TY - GEN A1 - Azuma, Yusuke A1 - Kükenshöner, Tim A1 - Ma, Guangyong A1 - Yasunaga, Jun-ichiro A1 - Imanishi, Miki A1 - Tanaka, Gen A1 - Nakase, Ikuhiko A1 - Maruno, Takahiro A1 - Kobayashi, Yuji A1 - Arndt, Katja Maren A1 - Matsuoka, Masao A1 - Futaki, Shiroh T1 - Controlling leucine-zipper partner recognition in cells through modification of a–g interactions N2 - By focusing on the a–g interactions, successful design and selection were accomplished to obtain a leucine-zipper segment that discriminates the appropriate partner over another that provides very similar patterns of electrostatic interactions. T3 - Zweitveröffentlichungen der Universität Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe - 276 Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-98758 ER - TY - GEN A1 - Badalyan, Artavazd A1 - Dierich, Marlen A1 - Stiba, Konstanze A1 - Schwuchow, Viola A1 - Leimkühler, Silke A1 - Wollenberger, Ulla T1 - Electrical wiring of the aldehyde oxidoreductase PaoABC with a polymer containing osmium redox centers BT - biosensors for benzaldehyde and GABA T2 - Postprints der Universität Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe N2 - Biosensors for the detection of benzaldehyde and g-aminobutyric acid (GABA) are reported using aldehyde oxidoreductase PaoABC from Escherichia coli immobilized in a polymer containing bound low potential osmium redox complexes. The electrically connected enzyme already electrooxidizes benzaldehyde at potentials below −0.15 V (vs. Ag|AgCl, 1 M KCl). The pH-dependence of benzaldehyde oxidation can be strongly influenced by the ionic strength. The effect is similar with the soluble osmium redox complex and therefore indicates a clear electrostatic effect on the bioelectrocatalytic efficiency of PaoABC in the osmium containing redox polymer. At lower ionic strength, the pH-optimum is high and can be switched to low pH-values at high ionic strength. This offers biosensing at high and low pH-values. A “reagentless” biosensor has been formed with enzyme wired onto a screen-printed electrode in a flow cell device. The response time to addition of benzaldehyde is 30 s, and the measuring range is between 10–150 µM and the detection limit of 5 µM (signal to noise ratio 3:1) of benzaldehyde. The relative standard deviation in a series (n = 13) for 200 µM benzaldehyde is 1.9%. For the biosensor, a response to succinic semialdehyde was also identified. Based on this response and the ability to work at high pH a biosensor for GABA is proposed by coimmobilizing GABA-aminotransferase (GABA-T) and PaoABC in the osmium containing redox polymer. T3 - Zweitveröffentlichungen der Universität Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe - 1082 KW - redox polymer KW - aldehyde oxidoreductase KW - ionic strength KW - benzaldehyde KW - GABA KW - biosensor Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-475070 SN - 1866-8372 IS - 1082 ER - TY - GEN A1 - Bechi, Beatrice A1 - Herter, Susanne A1 - McKenna, Shane A1 - Riley, Christopher A1 - Leimkühler, Silke A1 - Turner, Nicholas J. A1 - Carnell, Andrew J. T1 - Catalytic bio–chemo and bio–bio tandem oxidation reactions for amide and carboxylic acid synthesis N2 - A catalytic toolbox for three different water-based one-pot cascades to convert aryl alcohols to amides and acids and cyclic amines to lactams, involving combination of oxidative enzymes (monoamine oxidase, xanthine dehydrogenase, galactose oxidase and laccase) and chemical oxidants (TBHP or CuI(cat)/H2O2) at mild temperatures, is presented. Mutually compatible conditions were found to afford products in good to excellent yields. T3 - Zweitveröffentlichungen der Universität Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe - 282 Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-99414 ER - TY - THES A1 - Czesnick, Hjördis T1 - Functional specialization of Arabidopsis poly(A) polymerases in relation to flowering time and stress T1 - Funktionelle Spezialisierung von Arabidopsis Poly(A)-Polymerasen in Hinsicht auf Blühzeit und Stress N2 - Polyadenylation is a decisive 3’ end processing step during the maturation of pre-mRNAs. The length of the poly(A) tail has an impact on mRNA stability, localization and translatability. Accordingly, many eukaryotic organisms encode several copies of canonical poly(A) polymerases (cPAPs). The disruption of cPAPs in mammals results in lethality. In plants, reduced cPAP activity is non-lethal. Arabidopsis encodes three nuclear cPAPs, PAPS1, PAPS2 and PAPS4, which are constitutively expressed throughout the plant. Recently, the detailed analysis of Arabidopsis paps1 mutants revealed a subset of genes that is preferentially polyadenylated by the cPAP isoform PAPS1 (Vi et al. 2013). Thus, the specialization of cPAPs might allow the regulation of different sets of genes in order to optimally face developmental or environmental challenges. To gain insights into the cPAP-based gene regulation in plants, the phenotypes of Arabidopsis cPAPs mutants under different conditions are characterized in detail in the following work. An involvement of all three cPAPs in flowering time regulation and stress response regulation is shown. While paps1 knockdown mutants flower early, paps4 and paps2 paps4 knockout mutants exhibit a moderate late-flowering phenotype. PAPS1 promotes the expression of the major flowering inhibitor FLC, supposedly by specific polyadenylation of an FLC activator. PAPS2 and PAPS4 exhibit partially overlapping functions and ensure timely flowering by repressing FLC and at least one other unidentified flowering inhibitor. The latter two cPAPs act in a novel regulatory pathway downstream of the autonomous pathway component FCA and act independently from the polyadenylation factors and flowering time regulators CstF64 and FY. Moreover, PAPS1 and PAPS2/PAPS4 are implicated in different stress response pathways in Arabidopsis. Reduced activity of the poly(A) polymerase PAPS1 results in enhanced resistance to osmotic and oxidative stress. Simultaneously, paps1 mutants are cold-sensitive. In contrast, PAPS2/PAPS4 are not involved in the regulation of osmotic or cold stress, but paps2 paps4 loss-of-function mutants exhibit enhanced sensitivity to oxidative stress provoked in the chloroplast. Thus, both PAPS1 and PAPS2/PAPS4 are required to maintain a balanced redox state in plants. PAPS1 seems to fulfil this function in concert with CPSF30, a polyadenylation factor that regulates alternative polyadenylation and tolerance to oxidative stress. The individual paps mutant phenotypes and the cPAP-specific genetic interactions support the model of cPAP-dependent polyadenylation of selected mRNAs. The high similarity of the polyadenylation machineries in yeast, mammals and plants suggests that similar regulatory mechanisms might be present in other organism groups. The cPAP-dependent developmental and physiological pathways identified in this work allow the design of targeted experiments to better understand the ecological and molecular context underlying cPAP-specialization. N2 - Polyadenylierung ist ein entscheidender Schritt der 3‘-End-Prozessierung und somit der Reifung von prä-mRNAs. Die Länge des Poly(A)-Schwanzes entscheidet unter anderem über die Stabilität und Lokalisierung von mRNAs. Viele Eukaryoten besitzen mehrere Kopien der kanonischen Poly(A)-Polymerasen (PAP). In Säugetieren ist das Ausknocken dieser Enzyme letal. Pflanzen mit reduzierter PAP-Aktivität sind hingegen überlebensfähig. Arabidopsis exprimiert drei im Zellkern lokalisierte PAPs namens PAPS1, PAPS2 und PAPS4. Kürzlich ergab die Analyse von Arabidopsis paps1-Mutanten, dass eine Gen-Untergruppe vorzugsweise von PAPS1 polyadenyliert wird (Vi et al. 2013). Die Spezialisierung der PAPs könnte der Regulierung verschiedener Gengruppen in Anpassung an die Pflanzenentwicklung und an bestimmte Umweltbedingungen dienen. In der vorliegenden Arbeit werden die Phänotypen von Arabidopsis PAP-Mutanten unter verschiedenen Bedingungen im Detail charakterisiert, um die PAP-basierte Genregulation besser zu verstehen. Es wird gezeigt, dass alle drei PAPs an der Regulation der Blühzeit und an der Regulation von Stressantworten beteiligt sind. Während paps1-Mutanten früh blühen, zeigen paps4- und paps2 paps4-Mutanten einen spät blühenden Phänotypen. PAPS1 fördert die Expression des Blühzeitinhibitors FLC vermutlich über die Polyadenylierung eines FLC-Aktivators. PAPS2 und PAPS4 haben teilweise überlappende Funktionen und unterdrücken die Expression von FLC und mindestens einem weiteren, bisher unbekannten Blühzeitinhibitor. Die beiden PAPs agieren in einem neu entdeckten, genetischen Pfad gemeinsam mit dem Blühzeitregulator FCA, jedoch unabhängig von den Polyadenylierungsfaktoren und Blühzeitregulatoren CstF64 und FY. Des Weiteren regulieren PAPS1 und PAPS2/PAPS4 verschiedene Stressantworten. Das Reduzieren der PAPS1-Aktivität führt zu verstärkter Resistenz gegen osmotischen und oxidativen Stress, bei gleichzeitig erhöhter Kältesensitivität der Pflanzen. PAPS2/PAPS4 sind im Gegensatz dazu nicht an der Regulation von Kälte- oder osmotischem Stress beteiligt. Die paps2 paps4-Mutanten besitzen jedoch reduzierte Toleranz gegen oxidativen Stress in Chloroplasten. Das heißt, sowohl PAPS1 als auch PAPS2/PAPS4 sind nötig, um einen ausgeglichenen Redoxstatus der Pflanzenzellen zu gewährleisten. PAPS1 arbeitet bei dieser Regulation scheinbar mit dem Polyadenylierungsfaktor CPSF30 zusammen. Die individuellen Phänotypen der paps-Mutanten und die spezifischen genetischen Interaktionen der Poly(A)-Polymerasen in Arabidopsis unterstützen das Modell der PAP-abhängigen Polyadenylierung von selektierten mRNAs. Da die Polyadenylierungskomplexe in Hefen, Säugetieren und Pflanzen starke Ähnlichkeiten aufweisen, ist es denkbar, dass dieser Regulierungsmechanismus auch in anderen Organismengruppen präsent ist. Basierend auf den Ergebnissen dieser Arbeit können gezielt weitere Experimente entwickelt werden, um die ökologischen und molekularen Grundlagen der PAP-Spezialisierung zu untersuchen. KW - polyadenylation KW - flowering KW - Polyadenylierung KW - Arabidopsis KW - Poly(A)-Polymerasen KW - Blühzeit Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-78015 ER - TY - THES A1 - Fronton, Ludivine T1 - Modeling approaches to characterize the disposition of