TY - THES A1 - Stiegler, Jonas T1 - Mobile link functions in unpredictable agricultural landscapes N2 - Animal movement is a crucial aspect of life, influencing ecological and evolutionary processes. It plays an important role in shaping biodiversity patterns, connecting habitats and ecosystems. Anthropogenic landscape changes, such as in agricultural environments, can impede the movement of animals by affecting their ability to locate resources during recurring movements within home ranges and, on a larger scale, disrupt migration or dispersal. Inevitably, these changes in movement behavior have far-reaching consequences on the mobile link functions provided by species inhabiting such extensively altered matrix areas. In this thesis, I investigate the movement characteristics and activity patterns of the European hare (Lepus europaeus), aiming to understand their significance as a pivotal species in fragmented agricultural landscapes. I reveal intriguing results that shed light on the importance of hares for seed dispersal, the influence of personality traits on behavior and space use, the sensitivity of hares to extreme weather conditions, and the impacts of GPS collaring on mammals' activity patterns and movement behavior. In Chapter I, I conducted a controlled feeding experiment to investigate the potential impact of hares on seed dispersal. By additionally utilizing GPS data of hares in two contrasting landscapes, I demonstrated that hares play a vital role, acting as effective mobile linkers for many plant species in small and isolated habitat patches. The analysis of seed intake and germination success revealed that distinct seed traits, such as density, surface area, and shape, profoundly affect hares' ability to disperse seeds through endozoochory. These findings highlight the interplay between hares and plant communities and thus provide valuable insights into seed dispersal mechanisms in fragmented landscapes. By employing standardized behavioral tests in Chapter II, I revealed consistent behavioral responses among captive hares while simultaneously examining the intricate connection between personality traits and spatial patterns within wild hare populations. This analysis provides insights into the ecological interactions and dynamics within hare populations in agricultural habitats. Examining the concept of animal personality, I established a link between personality traits and hare behavior. I showed that boldness, measured through standardized tests, influences individual exploration styles, with shy and bold hares exhibiting distinct space use patterns. In addition to providing valuable insights into the role of animal personality in heterogeneous environments, my research introduced a novel approach demonstrating the feasibility of remotely assessing personality types using animal-borne sensors without additional disturbance of the focal individual. While climate conditions severely impact the activity and, consequently, the fitness of wildlife species across the globe, in Chapter III, I uncovered the sensitivity of hares to temperature, humidity, and wind speed during their peak reproduction period. I found a strong response in activity to high temperatures above 25°C, with a particularly pronounced effect during temperature extremes of over 35°C. The non-linear relationship between temperature and activity was characterized by contrasting responses observed for day and night. These findings emphasize the vulnerability of hares to climate change and the potential consequences for their fitness and population dynamics with the ongoing rise of temperature. Since such insights can only be obtained through capturing and tagging free-ranging animals, I assessed potential impacts and the recovery process post-collar attachment in Chapter IV. For this purpose, I examined the daily distances moved and the temporal-associated activity of 1451 terrestrial mammals out of 42 species during their initial tracking period. The disturbance intensity and the speed of recovery varied across species, with herbivores, females, and individuals captured and collared in relatively secluded study areas experiencing more pronounced disturbances due to limited anthropogenic influences. Mobile linkers are essential for maintaining biodiversity as they influence the dynamics and resilience of ecosystems. Furthermore, their ability to move through fragmented landscapes makes them a key component for restoring disturbed sites. Individual movement decisions determine the scale of mobile links, and understanding variations in space use among individuals is crucial for interpreting their functions. Climate change poses further challenges, with wildlife species expected to adjust their behavior, especially in response to high-temperature extremes, and comprehending the anthropogenic influence on animal movements will remain paramount to effective land use planning and the development of successful conservation strategies. This thesis provides a comprehensive ecological understanding of hares in agricultural landscapes. My research findings underscore the importance of hares as mobile linkers, the influence of personality traits on behavior and spatial patterns, the vulnerability of hares to extreme weather conditions, and the immediate consequences of collar attachment on mammalian movements. Thus, I contribute valuable insights to wildlife conservation and management efforts, aiding in developing strategies to mitigate the impact of environmental changes on hare populations. Moreover, these findings enable the development of methodologies aimed at minimizing the impacts of collaring while also identifying potential biases in the data, thereby benefiting both animal welfare and the scientific integrity of localization studies. N2 - Die Bewegung von Tieren ist ein entscheidender Aspekt des Lebens, der ökologische und evolutionäre Prozesse beeinflusst. Sie spielt eine wichtige Rolle bei der Gestaltung der biologischen Vielfalt und verbindet Lebensräume und Ökosysteme miteinander. Anthropogene Landschaftsveränderungen, z.B. in der Landwirtschaft, können die Bewegung von Tieren behindern, indem sie ihre Fähigkeiten beeinträchtigen, Ressourcen innerhalb ihres täglichen Bewegungsradius zu lokalisieren und im größeren Maßstab, ihre Wanderung oder Ausbreitung limitieren. In dieser Thesis untersuche ich die Bewegungsmerkmale und Aktivitätsmuster des Feldhasen (Lepus europaeus), um seine Bedeutung als Schlüsselart in fragmentierten Agrarlandschaften zu verstehen. Ich lege faszinierende Ergebnisse vor, die die Bedeutung des Hasen für die Verbreitung von Saatgut, den Einfluss von Persönlichkeitsmerkmalen auf das Verhalten und die Raumnutzung, die Sensibilität des Hasen gegenüber extremen Witterungsbedingungen und die Auswirkungen von GPS-Empfängern auf die Aktivitätsmuster und das Bewegungsverhalten der Säugetiere beleuchten. In Kapitel I führte ich ein kontrolliertes Fütterungsexperiment durch, um den potenziellen Einfluss von Hasen auf die Samenausbreitung zu analysieren. Durch die zusätzliche Verwendung von GPS-Daten von Hasen in zwei kontrastierenden Landschaften konnte ich nachweisen, dass Hasen eine wichtige Rolle spielen, da sie in kleinen und isolierten Habitatfeldern als effektive mobile Verbindungsglieder für viele Pflanzenarten fungieren. Die Analyse der Samenaufnahme und des Keimungserfolgs zeigte, dass verschiedene Eigenschaften der Samen, wie Dichte, Oberfläche und Form, die Fähigkeit der Hasen, Samen durch Endozoochorie zu verbreiten, stark beeinflussen. Diese Ergebnisse verdeutlichen die Wechselwirkung zwischen Hasen und Pflanzengemeinschaften und liefern somit wertvolle Erkenntnisse über die Mechanismen der Samenverbreitung in fragmentierten Landschaften. Durch den Einsatz standardisierter Verhaltenstests in Kapitel II konnte ich konsistente Verhaltensreaktionen bei in Gefangenschaft lebenden Hasen aufdecken und zeitgleich den komplexen Zusammenhang zwischen Persönlichkeitsmerkmalen und räumlichen Mustern in Wildhasenpopulationen untersuchen. Diese Analyse bietet Einblicke in die ökologischen Interaktionen und die Dynamik von Hasenpopulationen in landwirtschaftlichen Lebensräumen. Indem ich das Konzept der Tierpersönlichkeit untersuchte, stellte ich eine Verbindung zwischen Persönlichkeitsmerkmalen und dem Verhalten von Hasen her. Ich habe gezeigt, dass die durch standardisierte Tests gemessene Kühnheit den individuellen Erkundungsstil beeinflusst, wobei schüchterne und kühne Hasen unterschiedliche Raumnutzungsmuster aufweisen. Meine Forschung liefert nicht nur wertvolle Einblicke in die Rolle der Tierpersönlichkeit in heterogenen Umgebungen, sondern stellt auch einen neuartigen Ansatz vor, der die Durchführbarkeit einer Fernbeurteilung von Persönlichkeitstypen mithilfe von am Tier angebrachten Sensoren ohne zusätzliche Störung des Zielindividuums demonstrierte. Da die Klimabedingungen die Aktivität und folglich die Fitness von Wildtierarten auf der ganzen Welt stark beeinflussen, habe ich in Kapitel III die Sensibilität von Hasen gegenüber Temperatur, Luftfeuchtigkeit und Windgeschwindigkeit während ihrer Hauptfortpflanzungszeit ermittelt. Ich stellte fest, dass die Aktivität stark auf hohe Temperaturen über 25 °C reagiert, wobei die Auswirkungen bei extremen Temperaturen von über 35 °C besonders ausgeprägt sind. Die nicht lineare Beziehung zwischen Temperatur und Aktivität war durch gegensätzliche Reaktionen bei Tag und Nacht gekennzeichnet. Diese Ergebnisse unterstreichen die Anfälligkeit der Hasen für den Klimawandel und die möglichen Folgen für ihre Fitness und Populationsdynamik bei einem anhaltenden Temperaturanstieg. Da solche Erkenntnisse nur durch Fangen und Besendern von Wildtieren ermöglicht werden können, habe ich in Kapitel IV die potenziellen negativen Auswirkungen auf das Individuuum, sowie den Erholungsprozess nach dem Anlegen des Halsbandes untersucht. Hierfür analysierte ich die zurückgelegten täglichen Entfernungen in Verbindung mit der Aktivität von 1451 terrestrischen Säugetieren aus 42 verschiedenen Arten während ihrer anfänglichen Verfolgung. Die Intensität der Störung sowie die Geschwindigkeit der Erholung variieren je nach Art, wobei Pflanzenfresser, Weibchen und Individuen, die in relativ abgelegenen Untersuchungsgebieten gefangen und mit Halsbändern versehen wurden, aufgrund bisher begrenzter anthropogener Einflüsse stärkere Störungen erfahren. Mobile Verbindungsglieder sind essentiell für die Erhaltung der Biodiversität, indem sie eine wichtige Rolle in der Dynamik und Resilienz von Ökosystemen spielen. Weiterhin macht ihre Fähigkeit, sich durch zerstückelte Landschaften zu bewegen sie zu wichtigen Schlüsselkomponenten bei der Wiederherstellung von zerstörten Landschaften. Individuelle Bewegungsentscheidungen bestimmen den Maßstab der mobilen Verbindungen und die Schwankungen der Raumnutzung unter Individuen zu verstehen ist unerlässlich, um deren Funktion zu interpretieren. Der Klimawandel stellt eine weitere Herausforderung dar, indem Wildtiere dazu gezwungen werden, sich zu adaptieren, insbesondere an Hochtemperatur-Extreme. Den anthropogenen Einfluss auf Tierbewegungen aufzudecken bleibt von größter Bedeutung in der Landnutzungsplanung und die Entwicklung von erfolgreichen Strategien zum Schutz der Natur. Diese Thesis liefert ein umfassendes ökologisches Verständnis von Feldhasen in Agrarlandschaften. Die Ergebnisse meiner Forschung unterstreichen die Bedeutung von Hasen als mobile Bindeglieder, den Einfluss von Persönlichkeitsmerkmalen auf Verhalten und räumliche Muster, die Anfälligkeit von Hasen gegenüber extremen Wetterbedingungen und die unmittelbaren Folgen der Halsbandanbringung auf Tierbewegungen. Damit leiste ich einen wertvollen Beitrag zum Schutz und zur Bewirtschaftung von Wildtieren, indem ich die Entwicklung von Strategien zur Abschwächung der Auswirkungen von Umweltveränderungen auf Hasenpopulationen unterstütze. Darüber hinaus ermöglichen diese Erkenntnisse die Entwicklung von Methoden, die darauf abzielen, die Folgen der Halsbandanbringung zu minimieren und gleichzeitig potenzielle Verzerrungen in den Daten zu identifizieren, was sowohl dem Tierschutz als auch der wissenschaftlichen Integrität von Lokalisierungsstudien zugutekommt. KW - European hare KW - mammals KW - ecology KW - animal personality KW - seed dispersal KW - movement ecology KW - tracking impacts KW - energy budget KW - climate change KW - accelerometry KW - GPS KW - tracking KW - Feldhase KW - GPS KW - Beschleunigungsmessungen KW - Tierpersönlichkeit KW - Klimawandel KW - Tierökologie KW - Energiebudget KW - Säugetiere KW - Bewegungsökologie KW - Samenausbreitung KW - Tierortung KW - Konsequenzen von Fang und Besenderung Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-622023 ER - TY - THES A1 - Yildiz, Tugba T1 - Dissecting the role of the TusA protein for cell functionality and FtsZ ring assembly in Escherichia coli T1 - Entschlüsselung der Rolle des TusA-Proteins für die Zellfunktionalität und FtsZ-Ringbildung in Escherichia coli N2 - In this work, the role of the TusA protein was investigated for the cell functionality and FtsZ ring assembly in Escherichia coli. TusA is the tRNA-2-thiouridine synthase that acts as a sulfur transferase in tRNA thiolation for the formation of 2-thiouridine at the position 34 (wobble base) of tRNALys, tRNAGlu and tRNAGln. It binds the persulfide form of sulfur and transfers it to further proteins during mnm5s2U tRNA modification at wobble position and for Moco biosynthesis. With this thiomodification of tRNA, the ribosome binding is more efficient and frameshifting is averted during the protein translation. Previous studies have revealed an essential role of TusA in bacterial cell physiology since deletion of the tusA gene resulted in retarded growth and filamentous cells during the exponential growth phase in a rich medium which suddenly disappeared during the stationary phase. This indicates a problem in the cell division process. Therefore the focus of this work was to investigate the role of TusA for cell functionality and FtsZ ring formation and thus the cell separation. The reason behind the filamentous growth of the tusA mutant strain was investigated by growth and morphological analyses. ΔtusA cells showed a retarded growth during the exponential phase compared to the WT strain. Also, morphological analysis of ΔtusA cells confirmed the filamentous cell shape. The growth and cell division defects in ΔtusA indicated a defect in FtsZ protein as a key player of cell division. The microscopic investigation revealed that filamentous ΔtusA cells possessed multiple DNA parts arranged next to each other. This suggested that although the DNA replication occurred correctly, there was a defect in the step where FtsZ should act; probably FtsZ is unable to assemble to the ring structure or the assembled ring is not able to constrict. All tested mutant strains (ΔtusD, ΔtusE and ΔmnmA) involved in the mnm5s2U34 tRNA modification pathway shared the similar retarded growth and filamentous cell shape like ΔtusA strain. Thus, the cell division defect arises from a defect in mnm5s2U34 tRNA thiolation. Since the FtsZ ring formation was supposed to be defective in filaments, a possible intracellular interaction of TusA and FtsZ was examined by fluorescent (EGFP and mCherry) fusion proteins expression and FRET. FtsZ expressing tusA mutant (DE3) cells showed a red mCherry signal at the cell poles, indicating that FtsZ is still in the assembling phase. Interestingly, the cellular region of EGFP-TusA fusion protein expressed in ΔtusA (DE3) was conspicuous; the EGFP signal was spread throughout the whole cell and, in addition, a slight accumulation of the EGFP-TusA fluorescence was detectable at the cell poles, the same part of the cell as for mCherry-FtsZ. Thus, this strongly suggested an interaction of TusA and FtsZ. Furthermore, the cellular FtsZ and Fis concentrations, and their change during different growth phases were determined via immunoblotting. All tested deletion strains of mnm5s2U34 tRNA modification show high cellular FtsZ and Fis levels in the exponential phase, shifting to the later growth phases. This shift reflects the retarded growth, whereby the deletion strains reach later the exponential phase. Conclusively, the growth and cell division defect, and thus the formation of filaments, is most likely caused by changes in the cellular FtsZ and Fis concentrations. Finally, the translation efficiencies of certain proteins (RpoS, Fur, Fis and mFis) in tusA mutant and in additional gene deletion strains were studied whether they were affected by using unmodified U34 tRNAs of Lys, Glu and Gln. The translation efficiency is decreased in mnm5s2U34 tRNA modification-impaired strains in addition to their existing growth and cell division defect due to the elimination of these three amino acids. Finally, these results confirm and reinforce the importance of Lys, Glu and Gln and the mnm5s2U34 tRNA thiolation for efficient protein translation. Thus, these findings verify that the translation of fur, fis and rpoS is regulated by mnm5s2U34 tRNA modifications, which is growth phase-dependent. In total, this work showed the importance of the role of TusA for bacterial cell functionality and physiology. The deletion of the tusA gene disrupted a complex regulatory network within the cell, that most influenced by the decreased translation of Fis and RpoS, caused by the absence of mnm5s2U34 tRNA modifications. The disruption of RpoS and Fis cellular network influences in turn the cellular FtsZ level in the early exponential phase. Finally, the reduced FtsZ concentration leads to elongated, filamentous E. coli cells, which are unable to divide. N2 - In dieser Arbeit wurde die Rolle des TusA-Proteins für die Zellfunktionalität und FtsZ-Ringbildung in Escherichia coli untersucht. Bei TusA handelt es sich um die tRNA-2-Thiouridine-Synthase, die als Schwefeltransferase bei der tRNA-Thiolierung zur Bildung von 2-Thiouridin an der Position 34 (Wobble-Base) von tRNALys, tRNAGlu und tRNAGln dient. Dieses Protein bindet das Schwefelatom als Persulfid und überträgt dieses bei der mnm5s2U tRNA-Modifikation an der Wobble-Position und der Molybdän-Cofaktor (Moco)-Biosynthese auf weitere Proteine. Durch diese Thiomodifikation der tRNA wird eine effizientere Bindung des Ribosoms erreicht und zudem eine Verschiebung des Leserasters während der Proteintranslation verhindert. Frühere Studien haben eine essenzielle Rolle für TusA in der bakteriellen Zellphysiologie gezeigt: die Deletion des tusA-Gens führte zu einem verlangsamten Wachstum und filamentösen (fadenförmigen) Zellen als WT-Zellen während der exponentiellen Wachstumsphase in einem reichhaltigen Medium. In der stationären Phase waren diese Filamente hingegen nicht mehr zu beobachten, was auf einen Defekt während der Zellteilung hindeutete. Ziel dieser Arbeit war es daher die Rolle des TusA-Proteins für die Zellfunktionalität und FtsZ-Ringbildung zu analysieren. Im Rahmen der vorliegenden Doktorarbeit wurde die Ursache für das filamentöse Wachstum der tusA-Mutante untersucht. Dafür wurden Wachstums- und Morphologieanalysen durchgeführt. Die ΔtusA-Zellen zeigten im Vergleich zum WT-Stamm ein verzögertes Wachstum in der exponentiellen Phase. Die filamentöse Zellform der ΔtusA-Zellen wurde ebenfalls durch die Analyse der Zellmorphologie bestätigt. Demnach deutete das Wachstums- und Zellteilungsproblem von ΔtusA auf einen Defekt des FtsZ-Proteins hin, das eine Schlüsselrolle bei der Zellteilung besitzt. Anhand von mikroskopischen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die filamentöse ΔtusA-Zellen mehrere nebeneinander angeordnete DNA-Abschnitte besaßen. Dies ließ die Vermutung zu, dass trotz korrekt verlaufender DNA-Replikation, ein Defekt in dem Schritt, in dem FtsZ einsetzen sollte, vorliegt. Folglich scheint FtsZ sich nicht zur Ringstruktur anordnen zu können. Denkbar wäre auch, dass der zusammengesetzte Ring nicht in der Lage ist zu kontrahieren. Alle getesteten Mutantenstämme (ΔtusD, ΔtusE und ΔmnmA), die an der mnm5s2U34-Modifikation beteiligt sind, zeigten ein ähnlich verzögertes Wachstum und eine ähnliche filamentöse Zellform wie der ΔtusA-Stamm. Somit ist der Zellteilungsdefekt auf einen Defekt in der mnm5s2U34-tRNA-Thiolierung zurückzuführen. Des Weiteren wurde eine mögliche intrazelluläre Interaktion von TusA und FtsZ anhand der Expression von fluoreszierender (EGFP und mCherry) Fusionsproteine und FRET-Analysen überprüft, da die Bildung des FtsZ-Rings in den Filamenten defekt zu sein scheint. Für FtsZ-exprimierende tusA (DE3)-Zellen wurden rote mCherry-Signale an den Zellpolen detektiert, was auf das sich noch assemblierende FtsZ hindeutete. Interessanterweise war die zelluläre Region des EGFP-TusA Signals, das in ΔtusA (DE3) exprimiert wurde, überlappend mit dem von mCherry-FtsZ. Das EGFP-Signal zeigte eine Verteilung über die gesamte Zelle, wobei noch zusätzlich eine leichte Akkumulation der EGFP-TusA-Fluoreszenz an den Zellpolen (wie bei mCherry-FtsZ) festgestellt wurde. Somit deutet dies auf eine Interaktion zwischen TusA und FtsZ hin. Zusätzlich wurden die FtsZ- und Fis-Konzentrationen und deren Änderung während der unterschiedlichen Wachstumsphasen anhand von Immunoblot-Analysen ermittelt. Alle getesteten Deletionsstämme der mnm5s2U34-tRNA-Modifikation zeigten hohe zelluläre FtsZ- und Fis-Mengen in der exponentiellen Phase, die in die späteren Wachstumsphasen verschoben sind. Diese Verschiebung spiegelt das verlangsamte Wachstum wider, wodurch die Deletionsstämme später die exponentielle Phase erreichen. Demzufolge ist anzunehmen, dass der Wachstums- und Zellteilungsdefekt und daraus die Bildung von Filamenten durch Veränderungen der zellulären FtsZ- und Fis-Konzentrationen verursacht werden. Abschließend wurde in dieser Arbeit mittels Durchflusszytometrie die Translationseffizienz bestimmter Proteine (RpoS, Fur, Fis und mFis) in ΔtusA und zusätzlichen Gendeletionsstämmen untersucht. Insbesondere sollte gezeigt werden, ob die Translation der Proteine durch die Verwendung von unmodifizierten U34-tRNAs für Lys, Glu und Gln beeinträchtigt wird. Somit ist die Translationseffizienz in den Stämmen mit beeinträchtigter mnm5s2U34-tRNA-Modifikation verringert, was zusätzlich zu ihren bereits bestehenden Wachstums- und Zellteilungsdefekten aufgrund der Eliminierung dieser drei Aminosäuren hinzukommt. Damit bestätigen und verstärken diese Ergebnisse die Bedeutung von Lys, Glu und Gln und der mnm5s2U34 tRNA-Thiolierung für eine effiziente Proteintranslation. Sie belegen auch, dass die Translation von fur, fis und rpoS durch die mnm5s2U34-tRNA-Modifikation reguliert wird, welche wachstumsphasenabhängig ist. Im Résumé zeigen die Ergebnisse dieser Forschungsarbeit neue Funktionen des TusA-Proteins für die Funktionalität und Physiologie von Bakterienzellen. Durch die Deletion des tusA-Gens wurde ein komplexes regulatorisches Netzwerk innerhalb der Zelle gestört, das vor allem durch die verringerte Translation von Fis und RpoS beeinflusst wird (die durch das Fehlen der mnm5s2U34-tRNA-Modifikation verursacht wird). Die Unterbrechung des zellulären RpoS- und Fis-Netzwerks beeinflusst wiederum die zelluläre FtsZ-Menge in der frühen exponentiellen Phase. Schließlich führt diese Verringerung der FtsZ-Konzentration zu filamentösen E. coli-Zellen, die sich nicht mehr teilen können. KW - tRNA thiomodifications KW - 5-methylaminomethyl-2-thiouridine KW - TusA KW - growth defect KW - cell division KW - FtsZ KW - FtsZ ring assemby KW - RpoS KW - Fis KW - translation efficiency KW - tRNA Thiomodifikation KW - 5-Methylaminomethyl-2-Thiouridin KW - TusA KW - Zellteilungsdefekt KW - Zellteilung KW - FtsZ-Ringbildung KW - Translationseffizienz KW - filaments KW - Filamente Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-617135 ER - TY - THES A1 - Sureshkumar, Priyavathi T1 - Erweiterung der zellbasierten Calcium-Imaging-Methode im eukaryotischen zellfreien Proteinsynthese-System für die transient-receptor-potential (TRP) - Ionenkanäle N2 - Die Fluoreszenz-Calcium-Imaging-Methode wird auch heute noch als gängige Methode verwendet, vor allem wegen der geringeren Kosten für das Wirkstoffscreening in der pharmazeutischen Forschung, wobei Ionenkanäle sowie einige der G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) die Mehrzahl der Wirkstoffziele ansprechen. Die zellfreie Synthese eukaryotischer Proteine hat nicht die Nachteile, die bei der Überexpression dieser ionenpermeablen Proteine in Zellen auftreten können, wie z. B. Zelltoxizität, geringere Proteinexpression und die Beseitigung der exprimierten Proteine aufgrund veränderter Domänen sowie die zeitaufwändige Pflege von Zelllinien. Die Synthese von Ionenkanälen in zellfreien Proteinsyntheseplattformen für das künftige Wirkstoffscreening ist noch in der Grundlagenforschung. Obwohl die Fluoreszenz-Calcium-Imaging-Methode in zellbasierten Assays weit verbreitet ist, wurde diese Methode bisher noch nicht in zellfreien Proteinexpressionssystemen verwendet. Insgesamt ist die neue Anwendung der Calcium-Imaging-Methode in eukaryontischen zellfreien Systemen eine Voraussetzung für die schnelle pharmakologische Analyse von Wirkstoffen. Das erste Ziel dieser wissenschaftlichen Arbeit bestand darin, die grundlegenden Prinzipien der Calcium-Imaging-Methode zur Untersuchung von Ionenkanälen in zellbasierten Systemen zu untersuchen. Hierfür wurden zwei Tumorzelllinien des Auges verwendet, und zwar benigne Pterygiumzellen und maligne Aderhautmelanom 92.1 Zellen. In diesen Studien wurde die Interaktion zwischen den nativ überexprimierten transient-receptor-potential-Ionenkanälen (TRPs) wie TRP Vanilliod 1 (TRPV1) (Capsaicinrezeptor) und TRP Melastatin 8 (TRPM8) (Mentholrezeptor) in diesen Tumorzellen nach Zugabe von verschiedenen Medikamenten und Hormonen untersucht. Das zweite Ziel dieser Arbeit war es, den Calcium-Mechanismus von GPCRs in den Zellen zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurde Mas, ein GPCR und Angiotensin (1-7) -Hormonrezeptor, aus dem renin-angiotensin-aldosteron-system (RAAS) in der Human Embryonic Kidney-293 (HEK293) Zelllinie überexprimiert. In dieser Studie wurden insbesondere die Aktivierung klassischer GPCR-Signalwege wie Phospholipase C und Proteinkinase C durch Angiotensin-(1-7) über Mas und die Beteiligung von TRP-Kanälen nachgewiesen. Die zellbasierte-Calcium-Imaging-Methode für chemische Calcium-Indikatoren ließ sich aufgrund der Anwesenheit einer großen Menge cytosolischer Carboxylesterasen gut anwenden. Carboxylesterase ist das wichtigste Enzym in der Calcium Imaging Methode, das die Verarbeitung chemischen Calcium-Farbstoffe behandelt. Dieses Enzym fehlt jedoch in Mikrosomen, die als Basismembran für die Integration synthetisierter Ionenkanäle in eukaryontischen zellfreien Systemen verwendet werden. Das dritte Ziel dieser Forschungsarbeit war die Umsetzung der zellbasierten Calcium-Imaging Methode und der Calcium-Signalwege in zellfreie Systeme. Hier wurde die zellfrei synthetisierte Carboxylesterase in Mikrosomen von Spodoptera frugiperda (Sf21) als praktikables Calcium-Imaging-Werkzeug etabliert, um sowohl native ionenpermeable Proteine als auch zellfrei-synthetisierte Ionenkanäle zu untersuchen. Die Enzymaktivität der zellfrei-synthetisierten Carboxylesterase in Mikrosomen wurde durch Esterase-Assays und den Calcium-Fluoreszenzfarbstoff Fluo-5N Acetoxymethylester (Fluo-5N AM) Belastungstests nachgewiesen. Das Calcium-Imaging der nativ vorhandenen Ca2+-ATPase des sarkoplasmatischen/endoplasmatischen