TY  - THES
A1  - Sarlet, Adrien
T1  - Tuning the viscoelasticity of Escherichia coli biofilms
T1  - Abstimmung der Viskoelastizität von Escherichia coli-Biofilmen
BT  - interplay between extrinsic and intrinsic factors
BT  - Wechselspiel zwischen extrinsischen und intrinsischen Faktoren
N2  - Biofilms are heterogeneous structures made of microorganisms embedded in a self-secreted extracellular matrix. Recently, biofilms have been studied as sustainable living materials with a focus on the tuning of their mechanical properties. One way of doing so is to use metal ions. In particular biofilms have been shown to stiffen in presence of some metal cations and to soften in presence of others. However, the specificity and the determinants of those interactions vary between species. While Escherichia coli is a widely studied model organism, little is known concerning the response of its biofilms to metal ions. In this work, we aimed at tuning the mechanics of E. coli biofilms by acting on the interplay between matrix composition and metal cations. To do so, we worked with E. coli strains producing a matrix composed of curli amyloid fibres or phosphoethanolamine-cellulose (pEtN-cellulose) fibres or both. The viscoelastic behaviour of the resulting biofilms was investigated with rheology after incubation with one of the following metal ion solutions: FeCl3, AlCl3, ZnCl2 and CaCl2 or ultrapure water. We observed that the strain producing both fibres stiffen by a factor of two when exposed to the trivalent metal cations Al(III) and Fe(III) while no such response is observed for the bivalent cations Zn(II) and Ca(II). Strains producing only one matrix component did not show any stiffening in response to either cation, but even a small softening. In order to investigate further the contribution of each matrix component to the mechanical properties, we introduced additional bacterial strains producing curli fibres in combination with non-modified cellulose, non-modified cellulose only or neither component. We measured biofilms produced by those different strains with rheology and without any solution. Since rheology does not preserve the architecture of the matrix, we compared those results to the mechanical properties of biofilms probed with the non-destructive microindentation. The microindentation results showed that biofilm stiffness is mainly determined by the presence of curli amyloid fibres in the matrix. However, this clear distinction between biofilm matrices containing or not containing curli is absent from the rheology results, i.e. following partial destruction of the matrix architecture. In addition, rheology also indicated a negative impact of curli on biofilm yield stress and flow stress. This suggests that curli fibres are more brittle and therefore more affected by the mechanical treatments. Finally, to examine the molecular interactions between the biofilms and the metal cations, we used Attenuated total reflectance - Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) to study the three E.coli strains producing a matrix composed of curli amyloid fibres, pEtN-cellulose fibres or both. We measured biofilms produced by those strains in presence of each of the aforementioned metal cation solutions or ultrapure water. We showed that the three strains cannot be distinguished based on their FTIR spectra and that metal cations seem to have a non-specific effect on bacterial membranes in absence of pEtN-cellulose. We subsequently conducted similar experiments on purified curli or pEtN-cellulose fibres. The spectra of the pEtN-cellulose fibres revealed a non-valence-specific interaction between metal cations and the phosphate of the pEtN-modification. Altogether, these results demonstrate that the mechanical properties of E. coli biofilms can be tuned via incubation with metal ions. While the mechanism involving curli fibres remains to be determined, metal cations seem to adsorb onto pEtN-cellulose and this is not valence-specific. This work also underlines the importance of matrix architecture to biofilm mechanics and emphasises the specificity of each matrix composition.