monoclonal antibodies T1 - Modellierungsansätze zur Charakterisierung der Verteilung und Eliminierung monoklonaler Antikörper BT - from detailed PBPK models to classical compartment models BT - vom detaillierten PBPK-Model zum klassischen Kompartiment-Model N2 - Monoclonal antibodies (mAbs) are engineered immunoglobulins G (IgG) used for more than 20 years as targeted therapy in oncology, infectious diseases and (auto-)immune disorders. Their protein nature greatly influences their pharmacokinetics (PK), presenting typical linear and non-linear behaviors. While it is common to use empirical modeling to analyze clinical PK data of mAbs, there is neither clear consensus nor guidance to, on one hand, select the structure of classical compartment models and on the other hand, interpret mechanistically PK parameters. The mechanistic knowledge present in physiologically-based PK (PBPK) models is likely to support rational classical model selection and thus, a methodology to link empirical and PBPK models is desirable. However, published PBPK models for mAbs are quite diverse in respect to the physiology of distribution spaces and the parameterization of the non-specific elimination involving the neonatal Fc receptor (FcRn) and endogenous IgG (IgGendo). The remarkable discrepancy between the simplicity of biodistribution data and the complexity of published PBPK models translates in parameter identifiability issues. In this thesis, we address this problem with a simplified PBPK model—derived from a hierarchy of more detailed PBPK models and based on simplifications of tissue distribution model. With the novel tissue model, we are breaking new grounds in mechanistic modeling of mAbs disposition: We demonstrate that binding to FcRn is indeed linear and that it is not possible to infer which tissues are involved in the unspecific elimination of wild-type mAbs. We also provide a new approach to predict tissue partition coefficients based on mechanistic insights: We directly link tissue partition coefficients (Ktis) to data-driven and species-independent published antibody biodistribution coefficients (ABCtis) and thus, we ensure the extrapolation from pre-clinical species to human with the simplified PBPK model. We further extend the simplified PBPK model to account for a target, relevant to characterize the non-linear clearance due to mAb-target interaction. With model reduction techniques, we reduce the dimensionality of the simplified PBPK model to design 2-compartment models, thus guiding classical model development with physiological and mechanistic interpretation of the PK parameters. We finally derive a new scaling approach for anatomical and physiological parameters in PBPK models that translates the inter-individual variability into the design of mechanistic covariate models with direct link to classical compartment models, specially useful for PK population analysis during clinical development. N2 - Monoklonale Antikörper (mAbs) sind gentechnisch hergestellte Immunglobuline G (IgG), die seit mehr als 20 Jahren therapeutisch gezielt gegen spezifische Antigene eingesetzt werden. Die Hauptindikationen sind vor allem die Gebiete Onkologie, Infektions- und (Auto-)Immun-Erkrankungen. Monoklonale Antikörper sind hydrophile und geladene Moleküle mit hoher Affinität und Selektivität für ihr Target. Diese Eigenschaften haben einen groçen Einfluss auf die Pharmacokinetik (PK), wobei oft lineares und nicht-lineares Verhalten beobachtet wird. Mathematische Modelle, wie zum Beispiel empirische Modelle, werden routinemässig in der Forschung und Entwicklung verwendet, um die PK für mAbs zu charakterisieren. Hingegen sind physiologisch-basierte PK (PBPK) Modelle für mAbs nur begrenzt einsetzbar. Zur Identifikation und Quantifizierung der Variabilität in klinischen PK-Daten werden meistens empirische 2-Kompartiment Modelle für populationspharmakokinetischen Analysen eingesetzt. Allerdings gibt es weder einen klaren Konsens noch Richtlinien, um lineare und nicht-lineare Clearances zu erklären und um physiologische und mechanistische PK-Parameter zu interpretieren. Prädiktive PBPK-Modelle, die für mAbs publiziert wurden, sind sehr unterschiedlich in Bezug auf die betrachteten Verteilungsvolumina (vaskulär, interstitiell, endosomal) und die Parametrisierung der nicht-spezifischen Elimination durch den neonatalen Fc-Rezeptor und endogenes IgG. Je detaillierter die Beschreibung dieser Prozesse ist, desto mehr Parameter werden benötigt. Allerdings sind deren Werte oftmals nicht bekannt. Dies führt zu Problemen in der Identifizierbarkeit bei den üblicherweise zur Verfügung stehenden in vivo Verteilungsdaten. In der vorliegenden Doktorarbeit präsentieren wir hierarchisch aufgebaute PBPK Modelle für mAbs. Dazu gehören detaillierte, intermediäre und vereinfachte Modelle, deren Ableitungen auf Simplifizierungen des Gewebe-Verteilungs-Modells basieren. Mit dem neuen, vereinfachten PBPK Modell können wir einen Einblick in die mechanistische Interpretation von Gewebe-Verteilungskoeffizienten geben. Diese können mit publizierten, auf Daten basierenden Antikörper Biodistributions Koeffizienten verglichen werden. Weiterhin erlaubt ein simplifiziertes Modell Parameter Identifizierbarkeit und die Auswahl an Gewebe, die bei der nicht-spezifischen Eliminierung der mAbs eine Rolle spielen. Das vereinfachte PBPK Modell kann nach Bedarf um ein Target erweitert werden, das relevant ist für die nicht-lineare Clearance in Folge einer mAb-Target Interaktion zu erklären. Mit Hilfe von Techniken zur Modell-Reduktion reduzieren wir das vereinfachte PBPK Modell, um Kompartiment-Modelle mit niedriger Dimensionalität zu entwickeln. Dadurch wird die physiologische und mechanistische Interpretation der PK Parameter garantiert. Zuletzt leiten wir eine neue Skalierungsmethode für anatomische und physiologische Parameter ab. Sie ermöglicht die Translation der inter-individuellen Variabilität in das Design eines mechanistischen Covariat-Models mit direktem Link zu klassischen Kompartiment-Modellen. Dies ist vor allem für populationspharmakokinetischen Analysen wÃdhrend der klinischen Entwicklung hilfreich. KW - mAb disposition KW - PBPK KW - extravasation-rate limited tissue model KW - classical compartment model KW - mAb Disposition KW - PBPK KW - Extravasation-rate limited Gewebemodelle KW - Kompartiment-Modelle Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-76537 ER - TY - GEN A1 - Gamba, Cristina A1 - Jones, Eppie R. A1 - Teasdale, Matthew D. A1 - McLaughlin, Russell L. A1 - González-Fortes, Gloria M. A1 - Mattiangeli, Valeria A1 - Domboróczki, László A1 - Kővári, Ivett A1 - Pap, Ildikó A1 - Anders, Alexandra A1 - Whittle, Alasdair A1 - Dani, János A1 - Raczky, Pál A1 - Higham, Thomas F. G. A1 - Hofreiter, Michael A1 - Bradley, Daniel G. A1 - Pinhasi, Ron T1 - Genome flux and stasis in a five millennium transect of European prehistory T2 - Zweitveröffentlichungen der Universität Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe N2 - The Great Hungarian Plain was a crossroads of cultural transformations that have shaped European prehistory. Here we analyse a 5,000-year transect of human genomes, sampled from petrous bones giving consistently excellent endogenous DNA yields, from 13 Hungarian Neolithic, Copper, Bronze and Iron Age burials including two to high (similar to 22x) and seven to similar to 1x coverage, to investigate the impact of these on Europe's genetic landscape. These data suggest genomic shifts with the advent of the Neolithic, Bronze and Iron Ages, with interleaved periods of genome stability. The earliest Neolithic context genome shows a European hunter-gatherer genetic signature and a restricted ancestral population size, suggesting direct contact between cultures after the arrival of the first farmers into Europe. The latest, Iron Age, sample reveals an eastern genomic influence concordant with introduced Steppe burial rites. We observe transition towards lighter pigmentation and surprisingly, no Neolithic presence of lactase persistence. T3 - Zweitveröffentlichungen der Universität Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe - 1332 KW - ancient DNA KW - lactase-persistence KW - positive selection KW - patterns KW - sequence KW - farmers KW - pigmentation KW - homozygosity KW - ancestry KW - skin Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-437999 SN - 1866-8372 VL - 5 IS - 1332 ER - TY - THES A1 - Girbig, Dorothee T1 - Analysing concerted criteria for local dynamic properties of metabolic systems T1 - Die Analyse koordinierter Kriterien für lokale dynamische Eigenschaften metabolischer Systeme N2 - Metabolic systems tend to exhibit steady states that can be measured in terms of their concentrations and fluxes. These measurements can be regarded as a phenotypic representation of all the complex interactions and regulatory mechanisms taking place in the underlying metabolic network. Such interactions determine the system's response to external perturbations and are responsible, for example, for its asymptotic stability or for oscillatory trajectories around the steady state. However, determining these perturbation responses in the absence of fully specified kinetic models remains an important challenge of computational systems biology. Structural kinetic modeling (SKM) is a framework to analyse whether a metabolic steady state remains stable under perturbation, without requiring detailed knowledge about individual rate equations. It provides a parameterised representation of the system's Jacobian matrix in which the model parameters encode information about the enzyme-metabolite interactions. Stability criteria can be derived by generating a large number of structural kinetic models (SK-models) with randomly sampled parameter sets and evaluating the resulting Jacobian matrices. The parameter space can be analysed statistically in order to detect network positions that contribute significantly to the perturbation response. Because the sampled parameters are equivalent to the elasticities used in metabolic control analysis (MCA), the results are easy to interpret biologically. In this project, the SKM framework was extended by several novel methodological improvements. These improvements were evaluated in a simulation study using a set of small example pathways with