Retikulums (SERCA) und der Ryanodin-Rezeptoren (RyR) in den Mikrosomen sowie der zell-frei exprimierten TRP-Ionenkanäle wurden mit dem Fura-5N-AM- Fluoreszenzfarbstoff in mit Carboxylesterase vorsynthetisierten Mikrosomen nachgewiesen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Prinzip der zellbasierten Calcium-Imaging -Methode vielversprechend an das eukaryotische zellfreie Sf21-System angepasst werden konnte, um Ionenkanäle zu analysieren. Nach entsprechender Forschung könnte die etablierte Methode in Zukunft auch auf andere Membranproteine ausgeweitet werden. Dies umfasst die Untersuchung anderer zell-frei exprimierte GPCRs oder anderer Ionenkanäle wie Kalium-, Natrium- und Chlorid-Ionenkanäle. N2 - Fluorescence calcium imaging is still used today used as the common method, mainly due to its cheaper costs for drug screening in pharmaceutical research encompassing both ion channels, and part of G- Protein Coupled Receptors (GPCRs) in the major share of drug targets. Eukaryotic cell-free protein translation overcomes several drawbacks that might occur for overexpression of these ion-permeable proteins in the cells such as cell toxicity, poor protein expression, and deletion due to modified protein domain and time-consuming cell line maintenance. Expressing ion channels in the cell-free protein synthesis platform for future drug screening processes is still ongoing basic research and so far, no calcium imaging technique for cell-free expressed ion channels is available. Taken together, the novel application of the fluorescence calcium imaging method in eukaryotic cell-free systems is a prerequisite for rapid pharmacological drug investigations, which are not feasible using conventional call-based approaches. The aim of this thesis is to investigate the common calcium signaling pathways relevant to drug research via ion channels and GPCRs in cell-based systems. Thereby, the basic mechanism of the cell-based calcium imaging for chemical calcium indicators is studied and then translate its principle to the cell-free protein synthesis platforms. In order to study the cell-based calcium imaging and calcium pathways, two types of eye tumor cell-based models, namely benign pterygial tumor cells and malign uveal melanoma 92.1 cells were used. Specifically, the interplay between the natively expressed Transient Receptor Potential Channels (TRPs) like TRP-Vanilloid 1 (TRPV1) (Capsaicin receptor) and TRP-Melastatin 8 (TRPM8) (Menthol receptor) in these tumor cells was investigated by application of various drugs and hormones. The second aim of this thesis was to investigate the cell-based calcium mechanism of GPCRs. For this, overexpressed Mas, a GPCR and Angiotensin-(1-7) hormone receptor, from the Renin Angiotensin Aldosterone System (RAAS) in the Human Embryonic Kidney (HEK293) cells was used. Particularly, the activation of classical GPCR pathways like Phospholipase C and Proteinkinase C via Ang-(1-7) through Mas and the involvement of TRPs was proven in this study. The third aim of this thesis is to translate the cell-based calcium imaging principle to cell-free systems. Cell-based calcium imaging for chemical calcium indicators could be performed with all ease due to the presence of a large amount of cytosolic carboxylesterase, the crucial enzyme which handles the chemical calcium dyes. But this enzyme is absent in microsomes. Microsomes are used as a backbone membrane to integrate the synthesized ion channels in a eukaryotic cell-free system. Cell-free synthesized carboxylesterase in Spodoptera frugiperda (Sf21) microsomes is established as a viable calcium imaging tool to study both natively present ion permeable proteins and cell-free synthesized ion channels. The enzyme activity of the carboxylesterase in microsomes was confirmed by esterase assays and fluorescent calcium dye Fluo-5N Acetoxymethylester (Fluo-5N AM) loading assays. Fluorescent calcium imaging of natively present SERCA (Sarco Endoplasmic Reticulum Calcium ATPase) and ryanodine channels in the microsomes and cell-free expressed TRPV1 channel was demonstrated using Fluo-5N AM fluorescent dye in carboxylesterase pre-synthesized microsomes. With adequate research in future, the established method could be promisingly extended to study other cell-free expressed GPCRs or other ion channels like potassium, sodium, and chloride ion channels. KW - zellfreie Proteinsynthese KW - Calcium-Imaging KW - transient-receptor-potential-Ionenkanäle KW - calcium imaging KW - transient receptor potential ion channels KW - cell-free protein synthesis Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-619872 ER - TY - THES A1 - Calderón Quiñónez, Ana Patricia T1 - Ecology and conservation of the jaguar (Panthera onca) in Central America T1 - Ökologie und Schutz des Jaguars (Panthera onca) in Mittelamerika N2 - Conservation of the jaguar relies on holistic and transdisciplinary conservation strategies that integratively safeguard essential, connected habitats, sustain viable populations and their genetic exchange, and foster peaceful human-jaguar coexistence. These strategies define four research priorities to advance jaguar conservation throughout the species’ range. In this thesis I provide several relevant ecological and sociological insights into these research priorities, each addressed in a separate chapter. I focus on the effects of anthropogenic landscapes on jaguar habitat use and population gene flow, spatial patterns of jaguar habitat suitability and functional population connectivity, and on innovative governance approaches which can work synergistically to help achieve human-wildlife conviviality. Furthermore, I translate these insights into recommendations for conservation practice by providing tools and suggestions that conservation managers and stakeholders can use to implement local actions but also make broad scale conservation decisions in Central America. In Chapter 2, I model regional habitat use of jaguars, producing spatially-explicit maps for management of key areas of habitat suitability. Using an occupancy model of 13-year-camera-trap occurrence data, I show that human influence has the strongest impact on jaguar habitat use, and that Jaguar Conservation Units are the most important reservoirs of high quality habitat in this region. I build upon these results by zooming in to an area of high habitat suitability loss in Chapter 3, northern Central America. Here I study the drivers of jaguar gene flow and I produce spatially-explicit maps for management of key areas of functional population connectivity in this region. I use microsatellite data and pseudo-optimized multiscale, multivariate resistance surfaces of gene flow to show that jaguar gene flow is influenced by environmental, and even more strongly, by human influence variables; and that the areas of lowest gene flow resistance largely coincide with the location of the Jaguar Conservation Units. Given that human activities significantly impact jaguar habitat use and gene flow, securing viable jaguar populations in anthropogenic landscapes also requires fostering peaceful human-wildlife coexistence. This is a complex challenge that cannot be met without transdisciplinary academic research and cross-sectoral, collaborative governance structures that effectively respond to the multiple challenges of such coexistence. With this in mind, I focus in Chapter 4 on carnivore conservation initiatives that apply transformative governance approaches to enact transformative change towards human-carnivore coexistence. Using the frameworks of transformative biodiversity governance and convivial conservation, I highlight in this chapter concrete pathways, supported by more inclusive, democratic forms of conservation decision-making and participation that promote truly transformative changes towards human-jaguar conviviality. N2 - Die Erhaltung des Jaguars beruht auf ganzheitlichen und transdisziplinären Erhaltungsstrategien, die wesentliche, zusammenhängende Lebensräume schützen, lebensfähige Populationen und deren genetischen Austausch erhalten und die friedliche Koexistenz von Mensch und Jaguar fördern. Diese Strategien werden durch die vier Forschungsprioritäten veranschaulicht, die den Schutz des Jaguars im gesamten Verbreitungsgebiet der Art vorantreiben sollen. In dieser Arbeit möchte ich die Forschung zum Schutz des Jaguars vorantreiben, indem ich mehrere relevante ökologische und soziologische Einblicke in diese Forschungsschwerpunkte gebe, die jeweils in einem eigenen Kapitel behandelt werden. Ich konzentriere mich auf die Auswirkungen anthropogener Landschaften auf die Lebensraumnutzung von Jaguaren und den Genfluss in der Population, auf räumliche Muster der Lebensraumeignung von Jaguaren und die funktionale Konnektivität von Populationen sowie auf innovative Governance-Ansätze, die synergetisch wirken können, um die Konvivenz zwischen Mensch und Wildtier zu fördern. Darüber hinaus setze ich diese Erkenntnisse in Empfehlungen für die Naturschutzpraxis um, indem ich konkrete Instrumente und Vorschläge für Maßnahmen anbiete, die Naturschutzmanager und Interessenvertreter nutzen können, um lokale Maßnahmen umzusetzen, aber auch um weitreichende Naturschutzentscheidungen in Zentralamerika zu treffen. In Kapitel 2 modelliere ich die regionale Lebensraumnutzung von Jaguaren und erstelle räumlich explizite Karten für das Management von Schlüsselgebieten mit geeigneter Lebensraumnutzung. Mithilfe eines Habitatmodells basierend auf 13-Jahres-Kamerfangdaten-Studien zeige ich, dass der menschliche Einfluss die stärkste Auswirkung auf die Lebensraumnutzung von Jaguaren hat und dass die Jaguar-Schutzgebiete die wichtigsten Reservoirs für hochwertige Lebensräume in dieser Region sind. Auf diesen Ergebnissen baue ich auf, indem ich in Kapitel 3 ein Gebiet mit einem hohen Verlust an Lebensraumeignung, das nördliche Mittelamerika, näher betrachte. Hier untersuche ich die Triebkräfte des Genflusses bei Jaguaren und erstelle räumlich explizite Karten für das Management von Schlüsselgebieten mit funktionaler Populationskonnektivität in dieser Region. Ich verwende Mikrosatellitendaten und pseudo-optimierte multiskalige, multivariate Widerstandsflächen des Genflusses, um zu zeigen, dass der Genfluss von Jaguaren durch Umweltvariablen und noch stärker durch menschliche Einflussfaktoren beeinflusst wird und dass die Gebiete mit dem geringsten Genflusswiderstand weitgehend mit den Standorten der Jaguar-Schutzgebiete übereinstimmen. Da sich menschliche Aktivitäten erheblich auf die Lebensraumnutzung der Jaguare und den Genfluss auswirken, ist für die Sicherung lebensfähiger Jaguarpopulationen in anthropogenen Landschaften auch die Förderung einer friedlichen Koexistenz von Mensch und Wildtieren erforderlich. Dies ist eine komplexe Herausforderung, die ohne transdisziplinäre akademische Forschung und sektorübergreifende, kooperative Governance-Strukturen, die wirksam auf die vielfältigen Herausforderungen einer solchen Koexistenz reagieren, nicht zu bewältigen ist. Vor diesem Hintergrund konzentriere ich mich in Kapitel 4 auf Initiativen zum Schutz von Raubtieren, die transformative Governance-Ansätze anwenden, um einen Wandel hin zu einer Konvivenz zwischen Mensch und Raubtier zu bewirken. Unter Verwendung des Rahmens der transformativen Biodiversitäts-Governance und des konvivialen Naturschutzes zeige ich in diesem Kapitel konkrete Wege auf, die durch integrativere, demokratische Formen der Entscheidungsfindung im Naturschutz unterstützt werden und wirklich transformative Veränderungen in Richtung Konvivialität zwischen Mensch und Jaguar fördern. KW - jaguar KW - ecology KW - felid conservation KW - Central America KW - habitat use KW - coexistence KW - population connectivity KW - Mittelamerika KW - Koexistenz KW - Ökologie KW - Schutz von Raubtieren KW - Lebensraumnutzung KW - Jaguar KW - Populationskonnektivität Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-613671 ER - TY - THES A1 - Flores Castellanos, Junio T1 - Potato tuber (Solanum tuberosum L. cv Desiree) — characterization of starch interacting proteins and maltodextrin metabolism T1 - Kartoffelknolle (Solanum tuberosum L. cv Desiree) - Charakterisierung von Stärke-interagierenden Proteinen und Maltodextrin-Stoffwechsel N2 - Starch is a biopolymer for which, despite its simple composition, understanding the precise mechanism behind its formation and regulation has been challenging. Several approaches and bioanalytical tools can be used to expand the knowledge on the different parts involved in the starch metabolism. In this sense, a comprehensive analysis targeting two of the main groups of molecules involved in this process: proteins, as effectors/regulators of the starch metabolism, and maltodextrins as starch components and degradation products, was conducted in this research work using potato plants (Solanum tuberosum L. cv. Desiree) as model of study. On one side, proteins physically interacting to potato starch were isolated and analyzed through mass spectrometry and western blot for their identification. Alternatively, starch interacting proteins were explored in potato tubers from transgenic plants having antisense inhibition of starch-related enzymes and on tubers stored under variable environmental conditions. Most of the proteins recovered from the starch granules corresponded to previously described proteins having a specific role in the starch metabolic pathway. Another set of proteins could be grouped as protease inhibitors, which were found weakly interacting to starch. Variations in the protein profile obtained after electrophoresis separation became clear when tubers were stored under different temperatures, indicating a differential expression of proteins in response to changing environmental conditions. On the other side, since maltodextrin metabolism is thought to be involved in both starch initiation and degradation, soluble maltooligosaccharide content in potato tubers was analyzed in this work under diverse experimental variables. For this, tuber disc samples from wild type and transgenic lines strongly repressing either the plastidial or cytosolic form of the -glucan phosphorylase and phosphoglucomutase were incubated with glucose, glucose-6-phosphate, and glucose-1-phosphate solutions to evaluate the influence of such enzymes on the conversion of the carbon sources into soluble maltodextrins, in comparison to wild-type samples. Relative maltodextrin amounts analyzed through capillary electrophoresis equipped with laser-induced fluorescence (CE-LIF) revealed that tuber discs could immediately uptake glucose-1-phosphate and use it to produce maltooligosaccharides with a degree of polymerization of up to 30 (DP30), in contrast to transgenic tubers with strong repression of the plastidial glucan phosphorylase. The results obtained from the maltodextrin analysis support previous indications that a specific transporter for glucose-1-phosphate may exist in both the plant cells and the plastidial membranes, thereby allowing a glucose-6-phosphate independent transport. Furthermore, it confirms that the plastidial glucan phosphorylase is responsible for producing longer maltooligosaccharides in the plastids by catalyzing a glucan polymerization reaction when glucose-1-phosphate is available. All these findings contribute to a better understanding of the role of the plastidial glucan phosphorylase as a key enzyme directly involved in the synthesis and degradation of glucans and their implication on starch metabolism. N2 - Stärke ist ein Biopolymer, bei dem es trotz seiner einfachen Zusammensetzung schwierig ist, den genauen Mechanismus seiner Bildung und Regulierung zu verstehen. Verschiedene Ansätze und bioanalytische Instrumente können genutzt werden, um das Wissen über die verschiedenen am Stärkemetabolismus beteiligten Komponenten zu erweitern. In diesem Sinne wurde in dieser Forschungsarbeit eine umfassende Analyse durchgeführt, die auf zwei der wichtigsten Molekülgruppen abzielt, die an diesem Prozess beteiligt sind: Proteine als Effektoren/Regulatoren des Stärkestoffwechsels und Maltodextrine als Stärkebestandteile und Abbauprodukte, wobei Kartoffelpflanzen (Solanum tuberosum L. cv. Desiree) als Untersuchungsmodell dienten. Einerseits wurden Proteine, die physisch mit Kartoffelstärke interagieren, isoliert und mittels Massenspektrometrie und Western Blot analysiert, um sie zu identifizieren. Andererseits wurden die mit Stärke interagierenden Proteine in Kartoffelknollen von transgenen Pflanzen mit Antisense-Hemmung von stärkeverwandten Enzymen und in Knollen, die unter variablen Umweltbedingungen gelagert wurden, untersucht. Die meisten der aus den Stärkekörnchen gewonnenen Proteine entsprachen zuvor beschriebenen Proteinen, die eine spezifische Rolle im Stärkestoffwechselweg spielen. Eine andere Gruppe von Proteinen konnte als Proteaseinhibitoren gruppiert werden, die nur schwach mit der Stärke interagieren. Variationen im Proteinprofil nach der Elektrophorese-Trennung wurden deutlich, wenn die Knollen bei unterschiedlichen Temperaturen gelagert wurden, was auf eine unterschiedliche Expression von Proteinen als Reaktion auf wechselnde Umweltbedingungen hindeutet. Da man davon ausgeht, dass der Maltodextrin-Stoffwechsel sowohl an der Entstehung als auch am Abbau von Stärke beteiligt ist, wurde in dieser Arbeit der Gehalt an löslichen Maltooligosacchariden in Kartoffelknollen unter verschiedenen experimentellen Variablen analysiert. Zu diesem Zweck wurden Knollenscheibenproben von Wildtypen und transgenen Linien, die entweder die plastidiale oder die cytosolische Form der α-Glucanphosphorylase und Phosphoglucomutase stark unterdrücken, mit Glucose-, Glucose-6-Phosphat- und Glucose-1-Phosphat-Lösungen inkubiert, um den Einfluss dieser Enzyme auf die Umwandlung der Kohlenstoffquellen in lösliche Maltodextrine im Vergleich zu Wildtyp-Proben zu bewerten. Relative Maltodextrinmengen, die durch Kapillarelektrophorese mit laserinduzierter Fluoreszenz (CE-LIF) analysiert wurden, zeigten, dass die Knollenscheiben Glukose-1-Phosphat sofort aufnehmen und zur Herstellung von Maltooligosacchariden mit einem Polymerisationsgrad von bis zu 30 (DP30) verwenden konnten, im Gegensatz zu transgenen Knollen mit starker Unterdrückung der plastidialen Glukanphosphorylase. Die Ergebnisse der Maltodextrin-Analyse stützen frühere Hinweise darauf, dass ein spezifischer Transporter für Glucose-1-Phosphat sowohl in den Pflanzenzellen als auch in den plastidialen Membranen vorhanden sein könnte, was einen von Glucose-6-Phosphat unabhängigen Transport ermöglicht. Außerdem wird bestätigt, dass die plastidiale Glucanphosphorylase für die Herstellung längerer Maltooligosaccharide in den Plastiden verantwortlich ist, indem sie eine Glucanpolymerisationsreaktion katalysiert, wenn Glucose-1-Phosphat verfügbar ist. All diese Erkenntnisse tragen zu einem besseren Verständnis der Rolle der plastidialen Glucanphosphorylase als Schlüsselenzym bei, das direkt an der Synthese und dem Abbau von Glucanen und deren Auswirkungen auf den Stärkemetabolismus beteiligt ist. KW - Solanum tuberosum KW - potato KW - maltodextrin KW - starch KW - Stärke KW - Solanum tuberosum KW - Maltodextrin KW - Kartoffel Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-615055 ER - TY - THES A1 - Stanke, Sandra T1 - AC electrokinetic immobilization of influenza viruses and antibodies on nanoelectrode arrays for on-chip immunoassays T1 - AC elektrokinetische Immobilisierung von Influenzaviren und Antikörpern auf Nanoelektrodenarrays für on-Chip Immunoassays N2 - In the present thesis, AC electrokinetic forces, like dielectrophoresis and AC electroosmosis, were demonstrated as a simple and fast method to functionalize the surface of nanoelectrodes with submicrometer sized biological objects. These nanoelectrodes have a cylindrical shape with a diameter of 500 nm arranged in an array of 6256 electrodes. Due to its medical relevance influenza virus as well as anti-influenza antibodies were chosen as a model organism. Common methods to bring antibodies or proteins to biosensor surfaces are complex and time-consuming. In the present work, it was demonstrated that by applying AC electric fields influenza viruses and antibodies can be immobilized onto the nanoelectrodes within seconds without any prior chemical modification of neither the surface nor the immobilized biological object. The distribution of these immobilized objects is not uniform over the entire array, it exhibits a decreasing gradient from the outer row to the inner ones. Different causes for this gradient have been discussed, such as the vortex-shaped fluid motion above the nanoelectrodes generated by, among others, electrothermal fluid flow. It was demonstrated that parts of the accumulated material are permanently immobilized to the electrodes. This is a unique characteristic of the presented system since in the literature the AC electrokinetic immobilization is almost entirely presented as a method just for temporary immobilization. The spatial distribution of the immobilized viral material or the anti-influenza antibodies at the electrodes was observed by either the combination of fluorescence microscopy and deconvolution or by super-resolution microscopy (STED). On-chip immunoassays were performed to examine the suitability of the functionalized electrodes as a potential affinity-based biosensor. Two approaches were pursued: A) the influenza virus as the bio-receptor or B) the influenza virus as the analyte. Different sources of error were eliminated by ELISA and passivation experiments. Hence, the activity of the immobilized object was inspected by incubation with the analyte. This resulted in the successful detection of anti-influenza antibodies by the immobilized viral material. On the other hand, a detection of influenza virus particles by the immobilized anti-influenza antibodies was not possible. The latter might be due to lost activity or wrong orientation of the antibodies. Thus, further examinations on the activity of by AC electric fields immobilized antibodies should follow. When combined with microfluidics and an electrical read-out system, the functionalized chips possess the potential to serve as a rapid, portable, and cost-effective point-of-care (POC) device. This device can be utilized as a basis for diverse applications in diagnosing and treating influenza, as well as various other pathogens. N2 - In der vorliegenden Arbeit wurden AC elektrokinetische Kräfte, wie die Dielektrophorese und die AC Elektroosmose, als einfache und schnelle Methode zur Funktionalisierung der Oberfläche von Nanoelektroden mit biologischen Objekten in Submikrometergröße demonstriert. Diese Nanoelektroden haben eine zylindrische Form mit einem Durchmesser von 500 nm und sind in einem Array aus 6256 Elektroden angeordnet. Aufgrund ihrer medizinischen Relevanz wurden Influenzaviren sowie anti-Influenza Antikörper als Modellorganismus ausgewählt. Gängige Methoden, um Antikörper oder Proteine auf Biosensoroberflächen zu bringen, sind komplex und zeitaufwändig. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass durch die Anwendung elektrischer Wechselfelder Influenzaviren und Antikörper innerhalb von Sekunden auf den Nanoelektroden immobilisiert werden können, ohne dass zuvor eine chemische Modifikation der Oberfläche noch des immobilisierten biologischen Objekts erforderlich ist. Die Verteilung dieser immobilisierten Objekte ist über das gesamte Array ungleichmäßig. Es kommt zur Ausbildung eines Gradienten, welcher von der äußeren zur den inneren Reihen hin abnimmt. Verschiedene Ursachen für diesen Gradienten wurden diskutiert, beispielsweise der Vortex-förmige Flüssigkeitsstrom über den Nanoelektroden, der unter anderem durch elektrothermische Flüssigkeitsbewegung erzeugt wird. Es wurde gezeigt, dass Teile des akkumulierten Materials dauerhaft an den Elektroden immobilisiert sind. Dies ist ein Alleinstellungsmerkmal des vorgestellten Systems, da in der Literatur die AC elektrokinetische Immobilisierung fast ausschließlich als Methode nur zur temporären Immobilisierung dargestellt wird. Die räumliche Verteilung des immobilisierten Virusmaterials bzw. der anti-Influenza Antikörper an den Elektroden wurde entweder durch die Kombination aus Fluoreszenzmikroskopie und Dekonvolution oder durch super-resolution Mikroskopie (STED) betrachtet. Es wurden On-Chip-Immunoassays durchgeführt, um die Eignung der funktionalisierten Elektroden für einen potenziellen affinitätsbasierten Biosensor zu untersuchen. Dabei wurden zwei Ansätze verfolgt: A) Influenzaviren als Biorezeptor oder B) Influenzavirus als Analyt. Verschiedene Fehlerquellen wurden mittels ELISA und Passivierungsexperimente eliminiert. Infolgedessen wurde die Aktivität der immobilisierten Objekte durch Inkubation mit dem Analyten überprüft. Dies führte zum erfolgreichen Nachweis von anti-Influenza Antikörpern mittels immobilisiertem Virusmaterial. Andererseits war ein Nachweis von Influenzaviruspartikeln durch die immobilisierten anti-Influenza Antikörper nicht möglich. Letzteres könnte auf einen Aktivitätsverlust oder eine falsche Ausrichtung der Antikörper zurückzuführen sein. Daher sollten weitere Untersuchungen zur Aktivität von durch elektrische Wechselfelder immobilisierte Antikörper folgen. In Kombination mit Mikrofluidik und einem elektrischen Auslesesystem besitzen die funktionalisierten Chips das Potenzial, als schnelle, tragbare und kostengünstige Point-of-Care-Einheit (POC) zu dienen. Dieses Einheit kann als Grundlage für vielfältige Anwendungen bei der Diagnose und Behandlung von Influenza und verschiedenen anderen Krankheitserregern genutzt werden. KW - AC electrokinetics KW - AC Elektrokinetik KW - AC electroosmosis KW - AC Elektroosmosis KW - dielectrophoresis KW - Dielektrophorese KW - virus KW - Virus KW - influenza KW - Influenza KW - antibody KW - Antikörper KW - nanoelectrodes KW - Nanoelektroden KW - lab-on-chip KW - lab-on-chip KW - LOC KW - LOC KW - point-of-care KW - point-of-care KW - POC KW - POC KW - immunoassay KW - Immunoassay Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-617165 ER - TY - JOUR A1 - Glowinski, Ingrid A1 - Autenrieth, Marijke T1 - Eigene Forschung im Labor, um naturwissenschaftliche Erkenntnisgewinnung kompetent unterrichten zu können? BT - Konzeption und Evaluation eines forschungsorientierten Seminars und Praktikums für Lehramtsstudierende im Fach Biologie JF - PSI-Potsdam: Ergebnisbericht zu den Aktivitäten im Rahmen der Qualitätsoffensive Lehrerbildung (2019-2023) (Potsdamer Beiträge zur Lehrerbildung und Bildungsforschung ; 3) N2 - Im Rahmen des PSI-Projekts wurde eine Lehrveranstaltung konzipiert, die Lehramtsstudierenden einen vertieften Einblick sowohl in den Ablauf von Forschung als auch eine Bearbeitung einer eigenen experimentellen Forschungsaufgabe ermöglichen soll. Anlass waren die Berücksichtigung eines „Wissens über Erkenntnisgewinnung in der Disziplin“ im Modell des „Erweiterten Fachwissens für den schulischen Kontext“ (PSI) sowie Erkenntnisse empirischer Studien, die die Relevanz eigener Forschungserfahrung für das Unterrichten naturwissenschaftlicher Erkenntnisgewinnungsprozesse zeigen. Hier stellen wir eine neue Lehrveranstaltung (4 SWS) vor, die den angehenden Lehrkräften Forschungserfahrung ermöglicht (Seminar und Praktikum). Die Lehrveranstaltung vermittelt Einblicke in Forschung und die „Natur der Naturwissenschaften“, ermöglicht das Durchführen eigener wissenschaftlicher und schulrelevanter Experimente und bietet eine