konnten. NIC4 induzierte Barium-inhibierbare Kaliumströme, die spannungsunabhängig waren. Für NIC2 ließ sich in diesem Expressionssystem keine Aktivität detektieren. Zur Untersuchung der NIC1-Funktion in planta wurde die Genaktivität in transgenen Pflanzen lokalisiert und reduziert. Die NIC1-Genexpression war hauptsächlich in den vaskulären Geweben der Pflanze detektierbar und einer Verminderung des NIC1-Transkriptgehalts beeinflusste die Entwicklungsgeschwindigkeit der Pflanzen. Sie entwickelten sich deutlich langsamer als der parallel kultivierte Wildtyp. Der deutliche Phänotyp bei Veränderung der Genaktivität von nur einem der mindestens 56 vorhandenen MATE-Gene in A. thaliana zeigte, dass vermutlich keine weitere MATE-Isoform in der Lage ist, die Funktion von NIC1 zu übernehmen.
N2 - Gene expression analysis of the protein phosphatase (PP) genes, TOPP1, TOPP2, TOPP5, STH1 and STH2, of Arabidopsis thaliana was investigated in the first part of this thesis. All five genes encode PP of subgroups PP1 or PP2A. It was determined that homologous isoforms show individual and differing expression patterns. The PP-expression in guard cells was analysed further, because previous inhibitor studies showed an important influence of PP1/PP2A on signal transduction processes in these specialised cells. The previous studies had not addressed molecular identification of the inhibited PP1-/PP2A-subunits. This work demonstrates for the first time a preferential expression of a PP1 isoform, TOPP1, in guard cells. Further analysis of TOPP1, TOPP2 and TOPP5 gene expression also revealed isoform-specific expression patterns, suggesting non-redundant functions in planta. Characterisation of the nearly identical PP2A-related genes, STH1 and STH2, also revealed individual expression patterns. An established screening approach (this work) for the identification of PP-genes from EF (epidermal fragments; a preparation enriched for guard cells) made it possible to distinguish the cDNAs of STH1 and STH2. The two genes form a subgroup of PP2A-related sequences. Differences in their expression patterns suggest that STH1 and STH2 have different functions in A. thaliana. The analysis of plants with altered gene expression of TOPP2 and STH1 gave further insights into the roles of individual PP isoforms. The RNAi-mediated reduction of TOPP2-expression led to changed morphology of leaves, which showed curling and asymmetric development. The reason for this phenotype is probably due to changes of the cell cycle in certain parts of the leaf. Previous studies have already shown that heterologously expressed TOPP2 complements yeast cell cycle mutants. The selection and characterisation of plants with insertions in both STH1-allels revealed the individual roles of STH1 and STH2 in planta. Although STH2 was not affected, plants developed an extreme phenotype with reduced growth and altered leave shape. Previous studies with STH2 loss-of-function mutants did not show this morphology. The second part of this thesis includes the identification and characterisation of a MATE (multidrug and toxic extrusion) membrane protein in plants. Described is NIC1, the first of at least 56 MATE proteins in A. thaliana. Indeed a study of the MATE protein, ERC1, of Saccharomyces cerevisiae was the only description of a eukaryotic member of this large family of membrane proteins.
KW - Biologie
KW - Molekularbiologie
KW - molecular biology
Y1 - 2004
U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-2500
ER -
TY - THES
A1 - Steinhauser, Dirk
T1 - Inferring hypotheses from complex profile data - by means of CSB.DB, a comprehensive systems-biology database
T1 - Generierung von Hypothesen aus komplexen Profildaten mittels CSB.DB, a comprehensive systems-biology database
N2 - The past decades are characterized by various efforts to provide complete sequence information of genomes regarding various organisms. The availability of full genome data triggered the development of multiplex high-throughput assays allowing simultaneous measurement of transcripts, proteins and metabolites. With genome information and profiling technologies now in hand a highly parallel experimental biology is offering opportunities to explore and discover novel principles governing biological systems. Understanding biological complexity through modelling cellular systems represents the driving force which today allows shifting from a component-centric focus to integrative and systems level investigations. The emerging field of systems biology integrates discovery and hypothesis-driven science to provide comprehensive knowledge via computational models of biological systems. Within the context of evolving systems biology, investigations were made in large-scale computational analyses on transcript co-response data through selected prokaryotic and plant model organisms. CSB.DB - a comprehensive systems-biology database - (http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/) was initiated to provide public and open access to the results of biostatistical analyses in conjunction with additional biological knowledge. The database tool CSB.DB enables potential users to infer hypothesis about functional interrelation of genes of interest and may serve as future basis for more sophisticated means of elucidating gene function. The co-response concept and the CSB.DB database tool were successfully applied to predict operons in Escherichia coli by using the chromosomal distance and transcriptional co-responses. Moreover, examples were shown which indicate that transcriptional co-response analysis allows identification of differential promoter activities under different experimental conditions. The co-response concept was successfully transferred to complex organisms with the focus on the eukaryotic plant model organism Arabidopsis thaliana. The investigations made enabled the discovery of novel genes regarding particular physiological processes and beyond, allowed annotation of gene functions which cannot be accessed by sequence homology. GMD - the Golm Metabolome Database - was initiated and implemented in CSB.DB to integrated metabolite information and metabolite profiles. This novel module will allow addressing complex biological questions towards transcriptional interrelation and extent the recent systems level quest towards phenotyping.
N2 - Die vergangenen Jahrzehnte waren gekennzeichnet durch umfangreiche Bemühungen, die Genomsequenz verschiedener Organismen vollständig zu entschlüsseln. Die Verfügbarkeit vollständiger genomischer Daten löste die Entwicklung von modernen Hochdurchsatzmethoden aus, welche die gleichzeitige Messung von verschiedenen Transkripten, Proteinen und Metaboliten erlauben. Mittels genomischer Informationen und Hochdurchsatztechnologien erlaubt eine hoch parallelisierte experimentelle Biologie die Erforschung von Gesetzmäßigkeiten, welchen biologischen Systemen zugrunde liegen. Das Verständnis biologischer Komplexität durch Modellierung zellulärer Systeme repräsentiert die treibende Kraft, welche heutzutage den Element-zentrierten Focus auf integrative und ganzheitliche Untersuchungen lenkt. Das sich entwickelnde Feld der Systembiologie integriert Entdeckungs- und Hypothesen-getriebene Wissenschaft um ein umfangreiches Wissen durch Computermodelle biologischer Systeme bereitzustellen. Im Kontext der sich neu entwickelnden Systembiologie investierte ich in umfangreiche Computeranalysen zur Transkript Co-Response bezüglich ausgewählter prokaryotischer und pflanzlicher eukaryotischer Organismen. CSB.DB - a comprehensive systems-biology database - (http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/) wurde initiiert, um freien Zugang zu den biostatistischen Ergebnissen als auch zu weiterem biologischem Wissen zu bieten. Die Datenbank CSB.DB ermöglicht potentiellen Anwendern die Hypothesengenerierung bezüglich der funktionalen Wechselbeziehungen von Genen von Interesse und kann zukünftig die Grundlage für einen fortgeschrittenen Weg der Zuordnung von Genfunktionen darstellen. Unter Verwendung chromosomaler Distanzen und Transkript Co-Response konnte das Konzept und CSB.DB angewandt werden, um bakterielle Operons in Escherichia coli erfolgreich vorherzusagen. Darüber hinaus werden Beispiele gezeigt, die andeuten, dass die Transkript Co-Response Analyse eine Identifizierung differentieller Promoteraktivität in verschiedenen experimentellen Bedingungen ermöglicht. Das Co-Response Konzept wurde, mit dem Schwerpunkt auf die eukaryotische Modellpflanze Arabidopsis thaliana, erfolgreich auf komplexere Organismen angewandt. Die durchgeführten Untersuchungen ermöglichten die Identifizierung neuer Gene hinsichtlich physiologischer Prozesse und darüber hinaus die Zuweisung von Genfunktionen, welche nicht durch Sequenzhomologie ermöglicht werden kann. GMD - The Golm Metabolome Database - wurde initiiert und in CSB.DB implementiert, um Metaboliten Informationen als auch Metaboliten Profile zu integrieren. Dieses neue Modul ermöglicht die Ausrichtung auf komplexere biologische Fragen und erweitert die derzeitige systembiologische Fragestellung in Richtung Phänotypus-Zuordnung.
