TY - THES A1 - Bölling, Christian T1 - Comprehensive metabolite analysis in Chlamydomonas reinhardtii : method development and application to the study of environmental and genetic perturbations T1 - Multiparallele Metabolitenanalyse in Chlamydomonas reinhardtii N2 - This study introduces a method for multiparallel analysis of small organic compounds in the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii, one of the premier model organisms in cell biology. The comprehensive study of the changes of metabolite composition, or metabolomics, in response to environmental, genetic or developmental signals is an important complement of other functional genomic techniques in the effort to develop an understanding of how genes, proteins and metabolites are all integrated into a seamless and dynamic network to sustain cellular functions. The sample preparation protocol was optimized to quickly inactivate enzymatic activity, achieve maximum extraction capacity and process large sample quantities. As a result of the rapid sampling, extraction and analysis by gas chromatography coupled to time-of-flight mass spectrometry (GC-TOF) more than 800 analytes from a single sample can be measured, of which over a 100 could be positively identified. As part of the analysis of GC-TOF raw data, aliquot ratio analysis to systematically remove artifact signals and tools for the use of principal component analysis (PCA) on metabolomic datasets are proposed. Cells subjected to nitrogen (N), phosphorus (P), sulfur (S) or iron (Fe) depleted growth conditions develop highly distinctive metabolite profiles with metabolites implicated in many different processes being affected in their concentration during adaptation to nutrient deprivation. Metabolite profiling allowed characterization of both specific and general responses to nutrient deprivation at the metabolite level. Modulation of the substrates for N-assimilation and the oxidative pentose phosphate pathway indicated a priority for maintaining the capability for immediate activation of N assimilation even under conditions of decreased metabolic activity and arrested growth, while the rise in 4-hydroxyproline in S deprived cells could be related to enhanced degradation of proteins of the cell wall. The adaptation to sulfur deficiency was analyzed with greater temporal resolution and responses of wild-type cells were compared with mutant cells deficient in SAC1, an important regulator of the sulfur deficiency response. Whereas concurrent metabolite depletion and accumulation occurs during adaptation to S deprivation in wild-type cells, the sac1 mutant strain is characterized by a massive incapability to sustain many processes that normally lead to transient or permanent accumulation of the levels of certain metabolites or recovery of metabolite levels after initial down-regulation. For most of the steps in arginine biosynthesis in Chlamydomonas mutants have been isolated that are deficient in the respective enzyme activities. Three strains deficient in the activities of N-acetylglutamate-5-phosphate reductase (arg1), N2 acetylornithine-aminotransferase (arg9), and argininosuccinate lyase (arg2), respectively, were analyzed with regard to activation of endogenous arginine biosynthesis after withdrawal of externally supplied arginine. Enzymatic blocks in the arginine biosynthetic pathway could be characterized by precursor accumulation, like the amassment of argininosuccinate in arg2 cells, and depletion of intermediates occurring downstream of the enzymatic block, e.g. N2-acetylornithine, ornithine, and argininosuccinate depletion in arg9 cells. The unexpected finding of substantial levels of the arginine pathway intermediates N-acetylornithine, citrulline, and argininosuccinate downstream the enzymatic block in arg1 cells provided an explanation for the residual growth capacity of these cells in the absence of external arginine sources. The presence of these compounds, together with the unusual accumulation of N-Acetylglutamate, the first intermediate that commits the glutamate backbone to ornithine and arginine biosynthesis, in arg1 cells suggests that alternative pathways, possibly involving the activity of ornithine aminotransferase, may be active when the default reaction sequence to produce ornithine via acetylation of glutamate is disabled. N2 - Entwicklung und Anwendung von Methoden