TY - THES A1 - Raschke, Stefanie T1 - Characterization of selenium and copper in cell systems of the neurovascular unit T1 - Charakterisierung von Selen und Kupfer in Zellsystemen der neurovaskulären Einheit N2 - The trace elements, selenium (Se) and copper (Cu) play an important role in maintaining normal brain function. Since they have essential functions as cofactors of enzymes or structural components of proteins, an optimal supply as well as a well-defined homeostatic regulation are crucial. Disturbances in trace element homeostasis affect the health status and contribute to the incidence and severity of various diseases. The brain in particular is vulnerable to oxidative stress due to its extensive oxygen consumption and high energy turnover, among other factors. As components of a number of antioxidant enzymes, both elements are involved in redox homeostasis. However, high concentrations are also associated with the occurrence of oxidative stress, which can induce cellular damage. Especially high Cu concentrations in some brain areas are associated with the development and progression of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease (AD). In contrast, reduced Se levels were measured in brains of AD patients. The opposing behavior of Cu and Se renders the study of these two trace elements as well as the interactions between them being particularly relevant and addressed in this work. N2 - Die Spurenelemente Selen (Se) und Kupfer (Cu) spielen eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung einer normalen Ge¬hirnfunktion. Da sie wesentliche Funktionen als Cofaktoren von Enzymen oder Strukturbestandteile von Proteinen haben, sind eine optimale Versorgung sowie eine genau definierte homöostatische Regulierung von entscheidender Bedeutung. Störungen der Spurenelement-homöostase beeinträchtigen den Gesund¬heitszustand und tragen zum Auftreten und zur Schwere verschiedener Krankheiten bei. Insbesondere das Gehirn ist aufgrund seines hohen Sauerstoffverbrauchs und seines hohen Energieumsatzes anfällig für oxi¬dativen Stress. Als Bestandteile einer Reihe von antioxidativen Enzymen sind beide Elemente an der Redox-Homöostase beteiligt. Hohe Konzentrationen werden jedoch auch mit dem Auftreten von oxidati¬vem Stress in Verbindung gebracht, der zu Zellschäden führen kann. Besonders hohe Cu-Konzentrationen in einigen Hirnregionen werden mit der Entwicklung und der Progression neurodegenerativer Erkran¬kungen wie Alzheimer in Verbindung gebracht. Im Gegensatz dazu wurden in den Gehirnen von Alzheimer-Patienten geringere Se-Konzentrationen gemessen. Das gegensätzliche Verhalten von Cu und Se verdeutlicht die Relevanz der Untersuchung dieser beiden Spurenelemente sowie deren Wechselwirkungen und wird in dieser Arbeit thematisiert. KW - selenium KW - copper KW - Selen KW - Kupfer KW - Blut-Hirn-Schranke KW - Neuronen KW - Astrozyten KW - blood-brain barrier KW - neurons KW - astrocytes Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-603666 ER - TY - THES A1 - Prada, Marcela T1 - Fatty acid biomarkers of intake and metabolism and their association with type 2 diabetes N2 - Background: The role of fatty acid (FA) intake and metabolism in type 2 diabetes (T2D) incidence is controversial. Some FAs are not synthesised endogenously and, therefore, these circulating FAs reflect dietary intake, for example, the trans fatty acids (TFAs), saturated odd chain fatty acids (OCFAs), and linoleic acid, an n-6 polyunsaturated fatty acids (PUFA). It remains unclear if intake of TFA influence T2D risk and whether industrial TFAs (iTFAs) and ruminant TFAs (rTFAs) exert the same effect. Unlike even chain saturated FAs, the OCFAs have been inversely associated with T2D risk, but this association is poorly understood. Furthermore, the associations of n-6 PUFAs intake with T2D risk are still debated, while delta-5 desaturase (D5D), a key enzyme in the metabolism of PUFAs, has been consistently related to T2D risk. To better understand these relationships, the FA composition in circulating lipid fractions can be used as biomarkers of dietary intake and metabolism. The exploration of TFAs subtypes in plasma phospholipids and OCFAs and n-6 PUFAs within a wide range of lipid classes may give insights into the pathophysiology of T2D. Aim: This thesis aimed mainly to analyse the association of TFAs, OCFAs and n-6 PUFAs with self-reported dietary intake and prospective T2D risk, using seven types of TFAs in plasma phospholipids and deep lipidomics profiling data from fifteen lipid classes. Methods: A prospective case-cohort study was designed within the European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition (EPIC)-Potsdam study, including all the participants who developed T2D (median follow-up 6.5 years) and a random subsample of the full cohort (subcohort: n=1248; T2D cases: n=820). The main analyses included two lipid profiles. The first was an assessment of seven TFA in plasma phospholipids, with a modified method for analysis of FA with very low abundances. The second lipid profile was derived from a high-throughout lipid profiling technology, which identified 940 distinct molecular species and allowed to quantify OCFAs and PUFAs composition across 15 lipid classes. Delta-5 desaturase (D5D) activity was estimated as 20:4/20:3-ratio. Using multivariable Cox regression models, we examined the associations of TFA subtypes with incident T2D and class-specific associations of OCFA and n-6 PUFAs with T2D risk. Results: 16:1n-7t, 18:1n-7t, and c9t11-CLA were positively correlated with the intake of fat-rich dairy foods. iTFA 18:1 isomers were positively correlated with margarine. After adjustment for confounders and other TFAs, higher plasma phospholipid concentrations of two rTFAs were associated with a lower incidence of T2D: 18:1n-7t and t10c12-CLA. In contrast, the rTFA c9t11-CLA was associated with a higher incidence of T2D. rTFA 16:1n-7t and iTFAs (18:1n-6t, 18:1n-9t, 18:2n-6,9t) were not statistically significantly associated with T2D risk. We observed heterogeneous integration of OCFA in different lipid classes, and the contribution of 15:0 versus 17:0 to the total OCFA abundance differed across lipid classes. Consumption of fat-rich dairy and fiber-rich foods were positively and red meat inversely correlated to OCFA abundance in plasma phospholipid classes. In women only, higher abundances of 15:0 in phosphatidylcholines (PC) and diacylglycerols (DG), and 17:0 in PC, lysophosphatidylcholines (LPC), and cholesterol esters (CE) were inversely associated with T2D risk. In men and women, a higher abundance of 15:0 in monoacylglycerols (MG) was also inversely associated with T2D. Conversely, a higher 15:0 concentration in LPC and triacylglycerols (TG) was associated with higher T2D risk in men. Women with a higher concentration of 17:0 as free fatty acids (FFA) also had higher T2D incidence. The integration of n-6 PUFAs in lipid classes was also heterogeneous. 18:2 was highly abundant in phospholipids (particularly PC), CE, and TG; 20:3 represented a small fraction of FA in most lipid classes, and 20:4 accounted for a large proportion of circulating phosphatidylinositol (PI) and phosphatidylethanolamines (PE). Higher concentrations of 18:2 were inversely associated with T2D risk, especially within DG, TG, and LPC. However, 18:2 as part of MG was positively associated with T2D risk. Higher concentrations of 20:3 in phospholipids (PC, PE, PI), FFA, CE, and MG were linked to higher T2D incidence. 20:4 was unrelated to risk in most lipid classes, except positive associations were observed for 20:4 enriched in FFA and PE. The estimated D5D activities in PC, PE, PI, LPC, and CE were inversely associated with T2D and explained variance of estimated D5D activity by genomic variation in the FADS locus was only substantial in those lipid classes. Conclusion: The TFAs' conformation is essential in their relationship to diabetes risk, as indicated by plasma rTFA subtypes concentrations having opposite directions of associations with diabetes risk. Plasma OCFA concentration is linked to T2D risk in a lipid class and sex-specific manner. Plasma n-6 PUFA concentrations are associated differently with T2D incidence depending on the specific FA and the lipid class. Overall, these results highlight the complexity of circulating FAs and their heterogeneous association with T2D risk depending on the specific FA structure, lipid class, and sex. My results extend the evidence of the relationship between diet, lipid metabolism, and subsequent T2D risk. In addition, my work generated several potential new biomarkers of dietary intake and prospective T2D risk. N2 - Die Rolle der Fettsäureaufnahme und des Fettsäurestoffwechsels bei der Prävention von Typ-2-Diabetes (T2D) ist nach wie vor umstritten. Die Fettsäure (FS)-Zusammensetzung in den Blutfettfraktionen kann als Biomarker für die Nahrungsaufnahme und den Stoffwechsel verwendet werden, um die Beziehung zwischen den FS und dem T2D-Risiko besser zu verstehen. Das Hauptziel dieser Arbeit war es, den Zusammenhang zwischen zirkulierenden trans-FS (TFS), ungeradkettigen gesättigten FS (UGFS) und n-6 poly ungesättigte FS (PUFS), die in verschiedenen Lipidklassen angereichert sind, mit dem T2D-Risiko zu untersuchen. Mit einer eingebetten Fall-Kohorten-Studie, die im Rahmen der prospektiven EPIC-Potsdam-Studie konzipiert wurde, untersuchte diese Arbeit zwei Lipidprofile im Hinblick auf das T2D-Risiko: (1) Sieben TFS-Subtypen in Plasma-Phospholipiden und (2) die Zusammensetzung von UGFS und PUFA in 15 Plasma-Lipidklassen. Die Aktivität der Delta-5-Desaturase (D5D) wurde als 20:4/20:3-Verhältnis geschätzt. Assoziationen mit dem Auftreten von T2D wurden mit multivariablen Cox-Regressionsmodellen untersucht. Von den üblicherweise aus Milchprodukten stammenden TFS waren 18:1n-7t und t10c12-CLA mit einer geringeren T2D-Inzidenz, c9t11-CLA mit einer höheren Inzidenz und 16:1n-7t nicht mit dem T2D-Risiko assoziiert. TFS aus industriellen Quellen (18:1n-6t, 18:1n-9t, 18:2n-6t) zeigten keinen statistisch signifikanten Zusammenhang mit dem T2D-Risiko. Die UGFS-Konzentration im Plasma war mit dem T2D-Risiko auf lipidklassen- und geschlechtsspezifische Weise assoziiert, wobei bei Frauen stärkere inverse Zusammenhänge für 15:0 in Monoacylglycerinen (MG), Phosphatidylcholinen (PC) und Diacylglycerinen (DG) sowie für 17:0 in PC, Lysophosphatidylcholinen (LPC) und Cholesterinestern (CE) beobachtet wurden. Höhere Konzentrationen von 18:2 waren in DG, TG und LPC invers mit dem T2D-Risiko assoziiert, während MG(18:2) positiv mit dem T2D-Risiko assoziiert war. Höhere Konzentrationen von 20:3 in Phospholipiden (PC, PE, Phosphatidylinositole (PI)), Fettsäuren (FFS), CE und MG waren mit einer höheren T2D-Inzidenz verbunden. 20:4 stand in den meisten Lipidklassen in keinem statistisch singifikanten Zusammenhang mit dem Risiko, außer bei in FFS und PE angereichertem 20:4, das positiv assoziiert war. Die geschätzten D5D-Aktivitäten in PC, PE, PI, LPC und CE waren invers mit dem T2D-Risiko assoziiert. Zusammenfassend ist die Konformation der TFS für ihren Zusammenhang mit dem Diabetesrisiko entscheidend. Die Assoziationen der UGFS-Plasma-Konzentrationen mit dem T2D-Risiko zeigten lipidklassen- und geschlechtsspezifische Unterschiede. Die Plasma-Konzentrationen der n-6-PUFA waren je nach spezifischer FA und Lipidklasse unterschiedlich mit der T2D-Inzidenz assoziiert. Insgesamt unterstreichen diese Ergebnisse die Komplexität der zirkulierenden FAs und ihren heterogenen Zusammenhang mit dem T2D-Risiko in Abhängigkeit der spezifischen FA-Struktur, der Lipidklasse und des Geschlechtes. KW - fatty acids KW - lipidomics KW - type 2 diabetes KW - trans fatty acids KW - odd chain fatty acids KW - polyunsaturated fatty acids KW - Fettsäuren KW - Lipidomics KW - Typ-2-Diabetes KW - Biomarker KW - Lipidstoffwechsel KW - Trans-Fettsäuren KW - ungeradkettige Fettsäuren KW - poly ungesättigte Fettsäuren Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-581598 ER - TY - THES A1 - Rausch, Theresa T1 - Role of intestinal bacteria in the conversion of dietary sulfonates N2 - Over the last decades, interest in the impact of the intestinal microbiota on host health has steadily increased. Diet is a major factor that influences the gut microbiota and thereby indirectly affects human health. For example, a high fat diet rich in saturated fatty acids led to an intestinal proliferation of the colitogenic bacterium Bilophila (B.) wadsworthia by stimulating the release of the bile acid taurocholate (TC). TC contains the sulfonated head group taurine, which undergoes conversion to sulfide (H2S) by B. wadsworthia. In a colitis prone murine animal model (IL10 / mice), the bloom of B. wadsworthia was accompanied by an exacerbation of intestinal inflammation. B. wadsworthia is able to convert taurine and also other sulfonates to H2S, indicating the potential association of sulfonate utilization and the stimulation of colitogenic bacteria. This potential link raised the question, whether dietary sulfonates or their sulfonated metabolites stimulate the growth of colitogenic bacteria such as B. wadsworthia and whether these bacteria convert sulfonates to H2S. Besides taurine, which is present in meat, fish and life-style beverages, other dietary sulfonates are part of daily human nutrition. Sulfolipids such as sulfoquinovosyldiacylglycerols (SQDG) are highly abundant in salad, parsley and the cyanobacterium Arthrospira platensis (Spirulina). Based on previous findings, Escherichia (E.) coli releases the polar headgroup sulfoquinovose (SQ) from SQDG. Moreover, E. coli is able to convert SQ to 2,3 dihydroxypropane 1 sulfonate (DHPS) under anoxic conditions. DHPS is also converted to H2S by B. wadsworthia or by other potentially harmful gut bacteria such as members of the genus Desulfovibrio. However, only few studies report the conversion of sulfonates to H2S by bacteria directly isolated from the human intestinal tract. Most sulfonate utilizing bacteria were obtained from environmental sources such as soil or lake sediment or from potentially intestinal sources such as sewage. In the present study, fecal slurries from healthy human subjects were incubated with sulfonates under strictly anoxic conditions, using formate and lactate as electron donors. Fecal slurries that converted sulfonates to H2S, were used as a source for the isolation of H2S forming bacteria. Isolates were identified based on their 16S ribosomal RNA (16S rRNA) gene sequence. In addition, conventional C57BL/6 mice were fed a semisynthetic diet supplemented with the SQDG rich Spirulina (SD) or a Spirulina free control diet (CD). During the intervention, body weight, water and food intake were monitored and fecal samples were collected. After three weeks, mice were killed and organ weight and size were measured, intestinal sulfonate concentrations were quantified, gut microbiota composition was determined and parameters of intestinal and hepatic fat metabolism were analyzed. Human fecal slurries converted taurine, isethionate, cysteate, 3 sulfolacate, SQ and DHPS to H2S. However, inter individual differences in the degradation of these sulfonates were observed. Taurine, isethionate, and 3 sulfolactate were utilized by fecal microbiota of all donors, while SQ, DHPS and cysteate were converted to H2S only by microbiota from certain individuals. Bacterial isolates from human feces able to convert sulfonates to H2S were identified as taurine-utilizing Desulfovibrio strains, taurine- and isethionate-utilizing B. wadsworthia, or as SQ- and 3-sulfolactate- utilizing E. coli. In addition, a co culture of E. coli and B. wadsworthia led to complete degradation of SQ to H2S, with DHPS as an intermediate. Of the human fecal isolates, B. wadsworthia and Desulfovibrio are potentially harmful. E. coli strains might be also pathogenic, but isolated E. coli strains from human feces were identified as commensal gut bacteria. Feeding SD to mice increased the cecal and fecal SQ concentration and altered the microbiota composition, but the relative abundance of SQDG or SQ converting bacteria and colitogenic bacteria was not enriched in mice fed SD for 21 days. SD did not affect the relative abundance of Enterobacteriaceae, to which the SQDG- and SQ-utilizing E. coli strain belong to. Furthermore, the abundance of B. wadsworthia decreased from day 2 to day 9 in feces, but recovered afterwards in the same mice. In cecum, the family Desulfovibrionaceae, to which B. wadsworthia and Desulfovibrio belong to, were reduced. No changes in the number of B. wadsworthia in cecal contents or of Desulfovibrionaceae in feces were observed. SD led to a mild activation of the immune system, which was not observed in control mice fed CD. Mice fed SD had an increased body weight, a higher adipose tissue weight, and a decreased liver weight compared to the control mice, suggesting an impact of Spirulina supplementation on fat metabolism. However, expression levels of genes involved in intestinal and hepatic intracellular lipid uptake and availability were reduced. Further investigations on the lipid metabolism at protein level could help to clarify these discrepancies. In summary, humans differ in the ability of their fecal microbiota to utilize dietary sulfonates. While sulfonates stimulated the proliferation of potentially colitogenic isolates from human fecal slurries, the increased availability of SQ in Spirulina fed conventional mice did not lead to an enrichment of such bacteria. Presence or absence of these bacteria may explain the inter individual differences in sulfonate conversion observed for fecal slurries. This work provides new insights in the ability of intestinal bacteria to utilize sulfonates and thus, contributes to a better understanding of microbiota-mediated effects on dietary sulfonate utilization. Interestingly, feeding of the Spirulina-supplemented diet led to body-weight gain in mice in the first two days of intervention, the reasons for which are unknown. N2 - Die Darmmikrobiota hat auf die menschliche Gesundheit einen großen Einfluss. Nahrungskom-ponente sind die Hauptquelle für bakterielle Substrate und beeinflussen somit das Wachstum von Darmbakterien. In einer Studie mit Mäusen führte z.B. eine Hochfettdiät zu einer erhöhten Freisetzung der Gallensäure Taurocholat (TC), was wiederum zur Anreicherung des kolitogenen Bakteriums Bilophila (B.) wadsworthia führte. In einem Interleukin-10-defizienten Maus-Model für Kolitis, führte eine erhöhte intestinale Verfügbarkeit von TC zu Darmentzündungen und Wachstum von B. wadsworthia. TC enthält den sulfonierten Taurin-Rest, der auch in Nahrungsmitteln wie Fisch und Fleisch enthalten ist, und von B. wadsworthia genutzt und zu Sulfid (H2S) reduziert werden kann. Bisher gibt es jedoch nur wenige Studien, welche die Umwandlung von Sulfonaten in H2S durch Darmbakterien belegen, wobei auch H2S mit Darmentzündungen in Verbindung gebracht wird. Aus diesen Literaturdaten resultierten die Fragen, ob Sulfonate aus der Nahrung das Wachstum von kolitogenen Bakterien wie B. wadsworthia stimulieren und ob diese Bakterien Sulfonate zu H2S umwandeln können. Weitere Nahrungsmittel-Sulfonate sind die Sulfolipide Sulfoquinovosyldiacylglycerole (SQDG) in Salaten, Petersilie und Spirulina. Escherichia (E.) coli kann Sulfoquinovose (SQ) aus SQDG abspalten und in 2,3-Dihydroxypropan-1-sulfonat (DHPS) umwandeln, welches wiederum von B. wadsworthia oder einem Desulfovibrio-Stamm, einem anderen potenziell kolitogenem Darmbakterium, verwendet und zu H2S reduziert werden kann. In der vorliegenden Arbeit wurden Fäzes-Suspensionen von gesunden Menschen unter strikt anoxischen Bedingungen mit Sulfonaten und Formiat und Laktat als Elektronendonoren inkubiert. Aus den Fäzes-Suspensionen wurden H2S-bildende Bakterienstämme isoliert und identifiziert. Zusätzlich wurden konventionelle C57BL/6-Mäuse mit einer semisynthetischen Diät, welche mit SQDG-reicher Spirulina supplementiert war (SD), gefüttert. Während des Versuchs wurde das Körpergewicht der Mäuse, deren Wasser- und Nahrungsaufnahme bestimmt und Fäzesproben gesammelt. Nach drei Wochen wurden die intestinale Sulfonatkonzentration, die Zusammensetzung der Mikrobiota und die Parameter des hepatischen und intestinalen Fettstoffwechsels bestimmt. Die Ergebnisse zeigten, dass humane Fäzes-Suspensionen Taurin, Isethionat, Cysteat, 3-Sulfolaktat, SQ und DHPS mit interindividuellen Unterschieden zu H2S umwandeln. Als Sulfonat-umsetzende Bakterien wurden Stämme der Gattung Desulfovibrio, B. wadsworthia oder E. coli isoliert, wobei die Desulfovibrio-Stämme Taurin, B. wadsworthia Taurin und Isethionat und E. coli SQ und 3-Sulfolaktat zu H2S reduzieren konnten. Eine Kokultivierung von E. coli und B. wadsworthia zeigte den vollständigen Abbau von SQ über DHPS zu H2S. Die Gabe von SD an Mäuse erhöhte die intestinale SQ-Konzentration und veränderte die Mikrobiota-Zusammensetzung, jedoch war die Zellzahl von SQDG- oder SQ-umwandelnden Bakterien und kolitogenen Bakterien nicht erhöht. Die Zellzahl von B. wadsworthia in denselben Mäusen von Tag 2 bis 9 ab, normalisierte sich danach aber wieder. Im Zäkum war die Familie der Desulfovibrionaceae reduziert, zu welcher B. wadsworthia und Desulfovibrio-Stämme gehören. SD führte zu einer schwachen Aktivierung des Immunsystems und zur Erhöhung des Körpergewichtes. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Darmbakterien in der Lage sind, Sulfonate aus der Nahrung mit interindividuellen Unterschieden zu verwerten. Das Vorkommen von Bakterien könnte diese Unterschiede erklären. Diese Studie ermöglicht es uns, die biologische Rolle der mit der Nahrung aufgenommenen Sulfonate zu verstehen und könnte neue Erkenntnisse über die Fähigkeit der Darmbakterien zur Verwertung von Sulfonaten liefern. T2 - Die Rolle von Darmbakterien bei der Umsetzung von Nahrungsmittel-Sulfonaten KW - microbiology KW - Bilophila wadsworthia KW - sulfide KW - intestinal KW - Bilophila wadsworthia KW - intestinal KW - Mikrobiologie KW - Sulfid KW - dietary sulfonates KW - Nahrungssulfonate Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-574036 ER - TY - THES A1 - Drobyshev, Evgenii T1 - Toxic or beneficial? What is the role of food-relevant selenium species selenoneine? T1 - Giftig oder nützlich? Welche Rolle spielt die lebensmittelrelevante Selenspezies Selenonein? N2 - Selenium (Se) is an essential trace element that is ubiquitously present in the environment in small concentrations. Essential functions of Se in the human body are manifested through the wide range of proteins, containing selenocysteine as their active center. Such proteins are called selenoproteins which are found in multiple physiological processes like antioxidative defense and the regulation of thyroid hormone functions. Therefore, Se deficiency is known to cause a broad spectrum of physiological impairments, especially in endemic regions with low Se content. Nevertheless, being an essential trace element, Se could exhibit toxic effects, if its intake exceeds tolerable levels. Accordingly, this range between deficiency and overexposure represents optimal Se supply. However, this range was found to be narrower than for any other essential trace element. Together with significantly varying Se concentrations in soil and the presence of specific bioaccumulation factors, this represents a noticeable difficulty in the assessment of Se epidemiological status. While Se is acting in the body through multiple selenoproteins, its intake occurs mainly in form of small organic or inorganic molecular mass species. Thus, Se exposure not only depends on daily intake but also on the respective chemical form, in which it is present. The essential functions of selenium have been known for a long time and its primary forms in different food sources have been described. Nevertheless, analytical capabilities for a comprehensive investigation of Se species and their derivatives have been introduced only in the last decades. A new Se compound was identified in 2010 in the blood and tissues of bluefin tuna. It was called selenoneine (SeN) since it is an isologue of naturally occurring antioxidant ergothioneine (ET), where Se replaces sulfur. In the following years, SeN was identified in a number of edible fish species and attracted attention as a new dietary Se source and potentially strong antioxidant. Studies in populations whose diet largely relies on fish revealed that SeN represents the main non-protein bound Se pool in their blood. First studies, conducted with enriched fish extracts, already demonstrated the high antioxidative potential of SeN and its possible function in the detoxification of methylmercury in fish. Cell culture studies demonstrated, that SeN can utilize the same transporter as ergothioneine, and SeN metabolite was found in human urine. Until recently, studies on SeN properties were severely limited due to the lack of ways to obtain the pure compound. As a predisposition to this work was firstly a successful approach to SeN synthesis in the University of Graz, utilizing genetically modified yeasts. In the current study, by use of HepG2 liver carcinoma cells, it was demonstrated, that SeN does not cause toxic effectsup to 100 μM concentration in hepatocytes. Uptake experiments showed that SeN is not bioavailable to the used liver cells. In the next part a blood-brain barrier (BBB) model, based on capillary endothelial cells from the porcine brain, was used to describe the possible transfer of SeN into the central nervous system (CNS). The assessment of toxicity markers in these endothelial cells and monitoring of barrier conditions during transfer experiments demonstrated the absence of toxic effects from SeN on the BBB endothelium up to 100 μM concentration. Transfer data for SeN showed slow but substantial transfer. A statistically significant increase was observed after 48 hours following SeN incubation from the blood-facing side of the barrier. However, an increase in Se content was clearly visible already after 6 hours of incubation with 1 μM of SeN. While the transfer rate of SeN after application of 0.1 μM dose was very close to that for 1 μM, incubation with 10 μM of SeN resulted in a significantly decreased transfer rate. Double-sided application of SeN caused no side-specific transfer of SeN, thus suggesting a passive diffusion mechanism of SeN across the BBB. This data is in accordance with animal studies, where ET accumulation was observed in the rat brain, even though rat BBB does not have the primary ET transporter – OCTN1. Investigation of capillary endothelial cell monolayers after incubation with SeN and reference selenium compounds showed no significant increase of intracellular selenium concentration. Speciesspecific Se measurements in medium samples from apical and basolateral compartments, as good as in cell lysates, showed no SeN metabolization. Therefore, it can be concluded that SeN may reach the brain without significant transformation. As the third part of this work, the assessment of SeN antioxidant properties was performed in Caco-2 human colorectal adenocarcinoma cells. Previous studies demonstrated that the intestinal epithelium is able to actively transport SeN from the intestinal lumen to the blood side and accumulate SeN. Further investigation within current work showed a much higher antioxidant potential of SeN compared to ET. The radical scavenging activity after incubation with SeN was close to the one observed for selenite and selenomethionine. However, the SeN effect on the viability of intestinal cells under oxidative conditions was close to the one caused by ET. To answer the question if SeN is able to be used as a dietary Se source and induce the activity of selenoproteins, the activity of glutathione peroxidase (GPx) and the secretion of selenoprotein P (SelenoP) were measured in Caco-2 cells, additionally. As expected, reference selenium compounds selenite and selenomethionine caused efficient induction of GPx activity. In contrast to those SeN had no effect on GPx activity. To examine the possibility of SeN being embedded into the selenoproteome, SelenoP was measured in a culture medium. Even though Caco-2 cells effectively take up SeN in quantities much higher than selenite or selenomethionine, no secretion of SelenoP was observed after SeN incubation. Summarizing, we can conclude that SeN can hardly serve as a Se source for selenoprotein synthesis. However, SeN exhibit strong antioxidative properties, which appear when sulfur in ET is exchanged by Se. Therefore, SeN is of particular interest for research not as part of Se metabolism, but important endemic dietary antioxidant. N2 - Selen (Se) ist ein essentielles Spurenelement, das in geringen Konzentrationen ubiquitär in der Umwelt vorkommt. Essentielle Funktionen von Se im menschlichen Körper manifestieren sich in einer Vielzahl von Proteinen, die Selenocystein als aktives Zentrum enthalten. Solche Proteine werden Selenoproteine genannt, die in zahlreichen physiologischen Prozessen wie der antioxidativen Abwehr und der Regulierung der Schilddrüsenhormonfunktionen vorkommen. Daher ist bekannt, dass ein Se-Mangel ein breites Spektrum physiologischer Beeinträchtigungen verursacht, insbesondere in solchen Regionen mit niedrigem Se-Bodengahlten. Dennoch kann Se als essentielles Spurenelement auch toxische Wirkungen entfalten, wenn seine Aufnahme das tolerierbare Maß überschreitet. Dementsprechend stellt dieser Bereich zwischen Mangel und Überbelichtung eine optimale Se-Versorgung dar. Dieser Bereich erwies sich jedoch als enger als bei jedem anderen essentiellen Spurenelement. Zusammen mit stark schwankenden SeKonzentrationen im Boden und dem Vorliegen spezifischer Bioakkumulationsfaktoren stellt dies eine deutliche Schwierigkeit bei der Beurteilung des epidemiologischen Selenstatus dar. Während im Körper mehrere Selenoproteine vorliegen, erfolgt seine Aufnahme hauptsächlich in Form kleiner organischer oder anorganischer Moleküle. Somit hängt die Se-Exposition nicht nur von der täglichen Aufnahme ab, sondern auch von der jeweiligen chemischen Form, in der es vorliegt. Die essentiellen Funktionen von Selen sind seit langem bekannt und seine Primärformen in verschiedenen Nahrungsquellen dominierenden Formen wurden bereits gut beschrieben. Dennoch wurden erst in den letzten Jahrzehnten neue analytische Möglichkeiten für eine umfassendere Untersuchung von Se-Spezies und ihren Derivaten entwickelt. Beispielsweise wurde 2010 eine neue Se-Verbindung im Blut und im Gewebe von Rotem Thunfisch identifiziert. Es wurde Selenonein (SeN) genannt, da es ein Isolog des natürlich vorkommenden Antioxidans Ergothionein (ET) ist, bei dem Se durch Schwefel ersetzt ist. In den folgenden Jahren wurde SeN in einer Reihe von essbaren Fischarten identifiziert und erregte einerseits als neue Nahrungsquelle für Se und andererseits als potenziell starkes Antioxidans Aufmerksamkeit. Studien an Probanden, deren Ernährung hauptsächlich von Fisch geprägt ist, haben gezeigt, dass SeN den hauptsächlichen nicht-proteingebundenen Se-Pool in ihrem Blut darstellt. Erste Studien mit angereicherten Fischextrakten zeigten bereits das hohe antioxidative Potenzial von SeN und seine mögliche Funktion bei der Entgiftung von Methylquecksilber im Fisch. Zellkulturstudien zeigten, dass SeN den gleichen Transporter wie Ergothionein nutzen kann und ein weiterer SeN-Metabolit wurde im menschlichen Urin gefunden. Bis vor kurzem waren Studien zu den Eigenschaften von SeN aufgrund fehlender Möglichkeiten, die reine Verbindung zu erwerben, stark eingeschränkt. Als wichtige Grundlage für die vorliegende Arbeit diente zunächst die erfolgreiche Synthese des SeN, welche an der Universität Graz unter Verwendung gentechnisch veränderter Hefen erfolgte. In der aktuellen Studie wurde unter Verwendung von HepG2-Leberkarzinomzellen gezeigt, dass SeN in physiologisch relevanten Konzentrationen keine toxischen Effekte in diesen Hepatozyten induziert. Bioverfügbarkeitsexperimente zeigten, dass SeN für die verwendeten Leberzellen nicht bioverfügbar ist. Im nächsten Teil wurde ein Modell der Blut-Hirn-Schranke (BHS) verwendet, das auf kapillaren Endothelzellen aus dem Schweinehirn basiert, um den möglichen Transfer von SeN in das zentrale Nervensystem (ZNS) zu untersuchen. Die Bewertung von Toxizitätsmarkern in diesen Endothelzellen und die online Überwachung der Barriere-Bedingungen während der Transferexperimente zeigten, dass bei physiologisch relevanten Konzentrationen keine toxischen Wirkungen von SeN auf das BHS-Endothel auftreten. Daten bezüglich des Übergangs der Selenspezies SeN zeigten zwar eine langsame, jedoch eine nicht zu vernachlässigenden Menge, die die Barriere passieren kann. Die gleichzeitige Inkubation von SeN auf beiden Barriere-Seiten verursachte keinen seitenspezifischen Transfer von SeN, was auf einen passiven Diffusionsmechanismus von SeN über die BHS hindeutet. Diese Daten stimmen mit Tierstudien überein, in denen eine ET-Akkumulation im Rattengehirn beobachtet wurde, obwohl die BHS der Ratte nicht über den primären ET-Transporter – OCTN1 – verfügt. Die Untersuchung von Monolayern aus kapillaren Endothelzellen nach Inkubation mit SeN und Referenzselenverbindungen zeigte keinen signifikanten Anstieg der intrazellulären Selenkonzentration. Speziesspezifische Se-Messungen in Mediumproben aus den apikalen und basolateralen Kompartimenten, sowie in den Zelllysaten zeigten keine SeN-Metabolisierung. Daraus kann geschlossen werden, dass SeN das Gehirn ohne signifikante Transformation erreichen kann. Als dritter Teil dieser Arbeit wurde die Bewertung der antioxidativen Eigenschaften von SeN in menschlichen Caco-2, also kolorektale Adenokarzinomzellen, durchgeführt. Frühere Studien zeigten, dass das Darmepithel in der Lage ist, SeN aktiv vom Darmlumen zur Blutseite zu transportieren und dort SeN anzureichern. Weitere Untersuchungen im Rahmen der aktuellen Arbeiten zeigten ein viel höheres antioxidatives Potenzial von SeN im Vergleich zu ET. Die Aktivität als Radikalfänger nach Inkubation mit SeN war ähnlich wie bei Selenit und Selenomethionin. Wobei die Wirkung von SeN auf die Lebensfähigkeit von Darmzellen unter oxidativen Bedingungen jedoch ähnlich der durch ET verursachten war. Um die Frage zu beantworten, ob SeN als diätetische Se-Quelle verwendet werden kann um die Aktivität von Selenoproteinen zu induzieren, wurden zusätzlich die Aktivität der Glutathionperoxidase (GPx) und die Sekretion von Selenoprotein P (SelenoP) in Caco-2-Zellen gemessen. Wie erwartet, bewirkten die Referenz-Selenverbindungen Selenit und Selenomethionin eine effiziente Induktion der GPx-Aktivität, im Gegensatz zu diesen hatte SeN keinen Einfluss auf die GPx-Aktivität. Um die Möglichkeit einer Einbettung von SeN in das Selenoproteom zu untersuchen, wurde SelenoP im Kulturmedium gemessen. Obwohl Caco-2-Zellen SeN effektiv in viel höherenMengen als Selenit oder Selenomethionin aufnehmen, wurde nach der SeN-Inkubation keine Sekretion von SelenoP beobachtet. Zusammenfassend können wir schlussfolgern, dass SeN kaum als Se-Quelle für die Selenoproteinsynthese dienen kann. SeN weist jedoch starke antioxidative Eigenschaften auf, die auftreten, wenn Schwefel in ET durch Se ausgetauscht wird. Daher ist SeN von besonderem Interesse für die Forschung, nicht als Teil des Se-Stoffwechsels, sondern als wichtiges endemisches diätetisches Antioxidans. KW - selenium KW - selenoneine KW - HepG2 KW - Caco-2 KW - PBCEC KW - Caco-2 KW - HepG2 KW - PBCEC KW - Selen KW - Selenonein Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-573794 ER - TY - THES A1 - Polemiti, Elli T1 - Identifying risk of microvascular and macrovascular complications of type 2 diabetes T1 - Identifizierung des Risikos mikrovaskulärer und makrovaskulärer Komplikationen bei Typ-2-Diabetes BT - findings from the European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition-Potsdam Study BT - Ergebnisse der europäischen prospektiven Krebsforschung und Ernährungs-Potsdamer Studie N2 - Diabetes is hallmarked by high blood glucose levels, which cause progressive generalised vascular damage, leading to microvascular and macrovascular complications. Diabetes-related complications cause severe and prolonged morbidity and are a major cause of mortality among people with diabetes. Despite increasing attention to risk factors of type 2 diabetes, existing evidence is scarce or inconclusive regarding vascular complications and research investigating both micro- and macrovascular complications is lacking. This thesis aims to contribute to current knowledge by identifying risk factors – mainly related to lifestyle – of vascular complications, addressing methodological limitations of previous literature and providing comparative data between micro- and macrovascular complications. To address this overall aim, three specific objectives were set. The first was to investigate the effects of diabetes complication burden and lifestyle-related risk factors on the incidence of (further) complications. Studies suggest that diabetes complications are interrelated. However, they have been studied mainly independently of individuals’ complication burden. A five-state time-to-event model was constructed to examine the longitudinal patterns of micro- (kidney disease, neuropathy and retinopathy) and macrovascular complications (myocardial infarction and stroke) and their association with the occurrence of subsequent complications. Applying the same model, the effect of modifiable lifestyle factors, assessed alone and in combination with complication load, on the incidence of diabetes complications was studied. The selected lifestyle factors were body mass index (BMI), waist circumference, smoking status, physical activity, and intake of coffee, red meat, whole grains, and alcohol. Analyses were conducted in a cohort of 1199 participants with incident type 2 diabetes from the European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition (EPIC)-Potsdam, who were free of vascular complications at diabetes diagnosis. During a median follow-up time of 11.6 years, 96 cases of macrovascular complications (myocardial infarction and stroke) and 383 microvascular complications (kidney disease, neuropathy and retinopathy) were identified. In multivariable-adjusted models, the occurrence of a microvascular complication was associated with a higher incidence of further micro- (Hazard ratio [HR] 1.90; 95% Confidence interval [CI] 0.90, 3.98) and macrovascular complications (HR 4.72; 95% CI 1.25, 17.68), compared with persons without a complication burden. In addition, participants who developed a macrovascular event had a twofold higher risk of future microvascular complications (HR 2.26; 95% CI 1.05, 4.86). The models were adjusted for age, sex, state duration, education, lifestyle, glucose-lowering medication, and pre-existing conditions of hypertension and dyslipidaemia. Smoking was positively associated with macrovascular disease, while an inverse association was observed with higher coffee intake. Whole grain and alcohol intake were inversely associated with microvascular complications, and a U-shaped association was observed for red meat intake. BMI and waist circumference were positively associated with microvascular events. The associations between lifestyle factors and incidence of complications were not modified by concurrent complication burden, except for red meat intake and smoking status, where the associations were attenuated among individuals with a previous complication. The second objective was to perform an in-depth investigation of the association between BMI and BMI change and risk of micro- and macrovascular complications. There is an ongoing debate on the association between obesity and risk of macrovascular and microvascular outcomes in type 2 diabetes, with studies suggesting a protective effect among people with overweight or obesity. These findings, however, might be limited due to suboptimal control for smoking, pre-existing chronic disease, or short-follow-up. After additional exclusion of persons with cancer history at diabetes onset, the associations between pre-diagnosis BMI and relative annual change between pre- and post-diagnosis BMI and incidence of complications were evaluated in multivariable-adjusted Cox models. The analyses were adjusted for age, sex, education, smoking status and duration, physical activity, alcohol consumption, adherence to the Mediterranean diet, and family history of diabetes and cardiovascular disease (CVD). Among 1083 EPIC-Potsdam participants, 85 macrovascular and 347 microvascular complications were identified during a median follow-up period of 10.8 years. Higher pre-diagnosis BMI was associated with an increased risk of total microvascular complications (HR per 5 kg/m2 1.21; 95% CI 1.07, 1.36), kidney disease (HR 1.39; 95% CI 1.21, 1.60) and neuropathy (HR 1.12; 95% CI 0.96, 1.31); but no association was observed for macrovascular complications (HR 1.05; 95% CI 0.81, 1.36). Effect modification was not evident by sex, smoking status, or age groups. In analyses according to BMI change categories, BMI loss of more than 1% indicated a decreased risk of total microvascular complications (HR 0.62; 95% CI 0.47, 0.80), kidney disease (HR 0.57; 95% CI 0.40, 0.81) and neuropathy (HR 0.73; 95% CI 0.52, 1.03), compared with participants with a stable BMI. No clear association was observed for macrovascular complications (HR 