T2 - Inferring hypotheses from complex profile data - by means of CSB.DB, a comprehensive systems-biology database
KW - Datenbank
KW - Korrelation
KW - Korrelationsanalyse
KW - Escherichia coli
KW - Saccharomyces cerevisiae
KW - Ackerschmalwand
KW - Operon
KW - Brassinosteroide
KW - Transkript
KW - database
KW - correlation
KW - co-response
KW - metabolite
KW - transcript
Y1 - 2004
U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-2467
ER -
TY - THES
A1 - Helaly, Alaa El-din A.
T1 - Molecular studies on plants to enhance their stress tolerance
T1 - -
N2 - Environmental stresses such as drought, high salt and low temperature affect plant growth and decrease crop productivity extremely. It is important to improve stress tolerance of the crop plant to increase crop yield under stress conditions. The Arabidopsis thaliana salt tolerance 1 gene (AtSTO1) was originally identified by Lippuner et al., (1996). In this study around 27 members of STO-like proteins were identified in Arabidopsis thaliana, rice and other plant species. The STO proteins have two consensus motifs (CCADEAAL and FCV(L)EDRA). The STO family members can be regarded as a distinct class of C2C2 proteins considering their low sequence similarity to other GATA like proteins and poor conservation in the C-terminus. AtSTO1 was found to be induced by salt, cold and drought in leaves and roots of 4-week-old Arabidopsis thaliana wild-type plants. The expression of AtSTO1 under salt and cold stress was more pronounced in roots than in leaves. The data provided here revealed that the AtSTO1 protein is localized in the nucleus. The observation that AtSTO1 localizes in the nucleus is consistent with its proposed function as a transcription factor. AtSTO1-dependent phenotypes were observed when plant were grown at 50 mM NaCl on agar plates. Leaves of AtSTO1 overexpression lines were bigger with dark green coloration, whereas stunted growth and yellowish leaves were observed in wild-type and RNAi plants. Also, the AtSTO1 overexpression plants when exposed to long-term cold stress had a red leaf coloration which was much stronger than in wild-type and RNAi lines. Growth of AtSTO1 overexpression lines in long term under salt and cold stress was always associated with long roots which was more pronounced than in wild-type and RNAi lines. Proline accumulation increased more strongly in leaves and roots of AtSTO1 overexpression lines than in tissues of wild-type and RNAi lines when treated with 200 mM NaCl, exposed to cold stress or when watering was prevented for one day or two weeks. Also, soluble sugar content increased to higher levels under salt, cold and drought stress in AtSTO1 overexpression lines when compared to wild-type and RNAi lines. The increase in soluble sugar content was detected in AtSTO1 overexpression lines after long-term (2 weeks) growth of plants under these stresses. Anthocyanins accumulated in leaves of AtSTO1 overexpression lines when exposed to long term salt stress (200 mM NaCl for 2 weeks) or to 4°C for 6 and 8 weeks. Also, anthocyanin content was increased in flowers of AtSTO1 overexpression plants kept at 4°C for 8 weeks. Taken together these data indicate that overexpression of AtSTO1 enhances abiotic stress toleranc via a more pronounced accumulation of compatible solutes under stress.
N2 - Umweltstress wie zum Beispiel Trockenheit, Salz und niedrige Temperaturen beeinflussen in erheblichem Maße das pflanzliche Wachstum und haben einen negativen Einfluss auf Ertragsleistungen. Untersuchungen zur Verbesserung der Stresstoleranz und des Ernteertrages von Kulturpflanzen sind daher von großer Bedeutung. Pflanzen passen sich Umweltveränderungen durch physiologische und entwicklungsabhängige Prozesse an. In den letzten Jahren wurden zahlreiche Gene identifiziert, die als Reaktion von Umweltstress in der Pflanze aktiviert werden. Salzstress bewirkt negative Veränderungen des pflanzlichen Wasserstatus, die auf veränderte K+/Na+-Verhältnisse und Na+- und Cl--Konzentrationen zurückzuführen sind. Neben Veränderungen in der Bewässerungspraxis spielt heute die Züchtung salztoleranter Pflanzen und die biotechnologische Verbesserung von Kulturpflanzen eine zunehmend wichtige Rolle. Im Rahmen der Doktorarbeit wurde ein bisher wenig untersuchtes Gen, welches AtSTO1 genannt wird, anhand der Modellpflanze Ackerschmalwand (lat. Arabidopsis thaliana) analysiert. Das Gen wird durch Umweltstress, insbesondere durch Kälte, aktiviert. Es wurden gentechnisch veränderte Pflanzen hergestellt, die eine verstärkte Aktivität des AtSTO1-Gens aufweisen. Diese Pflanzen zeigten bei Vorliegen von hohen Salzkonzentration ein im Vergleich zu unveränderten Pflanzen verbessertes Wachstum. Diese Stimulation des pflanzlichen Wachstums unter Salzstress-Bedingungen war begleitet von einer vermehrten Bildung bestimmter chemischer Substanzen, die die Pflanzen in die Lage versetzen, mit dem Stress besser fertig zu werden. Dazu gehört beispielsweise die Aminosäure Prolin, deren Konzentration in den gentechnisch veränderten Pflanzen nach Stressbehandlung stärker erhöht ist, als in den unveränderten Kontrollpflanzen oder in Pflanzen, die eine reduzierte AtSTO1-Aktivität besaßen. Auch die Gehalte einiger Zucker waren in den gentechnisch modifizierten Pflanzen unter Stress erhöht. Insgesamt hat sich gezeigt, dass AtSTO1 eine wichtige Aufgabe in der Stressantwort spielt. Weitere Untersuchungen sollten es ermöglichen, auch bei Kulturpflanzen, wie etwa Reis, die Stresstoleranz durch Veränderung verwandter Gene zu erhöhen. ----------- vollständiger Name des Autors: Abdallah Helaly, Alaa El-Din
Y1 - 2004
U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-2427
ER -
TY - THES
A1 - Schwonbeck, Susanne
T1 - Analyse von Single Nucleotide Polymorphisms an Glas-Oberflächen
