TY - THES A1 - Müller, Carsten T1 - Nachweis antioxidativer und chemopräventiver Eigenschaften von Naturstoffen zur Verwendung als potenzielle Nahrungsergänzungsmittel Y1 - 2009 CY - Potsdam ER - TY - THES A1 - Hessel, Stefanie T1 - Mechanismen zur Detoxifizierung von Benzo[a]pyren-Metaboliten in der gastrointestinalen Barriere Y1 - 2009 CY - Potsdam ER - TY - THES A1 - Hanisch, Christiana T1 - Die Wirkung eines Symbiotikums auf die Zusammensetzung der intestinalen Mikrobiota, die fäkale Exkretion von kurzkettigen Fettsäuren sowie ausgewählte Parameter der Darmfunktion bei über 65-jährigen Frauen und Männern Y1 - 2009 ER - TY - THES A1 - Vogel, Heike T1 - Identifizierung, Charakterisierung und Eingrenzung eines Suszeptibilitätslocus (Nob3) für Adipositas und Hyperglykämie im Mausgenom Y1 - 2009 CY - Potsdam ER - TY - THES A1 - Brockhoff, Anne T1 - Struktur-Funktionsbeziehungen menschlicher Bitterrezeptoren Y1 - 2009 CY - Potsdam ER - TY - THES A1 - Gärtner, Sonja T1 - Elektrochemische Charakterisierung von Anthocyanen und mögliche Wechselwirkungen mit biologisch relevanten Systemen Y1 - 2009 CY - Potsdam ER - TY - THES A1 - Drewes, Gunnar T1 - Die Bedeutung Eisen-Schwefel-Cluster-assoziierter Mechanismen für Mutagenese und Kanzerogenese Y1 - 2009 CY - Potsdam ER - TY - JOUR A1 - Barth, Christian A. T1 - Ein Vitamin mit zwei Gesichtern : Folat in der Vorsorge Y1 - 2009 UR - http://www.dlr-online.de/ SN - 0012-0413 ER - TY - THES A1 - Wend, Korinna T1 - Konstruktion und toxikologische Nutzung von transgenen Mäusen mit den allelischen Varianten von humanen SULT1A-Genen T1 - Construction and characterisation of transgenic mice for human sulfotransferases with polymorphic SULT1A genes N2 - Eine besondere Rolle im Fremdstoffmetabolismus hat die SULT1A1 beim Menschen aufgrund der hohen Expression und breiten Gewebeverteilung. Während die humane SULT1A1 in sehr vielen Geweben exprimiert wird, wurde die murine SULT1A1 vor allem in der Leber, Lunge und Colon gefunden. Neben der Gewebeverteilung spielt auch der Polymorphismus im humanen SULT1A1-Gen eine bedeutende Rolle. Der häufigste Polymorphismus in diesem Gen führt zu einer Aminosäuresubstitution von Arginin zu Histidin an Position 213. Die Genvariante mit Histidin (auch als SULT1A1*2 bezeichnet) codiert für ein Protein mit einer geringen Enzymaktivität und einer reduzierten Enzymmenge in Thrombocyten. Über den Einfluss dieser allelischen Varianten in anderen Geweben ist bislang wenig bekannt. In vorausgegangenen epidemiologischen Studien wurden mögliche Korrelationen zwischen den Genvarianten und der Krebsentstehung in verschiedenen Geweben untersucht. Diese Daten liefern jedoch widersprüchliche Ergebnisse zum Krebsrisiko. Aufgrund der strittigen epidemiologischen Daten sollten Tiermodelle generiert werden, um die häufigsten SULT1A1-Allele hinsichtlich der Empfindlichkeit gegenüber Nahrungs- und Umweltkanzerogenen zu untersuchen. Zur Erzeugung transgener (tg) Mauslinien wurde mittels Mikroinjektion der codierenden Genbereich und große flankierende Humansequenzen stromaufwärts und stromabwärts in das Mausgenom integriert. Es wurden mehrere Mauslinien hergestellt. Zwei davon, die Mauslinie 31 mit dem SULT1A1*1-Allel und die Mauslinie 28 mit dem SULT1A1*2-Allel, wurden eingehend analysiert. In beiden Linien wurde eine identische Kopienzahl des Transgens ermittelt. Proteinbiochemische Charakterisierungen zeigten eine weitgehend dem Menschen entsprechende Gewebeverteilung und zelluläre und subzelluläre Lokalisation der humanen SULT1A1 in der Linie (Li) 28. In Li 31 wurden Unterschiede zu Li 28 sowohl in der Gewebeverteilung als auch in der zellulären Lokalisation des exprimierten humanen Proteins ermittelt. Dabei war die Expression auf Proteinebene in der SULT1A1*2-tg Linie generell stärker als in der SULT1A1*1-Linie. Dieses Ergebnis war überraschend, denn in humanen Thrombocyten führt das SULT1A1*1-Allel zu einem höheren Gehalt an SULT1A1-Protein als das SULT1A1*2-Allel. Zur Analyse der unterschiedlichen Proteinexpressionen in den tg Mauslinien wurde die cDNA und der 5´-flankierende Bereich des SULT1A1-Gens sequenziert. In beiden tg Linien entsprach die Sequenz der cDNA der Referenzsequenz aus der Gendatenbank (Pubmed). In der 5´-flankierenden Region wurden bekannte Polymorphismen analysiert und unterschiedliche Haplotypen in den tg Linien an den Positionen -624 und -396 ermittelt. Dabei wurde in der Li 31 der Haplotyp detektiert, der in der Literatur mit einer höheren SULT1A1-Enzymaktivität beschrieben wird. Der mögliche Zusammenhang zwischen Transkriptionsrate und Proteinexpression wurde in RNA-Expressionsanalysen im codierenden und 5´-nicht codierenden Bereich (mit den alternativen Exons 1B und 1A) untersucht. Im codierenden Bereich und im Exon 1B konnte in den untersuchten Organen eine höhere RNA-Expression in der Li 28 im Vergleich zur Li 31 ermittelt werden. Außer in der Lunge wurde für Exon 1B eine identische RNA-Expression detektiert. RNA, die Exon 1A enthielt, wurde in allen untersuchten Organen der Li 28, aber nur in der Lunge bei der Li 31 