angemessene Reflexion über die verschiedenen Kurselemente. Die Evaluationsergebnisse sind überwiegend positiv, zeigen aber auch, dass für die Studierenden die wahrgenommene Schulrelevanz und die fachdidaktischen Aspekte ein wichtiges Kriterium für die positive Bewertung sind. N2 - As part of the PSI project, a new course was designed to give pre-service science teachers an in-depth insight into scientific research and to enable them to design their own scientific research experiment. Motivated by the consideration of “knowledge of scientific research processes” in the model of “extended content knowledge for the school context” (PSI) as well as by findings of empirical studies showing the relevance of own scientific research experiences for the competencies of pre-service science teachers concerning teaching about “Nature of Science” and “scientific inquiry” processes. Here we present a new course (4 hours/week) that provides pre-service science teachers with research experiences and knowledge about scientific research, integrated with aspects of pedagogical content knowledge (seminar and laboratory course). The course provides insights into scientific research and the “Nature of Science”, allows pre-service teachers to conduct their own scientific and school-relevant experiments, and provides appropriate reflection on the various course elements. The evaluation results are predominantly positive, but also show that for the pre-service science teachers the perceived school relevance and the aspects of pedagogical content knowledge are an important criterion for the positive evaluation. KW - Professionswissen KW - Erkenntnisgewinnung KW - Forschungsorientierung KW - Lehramtsstudium Biologie KW - „Natur der Naturwissenschaften“ KW - pre-service teacher KW - professional knowledge KW - inquiry KW - nature of science KW - biology Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-617922 SN - 978-3-86956-568-2 SN - 2626-3556 SN - 2626-4722 IS - 3 SP - 273 EP - 293 PB - Universitätsverlag Potsdam CY - Potsdam ER - TY - THES A1 - Prüfer, Mareike T1 - Charakterisierung und wechselfeldgestützte Herstellung von Enzym-Nanoarrays T1 - Characterization and AC-electrokinetical production of enzyme nanoarrays N2 - Dielektrophorese ist die Manipulation polarisierbarer Partikel durch inhomogene elektrische Wechselfelder. In dieser Arbeit wurden drei verschiedene Enzyme durch Dielektrophorese immobilisiert und anschließend hinsichtlich ihrer katalytischen Aktivität untersucht: Meerrettichperoxidase, Cholinoxidase aus Alcaligenes sp. und Glucoseoxidase aus Aspergillus niger. Die Immobilisierung erfolgte durch Dielektrophorese auf nano-Elektrodenarrays aus Wolfram-Zylindern mit 500 nm Durchmesser oder aus Titannitrid-Ringen mit 20 nm Breite. Die Immobilisierung der Enzyme konnte fluoreszenzmikroskopisch entweder anhand der intrinsischen Fluoreszenz oder aufgrund einer Fluoreszenzmarkierung vor oder nach der Immobilisierung für alle getesteten Enzyme nachgewiesen werden. Die Messung der Enzymaktivität erfolgte quantitativ durch den direkten oder indirekten Nachweis des gebildeten Produktes oder, im Falle der Cholinoxidase, durch Beobachtung der intrinsischen Fluoreszenz des Cofaktors FAD, die vom Oxidationszustand dieses Enzyms abhängt. Für die Meerrettichperoxidase konnte so eine hohe erhaltene Enzymaktivität nach der Immobilisierung nachgewiesen werden. Die Aktivität der permanent immobilisierten Fraktion der Meerrettichperoxidase entsprach bis zu 47 % der höchstmöglichen Aktivität einer Monolage dieses Enzyms auf den Elektroden des Chips. Diese Aktivität kann als aktive, aber zufällig gegenüber der Oberfläche ausgerichtete Enzymschicht interpretiert werden. Für die permanent immobilisierte Glucoseoxidase wurde nur eine Aktivität entsprechend <1,3 % der Aktivität einer solchen Enzymschicht detektiert, während für die immobilisierte Cholinoxidase gar keine Aktivität nachgewiesen werden konnte. Die Aktivität der durch DEP immobilisierten Enzyme konnte somit quantitativ bestimmt werden. Der Anteil an erhaltener Aktivität hängt dabei stark vom verwendeten Enzym ab. N2 - Dielectrophoresis is the manipulation of polarizable particles by alternating inhomogeneous electric fields. In this work, three enzymes were immobilized by dielectrophoresis and were analyzed regarding their catalytic activity afterwards: Horseradish peroxidase, choline oxidase from Alcaligenes sp. and glucose oxidase from Aspergillus niger. Immobilization by dielectrophoresis took place on nanoelectrode arrays consisting of tungsten cylinders with a diameter of 500 nm or of titanium nitride rings with a width of 20 nm. Immobilization was verified by fluorescence microscopy using either the intrinsic fluorescence of the enzymes or fluorescent labeling of the enzymes before or after immobilization. Enzyme activity measurements were performed quantitatively by direct or indirect detection of the enzyme’s product or, in the case of choline oxidase, by observing the intrinsic fluorescence of the enzyme’s cofactor FAD which is a function of its oxidation state. For horesradish peroxidase, a rather high retained activity of the enzyme after immobilization was observed. The activity of the permanently immobilized fraction of horseradish peroxidase equaled up to 47 % of the activity which can be maximally expected for a fully active monolayer of the enzyme molecules on all electrodes of the chip. This activity can be interpreted as the result of a fully active, but randomly oriented monolayer of immobilized horseradish peroxidase. The activity of permanently immobilized glucose oxidase equaled only <1,3 % of a fully active monolayer, whereas no activity was evident for immobilized choline oxidase. Accordingly, the activity of enzymes immobilized by DEP was measured quantitatively. The percentage of retained activity thereby strongly depends on the enzyme under investigation. KW - Enzyme KW - Dielektrophorese KW - enzymes KW - dielectrophoresis Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-612329 ER - TY - THES A1 - Dreymann, Nico T1 - Identification and functional characterization of aptamers targeting human urokinase and NDM-1 for therapeutic and diagnostic applications T1 - Identifizierung und funktionelle Charakterisierung von Aptameren gegen humane Urokinase und NDM-1 für therapeutische und diagnostische Anwendungen N2 - Aptamers are single-stranded DNA (ssDNA) or RNA molecules that can bind specifically and with high affinity to target molecules due to their unique three-dimensional structure. For this reason, they are often compared to antibodies and sometimes even referred to as “chemical antibodies”. They are simple and inexpensive to synthesize, easy to modify, and smaller than conventional antibodies. Enzymes, especially hydrolases, are interesting targets in this context. This class of enzymes is capable of hydrolytically cleaving various macromolecules such as proteins, as well as smaller molecules such as antibiotics. Hence, they play an important role in many biological processes including diseases and their treatment. Hydrolase detection as well as the understanding of their function is therefore of great importance for diagnostics and therapy. Due to their various desirable features compared to antibodies, aptamers are being discussed as alternative agents for analytical and diagnostic use in various applications. The use of aptamers in therapy is also frequently investigated, as the binding of aptamers can have effects on the catalytic activity, protein-protein interactions, or proteolytic cascades. Aptamers are generated by an in vitro selection process. Potential aptamer candidates are selected from a pool of enriched nucleic acid sequences with affinity to the target, and their binding affinity and specificity is investigated. This is one of the most important steps in aptamer generation to obtain specific aptamers with high affinity for use in analytical and diagnostic applications. The binding properties or binding domains and their effects on enzyme functions form the basis for therapeutic applications. In this work, the binding properties of DNA aptamers against two different hydrolases were investigated. In view of their potential utility for analytical methods, aptamers against human urokinase (uPA) and New Delhi metallo-β-lactamase-1 (NDM-1) were evaluated for their binding affinity and specificity using different methods. Using the uPA aptamers, a protocol for measuring the binding kinetics of an aptamer-protein-interaction by surface plasmon resonance spectroscopy (SPR) was developed. Based on the increased expression of uPA in different types of cancer, uPA is discussed as a prognostic and diagnostic tumor marker. As uPA aptamers showed different binding sites on the protein, microtiter plate-based aptamer sandwich assay systems for the detection of uPA were developed. Because of the function of urokinase in cancer cell proliferation and metastasis, uPA is also discussed as a therapeutic target. In this regard, the different binding sites of aptamers showed different effects on uPA function. In vitro experiments demonstrated both inhibition of uPA binding to its receptor as well as the inhibition of uPA catalytic activity for different aptamers. Thus, in addition to their specificity and affinity for their targets, the utility of the aptamers for potential diagnostic and therapeutic applications was demonstrated. First, as an alternative inhibitor of human urokinase for therapeutic purposes, and second, as valuable recognition molecules for the detection of urokinase, as a prognostic and diagnostic marker for cancer, and for NDM-1 to detect resistance to carbapenem antibiotics. N2 - Aptamere sind einzelsträngige DNA- oder RNA-Moleküle, die aufgrund ihrer charakteristischen dreidimensionalen Struktur spezifisch und mit hoher Affinität an Zielmoleküle binden. Häufig werden sie mit Antikörpern verglichen und als „chemische Antikörper“ bezeichnet. Sie sind einfach und kostengünstig zu synthetisieren, leicht zu modifizieren und kleiner als herkömmliche Antikörper. Enzyme, insbesondere Hydrolasen, sind hierbei unter anderem interessante Zielmoleküle. Diese Klasse von Enzymen ist in der Lage verschiedene Makromoleküle wie z.B. Proteine, aber auch kleinere Moleküle, wie z.B. Antibiotika, hydrolytisch zu spalten. Sie spielen in vielen biologischen Prozessen und somit auch in Erkrankungen und deren Behandlung eine wichtige Rolle. Daher ist ihre Detektion, sowie das Verständnis ihrer Funktion für die Diagnostik und Therapie von hoher Bedeutung. Durch ihre Vorteile gegenüber Antikörpern werden Aptamere als Alternativen für den analytischen und diagnostischen Einsatz in verschiedenen Applikationen diskutiert. Der Einsatz von Aptameren in der Therapie wird ebenfalls häufig untersucht, da die Bindung der Aptamere Auswirkungen auf die katalytische Aktivität, Protein-Protein-Interaktionen oder proteolytische Kaskaden haben kann. Aptamere werden mittels in vitro Selektion generiert. Aus einem Pool angereicherter Nukleinsäuren mit Affinität zum Zielmolekül werden anschließend potentielle Aptamerkandidaten identifiziert und ihre Bindung zum Zielmolekül untersucht. Dies ist einer der wichtigsten Schritte in der Aptamergenerierung, um spezifische Aptamere mit hoher Affinität für den späteren Einsatz in analytischen und diagnostischen Applikationen zu erhalten. Die Bindungseigenschaften einschließlich der Bindedomänen und deren Auswirkungen auf die Funktion des Zielmoleküls stellen die Grundlage für spätere therapeutische Anwendungen dar. In dieser Arbeit wurden die Bindungseigenschaften von DNA Aptameren gegen zwei verschiedene Hydrolasen untersucht. Für den potentiellen Nutzen in analytischen Methoden wurden Aptamere gegen die humane Urokinase (uPA), sowie gegen die New-Delhi metallo β-lactamase-1 (NDM-1) mittels molekularbiologischer Methoden auf deren Bindungsaffinität und Spezifität untersucht. Anhand der uPA-Aptamere wurde ein Protokoll für die Messung der Bindungskinetik einer Aptamer-Protein-Bindung mittels Oberflächenplasmonenresonanz Spektroskopie (SPR) entwickelt. Durch die erhöhte Expression von uPA in vielen Krebserkrankungen, wird dieser als prognostischer und diagnostischer Tumormarker diskutiert. Die in dieser Arbeit untersuchten Aptamere gegen die Urokinase zeigten unterschiedliche Bindestellen, wodurch Aptamer-basierte Sandwich Assay Systeme auf Mikrotiterplattenbasis für die Detektion von uPA etabliert werden konnten. Durch die Funktion der Urokinase in der Zellproliferation und Metastasierung in Krebserkrankungen wird uPA ebenfalls als therapeutisches Zielprotein diskutiert. Hierbei zeigten die unterschiedlichen Bindestellen der Aptamere verschiedene Auswirkungen auf die Funktion von uPA. Mittels in vitro Experimenten konnte die Inhibierung der Bindung von uPA zu ihrem Rezeptor, sowie die Inhibierung der katalytischen Aktivität von uPA mit Hilfe verschiedener Aptamere nachgewiesen werden. Somit wurde für die Aptamere, neben ihrer Spezifität und Affinität zu ihren Zielmolekülen, der Nutzen für potentielle diagnostische und therapeutische Anwendungen gezeigt. Zum einen als alternativer Inhibitor der Urokinase für therapeutische Zwecke, als auch als wertvolle Erkennungsmoleküle für den Nachweis von Urokinase, als prognostischer und diagnostischer Marker für Krebserkrankungen, sowie für NDM-1, zum Nachweis der Resistenz gegen Carbapenem-Antibiotika. KW - DNA-Aptamer KW - protein-aptamer interaction KW - Surface Plasmon Resonance (SPR) KW - Microscale Thermophoresis (MST) KW - aptamer-based sandwich assay KW - cancer biomarker KW - cancer therapy KW - cancer detection KW - Urokinase-type Plasminogen Activator (uPA) KW - antibiotic resistance KW - New Delhi metallo-β-lactamase 1 (NDM-1) KW - DNA-Aptamer KW - Microscale Thermophoresis (MST) KW - Neu-Delhi Metallo-Beta-Laktamase 1 (NDM-1) KW - Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie (SPR-Spektroskopie) KW - Urokinase-Typ Plasminogen Aktivator (uPA) KW - Antibiotikaresistenz KW - Sandwich-Assay auf Basis von Aptameren KW - Krebsbiomarker KW - Krebserkennung KW - Krebstherapie KW - Protein-Aptamer Interaktion Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-612919 ER - TY - THES A1 - Stübler, Sabine T1 - Mathematical model of the mucosal immune response to study inflammatory bowel diseases and their treatments T1 - Mathematisches Modell der mukosalen Immunantwort zur Analyse von chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen und deren Behandlung N2 - Inflammatory bowel diseases (IBD), characterised by a chronic inflammation of the gut wall, develop as consequence of an overreacting immune response to commensal bacteria, caused by a combination of genetic and environmental conditions. Large inter-individual differences in the outcome of currently available therapies complicate the decision for the best option for an individual patient. Predicting the prospects of therapeutic success for an individual patient is currently only possible to a limited extent; for this, a better understanding of possible differences between responders and non-responders is needed. In this thesis, we have developed a mathematical model describing the most important processes of the gut mucosal immune system on the cellular level. The model is based on literature data, which were on the one hand used (qualitatively) to choose which cell types and processes to incorporate and to derive the model structure, and on the other hand (quantitatively) to derive the parameter values. Using ordinary differential equations, it describes the concentration-time course of neutrophils, macrophages, dendritic cells, T cells and bacteria, each subdivided into different cell types and activation states, in the lamina propria and mesenteric lymph nodes. We evaluate the model by means of simulations of the healthy immune response to salmonella infection and mucosal injury. A virtual population includes IBD patients, which we define through their initially asymptomatic, but after a trigger chronically inflamed gut wall. We demonstrate the model's usefulness in different analyses: (i) The comparison of virtual IBD patients with virtual healthy individuals shows that the disease is elicited by many small or fewer large changes, and allows to make hypotheses about dispositions relevant for development of the disease. (ii) We simulate the effects of different therapeutic targets and make predictions about the therapeutic outcome based on the pre-treatment state. (iii) From the analysis of differences between virtual responders and non-responders, we derive hypotheses about reasons for the inter-individual variability in treatment outcome. (iv) For the example of anti-TNF-alpha therapy, we analyse, which alternative therapies are most promising in case of therapeutic failure, and which therapies are most suited for combination therapies: For drugs also directly targeting the cytokine levels or inhibiting the recruitment of innate immune cells, we predict a low probability of success when used as alternative treatment, but a large gain when used in a combination treatment. For drugs with direct effects on T cells, via modulation of the sphingosine-1-phosphate receptor or inhibition of T cell proliferation, we predict a considerably larger probability of success when used as alternative treatment, but only a small additional gain when used in a combination therapy. N2 - Chronisch-entzündliche Darmerkrankungen (CED), charakterisiert durch chronische Entzündung der Darmwand, entstehen durch eine Überreaktion der Immunantwort auf kommensale Bakterien, ausgelöst durch eine Kombination an genetischen und Umwelteinflüssen. Große inter-individuelle Unterschiede im Behandlungserfolg mit den verfügbaren Medikamenten erschweren die Wahl der für den jeweiligen Patienten besten Therapieoption. Eine Vorhersage der Erfolgsaussichten einer Behandlung für einen Patienten ist zum jetzigen Zeitpunkt nur sehr bedingt möglich; dafür wird ein besseres Verständnis möglicher Unterschiede zwischen sogenannten Respondern und Non-Respondern (Patienten, die gut bzw. schlecht auf ein Medikament ansprechen) benötigt. In der Dissertation haben wir ein mathematisches Modell entwickelt, das die wichtigsten Prozesse des mukosalen Immunsystems des Darms auf zellulärer Ebene beschreibt. Das Modell basiert auf Literaturdaten, die einerseits (qualitativ) zur Auswahl der zu betrachtenden Zelltypen und Prozesse und zur Herleitung der Modellstruktur und andererseits (quantitativ) zur Herleitung der Parameterwerte verwendet wurden. Mithilfe gewöhnlicher Differentialgleichungen wird der Konzentrations-Zeit-Verlauf von Neutrophilen, Makrophagen, dendritischen Zellen, T-Zellen und Bakterien, jeweils unterteilt in unterschiedliche Zelltypen und Aktivierungszustände, in der Lamina propria und den mesenterischen Lymphknoten, beschrieben. Wir evaluieren das Modells anhand von Simulationen der gesunden Immunantwort auf Salmonelleninfektion und Verletzung der Darmbarriere. Eine virtuelle Population beinhaltet CED-Patienten, die wir durch ein zunächst asymptomatisches, aber nach einem Auslöser chronisch entzündetes Darmgewebe definieren. Wir zeigen den Nutzen des Modells anhand verschiedener Analysen: (i) Der Vergleich von virtuellen CED-Patienten und virtuellen gesunden Individuen zeigt, dass die Krankheit durch viele kleine oder wenige große Veränderungen ausgelöst werden kann, und erlaubt, Hypothesen über krankheitsauslösende Veränderungen aufzustellen. (ii) Wir simulieren verschiedene Therapiemechanismen und treffen, basierend auf dem Zustand vor Behandlungsstart, Vorhersagen über den Therapieerfolg. (iii) Durch Analyse der Unterschiede zwischen virtuellen Respondern und Non-Respondern leiten wir Hypothesen über Ursachen für die inter-individuelle Variabilität im Therapieerfolg her. (iv) Am Beispiel von TNF-alpha-Antikörpern untersuchen wir, welche alternativen Therapien bei Therapieversagen am vielversprechendsten sind und welche Therapien sich besonders für Kombinationstherapien eignen: Für Medikamente, die auch direkt die Zytokinlevel beeinflussen oder die Rekrutierung von Zellen der natürlichen Immunantwort inhibieren, sagen wir eine geringe Erfolgswahrscheinlichkeit bei Nutzung als Alternativtherapie, aber einen großen Gewinn durch Nutzung in einer Kombinationstherapie vorher. Für Medikamente mit direkten Effekten auf T-Zellen, durch Modulation des Sphingosin-1-Phosphat-Rezeptors oder Inhibierung der T-Zellproliferation, sagen wir eine deutlich größere Erfolgswahrscheinlichkeit bei Nutzung als Alternativtherapie, aber nur einen geringen zusätzlichen Effekt bei Nutzung in einer Kombinationstherapie vorher. KW - systems biology KW - IBD KW - QSP KW - Systembiologie KW - CED KW - QSP Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-612301 ER - TY - THES A1 - Petrich, Annett T1 - Quantitative fluorescence microscopy methods to investigate molecular interactions and dynamics in living cells T1 - Quantitative Fluoreszenzmikroskopiemethoden zur Untersuchung molekularer Interaktionen und Dynamik in lebenden Zellen N2 - Biomolecules such as proteins and lipids have vital roles in numerous cellular functions, including biomolecule transport, protein functions, cellular homeostasis and biomembrane integrity. Traditional biochemistry methods do not provide precise information about cellular biomolecule distribution and behavior under native environmental conditions since they are not transferable to live cell samples. Consequently, this can lead to inaccuracies in quantifying biomolecule interactions due to potential complexities arising from the heterogeneity of native biomembranes. To overcome these limitations, minimal invasive microscopic techniques, such as fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) in combination with fluorescence proteins (FPs) and fluorescence lipid analogs, have been developed. FFS techniques and membrane property sensors enable the quantification of various parameters, including concentration, dynamics, oligomerization, and interaction of biomolecules in live cell samples. In this work, several FFS approaches and membrane property sensors were implemented and employed to examine biological processes of diverse context. Multi-color scanning fluorescence fluctuation spectroscopy (sFCS) was used the examine protein oligomerization, protein-protein interactions (PPIs) and protein dynamics at the cellular plasma membrane (PM). Additionally, two-color number and brightness (N&B) analysis was extended with the cross-correlation analysis in order to quantify hetero-interactions of proteins in the PM with very slow motion, which would not accessible with sFCS due strong initial photobleaching. Furthermore, two semi-automatic analysis pipelines were designed: spectral Förster resonance energy transfer (FRET) analysis to study changes in membrane charge at the inner leaflet of the PM, and spectral generalized polarization (GP) imaging and spectral phasor analysis to monitor changes in membrane fluidity and order. An important parameter for studying PPIs is molecular brightness, which directly determines oligomerization and can be extracted from FFS data. However, FPs often display complex photophysical transitions, including dark states. Therefore, it is crucial to characterize FPs for their dark-states to ensure reliable oligomerization measurements. In this study, N&B and sFCS analysis were applied to determine photophysical properties of novel green FPs under different conditions (i.e., excitation power and pH) in living cells. The results showed that the new FPs, mGreenLantern (mGL) and Gamillus, exhibited the highest molecular brightness at the cost of lower photostability. The well-established monomeric enhanced green fluorescent protein (mEGFP) remained the best option to investigate PPIs at lower pH, while mGL was best suited for neutral pH, and Gamillus for high pH. These findings provide guidance for selecting an appropriate FP to quantify PPIs via FFS under different environmental conditions. Next, several biophysical fluorescence microscopy approaches (i.e., sFCS, GP imaging, membrane charge FRET) were employed to monitor changes in lipid-lipid-packing in biomembranes in different biological context. Lipid metabolism in cancer cells is known to support rapid proliferation and metastasis. Therefore, targeting lipid synthesis or membrane integrity holds immense promise as an anticancer strategy. However, the mechanism of action of the novel agent erufosine (EPC3) on membrane stability is not fully under stood. The present work revealed that EPC3 reduces lipid packing and composition as well as increased membrane fluidity and dynamic, hence, modifies lipid-lipid-interaction. These effects on membrane integrity were likely triggered by modulations in lipid metabolism and membrane organization. In the case of influenza A virus (IAV) infection, regulation of lipid metabolism is crucial for multiple steps in IAV replication and is related to the pathogenicity of IAV. Here, it is shown for the first time that IAV infection triggers a local enrichment of negatively charged lipids at the inner leaflet of the PM, which decreases membrane fluidity and dynamic, as well as increases lipid packing at the assembly site in living cells. This suggests that IAV alters lipid-lipid interactions and organization at the PM. Overall, this work highlights the potential of biophysical techniques as a screening platform for studying membrane properties in living cells at the single-cell level. Finally, this study addressed remaining questions about the early stage of IAV assembly. The recruitment of matrix protein 1 (M1) and its interaction with other viral surface proteins, hemagglutinin (HA), neuraminidase (NA), and matrix protein 2 (M2), has been a subject of debate due to conflicting results. In this study, different FFS approaches were performed in transfected cells to investigate interactions between IAV proteins themselves and host factors at the PM. FFS measurements revealed that M2 interacts strongly with M1, leading to the translocation of M1 to the PM. This interaction likely took place along the non-canonical pathway, as evidenced by the detection of an interaction between M2 and the host factor LC3-II, leading to the recruitment of LC3-II to the PM. Moreover, weaker interaction was observed between HA and membrane-bound M1, and no interaction between NA and M1. Interestingly, higher oligomeric states of M1 were only detectable in infected cells. These results indicate that M2 initiates virion assembly by recruiting M1 to the PM, which may serve as a platform for further interactions with viral proteins and host factors. N2 - Biomoleküle wie Proteine und Lipide spielen eine wichtige Rolle bei zahlreichen Zellfunktionen, darunter Biomolekültransport, Proteinfunktionen, zelluläre Homöostase und Biomembranintegrität. Traditionelle biochemische Methoden liefern keine Informationen über die Verteilung und das Verhalten zellulärer Biomolekülen unter natürlichen Bedingungen, da sie nicht auf lebende Zellproben übertragbar sind. Folglich kann dies zu Ungenauigkeiten bei der Quantifizierung von Biomolekülinteraktionen führen und potenzielle Komplexitäten der Heterogenität nativer Biomembranen übersehen. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden minimalinvasive mikroskopische Techniken wie die Fluoreszenzfluktuationsspektroskopie (FFS) in Kombination mit Fluoreszenzproteinen (FPs) und Fluoreszenzlipidanaloga entwickelt. FFS-Techniken und Membraneigenschaftssensoren ermöglichen die Quantifizierung verschiedener Parameter, einschließlich Konzentration, Dynamik, Oligomerisierung und Wechselwirkung von Biomolekülen in lebenden Zellproben. In dieser Arbeit wurden mehrere FFS-Ansätze und Sensoren für Membraneigenschaften implementiert und eingesetzt, um biologische Prozesse in verschiedenen Zusammenhängen zu untersuchen. Die Mehrfarben-Scanning-Fluoreszenzfluktuationsspektroskopie (sFCS) wurde zur Untersuchung von Protein-Oligomerisierung, Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPIs) und Proteindynamik an der zellulären Plasmamembran (PM) eingesetzt. Zusätzlich wurde die Zweifarben-Analyse von Anzahl und Helligkeit (N&B) mit der Kreuzkorrelationsanalyse erweitert, um Hetero-Interaktionen von Proteinen in der PM mit sehr langsamer Dynamik zu quantifizieren, die mit sFCS aufgrund starker anfänglicher Bleiche der Fluorophore nicht zugänglich wären. Darüber hinaus wurden zwei halbautomatische Analysepipelines entwickelt: die spektrale Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET)-Analyse zur Untersuchung von Änderungen der Membranladung auf der Innenseite der PM und die spektrale generalisierte Polarisation (GP)-Bildgebung sowie die spektrale Phasor-Analyse zur Überwachung von Änderungen der Membranfluidität und -ordnung. Ein wichtiger Parameter zur Untersuchung von PPIs ist die molekulare Helligkeit, die die Oligomerisierung direkt bestimmt und aus FFS daten extrahiert werden kann. Allerdings weisen FPs häufig komplexe photophysikalische Übergänge auf, einschließlich nichtfluoreszierender Zustände. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, FPs hinsichtlich ihrer dunklen Zustände zu charakterisieren, um zuverlässige Oligomerisierungsmessungen sicherzustellen. In dieser Studie wurden N&B- und sFCS-Analysen angewendet, um die photophysikalischen Eigenschaften neuartiger grüner FPs unter verschiedenen Bedingungen (d. h. Anregungsleistung und pH-Wert) in lebenden Zellen zu bestimmen. Die Ergebnisse zeigten, dass die neuen FPs mGreenLantern (mGL) und Gamillus die höchste molekulare Helligkeit aufwiesen, allerdings auf Kosten einer geringeren Photostabilität. Das etablierte mEGFP blieb die beste Option, um PPIs bei niedrigerem pH-Wert zu untersuchen, während mGL am besten für neutralen pH-Wert und Gamillus für hohen pH-Wert geeignet war. Diese Ergebnisse bieten Orientierung für die Auswahl eines geeigneten FP zur Quantifizierung von PPIs über FFS unter verschiedenen Umgebungsbedingungen. Als nächstes wurden mehrere biophysikalische Fluoreszenzmikroskopie-Ansätze (z. B. sFCS, GP-Bildgebung, Membranladung-FRET) eingesetzt, um Veränderungen in der Lipid-Lipid-Packung in Biomembranen in verschiedenen biologischen Kontexten zu überwachen. Es ist bekannt, dass der Lipidstoffwechsel in Krebszellen die schnelle Vermehrung und Metastasierung fördert. Daher ist die gezielte Beeinflussung der Lipidsynthese oder der Membranintegrität eine vielversprechende Strategie zur Krebsbekämpfung. Der Wirkungsmechanismus des neuartigen Wirkstoffs Erufosin (EPC3) auf die Membranstabilität ist nicht vollständig geklärt. Die vorliegende Arbeit ergab, dass EPC3 die Lipidpackung und -zusammensetzung reduziert sowie die Fluidität und Dynamik der Membran erhöht und somit die Lipid-Lipid-Wechselwirkung verändert. Diese Auswirkungen auf die Membranintegrität wurden wahrscheinlich durch Modulationen des Lipidstoffwechsels und der Membranorganisation ausgelöst. Im Falle einer Infektion mit dem Influenza-A-Virus (IAV) ist die Regulierung des Lipidstoffwechsels für mehrere Schritte der IAV-Replikation von entscheidender Bedeutung und hängt mit der Pathogenität von IAV zusammen. Hier wird zum ersten Mal gezeigt, dass eine IAV-Infektion eine lokale Anreicherung negativ geladener Lipide an der Innenseite der PM auslöst, die Fluidität und Dynamik der Membran verringert und die Lipidpackung an der Assemblierungsstelle in lebenden Zellen erhöht. Dies legt nahe, dass IAV die Lipid-Lipid-Wechselwirkungen und die Organisation am PM verändert. Insgesamt unterstreicht diese Arbeit das Potenzial biophysikalischer Techniken als Screening-Plattform zur Untersuchung von Membraneigenschaften in lebenden Zellen auf Einzelzellebene. Abschließend ging diese Studie auf verbleibende Fragen zur frühen Phase der IAV-Assemblierung ein. Die Rekrutierung von Matrixprotein 1 (M1) und seine Wechselwirkung mit anderen viralen Oberflächenproteinen, Hämagglutinin (HA), Neuraminidase (NA) und Matrixprotein 2 (M2), war aufgrund widersprüchlicher Ergebnisse Gegenstand von Debatten. In dieser Studie wurden verschiedene FFS-Ansätze in transfizierten Zellen durchgeführt, um Wechselwirkungen zwischen IAV-Proteinen untereinander und Wirtsfaktoren an der PM zu untersuchen. FFS-Messungen ergaben, dass M2 stark mit M1 interagiert, was zur Translokation von M1 zur PM führt. Diese Interaktion fand wahrscheinlich entlang des nichtkanonischen Weges statt, was durch den Nachweis einer Interaktion zwischen M2 und dem Wirtsfaktor LC3-II belegt wurde, die zur Rekrutierung von LC3-II zur PM führte. Darüber hinaus wurde eine schwächere Wechselwirkung zwischen HA und membrangebundenem M1 beobachtet und keine Wechselwirkung zwischen NA und M1. Interessanterweise waren höhere oligomere Zustände von M1 nur in infizierten Zellen nachweisbar. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass M2 den Zusammenbau von Virionen initiiert, indem es M1 zur PM rekrutiert, welches als Plattform für weitere Interaktionen mit viralen Proteinen und Wirtsfaktoren dienen könnte. KW - influenza A virus KW - virus-host interaction KW - cancer KW - biomolecule interactions KW - membrane fluidity KW - fluorescence fluctuation spectroscopy KW - fluorescent proteins KW - biosensors KW - Biomolekülinteraktionen KW - Biosensoren KW - Krebs KW - Fluoreszenzfluktuationsspektroskopie KW - fluoreszierende Proteine KW - Influenza A Virus KW - Membranfluidität KW - Virus-Wirt-Interaktion Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-611800 ER - TY - THES A1 - Pramanik, Shreya T1 - Protein reconstitution in giant vesicles N2 - Das Leben auf der Erde ist vielfältig und reicht von einzelligen Organismen bis hin zu mehrzelligen Lebewesen wie dem Menschen. Obwohl es Theorien darüber gibt, wie sich diese Organismen entwickelt haben könnten, verstehen wir nur wenig darüber, wie "Leben" aus Molekülen entstanden ist. Die synthetische Bottom-up-Biologie zielt darauf ab, minimale Zellen zu schaffen, indem sie verschiedene Module wie Kompartimentierung, Wachstum, Teilung und zelluläre Kommunikation kombiniert. Alle lebenden Zellen haben eine Membran, die sie von dem sie umgebenden wässrigen Medium trennt und sie schützt. Darüber hinaus haben alle eukaryotischen Zellen Organellen, die von intrazellulären Membranen umschlossen sind. Jede Zellmembran besteht hauptsächlich aus einer Lipiddoppelschicht mit Membranproteinen. Lipide sind amphiphile Moleküle, die molekulare Doppelschichten aus zwei Lipid-Monoschichten oder Blättchen bilden. Die hydrophoben Ketten der Lipide sind einander zugewandt, während ihre hydrophilen Kopfgruppen die Grenzflächen zur wässrigen Umgebung bilden. Riesenvesikel sind Modellmembransysteme, die Kompartimente mit einer Größe von mehreren Mikrometern bilden und von einer einzigen Lipiddoppelschicht umgeben sind. Die Größe der Riesenvesikel ist mit der Größe von Zellen vergleichbar und macht sie zu guten Membranmodellen, die mit einem Lichtmikroskop untersucht werden können. Allerdings fehlen den Riesenvesikelmembranen nach der ersten Präparation Membranproteine, die in weiteren Präparationsschritten in diese Membranen eingebaut werden müssen. Je nach Protein kann es entweder über Ankerlipide an eines der Membranblättchen gebunden oder über seine Transmembrandomänen in die Lipiddoppelschicht eingebaut werden. Diese Arbeit befasst sich mit der Herstellung von Riesenvesikeln und der Rekonstitution von Proteinen in diesen Vesikeln. Außerdem wird ein mikrofluidischer Chip entworfen, der in verschiedenen Experimenten verwendet werden kann. Die Ergebnisse dieser Arbeit werden anderen Forschern helfen, die Protokolle für die Herstellung von GUVs zu verstehen, Proteine in GUVs zu rekonstituieren und Experimente mit dem mikrofluidischen Chip durchzuführen. Auf diese Weise wird die vorliegende Arbeit für das langfristige Ziel von Nutzen sein, die verschiedenen Module der synthetischen Biologie zu kombinieren, um eine Minimalzelle zu schaffen. N2 - Life on Earth is diverse and ranges from unicellular organisms to multicellular creatures like humans. Although there are theories about how these organisms might have evolved, we understand little about how ‘life’ started from molecules. Bottom-up synthetic biology aims to create minimal cells by combining different modules, such as compartmentalization, growth, division, and cellular communication. All living cells have a membrane that separates them from the surrounding aqueous medium and helps to protect them. In addition, all eukaryotic cells have organelles that are enclosed by intracellular membranes. Each cellular membrane is primarily made of a lipid bilayer with membrane proteins. Lipids are amphiphilic molecules that assemble into molecular bilayers consisting of two leaflets. The hydrophobic chains of the lipids in the two leaflets face each other, and their hydrophilic headgroups face the aqueous surroundings. Giant unilamellar vesicles (GUVs) are model membrane systems that form large compartments with a size of many micrometers and enclosed by a single lipid bilayer. The size of GUVs is comparable to the size of cells, making them good membrane models which can be studied using an optical microscope. However, after the initial preparation, GUV membranes lack membrane proteins which have to be reconstituted into these membranes by subsequent preparation steps. Depending on the protein, it can be either attached via anchor lipids to one of the membrane leaflets or inserted into the lipid bilayer via its transmembrane domains. The first step is to prepare the GUVs and then expose them to an exterior solution with proteins. Various protocols have been developed for the initial preparation of GUVs. For the second step, the GUVs can be exposed to a bulk solution of protein or can be trapped in a microfluidic device and then supplied with the protein solution. To minimize the amount of solution and for more precise measurements, I have designed a microfluidic device that has a main channel, and several dead-end side channels that are perpendicular to the main channel. The GUVs are trapped in the dead-end channels. This design exchanges the solution around the GUVs via diffusion from the main channel, thus shielding the GUVs from the flow within the main channel. This device has a small volume of just 2.5 μL, can be used without a pump and can be combined with a confocal microscope, enabling uninterrupted imaging of the GUVs during the experiments. I used this device for most of the experiments on GUVs that are discussed in this thesis. In the first project of the thesis, a lipid mixture doped with an anchor lipid was used that can bind to a histidine chain (referred to as His-tag(ged) or 6H) via the metal cation Ni2+. This method is widely used for the biofunctionalization of GUVs by attaching proteins without a transmembrane domain. Fluorescently labeled His-tags which are bound to a membrane can be observed in a confocal microscope. Using the same lipid mixture, I prepared the GUVs with different protocols and investigated the membrane composition of the resulting GUVs by evaluating the amount of fluorescently labeled His-tagged molecules bound to their membranes. I used the microfluidic device described above to expose the outer leaflet of the vesicle to a constant concentration of the His-tagged molecules. Two fluorescent molecules with a His-tag were studied and compared: green fluorescent protein (6H-GFP) and fluorescein isothiocyanate (6H-FITC). Although the quantum yield in solution is similar for both molecules, the brightness of the membrane-bound 6H-GFP is higher than the brightness of the membrane-bound 6H-FITC. The observed difference in the brightness reveals that the fluorescence of the 6H-FITC is quenched by the anchor lipid via the Ni2+ ion. Furthermore, my measurements also showed that the fluorescence intensity of the membranebound His-tagged molecules depends on microenvironmental factors such as pH. For both 6H-GFP and 6H-FITC, the interaction with the membrane is quantified by evaluating the equilibrium dissociation constant. The membrane fluorescence is measured as a function of the fluorophores’ molar concentration. Theoretical analysis of these data leads to the equilibrium dissociation constants of (37.5 ± 7.5) nM for 6H-GFP and (18.5 ± 3.7) nM for 6H-FITC. The anchor lipid mentioned previously used the metal cation Ni2+ to mediate the bond between the anchor lipid and the His-tag. The Ni2+ ion can be replaced by other transition metal ions. Studies have shown that Co3+ forms the strongest bonds with the His-tags attached to proteins. In these studies, strong oxidizing agents were used to oxidize the Co2+ mediated complex with the His-tagged protein to a Co3+ mediated complex. This procedure puts the proteins at risk of being oxidized as well. In this thesis, the vesicles were first prepared with anchor lipids without any metal cation. The Co3+ was added to these anchor lipids and finally the His-tagged protein was added to the GUVs to form the Co3+ mediated bond. This system was also established using the microfluidic device. The different preparation procedures of GUVs usually lead to vesicles with a spherical morphology. On the other hand, many cell organelles have a more complex architecture with a non spherical topology. One fascinating example is provided by the endoplasmic reticulum (ER) which is made of a continuous membrane and extends throughout the cell in the form of tubes and sheets. The tubes are connected by three-way junctions and form a tubular network of irregular polygons. The formation and maintenance of these reticular networks requires membrane proteins that hydrolyize guanosine triphosphate (GTP). One of these membrane proteins is atlastin. In this thesis, I reconstituted the atlastin protein in GUV membranes using detergent-assisted reconstitution protocols to insert the proteins directly into lipid bilayers. This thesis focuses on protein reconstitution by binding His-tagged proteins to anchor lipids and by detergent-assisted insertion of proteins with transmembrane domains. It also provides the design of a microfluidic device that can be used in various experiments, one example is the evaluation of the equilibrium dissociation constant for membrane-protein interactions. The results of this thesis will help other researchers to understand the protocols for preparing GUVs, to reconstitute proteins in GUVs, and to perform experiments using the microfluidic device. This knowledge should be beneficial for the long-term goal of combining the different modules of synthetic biology to make a minimal cell. KW - protein reconstitution KW - giant vesicles KW - microfluidics KW - synthetic biology KW - Riesenvesikel KW - Mikrofluidik KW - Proteinrekonstitution KW - synthetische Biologie Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-612781 ER - TY - THES A1 - Ogunkola, Moses T1 - Role of the tRNA thiouridine modification protein (TUM1) as a sulfurtransferase in humans T1 - Die Rolle des tRNA-Thiouridin-Modifikationsproteins (TUM1) als Sulfurtransferase beim Menschen N2 - Sulfur is essential for the functionality of some important biomolecules in humans. Biomolecules like the Iron-sulfur clusters, tRNAs, Molybdenum cofactor, and some vitamins. The trafficking of sulfur involves proteins collectively called sulfurtransferase. Among these are TUM1, MOCS3, and NFS1. This research investigated the role of TUM1 for molybdenum cofactor biosynthesis and cytosolic tRNA thiolation in humans. The rhodanese-like protein MOCS3 and the L-cysteine desulfurase (NFS1) have been previously demonstrated to interact with TUM1. These interactions suggested a dual function of TUM1 in sulfur transfer for Moco biosynthesis and cytosolic tRNA thiolation. TUM1 deficiency has been implicated to be responsible for a rare inheritable disorder known as mercaptolactate cysteine disulfiduria (MCDU), which is associated with a mental disorder. This mental disorder is similar to the symptoms of sulfite oxidase deficiency which is characterised by neurological disorders. Therefore, the role of TUM1 as a sulfurtransferase in humans was investigated, in CRISPR/Cas9 generated TUM1 knockout HEK 293T cell lines. For the first time, TUM1 was implicated in Moco biosynthesis in humans by quantifying the intermediate product cPMP and Moco using HPLC. Comparing the TUM1 knockout cell lines to the wild-type, accumulation and reduction of cPMP and Moco were observed respectively. The effect of TUM1 knockout on the activity of a Moco-dependent enzyme, Sulfite oxidase, was also investigated. Sulfite oxidase is essential for the detoxification of sulfite to sulfate. Sulfite oxidase activity and protein abundance were reduced due to less availability of Moco. This shows that TUM1 is essential for efficient sulfur transfer for Moco biosynthesis. Reduction in cystathionin -lyase in TUM1 knockout cells was quantified, a possible coping mechanism of the cell against sulfite production through cysteine catabolism. Secondly, the involvement of TUM1 in tRNA thio-modification at the wobble Uridine-34 was reported by quantifying the amount of mcm5s2U and mcm5U via HPLC. The reduction and accumulation of mcm5s2U and mcm5U in TUM1 knockout cells were observed in the nucleoside analysis. Herein, exogenous treatment with NaHS, a hydrogen sulfide donor, rescued the Moco biosynthesis, cytosolic tRNA thiolation, and cell proliferation deficits in TUM1 knockout cells. Further, TUM1 was shown to impact mitochondria bioenergetics through the measurement of the oxygen consumption rate and extracellular acidification rate (ECAR) via the seahorse cell Mito stress analyzer. Reduction in total ATP production was also measured. This reveals how important TUM1 is for H2S biosynthesis in the mitochondria of HEK 293T. Finally, the inhibition of NFS1 in HEK 293T and purified NFS1 protein by 2-methylene 3-quinuclidinone was demonstrated via spectrophotometric and radioactivity quantification. Inhibition of NFS1 by MQ further affected the iron-sulfur cluster-dependent enzyme aconitase activity. N2 - Schwefel ist für die Funktionalität einiger wichtiger Biomoleküle beim Menschen wie die Eisen-Schwefel-Cluster, tRNA, Molybdän-Cofaktoren und einige Vitamine unerlässlich. Am Schwefelverkehr ist eine weit verbreitete Gruppe von Proteinen beteiligt, die als Rhodanese (Sulfurtransferase) bezeichnet wird. Zu dieser Klasse von Enzymen gehören die humanen (Proteine) TUM1, MOCS3 und NFS1. Es hat sich gezeigt, dass TUM1 mit der L-Cystein-Desulfurase (NFS1) und dem rhodaneseähnlichen Protein MOCS3 interagiert. Diese Wechselwirkungen deuten auf eine Doppelfunktion von TUM1 beim Schwefeltransfer für die Moco-Biosynthese und die zytosolische tRNA-Thiolierung hin. Ein TUM1-Mangel wird für eine seltene vererbbare Störung verantwortlich gemacht, die als Mercaptolactat-Cystein-Disulfidurie (MCDU) bekannt ist und mit geistigen Störungen einhergeht. Diese psychische Störung könnte auf die Symptome des Sulfit-Oxidase-Mangels zurückzuführen sein, der auch durch neurologische Störungen gekennzeichnet ist. In dieser Studie wurde zum ersten Mal die Rolle von TUM1 bei der Biosynthese von Molybdän-Cofaktoren und der zytosolischen tRNA-Thiolierung beim Menschen untersucht. Dies wurde durch die Verwendung von einer zuvor generierten TUM1-Deletion in HEK 293T-Zelllinien unter Verwendung von CRISPR/Cas9 erreicht. Hier wurde zum ersten Mal die Funktion von TUM1 in der Moco-Biosynthese im Menschen untersucht, wobei das Zwischenprodukt cPMP und Moco mittels HPLC quantifiziert wurde. Beim Vergleich der TUM1-deletierten-Zelllinien mit dem Wildtyp wurde eine Akkumulation bzw. Reduktion von cPMP und Moco beobachtet. Die Auswirkungen der TUM1-Deletion auf die Aktivität eines Moco-abhängigen Enzyms, der Sulfit-Oxidase, wurden ebenfalls untersucht. Sulfit ist wichtig für die Entgiftung von Sulfit zu Sulfat. Die Aktivität der Sulfit-Oxidase und die Proteinquantität waren aufgrund der geringeren Verfügbarkeit von Moco reduziert. Dies zeigt, dass TUM1 für einen effizienten Schwefeltransfer für die Moco-Biosynthese wichtig ist. Wir berichteten auch über die Verringerung der Cystathionin -Lyase in TUM1-deletierten-Zellen, ein möglicher Bewältigungsmechanismus der Zelle gegen die Sulfitproduktion. Zweitens wurde die Beteiligung von TUM1 an der tRNA-ThioModifikation am Wobble Uridin-34 durch Quantifizierung der Menge an mcm5s2U und mcm5U mittels HPLC untersucht. Es wurde eine Reduktion bzw. Akkumulation von mcm5s2U und mcm5U in TUM1-Knockout-Zellen beobachtet. Die exogene Behandlung mit NaHS, einem Schwefelwasserstoff-Donor, rettete die Moco-Biosynthese, die zytosolische tRNA-Thiolation und das Defizit der Zellproliferation in TUM1-deletion-Zellen. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass TUM1 die Bioenergetik der Mitochondrien beeinflusst, indem die Sauerstoffverbrauchsrate und die extrazelluläre Versauerungsrate (ECAR) über den Seahorse XF Analyzer gemessen wurden. Eine Verringerung der gesamten ATP-Produktion war ebenfalls erkennbar. Dies zeigt, wie wichtig TUM1 für die H2S-Biosynthese in den Mitochondrien von HEK 293T ist. Schließlich wurde die Hemmung von NFS1 in HEK 293T und gereinigtem NFS1-Protein durch 2-Methylen-3-chinuclidinon mittels spektrophotometrischer und radioaktiver Quantifizierung nachgewiesen. Die Hemmung von NFS1 durch 2-Methylen-3-chinuclidinon verringerte die Aktivität des von Eisen-Schwefel-Clustern abhängigen Enzyms Aconitase in HEK 293T. KW - Moco biosynthesis KW - sulfite oxidase KW - cytosolic tRNA thiolation KW - 5-methoxycarbonylmethyl-2-thiouridine KW - H2S biosynthesis KW - cellular bioenergetics KW - Moco-Biosynthese KW - Sulfit-Oxidase KW - zytosolische tRNA-Thiolierung KW - 5-Methoxycarbonylmethyl-2-Thiouridin KW - H2S-Biosynthese KW - zelluläre Bioenergetik Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-611357 ER - TY - THES A1 - Mendes Ferreira, Clara T1 - Indirect, tri-trophic effects of fear on biodiversity N2 - Predator-forager interactions are a major factor in evolutionary adaptation of many species, as predators need to gain energy by consuming prey species, and foragers needs to avoid the worst fate of mortality while still consuming resources for energetic gains. In this evolutionary arms race, the foragers have constantly evolved anti-predator behaviours (e.g. foraging activity changes). To describe all these complex changes, researchers developed the framework of the landscape of fear, that is, the spatio-temporal variation of perceived predation risk. This concept simplifies all the involved ecological processes into one framework, by integrating animal biology and distribution with habitat characteristics. Researchers can then evaluate the perception of predation risk in prey species, what are the behavioural responses of the prey and, therefore, understand the cascading effects of landscapes of fear at the resource levels (tri-trophic effects). Although tri-trophic effects are well studied at the predator-prey interaction level, little is known on how the forager-resource interactions are part of the overall cascading effects of landscapes of fear, despite the changes of forager feeding behaviour - that occur with perceived predation risk - affecting directly the level of the resources. This thesis aimed to evaluate the cascading effects of the landscape of fear on biodiversity of resources, and how the feeding behaviour and movement of foragers shaped the final resource species composition (potential coexistence mechanisms). We studied the changes caused by landscapes of fear on wild and captive rodent communities and evaluated: the cascading effects of different landscapes of fear on a tri-trophic system (I), the effects of fear on a forager’s movement patterns and dietary preferences (II) and cascading effects of different types of predation risk (terrestrial versus avian, III). In Chapter I, we applied a novel measure to evaluate the cascading effects of fear at the level of resources, by quantifying the diversity of resources left after the foragers gave-up on foraging (diversity at the giving-up density). We tested the measure at different spatial levels (local and regional) and observed that with decreased perceived predation risk, the density and biodiversity of resources also decreased. Foragers left a very dissimilar community of resources based on perceived risk and resources functional traits, and therefore acted as an equalising mechanism. In Chapter II, we wanted to understand further the decision-making processes of rodents in different landscapes of fear, namely, in which resource species rodents decided to forage on (based on three functional traits: size, nutrients and shape) and how they moved depending on perceived predation risk. In safe landscapes, individuals increased their feeding activity and movements and despite the increased costs, they visited more often patches that were further away from their central-place. Despite a preference for the bigger resources regardless of risk, when perceived predation risk was low, individuals changed their preference to fat-rich resources. In Chapter III, we evaluated the cascading effects of two different types of predation risk in rodents: terrestrial (raccoon) versus avian predation risk. Raccoon presence or absence did not alter the rodents feeding behaviour in different landscapes of fear. Rodent’s showed risk avoidance behaviours towards avian predators (spatial risk avoidance), but not towards raccoons (lack of temporal risk avoidance). By analysing the effects of fear in tri-trophic systems, we were able to deepen the knowledge of how non-consumptive effects of predators affect the behaviour of foragers, and quantitatively measure the cascading effects at the level of resources with a novel measure. Foragers are at the core of the ecological processes and responses to the landscape of fear, acting as variable coexistence agents for resource species depending on perceived predation risk. This newly found measures and knowledge can be applied to more trophic chains, and inform researchers on biodiversity patterns originating from landscapes of fear. N2 - Die Wechselwirkungen zwischen Raubtier und Beute sind ein wichtiger Faktor in der Evolution der Tierwelt, da sich die Raubtiere anpassen müssen, um ihre Beute besser jagen zu können und die Beutetiere vermeiden müssen, gefressen zu werden, während sie immer noch genügend Ressourcen für ihre täglichen Bedürfnisse verbrauchen. In diesem ständigen Kampf müssen die Beutetiere ihr Verhalten ständig ändern, da sie die Anwesenheit von Raubtieren fürchten. Die Landschaft der Angst ist ein Rahmen, der alle ökologischen Prozesse beschreibt, die ablaufen, wenn die Tiere das Raubtierrisiko auf unterschiedliche Weise wahrnehmen. In Angstlandschaften reichen die indirekten Auswirkungen der Angst vor einem Raubtier aus, um eine Vielzahl von Reaktionen bei den Beutetieren hervorzurufen und folglich die Art und Weise zu beeinflussen, in der die Beutetiere Naturgutstype fressen (tritrophe Effekte). Während die Interaktionen zwischen Raubtieren und Beutetieren