N2 - Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung einer SNP-Genotypisierungsmethode mit auf Mikroarrays immobilisierten PCR-Produkten. Für die Analyse wurde ein faseroptischer Affinitätssensor bzw. ein Durchfluss-Biochip-Scanner mit integrierter Fluoreszenzdetektion verwendet. An den immobilisierten Analyten (PCR-Produkten) wurde eine Fluoreszenzoligonukleotidsonde hybridisiert und anschließend die Dissoziation der Sonde im Fluss verfolgt. Die Diskriminierung von Wildtyp- und Mutanten-DNA erfolgte durch die kinetische Auswertung der Dissoziationskurven sowie durch die Analyse der Fluoreszenzintensität. Die Versuche am faseroptischen Affinitätssensor zeigten, dass DNA-DNA-Hybride sowohl von Oligonukleotiden als auch von PCR-Produkten ein typisches Dissoziationsverhalten aufweisen, wobei fehlgepaarte Hybride eine signifikant schnellere Dissoziation zeigen als perfekt passende Hybride. Dieser Geschwindigkeitsunterschied lässt sich durch den Vergleich der jeweiligen kinetischen Geschwindigkeitskonstanten kD quantitativ erfassen. Da die Kopplung des Analyten an der Chipoberfläche sowie die Hybridisierungs- und Dissoziationsparameter essentiell für die Methodenentwicklung war, wurden die Parameter für ein optimales Spotting und die Immobilisierung von PCR-Produkten ermittelt. Getestet wurden die affine Kopplung von biotinylierten PCR-Produkten an Streptavidin-, Avidin- und NeutrAvidin-Oberflächen sowie die kovalente Bindung von phosphorylierten Amplifikaten mit der EDC/Methylimidazol-Methode. Die besten Ergebnisse sowohl in Spotform und -homogenität als auch im Signal/Rausch-Verhältnis wurden an NeutrAvidin-Oberflächen erreicht. Für die Etablierung der Mikroarray-Genotypisierungsmethode durch kinetische Analyse nach einem Hybridisierungsexperiment wurden Sondenlänge, Puffersystem, Spotting-Konzentration des Analyten sowie Temperatur optimiert. Das Analysensystem erlaubte es, PCR-Produkte mit einer Konzentration von 250 ng/µl in einem HEPES-EDTA-NaCl-Puffer auf mit NeutrAvidin beschichtete Glasträger zu spotten. In den anschließenden Hybridisierungs- und Dissoziationsexperimenten bei 30 °C konnte die Diskriminierung von homocygoter Wildtyp- und homocygoter Mutanten- sowie heterocygoter DNA am Beispiel von Oligonukleotid-Hybriden erreicht werden. In einer Gruppe von 24 homocygoten Patienten wurde ein Polymorphismus im SULT1A1-Gen analysiert. Sowohl durch kinetische Auswertung als auch mit der Analyse der Fluoreszenzintensität wurde der Genotyp der Proben identifiziert. Die Ergebnisse wurden mit dem Referenzverfahren, der Restriktionschnittstellenanalyse (PCR-RFLP) validiert. Lediglich ein Genotyp wurde falsch bestimmt, die Genauigkeit lag bei 96%. In einer Gruppe von 44 Patienten wurde der Genotyp eines SNP in der Adiponectin-Promotor-Region untersucht. Nach Vergleich der Analysenergebnisse mit denen eines Referenzverfahrens konnten lediglich 14 der untersuchten Genotypen bestätigt werden. Ursache für die unzureichende Genauigkeit der Methode war vor allem das schlechte Signal/Rausch-Verhältnis. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass das in dieser Arbeit entwickelte Analysesystem für die Genotypisierung von Einzelpunktmutationen geeignet ist, homocygote Patientenproben zuverlässig zu analysieren. Prinzipiell ist das auch bei heterocygoter DNA möglich. Da nach aktuellem Kenntnisstand eine SNP-Analysemethode an immobilisierten PCR-Produkten noch nicht veröffentlicht wurde, stellt das hier entwickelte Verfahren eine Alternative zu bisher bekannten Mikroarray-Verfahren dar. Als besonders vorteilhaft erweist sich der reverse Ansatz der Methode. Der hier vorgestellte Ansatz ist eine kostengünstigere und weniger hoch dimensionierte Lösung für Fragestellungen beispielsweise in der Ernährungswissenschaft, bei denen meist eine mittlere Anzahl Patienten auf nur einige wenige SNPs zu untersuchen ist. Wenn es gelingt, durch die Weiterentwicklung der Hardware bzw. weiterer Optimierung, eine Verbesserung des Signal/Rausch-Verhältnisses und damit die Diskriminierung von heterocygoter DNA zu erreichen, kann diese Methode zukünftig bei der Analyse von mittelgroßen Patientengruppen alternativ zu anderen Genotypisierungsmethoden verwendet werden.
N2 - The aim of this thesis was the development of a SNP genotyping method involving PCR products immobilised on microarrays. For the analysis a fibre optic affinity biosensor and a flow-through biochip scanner were used. Fluorescent probes were hybridized with the immobilised PCR products. In order to start the dissociation process the surface was rinsed with buffer and the fluorescence intensity was measured. Two different cases were studied: First, the full-matched DNA hybrid (wildtyp single strand with complementary wildtype single strand), second the mis-matched hybrid (wildtype single strand and mutant single strand). After determinating the reaction rates (kD) as kinetic parameter the kD values of both cases were compared. The experiments showed a significant difference in the kD value of the full- and the mis-match hybrids. Therefore, mutant and wildtype DNA were discriminated by kinetic analysis of the dissociation process and analysis of the fluorescence intensity. To set up the complete analysis process the reaction parameters like coupling of the PCR products had to be optimised. Both affininty coupled (streptavidin, neutravidin, avidin - biotin) and covalent methods (EDC/methylimidazol) were carried out. Best results in spot homogeinity and spot appearance were obtained with coupling of biotinylated PCR products on neutravidin coated chip surfaces. Additionally, the length of the probe, the spotting concentration, the spotting buffer and the reaction temperature were optimised. In the optimised analysis PCR products (250 µg/µl) were spotted onto neutravidin coated surfaces. The hybridisation and dissociation processes were carried out at 30°C. A HEPES-EDTA-NaCl buffer was used for spotting, diluting of the fluorescent probe and rinsing the microarray surface. A fluorescent probe was used with 13 nucleotides in length. The mis- or full-matching base indicating the polymorphism was located in the center position of the probe. The analysis system was tested with the genomic DNA of a group of 24 homocygote individuals with a SNP in the SULT1A1 gene region. The hybridisation and dissociation processes were carried out and the reaction rates were determinated. Subsequently after the analysis in the flow-through biochip scanner the fluorescence intensity of the spots were measured. The results showed very good comparability with results of a PCR-RFLP analysis (one false genotype). Additionally, a group of 44 heterocygote DNA samples with one SNP in the adiponectin promotor region were also genotyped. Compared to a reference method only 14 genotypes were correctly determined. This was mostly due to a low signal-noise-ratio and needs to be further investigated. Besides the problem in analysing heterocygote DNA samples the developed analysis system is very useful for genotyping SNP in homocygote DNA samples. The successful analysis of heterocygote sample is principally possible and with further investigations/optimisation, a better analysis should be possible. The most important advantage of the developed method is the reverse approach of binding PCR products at the surface instead of oligonucleotides. This allows the parallel genotyping of several individuals. Other advantages include low costs and medium sized dimensions in terms of throughput.
