TY - THES A1 - Riedel, Simona T1 - Characterization of Mitochondrial ABC Transporter Homologues in Rhodobacter capsulatus T1 - Charakterisierung von Homologen zu mitochondrialen ABC Transportern in Rhodobacter capsulatus N2 - ABC-Transporter (ABC abgeleitet von ATP-Binding Cassette) gehören zur Klasse der Transmembran-Proteine und kommen in allen drei Domänen des Lebens vor. Ihr struktureller Aufbau ist dabei stets ähnlich, wohingegen konservierte Proteinsequenzen selten vorkommen. Die Transporter sind aus zwei lipophilen, membran-durchspannenden Domänen, welche auch TMDs (abgeleitet von Transmembrane spanning Domains) genannt werden, und zwei hydrophilen Domänen, die auch NBDs (abgeleitet von Nucleotide Binding Domains) genannt werden, aufgebaut. Die Vielzahl der durch ABC-Transporter beförderten Moleküle erklärt dabei die enorme Anzahl diverser TMDs. In den Mitochondrien des Menschen findet man vier ABC-Transporter (ABCB6, ABCB7, ABCB8 und ABCB10) mit funktionellen Homologen in Hefen und Pflanzen. In Bakterien hingegen können, mit Ausnahme von Rickettsiae und verwandten Bakterien, keine Homologen zu mitochondrialen ABC-Transportern identifiziert werden. Die transportierten Moleküle sowie die damit verbundenen Funktionen sind im Einzelnen bislang weitgehend unbekannt. ABCB7 und die entsprechenden Homologen in Hefen (Atm1) und in Pflanzen (ATM3) konnten mit der cytosolischen Eisen-Schwefel-Cluster-Biosynthese in Zusammenhang gebracht werden. Eine schwefelhaltige Verbindung der mitochondrialen Matrix wird mit Hilfe dieses Transporters der cytosolischen Eisen-Schwefel-Cluster-Assemblierung zur Verfügung gestellt. Die 2014 publizierten Kristallstrukturen von Atm1 (Hefe) und Atm1 aus Novosphingobium aromaticivorans offenbarten dabei eine hoch konservierte Glutathion-Bindetasche innerhalb der TMDs für ABCB7 Homologe. In der Modellpflanze Arabidopsis thaliana konnte ATM3 zusätzlich mit der Biosynthese des Molybdän-Cofaktors in Verbindung gebracht werden. In der vorliegenden Arbeit wurde das α-Proteobacterium Rhodobacter capsulatus als Modellorganismus genutzt, um mitochondriale ABC-Transporter Homologe zu untersuchen. Das Bakterium enthält zwei ABC-Transporter-Gene, rcc03139 und rcc02305, die mit den humanen mitochondrialen Transportern große Sequenzübereinstimmungen aufweisen (rcc03139: 41 % respektive 38 % Identität mit ABCB8 und ABCB10, rcc02305: 47 % identisch mit ABCB7 und ABCB6). Mit Hilfe erzeugter Interposon-Mutanten (Δrcc02305I und Δrcc03139I) konnte erstmals gezeigt werden, dass bakterielle Transporter funktionell sehr ähnliche Aufgaben wie die mitochondrialen ABC-Transporter übernehmen. Beispielsweise akkumulierten beide Interposon-Mutanten reaktive Sauerstoff-Spezies (ROS) ohne gleichzeitige Akkumulation von Glutathion oder Eisen. Weiterhin konnten wir zeigen, dass, ähnlich wie bereits für ATM3 postuliert, die Biosynthese des Molybdän-Cofaktors in Δrcc02305I verändert ist. Mit Hilfe einer lebensfähigen Doppelmutante, in der beide ABC-Transporter-Gene gleichzeitig deletiert wurden, konnten wir ausschließen, dass die beiden bakteriellen ABC-Transporter grundsätzlich redundante Funktionen haben. Durch die Analyse des Proteoms von Δrcc03139I im Vergleich zu der des Wildtyps, konnte eine extreme Beeinflussung der Tetrapyrrol Biosynthese sowie entsprechender Zielproteine identifiziert werden. Dies konnte zusätzlich durch die Quantifizierung einzelner Zwischenprodukte der Biosynthese bestätigt werden. Im Gegensatz dazu konnte anhand der Analyse des Proteoms in Verbindung mit analytischen Methoden in Δrcc02305I ein Ungleichgewicht in der Schwefelverteilung identifiziert werden. Zusammen mit der Entdeckung einer Pyridoxalphosphat (PLP) Bindestelle in Rcc02305 und anderen ABCB7-artigen Transportern, welche direkt mit dem Walker-A-Motiv der NBD überlappt, ermöglichte dies eine völlig neue Theorie, wie die schwefelhaltige Verbindung transportiert werden kann. Wir gehen davon aus, dass an PLP zunächst ein Persulfid produziert wird, welches unmittelbar mit dem Glutathion der transmembranen Bindetasche zu einem gemischten