zur multiparallelen Analyse von Metaboliten in der einzelligen Grünalge Chlamydomonas reinhardtii, einem der wichtigsten Modellorganismen der Zellbiologie, sind Gegenstand dieser Arbeit. Metabolomanalyse, die umfassende Analyse von Veränderungen der Konzentrationen von Stoffwechselprodukten durch Umweltreize oder genetische und entwicklungsbedingte Signale, ist ein wichtiges Komplement anderer Genomanalysemethoden, um die Integration von Genen, Proteinen und Metaboliten in ein nahtloses und dynamisches Netzwerk zur Aufrechterhaltung der Lebensfunktionen eines Organismus zu verstehen. Die Methode wurde im Hinblick auf schnelle Inaktivierung enzymatischer Aktivität, Maximierung der Extraktionskapazität und Behandlung großer Probenmengen optimiert. Im Ergebnis der Probenaufarbeitung, Extraktion und Analyse mittels Gaschromatographie und Time-Of-Flight-Massenspektrometrie konnten mehr als 800 analytische Signale in Einzelproben dargestellt werden, von denen über 100 identifiziert werden konnten. Die Arbeit stellt methodische Innovationen zur systematischen Erkennung von Artefakten in GC-MS Chromatogrammen und Werkzeuge zur Anwendung der Hauptkomponentenanalyse auf Metabolom-Daten vor. Zellen unter Stickstoff- (N), Phosphor- (P), Schwefel- (S), oder Eisen- (Fe) Mangel zeigen deutliche Unterschiede in ihrer Metabolitenausstattung. Die Anpassung an die einzelnen Nährstoffmangelsituationen ist durch spezifische Änderungen einer Reihe von Metaboliten zentraler Prozesse des Primärstoffwechsels gekennzeichnet. Die Konzentrationsänderungen von Substraten für die Stickstoffassimilation und den oxidativen Pentosephosphatweg deuten darauf hin, dass die Fähigkeit zur schnellen Aktivierung der N-Assimilation auch unter Bedingungen herabgesetzter Stoffwechsel- und Wachstumsaktivität aufrechterhalten wird. Die Akkumulation von 4-Hydroxyprolin unter Schwefelmangel könnte im Zusammenhang stehen mit der Degradation von Proteinen der Chlamydomonas-Zellwand, deren wesentlicher Bestandteil hydroxyprolinreiche Glykoproteine sind und die unter Schwefelmangel aktiv umgebaut wird. Die Anpassung an Schwefelmangel wurde mit größerer zeitlicher Auflösung in Wildtyp-Zellen und Zellen des sac1-Stammes untersucht. SAC1 ist ein zentraler Regulator der Schwefelmangelantwort in Chlamydomonas. Zeitgleiche Ab- und Zunahme von Metaboliten ist ein charakteristisches Element der Anpassung an Schwefelmangel in Wildtypzellen. Die Reaktion von SAC1-Mutanten auf Schwefelmangel ist durch weit reichenden Verlust zur Steuerung von Prozessen gekennzeichnet, die normalerweise zur vorübergehenden oder dauerhaften Anreicherung bestimmter Metabolite führen. Die Verfügbarkeit von Chlamydomonas-Stämmen mit fehlender Enzymaktivität für fast jeden der Schritte der Argininbiosynthese eröffnet die Möglichkeit, das Potential der Metabolitenanalyse zur Untersuchung der Regulation der Aminosäurebiosynthese in photosynthetischen Eukaryoten zur Anwendung zu bringen. Drei Stämme, mit fehlender Aktivität für N-Acetylglutamat-5-phosphat Reduktase (arg1), N2 Acetylornithin-Aminotransferase (arg9) beziehungsweise Argininosuccinat Lyase (arg2) wurden in Bezug auf die Aktivierung ihrer endogenen Argininbiosynthese nach Entzug externer Argininquellen analysiert. Die einzelnen enzymatischen Blocks konnten durch Precursor-Anreicherung, wie die Anhäufung von Argininosuccinat in arg2-Zellen, und Erschöpfung von Intermediaten nachgelagerter Reaktionen, beispielsweise die deutliche Abnahme von N2-Acetylornithin, Ornithin und Argininosuccinat in arg9-Zellen charakterisiert werden. Das unerwartete Vorhandensein von zum Teil das Wildtyp-Niveau überschreitender Mengen von N2-Acetylornithin, Citrullin und Argininosuccinat, die Produkte bzw. Substrate dem enzymatischen Block nachgelagerter Reaktionen in arg1-Zellen sind, bot eine Erklärung für eine noch vorhandene Restkapazität zum Wachstum des arg1-Stamms auch ohne äußere Arginingabe. Der Nachweis dieser Verbindungen sowie die ungewöhnliche Anreicherung von N-Acetylglutamat, der ersten Verbindung, die das Glutamat-Gerüst für die Ornithin- und Argininsynthese bindet, in arg1-Zellen könnte auf alternative Reaktionen, möglicherweise unter Beteiligung von Ornithin-Aminotransferase, zur Synthese von Ornithin hindeuten, die in Erscheinung treten, wenn die Synthesekette nach Acetylierung von Glutamat blockiert ist. KW - Chlamydomonas KW - Metabolite KW - Schwefel