TY - THES A1 - Troppmann, Britta T1 - Klonierung und Charakterisierung aminerger Rezeptoren der Amerikanischen Schabe Periplaneta americana T1 - Characterization of biogenic amine receptors of the american cockroach Periplaneta americana N2 - Biogene Amine sind kleine organische Verbindungen, die sowohl bei Vertebraten als auch bei Invertebraten als Neurotransmitter, Neuromodulatoren und/oder Neurohormone wirken. Sie bilden eine bedeutende Gruppe von Botenstoffen und entfalten ihre Wirkungen vornehmlich über die Bindung an G-Protein-gekoppelte Rezeptoren. Bei Insekten wurde eine Vielzahl von Wirkungen biogener Amine beschrieben. Das führte schon frühzeitig zur Vermutung, dass Insekten (u. a. Invertebraten) wie die Wirbeltiere ein diverses Repertoire an aminergen Rezeptoren besitzen. Für ein umfassendes Verständnis der komplexen physiologischen Wirkungen biogener Amine fehlten jedoch wichtige Informationen über die molekulare Identität der entsprechenden Rezeptorproteine und ihrer pharmakologischen Eigenschaften, ihre Lokalisation und ihre intrazellulären Reaktionspartner. Viele bei Schaben gut untersuchte (neuro)physiologische Prozesse sowie Verhaltensweisen werden durch Serotonin und Dopamin gesteuert bzw. moduliert. Über die beteiligten Rezeptoren ist jedoch bisher vergleichsweise wenig bekannt. Die Klonierung und Charakterisierung von Serotonin- und Dopaminrezeptoren der Amerikanischen Schabe P. americana ist damit ein längst überfälliger Schritt auf dem Weg zu einem umfassenden Verständnis der vielfältigen Wirkungen biogener Amine bei Insekten. Durch die Anwendung verschiedener Klonierungsstrategien konnten cDNAs isoliert werden, die für potentielle Serotoninrezeptoren und einen Dopaminrezeptor kodieren. Die Sequenzen weisen die größte Ähnlichkeit zu Mitgliedern der 5-HT1- und 5-HT7-Rezeptorklassen bzw. den Invertebratentyp-Dopaminrezeptoren auf. Die isolierten Rezeptoren der Amerikanischen Schabe wurden dementsprechend Pea(Periplaneta americana)5-HT1, Pea5-HT7 und PeaDop2 benannt. Das Hydropathieprofil dieser Rezeptoren postuliert das Vorhandensein der charakteristischen heptahelikalen Architektur G-Protein-gekoppelter Rezeptoren. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen zeigen typische Merkmale aminerger Rezeptoren. So sind Aminosäuren, die bedeutend für die Ligandenbindung, die Rezeptoraktivierung und die Kopplung an G﷓Proteine sind, in den Rezeptoren konserviert. Expressionsstudien zeigten eine auffallend hohe Expression aller drei Rezeptor-mRNAs im Gehirn sowie in den Speicheldrüsen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden polyklonale Antikörper gegen den Pea5-HT1-Rezeptor sowie den PeaDop2-Rezeptor hergestellt. Der anti-Pea5-HT1-Antikörper detektiert im Homogenat von Schabengehirnen, Speicheldrüsen und Pea5-HT1-exprimierenden HEK 293-Zellen die glykosylierte Form des Rezeptors. In Gehirnschnitten markiert der anti-Pea5-HT1-Antikörper spezifisch einige Zellkörper in der Pars intercerebralis und deren Axone, welche in den Corpora cardiaca Nerv I projizieren. Der PeaDop2-Rezeptor wurde durch den spezifischen anti-PeaDop2-Antikörper in Neuronen mit Somata im anterioren Randbereich der Medulla nachgewiesen. Diese Neurone innervieren die optischen Loben und projizieren in das ventrolaterale Protocerebrum. Die intrazellulären Signalwege der heterolog exprimierten Pea5-HT1- und PeaDop2-Rezeptoren wurden in HEK 293-Zellen untersucht. Die Aktivierung des Pea5-HT1-Rezeptors durch Serotonin führt zur Hemmung der cAMP-Synthese. Des Weiteren wurde gezeigt, dass der Rezeptor konstitutive Aktivität besitzt. WAY 100635, ein hoch selektiver 5-HT1A-Rezeptorantagonist, wurde als wirksamer inverser Agonist am Pea5-HT1-Rezeptor identifiziert. Der stabil exprimierte PeaDop2-Rezeptor antwortet auf eine Aktivierung durch Dopamin mit einer Erhöhung der cAMP-Konzentration. Eine C-terminal trunkierte Variante dieses Rezeptors ist eigenständig nicht funktional. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit indizieren, dass die untersuchten aminergen Rezeptoren im zentralen Nervensystems der Schabe an der Informationsverarbeitung beteiligt sind und verschiedene physiologische Prozesse in peripheren Organen regulieren. Mit der Klonierung und funktionellen Charakterisierung der ersten Serotoninrezeptoren und eines Dopaminrezeptors ist damit eine wichtige Grundlage für die Untersuchung ihrer Funktionen geschaffen worden. N2 - Biogenic amines are small organic compounds that act as neurotransmitters, neuromodulators and/or neurohormones in vertebrates and in invertebrates. They form an important group of messenger substances and mediate their diverse effects primarily by binding to G protein-coupled receptors. The molecular identification as well as the functional and pharmacological characterization of these receptors is crucial for the comprehension of the intracellular signaling pathways activated by biogenic amines. This work describes the molecular and functional characterization of the first serotonin receptors and an invertebrate-type dopamine receptor of the American cockroach, Periplaneta americana. Using a PCR-strategy based on degenerate primers and RACE-PCR three cDNAs encoding for putative biogenic amine receptors were isolated from P. americana brain cDNA (Pea5-ht1, Pea5-ht7, Peadop2). The deduced amino acid sequences display major characteristics common to all G protein-coupled receptors. Primarily Distribution of receptor mRNA was investigated by RT-PCR. The analysis revealed a high mRNA expression level for all three receptors in the brain and salivary glands. The distribution of the Pea5﷓HT1 and PeaDop2 receptor proteins was analyzed by immunohistochemistry with specific affinity-purified polyclonal antibodies. Both receptor proteins are expressed in brain and salivary glands. Furthermore the cellular distribution of the receptors was investigated by immunocytochemistry on brain sections. The anti-Pea5-HT1 receptor antibody specifically labelled some large somata in the pars intercerebralis. Labeled axons of these neurons pass down the anterior surface of the brain and cross over in the chiasma region of the corpora cardiaca nerve 1. The PeaDop2 receptor was detected in neurons with somata at the anterior edge of the medulla bilaterally innervating the optic lobes and projecting to the ventro-lateral protocerebrum. In order to clarify the functional and pharmacological properties of the cloned receptors, we studied HEK 293 cell lines stably expressing Pea5-HT1 or PeaDop2. Activation of Pea5-HT1 expressing cells by serotonin reduced adenylyl cyclase activity in a dose-dependent manner. The Pea5-HT1 receptor was expressed as a constitutively active receptor with methiothepin acting as a neutral antagonist and WAY 100635 as an inverse agonist. The activation of the PeaDop2 receptor by dopamine induced an increase in intracellular cAMP level, whereas a C-terminally truncated splice variant of this receptor does not exhibit any functional property by itself. The results of this work suggest important roles of the investigated receptors in various areas of the cockroach brain. The molecular and pharmacological characterization of the first serotonin receptors and a dopamine receptor of the cockroach now provides the basis for forthcoming studies regarding the significance of these particular receptors for cockroach behavior and physiology KW - Insekt KW - Dopamin KW - Serotonin KW - G-Protein-gekoppelte-Rezeptoren KW - insect KW - serotonin KW - dopamine KW - G-protein-coupled-receptors Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-36619 ER - TY - THES A1 - Blenau, Wolfgang T1 - Aminerge Signaltransduktion bei Insekten T1 - Aminergic signal transduction in insects N2 - Biogene Amine sind kleine organische Verbindungen, die sowohl bei Wirbeltieren als auch bei Wirbellosen als Neurotransmitter, Neuromodulatoren und/oder Neurohormone wirken können. Sie bilden eine bedeutende Gruppe von Botenstoffen und entfalten ihre Wirkungen über die Bindung an eine bestimmte Klasse von Rezeptorproteinen, die als G-Protein-gekoppelte Rezeptoren bezeichnet werden. Bei Insekten gehören zur Substanzklasse der biogenen Amine die Botenstoffe Dopamin, Tyramin, Octopamin, Serotonin und Histamin. Neben vielen anderen Wirkung ist z.B. gezeigt worden, daß einige dieser biogenen Amine bei der Honigbiene (Apis mellifera) die Geschmacksempfindlichkeit für Zuckerwasser-Reize modulieren können. Ich habe verschiedene Aspekte der aminergen Signaltransduktion an den „Modellorganismen“ Honigbiene und Amerikanische Großschabe (Periplaneta americana) untersucht. Aus der Honigbiene, einem „Modellorganismus“ für das Studium von Lern- und Gedächtnisvorgängen, wurden