N2  - Biofilme sind heterogene Strukturen aus Mikroorganismen, die in eine selbst-abgesonderte extrazelluläre Matrix eingebettet sind. In letzter Zeit wurden Biofilme als nachhaltige lebende Materialien untersucht, mit dem Ziel ihre mechanischen Eigenschaften zu modifizieren. Eine Möglichkeit, dies zu tun, ist die Verwendung von Metallionen. Es hat sich gezeigt, dass Biofilme in Gegenwart einiger Metallkationen steifer und in Gegenwart anderer weicher werden. Die Spezifität und die Bestimmungsfaktoren dieser Wechselwirkungen sind jedoch je nach Spezies unterschiedlich. Obwohl Escherichia coli ein weithin untersuchter Modellorganismus ist, ist wenig über den Einfluss von Metallionen auf die Eigenschaften von E. coli-Biofilmen bekannt. Ziel dieser Arbeit war, die mechanischen Eigenschaften von E. coli-Biofilmen durch Beeinflussung des Zusammenspiels von Matrixzusammensetzung und Metallkationen zu untersuchen und zu verändern. Zu diesem Zweck wurden E. coli-Stämme verwendet, die eine Matrix aus Curli-Fasern oder Phosphoethanolamin-modifizierter Zellulose (pEtN-Zellulose) oder aus beiden produzieren. Das viskoelastische Verhalten der resultierenden Biofilme wurde nach Inkubation mit einer der folgenden Metallsalzlösungen (oder Reinstwasser) rheologisch untersucht: FeCl3, AlCl3, ZnCl2 und CaCl2. Es zeigte sich, dass die Steifigkeit von Biofilmen des Stammes, der beide Fasern produziert, um das Doppelte höher ist, wenn sie den dreiwertigen Metallkationen Al(III) und Fe(III) ausgesetzt werden. Im Gegensatz dazu konnte keine derartige Veränderung der Steifigkeit beobachtet werden, wenn stattdessen die zweiwertigen Kationen Zn(II) und Ca(II) zugesetzt wurden. Stämme, die nur eine Matrixkomponente produzieren, zeigten keine Versteifung in Gegenwart von Kationen, sondern sogar eine geringe Erweichung. Um den Beitrag der einzelnen Matrixkomponenten zu den mechanischen Eigenschaften weiter zu untersuchen, wurden weitere Bakterienstämme mit den bereits genannten verglichen. Diese Stämme produzieren entweder Curli-Fasern in Kombination mit nicht modifizierter Zellulose, ausschließlich nicht modifizierte Zellulose oder keine der beiden Komponenten. Die resultierenden Biofilme wurden ohne den Zusatz von Salzlösung rheologisch charakterisiert. Da die Matrixarchitektur bei Rheologiemessungen zerstört wird, wurden die Biofilme ebenfalls mit Mikroindentation untersucht, welche mit intakten Biofilmen durchgeführt werden kann. Die Ergebnisse der Mikroindentation zeigen, dass die Steifigkeit der Biofilme hauptsächlich durch das Vorhandensein von Curli-Fasern bestimmt wird. Diese klare Unterscheidung der mechanischen Eigenschaften zwischen Biofilmmatrices mit und ohne Curli ist jedoch in den rheologischen Ergebnissen nicht erkennbar, d. h. nach teilweiser Zerstörung der Matrixarchitektur. Darüber hinaus zeigte die Rheologie eine niedrigere Fließspannung für Biofilme, die Curli enthalten. In der Kombination deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass Curli-Fasern spröder und daher stärker von der mechanischen Behandlung betroffen sind. Um die molekularen Wechselwirkungen zwischen der Biofilm-Matrix und Metallkationen zu untersuchen, wurden die drei E. coli-Stämme, die eine Matrix aus Curli-Fasern, pEtN-Zellulose oder beidem bilden, mit abgeschwächter Totalreflexions-Fourier-Transformations-Infrarot-Spektroskopie (ATR-FTIR) charakterisiert. Die von diesen Stämmen produzierten Biofilme wurden in Gegenwart jeder der oben genannten Metallsalzlösungen und in Reinstwasser untersucht. Es wurde gezeigt, dass die drei Stämme anhand ihrer FTIR-Spektren nicht unterschieden werden können und dass in Abwesenheit von pEtN-Zellulose eine mögliche unspezifische Wirkung auf bakterielle Membranen besteht. Ähnliche Experimente mit gereinigten Curli-Fasern oder pEtN-Zellulose deuten darauf hin, dass Metallkationen in erster Linie eine nicht-valenzspezifische Wechselwirkung mit der Phosphatgruppe der pEtN-Modifikation eingehen. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass die mechanischen Eigenschaften von E. coli-Biofilmen durch Inkubation mit Metallkationen modifiziert werden können. Während die Mechanismen, an denen Curli-Fasern beteiligt sind, noch nicht aufgeklärt sind, scheinen Metallkationen an pEtN-Zellulose zu adsorbieren. Diese Arbeit unterstreicht auch die Bedeutung der Matrixarchitektur für die Mechanik von Biofilmen und verdeutlicht die Wichtigkeit der jeweiligen Matrixzusammensetzung für die Spezifität und das Ausmaß der beobachteten Effekte.