KW - Argininbiosynthese KW - Stoffwechsel KW - Chlamydomonas KW - metabolite profiling KW - metabolomics KW - sulfur KW - arginine biosynthesis Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-11329 ER - TY - THES A1 - Schwahn, Kevin T1 - Data driven approaches to infer the regulatory mechanism shaping and constraining levels of metabolites in metabolic networks T1 - Entwicklung von datengestützten Verfahren, um regulatorischen Mechanismen zu untersuchen, die die Metabolitmengen in Stoffwechselnetzwerken beeinflussen N2 - Systems biology aims at investigating biological systems in its entirety by gathering and analyzing large-scale data sets about the underlying components. Computational systems biology approaches use these large-scale data sets to create models at different scales and cellular levels. In addition, it is concerned with generating and testing hypotheses about biological processes. However, such approaches are inevitably leading to computational challenges due to the high dimensionality of the data and the differences in the dimension of data from different cellular layers. This thesis focuses on the investigation and development of computational approaches to analyze metabolite profiles in the context of cellular networks. This leads to determining what aspects of the network functionality are reflected in the metabolite levels. With these methods at hand, this thesis aims to answer three questions: (1) how observability of biological systems is manifested in metabolite profiles and if it can be used for phenotypical comparisons; (2) how to identify couplings of reaction rates from metabolic profiles alone; and (3) which regulatory mechanism that affect metabolite levels can be distinguished by integrating transcriptomics and metabolomics read-outs. I showed that sensor metabolites, identified by an approach from observability theory, are more correlated to each other than non-sensors. The greater correlations between sensor metabolites were detected both with publicly available metabolite profiles and synthetic data simulated from a medium-scale kinetic model. I demonstrated through robustness analysis that correlation was due to the position of the sensor metabolites in the network and persisted irrespectively of the experimental conditions. Sensor metabolites are therefore potential candidates for phenotypical comparisons between conditions through targeted metabolic analysis. Furthermore, I demonstrated that the coupling of metabolic reaction rates can be investigated from a purely data-driven perspective, assuming that metabolic reactions can be described by mass action kinetics. Employing metabolite profiles from domesticated and wild wheat and tomato species, I showed that the process of domestication is associated with a loss of regulatory control on the level of reaction rate coupling. I also found that the same metabolic pathways in Arabidopsis thaliana and Escherichia coli exhibit differences in the number of reaction rate couplings. I designed a novel method for the identification and categorization of transcriptional effects on metabolism by combining data on gene expression and metabolite levels. The approach determines the partial correlation of metabolites with control by the principal components of the transcript levels. The principle components contain the majority of the transcriptomic information allowing to partial out the effect of the transcriptional layer from the metabolite profiles. Depending whether the correlation between metabolites persists upon controlling for the effect of the transcriptional layer, the approach allows us to group metabolite pairs into being associated due to post-transcriptional or transcriptional regulation, respectively. I showed that the classification of metabolite pairs into those that are associated due to transcriptional or post-transcriptional regulation are in agreement with existing literature and findings from a Bayesian inference approach. The approaches developed, implemented, and investigated in this thesis open novel ways to jointly study metabolomics and transcriptomics data as well as to place metabolic profiles in the network context. The results from these approaches have the potential to provide further insights into the regulatory machinery in a biological system. N2 - Die System Biologie ist auf die Auswertung biologischer