gefunden. In beiden tg Linien konnten mit den Exon 1A-Primern jedoch auch größere PCR-Produkte ermittelt werden. Dieser Unterschied im Exon 1A und mögliche Spleißvarianten könnten damit für die unterschiedliche Proteinexpression des humanen SULT1A1-Proteins in den beiden tg Mauslinien sein. Die in dieser Arbeit generierten und charakterisierten tg Mausmodelle wurden in einer toxikologischen Studie eingesetzt. Es wurde das heterozyklische aromatische Amin 2-Amino-1-methyl-6-phenylimidazo-[4,5-b]pyridin (PhIP) verwendet. PhIP wird beim Erhitzen und Braten von Fleisch und Fisch gebildet und könnte mit der erhöhten Krebsentstehung im Colon in der westlichen Welt im Zusammenhang stehen. Mittels 32P-Postlabelling sollte der Einfluss der zusätzlichen Expression der humanen SULT-Proteine auf die PhIP-DNA-Adduktbildung analysiert werden. Dabei wurden mehr DNA-Addukte in den tg Tieren als in den Wildtyp-Mäusen ermittelt. Die Konzentration der gebildeten DNA-Addukte korrelierte mit der Expressionsstärke des humanen SULT1A1-Proteins in den tg Mäusen. An den in dieser Arbeit generierten tg Mauslinien mit den häufigsten allelischen Varianten des SULT1A1-Gens konnten Unterschiede auf RNA- und Protein-Ebene ermittelt werden. Zudem konnte gezeigt werden, dass die Expression der humanen SULT1A1 eine Auswirkung sowohl auf die Stärke als auch das Zielgewebe der DNA-Adduktbildung in vivo hat. N2 - In humans, SULT1A1 and its polymorphic variants play an important role in xenobiotic metabolism and display a broad tissue distribution and high expression level. This enzyme is expressed in almost every human organ whereas in mice SULT1A1 can only be detected in liver, lung and colon. The most common polymorphism of this gene leads to an amino acid substitution from arginine to histidine at the position 213. In platelets, the allele encoding histidine (also designated as SULT1A1*2) is associated with both low activity and low thermal stability of the SULT protein. However, so far only little is known about the significance of these allelic variants in the other tissues with hSULT1A1 expression. Previous epidemiological studies have made attempts to correlate SULT1A1 allelic variants and cancer development, their data, however, have been contradictory for an appropriate cancer risk assessment. In this thesis, we addressed the effect of the hSULT1A1 genetic variability on the susceptibility to nutritional and environmental carcinogens using transgenic (tg) mouse models. We generated tg mice carrying the most common allelic variants of the human SULT1A1 gene. The coding region and large flanking human sequences upstream and downstream of the hSULT1A1 gene were integrated randomly into the mouse genome by microinjection. Several tg mouse lines were generated. Two of them, line (li) 31 with the SULT1A1*1 allele and li 28 with the SULT1A1*2 allele, were analysed in detail. At first, an identical transgene copy number was detected in both lines. Furthermore, biochemical characterization of li 28 showed that the tissue distribution, the cellular and subcellular localisation of the protein were very similar to those in humans. In contrast, li 31 exhibited differences in tissue distribution and cellular localisation of the human protein compared to li 28. The protein expression level in the tg line with SULT1A1*2 (li 28) was generally higher than in SULT1A1*1 (li 31) mice. These results were surprising since the SULT1A1*1 allele in human platelets usually leads to a higher amount of SULT1A1 protein compared to the SULT1A1*2 allele. To investigate these differences, we sequenced the cDNA and 5´-flanking region of the SULT1A1 gene. In both tg mouse lines, the cDNA sequence was identical to the reference sequence from the gene databank (Pubmed). We subsequently analysed the common polymorphisms of the 5´-flanking region, and determined different haplotypes at position -624 and -396 in the tg mouse lines. According to the literature, the haplotype associated with a higher SULT1A1 enzyme activity, we detected in li 31. We analyzed the possible correlation between gene transcription and protein expression by measuring RNA expression levels of the coding and the non-coding region (with alternative exons 1B and 1A). We detected a higher RNA expression level of the coding region and exon 1B in li 28 compared to li 31, whereas RNA for exon 1A was only found in li 28 in all investigated tissues, but only in lung in li 31. Furthermore we detected with exon 1A-primers larger RNA in both lines. These differences in exon 1A expression accompanied by potential splicing variants could be responsible for the different expression and activity of the human SULT1A1 protein in both tg mouse lines. In order to validate our generated and characterized tg mouse models as toxicological in vivo models, we used them for the evaluation of the heterocyclic aromatic amine 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo-[4,5-b]pyridine (PhIP). PhIP is typically generated during heating and roasting of meat and fish and is suggested to be associated with an