KW  - E. coli
KW  - biofilm
KW  - metal cation
KW  - matrix
KW  - viscoelasticity
KW  - E. coli
KW  - Biofilm
KW  - Metallkation
KW  - Matrix
KW  - Viskoelastizität
Y1  - 2023
ER  - 
TY  - THES
A1  - Ziege, Ricardo
T1  - Growth dynamics and mechanical properties of E. coli biofilms
T1  - Wachstumsdynamik und mechanische Eigenschaften von E. coli Biofilmen
N2  - Biofilms are complex living materials that form as bacteria get embedded in a matrix of self-produced protein and polysaccharide fibres. The formation of a network of extracellular biopolymer fibres contributes to the cohesion of the biofilm by promoting cell-cell attachment and by mediating biofilm-substrate interactions. This sessile mode of bacteria growth has been well studied by microbiologists to prevent the detrimental effects of biofilms in medical and industrial settings. Indeed, biofilms are associated with increased antibiotic resistance in bacterial infections, and they can also cause clogging of pipelines or promote bio-corrosion. However, biofilms also gained interest from biophysics due to their ability to form complex morphological patterns during growth. Recently, the emerging field of engineered living materials investigates biofilm mechanical properties at multiple length scales and leverages the tools of synthetic biology to tune the functions of their constitutive biopolymers.  
This doctoral thesis aims at clarifying how the morphogenesis of Escherichia coli (E. coli) biofilms is influenced by their growth dynamics and mechanical properties. To address this question, I used methods from cell mechanics and materials science. I first studied how biological activity in biofilms gives rise to non-uniform growth patterns. In a second study, I investigated how E. coli biofilm morphogenesis and its mechanical properties adapt to an environmental stimulus, namely the water content of their substrate. Finally, I estimated how the mechanical properties of E. coli biofilms are altered when the bacteria express different extracellular biopolymers.
On nutritive hydrogels, micron-sized E. coli cells can build centimetre-large biofilms. During this process, bacterial proliferation and matrix production introduce mechanical stresses in the biofilm, which release through the formation of macroscopic wrinkles and delaminated buckles. To relate these biological and mechanical phenomena, I used time-lapse fluorescence imaging to track cell and matrix surface densities through the early and late stages of E. coli biofilm growth. Colocalization of high cell and matrix densities at the periphery precede the onset of mechanical instabilities at this annular region. Early growth is detected at this outer annulus, which was analysed by adding fluorescent microspheres to the bacterial inoculum. But only when high rates of matrix production are present in the biofilm centre, does overall biofilm spreading initiate along the solid-air interface. By tracking larger fluorescent particles for a long time, I could distinguish several kinematic stages of E. coli biofilm expansion and observed a transition from non-linear to linear velocity profiles, which precedes the emergence of wrinkles at the biofilm periphery. Decomposing particle velocities to their radial and circumferential components revealed a last kinematic stage, where biofilm movement is mostly directed towards the radial delaminated buckles, which verticalize. The resulting compressive strains computed in these regions were observed to substantially deform the underlying agar substrates. The co-localization of higher cell and matrix densities towards an annular region and the succession of several kinematic stages are thus expected to promote the emergence of mechanical instabilities at the biofilm periphery. These experimental findings are predicted to advance future modelling approaches of biofilm morphogenesis. 