simple Michaelis Menten rate laws. Afterwards, a detailed analysis of the dynamic properties of the neuronal TCA cycle was performed in order to demonstrate how the new insights obtained in this work could be used for the study of complex metabolic systems. The first improvement was achieved by examining the biological feasibility of the elasticity combinations created during Monte Carlo sampling. Using a set of small example systems, the findings showed that the majority of sampled SK-models would yield negative kinetic parameters if they were translated back into kinetic models. To overcome this problem, a simple criterion was formulated that mitigates such infeasible models and the application of this criterion changed the conclusions of the SKM experiment. The second improvement of this work was the application of supervised machine-learning approaches in order to analyse SKM experiments. So far, SKM experiments have focused on the detection of individual enzymes to identify single reactions important for maintaining the stability or oscillatory trajectories. In this work, this approach was extended by demonstrating how SKM enables the detection of ensembles of enzymes or metabolites that act together in an orchestrated manner to coordinate the pathways response to perturbations. In doing so, stable and unstable states served as class labels, and classifiers were trained to detect elasticity regions associated with stability and instability. Classification was performed using decision trees and relevance vector machines (RVMs). The decision trees produced good classification accuracy in terms of model bias and generalizability. RVMs outperformed decision trees when applied to small models, but encountered severe problems when applied to larger systems because of their high runtime requirements. The decision tree rulesets were analysed statistically and individually in order to explore the role of individual enzymes or metabolites in controlling the system's trajectories around steady states. The third improvement of this work was the establishment of a relationship between the SKM framework and the related field of MCA. In particular, it was shown how the sampled elasticities could be converted to flux control coefficients, which were then investigated for their predictive information content in classifier training. After evaluation on the small example pathways, the methodology was used to study two steady states of the neuronal TCA cycle with respect to their intrinsic mechanisms responsible for stability or instability. The findings showed that several elasticities were jointly coordinated to control stability and that the main source for potential instabilities were mutations in the enzyme alpha-ketoglutarate dehydrogenase. N2 - Metabolische Systeme neigen zur Ausbildung von Fließgleichgewichten, deren Konzentrationen und Reaktionsflüsse experimentell charakterisierbar sind. Derartige Messungen bieten eine phänotypische Repräsentation der zahlreichen Interaktionen und regulatorischen Mechanismen des zugrundeliegenden metabolischen Netzwerks. Diese Interaktionen bestimmen die Reaktion des Systems auf externe Perturbationen, wie z.B. dessen asymptotische Stabilität und Oszillationen. Die Charakterisierung solcher Eigenschaften ist jedoch schwierig, wenn kein entsprechendes kinetisches Modell mit allen Ratengleichungen und kinetischen Parametern für das untersuchte System zur Verfügung steht. Die strukturelle kinetische Modellierung (SKM) ermöglicht die Untersuchung dynamischer Eigenschaften wie Stabilität oder Oszillationen, ohne die Ratengleichungen und zugehörigen Parameter im Detail zu kennen. Statt dessen liefert sie eine parametrisierte Repräsentation der Jacobimatrix, in welcher die einzelnen Parameter Informationen über die Sättigung der Enzyme des Systems mit ihren Substraten kodieren. Die Parameter entsprechen dabei den Elastizitäten aus der metabolischen Kontrollanalyse, was ihre biologische Interpretation vereinfacht. Stabilitätskriterien werden durch Monte Carlo Verfahren hergeleitet, wobei zunächst eine große Anzahl struktureller kinetische Modelle (SK-Modelle) mit zufällig gezogenen Parametermengen generiert, und anschließend die resultierenden Jacobimatrizen evaluiert werden. Im Anschluss kann der Parameterraum statistisch analysiert werden, um Enzyme und Metabolite mit signifikantem Einfluss auf die Stabilität zu detektieren. In der vorliegenden Arbeit wurde das bisherige SKM-Verfahren durch neue methodische Verbesserungen erweitert. Diese Verbesserungen wurden anhand einer Simulationsstudie evaluiert, welche auf kleinen Beispielsystemen mit einfachen Michaelis Menten Kinetiken basierte. Im Anschluss wurden sie für eine detaillierte Analyse der dynamischen Eigenschaften des Zitratzyklus verwendet. Die erste Erweiterung der bestehenden Methodik wurde durch Untersuchung der biologischen Machbarkeit der zufällig erzeugten Elastizitäten erreicht. Es konnte gezeigt werden, dass die Mehrheit der zufällig erzeugten SK-Modelle zu negativen Michaeliskonstanten führt. Um dieses Problem anzugehen, wurde ein einfaches Kriterium formuliert, welches das Auftreten solcher biologisch unrealistischer SK-Modelle verhindert. Es konnte gezeigt werden, dass die Anwendung des Kriteriums die Ergebnisse von SKM Experimenten stark beeinflussen kann. Der zweite Beitrag bezog sich auf die Analyse von SKM-Experimenten mit Hilfe überwachter maschineller Lernverfahren. Bisherige SKM-Studien konzentrierten sich meist auf die Detektion individueller Elastizitäten, um einzelne Reaktionen mit Einfluss auf das Stabilitäts- oder oszillatorische Verhalten zu identifizieren. In dieser Arbeit wurde demonstriert, wie SKM Experimente im Hinblick auf multivariate Muster analysiert werden können, um Elastizitäten zu entdecken, die gemeinsam auf orchestrierte und koordinierte Weise die Eigenschaften des Systems bestimmen. Sowohl Entscheidungsbäume als auch Relevanzvektormaschinen (RVMs) wurden als Klassifikatoren eingesetzt. Während Entscheidungsbäume im allgemeinen gute Klassifikationsergebnisse lieferten, scheiterten RVMs an ihren großen Laufzeitbedürfnissen bei Anwendung auf ein komplexes System wie den Zitratzyklus. Hergeleitete Entscheidungsbaumregeln wurden sowohl statistisch als auch individuell analysiert, um die Koordination von Enzymen und Metaboliten in der Kontrolle von Trajektorien des Systems zu untersuchen. Der dritte Beitrag, welcher in dieser Arbeit vorgestellt wurde, war die Etablierung der Beziehung zwischen SKM und der metabolischer Kontrollanalyse. Insbesondere wurde gezeigt, wie die zufällig generierten Elastizitäten in Flusskontrollkoeffizienten umgewandelt werden. Diese wurden im Anschluss bezüglich ihres Informationsgehaltes zum Klassifikationstraining untersucht. Nach der Evaluierung anhand einiger kleiner Beispielsysteme wurde die neue Methodik auf die Studie zweier Fließgleichgewichte des neuronalen Zitratzyklus angewandt, um intrinsische Mechanismen für Stabilität oder Instabilität zu finden. Die Ergebnisse identifizierten Mutationen im Enzym alpha-ketoglutarate dehydrogenase als wahrscheinlichste Quelle füur Instabilitäten. KW - Systembiologie KW - mathematische Modellierung KW - systems biology KW - mathematical modeling Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-72017 ER - TY - GEN A1 - Huynen, Leon A1 - Suzuki, Takayuki A1 - Ogura, Toshihiko A1 - Watanabe, Yusuke A1 - Millar, Craig D. A1 - Hofreiter, Michael A1 - Smith, Craig A1 - Mirmoeini, Sara A1 - Lambert, David M. T1 - Reconstruction and in vivo analysis of the extinct tbx5 gene from ancient wingless moa (Aves: Dinornithiformes) T2 - Postprints der Universität Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe N2 - Background The forelimb-specific gene tbx5 is highly conserved and essential for the development of forelimbs in zebrafish, mice, and humans. Amongst birds, a single order, Dinornithiformes, comprising the extinct wingless moa of New Zealand, are unique in having no skeletal evidence of forelimb-like structures. Results To determine the sequence of tbx5 in moa, we used a range of PCR-based techniques on ancient DNA to retrieve all nine tbx5 exons and splice sites from the giant moa, Dinornis. Moa Tbx5 is identical to chicken Tbx5 in being able to activate the downstream promotors of fgf10 and ANF. In addition we show that missexpression of moa tbx5 in the hindlimb of chicken embryos results in the formation of forelimb features, suggesting that Tbx5 was fully functional in wingless moa. An alternatively spliced exon 1 for tbx5 that is expressed specifically in the forelimb region was shown to be almost identical between moa and ostrich, suggesting that, as well as being fully functional, tbx5 is likely to have been expressed normally in moa since divergence from their flighted ancestors, approximately 60 mya. Conclusions The results suggests that, as in mice, moa tbx5 is necessary for the induction of forelimbs, but is not sufficient for their outgrowth. Moa Tbx5 may have played an important role in the development of moa’s remnant forelimb girdle, and may be required for the formation of this structure. Our results further show that genetic changes affecting genes other than tbx5 must be responsible for the complete loss of forelimbs in moa. T3 - Zweitveröffentlichungen der Universität Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe - 1117 KW - tbx5 KW - Moa KW - gene expression KW - ancient DNA KW - development KW - forelimb Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-431599 SN - 1866-8372 IS - 1117 ER - TY - THES A1 - Hübner, Sandra T1 - Molekulare Grundlagen der Bittergeschmackswahrnehmung in der Maus T1 - Molecular basics of bitter taste perception in mice N2 - Der Bittergeschmack dient Säugern vermutlich zur Wahrnehmung und Vermeidung toxischer Substanzen. Bitterstoffe können jedoch auch gesund sein oder werden oft bereitwillig mit der Nahrung aufgenommen. Ob sie geschmacklich unterschieden werden können, ist allerdings umstritten. Detektiert werden Bitterstoffe von oralen Bittergeschmacksrezeptoren, den TAS2R (human) bzw. Tas2r (murin). In der Literatur gibt es aber immer mehr Hinweise darauf, dass überdies Tas2r nicht nur in extragustatorischen Organen exprimiert werden, sondern dort auch wichtige Aufgaben erfüllen könnten, was wiederum die