increased colon cancer incidence in the western world. We measured the impact of the additionally expressed human SULT proteins on the PhIP-DNA adduct level by 32P-postlabelling. We detected significantly higher DNA adduct levels in tg compared to wildtype mice, which correlated positively with the expression pattern of the human SULT1A1 protein in the tg mice. In conclusion, in this thesis, we have successfully generated and validated the transgenic mouse lines carrying the most common allelic variants of the human SULT1A1 gene. Interestingly, these lines exhibited differences in both the SULT1A1 RNA and protein levels. Using these transgenic mouse models as in vivo toxicological tools we have shown that the expression of human SULT1A1 in mice has a decisive impact on the strength and the target tissue of DNA adducts. KW - transgenes Mausmodell KW - Polymorphismus KW - Sulfotransferase KW - SULT1A1 KW - SULT1A2 KW - PhIP KW - heterocyclisches aromatisches Amin KW - transgenic mousemodel KW - polymorphism KW - sulfotransferase KW - SULT1A1 KW - SULT1A2 KW - PhIP KW - heterocyclic aromatic amine Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-42052 ER - TY - THES A1 - Behrens, Verena T1 - Die Rolle des Glucosetransporters 8 (Slc2a8) in der Regulation der Glucosehomöostase, der Spermienmotilität sowie des Verhaltens T1 - The physiological role of glucose transporter 8 (Slc2a8) in regulation of glucose homeostasis, sperm motility and behavior N2 - Der ubiquitär exprimierte, multifunktionale Glucosetransporter GLUT8 gehört zur Klasse III der Familie der passiven Glucosetransporter, die aus insgesamt 14 Proteinen besteht. Die fünf Mitglieder der Klasse IIII unterscheiden sich strukturell leicht von den Mitgliedern der Klasse I und II (Joost und Thorens, 2001). GLUT8 besitzt ein N-terminales Dileucin-Motiv, das Teil eines [DE]XXXL[LI] Motivs ist, welches für die Sortierung des Transporters in späte Endosomen und Lysosomen verantwortlich ist (Augustin et al., 2005). Da bis heute kein Signal identifiziert wurde, das eine Translokation des Transporters zur Plasmamembran auslöst, wird eine intrazelluläre Funktion von GLUT8 vermutet (Widmer et al., 2005). Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die intrazelluläre Funktion des Transporters in der Regulation der Glucosehomöostase des Körpers durch Analyse einer Slc2a8-knockout-Maus untersucht. Die homozygote Deletion des Transporters erbrachte lebensfähige Nachkommen, die sich augenscheinlich nicht von ihren Wildtyp-Geschwistern unterschieden. Allerdings wurde bei Verpaarungen heterozygoter Mäuse eine verminderte Anzahl an Slc2a8-/--Nachkommen beobachtet, die signifikant von der erwarteten Mendel’schen Verteilung abwich. Da Slc2a8 die höchste mRNA-Expression in den Testes aufwies und die Überprüfung der Fertilität mittels verschiedener homozygoter Verpaarungen eine Störung der weiblichen Fortpflanzungsfähigkeit ausschloss, wurden die Spermatozoen der Slc2a8-/--Mäuse eingehender untersucht. Als Ursache für die verringerte Anzahl von Slc2a8-/--Geburten wurde eine verminderte Prozentzahl motiler Slc2a8-/--Spermien ermittelt, die durch eine unzureichende mitochondriale Kondensation in den Spermien bedingt war. Diese Veränderung war mit einem reduzierten mitochondrialen Membranpotential assoziiert, was eine verminderte ATP-Produktion nach sich zog. Somit scheint GLUT8 in den Spermien an einem intrazellulären Transportprozess beteiligt zu sein, der einen Einfluss auf die oxidative Phosphorylierung der Mitochondrien ausübt. Im Gehirn wurde Slc2a8 besonders stark im Hippocampus exprimiert, der in der Regulation von körperlicher Aktivität, Explorationsverhalten, Erinnerungs- und Lernprozessen sowie Angst- und Stressreaktionen eine Rolle spielt. Außerdem wurde GLUT8 im Hypothalamus nachgewiesen, der unter anderem an der Regulation der Nahrungsaufnahme beteiligt ist. Die Slc2a8-/--Mäuse zeigten im Vergleich zu ihren Slc2a8+/+-Geschwistern eine signifikant gesteigerte körperliche Aktivität, die zusammen mit der von Membrez et al. (2006) publizierten erhöhten Zellproliferation im Hippocampus auf eine Nährstoffunterversorgung dieses Areals hindeutet. Die Nahrungsaufnahme war in Abwesenheit von GLUT8 nicht verändert, was zusammen mit dem nur geringfügig niedrigeren Körpergewicht der Slc2a8-/--Mäuse eine Funktion von GLUT8 im Glucose-sensing der Glucose-sensitiven Neurone des Gehirns ausschließt. Das leicht reduzierte Körpergewicht der Slc2a8-/--Mäuse ließ sich keinem bestimmten Organ- oder Gewebetyp zuordnen, sondern schien durch eine marginale Gewichtsreduktion aller untersuchten Gewebe bedingt zu sein. Zusammen mit den erniedrigten Blutglucosespiegeln und der anscheinend gesteigerten Lebenserwartung zeigten die Slc2a8-/--Mäuse Symptome einer leichten Nährstoffunterversorgung. GLUT8 scheint daher am Transport von Zuckerderivaten, die während des lysosomalen/endosomalen Abbaus von Glykoproteinen anfallen, beteiligt zu sein. Die so wiederaufbereiteten Zucker dienen dem Körper offenbar als zusätzliche Energiequelle. N2 - The family of facilitative glucose