1.04; 95% CI 0.62, 1.74). The impact of BMI gain on diabetes-related vascular disease was less evident. Associations were consistent across strata of age, sex, pre-diagnosis BMI, or medication but appeared stronger among never-smokers than current or former smokers. The last objective was to evaluate whether individuals with a high-risk profile for diabetes and cardiovascular disease (CVD) also have a greater risk of complications. Within the EPIC-Potsdam study, two accurate prognostic tools were developed, the German Diabetes Risk Score (GDRS) and the CVD Risk Score (CVDRS), which predict the 5-year type 2 diabetes risk and 10-year CVD risk, respectively. Both scores provide a non-clinical and clinical version. Components of the risk scores include age, sex, waist circumference, prevalence of hypertension, family history of diabetes or CVD, lifestyle factors, and clinical factors (only in clinical versions). The association of the risk scores with diabetes complications and their discriminatory performance for complications were assessed. In crude Cox models, both versions of GDRS and CVDRS were positively associated with macrovascular complications and total microvascular complications, kidney disease and neuropathy. Higher GDRS was also associated with an elevated risk of retinopathy. The discrimination of the scores (clinical and non-clinical) was poor for all complications, with the C-index ranging from 0.58 to 0.66 for macrovascular complications and from 0.60 to 0.62 for microvascular complications. In conclusion, this work illustrates that the risk of complication development among individuals with type 2 diabetes is related to the existing complication load, and attention should be given to regular monitoring for future complications. It underlines the importance of weight management and adherence to healthy lifestyle behaviours, including high intake of whole grains, moderation in red meat and alcohol consumption and avoidance of smoking to prevent major diabetes-associated complications, regardless of complication burden. Risk scores predictive for type 2 diabetes and CVD were related to elevated risks of complications. By optimising several lifestyle and clinical factors, the risk score can be improved and may assist in lowering complication risk. N2 - Diabetes ist durch einen hohen Blutzuckerspiegel gekennzeichnet, der eine fortschreitende allgemeine Gefäßschädigung verursacht, die zu mikro- und makrovaskulären Komplikationen führt. Diabetesbedingte Komplikationen verursachen eine schwere und langanhaltende Morbidität und sind eine der Hauptursachen für die Mortalität von Menschen mit Diabetes. Trotz der zunehmenden Aufmerksamkeit der Erforschung der Risikofaktoren des Typ-2-Diabetes, ist die vorhandene Studienlage in Bezug auf vaskuläre Komplikationen nicht ein-deutig und nicht ausreichend. Diese Arbeit soll zum aktuellen Wissensstand beitragen, indem sie Risikofaktoren – hauptsächlich lebensstilbedingte Faktoren – für vaskuläre Komplikationen identifiziert, methodische Schwächen bisheriger Studien adressiert und vergleichende Daten zwischen mikro- und makrovaskulären Komplikationen liefert. Um dieses übergeordnete Ziel zu erreichen, wurden drei spezifische Ziele gesetzt. Das erste war die Untersuchung des Einflusses der Diabetes-Komplikationslast und lebensstilbezogener Risikofaktoren auf das Auftreten weiterer Komplikationen. Studien legen nahe, dass Diabeteskomplikationen in Wechselbeziehung zueinanderstehen. Allerdings wurden sie bisher hauptsächlich unabhängig von der individuellen Komplikationslast untersucht. Es wurde daher ein fünfstufiges Time-to-Event-Modell konstruiert, um die longitudinalen Muster von mikro- und makrovaskulären Komplikationen und deren Zusammenhang mit dem Auftreten von Folgekomplikationen zu untersuchen. Unter Anwendung desselben Modells wurde die Auswirkung modifizierbarer Lebensstilfaktoren, die allein und in Kombination mit der Komplikationslast untersucht wurden, auf das Auftreten von Diabeteskomplikatio-nen untersucht. Die ausgewählten Risikofaktoren waren der Body-Mass-Index (BMI), der Taillenumfang, der Raucherstatus, die körperliche Aktivität und der Konsum von Kaffee, rotem Fleisch, Vollkornprodukten und Alkohol. Die Analysen wurden in einer Kohorte von 1199 Teilnehmern mit neu diagnostiziertem Typ-2-Diabetes aus der European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition (EPIC)-Potsdam durchgeführt, die zum Zeitpunkt der Diabetesdiagnose frei von vaskulären Komplikationen waren. Während einer Nachbeobachtungszeit von 11,6 Jahren wurden 96 Fälle mit makrovaskulären Komplikati-onen (Myokardinfarkt und Schlaganfall) und 383 Fälle mit mikrovaskulären Komplikationen (Nierenerkrankungen, Neuropathie und Retinopathie) identifiziert. Das Auftreten einer mikrovaskulären Komplikation war mit einer höheren Inzidenz weiterer mikrovaskulärer Ereignisse (Hazard Ratio [HR] 1,90; 95% Konfidenzintervall [CI] 0,90, 3,98) und makrovaskulärer Komplikationen (HR 4,72; 95% CI 1,25, 17,68) assoziiert, verglichen mit Personen ohne Komplikationen. Darüber hinaus hatten Teilnehmende, die ein makrovaskuläres Ereignis entwickelten, ein doppelt so hohes Risiko für mikrovaskuläre Komplikationen (HR 2,26; 95% CI 1,05, 4,86). Die Modelle wurden für Alter, Geschlecht, Komplikationsdauer, Bildung, Lebensstil, glukosesenkende Medikamente und Vorerkrankungen wie Bluthochdruck und Dyslipidämie adjustiert. Rauchen war posi-tiv mit makrovaskulären Erkrankungen assoziiert, während eine inverse Assoziation für einen höheren Kaffeekonsum beobachtet wurde. Vollkorn- und Alkoholkonsum waren invers mit mikrovaskulären Komplikationen assoziiert, und eine U-förmige Assoziation wurde für den Konsum von rotem Fleisch beobachtet. BMI und Taillenumfang waren positiv mit mikrovaskulären Ereignissen assoziiert. Die Zusammenhänge zwischen Lebensstilfaktoren und Komplikationen wurden durch gleichzeitige Komplikationsbelastung nicht verändert, mit Ausnahme für den Verzehr von rotem Fleisch und dem Raucherstatus, dort waren die Assoziationen bei Personen mit Komplikationen abgeschwächt. Das zweite Ziel war die Untersuchung des Zusammenhangs zwischen BMI und BMI-Änderung und dem Risiko für mikro- und makrovaskuläre Komplikationen. Es gibt eine anhaltende Debatte über den Zusammenhang zwischen Adipositas und dem Risiko für makrovaskuläre und mikrovaskuläre Folgeerkrankungen bei Typ-2-Diabetes, bei der einige Studien einen protektiven Zusammenhang bei Menschen mit Übergewicht oder Adipositas nahelegen. Diese Ergebnisse könnten auf methodische Schwächen zurückzuführen sein, einschließlich einer suboptimalen Adjustierung für Rauchen, bestehende chronische Erkrankungen und eine kurze Nachbeobachtungszeit. Nach zusätzlichem Ausschluss von Personen mit einer bestehenden Krebserkrankung zu Diabetesbeginn, wurden die Zusam-menhänge zwischen BMI vor der Diagnose und die relative jährliche Veränderung zwischen BMI vor und nach der Diagnose hinsichtlich der Inzidenz von Komplikationen in Cox-Modellen ausgewertet. Die Analysen wurden für Alter, Geschlecht, Bildung, Raucherstatus und -dauer, körperliche Aktivität, Alkoholkonsum, Einhaltung der mediterranen Ernährung und Familienanamnese von Diabetes und kardiovaskulären Erkrankungen (CVD) adjustiert. Unter den 1083 Teilnehmern wurden 85 makrovaskuläre und 347 mikrovaskuläre Komplikationen während einer Nachbeobachtungszeit von 10,8 Jahren identifiziert. Ein höherer BMI vor der Diagnose war mit einem erhöhten Risiko für mikrovaskuläre Komplikationen insgesamt (HR pro 5 kg/m2 1,21; 95% CI 1,07, 1,36), Nierenerkrankungen (HR 1,39; 95% CI 1,21, 1,60) und Neuropathie (HR 1,12; 95% CI 0,96, 1,31) assozi-iert; für makrovaskuläre Komplikationen wurde jedoch kein Zusammenhang beobachtet (HR 1,05; 95% CI 0,81, 1,36). Analysen nach BMI-Kategorien bestätigten diese Ergebnisse. Es gab keine Hinweise für Effektmodifikation mit Geschlecht, Raucherstatus oder Alter. In den Analysen für BMI-Änderung zeigte sich, dass eine BMI-Abnahme von mehr als 1 % mit einem verringerten Risiko für mikrovaskuläre Komplikationen (HR 0,62; 95% CI 0,47, 0,80), Nierenerkrankungen (HR 0,57; 95% CI 0,40, 0,81) und Neuropathie (HR 0,73; 95% CI 0,52, 1,03) verbunden war, verglichen mit Teilnehmern mit einem stabilen BMI. Für makrovaskuläre Komplikationen wurde kein eindeutiger Zusammenhang beobachtet (HR 1,04; 95% CI 0,62, 1,74). Die Assoziationen waren in den Strata nach Alter, Ge-schlecht, BMI vor der Diagnose oder Medikation hinweg konsistent, schienen aber bei lebenslangen Nichtrauchern stärker zu sein als bei Rauchern oder ehemaligen Rauchern. Das letzte Ziel war es zu untersuchen, ob Personen mit einem Hochrisikoprofil für Di-abetes und CVD auch ein höheres Risiko für Komplikationen haben. Im Rahmen der EPIC-Potsdam-Studie wurden zwei präzise Prognoseinstrumente entwickelt, der German Diabetes Risk Score (GDRS) und der CVD Risk Score (CVDRS), die das 5-Jahres-Risiko für Typ-2-Diabetes bzw. das 10-Jahres-Risiko für CVD vorhersagen. Beide Scores sind als nicht-klinische und klinische Version verfügbar. Zu den Komponenten der Risikoscores gehören Alter, Geschlecht, Taillenumfang, Prävalenz von Bluthochdruck, familiäre Krankheitsvorgeschichte (Diabetes oder CVD), modifizierbare Lebensstilfaktoren und klinische Parameter (nur in den klinischen Versionen). Die Assoziation der Risikoscores mit Diabeteskomplikationen und ihre Diskriminierungsfähigkeit für Komplikationen wurden bewertet. In unadjustierten Cox-Modellen waren beide Versionen (GDRS und CVDRS) positiv mit makrovaskulären Komplikationen und insgesamt mit mikrovaskulären Komplikatio-nen, Nierenerkrankungen und Neuropathie in Personen mit Typ-2-Diabetes assoziiert. Ein höherer GDRS war auch mit einem erhöhten Risiko für eine Retinopathie assoziiert. Die Diskriminierung der Scores (klinisch und nicht-klinisch) war für alle Komplikationen gering, wobei der C-Index für makrovaskuläre Komplikationen von 0,58 bis 0,66 und für mikrovaskuläre Komplikationen von 0,60 bis 0,62 reichte. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass das Risiko für die Entwicklung von Komplikati-onen bei Personen mit Typ-2-Diabetes mit der bestehenden Komplikationslast zusammenhängt und dass eine regelmäßige Überwachung von zukünftigen Komplikationen wichtig ist. Sie unterstreicht die Bedeutung des Gewichtsmanagements und der Einhaltung gesunder Lebensgewohnheiten, einschließlich eines hohen Verzehrs von Vollkornprodukten, eines moderaten Konsums von rotem Fleisch und Alkohol, sowie des Verzichts auf das Rauchen, um schwere diabetesassoziierte Komplikationen, unabhängig von der Komplikationslast, zu verhindern. Die Risiko-Scores für Typ-2-Diabetes und Herz-Kreislauf-Erkrankungen waren mit einem erhöhten Komplikations-Risiko assoziiert. Durch die Optimierung des Lebens-stils und der klinischen Faktoren kann der Risikoscore verbessert werden, was das Auftreten von diabetesassoziierten Komplikationen verringern könnte. KW - type 2 diabetes KW - microvascular complications KW - macrovascular complications KW - nephropathy KW - neuropathy KW - retinopathy KW - CVD KW - myocardial infarction KW - stroke KW - lifestyle KW - diet KW - obesity KW - BMI KW - weight loss KW - risk scores KW - coffee KW - whole grains KW - physical activity KW - red meat KW - smoking KW - alcohol intake KW - Body-Mass-Index KW - Herzkreislauferkrankungen KW - Alkoholkonsum KW - Kaffee KW - Diät KW - Lebensstil KW - makrovaskuläre Komplikationen KW - mikrovaskuläre Komplikationen KW - Herzinfarkt KW - Nephropathie KW - Neuropathie KW - Adipositas KW - körperliche Aktivität KW - rotes Fleisch KW - Retinopathie KW - Risikobewertungen KW - Rauchen KW - Schlaganfall KW - Typ 2 Diabetes KW - Gewichtsverlust KW - Vollkorn Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-571038 ER - TY - THES A1 - Buczkowski, Agnes Johanna T1 - Vergleichende Untersuchungen von Schlüsselkomponenten aus Dämpfen der E-Zigarette T1 - Comparative studies of key components from e-cigarette vapours N2 - Respiratorische Erkrankungen stellen zunehmend eine relevante globale Problematik dar. Die Erweiterung bzw. Modifizierung von Applikationswegen möglicher Arzneimittel für gezielte topische Anwendungen ist dabei von größter Bedeutung. Die Variation eines bekannten Applikationsweges durch unterschiedliche technologische Umsetzungen kann die Vielfalt der Anwendungsmöglichkeiten, aber auch die Patienten-Compliance erhöhen. Die einfache und flexible Verfahrensweise durch schnelle Verfügbarkeit und eine handliche Technologie sind heutzutage wichtige Eigenschaften im Entwicklungsprozess eines Produktes. Eine direkte topische Behandlung von Atemwegserkrankungen am Wirkort in Form einer inhalativen Applikation bietet dabei viele Vorteile gegenüber einer systemischen Therapie. Die medizinische Inhalation von Wirkstoffen über die Lunge ist jedoch eine komplexe Herausforderung. Inhalatoren gehören zu den erklärungsbedürftigen Applikationsformen, die zur Erhöhung der konsequenten Einhaltung der Verordnung so einfach, wie möglich gestaltet werden müssen. Parallel besitzen und nutzen weltweit annähernd 68 Millionen Menschen die Technologie eines inhalativen Applikators zur bewussten Schädigung ihrer Gesundheit in Form einer elektronischen Zigarette. Diese bekannte Anwendung bietet die potentielle Möglichkeit einer verfügbaren, kostengünstigen und qualitätsgeprüften Gesundheitsmaßnahme zur Kontrolle, Prävention und Heilung von Atemwegserkrankungen. Sie erzeugt ein Aerosol durch elektrothermische Erwärmung eines sogenannten Liquids, das durch Kapillarkräfte eines Trägermaterials an ein Heizelement gelangt und verdampft. Ihr Bekanntheitsgrad zeigt, dass eine beabsichtigte Wirkung in den Atemwegen eintritt. Diese Wirkung könnte jedoch auch auf potentielle pharmazeutische Einsatzgebiete übertragbar sein. Die Vorteile der pulmonalen Verabreichung sind dabei vielfältig. Im Vergleich zur peroralen Applikation gelangt der Wirkstoff gezielt zum Wirkort. Wenn eine systemische Applikation zu Arzneimittelkonzentrationen unterhalb der therapeutischen Wirksamkeit in der Lunge führt, könnte eine inhalative Darreichung bereits bei niedriger Dosierung die gewünschten höheren Konzentrationen am Wirkort hervorrufen. Aufgrund der großen Resorptionsfläche der Lunge sind eine höhere Bioverfügbarkeit und ein schnellerer Wirkungseintritt infolge des fehlenden First-Pass-Effektes möglich. Es kommt ebenfalls zu minimalen systemischen Nebenwirkungen. Die elektronische Zigarette erzeugt wie die medizinischen Inhalatoren lungengängige Partikel. Die atemzuggesteuerte Technik ermöglicht eine unkomplizierte und intuitive Anwendung. Der prinzipielle Aufbau besteht aus einer elektrisch beheizten Wendel und einem Akku. Die Heizwendel ist von einem sogenannten Liquid in einem Tank umgeben und erzeugt das Aerosol. Das Liquid beinhaltet eine Basismischung bestehend aus Propylenglycol, Glycerin und reinem Wasser in unterschiedlichen prozentualen Anteilen. Es besteht die Annahme, dass das Basisliquid auch mit pharmazeutischen Wirkstoffen für die pulmonale Applikation beladen werden kann. Aufgrund der thermischen Belastung durch die e-Zigarette müssen potentielle Wirkstoffe sowie das Vehikel eine thermische Stabilität aufweisen. Die potentielle medizinische Anwendung der Technologie einer handelsüblichen e-Zigarette wurde anhand von drei Schwerpunkten an vier Wirkstoffen untersucht. Die drei ätherischen Öle Eucalyptusöl, Minzöl und Nelkenöl wurden aufgrund ihrer leichten Flüchtigkeit und der historischen pharmazeutischen Anwendung anhand von Inhalationen bei Erkältungssymptomen bzw. im zahnmedizinischen Bereich gewählt. Das eingesetzte Cannabinoid Cannabidiol (CBD) hat einen aktuellen Bezug zu dem pharmazeutischen Markt Deutschlands zur Legalisierung von cannabishaltigen Produkten und der medizinischen Forschung zum inhalativen Konsum. Es wurden relevante wirkstoffhaltige Flüssigformulierungen entwickelt und hinsichtlich ihrer Verdampfbarkeit zu Aerosolen bewertet. In den quantitativen und qualitativen chromatographischen Untersuchungen konnten spezifische Verdampfungsprofile der Wirkstoffe erfasst und bewertet werden. Dabei stieg die verdampfte Masse der Leitsubstanzen 1,8-Cineol (Eucalyptusöl), Menthol (Minzöl) und Eugenol (Nelkenöl) zwischen 33,6 µg und 156,2 µg pro Zug proportional zur Konzentration im Liquid im Bereich zwischen 0,5% und 1,5% bei einer Leistung von 20 Watt. Die Freisetzungsrate von Cannabidiol hingegen schien unabhängig von der Konzentration im Liquid im Mittelwert bei 13,3 µg pro Zug zu liegen. Dieses konnte an fünf CBD-haltigen Liquids im Konzentrationsbereich zwischen 31 µg/g und 5120 µg/g Liquid gezeigt werden. Außerdem konnte eine Steigerung der verdampften Massen mit Zunahme der Leistung der e-Zigarette festgestellt werden. Die Interaktion der Liquids bzw. Aerosole mit den Bestandteilen des Speichels sowie weiterer gastrointestinaler Flüssigkeiten wurde über die Anwendung von zugehörigen in vitro Modellen und Einsatz von Enzymaktivitäts-Assays geprüft. In den Untersuchungen wurden Änderungen von Enzymaktivitäten anhand des oralen Schlüsselenzyms α-Amylase sowie von Proteasen ermittelt. Damit sollte exemplarisch ein möglicher Einfluss auf physiologische bzw. metabolische Prozesse im humanen Organismus geprüft werden. Das Bedampfen von biologischen Suspensionen führte bei niedriger Leistung der e-Zigarette (20 Watt) zu keiner bzw. einer leichten Änderung der Enzymaktivität. Die Anwendung einer hohen Leistung (80 Watt) bewirkte tendenziell das Herabsetzen der Enzymaktivitäten. Die Erhöhung der Enzymaktivitäten könnte zu einem enzymatischen Abbau von Schleimstoffen wie Mucinen führen, was wiederum die effektive, mechanische Abwehr gegenüber bakteriellen Infektionen zur Folge hätte. Da eine Anwendung der Applikation insbesondere bei bakteriellen Atemwegserkrankungen denkbar wäre, folgten abschließend Untersuchungen der antibakteriellen Eigenschaften der Liquids bzw. Aerosole in vitro. Es wurden sechs klinisch relevante bakterielle Krankheitserreger ausgewählt, die nach zwei Charakteristika gruppiert werden können. Die drei multiresistenten Bakterien Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae und Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus können mithilfe von üblichen Therapien mit Antibiotika nicht abgetötet werden und haben vor allem eine nosokomiale Relevanz. Die zweite Gruppe weist Eigenschaften auf, die vordergründig assoziiert sind mit respiratorischen Erkrankungen. Die Bakterien Streptococcus pneumoniae, Moraxella catarrhalis und Haemophilus influenzae sind repräsentativ beteiligt an Atemwegserkrankungen mit diverser Symptomatik. Die Bakterienarten wurden mit den jeweiligen Liquids behandelt bzw. bedampft und deren grundlegende Dosis-Wirkungsbeziehung charakterisiert. Dabei konnte eine antibakterielle Aktivität der Formulierungen ermittelt werden, die durch Zugabe eines Wirkstoffes die bereits antibakterielle Wirkung der Bestandteile Glycerin und Propylenglycol verstärkte. Die hygroskopischen Eigenschaften dieser Substanzen sind vermutlich für eine Wirkung in aerosolierter Form verantwortlich. Sie entziehen die Feuchtigkeit aus der Luft und haben einen austrocknenden Effekt auf die Bakterien. Das Bedampfen der Bakterienarten Streptococcus pneumoniae, Moraxella catarrhalis und Haemophilus influenzae hatte einen antibakteriellen Effekt, der zeitlich abhängig von der Leistung der e-Zigarette war. Die Ergebnisse der Untersuchungen führen zu dem Schluss, dass jeder Wirkstoff bzw. jede Substanzklasse individuell zu bewerten ist und somit Inhalator und Formulierung aufeinander abgestimmt werden müssen. Der Einsatz der e-Zigarette als Medizinprodukt zur Applikation von Arzneimitteln setzt stets Prüfungen nach Europäischem Arzneibuch voraus. Durch Modifizierungen könnte eine Dosierung gut kontrollierbar gemacht werden, aber auch die Partikelgrößenverteilung kann insoweit reguliert werden, dass die Wirkstoffe je nach Partikelgröße zu einem geeigneten Applikationsort wie Mund, Rachen oder Bronchien transportiert werden. Der Vergleich mit den Eigenschaften anderer medizinischer Inhalatoren führt zu dem Schluss, dass die Technologie der e-Zigarette durchaus eine gleichartige oder bessere Performance für thermisch stabile Wirkstoffe bieten könnte. Dieses fiktive Medizinprodukt könnte aus einer hersteller-unspezifisch produzierten, wieder aufladbaren Energiequelle mit Universalgewinde zum mehrfachen Gebrauch und einer hersteller- und wirkstoffspezifisch produzierten Einheit aus Verdampfer und Arzneimittel bestehen. Das Arzneimittel, ein medizinisches Liquid (Vehikel und Wirkstoff) kann in dem Tank des Verdampfers mit konstanten, nicht variablen Parametern patientenindividuell produziert werden. Inhalative Anwendungen werden perspektivisch wohl nicht zuletzt aufgrund der