TY - JOUR A1 - Voss, Henning A1 - Meyer, Jeannette A1 - Schwonbeck, Susanne A1 - Fritsche, Immo A1 - Hartmann, Bernhard A1 - Wegwarth, Odette A1 - Friedrich, Anke A1 - Buchheister-Knappe, Stefanie A1 - Marwan, Norbert A1 - Bandau, Anja A1 - Bullinger, Hans-Jörg A1 - Weith, Thomas T1 - Portal alumni T2 - Das Ehemaligen-Magazin der Universität Potsdam N2 - Liebe Leserin, lieber Leser, erforschen, was die Welt im Innersten zusammenhält- das ist für viele Studierende ein Traum. Doch welche Opfer muss man bringen, um ihn zu verwirklichen? Welche Bemfsperspektive hat der Bemf Forscher heute noch? Auch viele Absolventen der Universität Potsdam müssen sich diese Fragen beantworten. Zu welchen Antworten einige dabei gekommen sind und welche Probleme sie zu bewältigen haben, vom Spaß am Forschen und von Zukunftsängsten berichten sie in der Rubrik "Forscherkarrieren". Gelder für die Forschung fließen in Deutschland zu spärlich, verglichen mit anderen führenden Industrienationen. So sind die Bedingungen für Forscher hierzulande nicht die besten. Manchen jungen Wissenschaftler zieht es- mitunter notgedrungen- ins Ausland. Wie Deutschland dadurch seine ZukunftsHihigkeit riskiert, thematisiert der Präsident der Fraunhofer-Gesellschaft, Prof. Dr. Hans-Jörg Bullinger, in der Rubrik "wissenstransfer". Auch die Universität ist kein Garant für eine gesicherte Zukunft in der Forschung. Wer sechs Jahre nach der Promotion den Sprung zur Professur nicht geschafft hat, geht einer ungewissen Zukunft als Privatdozent entgegen. Seit einigen Jahren gibt es neben der Habilitation noch einen zweiten Weg zur Professur- die Juniorprofessur. Auch an der Universität Potsdam gibt es seit 2002 Juniorprofessoren, von denen die ersten jetzt evaluiert wurden. Näheres dazu finden Sie ebenfalls in der Rubrik "wissenstransfer". Wer noch nach einer Finanzierungsmöglichkeit für seine Promotion sucht, findet Tipps in der Rubrik "wegweiser". Die Redaktion wünscht Ihnen viel Vergnügen beim Lesen von Portal alumni und freut sich auf zahlreiche Leserbriefe. N2 - Dear readers, many students dream of researching the world's inner and outermost secrets. Still, what sacrifice must one bring in order to achieve this goa/, and what are the professional perspectives being offered to researchers today? Many University of Potsdom alumni have to find answers to these questions as weil. in the section "forscher/eben", a number of alumni discuss their answers, the problems that they have encountered along the way, the enJoyment that they have received through their research and their worries for the future. In Germany, the funding of research on part ofboth the state and the corporate world is sparsein comparison to other leading industrial countries, and the current opportunities for researchers are clearly not the best. in the section ,.wissenstransfer", the president of the Frauenhofer-Gesellschaft, Prof Dr. Hans-jörg Bullinger, discusses how Germany is losing its future potential in the process. Indeed, the university is no guarantee for a secure profossianal future in the research field. A few years ago, the Junior professorship was created as a second path to a Juli professorship, next to the traditional postdoctoral qualification (Habilitation). in 2002, the University of Potsdom began to establish Junior professorships. The first of these are currently being evaluated. More information on this process can be found in the section "wissenstransfer". In addition, suggestions and tips can be found in the section "wegweiser" for those who are seekingfunding opportunities for their dissertation work. T3 - Portal alumni : das Ehemaligen-Magazin der Universität Potsdam - 3/2005 Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-481608 VL - 2005 IS - 3 EP - 58 ER - TY - THES A1 - Schwonbeck, Susanne T1 - Analyse von Single Nucleotide Polymorphisms an Glas-Oberflächen N2 - Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung einer SNP-Genotypisierungsmethode mit auf Mikroarrays immobilisierten PCR-Produkten. Für die Analyse wurde ein faseroptischer Affinitätssensor bzw. ein Durchfluss-Biochip-Scanner mit integrierter Fluoreszenzdetektion verwendet. An den immobilisierten Analyten (PCR-Produkten) wurde eine Fluoreszenzoligonukleotidsonde hybridisiert und anschließend die Dissoziation der Sonde im Fluss verfolgt. Die Diskriminierung von Wildtyp- und Mutanten-DNA erfolgte durch die kinetische Auswertung der Dissoziationskurven sowie durch die Analyse der Fluoreszenzintensität. Die Versuche am faseroptischen Affinitätssensor zeigten, dass DNA-DNA-Hybride sowohl von Oligonukleotiden als auch von PCR-Produkten ein typisches Dissoziationsverhalten aufweisen, wobei fehlgepaarte Hybride eine signifikant schnellere Dissoziation zeigen als perfekt passende Hybride. Dieser Geschwindigkeitsunterschied lässt sich durch den Vergleich der jeweiligen kinetischen Geschwindigkeitskonstanten kD quantitativ erfassen. Da die Kopplung des Analyten an der Chipoberfläche sowie die Hybridisierungs- und Dissoziationsparameter essentiell für die Methodenentwicklung war, wurden die Parameter für ein optimales Spotting und die Immobilisierung von PCR-Produkten ermittelt. Getestet wurden die affine Kopplung von biotinylierten PCR-Produkten an Streptavidin-, Avidin- und NeutrAvidin-Oberflächen sowie die kovalente Bindung von phosphorylierten Amplifikaten mit der EDC/Methylimidazol-Methode. Die besten Ergebnisse sowohl in Spotform und -homogenität als auch im Signal/Rausch-Verhältnis wurden an NeutrAvidin-Oberflächen erreicht. Für die Etablierung der Mikroarray-Genotypisierungsmethode durch kinetische Analyse nach einem Hybridisierungsexperiment wurden Sondenlänge, Puffersystem, Spotting-Konzentration des Analyten sowie Temperatur optimiert. Das Analysensystem erlaubte es, PCR-Produkte mit einer Konzentration von 250 ng/µl in einem HEPES-EDTA-NaCl-Puffer auf mit NeutrAvidin beschichtete Glasträger zu spotten. In den anschließenden Hybridisierungs- und Dissoziationsexperimenten bei 30 °C konnte die Diskriminierung von homocygoter Wildtyp- und homocygoter Mutanten- sowie heterocygoter DNA am Beispiel von Oligonukleotid-Hybriden erreicht werden. In einer Gruppe von 24 homocygoten Patienten wurde ein Polymorphismus im SULT1A1-Gen analysiert. Sowohl durch kinetische Auswertung als auch mit der Analyse der Fluoreszenzintensität wurde der Genotyp der Proben identifiziert. Die Ergebnisse wurden mit dem Referenzverfahren, der Restriktionschnittstellenanalyse (PCR-RFLP) validiert. Lediglich ein Genotyp wurde falsch bestimmt, die Genauigkeit lag bei 96%. In einer Gruppe von 44 Patienten wurde der Genotyp eines SNP in der Adiponectin-Promotor-Region untersucht. Nach Vergleich der Analysenergebnisse mit denen eines Referenzverfahrens konnten lediglich 14 der untersuchten Genotypen bestätigt werden. Ursache für die unzureichende Genauigkeit der Methode war vor allem das schlechte Signal/Rausch-Verhältnis. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass das in dieser Arbeit entwickelte Analysesystem für die Genotypisierung von Einzelpunktmutationen geeignet ist, homocygote Patientenproben zuverlässig zu analysieren. Prinzipiell ist das auch bei heterocygoter DNA möglich. Da nach aktuellem Kenntnisstand eine SNP-Analysemethode an immobilisierten PCR-Produkten noch nicht veröffentlicht wurde, stellt das hier entwickelte Verfahren eine Alternative zu bisher bekannten Mikroarray-Verfahren dar. Als besonders vorteilhaft erweist sich der reverse Ansatz der Methode. Der hier vorgestellte Ansatz ist eine kostengünstigere und weniger hoch dimensionierte Lösung für Fragestellungen beispielsweise in der Ernährungswissenschaft, bei denen meist eine mittlere Anzahl Patienten auf nur einige wenige SNPs zu untersuchen ist. Wenn es gelingt, durch die Weiterentwicklung der Hardware bzw. weiterer Optimierung, eine Verbesserung des