Aufklärung ihrer noch nicht vollständig entschlüsselten Funktionsweisen erfordert. So ist noch unbekannt, ob alle bisher als funktionell identifizierten Tas2r wirklich gustatorische Funktionen erfüllen. Im Rahmen der Charakterisierung neu generierter, im Locus des Bittergeschmacksrezeptors Tas2r131 genetisch modifizierter Mauslinien, wurde in vorliegender Arbeit die gustatorische sowie extragustatorische Expression von Tas2r131 untersucht. Dass Tas2r131 nicht nur in Pilzpapillen, Wall- und Blätterpapillen (VP+FoP), Gaumen, Ductus nasopalatinus, Vomeronasalorgan und Kehldeckel, sondern auch in Thymus, Testes und Nebenhodenkopf, in Gehirnarealen sowie im Ganglion geniculatum nachgewiesen wurde, bildete die Grundlage für weiterführende Studien. Die vorliegende Arbeit zeigt außerdem, dass Tas2r108, Tas2r126, Tas2r135, Tas2r137 und Tas2r143 in Blut exprimiert werden, was auf eine heterogene Funktion der Tas2r hindeutet. Dass zusätzlich erstmals die Expression aller 35 als funktionell beschriebenen Tas2r im gustatorischen VP+FoP-Epithel von C57BL/6-Mäusen nachgewiesen wurde, verweist auf deren Relevanz als funktionelle Geschmacksrezeptoren. Weiter zeigten Untersuchungen zur Aufklärung eines möglichen Bitter-Unterscheidungsvermögens in Geschmackspapillen von Mäusen mit fluoreszenzmarkierten oder ablatierten Tas2r131-Zellen, dass Tas2r131 exprimierende Zellen eine Tas2r-Zellsubpopulation bilden. Darüber hinaus existieren innerhalb der Bitterzellen geordnete Tas2r-Expressionsmuster, die sich nach der chromosomalen Lage ihrer Gene richten. Isolierte Bitterzellen reagieren heterogen auf bekannte Bitterstoffe. Und Mäuse mit ablatierter Tas2r131-Zellpopulation besitzen noch andere Tas2r-Zellen und schmecken damit einige Bitterstoffe kaum noch, andere aber noch sehr gut. Diese Befunde belegen die Existenz verschiedener gustatorischer Tas2r-Zellpopulationen, welche die Voraussetzung bilden, Bitterstoffe heterogen zu detektieren. Ob dies die Grundlage für ein divergierendes Verhalten gegenüber unverträglichen und harmlosen oder gar nützlichen Bitterstoffen darstellt, kann mit Hilfe der dargelegten Tas2r-Expressionsmuster künftig in Verhaltensexperimenten geprüft werden. Die Bittergeschmackswahrnehmung in Säugetieren stellt sich als ein hochkomplexer Mechanismus dar, dessen Vielschichtigkeit durch die hier neu aufgezeigten heterogenen Tas2r-Expressions- und Funktionsmuster erneut verdeutlicht wird. N2 - In mammals bitter taste is assumed to serve as warning sensor and therefore prevent organisms from ingesting toxic substances. But bitter compounds can also be beneficial and often are readily consumed with food. However, it is disputed if they can be distinguished by taste. Bitter compounds are detected by oral bitter taste receptors, the TAS2Rs (human) or Tas2rs (murine). Moreover, literature provides more and more evidence that Tas2rs not only are expressed in extragustatory organs, but also appear to fulfill relevant functions there. This in turn requires elucidation of their modes of action, which are incompletely understood. Thus it is unknown, if all potentially functional Tas2rs really perform gustatory functions. Within present thesis, newly generated mouse lines with a genetically modified locus of bitter taste receptor Tas2r131 have been characterized by analyzing gustatory as well as extragustatory expression of Tas2r131. The detection of Tas2r131 in fungiform papillae, vallate and foliate papillae (VP+FoP), palate, naso-incisor duct, vomeronasal organ and epiglottis, as well as in thymus, testis and epididymis, in brain and in Ganglion geniculatum, provided the basis for further studies. In addition, present thesis shows expression of Tas2r108, Tas2r126, Tas2r135, Tas2r137, and Tas2r143 in blood, indicating heterogeneous function of Tas2rs. Nevertheless, the presently for the first time proven expression of all 35 potentially functional Tas2rs in gustatory VP+FoP tissue of C57BL/6 mice points to their role as functional taste receptors. To investigate the possibility of a bitter discrimination, further studies were performed in mice with fluorescent-labeled or ablated Tas2r131 cells. It could be demonstrated, that Tas2r131-expressing cells form a subpopulation of the whole Tas2r-expressing cell population. In addition, within bitter cells stable Tas2r expression patterns exist, that comply with chromosomal location of their genes. Single bitter cells respond heterogeneously to common bitter compounds. And mice with ablated Tas2r131 bitter cell population still posses further bitter cells and thereby hardly recognize some bitter substances, but well recognize others. These findings substantiate the existence of different gustatory Tas2r-expressing cell subpopulations, which built the prerequisite for a heterogeneous bitter compound detection. The demonstrated Tas2r expression patterns offer the basis for future behavioral experiments to clarify, if mice are able to distinguish between different bitter tastants. Bitter taste perception in mammals turns out to be a highly complex mechanism, which is again substantiated by the herein demonstrated heterogeneous Tas2r expression and functional patterns. KW - Geschmackswahrnehmung KW - Bittergeschmack KW - Bittergeschmacksrezeptor KW - Tas2r KW - taste KW - Tas2r-Expression KW - bitter taste perception KW - Tas2rs KW - Tas2r expression KW - murine Tas2rs Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-77720 ER - TY - THES A1 - Jüppner, Jessica T1 - Characterization of metabolomic dynamics in synchronized Chlamydomonas reinhardtii cell cultures and the impact of TOR inhibition on cell cycle, proliferation and growth T1 - Charakterisierung der metabolischen Dynamik in synchronisierten Chlamydomonas reinhardtii Zellkulturen und der Einfluss der TOR-Inhibition auf Zellzyklus, Proliferation und Wachstum N2 - The adaptation of cell growth and proliferation to environmental changes is essential for the surviving of biological systems. The evolutionary conserved Ser/Thr protein kinase “Target of Rapamycin” (TOR) has emerged as a major signaling node that integrates the sensing of numerous growth signals to the coordinated regulation of cellular metabolism and growth. Although the TOR signaling pathway has been widely studied in heterotrophic organisms, the research on TOR in photosynthetic eukaryotes has been hampered by the reported land plant resistance to rapamycin. Thus, the finding that Chlamydomonas reinhardtii is sensitive to rapamycin, establish this unicellular green alga as a useful model system to investigate TOR signaling in photosynthetic eukaryotes. The observation that rapamycin does not fully arrest Chlamydomonas growth, which is different from observations made in other organisms, prompted us to investigate the regulatory function of TOR in Chlamydomonas in context of the cell cycle. Therefore, a growth system that allowed synchronously growth under widely unperturbed cultivation in a fermenter system was set up and the synchronized cells were characterized in detail. In a highly resolved kinetic study, the synchronized cells were analyzed for their changes in cytological parameters as cell number and size distribution and their starch content. Furthermore, we applied mass spectrometric analysis for profiling of primary and lipid metabolism. This system was then used to analyze the response dynamics of the Chlamydomonas metabolome and lipidome to TOR-inhibition by rapamycin The results show that TOR inhibition reduces cell growth, delays cell division and daughter cell release and results in a 50% reduced cell number at the end of the cell cycle. Consistent with the growth phenotype we observed strong changes in carbon and nitrogen partitioning in the direction of rapid conversion into carbon and nitrogen storage through an accumulation of starch, triacylglycerol and arginine. Interestingly, it seems that the conversion of carbon into triacylglycerol occurred faster than into starch after TOR inhibition, which may indicate a more dominant role of TOR in the regulation of TAG biosynthesis than in the regulation of starch. This study clearly shows, for the first time, a complex picture of metabolic and lipidomic dynamically changes during the cell cycle of Chlamydomonas reinhardtii and furthermore reveals a complex regulation and adjustment of metabolite pools and lipid composition in response to TOR inhibition. N2 - Die Anpassung der Wachstumsrate an Umweltveränderungen ist essentiell für das Überleben biologischer Systeme. Mit der Identifikation der evolutionär konservierten Serin/Threonin Kinase “Target of Rapamycin” (TOR) war ein zentraler Regulator gefunden, der in Abhängigkeit einer Vielzahl von Wachstumsfaktoren den zellulären Metabolismus und das Wachstum reguliert. Während zum heutigen Zeitpunkt schon relativ gute Kenntnisse über die Funktionen und Signalwege dieser Kinase in heterotrophen Organismen gewonnen werden konnten, wurden die Untersuchungen des TOR-Signalweges in photoautotrophen Organismen durch deren Resistenz gegenüber dem TOR-spezifischen Inhibitor Rapamycin für lange Zeit erschwert. Daher bietet die Entdeckung, dass die einzelligen Grünalge Chlamydomonas reinhardtii eine natürliche Sensitivität gegenüber Rapamycin aufweist, eine gute Grundlage zur Erforschung des TOR-Signalweges in photosynthetisch aktiven Eukaryoten. Aufgrund der Beobachtung, dass das Wachstum von Chlamydomonas nicht vollständig durch Rapamycin inhibiert werden konnte, was im Gegensatz zu Beobachtungen in anderen Organismen steht, entschieden wir uns für eine detailliertere Analyse des Einflusses von TOR auf den Zellzyklus. Dazu wurde ein System etabliert das eine Synchronisation der Zellen unter weitestgehend ungestörten Bedingungen in einem Fermenter-system erlaubte. Dieses System wurde dann für eine detaillierte Charakterisierung der synchronisierten Zellen genutzt. Mittels einer hochaufgelösten Zeitreihe wurden Veränderungen zytologischer Parameter (Zellzahl und Zellgrößenverteilung) und des Stärkegehalts analysiert. Zusätzlich wurden massenspektrometrische Verfahren zur Analyse des Primär- und Lipidmetabolismus verwendet. Dieses System wurde des Weiteren dazu genutzt dynamische Veränderungen im Metabolom und Lipidom von Chlamydomonas nach Inhibition der TOR Kinase durch Rapamycin zu untersuchen Die Ergebnisse