KW - Einzelbasenaustausch
KW - SNP
KW - Mikrochip
KW - DNA-Chip
KW - SULT1A1
KW - Adiponectin
KW - kinetische Analyse
KW - Dissoziation
KW - Durchfluß-Biochip-Scanner
KW - Fließsystem
KW - single nucleotide polymorphisms
KW - SNP
KW - microarray
KW - DNA
KW - kinetic analysis
KW - dissociation
KW - SULT1A1
KW - flow-through biochip scanner
Y1 - 2004
U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0001853
ER -
TY - THES
A1 - Ringleb, Jennifer
T1 - Identifikation antigener Determinanten des ZPB2 Proteins der Hauskatze und Charakterisierung ihrer kontrazeptiven und immunogenen Eigenschaften
N2 - Die immunologische Kontrazeption mittels Zona pellucida (ZP) Proteinen gilt als vielversprechender Ansatz für die Reproduktionskontrolle verwilderter Haus- und Wildtierbestände. Da die Applikation von nativer ZP mit Nebenwirkungen verbunden ist, wird die Verwendung einzelner ZP Peptide als Bestandteil kontrazeptiver Vakzine als besonders aussichtsreich erachtet. Das Prinzip dieser nebenwirkungsfreien ZP Immunisierung ist die gezielte Trennung der Entzündungsreaktionen auslösenden T-Zell-Epitope der ZP von den kontrazeptiv wirkenden B-Zell-Epitopen. Niedermolekulare synthetische oder rekombinante Peptide allein sind gering immunogen und können somit keine ausreichende Immunantwort induzieren. Die Verwendung von Peptiden für die immunologische Kontrazeption erfordert daher ein „Vakzin-Design“, d. h. die gezielte Kombination der Peptide mit immunstimulierenden Substanzen (Liposomen, Carrierproteinen, Adjuvantien). Zielstellung der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung des Potentials synthetischer Peptide für die Immunokontrazeption von verwilderten Hauskatzen (Felis catus). Dazu wurden zunächst relevante B-Zell-Epitope des felinen Zona pellucida Proteins, ZPB2, identifiziert und synthetisiert. Zwei der synthetischen Peptide (P3, P6) wurden zur Herstellung von Antikörpern an BSA konjugiert und zusammen mit Freundschem Adjuvans in Ratten verimpft. Die kontrazeptive Relevanz beider Peptide sowie der Ratten Anti-Peptid Antiseren wurde im in vitro Befruchtungssystem der Hauskatze geprüft. Zur Untersuchung der Immunogenität der Peptide in der Zielspezies Hauskatze erfolgte die Entwicklung von Vakzin-Prototypen für die einmalige Applikation. Neben der Eruierung der Stärke und Dauer der Immunantwort wurde durch Verpaarung der Tiere auch das kontrazeptive Potential in vivo abgeschätzt.
N2 - Immunological contraception based on zona pellucida (ZP) proteins is regarded as a promising approach for the control of reproduction in feral domestic and wild animals. Because application of native ZP caused adverse reactions, utilization of single ZP peptides as elements of contraceptive vaccines were considered to bear good prospects. The principle of this ZP immunization is based upon a systematic separation of inflammation triggering T-cell epitopes from the contraceptive B-cell epitopes. The present study evaluates the immunogenicity and contraceptive potential of synthetic feline ZPB2 peptides for immunocontraception in cats (Felis catus). First of all, relevant B-cell epitopes were identified and synthesized. In order to generate antipeptide antibodies two peptides (P3, P6) were chosen and coupled to BSA. Rats were immunized with the conjugation product combined with Freund′s complete adjuvant. The contraceptive efficacy of both peptides and of the anti-peptide antibodies generated were determined using in vitro fertilization of feline oocytes (IVF). To evaluate the peptides immunogenicity in the target species (cat), vaccine-prototypes were developed for a single application protocol. The strength and duration of the immune response was analyzed. Additionally, cats were mated to assess the contraceptive potential of the vaccines in vivo.
T2 - Identifikation antigener Determinanten des ZPB2 Proteins der Hauskatze und Charakterisierung ihrer kontrazeptiven und immunogenen Eigenschaften
KW - Zona pellucida
KW - Peptid
KW - Katze
KW - Kontraception
KW - zona pellucida
KW - peptide
KW - cat
KW - contraception
Y1 - 2004
U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0001901
ER -
TY - THES
A1 - Venevskaia, Irina
T1 - Modeling of vegetation diversity and a national conservation planning: example of Russia
N2 - Die übergreifende Zielsetzung meiner Studie ist eine Ausarbeitung quantitativer Methoden zur nationalen nationale Schutzplanung in Übereinstimmung mit dem internationalen Ansatz. Diese Zielsetzung erfordert eine Lösung der folgenden Probleme: 1) Wie lässt sich Vegetationsvielfalt in grober Auflösung auf Basis abiotischen Faktoren einschätzen? 2) Wie ist der Ansatz 'globaler Hotspots' für die Eingrenzung nationaler Biodiversitäts-Hotspots zu übernehmen? 3) Wie erfolgt die Auswahl von quantitativen Schutzzielen unter Einbezug der Unterschiede nationaler Hotspots bei Umweltbedingungen und durch den Menschen Bedrohung? 4) Wie sieht der Entwurf eines großflächigen nationalen Naturschutzkonzepts aus, das die hierarchische Natur der Artenvielfalt reflektiert? Die Fallstudie für nationale Naturschutzplanung ist Russland. Die nachfolgenden theoretischen Schlüsse wurden gezogen: · Großräumige Vegetationsdiversität ist weitgehend vorhersagbar durch klimabedingte latente Wärme für Verdunstung und topographische Landschaftsstruktur, beschrieben als Höhendifferenz. Das klimabasierte Modell reproduziert die beobachtete Artenanzahl von Gefäßpflanzen für verschiedene Gebiete auf der Welt mit einem durchschnittlichen Fehler von 15% · Nationale Biodiversitäts-Hotspots können auf Grundlage biotischer oder abiotischer Daten kartographiert werden, indem als Korrektur für ein Land die quantitativen Kriterien für Planzenendemismus und Landnutzung des Ansatzes der 'globalen Hotspots' genutzt wird · Quantitative Naturschutzziele, die die Unterschiede zwischen nationalen Biodiversitäts-Hotspots in Bezug auf Umweltbedingungen und der Bedrohung durch den Menschen miteinbeziehen, können mit nationalen Daten über Arten auf der Roten Liste gesetzt werden · Ein großräumiger nationaler Naturschutzplan, der die hierarchische Natur der Artenvielfalt berücksichtigt, kann durch eine Kombination von abiotischer Methode im nationalen Bereich (Identifikation großräumiger Hotspots) und biotischer Methode im regionalen Bereich (Datenanalyse der Arten auf der Roten Liste) entworfen werden
N2 - The overall objective of the study is an elaboration of quantitative methods for national conservation planning, coincident with the international approach ('hotspots' approach). This objective requires a solution of following problems: 1) How to estimate large scale vegetation diversity from abiotic factors only? 2) How to adopt 'global hotspots' approach for bordering of national biodiversity hotspots? 3) How to set conservation targets, accounting for difference in environmental conditions and human threats between national biodiversity hotspots? 4) How to design large scale national conservation plan reflecting hierarchical nature of biodiversity? The case study for national conservation planning is Russia. Conclusions: · Large scale vegetation diversity can be predicted to a major extent by climatically determined latent heat for evaporation and geometrical structure of landscape, described as an altitudinal difference. The climate based model reproduces observed species number of vascular plant for different areas of the world with an average error 15% · National biodiversity hotspots can be mapped from biotic or abiotic data using corrected for a country the quantitative criteria for plant endemism and land use from the 'global hotspots' approach · Quantitative conservation targets, accounting for difference in environmental conditions and human threats between national biodiversity hotspots can be set using national data for Red Data book species · Large scale national conservation plan reflecting hierarchical nature of biodiversity can be designed by combination of abiotic method at national scale (identification of large scale hotspots) and biotic method at regional scale (analysis of species data from Red Data book)
T2 - Modeling of vegetation diversity and a national conservation planning: example of Russia
KW - Vegetationsvielfalt
KW - nationaler Biodiversitäts-Hotspots
KW - quantitativen Schutzzielen
KW - nationalen Naturschutzplanung
KW - Russland
KW - large scale vegetation diversity
KW - national biodiversity hotspots
KW - conservation targets
KW - large scale national conservation plan
KW - Russia
Y1 - 2004
U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0001863
ER -
TY - THES
A1 - Junker, Björn H.