transporters consists of 14 different members in human, which are divided into three classes (Joost and Thorens, 2001). The class III family member GLUT8 contains an amino-terminal dileucine sorting signal, which is part of the highly conserved [DE]XXXL[LI] motif responsible for the localization of GLUT8 in lysosomes and late endosomes (Augustin et al., 2005). To date there is no stimulus known, which translocates the transporter to the plasma membrane, therefore an intracellular function rather than at the cell surface is considered (Widmer et al., 2005). The aim of the present dissertation was to analyze the intracellular role of GLUT8 in the regulation of whole body glucose homeostasis, by the characterization of the corresponding knockout mice (Slc2a8-/-). Slc2a8-/- mice were viable and showed no obvious disparity to their wild-type littermates. However, analysis of the offspring distribution of heterozygous mating provided a reduced number of born Slc2a8-/- offspring which differed significantly from the expected Mendelian distribution. Because Slc2a8 mRNA is expressed at highest levels in the testis and the female Slc2a8-/- mice showed no alterations in fertility, we further investigated the function of Slc2a8-/- spermatozoa. An impaired mitochondrial condensation in the Slc2a8-/- spermatozoa, which was associated with decreased ATP levels resulted in a reduced number of motile Slc2a8-/- sperm, which appeared to be responsible for the reduced number of born Slc2a8-/- offspring. Therefore in sperm cells GLUT8 seems to be important for an intracellular transport process, which exerts an influence on the oxidative phosphorylation in the mitochondria. In the brain Slc2a8 is expressed at highest levels in the hippocampus, which is important for the regulation of physical activity, exploration behaviour, memory and learning as well as anxiety related behaviour. Additionally, GLUT8 was detected in the hypothalamus, which is amongst others involved in the regulation of food intake. The Slc2a8-/- mice showed a significant increase in locomotor activity, which indicates a moderate undersupply of the hippocampus area. According to this finding the group of Membrez et al. (2006) observed a raised cell proliferation in the hippocampus of Slc2a8-/- mice. The fact that no alterations in food intake and only a moderate reduction in body weight was detected in Slc2a8-/- mice, indicates that GLUT8 is not important for the hypothalamic glucose sensing. The marginal decreased body weight of the Slc2a8-/- mice appeared to be associated with a slightly reduced weight of different tissues. Together with the lowered blood glucose concentrations and the apparently enhanced lifespan, the Slc2a8-/- mice showed symptoms of a moderate undersupply compareable to caloric restriction. Thus, we hypothesize that GLUT8 is important for the transport of sugar derivatives which arise during lysosomal/endosomal degradation of glycoproteins. These recycled sugars may serve as an additional energy source in the cell. KW - Glucosetransport KW - GLUT8 KW - Spermienmotilität KW - Verhalten KW - Glucosehomöostase KW - glucose transport KW - GLUT8 KW - sperm motility KW - behavior KW - glucose homeostasis Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-36308 ER - TY - THES A1 - Nell, Sandra T1 - Vitamin E und der vesikuläre Transport : Untersuchungen zu den genregulatorischen Funktionen von Vitamin E mittels Microarray- und real time PCR-Analysen in der Maus und funktionellen in vitro Assays in RBL-2H3 Zellen T1 - Vitamin E and the vesicular transport : examination of the generegulatory functions of vitamin E using microarrays and real time PCR analyses in the mouse and functional in vitro assays in RBL-2H3 cells N2 - Vitamin E wird immer noch als das wichtigste lipophile Antioxidanz in biologischen Membranen betrachtet. In den letzten Jahren hat sich jedoch der Schwerpunkt der Vitamin E-Forschung hin zu den nicht-antioxidativen Funktionen verlagert. Besonderes Interesse gilt dabei dem α-Tocopherol, der häufigsten Vitamin E-Form im Gewebe von Säugetieren, und seiner Rolle bei der Regulation der Genexpression. Das Ziel dieser Dissertation war die Untersuchung der genregulatorischen Funktionen von α-Tocoperol und die Identifizierung α-Tocopherol-sensitiver Gene in vivo. Zu diesem Zweck wurden Mäuse mit verschiedenen Mengen α-Tocopherol gefüttert. Die Analyse der hepatischen Genexpression mit Hilfe von DNA-Microarrays identifizierte 387 α-Tocopherol-sensitive Gene. Funktionelle Clusteranalysen der differentiell exprimierten Gene zeigten einen Einfluss von α-Tocooherol auf zelluläre Transportprozesse. Besonders solche Gene, die an vesikulären Transportvorgängen beteiligt sind, wurden größtenteils durch α-Tocopherol hochreguliert. Für Syntaxin 1C, Vesicle-associated membrane protein 1, N-ethylmaleimide-sensitive factor and Syntaxin binding protein 1 konnte eine erhöhte Expression mittels real time PCR bestätigt werden. Ein funktioneller Einfluss von α-Tocopherol auf vesikuläre Transportprozesse konnte mit Hilfe des in vitro β-Hexosaminidase