aktuellen COVID-19-Pandemie eine zunehmende Rolle spielen. Der Bedarf nach alternativen Therapieoptionen wird weiter ansteigen. Diese Arbeit liefert einen Beitrag zum Einsatz der Technologie der elektronischen Zigarette als electronic nicotin delivery system (ENDS) nach Modifizierung zu einem potentiellen pulmonalen Applikationssystem als electronic drug delivery system (EDDS) von inhalativen, thermisch stabilen Arzneimitteln in Form eines Medizinproduktes. N2 - Respiratory diseases increasingly represent a globally relevant problem. The extension or modification of application routes of possible drugs for targeted topical applications is thereby of utmost importance. The variation of a known application route through different technological implementations can increase the diversity of application possibilities, but also patient compliance. Simple and flexible procedures through rapid availability and a convenient technology are nowadays important characteristics in the development process of a product. Direct topical treatment of respiratory diseases at the site of action in form of inhaled application offers many advantages over systemic therapy. However, medical inhalation of active substances via lung is a complex challenge. Inhalers are one of the forms of application that require explanation and must be made as simple as possible to increase consistent adherence to the prescription. In parallel, approximately 68 million people worldwide own and use the technology of an inhaler to deliberately harm their health in form of an electronic cigarette. This well-known application offers the potential possibility of an available, cost-effective and quality-assured health measure to control, prevent and cure respiratory diseases. It produces an aerosol by electro-thermal heating of a so-called liquid, which reaches a heating element through capillary forces of a carrier material and vaporizes. Its popularity indicates that an intended effect occurs in the respiratory tract. However, this effect could also be transferable to potential pharmaceutical applications. The advantages of pulmonary administration are manifold. Compared to peroral application, the active ingredient reaches the site of action in a targeted manner. If systemic application results to drug concentrations below the therapeutic efficacy in the lung, inhalation could produce the desired higher concentrations at the site of action even at low doses. Due to the large absorption surface of the lungs, a higher bioavailability and a faster onset of action is possible as a result of the lack of first-pass effect. There are also minimal systemic side effects. Like medical inhalers, the electronic cigarette produces respirable particles. The breath-controlled technology enables uncomplicated and intuitive use. The basic construction consists of an electrically heated coil and a rechargeable battery. The heating coil is surrounded by a so-called liquid in a tank and generates the aerosol. The liquid contains a base mixture consisting of propylene glycol, glycerine and pure water in varying percentages. It is assumed that the base liquid can also be loaded with active pharmaceutical ingredients for pulmonary application. Due to thermal load of the e-cigarette, potential active ingredients as well as vehicles must exhibit thermal stability. The potential medical application of the technology of a commercially available e-cigarette was investigated on the basis of three focal investigations for four active ingredients. The three essential oils eucalyptus oil, mint oil and clove oil were chosen due to their light volatility and the historical pharmaceutical application based on inhalations for cold symptoms or in the dental field, respectively. The choice of the cannabinoid cannabidiol (CBD) used is currently related to the pharmaceutical market situation in Germany while considering the legalization of cannabis-containing products and medical research on inhaled consumption. Relevant liquid formulations containing active ingredients were developed and evaluated with regard to their evaporability to aerosols. In quantitative and qualitative chromatographic investigations, specific vaporization profiles of the active substances were recorded and evaluated. The evaporated mass of analytical markers 1,8-cineole (eucalyptus oil), menthol (mint oil) and eugenol (clove oil) increased between 33.6 µg and 156.2 µg per puff proportional to the concentration in liquids in the range between 0.5% and 1.5% at a power application of 20 watts. The release rate of cannabidiol, on the other hand, appeared to average 13.3 µg per puff regardless of the concentration in the liquid. This was demonstrated on five CBD-containing liquids in the concentration range between 31 µg/g and 5120 µg/g liquid. In addition, an increased vaporized mass with increased power of e-cigarette could be observed. The interaction of the liquids or aerosols with the components of saliva and other gastrointestinal fluids was tested by application of associated in vitro models and the use of enzyme activity assays. In the studies, changes in enzyme activities were determined using the key oral enzyme α-amylase as well as proteases. The aim was to test a possible influence on physiological or metabolic processes in the human organism as an example. Treatment of biological suspensions with aerosol resulted in no or a slight change in enzyme activity at low power of e-cigarette (20 watts). The application of high power (80 watts) tended to decrease enzyme activities. The increase in enzyme activities could lead to enzymatic degradation of mucins, which in turn could reduce effective mechanical defense against bacterial infections. Since an application would be conceivable in particular for bacterial respiratory diseases, concluding investigations of the antibacterial properties of the liquids or aerosols in vitro followed. Six clinically relevant bacterial pathogens were selected, which can be grouped according to two characteristics. The three multi-resistant bacteria Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae and methicillin-resistant Staphylococcus aureus cannot be killed by standard antibiotic therapies and are primarily of nosocomial relevance. The second group exhibits characteristics that are mainly associated with respiratory diseases. The bacteria Streptococcus pneumoniae, Moraxella catarrhalis and Haemophilus influenzae are representatively involved in respiratory diseases with diverse symptoms. These bacterial species were treated with the respective liquids or aerosols and their basic dose-response relationship was characterized. Antibacterial activity of formulations could be determined, which enhanced the already antimicrobial effect of the vehicle components glycerine and propylene glycol by addition of active pharmaceutical ingredients. The hygroscopic properties of these substances are probably responsible for an effect in aerosolized form. They remove moisture from air and have a desiccating effect on bacteria. The treatment of bacterial species Streptococcus pneumoniae, Moraxella catarrhalis and Haemophilus influenzae with aerosol had an antibacterial effect that was time-dependent on the applied power of e-cigarette. The results of investigations lead to the conclusion that each active pharmaceutical ingredient or substance class must be evaluated individually and thus inhaler and formulation must be matched to each other. The use of e-cigarette as a medical device for the application of medicinal products would definitely requires tests according to the European Pharmacopoeia. Modifications could make a dosage well controllable, but also the particle size distribution can be regulated to the extent that the active ingredients are transported to a suitable application site such as mouth, throat or bronchi depending on the particle size. The comparison with properties of other medical inhalers leads to the conclusion that the technology of e-cigarette could well offer similar or better performance for thermally stable active ingredients. This fictitious medical device could consist of a manufacturer-unspecifically produced, rechargeable energy source with a universal thread for multiple use and a manufacturer- and active substance-specifically produced unit consisting of vaporizer and personalized drug content. The drug, a medical liquid (vehicle and active ingredient) can be produced in the tank of the vaporizer with constant, non-variable parameters specific to the patient. Inhaled applications will probably play an increasing role in the future, not least because of the current COVID-19 pandemic. The need for alternative therapeutic options will continue to increase. This work provides a contribution to the use of electronic nicotine delivery system (ENDS) after modification to a potential pulmonary application system as an electronic drug delivery system (EDDS) of inhaled, thermally stable drugs in form of a medical device. KW - e-Zigarette KW - Medizinprodukt KW - inhalative Applikation KW - ätherische Öle KW - Cannabidiol (CBD) KW - Atemwegserkrankungen KW - antibakterielles Aerosol KW - e-cigarette KW - electronic nicotin delivery system (ENDS) KW - electronic drug delivery system (EDDS) KW - essential oils KW - cannabidiol (CBD) KW - respiratory diseases KW - antibacterial aerosol Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-565617 ER - TY - THES A1 - Geisendörfer, Birte T1 - Autologer Ansatz zur Entwicklung von 2D- und 3D-Kokultivierungsmethoden für die Bestimmung des sensibilisierenden Potenzials von Xenobiotika N2 - Die allergische Kontaktdermatitis ist eine immunologisch bedingte Hauterkrankung mit insbesondere in den westlichen Industrienationen hoher und weiter ansteigender Prävalenz. Es handelt sich hierbei um eine Hypersensitivitätsreaktion vom Typ IV, die sich nach Allergenkontakt durch Juckreiz, Rötung, Bläschenbildung und Abschälung der Haut äußert. Zahlreiche Xenobiotika besitzen das Potenzial, Kontaktallergien auszulösen, darunter Konservierungsstoffe, Medikamente, Duftstoffe und Chemikalien. Die wirksamste Maßnahme zur Eindämmung der Erkrankung ist die Expositionsprophylaxe, also die Vermeidung des Kontakts mit den entsprechenden Substanzen. Dies wiederum setzt die Kenntnis des jeweiligen sensibilisierenden Potenzials einer Substanz voraus, dessen Bestimmung aus diesem Grund eine hohe toxikologische Relevanz besitzt. Zu diesem Zweck existieren von der OECD veröffentlichte Testleitlinien, welche auf entsprechend validierten Testmethoden basieren. Goldstandard bei der Prüfung auf hautsensibilisierendes Potenzial war über lange Zeit der murine Lokale Lymphknotentest. Seit der 7. Änderung der EU-Kosmetikrichtlinie, welche Tierversuche für Kosmetika und deren Inhaltsstoffe untersagt, wurden vermehrt Alternativmethoden in die OECD-Testleitlinien implementiert.. Die bestehenden in vitro Methoden sind jedoch alleinstehend nur begrenzt aussagekräftig, da sie lediglich singuläre Mechanismen bei der Entstehung einer Kontaktallergie abbilden. Die Entwicklung von Testmethoden, welche mehrere dieser Schlüsselereignisse berücksichtigen, erscheint daher richtungsweisend. Einen vielversprechenden Ansatz liefert hierbei der Loose-fit coculture-based sensitisation assay (LCSA), welcher eine Kokultur aus primären Keratinozyten und PBMC darstellt. Bei der Kokultivierung von Immunzellen mit anderen Zelltypen stellt sich allerdings die Frage, inwiefern die Nutzung von Zellen derselben Spender*innen (autologe Kokultur) bzw. verschiedener Spender*innen (allogene Kokultur) einen Einfluss nimmt. Zu diesem Zweck wurden im Rahmen dieser Arbeit Hautzellen spenderspezifisch aus gezupften Haarfollikeln isoliert und der LCSA mit den generierten HFDK in autologen und allogenen Ansätzen verglichen. Zusätzlich wurde auch ein Vergleich zwischen der Nutzung von HFDK und NHK, welche aus humaner Vorhaut isoliert wurden, im LCSA durchgeführt. Dabei ergaben sich keine signifikanten Unterschiede zwischen autologen und allogenen Kokulturen bzw. zwischen der Verwendung von HFDK und NHK. Die Verwendung allogener Zellen aus anonymem Spendermaterial sowie die Nutzung von Keratinozyten aus unterschiedlichen Quellen scheint im Rahmen des LCSA problemlos möglich. Einige der getesteten Kontaktallergene, darunter DNCB und NiCl2, erwiesen sich im LCSA jedoch als problematisch und konnten nicht zufriedenstellend als sensibilisierend detektiert werden. Daher wurde eine Optimierung der Kokultur durch Verwendung ex vivo differenzierter Langerhans Zellen (MoLC) angestrebt, welche ein besseres Modell primärer epidermaler Langerhans Zellen darstellen als die dendritischen Zellen aus dem LCSA. Zusätzlich wurden weitere, den Erfolg der Kokultur beeinflussende Faktoren, wie die Art und Zusammensetzung des Mediums und die Kokultivierungsdauer, untersucht und angepasst. Das schlussendlich etablierte Kokultivierungsprotokoll führte zu einer maßgeblich verstärkten Expression von CD207 (Langerin) auf den MoLC, was auf eine wirkungsvolle Interaktion zwischen Haut- und Immunzellen in der Kokultur hindeutete. Des Weiteren konnten DNCB und NiCl2 im Gegensatz zum LCSA durch Verwendung des kostimulatorischen Moleküls CD86 sowie des Reifungsmarkers CD83 als Ausleseparameter eindeutig als Kontaktallergene identifiziert werden. Die Untersuchungen zur Kokultur von MoLC und HFDK wurden jeweils vergleichend in autologen und allogenen Ansätzen durchgeführt. Ähnlich wie beim LCSA kam es aber auch hier zu keinen signifikanten Unterschieden, weder hinsichtlich der Expression von Charakterisierungs- und Aktivierungsmarkern auf MoLC noch hinsichtlich der Zytokinsekretion in den Zellkulturüberstand. Die Hinweise aus zahlreichen Studien im Mausmodell, dass Zellen des angeborenen Immunsystems zur Erkennung von und Aktivierung durch allogene Zellen bzw. Gewebe in der Lage sind, bestätigten sich im Rahmen dieser Arbeit dementsprechend nicht. Aus diesem Grund wurden abschließend CD4+ T-Lymphozyten, die Effektorzellen des adaptiven Immunsystems, in die Kokultur aus MoLC und autologen bzw. allogenen HFDK integriert. Überraschenderweise traten auch hier keine verstärkten Aktivierungen in allogener Kokultur im Vergleich zur autologen Kokultur auf. Die Nutzung autologer Primärzellen scheint im Rahmen der hier getesteten Methoden nicht notwendig zu sein, was die Validierung von Kokulturen und deren Implementierung in die OECD-Testleitlinien erleichtern dürfte. Zuletzt wurde eine Kokultivierung primärer Haut- und Immunzellen auch im 3D-Vollhautmodell durchgeführt, wobei autologe MoLC in die Epidermisäquivalente entsprechender Modelle integriert werden sollten. Obwohl die erstellten Hautmodelle unter Verwendung autologer Haarfollikel-generierter Keratinozyten und Fibroblasten eine zufriedenstellende Differenzierung und Stratifizierung aufwiesen, gestaltete sich die Inkorporation der MoLC als problematisch und konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht erreicht werden. KW - Kontaktallergie KW - Langerhans Zellen KW - Alternativmethoden KW - Kokultur KW - Hautmodell Y1 - 2022 ER - TY - THES A1 - Wetzel, Alexandra T1 - Epigenetische Regulation des Epstein-Barr Virus-induzierten Gens 3 (EBI3) und dessen Bedeutung bei Colitis ulcerosa N2 - Epigenetische Mechanismen spielen eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese von Colitis ulcerosa (CU). Ihr Einfluss auf das beobachtete Ungleichgewicht zwischen pro- und anti-inflammatorischen Cytokinen ist hingegen weitgehend unerforscht. Einige der wichtigsten immunmodulatorischen Cytokine sind die Mitglieder der heterodimeren Interleukin- (IL-) 12-Familie, die durch das Kombinieren einer der drei α-Ketten (IL-12p35, IL-27p28, IL-23p19) mit den ß-Untereinheiten IL-12p40 oder EBI3 (Epstein-Barr Virus-induziertes Gen 3) charakterisiert sind. IL-35 (IL-12p35/EBI3) spielt eine bedeutende anti-inflammatorische Rolle bei verschiedenen Erkrankungen, wohingegen seine Level bei chronischen Entzündungen erniedrigt sind. Eine mögliche Ursache könnte eine transkriptionelle Stilllegung über epigenetische Modifikationen sein. Tatsächlich konnte durch die Stimulation mit dem DNA-Methyltransferase-Inhibitor (DNMTi) Decitabin (DAC; Dacogen®) eine Induktion von EBI3 in humanen Epithelzellen aus gesundem Colon (HCEC) erreicht werden, die als Modell für ein lokales Entzündungsgeschehen dienten. Diese Regulation über DNA-Methylierung konnte in weiteren humanen Zellen unterschiedlichen Ursprungs sowie durch Stimulation von HCEC-Zellen mit zwei weiteren DNMTi, dem Cytosin-Analogon Azacytidin (AZA; Vidaza®) und dem natürlich vorkommenden, epigenetisch wirksamen Polyphenol Epigallocatechingallat (EGCG), verifiziert werden. Die kombinierte Inkubation mit Tumor-Nekrose-Faktor α (TNFα) resultierte jeweils in einer über-additiven Induktion von EBI3. Weiterführende Untersuchungen zeigten, dass TNFα trotz Beeinflussung der epigenetischen DNMT- und Ten-eleven Translocation- (TET-) Enzyme keinen Einfluss auf die globalen Methylierungs- oder Hydroxymethylierungslevel hatte, jedoch eine genspezifische DNA-Hypomethylierung im EBI3-Promotor induzierte. Durch Nutzung verschiedener Inhibitoren konnte darüber hinaus nachgewiesen werden, dass der beobachtete synergistische Effekt der gemeinsamen DAC und TNFα-Stimulation hauptsächlich über NFκB (Nuclear factor “kappa-light-chain-enhancer” of activated B-cells) vermittelt wird. Ein Teil verläuft dabei über p38 MAPK (mitogen-activated protein kinases), während die JNK- (c-Jun N-terminale Kinasen-) und ERK- (extracellular-signal-regulated kinases) Signalwege keine Rolle spielen. In der vorliegenden Arbeit wurde zudem gezeigt, dass die DNA-Hypomethylierung während eines entzündlichen Zustandes auch in einer erhöhten EBI3-Proteinexpression resultiert. Die Höhe der immunologisch detektierten Banden wies auf eine Dimerbildung sowohl im Zelllysat als auch im Überstand hin. Humane Colonepithelzellen sind demnach in der Lage, Cytokine zu bilden und zu sezernieren, was die Bedeutung von Nicht-Immunzellen bei der lokalen Immunantwort unterstreicht. Mittels Genexpressionsanalysen wurden IL-12p35 und IL-23p19 als mögliche Bindungspartner identifiziert. Aufgrund kreuzreaktiver Antikörper ist ein direkter Nachweis der EBI3-Dimere derzeit nicht möglich. Die stattdessen genutzte Kombination verschiedener Methoden dient als geeigneter Ersatz für die problematischen Antikörper-basierten Analysen wie Immunpräzipitation oder ELISA. Durch molekularbiologische, immunologische und massenspektrometrische Methoden konnte IL-35 identifiziert werden, während IL-39 (IL-23p19/EBI3) nicht detektiert wurde. Dies ist in Einklang mit den Erkenntnissen mehrerer Forschungsgruppen, die eine Bildung des nativen humanen Dimers aus IL-23p19 und EBI3 bezweifeln. Des Weiteren wurde die biologische Aktivität des behandlungsinduzierten IL 35-Proteins durch einen Funktionsassay nachgewiesen. Neben einer DNMTi-bedingten transkriptionellen Aktivierung konnte eine Regulation von EBI3 über Histonacetylierungen gezeigt werden. Der EBI3-induzierende Effekt des Histondeacetylasen-Inhibitors (HDACi) Trichostatin A (TSA) wurde durch SAHA (suberoylanilide hydroxamic acid (Vorinostat; Zolinza®)) verifiziert. Ähnlich zu der Stimulation mit den hypomethylierenden Substanzen wurde ein synergistischer Effekt bei paralleler Inkubation mit TNFα beobachtet, der in einer gesteigerten Bildung des EBI3-Proteins resultierte. Um die Befunde in einem komplexeren in vivo-Modell zu untersuchen, wurde eine chronische Colitis in Ebi3-defizienten Mäusen und dem dazugehörigen Wildtypstamm C57BL/6 durch zyklische Applikation von Natriumdextransulfat (Dextran sodium sulfate (DSS)) induziert. Der Vergleich klinischer Parameter wie Mortalitätsrate und Körper- sowie Milzgewicht wies bei Abwesenheit von Ebi3 signifikant stärkere colitische Symptome auf. Dies bestätigte die zentrale Rolle von Ebi3 in der Colitisentwicklung und deutete auf eine bevorzugte Bildung des anti-inflammatorisch wirkenden IL-35 statt des pro-inflammatorischen IL-39 in den Wildtyptieren hin. Durch zusätzliche therapeutische Behandlung der C57BL/6-Mäuse nach der DSS-Gabe konnte die in der Literatur beschriebene positive Wirkung von SAHA auf die Colitismanifestation bestätigt werden. Im Gegensatz dazu war der HDACi in den Ebi3-defizienten Tieren nicht in der Lage, die colitischen Parameter zu verbessern beziehungsweise verschlimmerte den Krankheitsphänotyp. Expressionsanalysen von Up- und Downstream-Target-Genen lieferten weitere Hinweise darauf, dass bei Anwesenheit von Ebi3 IL-35 statt IL-39 gebildet wird, was in Einklang mit den in vitro-Untersuchungen steht. Die vorliegende Arbeit konnte durch den Vergleich der C57BL/6-Mäuse mit den Ebi3-defizienten Tieren neue Erkenntnisse über die Wirkungsweise von SAHA