T1 - Sucrose breakdown in the potato tuber
N2 - In dieser Arbeit wurden verschiedene Ansätze verfolgt, um das Verständnis des Saccharose-zu-Stärke Stoffwechselweges in sich entwickelnden Kartoffelknollen zu untersuchen. Zunächst wurde ein induzierbares Genexpressions-System aus dem Schimmelpilz Aspergillus nidulans für die Untersuchung des Metabolismus von Kartoffelknollen optimiert. Es wurde herausgefunden, dass dieses sogenannte alc system schneller auf Acetaldehyd reagiert als auf Ethanol, und dass Acetaldehyd weniger Seiteneffekte auf den Metabolismus hat. Die optimalen Induktionsbedingungen wurden dann benutzt um die Effekte einer zeitlich kontrollierten zytosolischen Expression einer Hefe-Invertase auf den Metabolismus der Kartoffelknolle zu untersuchen. Die beobachteten Unterschiede zwischen induzierter und konstitutiver Expression der Invertase führten zu der Feststellung, dass die Glycolyse erst induziert wird nachdem ein ATP-Mangel durch erhöhtes Saccharose-Cycling kreiert wurde. Weiterhin lassen die Ergebnisse darauf schließen, dass Maltose in der Kartoffelknolle eher ein Produkt der Kondensation zweier Glucose-Einheiten ist statt ein Produkt des Stärke-Abbaus zu sein. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die Expression einer Hefe-Invertase in der Vakuole von Kartoffelknollen ähnliche Effekte auf deren Metabolismus hat wie die Expression des gleichen Enzymes im Apoplasten. Diese Beobachtung ist ein weiterer Beleg für die Präsenz eines Mechanismus, bei dem Saccharose mittels Endozytose in die Vakuole aufgenommen wird anstatt über Transporter direkt ins Zytosol aufgenommen zu werden. Zum Schluß wird ein kinetisches Modell des Saccharose-Abbaus vorgestellt, das in der Lage ist diesen Teil des Stoffwechsels der Kartoffelknolle quantitativ zu simulieren. Weiterhin kann dieses Modell die metabolischen Effekte der Einführung einer Hefe-Invertase in das Zytosol von Kartoffelknollen mit erstaunlicher Präzision vorhersagen. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass induzierbare Genexpression sowie Computermodelle von Stoffwechselwegen nützliche Hilfsmittel für eine Verbesserung des Verständnisses des Pflanzenmetabolismus sind.
N2 - In this work different approaches are undertaken to improve the understanding of the sucrose-to-starch pathway in developing potato tubers. At first an inducible gene expression system from fungal origin is optimised for the use of studying metabolism in the potato tuber. It is found that the alc system from Aspergillus nidulans responds more rapidly to acetaldehyde than ethanol, and that acetaldehyde has less side-effects on metabolism. The optimal induction conditions then are used to study the effects of temporally controlled cytosolic expression of a yeast invertase on metabolism of potato tubers. The observed differences between induced and constitutive expression of the invertase lead to the conclusion that glycolysis is induced after an ATP demand has been created by an increase in sucrose cycling. Furthermore, the data suggest that in the potato tuber maltose is a product of glucose condensation rather than starch degradation. In the second part of the work it is shown that the expression of a yeast invertase in the vacuole of potato tubers has similar effects on metabolism than the expression of the same enzyme in the apoplast. These observations give further evidence to the presence of a mechanism by which sucrose is taken up via endocytosis to the vacuole rather than via transporters directly to the cytosol. Finally, a kinetic in silico model of sucrose breakdown is presented that is able to simulate this part of potato tuber metabolism on a quantitative level. Furthermore, it can predict the metabolic effects of the introduction of a yeast invertase in the cytosol of potato tubers with an astonishing precision. In summary, these data prove that inducible gene expression and kinetic computer models of metabolic pathways are useful tools to greatly improve the understanding of plant metabolism.