der TOR-Inhibition zeigen ein vermindertes Wachstum, eine Verzögerung in der Zellteilung und der Entlassung der Tochterzellen und resultieren in einer um 50% verringerten Zellzahl am Ende des Zellzyklus. Des Weiteren konnte eine Akkumulation von Kohlenstoff– und Stickstoff-Reserven in Form von Stärke und Triacylglyceriden, sowie Arginin beobachtet werden. Dabei ist vor allem interessant, dass die der Einbau von Kohlenstoff in Triacylglyceride offenbar schneller erfolgt als der in Stärke, was auf eine dominantere Rolle von TOR in der Regulation der Triacylglycerid-Biosynthese gegenüber der Stärkesynthese hindeutet. Diese Studie zeigt zum ersten Mal eine komplexe Analyse der dynamischen Veränderungen im Primär- und Lipidmetabolismus im Verlauf des Zellzyklus von Chlamydomonas und zeigt weiterhin die komplexe Regulation und Adjustierung des Metabolit-Pools und der Lipidzusammensetzung als Antwort auf die Inhibition von TOR. KW - chlamydomonas reinhardtii KW - metabolites KW - Metaboliten KW - lipids KW - Lipide Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-76923 ER - TY - THES A1 - Meissner, Sven T1 - Implications of Microcystin Production in Microcystis aeruginosa PCC 7806 T1 - Effekte der Produktion von Microcystin in Microcystis aeruginosa PCC 7806 N2 - Cyanobacteria produce about 40 percent of the world’s primary biomass, but also a variety of often toxic peptides such as microcystin. Mass developments, so called blooms, can pose a real threat to the drinking water supply in many parts of the world. This study aimed at characterizing the biological function of microcystin production in one of the most common bloom-forming cyanobacterium Microcystis aeruginosa. In a first attempt, the effect of elevated light intensity on microcystin production and its binding to cellular proteins was studied. Therefore, conventional microcystin quantification techniques were combined with protein-biochemical methods. RubisCO, the key enzyme for primary carbon fixation was a major microcystin interaction partner. High light exposition strongly stimulated microcystin-protein interactions. Up to 60 percent of the total cellular microcystin was detected bound to proteins, i.e. inaccessible for standard quantification procedures. Underestimation of total microcystin contents when neglecting the protein fraction was also demonstrated in field samples. Finally, an immuno-fluorescence based method was developed to identify microcystin producing cyanobacteria in mixed populations. The high light induced microcystin interaction with proteins suggested an impact of the secondary metabolite on the primary metabolism of Microcystis by e.g. modulating the activity of enzymes. For addressing that question, a comprehensive GC/MS-based approach was conducted to compare the accumulation of metabolites in the wild-type of Microcystis aeruginosa PCC 7806 and the microcystin deficient ΔmcyB mutant. From all 501 detected non-redundant metabolites 85 (17 percent) accumulated significantly different in either of both genotypes upon high light exposition. Accumulation of compatible solutes in the ΔmcyB mutant suggests a role of microcystin in fine-tuning the metabolic flow to prevent stress related to excess light, high oxygen concentration and carbon limitation. Co-analysis of the widely used model cyanobacterium Synechocystis PCC 6803 revealed profound metabolic differences between species of cyanobacteria. Whereas Microcystis channeled more resources towards carbohydrate synthesis, Synechocystis invested more in amino acids. These findings were supported by electron microscopy of high light treated cells and the quantification of storage compounds. While Microcystis accumulated mainly glycogen to about 8.5 percent of its fresh weight within three hours, Synechocystis produced higher amounts of cyanophycin. The results showed that the characterization of species-specific metabolic features should gain more attention with regard to the biotechnological use of cyanobacteria. N2 - Cyanobakterien produzieren etwa 40 Prozent der primären Biomasse auf der Welt aber auch giftige Peptide wie das leberschädigende Microcystin. Massenvorkommen, so genannte Blaualgenblüten, gefährden vielerorts regelmäßig die Trinkwasserversorgung. Diese Arbeit hatte zum Ziel, den Einfluss der Microcystinproduktion auf physiologische Abläufe in dem weit verbreiteten blütenbildenden Cyanobakterium Microcystis aeruginosa zu charakterisieren. Zum einen, wurde hierfür der Einfluss der Beleuchtungsintensität auf die Produktion von Microcystin und dessen Bindung an zelluläre Proteine ermittelt. Hierzu wurden etablierte Quantifizierungstechniken mit biochemischen Methoden kombiniert. RubisCO, das Schlüsselenzym zur primären Kohlenstofffixierung, war ein Hauptinteraktionspartner von Microcystin. Hohe Beleuchtungsintensität erhöhte die Menge von an Proteine gebundenem Microcystin. Bis zu 60 Prozent des gesamten zellulären Microcystins lag an Proteine gebunden vor, d.h. es wurde durch Standardquantifizierungsmethoden nicht erfasst. Die Notwendigkeit, zur Quantifizierung des gesamten Microcystins die Proteinfraktion mit einzubeziehen, wurde auch in Freilandproben demonstriert. Die Entwicklung einer immunofluoreszenzbasierten Methode erlaubte die Unterscheidung von toxischen und nichttoxischen Microcystis-Kolonien in Freilandproben. Die starklichtinduzierte Interaktion von Microcystin mit Proteinen deutete auf einen möglichen Einfluss des Sekundärmetabolits auf den Primärstoffwechsel von Microcystis hin. Um dieser Frage nachzugehen, wurde ein umfassender GC/MS-basierter Versuch durchgeführt, um die Akkumulation von Metaboliten im Microcystin produzierenden Stamm Microcystis aeruginosa PCC 7806 und dessen microcystinfreier ΔmcyB-mutierten Variante vergleichen zu können. Es zeigte sich, dass Microcystin einen Einfluss auf die Akkumulation von 85 (17 Prozent) aller 501 detektierten Metaboliten unter erhöhter Beleuchtungsstärke hatte. Besonders die vermehrte Synthese osmotisch aktiver Substanzen in der ΔmcyB Mutante, verstanden als generelle Reaktion auf allgemeinen Stress, deutete auf eine Beteiligung von Microcystin in der metabolischen Justierung von Microcystis hin. Die Parallelanalyse des Modellstamms Synechocystis PCC 6803 offenbarte grundsätzliche metabolische Unterschiede zwischen verschiedenen Cyanobakterienspezies. Demnach produzierte Microcystis vor allem Kohlehydrate und Synechocystis eher Aminosäuren. Die GC/MS-basierten Ergebnisse wurden durch elektronmikroskopische Aufnahmen und die Quantifizierung von Speichermetaboliten gestützt. Innerhalb drei Stunden bewirkte Starklicht die Akkumulation von Glykogen in Microcystis auf ca. 8.5 Prozent des Frischgewichts, wohingegen Synechocystis mehr Cyanophycin produzierte. Die Ergebnisse zeigten, dass im Hinblick auf die biotechnologische Nutzung von Cyanobakterien, die Charakterisierung speziesspezifischer metabolischer Eigenschaften mehr Beachtung finden sollte. KW - microcystin KW - Microcystin KW - cyanobacteria KW - Cyanobakterien Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-75199 ER - TY - THES A1 - Memczak, Henry T1 - Entwicklung influenzabindender Peptide für die Biosensorik T1 - Engineering of influenza-binding peptides for biosensing N2 - Das Influenzavirus infiziert Säugetiere und Vögel. Der erste Schritt im Infektionszyklus ist die Anbindung des Viruses über sein Oberflächenprotein Hämagglutinin (HA) an Zuckerstrukturen auf Epithelzellen des respiratorischen Traktes im Wirtsorganismus. Aus den drei komplementaritätsbestimmenden Regionen (complementarity determining regions, CDRs) der schweren Kette eines monoklonalen Hämagglutinin-bindenden Antikörpers wurden drei lineare Peptide abgeleitet. Die Bindungseigenschaften der drei Peptide wurden experimentell mittels Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie untersucht. Es zeigte sich, dass in Übereinstimmung mit begleitenden Molekulardynamik-Simulationen zwei der drei Peptide (PeB und PeC) analog zur Bindefähigkeit des Antikörpers in der Lage sind, Influenzaviren vom Stamm X31 (H3N2 A/Aichi/2/1968) zu binden. Die Interaktion des Peptids PeB, welches potentiell mit der konservierten Rezeptorbindestelle im HA interagiert, wurde anschließend näher charakterisiert. Die Detektion der Influenzaviren war unter geeigneten Immobilisationsbedingungen im diagnostisch relevanten Bereich möglich. Die Spezifität der PeB-Virus-Bindung wurde mittels geeigneter Kontrollen auf der Seite des Analyten und des Liganden nachgewiesen. Des Weiteren war das Peptid PeB in der Lage die Bindung von X31-Viren an Mimetika seines natürlichen Rezeptors zu inhibieren, was die spezifische Interaktion mit der Rezeptorbindungsstelle im Hämagglutinin belegt. Anschließend wurde die Primärsequenz von PeB durch eine vollständige Substitutionsanalyse im Microarray-Format hinsichtlich der Struktur-Aktivitäts-Beziehungen charakterisiert. Dies führte außerdem zu verbesserten Peptidvarianten mit erhöhter Affinität und breiterer Spezifität gegen aktuelle Influenzastämme verschiedener Serotypen (z.B. H1N1/2009, H5N1/2004, H7N1/2013). Schließlich konnte durch Verwendung einer in der Primärsequenz angepassten höher affinen Peptidvariante die Influenzainfektion in vitro inhibiert werden. Damit stellen die vom ursprünglichen Peptid PeB abgeleiteten Varianten Rezeptormoleküle in biosensorischen Testsystemen sowie potentielle Wirkstoffe dar. N2 - The influenza virus infects mammals and birds. The first step of the infection cycle comprises the attachment of the viral surface protein hemagglutinin (HA) on glycan structures on epithelial cells within the respiratory tract of the host organism. Starting from the complementarity determining regions (CDRs) of the heavy chain of a monoclonal hemagglutinin-binding antibody three linear peptides were derived. The binding properties of these peptides was characterized experimentally using surface plasmon resonance spectroscopy. In accordance with accompanying molecular dynamics simulation it was shown, that two of the three peptides (PeB and PeC) were able to bind the influenza virus of the strain X31 (H3N2 A/Aichi/2/1968) comparably to the antibody itself. The interaction of peptide PeB, which was supposed to bind to the conserved receptor binding site at the HA, was then characterized more in detail. The