gut erforscht sind, fehlt es an Wissen darüber, wie die Landschaft der Angst die Interaktionen zwischen Beutetieren und Naturgutstype beeinflussen kann (z. B. Pflanzenfresser, die Pflanzen fressen). In dieser Arbeit untersuchten wir die Kaskadeneffekte (d.h. Domino Effekte), die Beutetiere auf Naturgutstype haben, wenn sie verschiedene Prädationsrisiken wahrnehmen. Insbesondere wollten wir untersuchen, wie die Beutetiere entscheiden, was sie fressen und wohin sie sich bewegen, wie sich diese Veränderungen auf die biologische Vielfalt der Ressourcen auswirken können und welche Folgen dies für die Evolution der Ressourcenarten hat. Für alle unsere Studien haben wir Nagetiere als Modellarten verwendet. Wir entwickelten ein neues Maß zur Quantifizierung der Auswirkungen von Angst auf die biologische Vielfalt von Ressourcen und testeten es erfolgreich an wilden Nagetierpopulationen. Wir konnten beobachten, dass die Nagetiere unterschiedliche Samenarten und -mengen fressen, je nachdem, wie sie das Raubtierrisiko einschätzen und abhängig von den Eigenschaften der Samen und der Art der vorhandenen Raubtiere (terrestrische oder aviäre Fleischfresser). Wir konnten diese Veränderungen quantifizieren und Vorhersagen darüber machen, wie sich der Wettbewerb zwischen den Samen um das Wachstum verändern würde (Koexistenzmechanismen). Mit diesem Wissen haben wir den Rahmen der Angstlandschaft um die komplexen Wechselwirkungen zwischen Beute und Ressourcen erweitert und können unsere Erkenntnisse auch dazu nutzen, um zu verstehen, wie weitere Tierarten die biologische Vielfalt anderer Arten verändern, indem wir einfach verstehen, wie ängstlich sie sind. KW - landscape of fear KW - functional traits KW - foraging behaviour KW - biodiversity KW - giving-up density KW - cascading effects KW - Biodiversität KW - Kaskadeneffekte KW - Futtersuchverhalten KW - funktionale Merkmale KW - Landschaft der Angst Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-611020 ER - TY - THES A1 - Riedel, Soraya Lisanne T1 - Development of electrochemical antibody-based and enzymatic assays for mycotoxin analysis in food T1 - Entwicklung elektrochemischer Antikörper- und Enzym-basierter Assays für die Analyse von Mykotoxinen in Lebensmitteln N2 - Electrochemical methods are promising to meet the demand for easy-to-use devices monitoring key parameters in the food industry. Many companies run own lab procedures for mycotoxin analysis, but it is a major goal to simplify the analysis. The enzyme-linked immunosorbent assay using horseradish peroxidase as enzymatic label, together with 3,3',5,5' tetramethylbenzidine (TMB)/H2O2 as substrates allows sensitive mycotoxin detection with optical detection methods. For the miniaturization of the detection step, an electrochemical system for mycotoxin analysis was developed. To this end, the electrochemical detection of TMB was studied by cyclic voltammetry on different screen-printed electrodes (carbon and gold) and at different pH values (pH 1 and pH 4). A stable electrode reaction, which is the basis for the further construction of the electrochemical detection system, could be achieved at pH 1 on gold electrodes. An amperometric detection method for oxidized TMB, using a custom-made flow cell for screen-printed electrodes, was established and applied for a competitive magnetic bead-based immunoassay for the mycotoxin ochratoxin A. A limit of detection of 150 pM (60 ng/L) could be obtained and the results were verified with optical detection. The applicability of the magnetic bead-based immunoassay was tested in spiked beer using a handheld potentiostat connected via Bluetooth to a smartphone for amperometric detection allowing to quantify ochratoxin A down to 1.2 nM (0.5 µg/L). Based on the developed electrochemical detection system for TMB, the applicability of the approach was demonstrated with a magnetic bead-based immunoassay for the ergot alkaloid, ergometrine. Under optimized assay conditions a limit of detection of 3 nM (1 µg/L) was achieved and in spiked rye flour samples ergometrine levels in a range from 25 to 250 µg/kg could be quantified. All results were verified with optical detection. The developed electrochemical detection method for TMB gives great promise for the detection of TMB in many other HRP-based assays. A new sensing approach, based on an enzymatic electrochemical detection system for the mycotoxin fumonisin B1 was established using an Aspergillus niger fumonisin amine oxidase (AnFAO). AnFAO was produced recombinantly in E. coli as maltose-binding protein fusion protein and catalyzes the oxidative deamination of fumonisins, producing hydrogen peroxide. It was found that AnFAO has a high storage and temperature stability. The enzyme was coupled covalently to magnetic particles, and the enzymatically produced H2O2 in the reaction with fumonisin B1 was detected amperometrically in a flow injection system using Prussian blue/carbon electrodes and the custom-made wall-jet flow cell. Fumonisin B1 could be quantified down to 1.5 µM (≈ 1 mg/L). The developed system represents a new approach to detect mycotoxins using enzymes and electrochemical methods. N2 - Zur Entwicklung von einfach zu bedienenden Vor-Ort-Geräten, welche für die Analytik von wichtigen Parametern in der Lebensmittelindustrie eingesetzt werden können, sind elektrochemische Methoden besonders vielversprechend. Viele Unternehmen führen bereits Mykotoxinanalytik in eigenen Laboren am Produktionsstandort durch, dennoch gibt es große Bestrebungen Analysenmethoden weiter zu vereinfachen. Der Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), welcher häufig mit der Meerrettichperoxidase als enzymatischem Label und 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB)/H2O2 als Enzymsubstraten arbeitet, ermöglicht den sensitiven Mykotoxinnachweis mithilfe optischer Detektionsmethoden. Zur Miniaturisierung des Detektionsschrittes wurde in dieser Arbeit der Aufbau von elektrochemischen Detektionssystemen für die Mykotoxinanalytik untersucht. Dazu wurde zunächst die elektrochemische Reaktion von TMB an verschiedenen Materialien siebgedruckter Elektroden (Kohlenstoff und Gold) sowie bei verschiedenen pH-Werten (pH 1 und pH 4) untersucht. Eine stabile Elektrodenreaktion, welche die Grundlage für den weiteren Aufbau des elektrochemischen Detektionssystems darstellt, konnte bei pH 1 an Goldelektroden erzielt werden. Basierend darauf wurde eine amperometrische Detektionsmethode für oxidiertes TMB entwickelt, wofür eine maßgefertigte Durchflusszelle verwendet wurde. Die amperometrische TMB-Detektion wurde für einen kompetitiven Magnetpartikel-basierten Immunoassay für Ochratoxin A eingesetzt. Mit diesem Assay wurde eine Nachweisgrenze von 150 pM (60 ng L-1) erreicht und die Ergebnisse konnten durch optische Detektion verifiziert werden. Die Anwendbarkeit des Assays konnte in Ochratoxin A dotiertem Bier demonstriert werden, wobei für die Detektion ein tragbarer Potentiostat verwendet wurde, welcher über Bluetooth mit einem Smartphone verbunden war. Hiermit konnten niedrige Ochratoxin A Konzentration von bis zu 1.2 nM (0.5 µg L-1) bestimmt werden. Aufbauend auf dem entwickelten elektrochemischen Detektionssystem für TMB wurde die Anwendbarkeit des Ansatzes auf einen Magnetpartikel-basierten Immunoassay für das Ergotalkaloid Ergometrine, evaluiert. Unter optimierten Bedingungen konnte mit dem Assay eine Nachweisgrenze von 3 nM (1 µg L-1) erreicht werden. In mit Ergometrin versetztem Roggenmehl konnten Konzentrationen von 25 bis 250 µg kg-1 nachgewiesen werden. Die entwickelte elektrochemische Nachweismethode für TMB bietet einen vielversprechenden Ansatz für den Einsatz in vielen anderen Meerrettichperoxidase-basierten Assays. Für das Mykotoxin Fumonisin B1, wurde ein neues sensorisches System entwickelt, welches auf einem enzymatischen elektrochemischen Nachweis basiert. Hierfür wurde eine Aspergillus niger Fumonisin Aminoxidase (AnFAO) rekombinant als Fusionsprotein mit dem Maltose-bindenden Protein exprimiert. AnFAO katalysiert die oxidative Deaminierung von Fumonisinen, wobei H2O2 gebildet wird. Es konnte gezeigt werden, dass AnFAO eine hohe Lagerungs- und Temperaturstabilität hat. Für den Nachweis von Fumonisin B1 wurde das Enzym kovalent an Magnetpartikel gekoppelt. Das enzymatisch produzierte H2O2 konnte anschließend amperometrisch mithilfe von Preußisch Blau/Kohlenstoff-Elektroden in der maßgefertigten Durchflusszelle detektiert werden. Fumonisin B1 konnte bis zu einer Konzentration von 1,5 µM (≈ 1 mg L-1) quantifiziert werden. Das entwickelte System stellt einen neuen Ansatz dar, um Mykotoxine unter Nutzung von Enzymen und elektrochemischen Methoden zu detektieren. KW - mycotoxins KW - Mykotoxine KW - immunoassay KW - Immunoassay KW - food analysis KW - Lebensmittelanalytik KW - enzyme KW - Enzym KW - amperometry KW - Amperometrie Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-607477 ER - TY - THES A1 - Soltani, Ouad T1 - BLF1-Mode of Action in Barley Leaf Size Control N2 - Establishment of final leaf size in plants represents a complex mechanism that relies on the precise regulation of two interconnected cellular processes, cell division and cell expansion. In previous work, the barley protein BROAD LEAF1 (BLF1) was identified as a novel negative regulator of cell proliferation, that mainly limits leaf growth in the width direction. Here I identified a novel RING/U-box protein that interacts with BLF1 through a yeast two hybrid screen. Using BiFC, Co-IP and FRET I confirmed the interaction of the two proteins in planta. Enrichment of the BLF1-mEGFP fusion protein and the increase of the FRET signal upon MG132 treatment of tobacco plants, together with an in vivo ubiquitylation assay in bacteria, confirmed that the RING/U-box E3 interacts with BLF1 to mediate its ubiquitylation and degradation by the 26S proteasome system. Consistent with regulation of endogenous BLF1 in barley by proteasomal degradation, inhibition of the proteasome by bortezomib treatment on BLF1-vYFP transgenic barley plants also resulted in an enrichment of the BLF1 protein. I thus demonstrated that RING/U-box E3 is colocalized with BLF1 in nuclei and negatively regulates BLF1 protein levels. Analysis of ring-e3_1 knock-out mutants suggested the involvement of the RING/U-box E3 gene in leaf growth control, although the effect was mainly on leaf length. Together, my results suggest that proteasomal degradation, possibly mediated by RING/U-box E3, contributes to fine-tuning BLF1 protein-level in barley. N2 - Die Festlegung der endgültigen Blattgröße bei Pflanzen ist ein komplexer Mechanismus, der auf der präzisen Regulierung zweier miteinander verbundener zellulärer Prozesse beruht, der Zellteilung und der Zellexpansion. In einer früheren Arbeit wurde das Gerstenprotein BROAD LEAF1 (BLF1), als ein neuartiger negativer Regulator der Zellproliferation identifiziert, der das Blattwachstum hauptsächlich in Richtung der Breite begrenzt. Hier habe ich durch einen Hefe-Zwei-Hybrid-Screen ein neuartiges RING/U-Box-Protein identifiziert, das mit BLF1 interagiert. Mittels BiFC, Co-IP und FRET konnte ich die Interaktion der beiden Proteine in der Pflanze bestätigen. Die Anreicherung des BLF1-mEGFP-Fusionsproteins und der Anstieg des FRET-Signals bei der Behandlung von Tabakpflanzen mit MG132 sowie ein in vivo Ubiquitylierungsassay in Bakterien bestätigten, dass das RING/U-Box-E3 mit BLF1 interagiert und dessen Ubiquitylierung und Abbau durch das 26S-Proteasom-System vermittelt. Darüber hinaus habe ich festgestellt, dass die Behandlung mit Bortezomib, einem Inhibitor des Proteasoms, bei BLF1-vYFP-transgenen Pflanzen ebenfalls zu einer Anreicherung des BLF1-Proteins führt. Ich zeige dass RING/U-Box E3 mit BLF1 in den Zellkernen kolokalisiert ist und den BLF1-Proteinspiegel negativ reguliert. Die Analyse der Knock-out-Mutante ring-e3_1 legte eine Beteiligung das RING/U-Box-E3 Gen an der Kontrolle des Blattlänge nahe, was es zu einem guten Kandidaten macht, der die Funktion des BLF1-Gens regulieren könnte. KW - Barley KW - Gerste KW - leaf width KW - Blattbreite KW - cell proliferation KW - Zellproliferation KW - INDETERMINATE DOMAIN protein KW - INDETERMINATE DOMAIN-Protein KW - BROAD LEAF1 KW - RING/U-box E3 KW - ubiquitination KW - Ubiquitinierung KW - proteasomal degradation KW - 26S-Proteasom-System-Abbau KW - protein-level regulation KW - Proteinspiegel regulieren Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-607054 ER - TY - THES A1 - Carrasco, Tomas T1 - Genome structure analysis and patterns of transposable elements evolution in the slow-evolving Testudines clade N2 - Transposable elements (TEs) are loci that can replicate and multiply within the genome of their host. Within the host, TEs through transposition are responsible for variation on genomic architecture and gene regulation across all vertebrates. Genome assemblies have increased in numbers in recent years. However, to explore in deep the variations within different genomes, such as SNPs (single nucleotide polymorphism), INDELs (Insertion-deletion), satellites and transposable elements, we need high-quality genomes. Studies of molecular markers in the past 10 years have limitations to correlate with biological differences because molecular markers rely on the accuracy of the genomic resources. This has generated that a substantial part of the studies of TE in recent years have been on high quality genomic resources such as Drosophila, zebrafinch and maize. As testudine have a slow mutation rate lower only to crocodilians, with more than 300 species, adapted to different environments all across the globe, the testudine clade can help us to study variation. Here we propose Testudines as a clade to study variation and the abundance of TE on different species that diverged a long time ago. We investigated the genomic diversity of sea turtles, identifying key genomic regions associated to gene family duplication, specific expansion of particular TE families for Dermochelyidae and that are important for phenotypic differentiation, the impact of environmental changes on their populations, and the dynamics of TEs within different lineages. In chapter 1, we identify that despite high levels of genome synteny within sea turtles, we identified that regions of reduced collinearity and microchromosomes showed higher concentrations of multicopy gene families, as well as genetic distances between species, indicating their potential importance as sources of variation underlying phenotypic differentiation. We found that differences in the ecological niches occupied by leatherback and green turtles have led to contrasting evolutionary paths for their olfactory receptor genes. We identified in leatherback turtles a long-term low population size. Nonetheless, we identify no correlation between the regions of reduced collinearity with abundance of TEs or an accumulation of a particular TE group. In chapter 2, we identified that sea turtle genomes contain a significant proportion of TEs, with differences in TE abundance between species, and the discovery of a recent expansion of Penelope-like elements (PLEs) in the highly conserved sea turtle genome provides new insights into the dynamics of TEs within Testudines. In chapter 3, we compared the proportion of TE across the Testudine clade, and we identified that the proportion of transposable elements within the clade is stable, regardless of the quality of the assemblies. However, we identified that the proportion of TEs orders has correlation with genome quality depending of their expanded abundancy. For retrotransposon, a highly abundant element for this clade, we identify no correlation. However, for DNA elements a rarer element on this clade, correlate with the quality of the assemblies. Here we confirm that high-quality genomes are fundamental for the study of transposable element evolution and the conservation within the clade. The detection and abundance of specific orders of TEs are influenced by the quality of the genomes. We identified that a reduction in the population size on D. coriacea had left signals of long-term low population sizes on their genomes. On the same note we identified an expansion of TE on D. coriacea, not present in any other member of the available genomes of Testudines, strongly suggesting that it is a response of deregulation of TE on their genomes as consequences of the low population sizes. Here we have identified important genomic regions and gene families for phenotypic differentiation and highlighted the impact of environmental changes on the populations of sea turtles. We stated that accurate classification and analysis of TE families are important and require high-quality genome assemblies. Using TE analysis we manage to identify differences in highly syntenic species. These findings have significant implications for conservation and provide a foundation for further research into genome evolution and gene function in turtles and other vertebrates. Overall, this study contributes to our understanding of evolutionary change and adaptation mechanisms. N2 - Transponierbare Elemente (TEs) sind Loci, die sich im Genom ihres Wirts replizieren und vermehren können. Innerhalb des Wirts sind TEs durch Transposition für die Variation der genomischen Architektur und der Genregulation bei allen Wirbeltieren verantwortlich. In den letzten Jahren hat die Zahl der Genomassemblies zugenommen. Um jedoch die Variationen innerhalb verschiedener Genome, wie SNPs, INDELs, Satelliten und transponierbare Elemente, eingehend zu untersuchen, benötigen wir qualitativ hochwertige Genome. Studien über molekulare Marker in den letzten 10 Jahren haben nur begrenzt mit biologischen Unterschieden korreliert, da molekulare Marker von der Genauigkeit der genomischen Ressourcen abhängen. Dies hat dazu geführt, dass ein großer Teil der TE-Studien der letzten Jahre an qualitativ hochwertigen genomischen Ressourcen wie Drosophila, Zebrafinken und Mais durchgeführt wurde. Da die Testudinen eine langsame Mutationsrate haben, die nur bei Krokodilen niedriger ist, aber mehr als 300 Arten umfassen, die an verschiedene Umgebungen auf der ganzen Welt angepasst sind, kann uns diese Gruppe bei der Untersuchung der Variation helfen. Hier schlagen wir Testudinen als Klade vor, um die Variation und die Häufigkeit von TE bei verschiedenen Arten zu untersuchen, die sich vor langer Zeit auseinanderentwickelt haben. Wir untersuchten die genomische Vielfalt der Meeresschildkröten und identifizierten genomische Schlüsselregionen, die mit der Duplikation von Genfamilien, der spezifischen Ausbreitung bestimmter TE-Familien bei den Dermochelyidae verbunden und für die phänotypische Differenzierung wichtig sind, sowie die Auswirkungen von Umweltveränderungen auf ihre Populationen und die Dynamik transponierbarer Elemente (TEs) innerhalb verschiedener Linien. In Kapitel 1 stellen wir fest, dass trotz des hohen Maßes an Genomsyntenie innerhalb der Meeresschildkröten Regionen mit geringerer Kollinearität und Mikrochromosomen eine höhere Konzentration von Genfamilien mit mehreren Kopien sowie genetische Abstände zwischen den Arten aufweisen, was auf ihre potenzielle Bedeutung als Variationsquellen für die phänotypische Differenzierung hinweist. Wir fanden heraus, dass die Unterschiede in den ökologischen Nischen, die Lederschildkröten und Suppenschildkröten besetzen, zu gegensätzlichen evolutionären Pfaden für ihre Geruchsrezeptorgene geführt haben. Bei Lederschildkröten haben wir Anzeichen für langfristig niedrige Populationsgrößen festgestellt. Dennoch konnten wir keine Korrelation zwischen den Regionen mit reduzierter Kollinearität und der Häufigkeit von TEs oder einer Akkumulation einer bestimmten TE-Gruppe feststellen. In Kapitel 2 haben wir festgestellt, dass die Genome von Meeresschildkröten einen beträchtlichen Anteil an TEs enthalten, mit Unterschieden in der TE-Häufigkeit zwischen den Arten, und die Entdeckung einer kürzlichen Ausbreitung von Penelope-ähnlichen Elementen (PLEs) im hochkonservierten Genom von Meeresschildkröten bietet neue Einblicke in die Dynamik von TEs innerhalb der Testudinen. In Kapitel 3 haben wir den Anteil der TE innerhalb der Testudinenklade verglichen und festgestellt, dass der Anteil der transponierbaren Elemente innerhalb der Klade stabil ist, unabhängig von der Qualität der Assemblies. Allerdings haben wir festgestellt, dass der Anteil der TEs Bestellungen hat Korrelation mit Genom Qualität in Abhängigkeit von ihrer erweiterten Häufigkeit, wie auf Retrotransposon, ein sehr häufig Element für diese Klade, wir identifizieren keine Korrelation, aber, DNA-Elemente ein seltener Element auf dieser Klade, korrelieren mit der Qualität der Baugruppen. Hier bestätigen wir, dass qualitativ hochwertige Genome für die Untersuchung der Entwicklung transponierbarer Elemente und der Erhaltung innerhalb der Gruppe von grundlegender Bedeutung sind. Der Nachweis und die Häufigkeit bestimmter Ordnungen von TEs werden durch die Qualität der Genome beeinflusst. Wir haben festgestellt, dass eine Verringerung der Populationsgröße bei D. coriacea Signale für langfristig niedrige Populationsgrößen in ihren Genomen hinterlassen hat. Gleichzeitig haben wir bei D. coriacea eine Ausdehnung der TE festgestellt, die in keinem anderen Mitglied der verfügbaren Genome der Testudinen vorkommt, was stark darauf hindeutet, dass es sich um eine Reaktion auf die Deregulierung der TE auf ihren Genomen als Folge der geringen Populationsgrößen handelt. Hier haben wir wichtige genomische Regionen und Genfamilien für die phänotypische Differenzierung identifiziert und die Auswirkungen von Umweltveränderungen auf die Populationen von Meeresschildkröten aufgezeigt. Wir haben festgestellt, dass eine genaue Klassifizierung und Analyse von TE-Familien wichtig ist und qualitativ hochwertige Genomassemblies erfordert. Mit Hilfe der TE-Analyse gelingt es uns, Unterschiede in hochsynthetischen Arten zu identifizieren. Diese Ergebnisse sind von großer Bedeutung für den Artenschutz und bilden eine Grundlage für die weitere Erforschung der Genomevolution und der Genfunktionen bei Schildkröten und anderen Wirbeltieren. Insgesamt trägt diese Studie zu unserem Verständnis des evolutionären Wandels und der Anpassungsmechanismen bei. KW - transposable elements KW - Chelonia mydas KW - Dermochelys coriacea KW - evolutionary biology KW - Transponierbare Elemente KW - Chelonia mydas KW - Dermochelys coriacea KW - Evolutionsbiologie Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-606577 ER - TY - THES A1 - Malchow, Anne-Kathleen T1 - Developing an integrated platform for predicting niche and range dynamics BT - inverse calibration of spatially-explicit eco-evolutionary models N2 - Species are adapted to the environment they live in. Today, most environments are subjected to rapid global changes induced by human activity, most prominently land cover and climate changes. Such transformations can cause adjustments or disruptions in various eco-evolutionary processes. The repercussions of this can appear at the population level as shifted ranges and altered abundance patterns. This is where global change effects on species are usually detected first. To understand how eco-evolutionary processes act and interact to generate patterns of range and abundance and how these processes themselves are influenced by environmental conditions, spatially-explicit models provide effective tools. They estimate a species’ niche as the set of environmental conditions in which it can persist. However, the currently most commonly used models rely on static correlative associations that are established between a set of spatial predictors and observed species distributions. For this, they assume stationary conditions and are therefore unsuitable in contexts of global change. Better equipped are process-based models that explicitly implement algorithmic representations of eco-evolutionary mechanisms and evaluate their joint dynamics. These models have long been regarded as difficult to parameterise, but an increased data availability and improved methods for data integration lessen this challenge. Hence, the goal of this thesis is to further develop process-based models, integrate them into a complete modelling workflow, and provide the tools and guidance for their successful application. With my thesis, I presented an integrated platform for spatially-explicit eco-evolutionary modelling and provided a workflow for their inverse calibration to observational data. In the first chapter, I introduced RangeShiftR, a software tool that implements an individual-based modelling platform for the statistical programming language R. Its open-source licensing, extensive help pages and available tutorials make it accessible to a wide audience. In the second chapter, I demonstrated a comprehensive workflow for the specification, calibration and validation of RangeShiftR by the example of the red kite in Switzerland. The integration of heterogeneous data sources, such as literature and monitoring data, allowed to successfully calibrate the model. It was then used to make validated, spatio-temporal predictions of future red kite abundance. The presented workflow can be adopted to any study species if data is available. In the third chapter, I extended RangeShiftR to directly link demographic processes to climatic predictors. This allowed me to explore the climate-change responses of eight Swiss breeding birds in more detail. Specifically, the model could identify the most influential climatic predictors, delineate areas of projected demographic suitability, and attribute current population trends to contemporary climate change. My work shows that the application of complex, process-based models in conservation-relevant contexts is feasible, utilising available tools and data. Such models can be successfully calibrated and outperform other currently used modelling approaches in terms of predictive accuracy. Their projections can be used to predict future abundances or to assess alternative conservation scenarios. They further improve our mechanistic understanding of niche and range dynamics under climate change. However, only fully mechanistic models, that include all relevant processes, allow to precisely disentangle the effects of single processes on observed abundances. In this respect, the RangeShiftR model still has potential for further extensions that implement missing influential processes, such as species interactions. Dynamic, process-based models are needed to adequately model a dynamic reality. My work contributes towards the advancement, integration and dissemination of such models. This will facilitate numeric, model-based approaches for species assessments, generate ecological insights and strengthen the reliability of predictions on large spatial scales under changing conditions. N2 - Arten sind an ihren jeweiligen Lebensraum angepasst, doch viele Lebensräume sind heute einem globalen Wandel unterworfen. Dieser äußert sich vor allem in Veränderungen von Landnutzung und Klima, welche durch menschliche Aktivitäten verursacht werden und ganze Ökosysteme in ihrem Gefüge stören können. Störungen der grundlegenden öko-evolutionären Prozesse können auf der Populationsebene in Form von veränderten Verbreitungsgebieten und Häufigkeitsmustern sichtbar werden. Hier werden die Auswirkungen des globalen Wandels auf eine Art oftmals zuerst beobachtet. Um zu untersuchen, wie die Wirkung und Wechselwirkung der verschiedenen öko-evolutionären Prozesse die beobachteten Verbreitungs- und Häufigkeitsmuster erzeugen, und wie diese Prozesse wiederum von Umweltbedingungen beeinflusst werden, stellen räumlich explizite Modelle wirksame Instrumente dar. Sie beschreiben die ökologische Nische einer Art, also die Gesamtheit aller Umweltbedingungen, unter denen die Art fortbestehen kann. Die derzeit am häufigsten verwendeten Modelle stützen sich auf statische, korrelative Zusammenhänge, die zwischen bestimmten räumlichen Prädiktoren und den beobachteten Artverteilungen hergestellt werden. Allerdings werden dabei stationäre Bedingungen angenommen, was sie im Kontext des globalen Wandels ungeeignet macht. Deutlich besser geeignet sind prozessbasierte Modelle, welche explizite, algorithmische Repräsentationen von ökologischen Prozessen beinhalten und deren gemeinsame Dynamik berechnen. Solche Modelle galten lange Zeit als schwierig zu parametrisieren, doch die zunehmende Verfügbarkeit von Beobachtungsdaten sowie die verbesserten Methoden zur Datenintegration machen ihre Verwendung zunehmend praktikabel. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, diese prozessbasierten Modelle weiterzuentwickeln, sie in umfassende Modellierungsabläufe einzubinden, sowie Software und Anleitungen für ihre erfolgreiche Anwendung verfügbar zu machen. In meiner Dissertation präsentiere ich eine integrierte Plattform für räumlich-explizite, öko-evolutionäre Modellierung und entwickle einen Arbeitsablauf für dessen inverse Kalibrierung an Beobachtungsdaten. Im ersten Kapitel stelle ich RangeShiftR vor: eine Software, die eine individuenbasierte Modellierungsplattform für die statistische Programmiersprache R implementiert. Durch die Open-Source-Lizenzierung, umfangreichen Hilfeseiten und online verfügbaren Tutorials ist RangeShiftR einem breiten Publikum zugänglich. Im zweiten Kapitel demonstriere ich einen vollständigen Modellierungsablauf am Beispiel des Rotmilans in der Schweiz, der die Spezifikation, Kalibrierung und Validierung von RangeShiftR umfasst.Durch die Integration heterogener Datenquellen, wie Literatur- und Monitoringdaten, konnte das Modell erfolgreich kalibriert werden. Damit konnten anschließend validierte, raum-zeitliche Vorhersagen über das Vorkommen des Rotmilans erstellt und die dafür relevanten Prozesse identifiziert werden. Der vorgestellte Arbeitsablauf kann auf andere Arten übertragen werden, sofern geeignete Daten verfügbar sind. Im dritten Kapitel habe ich RangeShiftR erweitert, sodass demografische Prozessraten direkt mit Klimavariablen verknüpft werden können. Dies ermöglichte es, die Reaktionen von acht Schweizer Brutvogelarten auf den Klimawandel genauer zu untersuchen. Insbesondere konnte das Modell die einflussreichsten klimatischen Faktoren identifizieren, demografisch geeignete Gebiete abgrenzen und aktuelle Populationstrends auf den bisherigen Klimawandel zurückführen. Meine Arbeit zeigt, dass die Anwendung komplexer, prozessbasierter Modelle in naturschutzrelevanten Kontexten mit verfügbaren Daten möglich ist. Solche Modelle können erfolgreich kalibriert werden und andere, derzeit verwendete Modellierungsansätze in Bezug auf ihre Vorhersagegenauigkeit übertreffen. Ihre Projektionen können zur Vorhersage zukünftiger Artvorkommen und zur Einschätzung alternativer Naturschutzmaßnahmen verwendet werden. Sie verbessern außerdem unser mechanistisches Verständnis von Nischen- und Verbreitungsdynamiken unter dem Einfluss des Klimawandels. Jedoch ermöglichen nur vollständig prozessbasierte Modelle, die alle relevanten Prozesse vereinen, eine korrekte Aufschlüsselung der Auswirkungen einzelner Prozesse auf die beobachteten Abundanzen. In dieser Hinsicht hat das RangeShiftR-Modell noch Potenzial für Weiterentwicklungen, um fehlende, einflussreiche Prozesse hinzuzufügen, wie zum Beispiel die Interaktionen zwischen Arten. Um eine dynamische Realität adäquat abbilden zu können, werden dynamische, prozessbasierte Modelle benötigt. Meine Arbeit leistet einen Beitrag zur Weiterentwicklung, Integration und Verbreitung solcher Modelle und stärkt somit die Anwendung numerischer, modellbasierter Methoden für die Bewertung des Zustands von Arten, die Untersuchung ökologischer Zusammenhänge und die Steigerung der Zuverlässigkeit von Vorhersagen auf großen räumlichen Skalen unter Umweltveränderungen. T2 - Entwicklung einer integrierten Modellierungs-Plattform zur Vorhersage von Nischen- und Verbreitungs-dynamiken: Inverse Kalibrierung räumlich-expliziter öko-evolutionärer Modelle KW - species distribution modelling KW - Bayesian inference KW - individual-based modelling KW - range shifts KW - ecological modelling KW - population dynamics KW - Bayes'sche Inferenz KW - ökologische Modellierung KW - individuen-basierte Modellierung KW - Populationsdynamik KW - Arealverschiebungen KW - Artverbreitungsmodelle Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-602737 ER - TY - THES A1 - Parry, Victor T1 - From individual to community level: Assessing swimming movement, dispersal and fitness of zooplankton T1 - Vom Individuum zur Gemeinschaft: Bewertung von Schwimmbewegungen, Ausbreitung und Fitness von Zooplankton N2 - Movement is a mechanism that shapes biodiversity patterns across spatialtemporal scales. Thereby, the movement process affects species interactions, population dynamics and community composition. In this thesis, I disentangled the effects of movement on the biodiversity of zooplankton ranging from the individual to the community level. On the individual movement level, I used video-based analysis to explore the implication of movement behavior on preypredator interactions. My results showed that swimming behavior was of great importance as it determined their survival in the face of predation. The findings also additionally highlighted the relevance of the defense status/morphology of prey, as it not only affected the prey-predator relationship by the defense itself but also by plastic movement behavior. On the community movement level, I used a field mesocosm experiment to explore the role of dispersal (time i.e., from the egg bank into the water body and space i.e., between water bodies) in shaping zooplankton metacommunities. My results revealed that priority effects and taxon-specific dispersal limitation influenced community composition. Additionally, different modes of dispersal also generated distinct community structures. The egg bank and biotic vectors (i.e. mobile links) played significant roles in the colonization of newly available habitat patches. One crucial aspect that influences zooplankton species after arrival in new habitats is the local environmental conditions. By using common garden experiments, I assessed the performance of zooplankton communities in their home vs away environments in a group of ponds embedded within an agricultural landscape. I identified environmental filtering as a driving factor as zooplankton communities from individual ponds developed differently in their home and away environments. On the individual species level, there was no consistent indication of local adaptation. For some species, I found a higher abundance/fitness in their home environment, but for others, the opposite was the case, and some cases were indifferent. Overall, the thesis highlights the links between movement and biodiversity patterns, ranging from the individual active movement to the community level. N2 - Fortbewegung ist ein Mechanismus, der die Biodiversitätsmuster sowohl über räumliche als auch zeitliche Skalen hinweg prägt. Dabei beeinflusst der Bewegungsprozess die Interaktionen zwischen den Arten, die Populationsdynamik und die Zusammensetzung der Gemeinschaften. Diese Arbeit dient dazu die Auswirkungen der Bewegung auf die Biodiversitätsmuster des Zooplanktons sowohl auf der individuellen als auch gemeinschaftlichen Ebene zu untersuchen. Um auf der individuellen Ebene die Auswirkungen des Bewegungsverhaltens auf die Interaktionen zwischen Räuber und Beute zu untersuchen, wurde eine videobasierte Analyse durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass das Schwimmverhalten von großer Bedeutung ist, da es über das Überleben der Tiere im Angesicht von Räubern entscheidet. Darüber hinaus verdeutlichen die Ergebnisse die Rolle des Verteidigungsstatus bzw. der Morphologie der Beutetiere, da diese nicht nur durch die Verteidigung selbst, sondern auch durch die Plastizität des Bewegungsverhaltens, die Beziehung zwischen Beute und Raubtier beeinflussen. Auf der Ebene der Bewegung von Gemeinschaften habe ich ein Mesokosmen-Feldexperiment durchgeführt, um die Rolle der Ausbreitung (zeitlich, d. h. von den Überdauerungsstadien, welche im Sediment gelagert sind, in Kleingewässer, und räumlich, d. h. zwischen Kleingewässer) bei der Strukturierung von Zooplankton-Metagemeinschaften zu untersuchen. Die Ergebnisse konnten zeigen, dass Prioritätseffekte und taxon-spezifische Ausbreitungslimitierungen die Zusammensetzung der Gemeinschaften beeinflussen. Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse, dass die unterschiedlichen Ausbreitungsarten (Windausbreitung und Tierverbreitung). Einfluss auf die Gemeinschaftsstrukturen haben. Zusätzlich spielt das Überdauerungsstadien-Reservoir in Sedimenten“, sowie biotische Ausbreitungsvektoren (d. h. Tiere, engl. mobile links), eine wichtige Rolle bei der Besiedlung neuer Habitate. Die lokalen Umweltbedingungen, die eine ankommende Art in einem Habitat vorfindet, sind ein entscheidender Aspekt, der die Struktur der Zooplanktongemeinschaft beeinflusst. Mit Hilfe eines Laborexperiments, für welches Wasserproben aus Kleingewässern/Söllen genutzt wurden, die von einer Agrarlandschaft umgeben sind, konnte ich die Fitness von Zooplanktongemeinschaften in ihrem Heimathabitat vs. in einem neuen Habitat untersuchen. Hierbei konnte ich zeigen, dass die Umweltfilterung ein entscheidender Faktor für die Gemeinschaftsstrukturierung ist, da sich die Zooplanktongemeinschaften der einzelnen Kleingewässer in ihrer Heimatumgebung anders entwickelten als in einer neuen Umgebung. Auf der Art-Ebene, konnte ich jedoch keine eindeutigen Hinweise auf eine lokale Anpassung finden. Bei einigen Arten konnten allerdings höhere Abundanz/Fitness in ihrer Heimatumgebung festgestellt werden, bei anderen war das Gegenteil der Fall, und in einigen F¨allen gab es keine eindeutigen Unterschiede. Zusammenfassend, unterstreicht diese Arbeit die Zusammenhänge zwischen Bewegungs- und Biodiversitätsmustern, die von der aktiven Bewegung des Einzelnen bis hin zur Gemeinschaftsebene reichen. KW - movement KW - zooplankton KW - dispersal KW - video analysis KW - environment filtering KW - Fortbewegung KW - Ausbreitung KW - Videoanalyse KW - Umweltfilterung KW - Zooplankton Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-597697 ER - TY - THES A1 - Courtin, Jérémy T1 - Biodiversity changes in Siberia between quaternary glacial and interglacial stages T1 - Veränderungen der Biodiversität in Sibirien zwischen Quartären Glazial- und Interglazialphasen BT - exploring the potential of sedaDNA BT - das Potenzial von sedaDNA erforschen N2 - Der vom Menschen verursachte Klimawandel wirkt sich auf die biologische Vielfalt der Erde und damit auf die Ökosysteme und ihre Leistungen aus. Die Ökosysteme in den hohen Breitengraden sind aufgrund der verstärkten Erwärmung an den Polen noch stärker betroffen als der Rest der nördlichen Hemisphäre. Dennoch ist es schwierig, die Dynamik von Ökosystemen in den hohen Breitengraden vorherzusagen, da die Wechselwirkungen zwischen abiotischen und biotischen Komponenten sehr komplex sind. Da die Vergangenheit der Schlüssel zur Zukunft ist, ist die Interpretation vergangener ökologischer Veränderungen möglich, um laufende Prozesse besser zu verstehen. Im Quartär durchlief das Pleistozän mehrere glaziale und interglaziale Phasen, welche die Ökosysteme der Vergangenheit beeinflussten. Während des letzten Glazials bedeckte die pleistozäne Steppentundra den größten Teil der unvergletscherten nördlichen Hemisphäre und verschwand parallel zum Aussterben der Megafauna am Übergang zum Holozän (vor etwa 11 700 Jahren). Der Ursprung des Rückgangs der Steppentundra ist nicht gut erforscht, und die Kenntnis über die Mechanismen, die zu den Veränderungen in den vergangenen Lebensgemeinschaften und Ökosystemen geführt haben, ist von hoher Priorität, da sie wahrscheinlich mit denen vergleichbar sind, die sich auf moderne Ökosysteme auswirken. Durch die Entnahme von See- oder Permafrostkernsedimenten kann die vergangene Artenvielfalt an den Übergängen zwischen Eis- und Zwischeneiszeiten untersucht werden. Sibirien und Beringia waren der Ursprung der Ausbreitung der Steppentundra, weshalb die Untersuchung dieses Gebiets hohe Priorität hat. Bis vor kurzem waren Makrofossilien und Pollen die gängigsten Methoden. Sie dienen der Rekonstruktion vergangener Veränderungen in der Zusammensetzung der Bevölkerung, haben aber ihre Grenzen und Schwächen. Seit Ende des 20. Jahrhunderts kann auch sedimentäre alte DNA (sedaDNA) untersucht werden. Mein Hauptziel war es, durch den Einsatz von sedaDNA-Ansätzen wissenschaftliche Beweise für Veränderungen in der Zusammensetzung und Vielfalt der Ökosysteme der nördlichen Hemisphäre am Übergang zwischen den quartären Eiszeiten und Zwischeneiszeiten zu liefern. In dieser Arbeit liefere ich Momentaufnahmen ganzer alter Ökosysteme und beschreibe die Veränderungen in der Zusammensetzung zwischen Quartärglazialen und Interglazialen und bestätige die Vegetationszusammensetzung sowie die räumlichen und zeitlichen Grenzen der pleistozänen Steppentundra. Ich stelle einen allgemeinen Verlust der Pflanzenvielfalt fest, wobei das Aussterben der Pflanzen parallel zum Aussterben der Megafauna verlief. Ich zeige auf, wie der Verlust der biotischen Widerstandsfähigkeit zum Zusammenbruch eines zuvor gut etablierten Systems führte, und diskutiere meine Ergebnisse im Hinblick auf den laufenden Klimawandel. Mit weiteren Arbeiten zur Eingrenzung von Verzerrungen und Grenzen kann sedaDNA parallel zu den etablierteren Makrofossilien- und Pollenansätzen verwendet werden oder diese sogar ersetzen, da meine Ergebnisse die Robustheit und das Potenzial von sedaDNA zur Beantwortung neuer paläoökologischer Fragen wie Veränderungen der Pflanzenvielfalt und -verluste belegen und Momentaufnahmen ganzer alter Biota liefern. N2 - Climate change of anthropogenic origin is affecting Earth’s biodiversity and therefore ecosystems and their services. High latitude ecosystems are even more impacted than the rest of Northern Hemisphere because of the amplified polar warming. Still, it is challenging to predict the dynamics of high latitude ecosystems because of complex interaction between abiotic and biotic components. As the past is the key to the future, the interpretation of past ecological changes to better understand ongoing processes is possible. In the Quaternary, the Pleistocene experienced several glacial and interglacial stages that affected past ecosystems. During the last Glacial, the Pleistocene steppe-tundra was covering most of unglaciated northern hemisphere and disappeared in parallel to the megafauna’s extinction at the transition to the Holocene (~11,700 years ago). The origin of the steppe-tundra decline is not well understood and knowledge on the mechanisms, which caused shifts in past communities and ecosystems, is of high priority as they are likely comparable to those affecting modern ecosystems. Lake or permafrost core sediments can be retrieved to investigate past biodiversity at transitions between glacial and interglacial stages. Siberia and Beringia were the origin of dispersal of the steppe-tundra, which make investigation this area of high priority. Until recently, macrofossils and pollen were the most common approaches. They are designed to reconstruct past composition changes but have limit and biases. Since the end of the 20th century, sedimentary ancient DNA (sedaDNA) can also be investigated. My main objectives were, by using sedaDNA approaches to provide scientific evidence of compositional and diversity changes in the Northern Hemisphere ecosystems at the transition between Quaternary glacial and interglacial stages. In this thesis, I provide snapshots of entire ancient ecosystems and describe compositional changes between Quaternary glacial and interglacial stages, and confirm the vegetation composition and the spatial and temporal boundaries of the Pleistocene steppe-tundra. I identify a general loss of plant diversity with extinction events happening in parallel of megafauna’ extinction. I demonstrate how loss of biotic resilience led to the collapse of a previously well-established system and discuss my results in regards to the ongoing climate change. With further work to constrain biases and limits, sedaDNA can be used in parallel or even replace the more established macrofossils and pollen approaches as my results support the robustness and potential of sedaDNA to answer new palaeoecological questions such as plant diversity changes, loss and provide snapshots of entire ancient biota. KW - sedaDNA KW - pleistocene KW - paleoecology KW - climate change KW - holocene KW - Siberia KW - sedaDNA KW - Pleistozän KW - Paläoökologie KW - Holozän KW - Klimawandel KW - Sibirien Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-595847 ER - TY - THES A1 - Derežanin, Lorena T1 - Contribution of structural variation to adaptive evolution of mammalian genomes T1 - Beteiligung der strukturellen Variation zur adaptiven Evolution von Säugetiergenomen N2 - Following the extinction of dinosaurs, the great adaptive radiation of mammals occurred, giving rise to an astonishing ecological and phenotypic diversity of mammalian species. Even closely related species often inhabit vastly different habitats, where they encounter diverse environmental challenges and are exposed to different evolutionary pressures. As a response, mammals evolved various adaptive phenotypes over time, such as morphological, physiological and behavioural ones. Mammalian genomes vary in their content and structure and this variation represents the molecular mechanism for the long-term evolution of phenotypic variation. However, understanding this molecular basis of adaptive phenotypic variation is usually not straightforward. The recent development of sequencing technologies and bioinformatics tools has enabled a better insight into mammalian genomes. Through these advances, it was acknowledged that mammalian genomes differ more, both within and between species, as a consequence of structural variation compared to single-nucleotide differences. Structural variant types investigated in this thesis - such as deletion, duplication, inversion and insertion, represent a change in the structure of the genome, impacting the size, copy number, orientation and content of DNA sequences. Unlike short variants, structural variants can span multiple genes. They can alter gene dosage, and cause notable gene expression differences and subsequently phenotypic differences. Thus, they can lead to a more dramatic effect on the fitness (reproductive success) of individuals, local adaptation of populations and speciation. In this thesis, I investigated and evaluated the potential functional effect of structural variations on the genomes of mustelid species. To detect the genomic regions associated with phenotypic variation I assembled the first reference genome of the tayra (Eira barbara) relying on linked-read sequencing technology to achieve a high level of genome completeness important for reliable structural variant discovery. I then set up a bioinformatics pipeline to conduct a comparative genomic analysis and explore variation between mustelid species living in different environments. I found numerous genes associated with species-specific phenotypes related to diet, body condition and reproduction among others, to be impacted by structural variants. Furthermore, I investigated the effects of artificial selection on structural variants in mice selected for high fertility, increased body mass and high endurance. Through selective breeding of each mouse line, the desired phenotypes have spread within these populations, while maintaining structural variants specific to each line. In comparison to the control line, the litter size has doubled in the fertility lines, individuals in the high body mass lines have become considerably larger, and mice selected for treadmill performance covered substantially more distance. Structural variants were found in higher numbers in these trait-selected lines than in the control line when compared to the mouse reference genome. Moreover, we have found twice as many structural variants spanning protein-coding genes (specific to each line) in trait-selected lines. Several of these variants affect genes associated with selected phenotypic traits. These results imply that structural variation does indeed contribute to the evolution of the selected phenotypes and is heritable. Finally, I suggest a set of critical metrics of genomic data that should be considered for a stringent structural variation analysis as comparative genomic studies strongly rely on the contiguity and completeness of genome assemblies. Because most of the available data used to represent reference genomes of mammalian species is generated using short-read sequencing technologies, we may have incomplete knowledge of genomic features. Therefore, a cautious structural variation analysis is required to minimize the effect of technical constraints. The impact of structural variants on the adaptive evolution of mammalian genomes is slowly gaining more focus but it is still incorporated in only a small number of population studies. In my thesis, I advocate the inclusion of structural variants in studies of genomic diversity for a more comprehensive insight into genomic variation within and between species, and its effect on adaptive evolution. N2 - Nach dem Aussterben der Dinosaurier kam es zu einer großen adaptiven Radiation der Säugetiere, die eine erstaunliche ökologische und phänotypische Vielfalt von Säugetierarten hervorbrachte. Selbst eng verwandte Arten bewohnen oft sehr unterschiedliche Lebensräume, in denen sie verschiedenen Umwelteinflüssen und evolutionärem Druck ausgesetzt sind. Als Reaktion darauf haben Säugetiere im Laufe der Zeit verschiedene adaptive Phänotypen entwickelt, z. B. morphologische, physiologische und verhaltensbezogene. Die Genome von Säugetieren variieren in ihrem Inhalt und ihrer Struktur, und diese Variation stellt den molekularen Mechanismus für die langfristige Evolution der phänotypischen Variation dar. Das Verständnis dieser molekularen Grundlage der adaptiven phänotypischen Variation ist jedoch meist nicht trivial. Die jüngste Entwicklung von Sequenzierungstechnologien und Bioinformatik-Tools hat einen besseren Einblick in die Genome von Säugetieren ermöglicht. Durch diese Fortschritte wurde erkannt, dass sich die Genome von Säugetieren sowohl innerhalb als auch zwischen den Arten stärker durch strukturelle Variationen als durch Unterschiede zwischen einzelnen Nukleotiden unterscheiden. Variantenarten, die in dieser Arbeit untersucht werden - wie Deletion, Duplikation, Inversion und Insertion - stellen eine Veränderung der Genomstruktur dar, die sich auf die Größe, die Kopienzahl, die richtung und den Inhalt der DNA-Sequenzen auswirken. Im Gegensatz zu kurzen Varianten können strukturelle Varianten mehrere Gene umfassen. Sie können die Genkopien verändern und bemerkenswerte Unterschiede in der Genexpression und in der Folge phänotypische Unterschiede hervorrufen. Dadurch können sie dramatischere Auswirkungen auf die Fitness (den Fortpflanzungserfolg) von Individuen, die lokale Anpassung von Populationen und die Artbildung haben. In dieser Arbeit untersuchte und bewertete ich die potenziellen funktionellen Auswirkungen von strukturellen Variationen auf die Genome von Mustelidenarten. Weil für die zuverlässige Entdeckung struktureller Varianten ein hohes Maß an Genomvollständigkeit wichtig ist, habe ich das erste Referenzgenom der Tayra (Eira barbara) mit Hilfe der Linked-Read-Sequenzierungstechnologie zusammengestellt, um die mit der phänotypischen Variation verbundenen Genomregionen zu ermitteln. Anschließend habe ich eine Bioinformatik-Pipeline aufgesetzt, um eine vergleichende Genomanalyse durchzuführen und die Variationen zwischen den in unterschiedlichen Umgebungen lebenden Mustelidenarten zu untersuchen. Ich fand heraus, dass zahlreiche Gene, die mit artspezifischen Phänotypen in Verbindung stehen, durch strukturelle Variationen beeinflusst werden. Diese Phänotypen stehen u.a. in Zusammenhang mit Ernährung, Körperzustand und Fortpflanzung. Darüber hinaus untersuchte ich die Auswirkungen der künstlichen Selektion auf strukturelle Variationen bei Mäusen, die auf hohe Fruchtbarkeit, erhöhte Körpermasse und hohe Ausdauer selektiert wurden. Durch selektive Züchtung jeder Mauslinie haben sich die gewünschten Phänotypen innerhalb dieser Populationen durchgesetzt, wobei die für jede Linie spezifischen strukturellen Variationen erhalten blieben. Im Vergleich zur Kontrolllinie hat sich die Wurfgröße in den Linien selektiert auf Fruchtbarkeit verdoppelt, die Individuen in den Linien mit hoher Körpermasse sind erheblich größer geworden, und die auf Laufbandleistung selektierten Mäuse haben wesentlich mehr Strecke zurückgelegt. Im Vergleich zum Referenzgenom der Maus wurden in diesen nach Merkmalen selektierten Linien mehr strukturelle Variationen gefunden als in der Kontrolllinie. Darüber hinaus fanden wir doppelt so viele strukturelle Variationen, die proteinkodierende Gene überspannen (spezifisch für jede Linie), in nach Merkmalen selektierten Linien. Mehrere dieser Varianten betreffen Gene, die mit ausgewählten phänotypischen Merkmalen in Verbindung stehen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass strukturelle Variationen tatsächlich zur Evolution der ausgewählten Phänotypen beiträgt und vererbbar ist. Abschließend schlage ich eine Sammlung von maßgeblichen Metriken für Genomdaten vor, die für eine strenge Analyse der strukturellen Variation berücksichtigt werden sollten, da vergleichende Genomstudien in hohem Maße von der Kontiguität und Vollständigkeit der Genomassemblies abhängen. Weil die meisten der verfügbaren Daten, die verwendet wurden, um Referenzgenome von Säugetierarten zu repräsentieren mit Short-Read-Sequenzierungstechnologien erzeugt wurden, verfügen wir möglicherweise nur über unvollständige Kenntnisse der genomischen Merkmale. Daher ist eine vorsichtige Analyse der strukturellen Variationen erforderlich, um die Auswirkungen technischer Beschränkungen zu minimieren. Der Einfluss struktureller Variationen auf die adaptive Evolution von Säugetiergenomen rückt langsam immer mehr in den Mittelpunkt, wird aber immer noch nur in wenigen Populationsstudien berücksichtigt. In meiner Dissertation befürworte ich die Einbeziehung struktureller Variationen in Studien zur genomischen Diversität, um einen umfassenderen Einblick in die genomische Variation innerhalb und zwischen den Arten und ihre Auswirkungen auf die adaptive Evolution zu erhalten. KW - doctoral thesis KW - evolutionary biology KW - adaptation KW - genomics KW - Adaptation KW - Dissertation KW - Evolutionsbiologie KW - Genomik Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-591443 ER - TY - THES A1 - Göthel, Markus T1 - Entwicklung eines Verfahrens zur Generierung von spezifischen monoklonalen Antikörpern gegen Mikroorganismen basierend auf in silico Epitopanalysen T1 - A new workflow to generate