T2 - Sucrose breakdown in the potato tuber
KW - Saccharose
KW - Solanum tuberosum
KW - Invertase
KW - induzierbare Genexpression
KW - Stoffwechselmodellierung
KW - sucrose
KW - Solanum tuberosum
KW - invertase
KW - inducible gene expression
KW - metabolic modelling
Y1 - 2004
U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0001673
ER -
TY - THES
A1 - Scheich, Christoph
T1 - High-throughput evaluation of protein folding conditions and expression constructs for structural genomics
N2 - Das E. coli Expressionssystem ist das am häufigsten angewandte hinsichtlich der rekombinante Proteinexpression für strukturelle und funktionelle Analysen aufgrund der hohen erzielten Ausbeuten und der einfachen Handhabbarkeit. Allerdings ist insbesondere die Expression eukaryotischer Proteine in E. coli problematisch, z.B. wenn das Protein nicht korrekt gefaltet ist und in unlöslichen Inclusion Bodies anfällt. In manchen Fällen ist die Analyse von Deletionskonstrukten oder einzelnen Proteindomänen der Untersuchung des Vollängeproteins vorzuziehen. Dies umfasst die Herstellung eines Satzes von Expressionskonstrukten, welche charakterisiert werden müssen. In dieser Arbeit werden Methoden optimiert und evaluiert für die in vitro-Faltung von Inclusion Body-Proteinen sowie die Entwicklung einer Hochdurchsatz-Charakterisierung von Expressionskonstrukten. Die Überführung von Inclusion Body-Proteinen in den nativen Zustand beinhaltet zwei Schritte: (a) Auflösen mit einen chaotropen Reagenz oder starkem ionischen Detergenz und (b) Faltung des Proteins durch Beseitigung des Chaotrops begleitet von dem Transfer in einen geeigneten Puffer. Die Ausbeute an nativ gefaltetem Protein ist oft stark eingeschränkt aufgrund von Aggregation und Fehlfaltung; sie kann allerdings durch die Zugabe bestimmter Additive zum Faltungspuffer erhöht werden. Solche Additive müssen empirisch identifiziert werden. In dieser Arbeit wurde eine Testprozedur für Faltungsbedingungen entwickelt. Zur Reduzierung der möglichen Kombinationen der getesteten Additive wurden sowohl empirische Beobachtungen aus der Literatur als auch bekannte Eigenschaften der Additive berücksichtigt. Zur Verminderung der eingesetzten Proteinmenge und des Arbeitsaufwandes wurde der Test automatisiert und miniaturisiert mittels eines Pipettierroboters. 20 Bedingungen zum schnellen Verdünnen von denaturierten Proteinen werden hierbei getestet und zwei Bedingungen zur Faltung von Proteinen mit dem Detergenz/Cyclodextrin Protein-Faltungssystem von Rozema et al. (1996). 100 µg Protein werden pro Bedingung eingesetzt. Zusätzlich werden acht Bedingungen für die Faltung von His-Tag-Fusionsproteinen (ca. 200 µg), welche an eine Metallchelat-Matrix immobilisiert sind, getestet. Die Testprozedur wurde erfolgreich angewendet zur Faltung eines humanen Proteins, der p22 Untereinheit von Dynactin, welche in E. coli in Inclusion Bodies exprimiert wird. So wie es sich bei vielen Proteinen darstellt, war auch für p22 Dynactin kein biologischer Nachweistest vorhanden, um den Erfolg des Faltungsexperimentes zu messen. Die Löslichkeit des Proteins kann nicht als eindeutiges Kriterium dienen, da neben nativ gefaltetem Protein, lösliche fehlgefaltete Spezies und Mikroaggregate auftreten können. Diese Arbeit evaluiert Methoden zur Detektion kleiner Mengen nativen Proteins nach dem automatisierten Faltungstest. Bevor p22 Dynactin gefaltet wurde, wurden zwei Modellenzyme zur Evaluierung eingesetzt, bovine Carboanhydrase II (CAB) und Malat Dehydrogenase aus Schweineherz-Mitochondrien. Die wiedererlangte Aktivität nach der Rückfaltung wurde korreliert mit verschiedenen biophysikalischen Methoden. Bindungsstudien mit 8-Anilino-1-Naphtalenesulfonsäure ergaben keine brauchbaren Informationen bei der Rückfaltung von CAB aufgrund der zu geringen Sensitivität und da fehlgefaltete Proteine nicht eindeutig von nativem Protein unterschieden werden konnten. Tryptophan Fluoreszenzspektren der rückgefalteten CAB wurden zur Einschätzung des Erfolges der Rückfaltung angewandt. Die Verschiebung des Intensitätsmaximum zu einer niedrigeren Wellenlänge im Vergleich zum denaturiert entfalteten Protein sowie die Fluoreszenzintensität korrelierten mit der wiedererlangten enzymatischen Aktivität. Für beide Modellenzyme war analytische hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) brauchbar zur Identifizierung rückgefalteter Proben mit aktivem Enzym. Kompakt gefaltetes, aktives Enzym eluierte in einem distinkten Peak im abnehmenden Ammoniumsulfat-Gradienten. Das Detektionslimit für analytische HIC lag bei 5 µg. Im Falle von CAB konnte gezeigt werden, dass Tryptophan-Fluoreszenz-Spektroskopie und analytische HIC in Kombination geeignet sind um Falsch-Positive oder Falsch-Negative, welche mit einem der Monitore erhalten wurden, auszuschließen. Diese beiden Methoden waren ebenfalls geeignet zur Identifizierung der Faltungsbedingungen von p22 Dynactin. Tryptophan-Fluoreszenz-Spektroskopie kann jedoch zu Falsch-Positiven führen, da in machen Fällen Spektren von löslichen Mikroaggregaten kaum unterscheidbar sind von Spektren des nativ gefalteten Proteins. Dies zusammenfassend wurde eine schnelle und zuverlässige Testprozedur entwickelt, um Inclusion Body-Proteine einer strukturellen und funktionellen Analyse zugänglich zu machen. In einem separaten Projekt wurden 88 verschiedene E. coli-Expressionskonstrukte für 17 humane Proteindomänen, welche durch Sequenzanalyse identifiziert wurden, mit einer Hochdurchsatzreinigung und –faltungsanalytik untersucht, um für die Strukturanalyse geeignete Kandidaten zu erhalten. Nach Expression in einem Milliliter im 96er Mikrotiterplattenformat und automatisierter Proteinreinigung wurden löslich exprimierte Proteindomänen direkt analysiert mittels 1D ¹H-NMR Spektroskopie. Hierbei zeigte sich, dass insbesondere isolierte Methylgruppen-Signale unter 0.5 ppm sensitive und zuverlässige Sonden sind für gefaltetes Protein. Zusätzlich zeigte sich, dass – ähnlich zur Evaluierung des Faltungstests – analytische HIC effizient eingesetzt werden kann zur Identifizierung von Konstrukten, welche kompakt gefaltetes Protein ergeben. Sechs Konstrukte, welche zwei Domänen repräsentieren, konnten schnell als tauglich für die Strukturanalyse gefunden werden. Die Struktur einer dieser Domänen wurde kürzlich von Mitarbeitern gelöst, die andere Struktur wurde im Laufe dieses Projektes von einer anderen Gruppe veröffentlicht.