E. coli biofilm morphogenesis is further anticipated to depend on external stimuli from the environment. To clarify how the water could be used to tune biofilm material properties, we quantified E. coli biofilm growth, wrinkling dynamics and rigidity as a function of the water content of the nutritive substrates. Time-lapse microscopy and computational image analysis revealed that substrates with high water content promote biofilm spreading kinetics, while substrates with low water content promote biofilm wrinkling. The wrinkles observed on biofilm cross-sections appeared more bent on substrates with high water content, while they tended to be more vertical on substrates with low water content. Both wet and dry biomass, accumulated over 4 days of culture, were larger in biofilms cultured on substrates with high water content, despite extra porosity within the matrix layer. Finally, the micro-indentation analysis revealed that substrates with low water content supported the formation of stiffer biofilms. This study shows that E. coli biofilms respond to the water content of their substrate, which might be used for tuning their material properties in view of further applications.
Biofilm material properties further depend on the composition and structure of the matrix of extracellular proteins and polysaccharides. In particular, E. coli biofilms were suggested to present tissue-like elasticity due to a dense fibre network consisting of amyloid curli and phosphoethanolamine-modified cellulose. To understand the contribution of these components to the emergent mechanical properties of E. coli biofilms, we performed micro-indentation on biofilms grown from bacteria of several strains. Besides showing higher dry masses, larger spreading diameters and slightly reduced water contents, biofilms expressing both main matrix components also presented high rigidities in the range of several hundred kPa, similar to biofilms containing only curli fibres. In contrast, a lack of amyloid curli fibres provides much higher adhesive energies and more viscoelastic fluid-like material behaviour. Therefore, the combination of amyloid curli and phosphoethanolamine-modified cellulose fibres implies the formation of a composite material whereby the amyloid curli fibres provide rigidity to E. coli biofilms, whereas the phosphoethanolamine-modified cellulose rather acts as a glue. These findings motivate further studies involving purified versions of these protein and polysaccharide components to better understand how their interactions benefit biofilm functions. 
All three studies depict different aspects of biofilm morphogenesis, which are interrelated. The first work reveals the correlation between non-uniform biological activities and the emergence of mechanical instabilities in the biofilm. The second work acknowledges the adaptive nature of E. coli biofilm morphogenesis and its mechanical properties to an environmental stimulus, namely water. Finally, the last study reveals the complementary role of the individual matrix components in the formation of a stable biofilm material, which not only forms complex morphologies but also functions as a protective shield for the bacteria it contains. Our experimental findings on E. coli biofilm morphogenesis and their mechanical properties can have further implications for fundamental and applied biofilm research fields.
N2  - Biofilme sind komplexe lebende Materialien, die sich bilden, wenn Bakterien in eine Matrix aus selbstproduzierten Protein- und Polysaccharidfasern eingebettet werden. Die Bildung eines Netzwerks aus extrazellulären Biopolymerfasern trägt zum Zusammenhalt des Biofilms bei, indem sie die Zell-Zell-Anhaftung fördert und die Wechselwirkungen zwischen Biofilm und Substrat vermittelt. Diese sessile Form des Bakterienwachstums wurde von Mikrobiologen eingehend untersucht, um die schädlichen Auswirkungen von Biofilmen in der Medizin und Industrie zu verhindern. Biofilme werden nämlich mit einer erhöhten Antibiotikaresistenz bei bakteriellen Infektionen in Verbindung gebracht, und sie können auch zur Verstopfung von Rohrleitungen führen oder Biokorrosion fördern. Biofilme sind jedoch auch für die Biophysik von Interesse, da sie während ihres Wachstums komplexe morphologische Muster bilden können. In jüngster Zeit werden auf dem aufstrebenden Gebiet der künstlich hergestellten lebenden Materialien die mechanischen Eigenschaften von Biofilmen auf verschiedenen Längenskalen untersucht und die Werkzeuge der synthetischen Biologie genutzt, um die Funktionen ihrer konstitutiven Biopolymere zu beeinflussen.  
In dieser Doktorarbeit soll geklärt werden, wie die Morphogenese von Escherichia coli (E. coli)-Biofilmen durch deren Wachstumsdynamik und mechanische Eigenschaften beeinflusst wird. Um dieser Frage nachzugehen, habe ich Methoden aus der Zellmechanik und der Materialwissenschaft verwendet. Zunächst habe ich untersucht, wie die biologische Aktivität in Biofilmen zu ungleichmäßigen Wachstumsmustern führt. In einer zweiten Studie untersuchte ich, wie sich die Morphogenese von E. coli-Biofilmen und ihre mechanischen Eigenschaften an einen Umweltstimulus, nämlich den Wassergehalt des Substrats, anpassen. Schließlich habe ich abgeschätzt, wie sich die mechanischen Eigenschaften von E. coli-Biofilmen verändern, wenn die Bakterien verschiedene extrazelluläre Biopolymere exprimieren.