Signal/Rausch-Verhältnisses und damit die Diskriminierung von heterocygoter DNA zu erreichen, kann diese Methode zukünftig bei der Analyse von mittelgroßen Patientengruppen alternativ zu anderen Genotypisierungsmethoden verwendet werden. N2 - The aim of this thesis was the development of a SNP genotyping method involving PCR products immobilised on microarrays. For the analysis a fibre optic affinity biosensor and a flow-through biochip scanner were used. Fluorescent probes were hybridized with the immobilised PCR products. In order to start the dissociation process the surface was rinsed with buffer and the fluorescence intensity was measured. Two different cases were studied: First, the full-matched DNA hybrid (wildtyp single strand with complementary wildtype single strand), second the mis-matched hybrid (wildtype single strand and mutant single strand). After determinating the reaction rates (kD) as kinetic parameter the kD values of both cases were compared. The experiments showed a significant difference in the kD value of the full- and the mis-match hybrids. Therefore, mutant and wildtype DNA were discriminated by kinetic analysis of the dissociation process and analysis of the fluorescence intensity. To set up the complete analysis process the reaction parameters like coupling of the PCR products had to be optimised. Both affininty coupled (streptavidin, neutravidin, avidin - biotin) and covalent methods (EDC/methylimidazol) were carried out. Best results in spot homogeinity and spot appearance were obtained with coupling of biotinylated PCR products on neutravidin coated chip surfaces. Additionally, the length of the probe, the spotting concentration, the spotting buffer and the reaction temperature were optimised. In the optimised analysis PCR products (250 µg/µl) were spotted onto neutravidin coated surfaces. The hybridisation and dissociation processes were carried out at 30°C. A HEPES-EDTA-NaCl buffer was used for spotting, diluting of the fluorescent probe and rinsing the microarray surface. A fluorescent probe was used with 13 nucleotides in length. The mis- or full-matching base indicating the polymorphism was located in the center position of the probe. The analysis system was tested with the genomic DNA of a group of 24 homocygote individuals with a SNP in the SULT1A1 gene region. The hybridisation and dissociation processes were carried out and the reaction rates were determinated. Subsequently after the analysis in the flow-through biochip scanner the fluorescence intensity of the spots were measured. The results showed very good comparability with results of a PCR-RFLP analysis (one false genotype). Additionally, a group of 44 heterocygote DNA samples with one SNP in the adiponectin promotor region were also genotyped. Compared to a reference method only 14 genotypes were correctly determined. This was mostly due to a low signal-noise-ratio and needs to be further investigated. Besides the problem in analysing heterocygote DNA samples the developed analysis system is very useful for genotyping SNP in homocygote DNA samples. The successful analysis of heterocygote sample is principally possible and with further investigations/optimisation, a better analysis should be possible. The most important advantage of the developed method is the reverse approach of binding PCR products at the surface instead of oligonucleotides. This allows the parallel genotyping of several individuals. Other advantages include low costs and medium sized dimensions in terms of throughput. KW - Einzelbasenaustausch KW - SNP KW - Mikrochip KW - DNA-Chip KW - SULT1A1 KW - Adiponectin KW - kinetische Analyse KW - Dissoziation KW - Durchfluß-Biochip-Scanner KW - Fließsystem KW - single nucleotide polymorphisms KW - SNP KW - microarray KW - DNA KW - kinetic analysis KW - dissociation KW - SULT1A1 KW - flow-through biochip scanner Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0001853 ER -