zwei Dopamin-Rezeptoren, ein Tyramin-Rezeptor, ein Octopamin-Rezeptor und ein Serotonin-Rezeptor charakterisiert. Die Rezeptoren wurden in kultivierten Säugerzellen exprimiert, um ihre pharmakologischen und funktionellen Eigenschaften (Kopplung an intrazelluläre Botenstoffwege) zu analysieren. Weiterhin wurde mit Hilfe verschiedener Techniken (RT-PCR, Northern-Blotting, in situ-Hybridisierung) untersucht, wo und wann während der Entwicklung die entsprechenden Rezeptor-mRNAs im Gehirn der Honigbiene exprimiert werden. Als Modellobjekt zur Untersuchung der zellulären Wirkungen biogener Amine wurden die Speicheldrüsen der Amerikanischen Großschabe genutzt. An isolierten Speicheldrüsen läßt sich sowohl mit Dopamin als auch mit Serotonin Speichelproduktion auslösen, wobei Speichelarten unterschiedlicher Zusammensetzung gebildet werden. Dopamin induziert die Bildung eines völlig proteinfreien, wäßrigen Speichels. Serotonin bewirkt die Sekretion eines proteinhaltigen Speichels. Die Serotonin-induzierte Proteinsekretion wird durch eine Erhöhung der Konzentration des intrazellulären Botenstoffs cAMP vermittelt. Es wurden die pharmakologischen Eigenschaften der Dopamin-Rezeptoren der Schaben-Speicheldrüsen untersucht sowie mit der molekularen Charakterisierung putativer aminerger Rezeptoren der Schabe begonnen. Weiterhin habe ich das ebony-Gen der Schabe charakterisiert. Dieses Gen kodiert für ein Enzym, das wahrscheinlich bei der Schabe (wie bei anderen Insekten) an der Inaktivierung biogener Amine beteiligt ist und im Gehirn und in den Speicheldrüsen der Schabe exprimiert wird. N2 - Biogenic amines are small organic compounds that act as neurotransmitters, neuromodulators and/or neurohormones in vertebrates and in invertebrates. They form an important group of messenger substances and mediate their diverse effects by binding to membrane receptors that primarily belong to the large gene-family of G protein-coupled receptors. In insects, the group of biogenic amine messengers consists of five members: dopamine, tyramine, octopamine, serotonin, and histamine. Besides many other effects, some of these biogenic amines were shown, for example, to modulate gustatory sensitivity to sucrose stimuli in the honeybee (Apis mellifera). I have investigated various aspects of the aminergic signal transduction in the “model organisms” honeybee and American cockroach (Periplaneta americana). So far, I have characterized two dopamine receptors, a tyramine receptor, an octopamine receptor and a serotonin receptor of the honeybee, which is well-known for its learning and memory capacities. The receptors where expressed in cultivated mammalian cells in order to analyze their pharmacological and functional (i.e., second messenger coupling) properties. The spatiotemporal expression patterns of the respective receptor mRNA were investigated in the honeybee brain by using different techniques (RT PCR, Northern blotting, in situ-hybridization). The salivary glands of the American cockroach were used as a model object in order to investigate the cellular effects of biogenic amines. Both dopamine and serotonin trigger salivary secretion in isolated salivary glands. The quality of the secreted saliva is, however, different. Stimulation of the glands by serotonin results in the production of a protein-rich saliva, whereas stimulation by dopamine results in saliva that is protein-free. Serotonin-induced protein secretion is mediated by an increase in the intracellular concentration of cAMP. The pharmacological properties of dopamine receptors associated with cockroach salivary glands were investigated and the molecular characterization of putative aminergic receptors of the cockroach was initiated. Furthermore, I have characterized the ebony gene of the cockroach. This gene encodes an enzyme that is probably involved in the inactivation of biogenic amines in the cockroach (as in other insects). The ebony gene is expressed in the brain and in the salivary glands of the cockroach. KW - Neurotransmitter-Rezeptor KW - Dopamin KW - Tyramin KW - Octopamin KW - Serotonin KW - Insekten KW - Biene KW - Amerikanische Schabe KW - Biogene Amine KW - G-Protein-gekoppelte-Rezeptoren KW - biogenic amines KW - G protein-coupled receptors KW - honeybee KW - salivary gland Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-7568 ER -