erbringen. Histonacetylierende Bedingungen verbessern colitische Symptome über einen Mechanismus, der die epigenetische Induktion von Ebi3 mit nachfolgender IL-35-Bildung involviert. Durch Kooperation der epigenetischen Mechanismen Hypomethylierung und Histonacetylierung wurde der stärkste Effekt auf die EBI3-Induktion bewirkt. Insgesamt konnte in der vorliegenden Arbeit durch in vitro- und in vivo-Analysen die epigenetische und NFκB-vermittelte Induktion von EBI3 über DNA-Demethylierung und Histonacetylierung mit nachfolgender IL-35-Bildung und –Sezernierung nachgewiesen werden. Da IL-35 in der Lage ist, colitische Symptome zu mildern, stellt die epigenetische Reaktivierbarkeit von EBI3 durch DNMTi und HDACi eine vielversprechende Alternative für die derzeit genutzten, oft nicht oder nur kurzfristig wirksamen Therapien bei der Behandlung einer CU dar. Einer übermäßigen Immunantwort während schubweiser entzündlicher Phasen könnte entgegengewirkt und Komplikationen wie die Bildung Colitis-assoziierter Karzinome verhindert werden. N2 - Aberrant epigenetic alterations are becoming increasingly relevant in the development of multiple diseases. Epigenetic mechanisms also play a crucial role in the pathogenesis of ulcerative colitis (CU). In contrast, their influence on the observed imbalance between pro- and anti-inflammatory cytokines is largely unexplored. Several of the most important immunomodulatory cytokines are the members of the heterodimeric interleukin- (IL-) 12 family, which are characterized by combining one of the three α-chains (IL-12p35, IL-27p28, IL-23p19) with the ß-subunits IL-12p40 or EBI3 (Epstein-Barr virus induced gene 3). IL-35 (IL-12p35/EBI3) plays a significant anti-inflammatory role in various diseases, while its levels are decreased in chronic inflammation. One possible reason could be transcriptional silencing via epigenetic modifications. Indeed, stimulation with the DNA methyltransferase inhibitor (DNMTi) decitabine (DAC; Dacogen®) resulted in reactivation of EBI3 in Human Colon Epithelial Cells (HCEC) generated from healthy tissue, which served as a model for a local inflammatory process. This regulation via DNA methylation could be verified in other human cells of different origin as well as by stimulating HCEC cells with two additional DNMTi, the cytosine analog azacytidine (AZA; Vidaza®) and the naturally occurring, epigenetically active polyphenol epigallocatechin gallate (EGCG). Combined incubation with tumor necrosis factor α (TNFα) resulted in synergistic induction of EBI3. Further studies showed that TNFα had no effect on global methylation or hydroxymethylation levels despite its influence on epigenetic DNMT and ten-eleven translocation (TET) enzymes, but induced gene-specific DNA hypomethylation in the EBI3 promoter. Moreover, by using several inhibitors, it has been demonstrated that the synergistic effect of DAC and TNFα stimulation is mediated mainly via NFκB (nuclear factor "kappa-light-chain-enhancer" of activated B-cells). Part of this occurs via p38 MAPK (mitogen-activated protein kinases), while the JNK (c-Jun N-terminal kinases) and ERK (extracellular-signal-regulated kinases) signaling pathways are not involved. In the present work, it was also shown that DNA hypomethylation during an inflammatory condition also results in increased EBI3 protein expression. The level of immunologically detected bands indicated dimer formation in both cell lysate and supernatant. Human epithelial cells are therefore capable of producing and secreting cytokines, underlining the importance of non-immune cells in the local immune response. Gene expression analyses identified IL-12p35 and IL-23p19 as possible binding partners. Due to cross-reactive antibodies, direct detection of EBI3 dimers is currently not possible. The combination of different methods used instead serves as a suitable alternative to the problematic antibody-based analyses such as immunoprecipitation or ELISA. Molecular biology, immunology, and mass spectrometry methods identified IL-35, whereas IL-39 (IL-23p19/EBI3) was not detected. This is in agreement with the findings of several research groups that doubt formation of the native human dimer. Furthermore, the biological activity of treatment-induced IL-35 protein was detected by a functional assay. In addition to DNMTi-induced reactivation, regulation of EBI3 via histone acetylation was demonstrated. The EBI3-inducing effect of the histone deacetylase inhibitor (HDACi) trichostatin A (TSA) was verified by SAHA (suberoylanilide hydroxamic acid (Vorinostat; Zolinza®)). Similar to stimulation with the hypomethylating agents, a synergistic effect was observed with parallel incubation with TNFα, resulting in increased EBI3 protein formation. To investigate the effects in a more complex in vivo model, chronic colitis was induced in Ebi3-deficient mice and the corresponding wild-type strain C57BL/6 by cyclic application of dextran sodium sulfate (DSS). Comparison of clinical parameters such as mortality rate and body as well as spleen weight showed significantly more severe colitic symptoms in the absence of Ebi3. This confirmed the central role of Ebi3 in colitis development and indicated preferential formation of the anti-inflammatory IL-35 rather than the pro-inflammatory IL-39 in wild-type animals. Additional therapeutic treatment of C57BL/6 mice after DSS administration confirmed the beneficial effect of SAHA on colitis manifestation reported in the literature. In contrast, HDACi in the Ebi3-deficient animals was not able to improve colitic parameters and even appeared to exacerbate the disease phenotype. Expression analyses of up- and downstream target genes provided further evidence that IL-35 rather than IL-39 is produced in the presence of Ebi3, consistent with the in vitro studies. Thus, comparison of the C57BL/6 mice with the Ebi3-deficient animals could provide insights into the mode of action of SAHA. Histone acetylating conditions ameliorate colitic symptoms via a mechanism involving epigenetic induction of Ebi3 followed by IL-35 formation. Based on the cooperation of epigenetic mechanisms and the drastic EBI3 induction shown by parallel hypomethylating and histone acetylating conditions, combined treatment with low-dose DNMTi and HDACi represents a therapeutic option for CU. In summary, the present work demonstrated epigenetic and NFκB-mediated reactivation of EBI3 via DNA demethylation and histone acetylation with subsequent IL-35 formation and secretion by in vitro and in vivo analyses. Since IL-35 is able to alleviate colitic symptoms, the epigenetic inducibility of EBI3 by DNMTi and HDACi represents a promising alternative for the currently used therapies in the treatment of CU, which are often not successful or only short-term effective. An excessive immune response during relapsing inflammatory phases could be counteracted and complications such as the formation of colitis-associated carcinomas prevented. KW - Epigenetik KW - Epstein-Barr Virus-induziertes Gen 3 KW - Colitis ulcerosa Y1 - 2022 ER - TY - THES A1 - Knoche, Lisa T1 - Untersuchung von Transformationsprodukten ausgewählter Tierarzneimittel generiert durch Elektrochemie, Mikrosomal Assay, Hydrolyse und Photolyse T1 - Investigation of transformation products of selected veterinary drugs generated by electrochemistry, microsomal assays, hydrolysis & photolysis N2 - The knowledge of transformation pathways and transformation products of veterinary drugs is important for health, food and environmental matters. Residues, consisting of original veterinary drug and transformation products, are found in food products of animal origin as well as the environment (e.g., soil or surface water). Several transformation processes can alter the original veterinary drug, ranging from biotransformation in living organism to environmental degradation processes like photolysis, hydrolysis, or microbial processes. In this thesis, four veterinary drugs were investigated, three ionophore antibiotics Monensin, Salinomycin and Lasalocid and the macrocyclic lactone Moxidectin. Ionophore antibiotics are mainly used to cure and prevent coccidiosis in poultry especially prophylactic in broiler farming. Moxidectin is an antiparasitic drug that is used for the treatment of internal and external parasites in food-producing and companion animals. The main objective of this work is to employ different laboratory approaches to generate and identify transformation products. The identification was conducted using high-resolution mass spectrometry (HRMS). A major focus was placed on the application of electrochemistry for simulation of transformation processes. The electrochemical reactor – equipped with a three-electrode flow-through cell – enabled the oxidation or reduction by applying a potential. The transformation products derived were analyzed by online coupling of the electrochemical reactor and a HRMS and offline by liquid chromatography (LC) combined with HRMS. The main modification reaction of the identified transformation products differed for each investigated veterinary drug. Monensin showed decarboxylation and demethylation as the main modification reactions, for Salinomycin mostly decarbonylation occurred and for Lasalocid methylation was prevalent. For Moxidectin, I observed an oxidation (hydroxylation) reaction and adduct formation with solvent. In general, for Salinomycin and Lasalocid, more transient transformation products (online measurement) than stable transformation products (offline measurements) were detected. By contrast, the number of transformation products using online and offline measurements were identical for Monensin and Moxidectin. As a complementary approach, metabolism tests with rat or human liver microsomes were conducted for the ionophore antibiotics. Monensin was investigated by using rat liver microsomes and the transformation products identified were based on decarboxylation and demethylation. Salinomycin and Lasalocid were converted by human and rat liver microsomes. For both substances, more transformation products were found by using human liver microsomes. The transformation products of the rat liver microsome conversion were redundant, and the transformation products were also found at the human liver microsome assay. Oxidation (hydroxylation) was found to be the main modification reaction for both. In addition, a frequent ion exchange between sodium and potassium was identified. The final two experiments were performed for one substance each, whereby the hydrolysis of Monensin and the photolysis of Moxidectin was investigated. The transformation products of the pH-dependent hydrolysis were based on ring-opening and dehydration. Moxidectin formed several transformation products by irradiation with UV-C light and the main modification reactions were isomeric changes, (de-)hydration and changes of the methoxime moiety. In summary, transformation products of the four investigated veterinary drugs were generated by the different laboratory approaches. Most of the transformation products were identified for the first time. The resulting findings provide an improved understanding of clarifying the transformation behavior. N2 - Das Wissen über die Entstehung und Identifizierung von Transformationsprodukten von Tierarzneimitteln ist wichtig für Gesundheit, Lebensmittel und Umwelt. Rückstände, dazu zählen die Ausgangssubstanzen und gebildete Transformationsprodukte, werden in tierischen Produkten und in Umweltproben (zum Beispiel im Boden oder in Oberflächengewässern) nachgewiesen. Verschiedenste Transformationsprozesse verändern die Ausgangssubstanz, dazu zählen Biotransformationsprozesse von Lebewesen bis hin zu Abbauprozesse in der Umwelt, wie Photolyse, Hydrolyse oder mikrobielle Umwandlungen. Die Tierarzneimittel, die im Rahmen dieser Arbeit untersucht wurden, sind drei Ionophore Antibiotika: Monensin, Salinomycin und Lasalocid. Des Weiteren war das makrozyklische Lakton Moxidectin Teil der Untersuchung. Ionophore Antibiotika werden gegen Kokzidiose vor allem in der Geflügelzucht genutzt. Der oftmals prophylaktische Einsatz erfolgt als Futtermittelzusatz. Das Antiparasitikum Moxidectin wird hingegen für die Behandlung gegen interne and externe Parasiten bei Nutz- und Haustieren eingesetzt. Das Ziel dieser Arbeit war es, Transformationsprodukte zu identifizieren, welche durch verschiedene Experimente im Labor generiert werden. Zur Identifizierung wurde hochaufgelöste Massenspektrometrie genutzt, zur Strukturaufklärung wurden MS/MS-Spektren ausgewertet. Hauptaugenmerk lag auf der Simulation von Transformationsprozessen durch Elektrochemie. In der Durchflusszelle des elektrochemischen Reaktors werden Oxidations- oder Reduktionsprozesse durch Anlegung eines Potentials ermöglicht. Die Analyse der entstehenden Transformationsprodukte erfolgt entweder durch die direkte Kopplung zwischen dem elektrochemischen Reaktor und dem Massenspektrometer oder offline, wobei das Eluat des elektrochemischen Reaktors mittels Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie analysiert wird. Für jedes Tierarzneimittel kann eine typische Modifizierung, welche zur Bildung des Transformationsproduktes führt, identifiziert werden. Die elektrochemisch induzierte Modifikation von Monensin ist Decarboxylierung und Demethylierung. Salinomycin weist Decarbonylierung auf und Lasalocid Methylierung. Für Moxidectin wurden Oxidation (Hydroxylierung) und Adduktbildung mit Lösemittelmolekülen gefunden. Im Allgemeinen wurden bei Salinomycin und Lasalocid mehr instabile Transformationsprodukte (online Kopplung) gefunden als stabile Transformationsprodukte (offline Messung). Im Gegensatz dazu ist die Zahl der detektierten Transformationsprodukte (online und offline) gleich für Monensin und Moxidectin. Als Weiteres wurden für die Ionophore Antibiotika Metabolismustests mit Ratten- bzw. menschlichen Lebermikrosomen durchgeführt. Monensin wurde nur mit Rattenlebermikrosomen umgesetzt und die entstandenen Transformations-produkte basieren auf Decarboxylierung und Demethylierung. Transformations-produkte von Salinomycin und Lasalocid wurden durch Tests mit Ratten- und menschlichen Lebermikrosomen generiert. Bei der Umsetzung mit den Rattenlebermikrosomen wurden identische Transformationsprodukte gefunden im Vergleich zur Umsetzung mit den menschlichen Lebermikrosomen. Neben der Oxidation (Hydroxylierung), als am meisten vorkommende Modifizierung, wurde für beide Ionophore ein Ionenaustausch zwischen Natrium und Kalium festgestellt. Zuletzt wurde die Hydrolyse von Monensin und die Photolyse von Moxidectin untersucht. Die gebildeten Transformationsprodukte der pH-abhängigen Hydrolyse von Monensin basieren auf Ringöffnungsreaktionen und Wasserabspaltung. Eine Vielzahl an Transformationsprodukten von Moxidectin zeigt sich nach der Bestrahlung mit UV-C Licht. Als Modifizierung treten Veränderungen der Stereochemie auf, Wasseranlagerung bzw. Abspaltung, und Veränderungen an der Methyloxim-Gruppe auf. Zusammengefasst wurden verschiedenste Transformationsprodukte der vier gewählten Tierarzneimittel durch unterschiedliche Experimente gebildet. Die meisten Transformationsprodukte wurden im Rahmen dieser Arbeit erstmals identifiziert, vor allem die elektrochemische Erzeugung der Transformationsprodukte wurde erstmals untersucht. Die resultierenden Ergebnisse führen zu einem weiterführenden Verständnis zur Aufklärung des Transformationsverhaltens. KW - Transformation product KW - Veterinary drugs KW - Electrochemistry KW - Microsomal KW - Assay High-resolution mass spectrometry KW - Transformationsprodukt KW - Tierarzneimittel KW - Elektrochemie KW - Mikrosomal KW - Assay hochauflösende Massenspektrometrie Y1 - 2022 ER - TY - THES A1 - Bishop, Christopher Allen T1 - Influence of dairy intake on odd-chain fatty acids and energy metabolism T1 - Einfluss der Milchaufnahme auf ungeradkettige Fettsäuren und Energiestoffwechsel N2 - As of late, epidemiological studies have highlighted a strong association of dairy intake with lower disease risk, and similarly with an increased amount of odd-chain fatty acids (OCFA). While the OCFA also demonstrate inverse associations with disease incidence, the direct dietary sources and mode of action of the OCFA remain poorly understood. The overall aim of this thesis was to determine the impact of two main fractions of dairy, milk fat and milk protein, on OCFA levels and their influence on health outcomes under high-fat (HF) diet conditions. Both fractions represent viable sources of OCFA, as milk fats contain a significant amount of OCFA and milk proteins are high in branched chain amino acids (BCAA), namely valine (Val) and isoleucine (Ile), which can produce propionyl-CoA (Pr-CoA), a precursor for endogenous OCFA synthesis, while leucine (Leu) does not. Additionally, this project sought to clarify the specific metabolic effects of the OCFA heptadecanoic acid (C17:0). Both short-term and long-term feeding studies were performed using male C57BL/6JRj mice fed HF diets supplemented with milk fat or C17:0, as well as milk protein or individual BCAA (Val; Leu) to determine their influences on OCFA and metabolic health. Short-term feeding revealed that both milk fractions induce OCFA in vivo, and the increases elicited by milk protein could be, in part, explained by Val intake. In vitro studies using primary hepatocytes further showed an induction of OCFA after Val treatment via de novo lipogenesis and increased α-oxidation. In the long-term studies, both milk fat and milk protein increased hepatic and circulating OCFA levels; however, only milk protein elicited protective effects on adiposity and hepatic fat accumulation—likely mediated by the anti-obesogenic effects of an increased Leu intake. In contrast, Val feeding did not increase OCFA levels nor improve obesity, but rather resulted in glucotoxicity-induced insulin resistance in skeletal muscle mediated by its metabolite 3-hydroxyisobutyrate (3-HIB). Finally, while OCFA levels correlated with improved health outcomes, C17:0 produced negligible effects in preventing HF-diet induced health impairments. The results presented herein demonstrate that the beneficial health outcomes associated with dairy intake are likely mediated through the effects of milk protein, while OCFA levels are likely a mere association and do not play a significant causal role in metabolic health under HF conditions. Furthermore, the highly divergent metabolic effects of the two BCAA, Leu and Val, unraveled herein highlight the importance of protein quality. N2 - In den letzten Jahren haben epidemiologische Studien einen Zusammenhang zwischen dem Verzehr von Milchprodukten und einem geringeren Krankheitsrisiko sowie einem erhöhten Gehalt an ungeradzahligen Fettsäuren (OCFA) aufgezeigt. Während die OCFA ebenfalls mit einem verminderten Krankheitsrisiko assoziiert sind, ist über die direkten diätetischen Quellen und die physiologische Rolle der OCFA noch wenig bekannt. Das Hauptziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Bedeutung der beiden Hauptfraktionen von Milchprodukten, Milchfett und Milchprotein, für den OCFA-Gehalt und ihren Einfluss auf die Gesundheit unter den Bedingungen einer fettreichen Ernährung (HF). Beide Fraktionen sind mögliche OCFA-Quellen, da Milchfette selber signifikante Mengen an OCFA enthalten und Milchproteine einen hohen Anteil an verzweigtkettigen Aminosäuren (BCAA) haben, nämlich Valin (Val) und Isoleucin (Ile), aus denen Propionyl-CoA (Pr-CoA), eine Vorstufe für die endogene OCFA-Synthese, gebildet werden kann, während das für Leucin (Leu) nicht der Fall ist. Außerdem sollten in diesem Projekt die spezifischen metabolischen Auswirkungen der OCFA Heptadecansäure (C17:0) geklärt werden. Dazu wurden Kurzzeit- und Langzeit-Fütterungsstudien mit männlichen C57BL/6JRj-Mäusen durchgeführt, die mit HF-Diäten gefüttert wurden, die mit Milchfett oder C17:0 sowie mit Milchprotein oder einzelnen BCAA (Val; Leu) supplementiert wurden, um deren Einfluss auf die OCFA und die metabolische Gesundheit zu untersuchen. Kurzzeitstudien zeigten, dass beide Milchfraktionen OCFA induzieren, wobei die Erhöhungen durch Milchprotein teilweise durch die Val-Aufnahme erklärt werden konnten. Studien mit primären Hepatozyten zeigten außerdem eine Induktion von OCFA nach Val-Behandlung durch de-novo-Lipogenese und eine erhöhte α-Oxidation. In den Langzeitstudien erhöhten Milchfett und Milchprotein die hepatischen und zirkulierenden OCFA-Spiegel; allerdings hatte nur Milchprotein eine schützende Wirkung auf Adipositas und hepatische Fettansammlung, wahrscheinlich vermittelt durch eine erhöhte Leu-Aufnahme. Im Gegensatz dazu hatte die Val-Supplementierung keinen Einfluss auf die OCFA-Spiegel oder die Entwicklung von Adipositas, führte jedoch zu einer durch Glukotoxizität induzierten Insulinresistenz im Skelettmuskel, vermittelt durch den Val-Metaboliten 3-Hydroxyisobutyrat (3-HIB). Die C17:0-Supplementierung schließlich hatte keine Auswirkungen auf die HF-Diät-induzierte Adipositas und assoziierten Gesundheitsbeeinträchtigungen. Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass die mit dem Verzehr von Milchprodukten verbundenen positiven gesundheitlichen Auswirkungen wahrscheinlich durch die Wirkung von Milchprotein vermittelt werden, während der OCFA-Gehalt wahrscheinlich nur eine Assoziation darstellt und keine signifikante kausale Rolle für die metabolische Gesundheit unter HF-Bedingungen spielt. Die hier aufgeklärten deutlich unterschiedlichen metabolischen Auswirkungen der beiden BCAA Leu und Val unterstreichen zudem die Bedeutung der Proteinqualität. KW - odd chain fatty acids KW - branched chain amino acids KW - protein KW - dairy intake KW - obesity KW - verzweigtkettige Aminosäuren KW - Milcheinnahme KW - Adipositas KW - ungeradkettige Fettsäuren KW - Protein Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-561541 ER - TY - THES A1 - Schell, Mareike T1 - Investigating the effect of Lactobacillus rhamnosus GG on emotional behavior in diet-induced obese C57BL/6N mice T1 - Untersuchung der Wirkung von Lactobacillus rhamnosus GG bei Störungen des emotionalen Verhaltens in einem Mausmodell Diät-induzierter Adipositas N2 - The prevalence of depression and anxiety is increased in obese patients compared to healthy humans, which is partially due to a shared pathogenesis, including insulin resistance and inflammation. These factors are also linked to intestinal dysbiosis. Additionally, the chronic consumption of diets rich in saturated fats results in body weight gain, hormonal resistances and unfavorable changes in the microbiome composition. The intake of Lactobacilli has already been shown to improve dysbiosis along with metabolism and mood. Yet, the beneficial role and the underlying mechanism of Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) to improve emotional behavior in established diet-induced obese conditions are, so far, unknown. To characterize the role of LGG in diet-induced obesity, female and male C57BL/6N mice were fed a semi-synthetic low-fat diet (LFD, 10 % kcal from fat) or a conventional high-fat diet (HFD, 45 % kcal from fat) for initial 6 weeks, which was followed by daily oral gavage of vehicle or 1x10^8 CFU of LGG until the end of the experiment. Mice were subjected to basic metabolic and extensive behavioral phenotyping, with a focus on emotional behavior. Moreover, composition of cecal gut microbiome, metabolomic profile in plasma and cerebrospinal fluid was investigated and followed by molecular analyses. Both HFD-feeding and LGG application resulted in sex-specific differences. While LGG prevented the increase of plasma insulin, adrenal gland weight and hyperactivity in diet-induced obese female mice, there was no regulation of anxiodepressive-like behavior. In contrast, metabolism of male mice did not benefit from LGG application, but strikingly, LGG decreased specifically depressive-like behavior in the Mousetail Suspension Test which was confirmed by the Splash Test characterizing motivation for ’self-care’. The microbiome analysis in male mice revealed that HFD-feeding, but not LGG application, altered cecal microbiome composition, indicating a direct effect of LGG on behavioral regulation. However, in female mice, both HFD-feeding and LGG application resulted in changes of microbiome composition, which presumably affected metabolism. Moreover, as diet-induced obese female mice unexpectedly did not exhibit anxiodepressive-like behavior, follow-up analyses were conducted in male mice. Here, HFD-feeding significantly altered abundance of plasma lipids whereas LGG decreased branched chain amino acids which associated with improved emotional behavior. In nucleus accumbens (NAcc) and VTA/SN, which belong to the dopaminergic system, LGG restored HFD-induced decrease of tyrosine hydroxylase, the rate-limiting enzyme in dopamine synthesis, on gene expression level. Lastly, transcriptome analysis in the NAcc identified gene expression of cholecystokinin as a potential mediator of the effect of LGG on HFD-induced emotional alterations. In summary, this thesis revealed the beneficial effects of LGG application on emotional alterations in established diet-induced obesity. Furthermore, both HFD-feeding and LGG treatment exhibited sex-specific effects, resulting in metabolic improvements in female mice while LGG application mitigated depressive-like behavior in obese male mice along with a molecular signature of restored dopamine synthesis and neuropeptide signaling. N2 - n adipösen Patienten liegt eine erhöhte Prävalenz von Depressionen und Angsterkrankungen vor. Dies liegt unter anderem an einer gemeinsamen Pathogenese, der eine Insulinresistenz sowie ein chronischer Entzündungszustand zugrunde liegen. Diese Faktoren sind mit einer intestinalen Dysbiose assoziiert, die auch durch eine Fehlernährung, beispielsweise mit einer fettreichen Diät, hervorgerufen werden kann. Es konnte bereits gezeigt werden, dass die Aufnahme von Laktobazillen nicht nur eine Dysbiose und den Stoffwechsel verbessert, sondern sich auch positiv auf das Gemüt auswirken kann. Ob jedoch Lactobacillus rhamnosus GG in der Lage ist, in einem Zustand der etablierten ernährungsbedingten Fettleibigkeit das emotionale Verhalten zu verbessern und welche Mechanismen zugrunde liegen, ist noch ungeklärt. Um die Rolle von LGG bei ernährungsbedingter Fettleibigkeit zu charakterisieren, wurden weibliche und männliche C57BL/6N Mäuse mit einer semi-synthetischen Niedrigfettdiät (LFD, 10 % kcal aus Fett) oder einer konventionellen Hochfettdiät (HFD, 45 % kcal aus Fett) für die ersten 6 Wochen gefüttert, um den Zustand einer Adipositas zu etablieren. Anschließend haben die Mäuse eine tägliche perorale Applikation eines Vehikels oder 1x10^8 KBE LGG bis zum Versuchsende erhalten. Die Mäuse wurden einer allgemeinen metabolischen Charakterisierung und einer umfassenden Verhaltensphänotypisierung unterzogen, die Aufschlüsse über das emotionale Verhalten liefern sollen. Darüber hinaus wurde die Zusammensetzung des Darmmikrobioms bestimmt, im Plasma und in der Zerebrospinalflüssigkeit das Metabolitprofil untersucht und durch molekulare Analysen ergänzt. Sowohl die HFD-Fütterung als auch die LGG-Applikation führten zu geschlechtsspezifischen Unterschieden. Während LGG den diätinduzierten Anstieg von Plasmainsulin, ein erhöhtes Nebennierengewicht und Hyperaktivität in weiblichen Mäusen verhinderte, wurde das emotionale Verhalten nicht reguliert. Im Gegensatz dazu profitierte der Stoffwechsel männlicher Mäuse nicht von der LGG-Anwendung, jedoch war LGG in der Lage, spezifisch das depressiv-ähnliches Verhalten zu verbessern, was durch eine Analyse des zielgerichteten Verhaltens bestätigt wurde. Die Mikrobiomanalyse ergab, dass die Diät, jedoch nicht LGG, die Zusammensetzung des Darmmikrobioms in männlichen Mäusen verändert, was auf eine direkte Rolle von LGG in der Verhaltensregulation hindeutet. Im Vergleich dazu war das Darmmikrobiom in weiblichen Mäusen durch die Diät als auch durch LGG verändert, was zu den positiven Veränderungen der Stoffwechselparameter geführt haben könnte. Da weibliche Mäuse weder durch die HFD-Fütterung noch durch die LGG-Gabe einen Effekt auf emotionales Verhalten aufwiesen, wurden die Folgeanalysen bei männlichen Mäusen durchgeführt. Während die HFD-Fütterung das Vorkommen von Plasmalipiden veränderte, lagen aufgrund der LGG-Gabe verzweigtkettige Aminosäuren verringert vor, was mit einem verbessertem emotionalen Verhalten assoziierte. In den dopaminergen Gehirnregionen Nucleus Accumbens (NAcc) und VTA/SN revertierte LGG die HFD-induzierte Reduktion der Tyrosinhydroxylase Genexpression, des geschwindigkeitsbegrenzenden Enzyms in der Dopaminsynthese. Abschließend wurde eine Transkriptomanalyse mittels RNA Sequencing durchgeführt, welche die Genexpression von Cholezystokinin im NAcc als potenzieller Mediator in der Wirkung von LGG bei HFD-induzierten emotionalen Veränderungen identifizierte. Zusammenfassend konnten in dieser Arbeit die positiven Auswirkungen der LGG-Gabe auf emotionales Verhalten bei etablierter ernährungsbedingter Fettleibigkeit gezeigt werden.. Sowohl die HFD-Fütterung als auch die LGG-Gabe führten zu geschlechtsspezifischen Effekten, was zu Stoffwechselverbesserungen bei weiblichen Mäusen führte, während die LGG-Gabe das depressiv-ähnliche Verhalten bei männlichen Mäusen abschwächte. Zudem wurden auf Genexpressionsebene Tyrosinhydroxylase und Cholezystokinin identifiziert, die potentiell den Effekt von LGG auf das emotionale Verhalten in einem Modell etablierter ernährungsbedingter Fettleibigkeit vermitteln. KW - obesity KW - insulin resistance KW - probiotics KW - lactobacillus KW - depression KW - emotionality Y1 - 2022 ER - TY - THES A1 - Figueroa Campos, Gustavo Adolfo T1 - Wet-coffee processing production wastes T1 - Produktionsabfälle aus der Nasskaffeeverarbeitung BT - quality, potentials, and valorization opportunities BT - Qualität, Potenziale und Verwertungsmöglichkeiten N2 - Countries processing raw coffee beans are burdened with low economical incomes to fight the serious environmental problems caused by the by-products and wastewater that is generated during the wet-coffee processing. The aim of this work was to develop alternative methods of improving the waste by-product quality and thus making the process economically more attractive with valorization options that can be brought to the coffee producers. The type of processing influences not only the constitution of green coffee but also of by-products and wastewater. Therefore, coffee bean samples as well as by-products and wastewater collected at different production steps of were analyzed. Results show that the composition of wastewater is dependent on how much and how often the wastewater is recycled in the processing. Considering the coffee beans, results indicate that the proteins might be affected during processing and a positive effect of the fermentation on the solubility and accessibility of proteins seems to be probable. The steps of coffee processing influence the different constituents of green coffee beans which, during roasting, give rise to aroma compounds and express the characteristics of roasted coffee beans. Knowing that this group of compounds is involved in the Maillard reaction during roasting, this possibility could be utilized for the coffee producers to improve the quality of green coffee beans and finally the coffee cup quality. The valorization of coffee wastes through modification to activated carbon has been considered as a low-cost option creating an adsorbent with prospective to compete with commercial carbons. Activation protocol using spent coffee and parchment was developed and prepared to assess their adsorption capacity for organic compounds. Spent coffee grounds and parchment proved to have similar adsorption efficiency to commercial activated carbon. The results of this study document a significant information originating from the processing of the de-pulped to green coffee beans. Furthermore, it showed that coffee parchment and spent coffee grounds can be valorized as low-cost option to produce activated carbons. Further work needs to be directed to the optimization of the activation methods to improve the quality of the materials produced and the viability of applying such experiments in-situ to bring the coffee producer further valorization opportunities with environmental perspectives. Coffee producers would profit in establishing appropriate simple technologies to improve green coffee quality, re-use coffee by-products, and wastewater valorization. N2 - Produktionsabfälle aus der Nasskaffeeverarbeitung: Qualität, Potenziale und Verwertungsmöglichkeiten Die Länder, die Rohkaffee verarbeiten, haben nur ein geringes wirtschaftliches Einkommen, um die ernsten Umweltprobleme zu bekämpfen, die durch die bei der Nasskaffeeverarbeitung anfallenden Nebenprodukte und Abwässer verursacht werden. Ziel dieser Arbeit war es, alternative Methoden zu entwickeln, um die Qualität der Nebenprodukte zu verbessern und so den Prozess wirtschaftlich attraktiver zu machen, indem den Kaffeeproduzenten Valorisierungsoptionen geboten werden. Die Art der Verarbeitung beeinflusst nicht nur die Beschaffenheit des Rohkaffees, sondern auch die der Nebenprodukte und des Abwassers. Daher wurden Proben von Kaffeebohnen sowie Nebenprodukte und Abwässer analysiert, die bei verschiedenen Produktionsschritten gesammelt wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass die Zusammensetzung des Abwassers davon abhängt, wie viel und wie oft das Abwasser bei der Verarbeitung recycelt wird. In Bezug auf die Kaffeebohnen deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die Proteine während der Verarbeitung beeinträchtigt werden könnten, und eine positive Auswirkung der Fermentation auf die Löslichkeit und Zugänglichkeit der Proteine scheint wahrscheinlich zu sein. Die Schritte der Kaffeeverarbeitung beeinflussen die verschiedenen Bestandteile der grünen Kaffeebohnen, die beim Rösten zu Aromastoffen werden und die Eigenschaften der gerösteten Kaffeebohnen zum Ausdruck bringen. Da diese Gruppe von Verbindungen an der Maillard-Reaktion während des Röstens beteiligt ist, könnte diese Möglichkeit von den Kaffeeproduzenten genutzt werden, um die Qualität der grünen Kaffeebohnen und schließlich die Qualität des zubereiteten Kaffees zu verbessern. Die Herstellung von Aktivkohle aus modifizierten Kaffeeabfällen wurde als kostengünstige Option zur Schaffung eines Adsorptionsmittels betrachtet, das mit handelsüblicher Aktivkohle konkurrieren könnte. Es wurde ein Aktivierungsprotokoll für gebrauchten Kaffee und Pergament entwickelt und vorbereitet, um deren Adsorptionskapazität für organische Verbindungen zu bewerten. Es zeigte sich, dass Kaffeesatz und Pergament eine ähnliche Adsorptionseffizienz aufweisen wie kommerzielle Aktivkohle. Die Ergebnisse dieser Studie belegen, dass die Verarbeitung von den entpulpten zu grünen Kaffeebohnen eine wichtige Information darstellt. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Kaffeepergament und Kaffeesatz als kostengünstige Möglichkeit zur Herstellung von Aktivkohle genutzt werden können. Weitere Arbeiten müssen sich mit der Optimierung der Aktivierungsmethoden befassen, um die Qualität der hergestellten Materialien zu verbessern, und mit der Durchführbarkeit solcher Experimente in-situ, um den Kaffeeproduzenten weitere Aufwertungsmöglichkeiten mit Umweltperspektive zu bieten. Die Kaffeeproduzenten würden von der Einführung geeigneter einfacher Technologien zur Verbesserung der Rohkaffeequalität, der Wiederverwendung von Kaffeenebenprodukten und der Aufwertung von Abwässern profitieren. KW - Arabica coffee beans KW - coffee processing KW - coffee by-products KW - protein modification KW - activated carbon KW - Arabica Kaffeebohnen KW - Aktivkohle KW - Kaffeenebenprodukte KW - Kaffeeverarbeitung KW - Protein Modifizierung Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-558828 ER - TY - THES A1 - Igual Gil, Carla T1 - Role of the GDF15-GFRAL pathway under skeletal muscle mitochondrial stress T1 - Funktion des GDF15-GFRAL Signaltransduktionsweges bei mitochondrialem Stress im Skelettmuskel N2 - Growth differentiation factor 15 (GDF15) is a stress-induced cytokine secreted into the circulation by a number of tissues under different pathological conditions such as cardiovascular disease, cancer or mitochondrial dysfunction, among others. While GDF15 signaling through its recently identified hindbrain-specific receptor GDNF family receptor alpha-like (GFRAL) has been proposed to be involved in the metabolic stress response, its endocrine role under chronic stress conditions is still poorly understood. Mitochondrial dysfunction is characterized by the impairment of oxidative phosphorylation (OXPHOS), leading to inefficient functioning of mitochondria and consequently, to mitochondrial stress. Importantly, mitochondrial dysfunction is among the pathologies to most robustly induce GDF15 as a cytokine in the circulation. The overall aim of this thesis was to elucidate the role of the GDF15-GFRAL pathway under mitochondrial stress conditions. For this purpose, a mouse model of skeletal muscle-specific mitochondrial stress achieved by ectopic expression of uncoupling protein 1 (UCP1), the HSA-Ucp1-transgenic (TG) mouse, was employed. As a consequence of mitochondrial stress, TG mice display a metabolic remodeling consisting of a lean phenotype, an improved glucose metabolism, an increased metabolic flexibility and a metabolic activation of white adipose tissue. Making use of TG mice crossed with whole body Gdf15-knockout (GdKO) and Gfral-knockout (GfKO) mouse models, this thesis demonstrates that skeletal muscle mitochondrial stress induces the integrated stress response (ISR) and GDF15 in skeletal muscle, which is released into the circulation as a myokine (muscle-induced cytokine) in a circadian manner. Further, this work identifies GDF15-GFRAL signaling to be responsible for the systemic metabolic remodeling elicited by mitochondrial stress in TG mice. Moreover, this study reveals a daytime-restricted anorexia induced by the GDF15-GFRAL axis under muscle mitochondrial stress, which is, mechanistically, mediated through the induction of hypothalamic corticotropin releasing hormone (CRH). Finally, this work elucidates a so far unknown physiological outcome of the GDF15-GFRAL pathway: the induction of anxiety-like behavior. In conclusion, this study uncovers a muscle-brain crosstalk under skeletal muscle mitochondrial stress conditions through the induction of GDF15 as a myokine that signals through the hindbrain-specific GFRAL receptor to elicit a stress response leading to metabolic remodeling and modulation of ingestive- and anxiety-like behavior. N2 - Der Wachstum- und Differenzierungsfaktor 15 (GDF15) ist ein stressinduziertes Zytokin, dass bei u.a. Krebs, kardiovaskulären oder mitochondrialer Erkrankungen in den betroffenen Geweben stark induziert und ins Blut sekretiert werden kann. Die endokrine Funktion von GDF15 sowie die Bedeutung des kürzlich identifizierten und spezifisch im Hirnstamm exprimierten GDF15-Rezeptors GFRAL (GDNF family receptor alpha-like) unter chronischen Stressbedingungen ist jedoch noch unzureichend verstanden. Mitochondrialer Stress ist durch eine Fehlfunktion der oxidativen Phosphorylierung (OXPHOS) charakterisiert, was eine ineffiziente ATP-Synthese und eine gestörte zelluläre Energiehomöostase zur Folge hat. Ziel der Doktorarbeit war es, die biologische Funktion des GDF15-GFRAL-Signalwegs unter mitochondrialen Stressbedingungen aufzuklären. Zu diesem Zweck wurde das etablierte transgene HSA-Ucp1-Mausmodel (TG) untersucht, welches durch eine chronisch verringerte OXPHOS-Effizienz spezifisch im Skelettmuskel sowie eine systemische Anpassung des Energiestoffwechsels charakterisiert ist. Dabei konnte in dieser Arbeit zunächst zeigt werden, dass mitochondrialer Stress im Skelettmuskel zell-autonom eine integrierte Stressantwort (ISR) induziert, wodurch die Expression und Sekretion von GDF15 in den Blutkreislauf als Myokin (muskelinduziertes Zytokin) stark erhöht wird. Zudem konnte erstmalig eine tageszeitliche Schwankung der muskulären Gdf15 Genexpression und der im Blut zirkulierenden GDF15-Level bei TG Mäusen identifiziert werden. Durch weiterführende Zuchtkreuzungen der TG-Mäuse mit konstitutiven Knockout-Mäusen (KO) zur Inaktivierung der Gene Gdf15 (GdKO) oder Gfral (GfKO), konnte zudem gezeigt werden, dass sowohl durch das zirkulierende GDF15 als auch die Aktivierung der GFRAL-Signalachse eine Tageszeit-abhängige Anorexie sowie die systemische Anpassung des Energiestoffwechsels im TG Mausmodell vermittelt werden. Mechanistisch konnte dabei erstmalig eine GFRAL-abhängige Induktion von Corticotropin-releasing Hormone (CRH) im Hypothalamus sowie ein erhöhtes, GFRAL-abhängiges Angstverhalten in TG Mäuse beschrieben werden. Zusammenfassend unterstreichen die Ergebnisse die systemische Rolle von GDF15 als Myokin und die Bedeutung der endokrinen Kommunikation zwischen Skelettmuskel und Gehirn, vermittelt durch GDF15-GFRAL Signalachse, für die Energiehomöostase bei mitochondrialer Fehlfunktion. Die gewonnen Erkenntnisse dieser Doktorarbeit können somit zur Entwicklung neuer Therapieansätze für Patienten mit einer mitochondrialen bzw. Stoffwechselerkrankung beitragen. KW - GDF15 KW - mitochondria KW - physiology KW - metabolism KW - GDF15 KW - Stoffwechsel KW - Mitochondrien