Auf nährstoffhaltigen Hydrogelen können mikrometergroße E. coli-Zellen zentimetergroße Biofilme bilden. Während dieses Prozesses führen die bakterielle Vermehrung und die Matrixproduktion zu mechanischen Spannungen im Biofilm, die sich durch die Bildung von makroskopischen Falten und delaminierten Knicken entladen. Um diese biologischen und mechanischen Phänomene miteinander in Beziehung zu setzen, habe ich mit Hilfe von Zeitraffer-Fluoreszenzaufnahmen die Zell- und Matrixoberflächendichte in den frühen und späten Phasen des E. coli-Biofilmwachstums verfolgt. Die Kolokalisierung hoher Zell- und Matrixdichten an der Peripherie geht dem Auftreten mechanischer Instabilitäten in diesem ringförmigen Bereich voraus. An diesem äußeren Ring wird ein frühes Wachstum festgestellt, das durch Zugabe von fluoreszierenden Mikrokugeln zum bakteriellen Inokulum analysiert wurde. Aber nur wenn im Zentrum des Biofilms hohe Raten der Matrixproduktion vorhanden sind, beginnt die Ausbreitung des gesamten Biofilms entlang der Feststoff-Luft-Grenzfläche. Indem ich größere fluoreszierende Partikel über einen längeren Zeitraum verfolgte, konnte ich mehrere kinematische Stadien der E. coli-Biofilmexpansion unterscheiden und einen Übergang von nichtlinearen zu linearen Geschwindigkeitsprofilen beobachten, der dem Auftreten von Falten an der Biofilmperipherie vorausgeht. Die Zerlegung der Partikelgeschwindigkeiten in ihre radialen und umlaufenden Komponenten ergab ein letztes kinematisches Stadium, in dem die Bewegung des Biofilms hauptsächlich auf die radialen delaminierten Knicke gerichtet ist, die sich vertikalisieren. Die in diesen Regionen berechneten Druckspannungen verformen die darunter liegenden Agarsubstrate erheblich. Die gleichzeitige Ansammlung höherer Zell- und Matrixdichten in einer ringförmigen Region und die Abfolge mehrerer kinematischer Stadien dürften somit das Entstehen mechanischer Instabilitäten an der Biofilm-Peripherie fördern. Diese experimentellen Ergebnisse werden voraussichtlich zukünftige Modellierungsansätze der Biofilmmorphogenese voranbringen. 
Die Morphogenese des E. coli-Biofilms wird voraussichtlich auch von externen Stimuli aus der Umwelt abhängen. Um zu klären, wie das Wasser zur Einstellung der Materialeigenschaften von Biofilmen genutzt werden könnte, haben wir das Wachstum, die Faltenbildung und die Steifigkeit von E. coli-Biofilmen in Abhängigkeit vom Wassergehalt der Nährsubstrate quantifiziert. Zeitraffermikroskopie und computergestützte Bildanalyse zeigten, dass Substrate mit hohem Wassergehalt die Ausbreitungskinetik des Biofilms fördern, während Substrate mit niedrigem Wassergehalt die Faltenbildung des Biofilms begünstigen. Die auf Biofilm-Querschnitten beobachteten Falten erschienen auf Substraten mit hohem Wassergehalt stärker gebogen, während sie auf Substraten mit niedrigem Wassergehalt eher vertikal verliefen. Sowohl die feuchte als auch die trockene Biomasse, die während der 4-tägigen Kultur akkumuliert wurde, war in Biofilmen, die auf Substraten mit hohem Wassergehalt gezüchtet wurden, größer, trotz der zusätzlichen Porosität innerhalb der Matrixschicht. Schließlich ergab die Mikroindentationsanalyse, dass Substrate mit niedrigem Wassergehalt die Bildung von steiferen Biofilmen begünstigten. Diese Studie zeigt, dass E. coli-Biofilme auf den Wassergehalt ihres Substrats reagieren, was für die Abstimmung ihrer Materialeigenschaften im Hinblick auf weitere Anwendungen genutzt werden könnte.