monoclonal antibodies against microorganisms based on in silico epitope predictions N2 - Monoklonale Antikörper (mAK) sind eines der wichtigsten Biomoleküle für die Umweltanalytik und die medizinische Diagnostik. Für die Detektion von Mikroorganismen bilden sie die Grundlage für ein schnelles und präzises Testverfahren. Bis heute gibt es, aufgrund des hohen zeitlichen und materiellen Aufwandes und der unspezifischen Immunisierungsstrategien, nur wenige mAK, die spezifisch Mikroorganismen erkennen. Zu diesem Zweck sollte ein anwendbares Verfahren für die Generierung von mAK gegen Mikroorganismen entwickelt werden, welches anhand von Escherichia coli O157:H7 und Legionella pneumophila validiert wurde. In dieser Dissertation konnten neue Oberflächenstrukturen auf den Mikroorganismen mittels vergleichender Genomanalysen und in silico Epitopanalysen identifiziert werden. Diese wurden in das Virushüllprotein VP1 integriert und für eine gezielte Immunisierungsstrategie verwendet. Für die Bestimmung antigenspezifischer antikörperproduzierender Hybridome wurde ein Immunfärbeprotokoll entwickelt und etabliert, um die Hybridome im Durchflusszytometer zu sortieren. In der vorliegenden Studie konnten für E. coli O157:H7 insgesamt 53 potenzielle Proteinkandidaten und für L. pneumophila 38 Proteine mithilfe der bioinformatischen Analyse identifiziert werden. Fünf verschiedene potenzielle Epitope wurden für E. coli O157:H7 und drei verschiedenen für L. pneumophila ausgewählt und für die Immunisierung mit chimären VP1 verwendet. Alle Immunseren zeigten eine antigenspezifische Immunantwort. Aus den nachfolgend generierten Hybridomzellen konnten mehrere Antikörperkandidaten gewonnen werden, welche in Charakterisierungsstudien eine starke Bindung zu E. coli O157:H7 bzw. L. pneumophila vorwiesen. Kreuzreaktivitäten zu anderen relevanten Mikroorganismen konnten keine bzw. nur in geringem Maße festgestellt werden. Folglich konnte der hier beschriebene interdisziplinäre Ansatz zur Generierung spezifischer mAK gegen Mikroorganismen nachweislich spezifische mAK hervorbringen und ist als hocheffizienter Arbeitsablauf für die Herstellung von Antikörpern gegen Mikroorganismen einsetzbar. N2 - Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most important biomolecules for environmental analysis and medical diagnostics. For the detection of microorganisms, they form the basis for a rapid and precise test procedure. Until today, due to the substantial time and material effort and the non-specific immunization strategies, there are only a few mAbs that specifically detect microorganisms. Therefore, an easy-to-use methodology for the generation of mAbs against microorganisms was developed and validated using Legionella pneumophila and Escherichia coli O157:H7. In this dissertation, several new surface structures on the microorganisms were identified using comparative genomic analyses and in silico epitope modeling. These were integrated into the VP1 viral envelope protein and used for a specific immunization strategy. For the identification of antigen-specific antibody-producing hybridomas, an immunostaining protocol was developed and established to sort the hybridomas. In the present study, 53 potential protein candidates were identified for E. coli O157:H7 and 38 proteins for L. pneumophila using bioinformatic analysis methods. Five different peptide epitopes were selected for E. coli O157:H7 and three different peptide epitopes for L. pneumophila for immunization using chimeric VP1. All immune sera showed an antigen-specific immune response. Several antibody candidates were obtained from the generated hybridoma cells, which showed strong binding to E. coli O157:H7 and L. pneumophila. Cross-reactivity to other relevant microorganisms could not be detected or could only be observed to a minor extent. Consequently, the interdisciplinary approach to generate specific mAbs against microorganisms has been shown to generate specific mAbs and is applicable as a highly efficient workflow for the generation of antibodies against microorganisms. KW - Antikörper KW - antibody KW - Epitopvorhersage KW - epitop prediction KW - Escherichia coli KW - legionella pneumophila Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-588017 ER - TY - THES A1 - Leins, Johannes A. T1 - Combining model detail with large scales T1 - Die Verbindung von Modelldetails und großen Skalen BT - a simulation framework for population viability analyses in changing and disturbed environments BT - ein Simulationswerkzeug zur Analyse der Überlebensfähigkeit von Populationen in einer sich verändernden und gestörten Umwelt N2 - The global climate crisis is significantly contributing to changing ecosystems, loss of biodiversity and is putting numerous species on the verge of extinction. In principle, many species are able to adapt to changing conditions or shift their habitats to more suitable regions. However, change is progressing faster than some species can adjust, or potential adaptation is blocked and disrupted by direct and indirect human action. Unsustainable anthropogenic land use in particular is one of the driving factors, besides global heating, for these ecologically critical developments. Precisely because land use is anthropogenic, it is also a factor that could be quickly and immediately corrected by human action. In this thesis, I therefore assess the impact of three climate change scenarios of increasing intensity in combination with differently scheduled mowing regimes on the long-term development and dispersal success of insects in Northwest German grasslands. The large marsh grasshopper (LMG, Stethophyma grossum, Linné 1758) is used as a species of reference for the analyses. It inhabits wet meadows and marshes and has a limited, yet fairly good ability to disperse. Mowing and climate conditions affect the development and mortality of the LMG differently depending on its life stage. The specifically developed simulation model HiLEG (High-resolution Large Environmental Gradient) serves as a tool for investigating and projecting viability and dispersal success under different climate conditions and land use scenarios. It is a spatially explicit, stage- and cohort-based model that can be individually configured to represent the life cycle and characteristics of terrestrial insect species, as well as high-resolution environmental data and the occurrence of external disturbances. HiLEG is a freely available and adjustable software that can be used to support conservation planning in cultivated grasslands. In the three case studies of this thesis, I explore various aspects related to the structure of simulation models per se, their importance in conservation planning in general, and insights regarding the LMG in particular. It became apparent that the detailed resolution of model processes and components is crucial to project the long-term effect of spatially and temporally confined events. Taking into account conservation measures at the regional level has further proven relevant, especially in light of the climate crisis. I found that the LMG is benefiting from global warming in principle, but continues to be constrained by harmful mowing regimes. Land use measures could, however, be adapted in such a way that they allow the expansion and establishment of the LMG without overly affecting agricultural yields. Overall, simulation models like HiLEG can make an important contribution and add value to conservation planning and policy-making. Properly used, simulation results shed light on aspects that might be overlooked by subjective judgment and the experience of individual stakeholders. Even though it is in the nature of models that they are subject to limitations and only represent fragments of reality, this should not keep stakeholders from using them, as long as these limitations are clearly communicated. Similar to HiLEG, models could further be designed in such a way that not only the parameterization can be adjusted as required, but also the implementation itself can be improved and changed as desired. This openness and flexibility should become more widespread in the development of simulation models. N2 - Die globale Klimakrise trägt maßgeblich dazu bei, dass sich Ökosysteme verändern, die Artenvielfalt sinkt und zahlreiche Spezies vom Aussterben bedroht sind. Viele Arten sind prinzipiell in der Lage, sich wandelnden Bedingungen anzugleichen oder ihre Habitate in geeignetere Regionen zu verlagern. Allerdings schreitet der Wandel schneller voran als sich einige Spezies anpassen können oder die mögliche Anpassung wird durch direkte und indirekte menschliche Eingriffe blockiert und gestört. Gerade die nicht-nachhaltige Landnutzung durch den Menschen ist neben der Klimaerhitzung einer der treibenden Faktoren für diese ökologisch kritischen Entwicklungen. Gleichzeitig ist sie durch ihre unmittelbare menschliche Ursache ein Faktor, der sich kurzfristig und schnell korrigieren ließe. Zu diesem Zweck untersuche ich in dieser Dissertation, wie sich drei Klimawandelszenarien ansteigender Intensität im Zusammenspiel mit unterschiedlich terminierten Mahdregimen im Nordwestdeutschen Grünland auf die langfristige Entwicklung und Ausbreitung von Insekten auswirken. In der Untersuchung fungiert die Sumpfschrecke (Stethophyma grossum, Linné 1758) als Bezugsspezies. Sie ist in Feucht- und Nasswiesen zu Hause und zu räumlicher Ausbreitung fähig, auch wenn sie nur eingeschränkt mobil ist. Mahd und Klimabedingungen wirken sich je nach Lebensstadium unterschiedlich stark auf die Entwicklung und Mortalität der Sumpfschrecke aus. Das eigens entwickelte Simulationsmodell HiLEG (High-resolution Large Environmental Gradient) dient als Werkzeug zur Untersuchung und Projektion der Überlebens- und Ausbreitungswahrscheinlichkeit unter verschiedenen Klima- und Landnutzungsszenarien. Es ist ein räumlich explizites, stadien- und kohortenbasiertes Modell, das individuell konfiguriert werden kann, um den Lebenszyklus und die Charakteristiken terrestrischer Insektenarten sowie hochaufgelöste Umweltdaten und das zeitlich variierende Auftreten externer Störfaktoren abzubilden. HiLEG ist eine frei verfügbare Software und kann zur Unterstützung bei der Planung von Umweltschutzmaßnahmen in kultiviertem Grünland verwendet werden. In den drei Fallstudien dieser Arbeit habe ich verschiedene Aspekte in Bezug auf die Struktur von Simulationsmodellen an sich, deren Bedeutung im Naturschutz im Allgemeinen und Erkenntnisse für die Sumpfschrecke im Speziellen untersucht. Es zeigte sich, dass die detaillierte Auflösung der Modellprozesse und -komponenten entscheidend ist, um den langfristigen Effekt räumlich und zeitlich begrenzter Ereignisse projizieren zu können. Insbesondere in Anbetracht der Klimakrise hat sich die gesteigerte Relevanz von Naturschutzmaßnahmen auf regionaler Ebene herausgestellt. Ich konnte außerdem bestätigen, dass die Sumpfschrecke zwar im Prinzip von der Klimaerwärmung profitiert, aber weiterhin durch ungeeignete Mahdregime beschränkt wird. Bewirtschaftungspläne könnten allerdings in dem Sinne angepasst werden, dass sie die Ausbreitung und Etablierung der Sumpfschrecke erlauben, ohne sich über die Maßen auf den Ertrag der Landwirtschaft auszuwirken. Insgesamt können Simulationsmodelle wie HiLEG einen wichtigen Beitrag und Mehrwert für die Planung von Naturschutzmaßnahmen und Politikinstrument leisten. Richtig eingesetzt beleuchten die Simulationsergebnisse Aspekte, die durch subjektive Bewertung und Erfahrung einzelner Akteure möglicherweise übersehen würden. Auch wenn es in der Natur von Modellen liegt, dass sie Einschränkungen unterworfen sind und nur Ausschnitte der Realität abbilden, sollte dies kein Hindernis für ihren Einsatz sein, solange diese Limitierungen klar kommuniziert werden. Analog zu HiLEG könnten Modelle so konzipiert werden, dass nicht nur ihre Parametrisierung nach Bedarf angepasst, sondern auch die Implementierung selbst beliebig verbessert und verändert werden kann. Diese Offenheit und Flexibilität sollte sich bei der Entwicklung von Simulationsmodelle stärker durchsetzen. KW - spatially explicit model KW - large marsh grasshopper KW - simulation framework KW - climate change KW - land use KW - Open Source KW - Open Access KW - dispersal KW - PVA (population viability analysis) KW - high resolution KW - scaling KW - grassland KW - disturbance timing KW - Klimawandel KW - Ausbreitung KW - Zeitpunkt von Störungen KW - Grünland KW - hohe Auflösung KW - Landnutzung KW - Sumpfschrecke KW - Open Access KW - Open Source KW - Populationsgefährdungsanalyse KW - Skalierung KW - Simulationsframework KW - räumlich explizites Modell KW - Stethophyma grossum Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-582837 ER - TY - THES A1 - Koikkarah Aji, Amit T1 - Quantitative sub cellular characterization of Hantavirus structural proteins T1 - Quantitativ Subzellulär Charakterisierung Von Hantavirus-Strukturproteine. N2 - Hantaviruses (HVs) are a group of zoonotic viruses that infect human beings primarily through aerosol transmission of rodent excreta and urine samplings. HVs are classified geographically into: Old World HVs (OWHVs) that are found in Europe and Asia, and New World HVs (NWHVs) that are observed in the Americas. These different strains can cause severe hantavirus diseases with pronounced renal syndrome or severe cardiopulmonary system distress. HVs can be extremely lethal, with NWHV infections reaching up to 40 % mortality rate. HVs are known to generate epidemic outbreaks in many parts of the world including Germany, which has seen periodic HV infections over the past decade. HV has a trisegmented genome. The small segment (S) encodes the nucleocapsid protein (NP), the middle segment (M) encodes the glycoproteins (GPs) Gn and Gc which forms up to tetramers and primarily monomers \& dimers upon independent expression respectively and large segment (L) encodes RNA dependent RNA polymerase (RdRp). Interactions between these viral proteins are crucial in providing mechanistic insights into HV virion development. Despite best efforts, there continues to be lack of quantification of these associations in living cells. This is required in developing the mechanistic models for HV viral assembly. This dissertation focuses on three key questions pertaining to the initial steps of virion formation that primarily involves the GPs and NP. The research investigations in this work were completed using Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS) approaches. FCS is frequently used in assessing the biophysical features of bio-molecules including protein concentration and diffusion dynamics and circumvents the requirement of protein overexpression. FCS was primarily applied in this thesis to evaluate protein multimerization, at single cell resolution. The first question addressed which GP spike formation model proposed by Hepojoki et al.(2010) appropriately describes the evidence in living cells. A novel in cellulo assay was developed to evaluate the amount of fluorescently labelled and unlabeled GPs upon co-expression. The results clearly showed that Gn and Gc initially formed a heterodimeric Gn:Gc subunit. This sub-unit then multimerizes with congruent Gn:Gc subunits to generate the final GP spike. Based on these interactions, models describing the formation of GP complex (with multiple GP spike subunits) were additionally developed. HV GP assembly primarily takes place in the Golgi apparatus (GA) of infected cells. Interestingly, NWHV GPs are hypothesized to assemble at the plasma membrane (PM). This led to the second research question in this thesis, in which a systematic comparison between OWHV and NWHV GPs was conducted to validate this hypothesis. Surprisingly, GP localization at the PM was congruently observed with OWHV and NWHV GPs. Similar results were also discerned with OWHV and NWHV GP localization in the absence of cytoskeletal factors that regulate HV trafficking in cells. The final question focused on quantifying the NP-GP interactions and understanding their influence of NP and GP multimerization. Gc mutlimers were detected in the presence of NP and complimented by the presence of localized regions of high NP-Gc interactions in the perinuclear region of living cells. Gc-CT domain was shown to influence NP-Gc associations. Gn, on the other hand, formed up to tetrameric complexes, independent from the presence of NP. The results in this dissertation sheds light on the initial steps of HV virion formation by quantifying homo and heterotypic interactions involving NP and GPs, which otherwise are very difficult to perform. Finally, the in cellulo methodologies implemented in this work can be potentially extended to understand other key interactions involved in HV virus assembly. N2 - Hantaviren (HVs) gehören zu einer Gruppe von Zoonosenviren, die den Menschen hauptsächlich über Aerosolübertragung von Nagetierausscheidungen und Urinproben infizieren. HVs werden geografisch unterteilt in: Alte Welt-HVs (OWHVs), die in Europa und Asien vorkommen, und Neue Welt-HVs (NWHVs), die auf dem amerikanischen Kontinent beobachtet werden. Diese verschiedenen Stämme können schwere Krankheiten verursachen, wie hämorrhagisches Fieber mit Nierensyndrom oder schwere Herz-Lungen-Störungen. HVs haben eine hohe Sterblichkeitsrate, wobei NWHV-Infektionen eine Sterblichkeitsrate von bis zu 40 % erreichen. Es ist bekannt, dass HVs in vielen Teilen der Welt epidemische Ausbrüche verursachen können, so auch in Deutschland, wo in den letzten zehn Jahren regelmäßig HV-Infektionen vorkamen. HV besitzt ein trisegmentiertes Genom. Das kleine Segment (S) kodiert das Nukleokapsidprotein (NP), das mittlere Segment (M) kodiert die Glykoproteine (GPs) Gn und Gc, die bei unabhängiger Expression Tetramere und Dimere bilden, und das große Segment (L) kodiert die RNA-abhängige RNA-Polymerase (RdRp). Die Wechselwirkungen zwischen diesen viralen Proteinen sind von entscheidender Bedeutung für die Aufklärung der Mechanismen der HV-entwicklung. Trotz aller Bemühungen fehlt es nach wie vor an der Quantifizierung dieser Verbindungen in lebenden Zellen. Dies ist für die Entwicklung komplexer Modelle für den Aufbau von HV erforderlich. Diese Arbeit konzentriert sich auf drei Schlüsselfragen im Zusammenhang mit den ersten Phasen der Virionenbildung, an denen hauptsächlich die GPs und NP beteiligt sind. Die Forschungsaufgaben in dieser Arbeit wurden mit Hilfe der Fluoreszenzkorrelationspektroskopie (FCS) untersucht. Die FCS wird häufig zur Bewertung der biophysikalischen Eigenschaften von Biomolekülen, einschließlich der Proteinkonzentration und Diffusionsdynamik, eingesetzt und macht eine Überexpression von Proteinen überflüssig. In dieser Arbeit wurde FFS in erster Linie eingesetzt, um die Multimerisierung von Proteinen bei Einzelzellauflösung zu untersuchen. Die erste Frage lautete, welches das von Hepojoki et al. (2010) vorgeschlagene Modell der GP-Spike-Bildung den Vorgang in lebenden Zellen adäquat beschreibt. Es wurde ein neuartiger in cellulo-Assay entwickelt, um die Konzentration von fluoreszenzmarkierten und unmarkierten GPs bei der Ko-expression zu bestimmen. Die Ergebnisse zeigten deutlich, dass Gn und Gc zunächst eine heterodimere Gn:Gc-Untereinheit bilden. Diese Untereinheit multimerisiert dann mit kongruenten Gn:Gc-Untereinheiten, um den finalen GP-Spike zu erzeugen. Auf der Grundlage dieser Interaktionen wurden zusätzlich Modelle entwickelt, die die Bildung des GP-Komplexes (mit mehreren GP-Spike-Untereinheiten) beschreiben. Die HV-GP-Assemblierung findet hauptsächlich im Golgi-Apparat (GA) von infizierten Zellen statt. Interessanterweise wird angenommen, dass NWHV GPs an der Plasmamembran (PM) assembliert werden. Dies führte zur zweiten Frage dieser Arbeit, bei der ein systematischer Vergleich zwischen OWHV- und NWHV-GP durchgeführt wurde, um diese Hypothese zu bestätigen. Überraschenderweise wurde die GP-Lokalisierung an der PM bei OWHV- und NWHV-GPs gleichermaßen beobachtet. Ähnliche Ergebnisse wurden auch bei der Lokalisierung von OWHV- und NWHV-GP in Abwesenheit von zytoskelettalen Faktoren festgestellt, die die HV-Infektion regulieren. Die letzte Frage dieser Arbeit konzentrierte sich auf die Quantifizierung der NP-GP-Wechselwirkungen und das Verständnis ihres Einflusses auf die Multimerisierung von NP und GPs. Gc-Multimere, die in Gegenwart von NP nachgewiesen wurden, wurden durch das Vorhandensein von perinukleär lokalisierten Regionen mit starken NP-Gc-Wechselwirkungen in lebenden Zellen komplettiert. Es wurde gezeigt, dass die Gc-CT-Domäne die NP-Gc-Assoziationen beeinflusst. Gn hingegen bildete unabhängig von der Anwesenheit von NP tetramerische Komplexe. Die Ergebnisse dieser Arbeit geben Aufschluss über die ersten Phasen der HV-Assemblierung, indem sie die Homo- und Hetero-Interaktionen zwischen NP und GPs quantifizieren, was sonst nur sehr schwer möglich ist. Schließlich können die in dieser Arbeit implementierten in cellulo-Methoden potenziell erweitert werden, um andere Schlüsselinteraktionen zu verstehen, die an der HV-Assemblierung beteiligt sind. KW - Hantavirus KW - fluorescence microscopy KW - fluorescence correlation spectroscopy KW - protein multimerization KW - virus assembly KW - single cell imaging KW - Hantaviren KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Fluoreszenzkorrelationspektroskopie KW - Virionenbildung KW - Proteinmultimerisierung Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-586612 ER - TY - THES A1 - Schlossarek, Dennis T1 - Identification of dynamic protein-metabolite complexes in saccharomyces cerevisiae using co-fractionation mass spectrometry T1 - Identifikation von dynamischen Protein-Metabolit Komplexes in Saccharomyces cerevisiae unter Nutzung der Co-Fraktionierungs Massenspektrometrie N2 - Cells are built from a variety of macromolecules and metabolites. Both, the proteome and the metabolome are highly dynamic and responsive to environmental cues and developmental processes. But it is not their bare numbers, but their interactions that enable life. The protein-protein (PPI) and protein-metabolite interactions (PMI) facilitate and regulate all aspects of cell biology, from metabolism to mitosis. Therefore, the study of PPIs and PMIs and their dynamics in a cell-wide context is of great scientific interest. In this dissertation, I aim to chart a map of the dynamic PPIs and PMIs across metabolic and cellular transitions. As a model system, I study the shift from the fermentative to the respiratory growth, known as the diauxic shift, in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. To do so, I am applying a co-fractionation mass spectrometry (CF-MS) based method, dubbed protein metabolite interactions using size separation (PROMIS). PROMIS, as well as comparable methods, will be discussed in detail in chapter 1. Since PROMIS was developed originally for Arabidopsis thaliana, in chapter 2, I will describe the adaptation of PROMIS to S. cerevisiae. Here, the obtained results demonstrated a wealth of protein-metabolite interactions, and experimentally validated 225 previously predicted PMIs. Applying orthogonal, targeted approaches to validate the interactions of a proteogenic dipeptide, Ser-Leu, five novel protein-interactors were found. One of those proteins, phosphoglycerate kinase, is inhibited by Ser-Leu, placing the dipeptide at the regulation of glycolysis. In chapter 3, I am presenting PROMISed, a novel web-tool designed for the analysis of PROMIS- and other CF-MS-datasets. Starting with raw fractionation profiles, PROMISed enables data pre-processing, profile deconvolution, scores differences in fractionation profiles between experimental conditions, and ultimately charts interaction networks. PROMISed comes with a user-friendly graphic interface, and thus enables the routine analysis of CF-MS data by non-computational biologists. Finally, in chapter 4, I applied PROMIS in combination with the isothermal shift assay to the diauxic shift in S. cerevisiae to study changes in the PPI and PMI landscape across this metabolic transition. I found a major rewiring of protein-protein-metabolite complexes, exemplified by the disassembly of the proteasome in the respiratory phase, the loss of interaction of an enzyme involved in amino acid biosynthesis and its cofactor, as well as phase and structure specific interactions between dipeptides and enzymes of central carbon metabolism. In chapter 5, I am summarizing the presented results, and discuss a strategy to unravel the potential patterns of dipeptide accumulation and binding specificities. Lastly, I recapitulate recently postulated guidelines for CF-MS experiments, and give an outlook of protein interaction studies in the near future. N2 - Die Zelle besteht aus einer Vielzahl von großen und kleinen Molekülen, und sowohl das Proteom als auch das Metabolom passen sich dynamisch den vorherrschenden Umweltbedingungen oder zellulären Anforderungen an. Allerdings ist es nicht die bloße Menge an biologischen Molekülen, sondern deren Interaktionen miteinander, die das Leben erst ermöglichen. Protein-Protein (PPI) und Protein-Metabolit Interaktionen (PMI) vollbringen und regulieren alle Aspekte der Zelle, vom Stoffwechsel bis zur Mitose. Die Studie dieser Interaktionen ist daher von fundamentalem wissenschaftlichem Interesse. In dieser Dissertation strebe ich an, eine Karte der Protein-Protein und Protein-Metabolit Interaktionen zu zeichnen, die den Übergang vom fermentativen zum respiratioschen Stoffwechsel in der Hefe Saccharomyces cerevisiae umfasst. Zu diesem Zweck nutze ich PROMIS (egl. protein metabolite interactions using size separation), eine auf der co-Fraktionierungs Massensprektrometrie (CF-MS) aufbauende Methode. PROMIS, und ähnliche Methoden zur Untersuchung von Protein-Interkationen, werden ausgiebig in Kapitel 1 vorgestellt. Da PROMIS ursprünglich für die Modellpflanze Arabadopsis thaliana entwickelt wurde, beschreibe ich in Kapitel 2 zunächst die erste Anwendung der Methode in S. cerevisiae. Die Ergebnisse stellen eine Fülle an Protein-Metabolit Interaktionen dar, und 225 zuvor prognostizierte Interaktionen wurden das erste Mal experimentell beschrieben. Mit Hilfe orthogonaler Methoden wurde außerdem eine inhibitorische Interaktion zwischen dem proteinogenen Dipeptid Ser-Leu und einem Enzym der Glykolyse gefunden. In Kapitel 3 präsentiere ich PROMISed, eine neue Web-Anwendung zur Auswertung von Daten von PROMIS oder anderen CF-MS Experimente. PROMISed kann genutzt werden um in rohen Fraktionierungs-Profile lokale Maxima zu finden, aus denen ein Interaktions-Netzwerk basierend auf Korrelationen erstellt wird. Außerdem kann die Anwendung Unterschiede in den Profilen zwischen verschiedenen experimentellen Bedingungen bewerten. PROMISed umfasst eine benutzerfreundliche grafische Oberfläche und bedarf daher keiner Programmierkenntnisse zur Nutzung. In Kapitel 4 benutze ich schließlich PROMIS und ItSA (engl. isothermal shift assay) um PPI und PMI während des Übergangs vom fermentativen zum respiratorischen Stoffwechsel in Hefe zu untersuchen. Hier beschreibe ich eine zellweite Umbildung der Protein-Metabolit-Komplexe, bespielhaft beschrieben anhand des Auseinanderfallens des Proteasoms im respiratorischen Stoffwechsel, des Verlustes der Interaktion zwischen einem Enzym des Aminosäure Stoffwechsels mit seinem Cofaktor und spezifischen Interaktionen zwischen Dipeptiden und Enzymen des zentralen Stoffwechsels. In Kapitel 5 fasse ich die gefundenen Ergebnisse zusammen und stelle eine Strategie zur Untersuchung