KW - Physiologie Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-554693 ER - TY - THES A1 - Herpich, Catrin T1 - Fibroblast growth factor 21 and its association with nutritional stimuli in older age N2 - Fibroblast growth differentiation factor 21 (FGF21) is known as a pivotal regulator of the glucose and lipid metabolism. As such, it is considered beneficial and has even been labelled a longevity hormone. Nevertheless, recent observational studies have shown that FGF21 is increased in higher age with possible negative effects such as loss of lean and bone mass as well as decreased survival. Hepatic FGF21 secretion can be induced by various nutritional stimuli such as starvation, high carbohydrate and fat intake as well as protein deficiency.. So far it is still unclear whether the FGF21 response to different macronutrients is altered in older age. An altered response would potentially contribute to explain the higher FGF21 concentrations found in older age. In this publication-based doctoral dissertation, a cross-sectional study as well as a dietary challenge were conducted to investigate the influence of nutrition on FGF21 concentrations and response in older age. In a cross-sectional study, FGF21 concentrations were assessed in older patients with and without cachexia anorexia syndrome anorexia syndrome compared to an older community-dwelling control group. Cachexia anorexia syndrome is a multifactorial syndrome frequently occurring in old age or in the context of an underlying disease. It is characterized by a severe involuntary weight loss, loss of appetite (anorexia) and reduced food intake, therefore representing a state of severe nutrient deficiency, in some aspects similar to starvation. The highest FGF21 concentrations were found in patients with cachexia anorexia syndrome. Moreover, FGF21 was positively correlated with weight loss and loss of appetite. In addition, cachexia anorexia syndrome itself was associated with FGF21 independent of sex, age and body mass index. As cachectic patients presumably exhibit protein malnutrition and FGF21 has been proposed a marker for protein insufficiency, the higher levels of FGF21 in patients with cachexia anorexia syndrome might be partly explained by insufficient protein intake. In order to investigate the acute response of FGF21 to different nutritional stimuli, a dietary challenge with a parallel group design was conducted. Here, healthy older (65-85 years) and younger (18-35 years) adults were randomized to one of four test meals: a dextrose drink, a high carbohydrate, high fat or high protein meal. Over the course of four hours, postprandial FGF21 concentrations (dynamics) were assessed and the FGF21 response (incremental area under the curve) to each test meal was examined.. In a sub-group of older and younger women, also the adiponectin response was investigated, as adiponectin is a known mediator of FGF21 effects on glucose and lipid metabolism. The dietary meal challenge revealed that dextrose and high carbohydrate intake result in higher FGF21 concentrations after four hours in older adults. This was partly explained by higher postprandial glucose concentrations in the old. For high fat ingestion no age differences were found. For the first time, acute FGF21 response to high protein intake was shown. Here, protein ingestion resulted in lower FGF21 concentrations in younger compared to older adults. Furthermore, sufficient protein intake, according to age-dependent recommendations, of the previous day, was associated with lower FGF21 concentrations in both age groups. The higher FGF21 response to dextrose ingestion resulted in a higher adiponectin response in older women, independent of fat mass, insulin resistance, triglyceride concentrations, inflammation and oxidative stress. Following the high fat meal, adiponectin concentrations declined in older women. Adiponectin response was not affected by meal composition in younger women. In summary, this thesis showed a positive association of FGF21 and cachexia anorexia syndrome with concomitant anorexia in older patients. Regarding the acute FGF21 response, a higher response following dextrose and carbohydrate ingestion was found in older compared with younger subjects. This might be attributed to a higher glucose response in older age. Furthermore, it was shown that the higher FGF21 response after dextrose ingestion possibly contributes to a higher adiponectin response in older women, independent of potential metabolic and inflammatory confounders. Acute protein ingestion resulted in a significant decrease in FGF21 concentrations. Moreover, protein intake of the previous day was inversely associated with fasting FGF21 concentrations. This might explain why FGF21 concentrations are higher in cachexia anorexia syndrome. These results therefore support the role of FGF21 as a sensor of protein restriction. N2 - Der Fibroblasten Wachstumsfaktor 21 (FGF21) gilt als wichtiger Regulator des Glukose- und Fettstoffwechsels. Es werden ihm verschiedene förderliche Eigenschaften zugeschrieben und er wurde darüber hinaus als Langlebigkeitshormon bezeichnet. Nichtsdestotrotz konnten Beobachtungsstudien zeigen, dass FGF21 Konzentration im Alter erhöht sind und möglicherweise mit negativen Auswirkungen, wie dem Verlust von Muskel- und Knochenmasse sowie einer geringeren Überlebenswahrscheinlichkeit, verbunden sind. FGF21 Sekretion in der Leber kann durch Hungern und verschiedene Makronährstoffe, wie hohe Kohlenhydrat- und Fettaufnahme, sowie einem Proteinmangel, induziert werden. Bisher ist jedoch unklar, ob sich die FGF21 Response auf verschiedene Makronährstoffe zwischen älteren und jüngeren Erwachsenen unterscheidet. Eine veränderte Response, könnte dazu beitragen die höheren FGF21 Konzentrationen im Alter zu erklären. In dieser vorliegenden kumulativen Dissertation wurden eine Querschnittsstudie sowie ein experimenteller Mahlzeitentest durchgeführt, um den Einfluss von Ernährung auf FGF21 Konzentrationen und die FGF21 Response im Alter zu untersuchen. In der Querschnittsstudie wurden FGF21 Konzentration von älteren PatientInnen mit und ohne Kachexie-Anorexie Syndrom sowie einer älteren Kontrollgruppe verglichen. Kachexie-Anorexie Syndrom ist ein multifaktorielles Syndrom, welches häufig im Alter und im Rahmen verschiedener Erkrankungen auftritt. Charakteristisch hierfür ist ein starker ungewollter Gewichtsverlust, Appetitverlust (Anorexie) sowie eine verminderte Nahrungsaufnahme. Daher repräsentiert das Kachexie-Anorexie Syndrom einen Zustand des schwerwiegenden Nährstoffmangels, der mit Unterernährung bei langanhaltenden Hungerphasen vergleichbar ist. Die höchsten FGF21 Konzentrationen wiesen PatientInnen mit Kachexie-Anorexie Syndrom auf. Des Weiteren korrelierte FGF21 positiv mit Gewichts- und Appetitverlust. Zusätzlich war das Kachexie-Anorexie Syndrom unabhängig von Alter, Geschlecht und BMI mit FGF21 assoziiert. Es ist davon auszugehen, dass PatientInnen mit Kachexie-Anorexie Syndrom eine unzureichende Proteinzufuhr aufweisen. Da FGF21 als Marker für Proteinrestriktion gilt, könnten die hohen FGF21 Konzentrationen bei Kachexie-Anorexie Syndrom teilweise durch eine zu geringe Proteinzufuhr erklärt werden. Um die akute Response von FGF21 auf verschiedene Makronährstoffe zu untersuchen, wurde ein Mahlzeitentest mit parallelen Gruppen durchgeführt. Hierfür erhielten ältere (65-85 Jahre) und jüngere (18-35 Jahre) Erwachsene eine von vier verschiedenen Testmahlzeiten (Dextrose Getränk, Kohlenhydrat-, Fett- und Proteinreiche Mahlzeit). Über vier Stunden wurden postprandiale FGF21 Konzentrationen (Dynamik) bestimmt und die FGF21 Response (inkrementelle Fläche unter der Kurve) auf jede Testmahlzeit untersucht. In einer Subgruppe von älteren und jüngeren Frauen wurde außerdem die Adiponektin Response bestimmt, da Adiponektin bekanntermaßen die Effekte von FGF21 auf den Glukose- und Fettstoffwechsel mediiert. Der Mahlzeitentest konnte zeigen, dass Dextrose und die kohlenhydratreiche Mahlzeit bei älteren Erwachsenen zu höheren FGF21 Konzentrationen nach vier Stunden führten. Dies könnte durch die höheren postprandialen Glukose Konzentrationen der Älteren erklärt werden. Die FGF21 Response auf die fettreiche Mahlzeit wies keine Altersunterschiede auf. Zum ersten Mal konnte die akute FGF21 Response auf eine proteinreiche Mahlzeit gezeigt werden. Hierbei führte die Mahlzeit bei jüngeren im Vergleich zu älteren Erwachsenen zu niedrigeren FGF21 Konzentration nach vier Stunden. Des Weiteren, war das Erreichen der altersspezifischen Proteinzufuhr des Vortrags bei beiden Altersgruppen mit niedrigeren nüchtern FGF21 Konzentrationen assoziiert. Bei älteren Frauen führte die höhere FGF21 Response nach Dextrose Aufnahme zu einer höheren Adiponektin Response, unabhängig von Fettmasse, Insulinresistenz, Triglyzeride Konzentrationen, Inflammation und oxidativem Stress. Nach Einnahme der fettreichen Mahlzeit sanken die Adiponektin Konzentrationen bei älteren Frauen, während bei jüngeren Frauen die Adiponektin Response nicht durch die Zusammensetzung der Mahlzeit beeinflusst wurde. Zusammenfassend konnte diese Dissertation eine positive Assoziation von FGF21 mit Kachexie-Anorexie Syndrom bei gleichzeitiger Anorexie bei älteren PatientInnen zeigen. Bezüglich der akuten Response von FGF21 zeigte sich eine höhere Response auf Dextrose und Kohlenhydrat-Aufnahme bei älteren im Vergleich zu jüngeren ProbandInnen. Dies ist vermutlich auf die erhöhte Glukose Response im Alter zurückzuführen. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass eine höhere FGF21 Response auf Dextrose bei älteren Frauen mit einer veränderten Adiponektin Response einhergingen, unabhängig von potentiellen metabolischen und inflammatorischen Einflussfaktoren. Eine akute hohe Proteinaufnahme führte zu einem deutlichen Abfall der postprandialen FGF21 Konzentrationen. Zudem bestand eine inverse Assoziation zwischen FGF21 Nüchternkonzentrationen und der Proteinzufuhr des Vortags. Dies könnte zum Teil erklären, warum FGF21 Konzentrationen bei Kachexie-Anorexie Syndrom erhöht sind. Demnach unterstützen diese Ergebnisse auch die Rolle von FGF21 als Sensor für Proteinrestriktion. KW - Ageing KW - FGF21 KW - protein KW - postprandial response Y1 - 2021 ER - TY - THES A1 - Grimmer, Benjamin T1 - Pannexin 1 BT - a novel regulator of hypoxic pulmonary vasoconstriction BT - ein neuer Regulator der hypoxischen pulmonalen Vasokonstriktion N2 - Hypoxic pulmonary vasoconstriction is an active alveolar hypoxia-caused physiological response redirecting pulmonary blood flow from poorly ventilated areas to better oxygenated lung regions in order to optimize oxygen supply. However, the signaling pathways underlying this pulmonary vascular response remain an area under investigation. In the present study I investigated the functional relevance of Pannexin 1 (Panx1)-mediated ATP release in hypoxic pulmonary vasoconstriction and chronic hypoxic pulmonary hypertension using murine isolated perfused lungs, chronic hypoxic mice, and pulmonary artery smooth muscle cell culture. In isolated mouse lungs, switch to hypoxic gas induced a marked increase in pulmonary artery pressure. Pharmacological inhibition of Panx1 using probenecid, Panx1 specific inhibitory peptide (10Panx1) or spironolactone as well as genetic deletion of Panx1 in smooth muscle cells diminished hypoxic pulmonary vasoconstriction in isolated perfused mouse lungs. Fura-2 imaging revealed a reduced Ca2+ response to hypoxia in pulmonary artery smooth muscle cells treated with spironolactone or 10Panx1. Although these findings suggested an important role of Panx1 in HPV, neither smooth muscle cell nor endothelial cell specific genetic deletion of Panx1 prevented the development of pulmonary hypertension in chronic hypoxic mice. Surprisingly, hypoxia did not induce ATP release and inhibition of purinergic receptors or ATP degradation by ATPase failed to decrease the pulmonary vasoconstriction response to hypoxia in isolated perfused mouse lungs. However, Panx1 antagonism as well as TRPV4 inhibition prevented the hypoxia-induced increase in intracellular Ca2+ concentration in pulmonary artery smooth muscle cells in an additive manner suggesting that Panx1 might modulate intracellular Ca2+ signaling independently of the ATP-P2-TRPV4 signaling axis. In line with this assumption, overexpression of Panx1 in HeLa cells increased intracellular Ca2+ concentrations in response to acute hypoxia. Conclusion: In this study I identifiy Panx1 as novel regulator of HPV.. Yet, the role of Panx1 was not attributable to the release of ATP and downstream P2 signaling pathways or activation of TRPV4 but rathter relates to a role of Panx1 as indirect or direct modulator of the Ca2+ response to hypoxia in PASMCs. Genetic deletion of Panx1 did not influence the development of chronic hypoxic pulmonary hypertension in mice. N2 - Die hypoxische pulmonale Vasokonstriktion ist ein durch alveoläre Hypoxie ausgelöster aktiver physiologischer Mechanismus, der den pulmonalen Blutfluss aus sauerstoffärmeren Bereichen der Lunge in besser ventilierte Regionen umleitet, um die Sauerstoffversorgung zu optimieren. Die molekularen Signalwege, welche die hypoxische pulmonale Vasokonstriktion regulieren, sind noch immer teilweise unverstanden. In der vorliegenden Studie wurde die Bedeutung des durch Pannexin 1 (Panx1) vermittelten ATP-Transports in der hypoxischen pulmonnalen Vasokonstriktion und der chronisch hypoxischen pulmonalen Hypertonie am Modell der isoliert perfundierten Lunge, im Mausmodells der chronisch hypoxischen pulmonalen Hypertonie und in Zellkulturversuchen mit pulmonal-arteriellen glatten Muskelzellen untersucht. In der isolierten Mauslunge induzierte der Wechsel zu hypoxischem Gas bei der Ventilation einen deutlichen Anstieg des pulmonal-arteriellen Drucks. Sowohl die pharmakologische Inhibition von Panx1 mit Probenecid, mit dem Panx1-spezifischen inhibitorischen Peptid (10Panx1) und mit Spironolacton als auch die genetische Deletion von Panx1 in glatten Muskelzellen schwächten die hypoxische pulmonale Vasokonstriktion in der Mauslunge ab. Parallel dazu zeigten Fura 2 Messungen eine verminderte Hypoxie-induzierte Kalziumantwort in pulmonal-arteriellen glatten Muskelzellen, die mit Spironolacton oder 10Panx1 behandelt wurden. Obwohl diese Ergebnisse auf eine wichtige Rolle für Panx1 in der hypoxischen pulmonalen Vasokonstriktion schließen lassen, hatte die genetische Deletion von Panx1 in glatten Muskelzellen oder Endothelzellen in Mäusen keinen Einfluss auf die Entwicklung einer chronisch hypoxischen pulmonalen Hypertonie. Überraschenderweise induzierte Hypoxie nicht die Freisetzung von ATP und die Hemmung purinerger Rezeptoren oder der Abbau von ATP durch ATPasen führte nicht zu einer Abschwächung der hypoxischen pulmonalen Vasokonstriktion. Die gleichzeitige Hemmung von Panx1 und TRPV4 verursachte einen additiven Effekt bei der Reduktion des Anstiegs der intrazellulären Kalziumkonzentration unter akut hypoxischen Bedingungen, was darauf schließen lässt, dass Panx1 die intrazelluläre Kalziumkonzentration unabhängig von der ATP-P2-TRPV4 Signalachse reguliert. Entsprechend führte eine Überexpression von Panx1 in HeLa-Zellen zu einer verstärkten Kalziumantwort, was ebenfalls auf eine unabhängige Regulierung der intrazellulären Ca2+-Konzentration durch Panx1 schließen lässt. Schlussfolgerung: In der vorliegenden Studie identifiziere ich Panx1 als einen neuen Regulator der HPV. Die Rolle von Panx1 in der HPV war jedoch nicht auf die Freisetzung von ATP und nachgerichtete P2-Signalwege oder die Aktivierung von TRPV4 zuruckzuführen. Viel mehr scheint Panx1 die durch Hypoxie induzierte intrazelluläre Kalziumantwort von PASMCs indirekt oder direkt zu modulieren. Die genetische Deletion von Panx1 hatte keinen Einfluss auf die Ausbildung einer chronisch hypoxischen pulmonalen Hypertonie in Mäusen. T2 - Pannexin 1 KW - hypoxic pulmonary vasoconstriction KW - Pannexin 1 KW - pulmonary artery smooth muscle cells KW - calcium KW - hypoxische pulmonale Vasokonstriktion KW - pulmonalarterielle glatte Muskelzellen KW - Kalzium Y1 - 2022 ER - TY - THES A1 - Engel, Anika T1 - Endocrine effects of plasticizers and the development of a breast cell-based toxicity screening system N2 - Humans are frequently exposed to a variety of endocrine disrupting chemicals (EDCs), which can cause harmful effects, e.g. disturbance of growth, development and reproduction, and cancer (UBA, 2016). EDCs are often components of synthetically manufactured products. Materials made of plastics, building materials, electronic items, textiles or cosmetic products can be particularly contaminated (Ain et al., 2021). One group of EDCs that has gained increased interest in recent years is phthalates. They are used as plasticizers in plastic materials to which people are daily exposed to. Phthalate plasticizers exert their harmful effects among others via activation of the estrogen receptor α (ERα), the estrogen receptor β (ERβ) and via inhibition of the androgen receptor (AR). Some phthalates have already been classified by the EU as Cancerogenic-, Mutagenic-, Reprotoxic- (CMR) substances and their use in industry has been restricted. After oral ingestion, phthalates are metabolized and are finally excreted with the urine. Numerous toxicological studies exist on phthalates, but mainly with the parent substances, not with their primary and secondary metabolites. In the course of the restriction of phthalates by the EU, the phthalate-free plasticizer di-isononylcyclohexane-1,2-dicarboxylate (DINCH®), was introduced to the market. So far, almost no toxicologically relevant properties have been identified for DINCH®. However, the effects of DINCH® have only been studied in animal experiments and, as with phthalates, almost exclusively with the parent substance. However, toxic effects of a particular compound may be induced by its metabolites and not by the parent compound itself. Therefore, potential endocrine effects of 15 phthalates, 19 phthalate metabolites, DINCH®, and five of its metabolites were investigated using reporter gene assays on the ERα, ERβ, and the AR. In addition, studies of the influence of some selected plasticizers on peroxisome proliferator-activated receptor α (PPARα) and peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ) activity were performed. Furthermore, a H295R steroidogenesis assay was performed to determine the influence of DINCH® and its metabolites on estradiol or testosterone synthesis. Analysis of the experiments shows that the phthalates either stimulated or inhibited ERα and ERβ activity and inhibited AR activity, whereas the phthalate metabolites did not affect the activity of these human hormone receptors. In contrast, metabolites of di-(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) stimulated transactivation of the human PPARα and PPARγ in analogous reporter gene assays, although DEHP itself did not activate these nuclear receptors. Therefore, primary and secondary phthalate metabolites appear to exert different effects at the molecular level compared to the parent compounds. Similarly, the results showed that the phthalate-free plasticizer DINCH® itself did not affect the activity of ERα, ERβ, AR, PPARα and PPARγ, while the DINCH® metabolites were shown to activate all these receptors. In the case of AR, DINCH® metabolites mainly enhanced AR activity stimulated by dihydrotestosterone (DHT). In the H295R steroidogenesis assay, neither DINCH® nor any of its metabolites affected estradiol or testosterone synthesis. Primary and secondary metabolites of DINCH® thus exert different effects at the molecular level than DINCH® itself. However, all these in vitro effects of DINCH® metabolites were observed only at high concentrations, which were about three orders of magnitude higher than the reported DINCH® metabolite concentrations in human urine. Therefore, the in vitro data does not support the assumption that DINCH® or any of the metabolites studied could have significant endocrine effects in vivo at relevant exposure levels in humans. Following the demonstration of direct and indirect endocrine effects of the studied plasticizers, a new effect-based in vitro 3D screening tool for toxicity assays of non-genotoxic carcinogens was developed using estrogen receptor-negative (ER-) MCF10-A cells and estrogen receptor-positive (ER+) MCF-12A cells. This arose from the background that breast cancer is the most common cancer occurring in women and estrogenic substances, such as phthalates, can probably influence the disease. The human mammary epithelial cell lines MCF-10A and MCF-12A form well-differentiated acini-like structures when cultured in three-dimensional Matrigel culture for