Assays in der sekretorischen Mastzelllinie RBL-2H3 gezeigt werden. Die Inkubation der Zellen mit α-Tocopherol resultierte in einer konzentrationsabhängigen Erhöhung der PMA/Ionomycin-stimulierten Sekretion der β-Hexosaminidase. Eine erhöhte Expression ausgewählter Gene, die an der Degranulation beteiligt sind, konnte nicht beobachtet werden. Damit schien ein direkter genregulatorischer Effekt von α-Tocopherol eher unwahrscheinlich. Da eine erhöhte Sekretion auch mit β-Tocopherol aber nicht mit Trolox, einem hydrophilen Vitamin E-Analogon, gefunden wurde, wurde vermutet, dass α-Tocopherol die Degranulation möglicherweise durch seine membranständige Lokalisation beeinflussen könnte. Die Inkubation der Zellen mit α-Tocopherol resultierte in einer veränderten Verteilung des Gangliosids GM1, einem Lipid raft Marker. Es wird angenommen, dass diese Membranmikrodomänen als Plattformen für Signaltransduktionsvorgänge fungieren. Ein möglicher Einfluss von Vitamin E auf die Rekrutierung/Translokation von Signalproteinen in Membranmikrodomänen könnte die beobachteten Effekte erklären. Eine Rolle von α-Tocopherol im vesikulären Transport könnte nicht nur seine eigene Absorption und seinen Transport beeinflussen, sondern auch eine Erklärung für die bei schwerer Vitamin E-Defizienz auftretenden neuronalen Dysfunktionen bieten. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die α-Tocopheroltransferprotein (Ttpa) Knockout-Maus als genetisches Modell für Vitamin E-Defizienz verwendet, um den Effekt von Ttpa auf die Genexpression und die Gewebeverteilung von α-Tocopherol zu analysieren. Ttpa ist ein cytosolisches Protein, das für die selektive Retention von α-Tocopherol in der Leber verantwortlich ist. Die Ttpa-Defizienz resultierte in sehr geringen α-Tocopherol-Konzentrationen im Plasma und den extrahepatischen Geweben. Die Analyse der α-Tocopherol-Gehalte im Gehirn wies auf eine Rolle von Ttpa bei der α-Tocopherol-Aufnahme ins Gehirn hin. N2 - Vitamin E is still considered the most important lipid-soluble antioxidant within biological membranes. However, in the last years the non-antioxidant functions of vitamin E have become the focus of vitamin E research. From the eight members of the vitamin E family, specific emphasis is given to α-tocopherol, the most abundant vitamin E form in mammalian tissues, and its role in the regulation of gene expression. The aim of this thesis was the analysis of the gene regulatory functions of α-tocopherol and the identification of α-tocopherol sensitive genes in vivo. For this purpose mice were fed diets differing in α-tocopherol content. The analysis of hepatic gene expression using DNA microarrays identified 387 α-tocopherol-sensitive genes. Functional cluster analyses of these differentially expressed genes demonstrated an influence of α-tocopherol on cellular transport processes. Especially the expression of genes involved in vesicular trafficking was largely upregulated by α-tocopherol. Upregulation of syntaxin 1C, vesicle-associated membrane protein 1, N-ethylmaleimide-sensitive factor and syntaxin binding protein 1 was verified by real time PCR. A role of α-tocopherol in exocytosis was shown by the in vitro β-hexosaminidase release assay in the secretory mast cell line RBL-2H3. Incubation with α-tocopherol resulted in a concentration dependent increase of PMA/ionomycin-stimulated secretion of β-hexosaminidase. Induction of selected genes involved in degranulation was not observed at any time point. Thus, a direct gene-regulatory effect of α-tocopherol seemed rather unlikely. Since increased secretion was also observed with ß-tocopherol but not with trolox, a water-soluble analog of vitamin E, it was hypothesized that α-tocopherol might affect degranulation through its localization at the plasma membrane. Incubation of cells with α-tocopherol changed the distribution of the gangliosid GM1, a Lipid raft marker. These membrane microdomains are assumed to function as signaling platforms. An possible influence of vitamin E on the recruitment/translocation of signaling proteins into membrane microdomains could explain the observed effects. A role of α-tocopherol in the vesicular transport might not only affect its own absorption and transport but also explain the neural dysfunctions observed in severe α-tocopherol deficiency. In the second part of this dissertation the α-tocopherol transfer protein (Ttpa) knockout-mouse as a model of genetic vitamin E deficiency was used to analyze the effect of Ttpa gene expression and tissue distribution of α-tocopherol. Ttpa is a cytosolic protein, which is responsible for the selective retention of α-tocopherol in the liver. Its deficiency resulted in very low α-tocopherol concentrations in plasma and extrahepatic tissues. Analysis of α-tocopherol contents in brain indicated a role for Ttpa in the uptake of α-tocopherol into the brain. KW - Vitamin E KW - Microarray KW - Genregulation KW - vesikulärer Transport KW - α-Tocopheroltransferprotein (Ttpa) KW - vitamin E KW - microarray KW - gene regulation KW - vesicular transport KW - alpha-tocopherol transfer protein (Ttpa) Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-35710 ER - TY - THES A1 - Schmidt, Antje T1 - Untersuchung des Recyclings Kaede-fusionierter Corticotropin-Releasing-Factor Rezeptoren Typ 1 T1 - Use of Kaede-Fusions to Visualize Recycling of the Corticotropin-Releasing Factor Receptor Type 1 N2 - Aktivierte G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR) werden schnell desensitisiert, internalisiert und anschließend entweder lysosomal degradiert oder zur Plasmamembran (PM) recycelt. Zur Resensitisierung der Zellen tragen neben recycelten auch neusynthetisierte Rezeptoren bei. Die Überlagerung beider Prozesse erschwert die Untersuchung des Rezeptorrecyclings. In dieser Arbeit sollte mit Hilfe des photokonvertierbaren Fluoreszenzproteins Kaede eine Technik entwickelt werden, mit der es möglich ist Recycling- von Neusyntheseprozessen zu trennen und das Recycling von GPCR mikroskopisch in Echtzeit zu beobachten. Als Modellproteine wurden der Vasopressin-1a-Rezeptor V1aR (recycelnder Rezeptor), der Vasopressin-2-Rezeptor V2R (degradierter Rezeptor) und der Corticotropin-Releasing Factor-Rezeptor Typ 1 (CRF1R) verwendet, wobei bei Letzterem untersucht werden sollte, ob er nach Stimulation zur PM zurücktransportiert wird. Da Kaede als fluoreszierendes Protein mit den GPCR fusioniert wird, wurde zunächst überprüft, ob es die Eigenschaften der Rezeptoren verändert und generell für Transportstudien geeignet ist. Eventuell könnte die bereits publizierte Tetramerisierung von Kaede seine Anwendung verhindern oder erschweren. Mittels Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie konnte gezeigt werden, dass Kaede nicht tetramerisiert, wenn es an ein Membranprotein fusioniert ist. Außerdem konnte in in vitro- und Zellkulturexperimenten belegt werden, dass die native und die photokonvertierte Form von Kaede gleichermaßen stabil sind. Darüber hinaus zeigten Kaede-fusionierte GPCR sowohl in Kolokalisationsstudien als auch in Agonistbindungs- und Rezeptoraktivierungsexperimenten die gleichen Eigenschaften wie CFP- bzw. die unfusionierte Rezeptoren. Lediglich die Expression der Kaede-fusionierten Rezeptoren war geringer. Parallel wurde anhand der bereits publizierten Kaede-Struktur versucht, die Tetramerisierung des Proteins durch den Austausch interagierender Aminosäuren zu unterbinden. Die eingeführten Mutationen bewirkten aber eine Fehlfaltung des Proteins und damit den Verlust der Fluoreszenz. Da zuvor gezeigt werden konnte, dass Kaede-fusionierte Membranproteine nicht tetramerisieren und nicht die Eigenschaften der fusionierten Proteine verändern, war monomerisiertes Kaede zur Untersuchung des Rezeptorrecyclings nicht notwendig. Im zweiten Teil der Arbeit wurde mit Hilfe von Kaede-Fusionsproteinen und mikroskopischer Testsysteme das noch unbekannte Recyclingverhalten des CRF1R untersucht. Hierfür wurden die Kaede-fusionierten Rezeptoren in eukaryotischen Zellen exprimiert und mit Agonisten internalisiert. Die internalisierten Rezeptoren wurden in Endosomen selektiv mit UV-Strahlung photokonvertiert. Anschließend wurde der Transport der photokonvertierten Form verfolgt. Sowohl beim CRF1R als auch beim V1aR wurden Signale in der PM detektiert, beim V2R hingegen nicht. Dies zeigt, dass es sich beim CRF1R um einen recycelnden Rezeptor handelt. Die als Kontrolle eingesetzten Rezeptoren verhielten sich in diesem Experiment wie erwartet: Der V1aR wurde zur PM zurücktransportiert, der V2R nicht. Diese Ergebnisse konnten mit Hilfe biochemischer und durchflusscytometrischer Experimente bestätigt werden. Die Internalisierung des CRF1R verläuft Clathrin-vermittelt in Anwesenheit von β-Arrestin. Je nach Stabilität der β Arrestin-Interaktion unterscheidet man zwei Klassen von Rezeptoren: Klasse A-Rezeptoren interagieren transient mit β Arrestin und können recyceln. Im Gegensatz dazu gehen Klasse B-Rezeptoren eine stabile Interaktion mit β Arrestin ein und werden nach Internalisierung degradiert. In mikroskopischen Untersuchungen konnte für die aktivierten CRF1R und V1aR eine Rekrutierung von β Arrestin zur PM und eine transiente Interaktion mit β Arrestin gezeigt werden (Klasse A-Rezeptoren). Für den V2R wurde dagegen eine stabile Interaktion mit β Arrestin beobachtet (Klasse B-Rezeptor). Diese Daten stützen die Ergebnisse des Kaede-basierten Recyclingversuchs und zeigen, dass der CRF1R ein recycelnder Rezeptor ist. Ferner wurde untersucht, ob der CRF1R zu den schnell oder langsam recycelnden Rezeptoren zählt. Schnell recycelnde Rezeptoren werden direkt aus frühen Endosomen, langsam recycelnde hingegen über das Trans-Golgi-Netzwerk (TGN) bzw. über Recycling-Endosomen zur PM transportiert. Als Marker für das TGN oder die Recycling-Endosomen wurde Rab11 verwendet. In Kolokalisationsstudien konnte gezeigt werden, dass der CRF1R den langsam recycelnden Rezeptoren zugeordnet werden kann. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit belegt werden, dass Kaede als Fusionspartner für Membranproteine genutzt werden kann um deren Transport in Echtzeit zu studieren. Damit wurde erstmals eine mikroskopische Methode etabliert, die es erlaubt recycelnde von neusynthetisierten Rezeptoren zu unterscheiden. Mit Hilfe dieser Methode war es möglich zu zeigen, dass der CRF1R ein recycelnder Rezeptor ist. N2 - Upon ligand binding and receptor activation, G protein-coupled receptors (GPCR) are rapidly desensitized, internalized and subsequently degraded in lysosomes or recycled back to the plasma membrane. Resensitization of the cell is enabled by both recycling receptors and newly synthesized receptors. The overlap of recycling and synthesis processes largely complicates the study of GPCR recycling mechanisms. One aim of this thesis was to develop a new microscopic technique for real-time visualization of GPCR recycling using the photoconvertible Kaede protein allowing to differentiate newly synthesized from recycling receptors. As model proteins, the V1aR (recycling receptor), the V2R (degraded receptor) and the CRF1R were used. In the case of the CRF1R, it was unknown whether this receptor recycles to the plasma membrane following agonist-promoted internalization. The study of the CRF1R recycling behaviour was another objective of this work. As the Kaede protein is fused C-terminally to the GPCRs, an influence on the pharmacological and trafficking properties of the receptors must be excluded. The previously published tetramerization of Kaede, for example, might hinder or even prevent its usability. To assess for the applicability of Kaede, fluorescence correlation spectroscopy experiments were performed and it was demonstrated that Kaede fused to membrane proteins cannot form tetramers in contrast to the soluble form. In vitro studies and experiments in cell culture revealed that both the native and the photoconverted Kaede are equally stable. Moreover Kaede-fused GPCR displayed the same pharmacological and trafficking properties as the untagged or CFP-tagged receptors. Only the expression levels of the Kaede fusion proteins were reduced, yet this did not affect the microscopic experiments. In parallel to these experiments, the interacting amino acids of the tetrameric Kaede were substituted according to the previously published crystal structure of the protein. Unfortunately, these mutations induced protein misfolding thereby causing loss of fluorescence functions. However, since it could be shown that membrane protein-fused Kaede cannot tetramerize, the monomerized Kaede was no more essential for the microscopic study of receptor recycling. In the second part of this work, Kaede-fusions were used to study the recycling behaviour of the CRF1R and the V1aR and V2R control proteins by the novel real-time recycling assay at the laser scanning microscope. To this end, HEK 293 cells expressing the Kaede-fused receptors were treated with agonist to induce receptor internalization. Internalized receptors were selectively photoconverted in endosomes using UV-irradiation and the subcellular fate of the new fluorescence signals was studied. In the case of the CRF1R, signals of the photoconverted receptors could be detected in the plasma membrane indicating that the CRF1R belongs to the family of recycling receptors. The control receptors showed the expected results: The V1aR recycled back to the plasma membrane whereas the V2R did not. These results were confirmed with biochemical and flow cytometry measurements. The CRF1R internalizes in a clathrin-dependent way via the adaptor protein AP2, dynamin and β arrestin. Depending on the stability of the resulting receptor-β-arrestin-complex, two classes of receptors can be differentiated. Class A receptors are recycling receptors undergoing a more transient β-arrestin interaction. In contrast, class B receptors stably interact with β-arrestin and are degraded after internalization. In the case of the CRF1R and V1aR, microscopic analyzes demonstrated that β arrestin transiently interacts with the stimulated CRF1R and V1aR indicating again that these receptors are recycling GPCRs (class A receptors). The V2R, in contrast, revealed a stable interaction (class B receptor). Moreover, it was studied whether the CRF1R recycles rapidly or more slowly to the plasma membrane. Rapidly recycling receptors are recruited out of early endosomes whereas slowly recycling receptors pass the trans-golgi-network or recycling endosomes before reaching the cell surface. Rab11 colocalization studies demonstrated that the CRF1R belongs to the family of slowly recycling receptors. In conclusion, a novel microscopic technique was established allowing to study GPCR recycling in real-time and to differentiate recycling and synthesis processes. Moreover, it was shown that the CRF1R belongs to the family of recycling receptors. The Kaede technique seems to be very well suited to study membrane protein trafficking in general. KW - Corticotropin-Releasing Factor Rezeptor Typ 1 KW - Recycling KW - GPCR KW - Kaede KW - Corticotropin-Releasing Factor Receptor Type 1 KW - Recycling KW - GPCR KW - Kaede Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-34902 ER - TY - THES A1 - Küster, Katrin T1 - Die funktionelle Bedeutung des Coxsackie- und Adenovirus Rezeptors (CAR) im kolorektalen Karzinom T1 - Functional role of the Coxsackie and Adenovirus Receptor (CAR) in colorectal carcinomas N2 - Der Coxsackie- und Adenovirus Rezeptor (CAR) ist als Bestandteil von Tight Junctions (TJ) an interzellulären Adhäsionsprozessen beteiligt und scheint eine wichtige Rolle in der Karzinogenese zu spielen. Diese ist jedoch insbesondere bei Entstehung von Darmkrebs weitgehend unklar. Ziel der Arbeit war es daher, die funktionelle Bedeutung, mögliche Interaktionspartner sowie die Expressionsregulation von CAR im kolorektalen Karzinom zu analysieren. In den Zelllinien CaCo2, Colo205, DLD1, HCT116, HT29, SW480 und T84 konnte die Expression von CAR (mRNA und Protein) nachgewiesen werden. Nach stabiler CAR-Überexpression durch Transfektion von CARcDNA in DLD1, HCT116 und SW480 wurde das Zellwachstum gehemmt und eine Abnahme von Migration und Invasion induziert. Eine stabile CAR-Inhibition nach Transfektion von CARsiRNA führte in diesen Zelllinien zum Anstieg der Proliferation sowie zu verstärkter Migrations- und Invasionsaktivität, die in DLD1 mit morphologischen Änderungen einhergingen. Eine Genexpressionsanalyse der Zelllinie DLD1 mit CAR-Inhibition identifizierte α-Catenin als das am stärksten regulierte Gen. Obwohl keine direkte Interaktion beider Proteine detektiert werden konnte, führte eine stabile Re-Expression von α-Catenin in DLD1 mit stabiler CAR-Inhibition zu einer deutlichen Reduktion von Proliferation, Migration und Invasion sowie zu einem Rückgang der zellmorphologischen Änderungen. Um den Einfluss von Differenzierung auf die Regulation der CAR-Expression zu untersuchen, erfolgte eine Behandlung aller Zelllinien mit Natriumbutyrat. Dies führte in fünf der sieben Zelllinien zu einer Aktivierung des CAR-Promotors sowie zu einer gesteigerten Expression und Immunoreaktivität von CAR an der Zelloberfläche. Die Zelllinie CaCo2 zeigte nach spontaner Differenzierung durch 21-tägiges Wachstum post Konfluenz ebenfalls eine verstärkte CAR-mRNA-Expression sowie eine erhöhte CAR-Präsenz an der Zelloberfläche. Die gewonnenen Daten konnten die funktionelle Bedeutung von CAR für die Kolonkarzinogenese sowie den Einfluss von α-Catenin auf diese Funktion deutlich machen. Es wurde gezeigt, dass die Expressionsregulation sowie die subzelluläre Verteilung von CAR durch den zellulären Differenzierungsstatus beeinflusst werden kann. N2 - The Coxsackie and Adenovirus Receptor (CAR) is a transmembrane compound of the tight junctions in polarized epithelial cells mediating cellular adhesion. CAR was suggested to play a functional role in the development of epithelial malignomas but detailed knowledge is still lacking, especially for the colorectal carcinoma. Therefore, the functional impact and regulation of CAR expression in human colorectal carcinoma cell models were investigated. CAR protein and mRNA was detectable in the cell lines CaCo2, Colo205, DLD1, HCT116, HT29, SW480 and T84. Stable CAR over expression by transfection of CARcDNA in DLD1, HCT116 and SW480 led to reduced proliferation in vitro and in vivo. Also reduced migration and invasion were observed. Stable CAR inhibition by transfection of CARsiRNA in the same cell lines resulted in increased migration and invasion. In DLD1 morphological changes were found after CAR inhibition. Differential gene expression was detected in DLD1 cells with stable CAR inhibition revealing an 18-fold decrease in α-Catenin gene expression. Loss of α-Catenin was obtained on protein level, too. Although no direct interaction between CAR and α-Catenin could be proven ectopic re-expression of α-Catenin in DLD1 with CAR inhibition reversed the determined functional and morphological effects of a CAR knock down. Then, the impact of differentiation on regulation of CAR expression was investigated. Sodium butyrate treatment induced differentiation in all cell lines (determined by alkaline phosphatase activity), which was paralleled by an increase of CAR immunoreactivity at the plasma membrane in all cell lines but CaCo2. However, CAR protein and mRNA expression, as well as CAR gene promoter activity increased in 5 cell lines only, whereas in SW480 and CaCo2 a down regulation was observed. Spontaneous differentiation of CaCo2 after a growth period of 21 days post confluence resulted in up regulation of CAR mRNA expression as well as increased CAR presence at the plasma membrane. The data suggest that CAR plays a crucial role in the carcinogenesis of colorectal carcinoma which could be influenced by α-Catenin interaction. Differentiation determines the regulation of CAR expression and the subcellular distribution of CAR in colon cancer cells. KW - Coxsackie- und Adenovirus Rezeptor KW - kolorektales Karzinom KW - Tight Junctions KW - alpha-Catenin KW - Differenzierung KW - Coxsackie and Adenovirus Receptor KW - colorectal carcinoma KW - tight junctions KW - alpha-Catenin KW - differentiation Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-31617 ER -