detection of influenza viruses was achieved within the diagnostically relevant concentration range using defined immobilization conditions. The specificity of the peptide-virus-binding was proven by appropriate control experiments. Additionally, peptide PeB was able to inhibit the binding of X31 viruses to mimics of its natural receptor. Furthermore the structure-activity-relationship within all the amino acids of peptide PeB was characterized using a full substitutional analysis in a microarray format. This led to improved peptidic variants, which were able to bind different influenza serotypes and inhibit the influenza infection in vitro. The found peptides and their variants can now be used as receptor molecules in biosensors and also represent potential drug candidates. KW - Influenza KW - Peptid KW - Biosensor KW - Virus KW - Interaktionsstudie KW - influenza KW - peptide KW - biosensor KW - virus KW - interaction analysis Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-72470 ER - TY - GEN A1 - Pajoro, Alice A1 - Madrigal, Pedro A1 - Muiño, Jose M. A1 - Matus, José Tomás A1 - Jin, Jian A1 - Mecchia, Martin A. A1 - Debernardi, Juan M. A1 - Palatnik, Javier F. A1 - Balazadeh, Salma A1 - Arif, Muhammad A1 - Ó’Maoiléidigh, Diarmuid S. A1 - Wellmer, Frank A1 - Krajewski, Pawel A1 - Riechmann, José-Luis A1 - Angenent, Gerco C. A1 - Kaufmann, Kerstin T1 - Dynamics of chromatin accessibility and gene regulation by MADS-domain transcription factors in flower development T2 - Zweitveröffentlichungen der Universität Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe N2 - Background: Development of eukaryotic organisms is controlled by transcription factors that trigger specific and global changes in gene expression programs. In plants, MADS-domain transcription factors act as master regulators of developmental switches and organ specification. However, the mechanisms by which these factors dynamically regulate the expression of their target genes at different developmental stages are still poorly understood. Results: We characterized the relationship of chromatin accessibility, gene expression, and DNA binding of two MADS-domain proteins at different stages of Arabidopsis flower development. Dynamic changes in APETALA1 and SEPALLATA3 DNA binding correlated with changes in gene expression, and many of the target genes could be associated with the developmental stage in which they are transcriptionally controlled. We also observe dynamic changes in chromatin accessibility during flower development. Remarkably, DNA binding of APETALA1 and SEPALLATA3 is largely independent of the accessibility status of their binding regions and it can precede increases in DNA accessibility. These results suggest that APETALA1 and SEPALLATA3 may modulate chromatin accessibility, thereby facilitating access of other transcriptional regulators to their target genes. Conclusions: Our findings indicate that different homeotic factors regulate partly overlapping, yet also distinctive sets of target genes in a partly stage-specific fashion. By combining the information from DNA-binding and gene expression data, we are able to propose models of stage-specific regulatory interactions, thereby addressing dynamics of regulatory networks throughout flower development. Furthermore, MADS-domain TFs may regulate gene expression by alternative strategies, one of which is modulation of chromatin accessibility. T3 - Zweitveröffentlichungen der Universität Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe - 1327 KW - flower development KW - floral organ KW - floral meristem KW - chromatin accessibility KW - growth regulate factor Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-431139 SN - 1866-8372 VL - 15 ER - TY - GEN A1 - Schedina, Ina Maria A1 - Hartmann, Stefanie A1 - Groth, Detlef A1 - Schlupp, Ingo A1 - Tiedemann, Ralph T1 - Comparative analysis of the gonadal transcriptomes of the all-female species Poecilia formosa and its maternal ancestor Poecilia mexicana N2 - Background The Amazon molly, Poecilia formosa (Teleostei: Poeciliinae) is an unisexual, all-female species. It evolved through the hybridisation of two closely related sexual species and exhibits clonal reproduction by sperm dependent parthenogenesis (or gynogenesis) where the sperm of a parental species is only used to activate embryogenesis of the apomictic, diploid eggs but does not contribute genetic material to the offspring. Here we provide and describe the first de novo assembled transcriptome of the Amazon molly in comparison with its maternal ancestor, the Atlantic molly Poecilia mexicana. The transcriptome data were produced through sequencing of single end libraries (100 bp) with the Illumina sequencing technique. Results 83,504,382 reads for the Amazon molly and 81,625,840 for the Atlantic molly were assembled into 127,283 and 78,961 contigs for the Amazon molly and the Atlantic molly, respectively. 63% resp. 57% of the contigs could be annotated with gene ontology terms after sequence similarity comparisons. Furthermore, we were able to identify genes normally involved in reproduction and especially in meiosis also in the transcriptome dataset of the apomictic reproducing Amazon molly. Conclusions We assembled and annotated the transcriptome of a non-model organism, the Amazon molly, without a reference genome (de novo). The obtained dataset is a fundamental resource for future research in functional and expression analysis. Also, the presence of 30 meiosis-specific genes within a species where no meiosis is known to take place is remarkable and raises new questions for future research. T3 - Zweitveröffentlichungen der Universität Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe - 404 Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-401420 ER - TY - THES A1 - Scheinemann, Hendrik Alexander T1 - Hygienisierung von Rindergülle und Klärschlämmen mittels milchsaurer Fermentation T1 - Hygienisation of sewage sludge or cattle manure by lactic acid fermentation N2 - Tierische und menschliche Fäkalien aus Landwirtschaft und Haushalten enthalten zahlreiche obligat und opportunistisch pathogene Mikroorganismen, deren Konzentration u. a. je nach Gesundheitszustand der betrachteten Gruppe schwankt. Neben den Krankheitserregern enthalten Fäkalien aber auch essentielle Pflanzennährstoffe (276) und dienen seit Jahrtausenden (63) als Dünger für Feldfrüchte. Mit der unbedarften Verwendung von pathogenbelastetem Fäkaldünger steigt jedoch auch das Risiko einer Infektion von Mensch und Tier. Diese Gefahr erhöht sich mit der globalen Vernetzung der Landwirtschaft, z. B. durch den Import von kontaminierten Futter- bzw. Lebensmitteln (29). Die vorliegende Arbeit stellt die milchsaure Fermentation von Rindergülle und Klärschlamm als alternative Hygienisierungsmethode gegenüber der Pasteurisation in Biogasanlagen bzw. gebräuchlichen Kompostierung vor. Dabei wird ein Abfall der Gram-negativen Bakterienflora sowie der Enterokokken, Schimmel- und Hefepilze unter die Nachweisgrenze von 3 log10KbE/g beobachtet, gleichzeitig steigt die Konzentration der Lactobacillaceae um das Tausendfache. Darüber hinaus wird gezeigt, dass pathogene Bakterien wie Staphylococcus aureus, Salmonella spp., Listeria monocytogenes, EHEC O:157 und vegetative Clostridum perfringens-Zellen innerhalb von 3 Tagen inaktiviert werden. Die Inaktivierung von ECBO-Viren und Spulwurmeiern erfolgt innerhalb von 7 bzw. 56 Tagen. Zur Aufklärung der Ursache der beobachteten Hygienisierung wurde das fermentierte Material auf flüchtige Fettsäuren sowie pH-Wertänderungen untersucht. Es konnte festgestellt werden, dass die gemessenen Werte nicht die alleinige Ursache für das Absterben der Erreger sind, vielmehr wird eine zusätzliche bakterizide Wirkung durch eine mutmaßliche Bildung von Bakteriozinen in Betracht gezogen. Die parasitizide Wirkung wird auf die physikalischen Bedingungen der Fermentation zurückgeführt. Die methodischen Grundlagen basieren auf Analysen mittels zahlreicher klassisch-kultureller Verfahren, wie z. B. der Lebendkeimzahlbestimmung. Darüber hinaus findet die MALDI-TOF-Massenspektrometrie und die klassische PCR in Kombination mit der Gradienten-Gelelektrophorese Anwendung, um kultivierbare Bakterienfloren zu beschreiben bzw. nicht kultivierbare Bakterienfloren stichprobenartig zu erfassen. Neben den Aspekten der Hygienisierung wird zudem die Eignung der Methode für die landwirtschaftliche Nutzung berücksichtigt. Dies findet sich insbesondere in der Komposition des zu fermentierenden Materials wieder, welches für die verstärkte Humusakkumulation im Ackerboden optimiert wurde. Darüber hinaus wird die Masseverlustbilanz während der milchsauren Fermentation mit denen der Kompostierung sowie der Verarbeitung in der Biogasanlage verglichen und als positiv bewertet, da sie mit insgesamt 2,45 % sehr deutlich unter den bisherigen Alternativen liegt (73, 138, 458). Weniger Verluste an organischem Material während der Hygienisierung führen zu einer größeren verwendbaren Düngermenge, die auf Grund ihres organischen Ursprungs zu einer Verstärkung des Humusanteiles im Ackerboden beitragen kann (56, 132). N2 - Manure from animal farms and sewage sludge contain pathogens and opportunistic organisms in various concentrations depending on the health of the herds and human sources. Other than for the presence of pathogens, these waste substances are excellent nutrient sources and constitute a preferred organic fertilizer. However, because of the pathogens, the risks of infection of animals or humans increase with the indiscriminate use of manure, especially liquid manure or sludge, for agriculture. This potential problem can increase with the global connectedness of animal herds fed imported feed grown on fields fertilized with local manures. This paper describes a simple, easy-to-use, low-tech hygienization method which conserves nutrients and does not require large investments in infrastructure. The proposed method uses the microbiotic shift during mesophilic fermentation of cow manure or sewage sludge during which gram-negative bacteria, enterococci and yeasts were inactivated below the detection limit of 3 log10 cfu/g while lactobacilli increased up to a thousand fold. Pathogens like Salmonella, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, E. coli EHEC