a period of 20 days. The model should make it possible to detect substance effects on cell differentiation and growth, on mammary cell acini, and to differentiate between estrogenic and non-estrogenic effects at the same time. In the present study, both cell lines were tested for their suitability as an effect-based in vitro assay system for non-genotoxic carcinogens. An Automated Acinus Detection And Morphological Evaluation (ADAME) software solution has been developed for automatic acquisition of acinus images and determination of morphological parameters such as acinus size, lumen size, and acinus roundness. Several test substances were tested for their ability to affect acinus formation and cellular differentiation. Human epithelial growth factor (EGF) stimulated acinus growth for both cell lines, while all trans retinoic acid (RA) inhibited acinar growth. The potent estrogen 17β-estradiol had no effect on acinus formation of MCF-10A cells but resulted in larger MCF-12A acini. Thus, the parallel use of both cell lines together with the developed high content screening and evaluation tool allows the rapid identification of the estrogenic and cancerogenic properties of a given test compound. The morphogenesis of the acini was only slightly affected by the test substances. On the one hand, this suggests a robust test system, on the other hand, it probably cannot detect low-potent estrogenic compounds such as phthalates or DINCH®. The advantage of the robustness of the system, however, may be that vast numbers of "positive" results with questionable biological relevance could be avoided, such as those observed in sensitive reporter gene assays. N2 - Der Mensch ist häufig einer Vielzahl von endokrin wirksamen Chemikalien (EDCs) ausgesetzt, die schädliche Auswirkungen haben können, z. B. Störungen von Wachstum, Entwicklung und Fortpflanzung sowie Krebs (UBA, 2016). Eine Gruppe von EDCs, die in den letzten Jahren vermehrt an Interesse gewonnen hat, sind die Phthalate. Diese werden als Weichmacher in Kunststoffen verwendet. Einige Phthalate wurden bereits von der EU als Kanzerogene-, Mutagene-, Reproduktionstoxische- (CMR) Stoffe klassifiziert und ihre Verwendung in der Industrie beschränkt. Nach der oralen Aufnahme werden Phthalate metabolisiert und schließlich mit dem Urin ausgeschieden. Für die Phthalate existieren zwar zahlreiche toxikologische Studien, allerdings vorwiegend mit den Ausgangssubstanzen, nicht mit ihren primären und sekundären Metaboliten. Im Zuge der Beschränkung der Phthalate durch die EU wurde der phthalatfreie Weichmacher Diisononylcyclohexan-1,2-dicarboxylat (DINCH®), auf den Markt gebracht. DINCH® werden bisher kaum toxikologisch relevante Eigenschaften zugeordnet. Bislang wurden die Auswirkungen von DINCH® jedoch lediglich in Tierexperimenten untersucht und fast ausschließlich mit der Stamm-Substanz. Aus diesem Grund wurden potentiell endokrine Effekte von 15 Phthalaten, 19 Phthalat-Metaboliten, DINCH® und fünf seiner Metabolite unter Verwendung von Reportergen-Assays auf den ERα, ERβ und den AR untersucht. Zusätzlich wurden Untersuchungen des Einflusses einiger ausgewählter Substanzen auf die Aktivität des Peroxisom-Proliferator-aktivierten Rezeptor α (PPARα) und des Peroxisom-Proliferator-aktivierten Rezeptor γ (PPARγ) durchgeführt. Weiterhin wurde ein H295R-Steroidogenese-Assay durchgeführt, um den Einfluss von DINCH® und seinen Metaboliten auf die Estradiol- oder Testosteronsynthese zu bestimmen. Die Auswertung der Experimente zeigt, dass die Phthalate entweder die ERα- und ERβ-Aktivität stimulierten oder hemmten und die AR-Aktivität hemmten, während die Phthalatmetaboliten keinen Einfluss auf die Aktivität dieser menschlichen Hormonrezeptoren hatten. Im Gegensatz dazu stimulierten die Metaboliten von Di-(2-ethylhexyl) phthalat (DEHP) die Transaktivierung des humanen PPARα und PPARγ in analogen Reportergen-Assays, obwohl DEHP selbst diese Kernrezeptoren nicht aktivierte. Daher scheinen primäre und sekundäre Phthalatmetaboliten im Vergleich zu den Ausgangsverbindungen unterschiedliche Wirkungen auf molekularer Ebene auszuüben. Ebenso zeigten die Ergebnisse, dass der phthaltfreie Weichmacher DINCH® selbst keinen Einfluss auf die Aktivität von ERα, ERβ, AR, PPARα und PPARγ hatte, während die DINCH®-Metaboliten nachweislich alle diese Rezeptoren aktivierten. Im Falle des AR verstärkten die DINCH®-Metaboliten vor allem die durch Dihydrotestosteron (DHT) stimulierte AR-Aktivität. Im H295R-Steroidogenese-Assay beeinflusste weder DINCH® noch einer seiner Metaboliten die Estradiol- oder Testosteronsynthese. Primäre und sekundäre Metabolite von DINCH® üben demnach auf molekularer Ebene andere Effekte aus als DINCH® selbst. Die hier gewonnenen in vitro-Daten unterstützen die Annahme nicht, dass DINCH® oder einer der untersuchten Metaboliten erhebliche endokrine Wirkungen in vivo bei relevanten Expositionsmengen beim Menschen haben könnten. Nachdem endokrine Wirkungen der untersuchten Weichmacher nachgewiesen werden konnten, wurde ein neues wirkungsbasiertes in vitro 3D-Screening-Tool für Toxizitäts-Tests nicht genotoxischer Karzinogene mit östrogenrezeptor-negativen (ER-) MCF10-A-Zellen und östrogenrezeptor-positiven (ER+) MCF-12A-Zellen entwickelt. Dies geschah aus dem Hintergrund, dass Brustkrebs die häufigste Krebsart bei Frauen ist und östrogene Stoffe wie Phthalate die Krankheit vermutlich beeinflussen können. Die humanen Brustepithelzelllinien MCF-10A und MCF-12A bilden gut differenzierte azinusartige Strukturen, wenn sie in dreidimensionaler Matrigel-Kultur über einen Zeitraum von 20 Tagen kultiviert werden. Das Modell sollte es ermöglichen Substanzeffekte auf die Zelldifferenzierung und das Zellwachstum der Brustzell-Azini zu detektieren und dabei gleichzeitig zwischen östrogenen und nicht östrogenen Effekten differenzieren. Eine Softwarelösung zur automatisierten Acinus Detection And Morphological Evaluation (ADAME) wurde zur automatischen Erfassung von Acinus-Bildern und zur Bestimmung morphologischer Parameter wie Azinus-Größe, Lumengröße und Azinus-Rundheit entwickelt. Eine Reihe von Testsubstanzen wurde auf ihre Fähigkeit getestet, die Azinusbildung und die zelluläre Differenzierung zu beeinflussen. Der humane epitheliale Wachstumsfaktor (EGF) stimulierte das Azinuswachstum für beide Zelllinien, während all-trans-Retinsäure (RA) das Azinuswachstum hemmte. Das starke Östrogen 17β-Östradiol hatte keinen Einfluss auf die Azinusbildung von MCF-10A-Azini, führte aber zu größeren MCF-12A-Azini. Die parallele Verwendung beider Zelllinien zusammen mit dem hierbei entwickelten High-Content-Screening- und Evaluierungstool ermöglicht somit die schnelle Identifizierung der östrogenen oder kanzerogenen Eigenschaften einer gegebenen Testverbindung. Die Morphogenese der Azini wurde durch die Testsubstanzen nur geringfügig beeinflusst. Dies spricht einerseits für ein robustes Testsystem, andererseits kann es wahrscheinlich keine niedrigpotenten östrogenen Verbindungen wie Phthalate oder DINCH® erkennen. Der Vorteil der Robustheit des Systems kann jedoch darin liegen, dass eine große Zahl "positiver" Ergebnisse mit fragwürdiger biologischer Relevanz vermieden werden könnte, wie sie bei empfindlichen Reportergen-Assays zu beobachten sind. KW - phthalates KW - 3D breast cell model KW - endocrine disruption Y1 - 2021 U6 - https://doi.org/10.25932/publishup-53117 ER - TY - THES A1 - Wandt, Viktoria Klara Veronika T1 - Trace elements, ageing, and sex BT - impact on genome stability maintenance Y1 - 2021 ER - TY - THES A1 - Reichmann, Robin T1 - Novel applications of machine learning techniques in epidemiology of age-related diseases BT - from multidimensional data modelling to risk prediction Y1 - 2021 ER - TY - THES A1 - Klauder, Julia T1 - Makrophagenaktivierung durch Hyperinsulinämie als Auslöser eines Teufelkreises der Entzündung im Kontext des metabolischen Syndroms T1 - Macrophage activation by hyperinsulinemia as a trigger of a vicious cycle of inflammation in the context of the metabolic syndrome N2 - Insulinresistenz ist ein zentraler Bestandteil des metabolischen Syndroms und trägt maßgeblich zur Ausbildung eines Typ-2-Diabetes bei. Eine mögliche Ursache für die Entstehung von Insulinresistenz ist eine chronische unterschwellige Entzündung, welche ihren Ursprung im Fettgewebe übergewichtiger Personen hat. Eingewanderte Makrophagen produzieren vermehrt pro-inflammatorische Mediatoren, wie Zytokine und Prostaglandine, wodurch die Konzentrationen dieser Substanzen sowohl lokal als auch systemisch erhöht sind. Darüber hinaus weisen übergewichtige Personen einen gestörten Fettsäuremetabolismus und eine erhöhte Darmpermeabilität auf. Ein gesteigerter Flux an freien Fettsäuren vom Fettgewebe in andere Organe führt zu einer lokalen Konzentrationssteigerung in diesen Organen. Eine erhöhte Darmpermeabilität erleichtert das Eindringen von Pathogenen und anderer körperfremder Substanzen in den Körper. Ziel dieser Arbeit war es, zu untersuchen, ob hohe Konzentrationen von Insulin, des bakteriellen Bestandteils Lipopolysaccharid (LPS) oder der freien Fettsäure Palmitat eine Entzündungsreaktion in Makrophagen auslösen oder verstärken können und ob diese Entzündungsantwort zur Ausbildung einer Insulinresistenz beitragen kann. Weiterhin sollte untersucht werden, ob Metabolite und Signalsubstanzen, deren Konzentrationen beim metabolischen Syndrom erhöht sind, die Produktion des Prostaglandins (PG) E2 begünstigen können und ob dieses wiederum die Entzündungsreaktion und seine eigene Produktion in Makrophagen regulieren kann. Um den Einfluss dieser Faktoren auf die Produktion pro-inflammatorischer Mediatoren in Makrophagen zu untersuchen, wurden Monozyten-artigen Zelllinien und primäre humane Monozyten, welche aus dem Blut gesunder Probanden isoliert wurden, in Makrophagen differenziert und mit Insulin, LPS, Palmitat und/ oder PGE2 inkubiert. Überdies wurden primäre Hepatozyten der Ratte isoliert und mit Überständen Insulin-stimulierter Makrophagen inkubiert, um zu untersuchen, ob die Entzündungsanwort in Makrophagen an der Ausbildung einer Insulinresistenz in Hepatozyten beteiligt ist. Insulin induzierte die Expression pro-inflammatorischer Zytokine in Makrophagen-artigen Zelllinien wahrscheinlich vorrangig über den Phosphoinositid-3-Kinase (PI3K)-Akt-Signalweg mit anschließender Aktiverung des Transkriptionsfaktors NF-κB (nuclear factor 'kappa-light-chain-enhancer' of activated B-cells). Die dabei ausgeschütteten Zytokine hemmten in primären Hepatozyten der Ratte die Insulin-induzierte Expression der Glukokinase durch Überstände Insulin-stimulierter Makrophagen. Auch LPS oder Palmitat, deren lokale Konzentrationen im Zuge des metabolischen Syndroms erhöht sind, waren in der Lage, die Expression pro-inflammatorischer Zytokine in Makrophagen-artigen Zelllinien zu stimulieren. Während LPS seine Wirkung, laut Literatur, unbestritten über eine Aktivierung des Toll-ähnlichen Rezeptors (toll-like receptor; TLR) 4 vermittelt, scheint Palmitat jedoch weitestgehend TLR4-unabhängig wirken zu können. Vielmehr schien die de novo-Ceramidsynthese eine entscheidene Rolle zu spielen. Darüber hinaus verstärkte Insulin sowohl die LPS- als auch die Palmitat-induzierte Ent-zündungsantwort in beiden Zelllinien. Die in Zelllinien gewonnenen Ergebnisse wurden größtenteils in primären humanen Makrophagen bestätigt. Desweiteren induzierten sowohl Insulin als auch LPS oder Palmitat die Produktion von PGE2 in den untersuchten Makrophagen. Die Daten legen nahe, dass dies auf eine gesteigerte Expression PGE2-synthetisierender Enzyme zurückzuführen ist. PGE2 wiederum hemmte auf der einen Seite die Stimulus-abhängige Expression des pro-inflammatorischen Zytokins Tumornekrosefaktor (TNF) α in U937-Makrophagen. Auf der anderen Seite verstärkte es jedoch die Expression der pro-inflammatorischen Zytokine Interleukin- (IL-) 1β und IL-8. Darüber hinaus verstärkte es die Expression von IL-6-Typ-Zytokinen, welche sowohl pro- als auch anti-inflammatorisch wirken können. Außerdem vestärkte PGE2 die Expression PGE2-synthetisierender Enzyme. Es scheint daher in der Lage zu sein, seine eigene Synthese zu verstärken. Zusammenfassend kann die Freisetzung pro-inflammatorischer Mediatoren aus Makro-phagen im Zuge einer Hyperinsulinämie die Entstehung einer Insulinresistenz begünstigen. Insulin ist daher in der Lage, einen Teufelskreis der immer stärker werdenden Insulin-resistenz in Gang zu setzen. Auch Metabolite und Signalsubstanzen, deren Konzentrationen beim metabolischen Syndrom erhöht sind (zum Beispiel LPS, freie Fettsäuren und PGE2), lösten Entzündungsantworten in Makrophagen aus. Das wechselseitige Zusammenspiel von Insulin und diesen Metaboliten und Signalsubstanzen löste eine stärkere Entzündungsantwort in Makrophagen aus als jeder der Einzelkomponenten. Die dadurch freigesetzten Zytokine könnten zur Manifestation einer Insulinresistenz und des metabolischen Syndroms beitragen. N2 - Insulin resistance is a central component of the metabolic syndrome and is a major contributor to the development of type 2 diabetes. One possible cause of insulin resistance is chronic low-grade inflammation, which originates in the adipose tissue of obese individuals. Immigrated macrophages produce increased levels of pro-inflammatory mediators such as cytokines and prostaglandins, resulting in increased concentrations of these substances both locally and systemically. In addition, obese individuals exhibit impaired fatty acid metabolism and increased intestinal permeability. Increased flux of free fatty acids from adipose tissue to other organs results in increased local concentrations in these organs. Increased intestinal permeability facilitates the entry of pathogens and other exogenous substances into the body. The aim of this work was to investigate whether high concentrations of insulin, the bacterial component lipopolysaccharide (LPS), or the free fatty acid palmitate can induce or enhance an inflammatory response in macrophages and whether this inflammatory response can contribute to the development of insulin resistance. Furthermore, to investigate whether metabolites and signaling substances whose concentrations are elevated in the metabolic syndrome can promote the production of prostaglandin (PG) E2 and whether this in turn can regulate the inflammatory response and its own production in macrophages. To investigate the influence of these factors on the production of pro-inflammatory mediators in macrophages, monocyte-like cell lines and primary human monocytes, that were isolated from the blood of healthy volunteers, were differentiated into macrophages and incubated for with insulin, LPS, palmitate and/ or PGE2. In addition, primary rat hepatocytes were isolated and incubated with supernatants of insulin-stimulated macrophages to investigate whether the inflammatory response in macrophages is involved in the development of insulin resistance in hepatocytes. Insulin induced the expression of pro-inflammatory cytokines in macrophage-like cell lines probably primarily via the phosphoinositide 3-kinase (PI3K)-Akt pathway with subsequent activation of the transcription factor NF-κB (nuclear factor 'kappa-light-chain-enhancer' of activated B-cells). The cytokines released in this process inhibited insulin-induced expression of glucokinase by supernatants of insulin-stimulated macrophages in primary rat hepatocytes. Also, LPS or palmitate, whose local concentrations are increased in the course of metabolic syndrome, were able to stimulate the expression of pro-inflammatory cytokines in macrophage-like cell lines. While LPS, according to the literature, undisputedly mediates its effect via activation of toll-like receptor (TLR) 4, palmitate, however, appears to be able to act mainly in a TLR4-independent manner. Rather, de novo ceramide synthesis appeared to play a crucial role. Moreover, insulin enhanced both LPS- and palmitate-induced inflammatory responses in both cell lines. The results obtained in macrophage-like cell lines were largely confirmed in primary human macrophages. Furthermore, both insulin and LPS or palmitate induced PGE2 production in the macrophages studied. The data suggest that this was not due to increased expression of arachidonic acid-synthesizing enzymes but rather to increased expression of PGE2-synthesizing enzymes. On the one hand PGE2 inhibited the stimulus-dependent expression of the pro-inflammatory cytokine tumor necrosis factor (TNF) α in U937 macrophages. However, on the other hand, it enhanced the expression of the pro-inflammatory cytokines interleukin- (IL-) 1β and IL-8. In addition, it enhanced the expression of IL-6-type cytokines, which can be both pro- and anti-inflammatory. In addition, PGE2 enhanced the expression of PGE2-synthesizing enzymes. It therefore appears to be able to enhance its own synthesis. In conclusion, the release of pro-inflammatory mediators from macrophages in the course of hyperinsulinemia may favor the development of insulin resistance. Thus, the hyperinsulinemia might be augmented in a vicious cycle feed forward loop. Metabolites and signaling substances whose concentrations are elevated in the metabolic syndrome (for example, LPS, free fatty acids, and PGE2) also triggered inflammatory responses in macrophages. The synergistic interaction of insulin and these metabolites and signaling substances triggered a stronger inflammatory response in macrophages than any of the individual components. The released cytokines could contribute to the manifestation of insulin resistance and the metabolic syndrome. KW - Metabolisches Syndrom KW - Entzündung KW - Makrophagen KW - Insulin KW - Zytokine KW - Typ-2-Diabetes KW - Prostaglandin KW - inflammation KW - insulin KW - macrophages KW - metabolic syndrom KW - prostaglandine KW - Type-2-diabetes KW - cytokines Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-520199 ER - TY - THES A1 - Saussenthaler, Sophie T1 - The impact of DNA methylation on susceptibility to typ 2 diabetes in NZO mice N2 - The development of type 2 diabetes (T2D) is driven by genetic as well as life style factors. However, even genetically identical female NZO mice on a high-fat diet show a broad variation in T2D onset. The main objective of this study was to elucidate and investigate early epigenetic determinants of type 2 diabetes. Prior to other experiments, early fat content of the liver (<55.2 HU) in combination with blood glucose concentrations (>8.8 mM) were evaluated as best predictors of diabetes in NZO females. Then, DNA methylome and transcriptome were profiled to identify molecular pathophysiological changes in the liver before diabetes onset. The major finding of this thesis is that alterations in the hepatic DNA methylome precede diabetes onset. Of particular interest were 702 differentially methylated regions (DMRs), of which 506 DMRs had genic localization. These inter-individual DMRs were enriched by fivefold in the KEGG pathway type 2 diabetes mellitus, independent of the level of gene expression, demonstrating an epigenetic predisposition toward diabetes. Interestingly, among the list of hepatic DMRs, eleven DMRs were associated with known imprinted genes in the mouse genome. Thereby, six DMRs (Nap1l5, Mest, Plagl1, Gnas, Grb10 and Slc38a4) localized to imprinting control regions, including five iDMRs that exhibited hypermethylation in livers of diabetes-prone mice. This suggests that gain of DNA methylation in multiple loci of the paternal alleles has unfavourable metabolic consequences for the offspring. Further, the comparative liver transcriptome analysis demonstrated differences in expression levels of 1492 genes related to metabolically relevant pathways, such as citrate cycle and fatty acid metabolism. The integration of hepatic transcriptome and DNA methylome indicated that 449 differentially expressed genes were potentially regulated by DNA methylation, including genes implicated in insulin signaling. In addition, liver transcriptomic profiling of diabetes-resistant and diabetes-prone mice revealed a potential transcriptional dysregulation of 17 hepatokines, in particular Hamp. The hepatic expression of Hamp was decreased by 52% in diabetes-prone mice, on account of an increase in DNA methylation of promoter CpG-118. Hence, HAMP protein levels were lower in mice prone to develop diabetes, which correlated to higher liver triglyceride levels.. In sum, the identified DNA methylation changes appear to collectively favor the initiation and progression of diabetes in female NZO mice. In near future, epigenetic biomarkers are likely to contribute to improved diagnosis for T2D. KW - epigenetics KW - DNA methylation KW - RNAseq KW - fatty liver KW - type 2 diabetes KW - HAMP Y1 - 2021 ER -