N2 - For recombinant production of proteins for structural and functional analyses, the E. coli expression system is the most widely used due to high yields and straightforward processing. However, particularly the expression of eukaryotic proteins in E. coli is often problematic, e.g. when the protein is not folded correctly and is deposited in insoluble inclusion bodies. In some cases it is favourable to analyse deletion constructs of a protein or an individual protein domain instead of the full-length protein. This implies the generation of a set of expression constructs that need to be characterised. In this work methods to optimise and evaluate in vitro folding of inclusion body proteins as well as high-throughput characterisation of expression constructs were developed. Transferring inclusion body proteins to their native state involves two steps: (a) solubilisation with a chaotropic reagent or a strong ionic detergent and (b) folding of the protein by removal of the chaotrop accompanied by the transfer into an appropriate buffer. The yield of natively folded protein is often substantially reduced due to aggregation or misfolding; it may, however, be improved by certain additives to the folding buffer. These additives need to be identified empirically. In this thesis a screening procedure for folding conditions was developed. To reduce the number of possible combinations of screening additives, empirical observations documented in the literature as well as well known properties of certain screening additives were considered. To decrease the amount of protein and work invested, the screen was miniaturised and automated using a pipetting robot. Twenty rapid dilution conditions for the denatured protein are tested and two conditions for folding of proteins using the detergent/cyclodextrin protein folding system of Rozema et al. (1996). 100 µg protein is used per condition. In addition, eight conditions can be tested for folding of His-tagged proteins (approx. 200 µg) immobilised on metal chelate resins. The screen was successfully applied to fold a human protein, the p22 subunit of dynactin that is expressed in inclusion bodies in E. coli. For p22 dynactin – as is the case for many proteins – there was no biological assay available to assess the success of the folding screen. Protein solubility can not be used as a stringent criterion because beside natively folded protein, soluble misfolded species and microaggregates may occur. This work evaluates methods to detect small amounts of natively folded protein after automated folding screening. Before folding screening with p22 dynactin, two model enzymes, bovine carbonic anhydrase II (CAB) and pig heart mitochondrial malate dehydrogenase, were used for evaluation. Recovered activity after refolding was correlated to different biophysical methods. 8-anilino-1-naphtalenesulfonic acid binding-experiments gave no useful information when refolding CAB, due to low sensitivity and because misfolded protein could not be readily distinguished from native protein. Tryptophan fluorescence spectra of refolded CAB were used to assess the success of refolding. The shift of the intensity maximum to a shorter wavelength, compared to the denaturant unfolded protein, as well as the fluorescence intensity correlated to recovered enzymatic activity. For both model enzymes, analytical hydrophobic interaction chromatography (HIC) was useful to identify refolded samples that contain active enzyme. Compactly folded, active enzyme eluted in a distinct peak in a decreasing ammonium sulfate gradient. The detection limit of analytical HIC was approx. 5 µg. In case of CAB, tryptophan fluorescence spectroscopy and analytical HIC showed that both methods in combination can be useful to rule out false positives or false negatives obtained with one method. These two methods were also useful to identify conditions for folding of p22 dynactin. However, tryptophan fluorescence spectroscopy can lead to false positives because in some cases spectra of soluble microaggregates are not well distinguishable from spectra of natively folded protein. In summary, a fast and reliable screening procedure was developed to make inclusion body proteins accessible to structural or functional analyses. In a separate project, 88 different E. coli expression constructs for 17 human protein domains that had been identified by sequence analysis were analysed using high-throughput purification and folding analysis in order to obtain candidates suitable for structural analysis. After 96 deep-well microplate expression and automated protein purification, solubly expressed protein domains were directly analysed using 1D ¹H-NMR spectroscopy. It was found that isolated methyl group signals below 0.5 ppm are particularly sensitive and reliable probes for folded protein. In addition – similar to the evaluation of a folding screen – analytical HIC proved to be an efficient tool for identifying constructs that yield compactly folded protein. Both methods, 1D ¹H-NMR spectroscopy and analytical HIC, provided complementary results. Six constructs, representing two domains, could be quickly identified as targets that are well suitable for structural analysis. The structure of one of these domains was solved recently by co-workers, the other structure was published by another group during this project.
T2 - High-throughput evaluation of protein folding conditions and expression constructs for structural genomics
KW - Strukturproteomics
KW - Proteinfaltungstest
KW - Proteindomänen
KW - structural genomics
KW - protein folding screen
KW - protein domains
Y1 - 2004
U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0001552
ER -
TY - THES
A1 - Walter, Monika
T1 - Die parallele beta-Helix der Pektat-Lyase aus Bacillus subtilis : Stabilität, Faltungsmechanismus und Faltungsmutanten
N2 - Die Pektat-Lyasen gehören zu einer Proteinfamilie, die meistens von pflanzenpathogenen Mikroorganismen sekretiert werden. Die Enzyme katalysieren den Abbau von Polygalakturonsäure, einem Hauptbestandteil in pflanzlichen Mittellamellen und Primärzellwänden. Der Abbau der alpha-1,4-verbrückten Galakturonsäurereste erfogt durch eine beta-Eliminierungsreaktion, dabei entsteht ein Produkt mit einer ungesättigten C4-C5 Bindung am nicht reduzierenden Ende, das durch spektroskopische Messungen beobachtet werden kann. Für die enzymatische Reaktion der Pektat-Lyasen ist Calcium nötig und das pH-Optimum der Reaktion liegt bei pH 8.5. Alle bis jetzt bekannten Strukturen der Pektat- und Pektin-Lyasen haben das gleiche Strukturmotiv - eine rechtsgängige parallele beta-Helix. Die Struktur der Pektat-Lyase aus Bacillus subtilis (BsPel) ist im Komplex mit Calcium gelöst worden. BsPel ist ein monomeres Protein mit einer ungefähren Molekularmasse von 43 kDa, das keine Disulfidbrücken enthält. Dies erlaubte sowohl eine effiziente rekombinante Expression des Wildtypproteins, als auch von destabilisierten Mutanten im Cytoplasma von E. coli. Parallele beta-Helices sind relativ große, jedoch verhältnismäßig einfach aufgebaute Proteine. Um detailliertere Informationen über die kritischen Schritte bei der in vitro-Faltung von parallelen beta-Helices zu erhalten, sollte in der vorliegenden Arbeit versucht werden, den Faltungsmechanismus dieses Proteins näher zu charakterisieren. Dabei sollte vor allem die Frage geklärt werden, welche Wechselwirkungen für die Stabilität dieses Proteins einerseits und für die Stabilität von essentiellen Faltungsintermediaten andererseits besonders wichtig sind.
Rückfaltung von BsPel, ausgehend vom guanidiniumchlorid-denaturierten Zustand, war bei kleinen Proteinkonzentrationen und niedrigen Temperaturen vollständig möglich. GdmCl-induzierte Faltungsübergänge waren aber nicht reversibel und zeigten eine apparente Hysterese. Kinetische Messungen des Fluoreszenz- und CD-Signals im fernen UV ergaben eine extreme Denaturierungsmittelabhängigkeit der Rückfaltungsrate im Bereich des Übergangmittelpunktes. Der extreme Abfall der Rückfaltungsraten mit steigender Denaturierungsmittelkonzentration kann als kooperative Entfaltung eines essentiellen Faltungsintermediats verstanden werden. Dieses Faltungsintermediat ist temperaturlabil und kann durch den Zusatz Glycerin im Renaturierungspuffer stabilisiert werden, wobei sich die Hysterese verringert, jedoch nicht vollständig aufgehoben wird. Durch reverse Doppelsprungexperimente konnten zwei transiente Faltungsintermediate nachgewiesen werden, die auf zwei parallelen Faltungswegen liegen und beide zum nativen Zustand weiterreagieren können. Fluoreszenzemissionsspektren der beiden Intermediate zeigten, daß beide schon nativähnliche Struktur aufweisen. Kinetische Daten von Prolin-Doppelsprungexperimenten zeigten, daß Prolinisomerisierung den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt in der Reaktivierung des denaturierten Enzyms darstellt. Desweiteren konnte durch Prolin-Doppelsprungexperimenten an Mutanten mit Substitutionen im Prolinrest 281 gezeigt werden, daß die langsame Renaturierung von BsPel nicht durch die Isomerisierung der einzigen cis-Peptidbindung an Prolin 281 verursacht wird, sondern durch die Isomerisierung mehrerer trans-Proline. Die beiden beobachteten transienten Faltungsintermediate sind somit wahrscheinlich zwei Populationen von Faltungsintermediaten mit nicht-nativen X-Pro-Peptidbindungen, wobei sich die Populationen durch mindestens eine nicht-native X-Pro-Peptidbindung unterscheiden.