Polysulfid reagiert. Im Anschluss daran wird die ATP-Bindestelle frei und die Hydrolyse des ATPs löst eine Konformationsänderung aus, welche das gemischte Polysulfid ins Periplasma bzw. in den intermembranen Raum freigibt. N2 - ATP-binding cassette (ABC) transporters are present in all kingdoms of life and enable active transport of various different molecules across biological membranes. They all share an overall architecture of two lipophilic transmembrane spanning domains (TMDs) traversing the membrane and two hydrophilic nucleotide binding domains (NBDs) usually lacking sequence identity. The multiplicity in transported molecules is accompanied by extreme diversity in TMDs. Human mitochondria harbor four ABC transporters, namely ABCB6, ABCB7, ABCB8 and ABCB10 with functional homologues in yeast and plants. Except the ones found in Rickettsiae and related bacteria mitochondrial ABC transporters are absent in bacteria. In addition to converting energy mitochondria are important platforms for biosynthesizing various cofactors as iron sulfur clusters, molybdenum cofactor (Moco) or heme. ABCB7 (Atm1 in yeast) has been shown to connect mitochondrial with cytosolic iron sulfur cluster assembly by exporting a yet unknown sulfur containing molecule. In addition, TMDs of Atm1 display a glutathione binding pocket accessible from the matrix which has been identified in all ABCB7-like transporters and also exists in a bacterial ABC transporter homologue of Atm1 in Novosphingobium aromaticivorans. In addition, ATM3, a plant mitochondrial homologous ABC transporter to human ABCB7, has been associated with biosynthesizing Moco. In this study we used the α-proteobacterium Rhodobacter capsulatus as a model organism to characterize mitochondrial ABC transporter homologues. R. capsulatus contains two homologues to mitochondrial ABC transporters with the corresponding gene loci rcc03139 and rcc02305. They share 38 to 47 % sequence identities to human mitochondrial ABC transporters ABCB8/ABCB10 and ABCB7/ABCB6, respectively. We created interposon mutants lacking either rcc03139 or rcc02305, analyzed the physiological effects on R. capsulatus and compared the findings especially to eukaryotic deletion studies. A viable bacterial double mutant strain lacking both mitochondrial ABC transporters was constructed to investigate possible overlapping functions. Both R. capsulatus single mutants showed a severe accumulation of intracellular reactive oxygen species (ROS) in comparison to ∆nifDK which revealed to be additive in the double mutant. In the proteome of ∆rcc03139I abundancies of tetrapyrrole related proteins were significantly increased in comparison to the proteome of parental strain, which was further validated by reduced amounts of tetrapyrrole intermediates in ∆rcc03139. In contrast, in ∆rcc02305I total glutathione (GSH) was elevated when endogenous GSH biosynthesis was inhibited. In conjunction with proteomic studies we uncovered misbalanced sulfur distribution in ∆rcc02305I. Furthermore, strains lacking Rcc02305 accumulated cyclic pyranopterin monophosphate (cPMP), an intermediate of Moco biosynthesis, as it was already shown for the deletion strain of the eukaryotic counterpart ATM3 in plants. In contrast single mutant strain Δrcc03139I neither accumulated cPMP nor glutathione. Bioinformatic analysis of the amino acid sequence of Rcc02305 revealed a pyridoxal 5´phosphate (PLP) binding site which overlaps with Walker A within the NBDs of Rcc02305 and other ABCB7-like transporters. The PLP cofactor is well studied in C-DES (L-cysteine/cystine lyase from Synechocystis) for persulfide production and in L-cysteine desulfurases such as IscS and NFS1 for its role in formation of protein-bound persulfides. Based on our findings we are able to propose a new modality for the transport of the sulfur containing molecule: first of all, the transporter produces a highly reactive persulfide which is then subsequently trapped by glutathione polysulfide, already bound within the binding pocket in TMDs. Walker A becomes accessible for ATP