O:157 and vegetative Clostridium perfringens were inactivated within 3 days of fermentation. In addition, ECBO-viruses and eggs of Ascaris suum were inactivated within 7 and 56 days, respectively. Compared to the mass lost through composting (15–57%), the loss of mass during fermentation (< 2.45%) is very low and provides strong economic and ecological benefits for this process. This method might be an acceptable hygienization method for developed as well as undeveloped countries, and could play a key role in public and animal health while safely closing the nutrient cycle by reducing the necessity of using energy-inefficient inorganic fertilizer for crop production. Scheinemann HA, Dittmar K, Stöckel FS, Müller H, Krüger ME (2015) Hygienisation and Nutrient Conservation of Sewage Sludge or Cattle Manure by Lactic Acid Fermentation. PLoS ONE 10(3): e0118230. doi:10.1371/journal.pone.0118230 KW - pathogene Bakterien KW - organischer Dünger KW - terra preta KW - Salmonella KW - Schwarzerde KW - Stoffkreislauf KW - öffentliche Gesundheit KW - terra preta KW - salmonella KW - black earth KW - fertiliser KW - pathogen bacteria KW - compost Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-77949 ER - TY - THES A1 - Schmitt, Clemens Nikolaus Zeno T1 - The role of protein metal complexes in the mechanics of Mytilus californianus byssal threads T1 - Der Einfluss von Protein-Metall-Komplexen auf die mechanischen Eigenschaften der Byssusfäden von Mytilus californianus N2 - Protein-metal coordination complexes are well known as active centers in enzymatic catalysis, and to contribute to signal transduction, gas transport, and to hormone function. Additionally, they are now known to contribute as load-bearing cross-links to the mechanical properties of several biological materials, including the jaws of Nereis worms and the byssal threads of marine mussels. The primary aim of this thesis work is to better understand the role of protein-metal cross-links in the mechanical properties of biological materials, using the mussel byssus as a model system. Specifically, the focus is on histidine-metal cross-links as sacrificial bonds in the fibrous core of the byssal thread (Chapter 4) and L-3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA)-metal bonds in the protective thread cuticle (Chapter 5). Byssal threads are protein fibers, which mussels use to attach to various substrates at the seashore. These relatively stiff fibers have the ability to extend up to about 100 % strain, dissipating large amounts of mechanical energy from crashing waves, for example. Remarkably, following damage from cyclic loading, initial mechanical properties are subsequently recovered by a material-intrinsic self-healing capability. Histidine residues coordinated to transition metal ions in the proteins comprising the fibrous thread core have been suggested as reversible sacrificial bonds that contribute to self-healing; however, this remains to be substantiated in situ. In the first part of this thesis, the role of metal coordination bonds in the thread core was investigated using several spectroscopic methods. In particular, X-ray absorption spectroscopy (XAS) was applied to probe the coordination environment of zinc in Mytilus californianus threads at various stages during stretching and subsequent healing. Analysis of the extended X-ray absorption fine structure (EXAFS) suggests that tensile deformation of threads is correlated with the rupture of Zn-coordination bonds and that self-healing is connected with the reorganization of Zn-coordination bond topologies rather than the mere reformation of Zn-coordination bonds. These findings have interesting implications for the design of self-healing metallopolymers. The byssus cuticle is a protective coating surrounding the fibrous thread core that is both as hard as an epoxy and extensible up to 100 % strain before cracking. It was shown previously that cuticle stiffness and hardness largely depend on the presence of Fe-DOPA coordination bonds. However, the byssus is known to concentrate a large variety of metals from seawater, some of which are also capable of binding DOPA (e.g. V). Therefore, the question arises whether natural variation of metal composition can affect the mechanical performance of the byssal thread cuticle. To investigate this hypothesis, nanoindentation and confocal Raman spectroscopy were applied to the cuticle of native threads, threads with metals removed (EDTA treated), and threads in which the metal ions in the native tissue were replaced by either Fe or V. Interestingly, replacement of metal ions with either Fe or V leads to the full recovery of native mechanical properties with no statistical difference between each other or the native properties. This likely indicates that a fixed number of metal coordination sites are maintained within the byssal thread cuticle – possibly achieved during thread formation – which may provide an evolutionarily relevant mechanism for maintaining reliable mechanics in an unpredictable environment. While the dynamic exchange of bonds plays a vital role in the mechanical behavior and self-healing in the thread core by allowing them to act as reversible sacrificial bonds, the compatibility of DOPA with other metals allows an inherent adaptability of the thread cuticle to changing circumstances. The requirements to both of these materials can be met by the dynamic nature of the protein-metal cross-links, whereas covalent cross-linking would fail to provide the adaptability of the cuticle and the self-healing of the core. In summary, these studies of the thread core and the thread cuticle serve to underline the important and dynamic roles of protein-metal coordination in the mechanical function of load-bearing protein fibers, such as the mussel byssus. N2 - Protein-Metall Bindungen sind vor allem durch ihre Rolle in physiologischen Prozessen bekannt. Vor kurzem jedoch wurde eine völlig andere Funktion dieser chemischen Bindungen, als lasttragendes Vernetzungselement in Kieferzangen mariner Ringelwürmer der Gattung Nereis und Byssusfäden mariner Muscheln der Gattung Mytilus (Miesmuscheln) entdeckt. Ziel dieser Dissertation ist es, am Beispiel von M. californianus Byssusfäden, ein besseres Verständnis des Einflusses von Protein-Metall Komplexen auf die mechanischen Eigenschaften biologischer Materialien zu erlangen. Byssusfäden sind Proteinfasern, welche Miesmuscheln zur sicheren Befestigung verwenden. Diese relativ steifen Fäden können bis zu 100 % gedehnt zu werden, ohne zu brechen. Bei sofortiger Wiederbelastung zeigt sich jedoch eine Verschlechterung der mechanischen Eigenschaften des Materials. Erstaunlicherweise können sich die mechanischen Eigenschaften der Fäden hiervon wieder erholen. Es wird angenommen, dass im Faserkern der Byssusfäden die Aminosäure Histidin Bindungen mit Metallionen eingeht, welche als reversible Opferbindungen fungieren können und so einen Selbstheilungsprozess ermöglichen. In dieser Arbeit wurde der Beitrag von Protein-Zink Bindungen zur Mechanik der Byssusfäden mittels Röntgenabsorptionsspektroskopie (XAS), untersucht. Die ermittelten Daten legen nahe, dass Zn-Aminosäure Bindungen unter Dehnung der Byssusfäden brechen. Des Weiteren scheint der Selbstheilungsprozess nicht auf der bloßen Wiederherstellung dieser Bindungen zu beruhen, sondern viel mehr auf der Regenerierung der anfänglichen Bindungsstruktur und -verteilung. Diese Erkenntnisse stellen interessante Konzepte für die Entwicklung von selbstheilenden Metallopolymeren bereit. Die relativ harte Hülle der Byssusfäden schützt den Faserkern vor Abrieb. Laut Literatur basiert ihre Härte und Steifigkeit hauptsächlich auf der Quervernetzung durch Fe-DOPA (eine modifizierte Aminosäure) Bindungen. Jedoch können verschiedene Metalle aus dem Meerwasser in Byssusfäden aufgenommen werden und auch Bindungen mit DOPA bilden. Daher stellt sich die Frage, nach dem Zusammenhang zwischen mechanischen Eigenschaften und der Metallzusammensetzung der Byssushülle. Um dieser Frage nachzugehen, wurden die Metallionen aus der Hülle natürlicher Byssusfäden entfernt, und durch entweder Fe oder V ersetzt. Anschließend wurden die mechanischen Eigenschaften der Hüllen der behandelten und unbehandelten Byssusfäden mittels Nanoindentierung bestimmt. Interessanterweise besteht kein Unterschied der mechanischen Eigenschaften der natürlichen und modifizierten Hüllen der Byssusfäden, was dafür spricht, dass in der Hülle der Byssusfäden eine feste Anzahl an Protein-Metall Quervernetzungspunkten vorhanden ist, die möglicherweise durch den speziellen Produktionsprozess der Fäden festgelegt wird. Dies könnte eine evolutionäre Anpassung des Byssus darstellen, um eine verlässliche Verankerung des Organismus in verschiedenen Umgebungen zu gewährleisten. Während die Dynamik der Protein-Metall Bindungen ihnen eine Rolle als chemische Opferbindung im selbstheilenden Faserkern erlaubt, ermöglicht sie die Funktion der Hülle unter Verwendung verschiedener Metalle. Andere nicht-kovalente Wechselwirkungen haben sicherlich eine ähnliche Dynamik, und kovalente Bindungen sind stabiler, aber nur Protein-Metall Bindungen erlauben eine stabile und dynamische Quervernetzung, ohne die weder das Anpassungsvermögen der Hülle, noch das Selbstheilungsvermögen des Faserkerns möglich wären. Die Untersuchungen der Hülle und des Faserkerns der Byssusfäden verdeutlichen die Wichtigkeit der Protein-Metall Bindungen und ihrer Dynamik für die mechanische Funktion lasttragender Proteinfasern, wie dem Byssus der Miesmuscheln. KW - biomaterials KW - self-healing materials KW - protein-metal interaction KW - Biomaterialien KW - selbstheilende Materialien KW - Protein-Metall-Wechselwirkung Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-74216 ER - TY - THES A1 - Wunderlich, Kai T1 - Entwicklung einer parallelen Mehrkomponentenanalyse von Antigen-Antikörper-Reaktionen in der Dopinganalyse T1 - Development of a multiplex-assay for the analysis of antigen-antibody reactions in doping analysis N2 - Weltweit streben Anti-Doping Institute danach jene Sportler zu überführen, welche sich unerlaubter Mittel oder Methoden bedienen. Die hierfür notwendigen Testsysteme werden kontinuierlich weiterentwickelt und neue Methoden aufgrund neuer Wirkstoffe der Pharmaindustrie