Systeme in ihrer Gesamtheit gerichtet. Dies geschieht durch das Sammeln und analysieren von großen Datensätzen der zugrundeliegenden Komponenten der Systeme. Computergestützte systembiologische Ansätze verwenden diese großen Datensätze, um Modelle zu erstellen und Hypothesen über biologische Prozesse auf verschiedenen zellularen Ebenen zu testen. Diese Ansätze führen jedoch unweigerlich zu rechnerischen Herausforderungen, da die Daten über eine hohe Dimensionalität verfügen. Des Weiteren weisen Daten, die von verschiedenen zellulären Ebenen gewonnen werden, unterschiedliche Dimensionen auf. Diese Doktorarbeit beschäftigt sich mit der Untersuchung und Entwicklung von rechnergestützten Ansätzen, um Metabolit-Profile im Zusammenhang von zellulären Netzwerken zu analysieren und um zu bestimmen, welche Aspekte der Netzwerkfunktionalität sich in den Metabolit-Messungen widerspiegeln. Die Zielsetzung dieser Arbeit ist es, die folgenden Fragen, unter Berücksichtigung der genannten Methoden, zu beantworten: (1) Wie ist die Beobachtbarkeit von biologischen Systemen in Metabolit-Profilen manifestiert und sind diese für phänotypische Vergleiche verwendbar? (2) Wie lässt sich die Kopplung von Reaktionsraten ausschließlich durch Metabolit-Profile identifizieren? (3) Welche regulatorischen Mechanismen, die Metabolit-Niveaus beeinflussen, sind unterscheidbar, wenn transkriptomische und metabolische Daten kombiniert werden? Ich konnte darlegen, dass Sensormetabolite, die durch eine Methode „observability theory“ identifiziert wurden, stärker korrelieren als Nicht-Sensoren. Die stärkere Korrelation zwischen Sensormetaboliten konnte mit öffentlich zugänglichen Daten, als auch mit synthetischen Daten aus einer Simulation mit einem mittelgroßen kinetischen Modell gezeigt werden. Durch eine Robustheitsanalyse war es mir möglich zu demonstrieren, dass die Korrelation auf die Position der Sensormetabolite im Netzwerk zurückzuführen und unabhängig von den experimentellen Bedingungen ist. Sensormetabolite sind daher geeignete Kandidaten für phänotypische Vergleiche zwischen verschiedenen Bedingungen durch gezielte metabolische Analysen. Des Weiteren ergaben meine Untersuchungen, dass die Auswertung der Kopplung von Stoffwechselreaktionsraten von einer ausschließlich datengestützten Perspektive möglich ist. Dabei muss die Annahme getroffen werden, dass Stoffwechselreaktionen mit dem Massenwirkungsgesetz beschreibbar sind. Ich konnte zeigen, dass der Züchtungsprozess mit einem Verlust der regulatorischen Kontrolle auf der Ebene der gekoppelten Reaktionsraten einhergeht. Dazu verwendete ich Metabolit-Profile von gezüchteten, als auch wilden Weizen- und Tomatenspezies. Meine Ergebnisse belegen, dass die selben Stoffwechselwege in Arabidopsis thaliana und Escherichia coli eine unterschiedliche Anzahl an gekoppelten Reaktionsraten aufweisen. Darüber hinaus habe ich eine neue Methode zur Identifizierung und Kategorisierung von transkriptionellen Effekten auf den Metabolismus entwickelt. Dies erfolgt durch die Kombination von Genexpressionsdaten und Messungen von Metaboliten. Die Methode ermittelt die partielle Korrelation zwischen Metaboliten, wobei die Hauptkomponenten der Transkriptdaten als Kontrollvariablen dienen. Dadurch kann der Einfluss der Transkription auf Metabolit-Profile herausgerechnet werden. Dieser Ansatz ermöglicht die Einteilung von Metabolitpaaren in assoziiert durch transkriptionelle oder assoziiert durch posttranskriptionelle Regulation. Die Einteilung ist abhängig davon, ob die Korrelation zwischen Metaboliten bestehen bleibt, wenn für den Einfluss der Transkription kontrolliert wird. Ich konnte nachweisen, dass die zuvor genannten Klassifizierungen von Metabolitpaaren mit existierender Literatur und den Ergebnissen einer auf bayessche Statistik basierenden Studie übereinstimmen. Die Methoden, die in dieser Doktorarbeit entwickelt, implementiert und untersucht wurden, öffnen neue Wege um metabolische und transkriptomische Daten gemeinsam auszuwerten. Sie erlauben Metabolit-Profile in den Kontext von metabolischen Netzwerken zu stellen. Die Ergebnisse haben das Potential uns weitere Einblicke in die regulatorische Maschinerie in biologischen Systemen zu gewähren. KW - systems biology KW - metabolomics KW - metabolites KW - Systembiologie KW - Metabolomik KW - Metabolite Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-423240 ER -