Der Austausch des Prolinrestes 281 gegen verschiedene Aminosäuren (Ala, Ile, Leu, Phe, Gly) führte zu einer starken Destabilisierung des nativen Proteins und daneben auch zu einer Reduktion in der Aktivität, da die Mutationsstelle in der Nähe der putativen Substratbindetasche liegt. Die Rückfaltungskinetiken der Prolinmutanten war bei 10°C annähernd gleich zum Wildtyp und die geschwindigkeitsbestimmenden Schritte der Faltung waren durch die Mutation nicht verändert. Die durch die Mutation verursachte drastische Destabilisierung des nativen Zustands führte zu einem reversiblen Entfaltungsgleichgewicht bei pH 7 und 10°C. GdmCl-induzierte Faltungsübergänge der Mutante P281A zeigten bei Messungen der Tryptophanfluoreszenzemission und der Aktivität einen kooperativen Phasenübergang mit einem Übergangsmittelpunkt bei 1.1 M GdmCl. Durch die Übereinstimmung der Faltungsübergänge bei beiden Messparametern konnten die Faltungsübergänge nach dem Zwei-Zustandsmodell ausgewertet werden. Dabei wurde eine freie Sabilisierungsenthalpie der Faltung für die Mutante von - 64.2 ± 0.4 kJ/mol und eine Kooperativität des Übergangs von - 58.2 ± 0.3 kJ/(mol·M) bestimmt.
BsPel enthält, wie die meisten monomeren rechtsgängigen parallelen beta-Helix-Proteine, einen internen Stapel wasserstoffverbrückter Asparagin-Seitenketten. Die Mehrheit der erzeugten Mutanten mit Substitutionen im Zentrum der Asn-Leiter (N271X) waren als enzymatisch aktives Protein zugänglich. Die Auswirkung der Mutation auf die Stabilität und Rückfaltung wurde an den Proteinen BsPel-N271T und BsPel-N271A näher analysiert. Dabei führte die Unterbrechung des Asparaginstapels im Inneren der beta-Helix zu keiner drastischen Destabilisierung des nativen Proteins. Allerdings führten diese Mutationen zu einem temperatur-sensitiven Faltungsphänotyp und die Hysterese im Denaturierungsübergang wurde verstärkt. Offenbar wird durch die Unterbrechung des Asparaginstapel ein essentielles, thermolabiles Faltungsintermediat destabilisiert. Der Asparaginstapel wird somit bei der Faltung sehr früh ausgebildet und ist wahrscheinlich schon im Übergangszustand vorhanden.
N2 - Pectate lyases belong to a family of proteins secreted by plant pathogenic microbes. The enzymes cleave alpha-1,4 linked galacturonic acid by a beta-elimination that results in an unsaturated product, which can be quantified spectrophotometrically. Calcium is essential for the activity and the pH-optimum is near 8.5. All known structures of pectate and pectin lyases have the same structural motif - a right handed parallel beta-helix. The structure of pectate lyase from Bacillus subtilis (BsPel) has been solved in complex with calcium. It is a monomeric protein, with a molecular mass of about 43 kDa and without disulfide bonds. This allows its high-yield recombinant expression in the cytoplasm of Escherichia coli. Parallel beta-helices are relative large proteins, however with a simple folding topology. The objective of this work was to characterize the folding mechanism of BsPel. In particular we investigated the role of the interactions of certain residues in the parallel beta-helix for the stability of the native protein and the stability of essential folding intermediates. Refolding of BsPel was possible at low protein concentrations and low temperature. However, denaturation of BsPel was not freely reversible. De- and renaturation curves showed a large apparent hysteresis. Furthermore, the folding rate constant deduced from fluorescence and circulardichroism measurements showed a very strong dependence on denaturant concentrations near the midpoint of the renaturation transition. This can be explained with a cooperative unfolding of an essential folding intermediate. Upon stabilisation of the temperature-sensitive intermediate by addition of glycerol in the renaturation buffer, the hysteresis is reduced, but does not disappear. Reverse double mixing kinetic experiments have shown that two transient folding intermediates are on the folding pathway. These intermediates are on parallel pathways and both can fold to the native state. Fluorescence emission spectra have shown the native-like structure of both intermediates. Furthermore, data from proline double mixing kinetic experiments revealed that isomerization of peptidyl-prolyl bonds was responsible for the slow kinetics in the reactivation of the enzyme. However, the isomerization of the single cis-peptidyl-prolyl bond at Pro281 was not responsible for the slowest folding phase observed, but rather the isomerization of other trans-peptidyl-prolyl bonds. Thus, both transient folding intermediates observed probably represent two populations of folding intermediates with non-native X-Pro-peptide bonds. The difference of the two populations is at least one non-native X-Pro-peptide bond. Mutations of the proline 281 against various residues (Ala, Ile, Leu, Phe, Gly) resulted in a strong destabilization of the native protein. Also, the activity of the mutant proteins was strong reduced due to the position of the mutation site near the putative active center of the protein. At 10°C the kinetic folding behavior of the proline mutants was not significant changed. However, the strong destabilization of the native state in the proline mutants resulted in a reversible folding equilibrium at pH 7 and 10°C. The unfolding of the P281A mutant was reversible as determined by fluorescence emission and enzyme activity measurements. The coincidence of these detected transitions is consistent with a two-state equilibrium transition. At pH 7 and 10°C the delta G°(H2O) for folding of P281A was - 64.2 ± 0.4 kJ/mol, with a midpoint of the transition at 1.1 M GdmCl and a cooperativity of - 58.2 ± 0.3 kJ/(mol·M). BsPel has an asparagine ladder in turn 2 of the parallel beta-helix with extensive network of side-chain hydrogen bonds between the Asn residues. Such an Asn-ladder is a conserved feature of many monomeric beta-helices crystallized so far. The middle Asn residue (271) was selected and exchanged for various residues. Most of the mutants were expressed at 25°C as soluble and active proteins but with a significant reduction in yield. Mutants N271T and N271A were selected to study the stability and refolding of these proteins in comparison with the wild-type protein. The substitution in the Asn-ladder did not drastically destabilize the native protein, but caused a temperature-sensitive-folding (tsf) phenotype with an increased hysteresis in the de- and renaturation transition curves. In addition, the disruption of the Asn-ladder resulted in destabilization of an essential, thermosensitive folding intermediate. Thus, the Asn-ladder is formed very early during the folding, probably well before the transition state of folding.
KW - Heubacillus ; Pectat-Lyase ; Helix
KW - apparente Hysterese
KW - parallele rechtsgängige beta-Helix
KW - Pektat-Lyase
KW - Peptidyl-Prolyl-cis-trans Isomerisierung
KW - Proteinfaltung
KW - temperatur-sensitive
KW - apparent hysteresis
KW - cis-trans isomerisation of prolyl-peptide bonds
KW - parallel beta-helix
KW - pectate lyase
KW - protein folding
KW - temperature sensitive foldi
Y1 - 2002
U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0000588
ER -