der Spezifität sowohl der Bildung als auch der Protein-Interaktionen von Dipeptiden vor. Zu aller letzt rekapituliere ich Richtlinien für CF-MS Experimente und gebe einen Ausblick auf die nahe Zukunft der Studien der Protein-Interkationen. KW - Protein KW - Metabolit KW - Interaktion KW - Interaktions Netzwerk KW - Stoffwechsel KW - Saccharomyces cerevisiae KW - protein KW - metabolite KW - interaction KW - interaction network KW - metabolism KW - saccharomyces cerevisiae KW - interactomics KW - proteomics KW - metabolomics Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-582826 ER - TY - THES A1 - Bysani Kondagari, Viswanada Reddy T1 - Engineering and evolution of saccharomyces cerevisiae for synthetic formatotrophic growth via the reductive glycine pathway N2 - Increasing demand for food, healthcare, and transportation arising from the growing world population is accompanied by and driving global warming challenges due to the rise of the atmospheric CO2 concentration. Industrialization for human needs has been increasingly releasing CO2 into the atmosphere for the last century or more. In recent years, the possibility of recycling CO2 to stabilize the atmospheric CO2 concentration and combat rising temperatures has gained attention. Thus, using CO2 as the feedstock to address future world demands is the ultimate solution while controlling the rapid climate change. Valorizing CO2 to produce activated and stable one-carbon feedstocks like formate and methanol and further upgrading them to industrial microbial processes to replace unsustainable feedstocks would be crucial for a future biobased circular economy. However, not all microbes can grow on formate as a feedstock, and those microbes that can grow are not well established for industrial processes. S. cerevisiae is one of the industrially well-established microbes, and it is a significant contributor to bioprocess industries. However, it cannot grow on formate as a sole carbon and energy source. Thus, engineering S. cerevisiae to grow on formate could potentially pave the way to sustainable biomass and value-added chemicals production. The Reductive Glycine Pathway (RGP), designed as the aerobic twin of the anaerobic Reductive Acetyl-CoA pathway, is an efficient formate and CO2 assimilation pathway. The RGP comprises of the glycine synthesis module (Mis1p, Gcv1p, Gcv2p, Gcv3p, and Lpd1p), the glycine to serine conversion module (Shmtp), the pyruvate synthesis module (Cha1p), and the energy supply module (Fdh1p). The RGP requires formate and elevated CO2 levels to operate the glycine synthesis module. In this study, I established the RGP in the yeast system using growth-coupled selection strategies to achieve formate and CO2-dependent biomass formation in aerobic conditions. Firstly, I constructed serine biosensor strains by disrupting the native serine and glycine biosynthesis routes in the prototrophic S288c and FL100 yeast strains and insulated serine, glycine, and one-carbon metabolism from the central metabolic network. These strains cannot grow on glucose as the sole carbon source but require the supply of serine or glycine to complement the engineered auxotrophies. Using growth as a readout, I employed these strains as selection hosts to establish the RGP. Initially, to achieve this, I engineered different serine-hydroxymethyltransferases in the genome of serine biosensor strains for efficient glycine to serine conversion. Then, I implemented the glycine synthesis module of the RGP in these strains for the glycine and serine synthesis from formate and CO2. I successfully conducted Adaptive Laboratory Evolution (ALE) using these strains, which yielded a strain capable of glycine and serine biosynthesis from formate and CO2. Significant growth improvements from 0.0041 h-1 to 0.03695 h-1 were observed during ALE. To validate glycine and serine synthesis, I conducted carbon tracing experiments with 13C formate and 13CO2, confirming that more than 90% of glycine and serine biosynthesis in the evolved strains occurs via the RGP. Interestingly, labeling data also revealed that 10-15% of alanine was labelled, indicating pyruvate synthesis from the formate-derived serine using native serine deaminase (Cha1p) activity. Thus, RGP contributes to a small pyruvate pool which is converted to alanine without any selection pressure for pyruvate synthesis from formate. Hence, this data confirms the activity of all three modules of RGP even in the presence of glucose. Further, ALE in glucose limiting conditions did not improve pyruvate flux via the RGP. Growth characterization of these strains showed that the best growth rates were achieved in formate concentrations between 25 mM to 300 mM. Optimum growth required 5% CO2, and dropped when the CO2 concentration was reduced from 5% to 2.5%. Whole-genome sequencing of these evolved strains revealed mutations in genes that encode Gdh1p, Pet9p, and Idh1p. These enzymes might influence intracellular NADPH, ATP, and NADH levels, indicating adjustment to meet the energy demand of the RGP. I reverse-engineered the GDH1 truncation mutation on unevolved serine biosensor strains and reproduced formate dependent growth. To elucidate the effect of the GDH1 mutation on formate assimilation, I reintroduced this mutation in the S288c strain and conducted carbon-tracing experiments to compared formate assimilation between WT and ∆gdh1 mutant strains. Comparatively, enhanced formate assimilation was recorded in the ∆gdh1 mutant strain. Although the 13C carbon tracing experiments confirmed the activity of all three modules of the RGP, the overall pyruvate flux via the RGP might be limited by the supply of reducing power. Hence, in a different approach, I overexpressed the formate dehydrogenase (Fdh1p) for energy supply and serine deaminase (Cha1p) for active pyruvate synthesis in the S288c parental strain and established growth on formate and serine without glucose in the medium. Further reengineering and evolution of this strain with a consistent energy, and formate-derived serine supply for pyruvate synthesis, is essential to achieve complete formatotrophic growth in the yeast system. N2 - Die steigende Nachfrage nach Lebensmitteln, Gesundheitsfürsorge und Transportmitteln durch die stetig wachsende Weltbevölkerung, sorgen für eine dramatisch fortschreitende globale Erwärmung; verursacht durch den massiven weltweiten CO2 Ausstoß. Durch die Industrialisierung wurde im vergangenen Jahrhundert immer mehr CO2 in die Atmosphäre freigesetzt. Recycling von CO2 hat in den letzten Jahren an Aufmerksamkeit gewonnen, um die steigenden Temperaturen zu stabilisieren. CO2 ist somit der ultimative Rohstoff, um den künftigen weltweiten Bedarf zu decken und gleichzeitig den raschen Klimawandel zu kontrollieren. Die Verwendung von CO2 zur Herstellung von aktivierten Ein-Kohlenstoff-Verbindungen wie Formiat und Methanol und die weitere Aufwertung durch mikrobielle Prozesse, wäre für die biobasierte Kreislaufwirtschaft von entscheidender Bedeutung. Allerdings können die allermeisten Mikroorganismen auf den genannten Ein-Kohlenstoffverbindungen- als Ausgangsstoff nicht wachsen und diejenigen, dies es können sind für industrielle Prozesse nicht geeignet. S. cerevisiae gehört zu den industriell etablierten Mikroorganismen und leistet einen wichtigen Beitrag zur Bioprozessindustrie. Sie kann jedoch nicht auf Formiat als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle wachsen. Die biotechnologische Anpassung von S. cerevisiae für das Wachstum auf Formiat könnte daher nachhaltige Wege für die Produktion von Biomasse und wertschöpfenden Chemikalien ebnen. Der Reduktive Glycinweg (RGP), der als aerober Zwilling des anaeroben Reduktiven Acetyl-CoA-Wegs konzipiert wurde, ist ein effizienter Formiat- und CO2 Assimilationsweg. Der RGP besteht aus dem Glycin-Synthesemodul (Mis1p, Gcv1p, Gcv2p, Gcv3p und Lpd1p), dem Modul zur Umwandlung von Glycin in Serin (Shmtp), dem Pyruvat-Synthesemodul (Cha1p) und dem Energieversorgungsmodul (Fdh1p). Der RGP benötigt Formiat und erhöhte CO2 Verfügbarkeit, um das Glycin-Synthesemodul zu betreiben. In dieser Studie habe ich das RGP im Hefesystem mit wachstumsgekoppelten Selektionsstrategien etabliert, um ein von Formiat und CO2 abhängiges zelluläres Wachstum unter aeroben Bedingungen zu erreichen. Zunächst habe ich Serin-Biosensor-Stämme konstruiert, indem ich die nativen Serin- und Glycin-Biosynthesewege in den prototrophen Stämmen S288c und FL100 unterbrochen und den Serin-, Glycin- und Ein-Kohlenstoff-Stoffwechsel vom zentralen Stoffwechselnetz isoliert habe. Diese Stämme können nicht mit Glukose als alleinige Kohlenstoffquelle wachsen, sondern benötigen die Zufuhr von Serin oder Glycin, um die eingeführten Auxotrophien zu ergänzen. Unter Verwendung von zellulärem Wachstum als Indikator, habe ich diese Stämme als Selektionswirte verwendet, um den RGP zu etablieren. Zu diesem Zweck habe ich durch genomische Integration von Serin-Hydroxymethyltransferasen (SHMTs) in diese Biosensorstämme effiziente Module zur Umwandlung von Glycin in Serin geschaffen. Dann implementierte ich das Glycin-Modul des RGP in die Stämme für die Glycin- und Serinsynthese aus Formiat und CO2. Mit diesen Stämmen führte ich erfolgreich eine adaptive Laborevolution (ALE) durch, die einen Stamm hervorbrachte, der zur Glycin- und Serinbiosynthese aus Ameisensäure und CO2 fähig ist. Während der ALE wurden signifikante Wachstumsverbesserungen von 0,0041 h-1 auf 0,03695 h-1 beobachtet. Um die Glycin- und Serinsynthese zu bestätigen, führte ich Experimente zur Kohlenstoffverfolgung mit 13C-Formiat und 13CO2 durch, die bestätigten, dass mehr als 90% der Glycin- und Serinbiosynthese über den RGP erfolgt. Interessanterweise ergaben die Markierungsdaten auch 10-15% markiertes Alanin, was auf eine Pyruvatsynthese aus dem von Formiat abgeleiteten Serin durch die native Serindeaminase (Cha1p) hinweist. Somit trägt der RGP zu einem kleinen Pyruvat-Pool bei, ohne dass ein Selektionsdruck für die Pryuvat Synthese aus Formiat besteht. Diese Daten bestätigen somit die Aktivität aller drei Module von RGP auch in Gegenwart von Glukose. Weitere ALE unter glukoselimitierenden Bedingungen verbesserte den Pyruvatfluss aus dem RGP allerdings nicht. Die Wachstumscharakterisierung der beschriebnen Stämme zeigte, dass die besten Wachstumsraten bei Formiatkonzentrationen zwischen 25 mM und 300 mM erzielt wurden. Für optimales Wachstum wurde 5% CO2 benötigt und die Wachstumsrate verschlechterte sich bei einer CO2 Konzentration von 2.5 %. Die Sequenzierung des gesamten Genoms dieser weiterentwickelten Stämme ergab Mutationen in Genen, die für Gdh1p, Pet9p und Idh1p kodieren. Diese Enzyme beeinflussen den intrazellulären NADPH-, ATP- und NADH-Spiegel, was auf den Energiebedarf für die Aktivität des RGP hinweist. Ich habe die GDH1-Mutation in nicht evolvierte Serin-Biosensor-Stämme eingebracht und damit das von Formiat und CO2 abhängige Wachstum reproduziert. Um die Auswirkung der GDH1-Mutation auf die Formationsassimilation zu klären, habe ich diese Mutation in den WT-Stamm eingeführt und ein Experiment zur Kohlenstoffverfolgung mit 13C-Formiat und Glukose durchgeführt. Es wurde nachgewiesen, dass die gdh1-Mutante im Vergleich zum WT-Stamm eine verbesserte Assimilation aufweist. Obwohl die 13C-Isotopenmarkierung die Aktivität aller drei Module der RGP bestätigte, könnte der Gesamtpyruvatfluss über den RGP durch die Versorgung mit Redox-Äuquivalenten begrenzt sein. In einem anderen Ansatz wurden daher die Formiatdehydrogenase (Fdh1p) für die Energieversorgung und die Serindesaminase (Cha1p) für die aktive Pyruvatsynthese überexprimiert und ein Wachstum mit Formiat und Serin ohne Glukose in der WT-Hefe festgestellt. Die weitere Entwicklung des gesamten Stoffwechsels in Kombination mit Evolutionsstrategien,und einer aus Formiat gewonnenen Serin- und Energiezufuhr für die Pyruvatsynthese ist unerlässlich, um ein vollständiges formatotrophes Wachstum im Hefesystem zu erreichen. KW - synthetic formatotrphy KW - green house gases KW - CHO-THF, CH-THF, CH2-THF, and CH3-THF KW - reductive glycine pathway KW - reductive acetyl-CoA pathway KW - glycine decarboxylase complex (=GCV) KW - glycine cleavage system KW - glycine synthase complex (reversal of GCV) KW - One-carbon KW - 10-Formyltetrahydrofolate KW - 5,10-Methenyltetrahydrofolate KW - 5,10-Methylenetetrahydrofolate KW - 5-Methyltetrahydrofolate KW - serine hydroxymethyltransferase KW - serine biosensor KW - adaptive laboratory evolution KW - next generation sequencing KW - Treibhausgase KW - Rahmenübereinkommen der Vereinten Nationen über Klimaänderungen KW - reduktiver Glycinweg KW - reduktiver Acetyl-CoA-Weg KW - Glycin-Spaltsystem KW - Glycin-Decarboxylase-Komplex (=GCV) KW - Glycin-Synthase-Komplex (Umkehrung von GCV) KW - Ein Kohlenstoff KW - 10-Formyltetrahydrofolat KW - 5,10-Methenyltetrahydrofolat KW - 5-Methyltetrahydrofolat KW - CHO-THF, CH-THF, CH2-THF und CH3-THF KW - 3-Phosphoglycerinsäure KW - Serin-Hydroxymethyltransferase KW - Serin-Biosensor KW - Evolutionsrunde KW - adaptive Laborentwicklung KW - Sequenzierung der nächsten Generation KW - Codierungssequenz KW - autonom replizierende Sequenz Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-582222 ER - TY - THES A1 - Martinez-Seidel, Federico T1 - Ribosome Heterogeneity and Specialization during Temperature Acclimation in Plants N2 - Ribosomes decode mRNA to synthesize proteins. Ribosomes, once considered static, executing machines, are now viewed as dynamic modulators of translation. Increasingly detailed analyses of structural ribosome heterogeneity led to a paradigm shift toward ribosome specialization for selective translation. As sessile organisms, plants cannot escape harmful environments and evolved strategies to withstand. Plant cytosolic ribosomes are in some respects more diverse than those of other metazoans. This diversity may contribute to plant stress acclimation. The goal of this thesis was to determine whether plants use ribosome heterogeneity to regulate protein synthesis through specialized translation. I focused on temperature acclimation, specifically on shifts to low temperatures. During cold acclimation, Arabidopsis ceases growth for seven days while establishing the responses required to resume growth. Earlier results indicate that ribosome biogenesis is essential for cold acclimation. REIL mutants (reil-dkos) lacking a 60S maturation factor do not acclimate successfully and do not resume growth. Using these genotypes, I ascribed cold-induced defects of ribosome biogenesis to the assembly of the polypeptide exit tunnel (PET) by performing spatial statistics of rProtein changes mapped onto the plant 80S structure. I discovered that growth cessation and PET remodeling also occurs in barley, suggesting a general cold response in plants. Cold triggered PET remodeling is consistent with the function of Rei-1, a REIL homolog of yeast, which performs PET quality control. Using seminal data of ribosome specialization, I show that yeast remodels the tRNA entry site of ribosomes upon change of carbon sources and demonstrate that spatially constrained remodeling of ribosomes in metazoans may modulate protein synthesis. I argue that regional remodeling may be a form of ribosome specialization and show that heterogeneous cytosolic polysomes accumulate after cold acclimation, leading to shifts in the translational output that differs between wild-type and reil-dkos. I found that heterogeneous complexes consist of newly synthesized and reused proteins. I propose that tailored ribosome complexes enable free 60S subunits to select specific 48S initiation complexes for translation. Cold acclimated ribosomes through ribosome remodeling synthesize a novel proteome consistent with known mechanisms of cold acclimation. The main hypothesis arising from my thesis is that heterogeneous/ specialized ribosomes alter translation preferences, adjust the proteome and thereby activate plant programs for successful cold acclimation. N2 - Ribosomen dekodieren mRNA, um Proteine zu synthetisieren. Ribosomen, früher als statische, ausführende Maschinen betrachtet, werden heute als dynamische Modulatoren der Translation angesehen. Zunehmend detailliertere Analysen der Strukturheterogenität von Ribosomen führte zu einem Paradigmenwechsel hin zu einer Spezialisierung von Ribosomen für eine selektive Translation. Als sessile Organismen können Pflanzen schädlichen Umwelteinflüssen nicht ausweichen und haben Strategien entwickelt, um diesen zu widerstehen. Zytosolische Ribosomen von Pflanzen sind in mancher Hinsicht vielfältiger, als die von anderen Metazoen. Diese Vielfalt könnte zur Stressakklimatisierung der Pflanzen beitragen. Ziel dieser Arbeit war es, festzustellen, ob Pflanzen die Heterogenität der Ribosomen nutzen, um die Proteinsynthese durch spezialisierte Translation zu regulieren. Ich habe mich auf die Temperaturakklimatisierung konzentriert, insbesondere auf den Wechsel zu niedrigen Temperaturen. Im Verlauf der Kälteakklimatisierung stellt Arabidopsis das Wachstum für sieben Tage ein. Währenddessen etabliert sie die für die Wiederaufnahme des Wachstums erforderlichen Anpassungen. Vorherige Ergebnisse deuten darauf hin, dass Ribosomenbiogenese für die Kälteakklimatisierung essentiell ist. REIL-Mutanten (reil-dkos), denen ein 60S-Reifungsfaktor fehlt, akklimatisieren sich nicht erfolgreich und nehmen das Wachstum nicht wieder auf. Anhand dieser Genotypen habe ich kältebedingte Defekte der Ribosomenbiogenese auf den Aufbau des Polypeptidaustritts-Tunnels (PET) zurückgeführt, indem ich räumliche statistische Analysen von rProtein-Veränderungen auf die pflanzliche 80S-Struktur abgebildet habe. Ich habe entdeckt, dass Wachstumsstillstand und PET-Umbau auch in Gerste auftreten, was auf eine allgemeine Kältereaktion in Pflanzen hindeutet. Der durch Kälte ausgelöste PET-Umbau stimmt über ein mit der Funktion von Rei-1, einem REIL-homologen Protein aus Hefe, in der Rei-1 die PET-Qualitätskontrolle durchführt. Anhand bahnbrechender Daten zur Ribosomenspezialisierung zeige ich, dass Hefe die tRNA-Eintrittsstelle von Ribosomen bei einem Wechsel von Kohlenstoffquellen umbaut, und demonstriere, dass ein räumlich begrenzter Umbau von Ribosomen in Metazoen die Proteinsynthese modulieren kann. Ich argumentiere, dass die regionale Umgestaltung eine Form der Ribosomenspezialisierung sein kann, und zeige, dass nach einer Kälteakklimatisierung heterogene zytosolische Polysomen akkumulieren, was zu Verschiebungen im Translationsoutput führt, der sich zwischen Wildtyp und reil-dkos unterscheidet. Ich habe festgestellt, dass die heterogenen Komplexe aus neu synthetisierten und wiederverwendeten Proteinen bestehen. Ich schlage vor, dass maßgeschneiderte Ribosomenkomplexe freie 60S-Untereinheiten in die Lage versetzen, spezifische 48S-Initiationskomplexe für die Translation auszuwählen. Kälte-akklimatisierte Ribosomen synthetisieren durch Ribosomenumbau ein neues Proteom, das mit bekannten Mechanismen der Kälteakklimatisierung übereinstimmt. Die Haupthypothese, die sich aus meiner Arbeit ergibt, ist, dass heterogene/spezialisierte Ribosomen ihre Translationspräferenzen verändern, das Proteom anpassen und dadurch Pflanzenprogramme für eine erfolgreiche Kälteakklimatisierung aktivieren. T2 - Ribosomenheterogenität und -spezialisierung während der Temperaturakklimatisierung in Pflanzen KW - Ribosome specialization KW - Ribosomal protein heterogeneity KW - Ribosomal protein substoichiometry KW - Protein synthesis KW - Translational regulation KW - Plant cytosolic translation KW - Cold acclimation KW - Ribosome biogenesis KW - 60S maturation KW - Hordeum vulgare KW - Arabidopsis thaliana KW - 60S-Reifung KW - Kälteakklimatisierung KW - Cytosolische Translation in Pflanzen KW - Proteinsynthese KW - Ribosomale Proteinheterogenität KW - Ribosomale Protein Substöchiometrie KW - Ribosomen-Biogenese KW - Ribosomen-Spezialisierung KW - Translationsregulation Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-580724 ER - TY - GEN A1 - Ogunkola, Moses Olalekan A1 - Guiraudie-Capraz, Gaelle A1 - Féron, François A1 - Leimkühler, Silke T1 - The Human Mercaptopyruvate Sulfurtransferase TUM1 Is Involved in Moco Biosynthesis, Cytosolic tRNA Thiolation and Cellular Bioenergetics in Human Embryonic Kidney Cells T2 - Zweitveröffentlichungen der Universität Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe N2 - Sulfur is an important element that is incorporated into many biomolecules in humans. The incorporation and transfer of sulfur into biomolecules is, however, facilitated by a series of different sulfurtransferases. Among these sulfurtransferases is the human mercaptopyruvate sulfurtransferase (MPST) also designated as tRNA thiouridine modification protein (TUM1). The role of the human TUM1 protein has been suggested in a wide range of physiological processes in the cell among which are but not limited to involvement in Molybdenum cofactor (Moco) biosynthesis, cytosolic tRNA thiolation and generation of H2S as signaling molecule both in mitochondria and the cytosol. Previous interaction studies showed that TUM1 interacts with the L-cysteine desulfurase NFS1 and the Molybdenum cofactor biosynthesis protein 3 (MOCS3). Here, we show the roles of TUM1 in human cells using CRISPR/Cas9 genetically modified Human Embryonic Kidney cells. Here, we show that TUM1 is involved in the sulfur transfer for Molybdenum cofactor synthesis and tRNA thiomodification by spectrophotometric measurement of the activity of sulfite oxidase and liquid chromatography quantification of the level of sulfur-modified tRNA. Further, we show that TUM1 has a role in hydrogen sulfide production and cellular bioenergetics. T3 - Zweitveröffentlichungen der Universität Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe - 1307 KW - Moco biosynthesis KW - sulfite oxidase KW - cytosolic tRNA thiolation KW - 5-methoxycarbonylmethyl-2-thiouridine KW - H2S biosynthesis KW - cellular bioenergetics Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-579580 SN - 1866-8372 IS - 1307 ER - TY - GEN A1 - Marggraf, Lara Christin A1 - Lindecke, Oliver A1 - Voigt, Christian C. A1 - Pētersons, Gunārs A1 - Voigt-Heucke, Silke Luise T1 - Nathusius’ bats, Pipistrellus nathusii, bypass mating opportunities of their own species, but respond to foraging heterospecifics on migratory transit flights T2 - Zweitveröffentlichungen der Universität Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe N2 - In late summer, migratory bats of the temperate zone face the challenge of accomplishing two energy-demanding tasks almost at the same time: migration and mating. Both require information and involve search efforts, such as localizing prey or finding potential mates. In non-migrating bat species, playback studies showed that listening to vocalizations of other bats, both con-and heterospecifics, may help a recipient bat to find foraging patches and mating sites. However, we are still unaware of the degree to which migrating bats depend on con-or heterospecific vocalizations for identifying potential feeding or mating opportunities during nightly transit flights. Here, we investigated the vocal responses of Nathusius’ pipistrelle bats, Pipistrellus nathusii, to simulated feeding and courtship aggregations at a coastal migration corridor. We presented migrating bats either feeding buzzes or courtship calls of their own or a heterospecific migratory species, the common noctule, Nyctalus noctula. We expected that during migratory transit flights, simulated feeding opportunities would be particularly attractive to bats, as well as simulated mating opportunities which may indicate suitable roosts for a stopover. However, we found that when compared to the natural silence of both pre-and post-playback phases, bats called indifferently during the playback of conspecific feeding sounds, whereas P. nathusii echolocation call activity increased during simulated feeding of N. noctula. In contrast, the call activity of P. nathusii decreased during the playback of conspecific courtship calls, while no response could be detected when heterospecific call types were broadcasted. Our results suggest that while on migratory transits, P. nathusii circumnavigate conspecific mating aggregations, possibly to save time or to reduce the risks associated with social interactions where aggression due to territoriality might be expected. This avoidance behavior could be a result of optimization strategies by P. nathusii when performing long-distance migratory flights, and it could also explain the lack of a response to simulated conspecific feeding. However, the observed increase of activity in response to simulated feeding of N. noctula, suggests that P. nathusii individuals may be eavesdropping on other aerial hawking insectivorous species during migration, especially if these occupy a slightly different foraging niche. T3 - Zweitveröffentlichungen der Universität Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe - 1306 KW - playback KW - phonotaxis KW - bats KW - acoustic communication KW - animal migration KW - eavesdropping KW - echolocation KW - Pipistrellus nathusii Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-579574 SN - 1866-8372 IS - 1306 ER - TY - GEN A1 - Ilicic, Doris A1 - Woodhouse, Jason A1 - Karsten, Ulf A1 - Zimmermann, Jonas A1 - Wichard, Thomas A1 - Quartino, Maria Liliana A1 - Campana, Gabriela Laura A1 - Livenets, Alexandra A1 - Van den Wyngaert, Silke A1 - Grossart, Hans-Peter T1 - Antarctic Glacial Meltwater Impacts the Diversity of Fungal Parasites Associated With Benthic Diatoms in Shallow Coastal Zones T2 - Zweitveröffentlichungen der Universität Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe N2 - Aquatic ecosystems are frequently overlooked as fungal habitats, although there is increasing evidence that their diversity and ecological importance are greater than previously considered. Aquatic fungi are critical and abundant components of nutrient cycling and food web dynamics, e.g., exerting top-down control on phytoplankton communities and forming symbioses with many marine microorganisms. However, their relevance for microphytobenthic communities is almost unexplored. In the light of global warming, polar regions face extreme changes in abiotic factors with a severe impact on biodiversity and ecosystem functioning. Therefore, this study aimed to describe, for the first time, fungal diversity in Antarctic benthic habitats along the salinity gradient and to determine the co-occurrence of fungal parasites with their algal hosts, which were dominated by benthic diatoms. Our results reveal that Ascomycota and Chytridiomycota are the most abundant fungal taxa in these habitats. We show that also in Antarctic waters, salinity has a major impact on shaping not just fungal but rather the whole eukaryotic community composition, with a diversity of aquatic fungi increasing as salinity decreases. Moreover, we determined correlations between putative fungal parasites and potential benthic diatom hosts, highlighting the need for further systematic analysis of fungal diversity along with studies on taxonomy and ecological roles of Chytridiomycota. T3 - Zweitveröffentlichungen der Universität Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe - 1290 KW - Antarctica KW - aquatic fungi KW - Chytridiomycota KW - phytoplankton host KW - salinity gradient KW - Illumina amplicon sequencing KW - Carlini Station Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-572895 SN - 1866-8372 IS - 1290 ER -