and after hydrolysis the mixed polysulfide is released. Based on our studies we are convinced that both mitochondrial ABC transporter homologues fulfil distinct roles in R. capsulatus: Rcc02305 is a representative of Atm1/ABCB7-like transporters and important for proper sulfur distribution by exporting persulfides. In contrast Rcc03139 is a representative of ABCB6/ABCB10 related transporters and involved in biosynthesizing tetrapyrroles. KW - Rhodobacter capsulatus KW - ABC Transporter KW - ABCB7 KW - Mitochondrien KW - PLP-Walker A-Überlagerung KW - Rhodobacter capsulatus KW - ABC transporter KW - ABCB7 KW - mitochondria KW - PLP-Walker A-overlap Y1 - 2019 ER - TY - THES A1 - Fischer, Axel T1 - Investigating the impact of genomic compartments contributing to non-Mendelian inheritance based on high throughput sequencing data T1 - Untersuchungen zum Einfluss genomischer Kompartimente auf Nicht-Mendelsche Vererbung unter Nutzung von Hochdurchsatz-Sequenzierungsdaten N2 - More than a century ago the phenomenon of non-Mendelian inheritance (NMI), defined as any type of inheritance pattern in which traits do not segregate in accordance with Mendel’s laws, was first reported. In the plant kingdom three genomic compartments, the nucleus, chloroplast, and mitochondrion, can participate in such a phenomenon. High-throughput sequencing (HTS) proved to be a key technology to investigate NMI phenomena by assembling and/or resequencing entire genomes. However, generation, analysis and interpretation of such datasets remain challenging by the multi-layered biological complexity. To advance our knowledge in the field of NMI, I conducted three studies involving different HTS technologies and implemented two new algorithms to analyze them. In the first study I implemented a novel post-assembly pipeline, called Semi-Automated Graph-Based Assembly Curator (SAGBAC), which visualizes non-graph-based assemblies as graphs, identifies recombinogenic repeat pairs (RRPs), and reconstructs plant mitochondrial genomes (PMG) in a semiautomated workflow. We applied this pipeline to assemblies of three Oenothera species resulting in a spatially folded and circularized model. This model was confirmed by PCR and Southern blot analyses and was used to predict a defined set of 70 PMG isoforms. With Illumina Mate Pair and PacBio RSII data, the stoichiometry of the RRPs was determined quantitatively differing up to three-fold. In the second study I developed a post-multiple sequence alignment algorithm, called correlation mapping (CM), which correlates segment-wise numbers of nucleotide changes to a numeric ascertainable phenotype. We applied this algorithm to 14 wild type and 18 mutagenized plastome assemblies within the Oenothera genus and identified two genes, accD and ycf2 that may cause the competitive behavior of plastid genotypes as plastids can be biparental inherited in Oenothera. Moreover, lipid composition of the plastid envelope membrane is affected by polymorphisms within these two genes. For the third study, I programmed a pipeline to investigate a NMI phenomenon, known as paramutation, in tomato by analyzing DNA and bisulfite sequencing data as well as microarray data. We identified the responsible gene (Solyc02g0005200) and were able to fully repress its caused phenotype by heterologous complementation with a paramutation insensitive transgene of the Arabidopsis thaliana orthologue. Additionally, a suppressor mutant shows a globally altered DNA methylation pattern and carries a large deletion leading to a gene fusion involving a histone deacetylase. In conclusion, my developed and implemented algorithms and data analysis pipelines are suitable to investigate NMI and led to novel insights about such phenomena by reconstructing PMGs (SAGBAC) as a requirement to study mitochondria-associated phenotypes, by identifying genes (CM) causing interplastidial competition as well by applying a DNA/Bisulfite-seq analysis pipeline to shed light in a transgenerational epigenetic inheritance phenomenon. N2 - Vor mehr als einem Jahrhundert wurde über das Phänomen der Nicht-Mendelschen Vererbung (NMI), welche als jede Art von Vererbungsmuster definiert wird, in denen Eigenschaften nicht nach dem Mendelschen Gesetzen segregieren, zum ersten Mal berichtet. Im Pflanzenkönigreich können drei Zellkompartimente mit ihrem eigenen Erbgut, Nukleus, Chloroplast, und Mitochondrium, an einem solchen Phänomen beteiligt sein. Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologien (HTS) stellen nachweislich eine Schlüsseltechnologie dar, um NMI Phänomene durch die Assemblierung und/oder Resequenzierung von ganzen Genomen zu untersuchen. Jedoch bleibt die Generierung, Analyse sowie die Interpretation solcher Datensätze durch die vielschichtige biologische Komplexität weiterhin eine Herausforderung. Um unser Wissen über NMI zu erweitern habe ich drei Studien durchgeführt in denen unterschiedliche HTS Technologien involviert waren und zwei neue Algorithmen implementiert um sie zu analysieren. In der ersten Studie habe ich eine neue Postassemblierungspipeline mit dem Namen Semi-Automated Graph-Based Assembly Curator (SAGBAC) entwickelt, welche nicht Graphen-basierte Genomassemblierungen als Graphen visualisiert, rekombinierende Repeatpaare (RRP) identifiziert, und pflanzliche mitochondrielle Genome (PMG) in einem halb-automatisierten Prozess rekonstruiert. Wir haben diese Pipeline auf Assemblierungen von drei Oenothera Spezies angewandt, was in gefalteten zirkularisierten Modellen resultierte. Dieses Modell wurde durch PCR und Southern Blot Analysen bestätigt, sowie verwendet, um einen definierten Satz von 70 PMG Isoformen vorherzusagen. Mit Illumina Mate Pair und PacBio RSII Daten wurde die Stöchiometrie der RRPs quantitativ bestimmt, die sich bis zu dreifach unterscheiden. In der zweiten Studie habe ich einen post-Multiples Sequenzalignment Algorithmus mit dem Namen Correlation Mapping (CM) entwickelt, der eine segmentweise Anzahl von Nukleotidaustauschen mit numerisch erfassbaren Phänotypen korreliert. Wir haben diesen Algorithmus auf 14 Wildtypen und 18 mutagenisierte Plastomassemblierungen aus der Gattung Oenothera angewandt und konnten zwei Gene, accD und ycf2 identifizieren, welche für das kompetitive Verhalten von Plastid Genotypen verantwortlich ist. Weiterhin wird die Lipidkomposition der Plastid-Hüllmembranen durch Polymorphismen in den beiden Genen beeinflusst. Für die dritte Studie habe ich eine Pipeline programmiert, um ein NMI Phänomen, bekannt als Paramutation, in der Tomate mit Hilfe von DNA- und Bisulfitsequenzierungsdaten sowie Microarray Daten zu analysieren. Wir haben das verantwortliche Gen (Solyc02g005200) identifiziert und waren in der Lage den verursachenden Phänotyp durch eine heterologe Komplementation eines paramutationsinsensitiven Transgens des Orthologs aus Arabidopsis thaliana vollständig zu unterdrücken. Weiterhin konnten wir zeigen, dass eine Suppressormutante ein global verändertes DNA-Methylierungsmuster aufweist und es durch eine große Deletion zu einer Genfusion gekommen ist, an der eine Histon-Deacetylase beteiligt ist. Zusammenfassend sind meine entwickelten und implementierten Algorithmen und Datenanalysen geeignet, um NMI zu untersuchen und haben wie folgt zu neuen Einsichten über solche Phänomene verholfen: (a) durch die Rekonstruktion von PMGs (SAGBAC) als Voraussetzung um Mitochondrien-assoziierte Phänotypen zu studieren, (b) durch die Identifizierung von Genen (CM), welche interplastidäre Kompetition auslösen sowie (c) durch Anwendung einer DNA-/Bisulfit-seq Analysepipeline zur Beantwortung der Ursache eines transgenerational epigenetischen Vererbungsphänomens. KW - non-Mendelian inheritance KW - de novo assembly KW - mitochondria KW - chloroplasts KW - paramutation KW - next generation sequencing KW - bisulfite sequencing KW - plant research KW - Bisulfit Sequenzierung KW - Chloroplasten KW - De novo Assemblierung KW - Mitochondrien KW - Sequenzierungstechnologien der nächsten Generation KW - nicht-Mendelsche Vererbung KW - Paramutation KW - Pflanzenforschung Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-549001 ER -