etabliert. Gegenstand dieser Arbeit war es, eine parallele Mehrkomponentenanalyse auf Basis von Antigen-Antikörper Reaktionen zu entwickeln, bei dem es primär um Verringerung des benötigten Probevolumens und der Versuchszeit im Vergleich zu einem Standard Nachweis-Verfahren ging. Neben der Verwendung eines Multiplex Ansatzes und der Mikroarraytechnologie stellten ebenfalls die Genauigkeit aller Messparameter, die Stabilität des Versuchsaufbaus sowie die Performance über einen Einfach-Blind-Ansatz Herausforderungen dar. Die Anforderung an den Multiplex Ansatz, keine falschen Signale trotz ähnlicher Strukturen zu messen, konnte durch die gezielte Kombination von spezifischen Antikörpern realisiert werden. Hierfür wurden neben Kreuzreaktivitätstests auf dem Mikroarray parallel erfolgreich Western Blot Versuche durchgeführt. Jene Antikörper, welche in diesen Versuchen die gesetzten Anforderungen erfüllten, wurden für das Ermitteln der kleinsten nachweisbaren Konzentration verwendet. Über das Optimieren der Versuchsbedingungen konnte unter Verwendung von Tween in der Waschlösung sowohl auf Glas als auch auf Kunststoff die Hintergrundfluoreszenz reduziert und somit eine Steigerung des Signal/Hintergrundverhältnisses erreicht werden. In den Versuchen zu Ermittlung der Bestimmungsgrenze wurde für das humane Choriongonadotropin (hCG-i) eine Konzentration von 10 mU/ml, für dessen beta-Untereinheit (hCG-beta) eine Konzentration von 3,6 mU/ml und für das luteinisierende Hormon (LH) eine Konzentration von 10 mU/ml bestimmt. Den ermittelten Wert im Serum für das hCG-i entspricht dem von der Welt-Anti-Dopin-Agentur (WADA) geforderten Wert in Urin von 5 mU/ml. Neben der Ermittlung von Bestimmungsgrenzen wurden diese hinsichtlich auftretender Matrixeffekte in Serum und Blut gemessen. Wie aus den Versuchen zur Ermittlung von Kreuzreaktivitäten auf dem Mikroarray zu entnehmen ist, lassen sich das LH, das hCG-i und hCG-β ebenfalls in Serum und Blut messen. Die Durchführung einer Performance-Analyse über einem Einfach-Blind-Ansatz mit 130 Serum Proben, wurde ebenfalls über dieses System realisiert. Die ausgewerteten Proben wurden anschließend über eine Grenzwertoptimierungskurve analysiert und die diagnostische Spezifität ermittelt. Für die Messungen des LH konnte eine Sensitivität und Spezifität von 100% erreicht werden. Demnach wurden alle negativen und positiven Proben eindeutig interpretiert. Für das hCG-β konnte ebenfalls eine Spezifität von 100% und eine Sensitivität von 97% erreicht werden. Die hCG-i Proben wurden mit einer Spezifität von 100% und eine Sensitivität von 97,5% gemessen. Um den Nachweis zu erbringen, dass dieser Versuchsaufbau über mehrere Wochen stabile Signale bei Vermessen von identischen Proben liefert, wurde ein über zwölf Wochen angesetzter Stabilitätstest für alle Parameter erfolgreich in Serum und Blut durchgeführt. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit erfolgreich eine Mehrkomponentenanalyse als Multiplex Ansatz auf einem Mikroarray entwickelt werden. Die Durchführung der Performance-Analyse und des Stabilitätstests zeigen bereits die mögliche Einsatzfähigkeit dieses Tests im Kontext einer Dopinganalyse. N2 - Worldwide it is the goal of anti-doping institutes to have a fair competition in sports free of doping and to prevent the misuse of therapeutics for doping purposes. Therefore there is a need to continuously develop new rapid test methods for the analysis and identification of pharmaceutical substances. Herein, the focus was to develop a multiplex assay on the basis of antigen antibody reactions in doping analysis. It was one goal to reduce the sample volume and the measurement time in comparison to standard methods (i.e. ELISA). Additional challenges were the application of a multiplex approach on the basis of microarray technology and to achieve a high sensitivity and precision. The major challenge for a multiplex analysis is the specific detection of all analytes without producing false positive signals, even of those analytes with similar molecular structure. This was solved using a special combination of specific monoclonal antibodies. Therefore cross-reaction-tests on the microarray platform and western blot analysis were performed simultaneously. Subsequently, the relevant antibodies were used for the analysis of the minimum detectable concentration. Optimization of experimental conditions on glass and polymer surfaces (i.e. COP) led to a reduction of the background fluorescence, resulting in an increase of signal-to-background ratio. The measured limit of detection (LOD) for the human choriongonadotropin (hCG-i) was a concentration of 10 mU/ml, for the beta-subunit (hCG-beta) 3,6 mU/ml and for the luteinizing hormone (LH) 10 mU/ml. The value of hCG-i in serum correlates to the claimed threshold limit from the world anti doping agency (WADA) of 5 mU/ml in urine. In parallel, matrix effects were analyzed in serum and whole blood. In a crossreactivity study it was shown, that it is possible to measure all three parameters in serum and whole blood independently. The performance analysis of a blinded experiment with 130 serum samples was analyzed with receiver operating characteristic (ROC) and showed the diagnostic specificity. For LH the specificity and sensitivity was 100%, for hCG-beta a specificity of 100% and a sensitivity of 97% was measured. The samples for hCG-i were measured with a specificity of 100% and a sensitivity of 97,5%. For the evidence of stability for several weeks of the experimental setup, a stability testing over a period of 12 weeks was performed. Identical samples gave stable signals over a period of 10 weeks in serum as well as in whole blood. In summary the development of a multiplex assay for the analysis of antigen-antibody reactions in doping analysis for LH and hCG was successful and represents a proof of concept. Due to the promising results in the performance analysis and the stability tests it might be possible to insert that kind of multiplex assay as a test method for the anti doping analysis. KW - Mehrkomponentenanalyse KW - Multiplex KW - Doping KW - Schnelltest KW - hCG KW - multiplex assay KW - microarray KW - dopingtest KW - point-of-care KW - in-vitro diagnostic Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-76869 ER - TY - GEN A1 - Yarman, Aysu A1 - Scheller, Frieder W. T1 - The first electrochemical MIP sensor for tamoxifen T2 - Postprints der Universität Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe N2 - We present an electrochemical MIP sensor for tamoxifen (TAM)-a nonsteroidal anti-estrogen-which is based on the electropolymerisation of an O-phenylenediamine. resorcinol mixture directly on the electrode surface in the presence of the template molecule. Up to now only. bulk. MIPs for TAM have been described in literature, which are applied for separation in chromatography columns. Electro-polymerisation of the monomers in the presence of TAM generated a film which completely suppressed the reduction of ferricyanide. Removal of the template gave a markedly increased ferricyanide signal, which was again suppressed after rebinding as expected for filling of the cavities by target binding. The decrease of the ferricyanide peak of the MIP electrode depended linearly on the TAM concentration between 1 and 100 nM. The TAM-imprinted electrode showed a 2.3 times higher recognition of the template molecule itself as compared to its metabolite 4-hydroxytamoxifen and no cross-reactivity with the anticancer drug doxorubucin was found. Measurements at + 1.1 V caused a fouling of the electrode surface, whilst pretreatment of TAM with peroxide in presence of HRP generated an oxidation product which was reducible at 0 mV, thus circumventing the polymer formation and electrochemical interferences. T3 - Zweitveröffentlichungen der Universität Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe - 1046 KW - molecularly imprinted polymers KW - anticancer drug KW - tamoxifen KW - electropolymerisation Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-476173 SN - 1866-8372 IS - 1046 ER - TY - GEN A1 - Zór, K. A1 - Heiskanen, A. A1 - Caviglia, Claudia A1 - Vergani, M. A1 - Landini, E. A1 - Shah, F. A1 - Carminati, Marco A1 - Martínez-Serrano, A. A1 - Ramos Moreno, T. A1 - Kokaia, M. A1 - Benayahu, Dafna A1 - Keresztes, Zs. A1 - Papkovsky, D. A1 - Wollenberger, Ursula A1 - Svendsen, W. E. A1 - Dimaki, M. A1 - Ferrari, G. A1 - Raiteri, R. A1 - Sampietro, M. A1 - Dufva, M. A1 - Emnéus, J. T1 - A compact multifunctional microfluidic platform for exploring cellular dynamics in real-time using electrochemical detection N2 - Downscaling of microfluidic cell culture and detection devices for electrochemical monitoring has mostly focused on miniaturization of the microfluidic chips which are often designed for specific applications and therefore lack functional flexibility. We present a compact microfluidic cell culture and electrochemical analysis platform with in-built fluid handling and detection, enabling complete cell based assays comprising on-line electrode cleaning, sterilization, surface functionalization, cell seeding, cultivation and electrochemical real-time monitoring of cellular dynamics. To demonstrate the versatility and multifunctionality of the platform, we explored amperometric monitoring of intracellular redox activity in yeast (Saccharomyces cerevisiae) and detection of exocytotically released dopamine from rat pheochromocytoma cells (PC12). Electrochemical impedance spectroscopy was used in both applications for monitoring cell sedimentation and adhesion as well as proliferation in the case of PC12 cells. The influence of flow rate on the signal amplitude in the detection of redox metabolism as well as the effect of mechanical stimulation on dopamine release were demonstrated using the programmable fluid handling capability. The here presented platform is aimed at applications utilizing cell based assays, ranging from e.g. monitoring of drug effects in pharmacological studies, characterization of neural stem cell differentiation, and screening of genetically modified microorganisms to environmental monitoring. T3 - Zweitveröffentlichungen der Universität Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe - 289 Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-99492 ER -