TY - JOUR A1 - Pitzen, Valentin A1 - Sander, Sophia A1 - Baumann, Otto A1 - Gräf, Ralph A1 - Meyer, Irene T1 - Cep192, a novel missing link between the centrosomal core and corona in Dictyostelium amoebae JF - Cells : open access journal N2 - The Dictyostelium centrosome is a nucleus-associated body with a diameter of approx. 500 nm. It contains no centrioles but consists of a cylindrical layered core structure surrounded by a microtubule-nucleating corona. At the onset of mitosis, the corona disassembles and the core structure duplicates through growth, splitting, and reorganization of the outer core layers. During the last decades our research group has characterized the majority of the 42 known centrosomal proteins. In this work we focus on the conserved, previously uncharacterized Cep192 protein. We use superresolution expansion microscopy (ExM) to show that Cep192 is a component of the outer core layers. Furthermore, ExM with centrosomal marker proteins nicely mirrored all ultrastructurally known centrosomal substructures. Furthermore, we improved the proximity-dependent biotin identification assay (BioID) by adapting the biotinylase BioID2 for expression in Dictyostelium and applying a knock-in strategy for the expression of BioID2-tagged centrosomal fusion proteins. Thus, we were able to identify various centrosomal Cep192 interaction partners, including CDK5RAP2, which was previously allocated to the inner corona structure, and several core components. Studies employing overexpression of GFP-Cep192 as well as depletion of endogenous Cep192 revealed that Cep192 is a key protein for the recruitment of corona components during centrosome biogenesis and is required to maintain a stable corona structure. KW - Cep192 KW - SPD-2 KW - centrosome KW - Dictyostelium KW - microtubule-organization KW - MTOC Y1 - 2021 U6 - https://doi.org/10.3390/cells10092384 SN - 2073-4409 VL - 10 IS - 9 PB - MDPI CY - Basel ER - TY - THES A1 - Pitzen, Valentin T1 - Weitergeführte funktionelle Charakterisierung des centrosomalen Proteins Cep192 und Untersuchung der Topologie des Centrosoms in Dictyostelium Amöben T1 - Functional Characterization of the Centrosomal Protein Cep192 and Investigation of the Topology of the Centrosome in Dictyostelium amoeba N2 - Das Centrosom von Dictyostelium ist acentriolär aufgebaut, misst ca. 500 nm und besteht aus einer dreischichten Core-Struktur mit umgebender Corona, an der Mikrotubuli nukleieren. In dieser Arbeit wurden das centrosomale Protein Cep192 und mögliche Interaktionspartner am Centrosom eingehend untersucht. Die einleitende Lokalisationsuntersuchung von Cep192 ergab, dass es während der gesamten Mitose an den Spindelpolen lokalisiert und im Vergleich zu den anderen Strukturproteinen der Core-Struktur am stärksten exprimiert ist. Die dauerhafte Lokalisation an den Spindelpolen während der Mitose wird für Proteine angenommen, die in den beiden identisch aufgebauten äußeren Core-Schichten lokalisieren, die das mitotische Centrosom formen. Ein Knockdown von Cep192 führte zur Ausbildung von überzähligen Mikrotubuli-organisierenden Zentren (MTOC) sowie zu einer leicht erhöhten Ploidie. Deshalb wird eine Destabilisierung des Centrosoms durch die verminderte Cep192-Expression angenommen. An Cep192 wurden zwei kleine Tags, der SpotH6- und BioH6-Tag, etabliert, die mit kleinen fluoreszierenden Nachweiskonjugaten markiert werden konnten. Mit den so getagten Proteinen konnte die hochauflösende Expansion Microscopy für das Centrosom optimiert werden und die Core-Struktur erstmals proteinspezifisch in der Fluoreszenzmikroskopie dargestellt werden. Cep192 lokalisiert dabei in den äußeren Core-Schichten. Die kombinierte Markierung von Cep192 und den centrosomalen Proteinen CP39 und CP91 in der Expansion Microscopy erlaubte die Darstellung des dreischichtigen Aufbaus der centrosomalen Core-Struktur, wobei CP39 und CP91 zwischen Cep192 in der inneren Core-Schicht lokalisieren. Auch die Corona wurde in der Expansion Microscopy untersucht: Das Corona-Protein CDK5RAP2 lokalisiert in räumlicher Nähe zu Cep192 in der inneren Corona. Ein Vergleich der Corona-Proteine CDK5RAP2, CP148 und CP224 in der Expansion Microscopy ergab unterscheidbare Sublokalisationen der Proteine innerhalb der Corona und relativ zur Core-Struktur. In Biotinylierungsassays mit den centrosomalen Core-Proteinen CP39 und CP91 sowie des Corona-Proteins CDK5RAP2 konnte Cep192 als möglicher Interaktionspartner identifiziert werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen die wichtige Funktion des Proteins Cep192 im Dictyostelium-Centrosom und ermöglichen durch die Kombination aus Biotinylierungsassays und Expansion Microscopy der untersuchten Proteine ein verbessertes Verständnis der Topologie des Centrosoms. N2 - The Dictyostelium centrosome contains no centrioles and has a diameter of approx. 500 nm. It consists of a three layered core structure and a surrounding corona, which nucleates microtubules. This work focusses on the centrosomal protein Cep192 and potential interactors at the centrosome. Localization studies showed, that Cep192 is a permanent resident at the spindle poles during mitosis and that, compared to other centrosomal core proteins, Cep192 is expressed at the highest level. The permanent residence at the spindle poles throughout mitosis is assumed for proteins which localize to the outer core layers, which form the mitotic centrosome. A knockdown of Cep192 resulted in supernumerary microtubule organizing centers (MTOC) and a slightly higher ploidy. Due to the phenotype, a destabilization of the centrosome caused by the reduced Cep192 expression is assumed. Cep192 was fused to the newly established short tags BioH6 and SpotH6, which are recognized by small fluorescently labelled probes. The tagged proteins were used for superresolution expansion microscopy. Superresolution expansion microscopy was optimized for the centrosome and allowed the protein specific resolving of the core structure for the first time. Cep192 localizes to the outer core layers. Combination of tagged proteins nicely mirrored all three core layers. CP39 and CP91 localize inbetween Cep192 in the inner core layer. Corona proteins were included in the expansion microscopy: the corona protein CDK5RAP2 comes into close proximity of Cep192 and localizes to the inner corona. A comparison with CP148 and CP224, two other corona proteins, revealed a distinct localization of the proteins within the corona and relatively to the core structure. Applied biotinylase assays with the core proteins CP39 and CP91, as well with the corona protein CDK5RAP2 revealed Cep192 as a possible interaction partner of all three proteins. The results of this work show the important function of Cep192 at the Dictyostelium centrosome and through the biotinylase assay and expansion microscopy data shed a light on the refined Dictyostelium centrosome topology. KW - Centrosom KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - expansion microscopy KW - Cep192 KW - CDK5RAP2 KW - fluorescence microscopy KW - Cep192 KW - CDK5RAP2 Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-548891 ER -