Die Materialeigenschaften von Biofilmen hängen außerdem von der Zusammensetzung und Struktur der Matrix aus extrazellulären Proteinen und Polysacchariden ab. Insbesondere wurde vermutet, dass E. coli-Biofilme aufgrund eines dichten Fasernetzwerks aus Amyloid-Curli und Phosphoethanolamin-modifizierter Cellulose eine gewebeähnliche Elastizität aufweisen. Um den Beitrag dieser Komponenten zu den entstehenden mechanischen Eigenschaften von E. coli-Biofilmen zu verstehen, führten wir an Biofilmen, die aus Bakterien verschiedener Stämme gewachsen waren, Mikroeindrücke durch. Biofilme, die beide Hauptmatrixkomponenten enthalten, wiesen nicht nur eine höhere Trockenmasse, einen größeren Ausbreitungsdurchmesser und einen leicht verringerten Wassergehalt auf, sondern auch eine hohe Steifigkeit im Bereich von mehreren hundert kPa, ähnlich wie Biofilme, die nur Curli-Fasern enthalten. Das Fehlen von Amyloid-Curli-Fasern führt dagegen zu deutlich höheren Adhäsionsenergien und einem viskoelastischeren, flüssigkeitsähnlichen Materialverhalten. Die Kombination von Amyloid-Curli-Fasern und Phosphoethanolamin-modifizierten Cellulosefasern impliziert daher die Bildung eines Verbundmaterials, bei dem die Amyloid-Curli-Fasern den E. coli-Biofilmen Steifigkeit verleihen, während die Phosphoethanolamin-modifizierte Cellulose eher als Klebstoff wirkt. Diese Ergebnisse motivieren zu weiteren Studien mit gereinigten Versionen dieser Protein- und Polysaccharidkomponenten, um besser zu verstehen, wie ihre Interaktionen die Funktionen des Biofilms unterstützen. 
Alle drei Studien zeigen verschiedene Aspekte der Biofilm-Morphogenese, die miteinander verbunden sind. Die erste Arbeit zeigt den Zusammenhang zwischen ungleichmäßigen biologischen Aktivitäten und dem Auftreten mechanischer Instabilitäten im Biofilm auf. Die zweite Arbeit bestätigt die Anpassungsfähigkeit der Morphogenese des E. coli-Biofilms und seiner mechanischen Eigenschaften an einen Umweltreiz, nämlich Wasser. Die letzte Studie schließlich zeigt die komplementäre Rolle der einzelnen Matrixkomponenten bei der Bildung eines stabilen Biofilmmaterials, das nicht nur komplexe Morphologien bildet, sondern auch als Schutzschild für die darin enthaltenen Bakterien fungiert. Unsere experimentellen Erkenntnisse über die Morphogenese von E. coli-Biofilmen und ihre mechanischen Eigenschaften können weitere Auswirkungen auf grundlegende und angewandte Biofilm-Forschungsbereiche haben.
KW  - biofilm
KW  - E. coli
KW  - living materials
KW  - mechanobiology
KW  - E. coli
KW  - Biofilm
KW  - lebende Materialien
KW  - Mechanobiologie
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-559869
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Unuabonah, Emmanuel
A1  - Nöske, Robert
A1  - Weber, Jens
A1  - Günter, Christina
A1  - Taubert, Andreas
T1  - New micro/mesoporous nanocomposite material from low-cost sources for the efficient removal of aromatic and pathogenic pollutants from water
JF  - Beilstein journal of nanotechnology
N2  - A new micro/mesoporous hybrid clay nanocomposite prepared from kaolinite clay, Carica papaya seeds, and ZnCl2 via calcination in an inert atmosphere is presented. Regardless of the synthesis temperature, the specific surface area of the nanocomposite material is between approximate to 150 and 300 m(2)/g. The material contains both micro- and mesopores in roughly equal amounts. X-ray diffraction, infrared spectroscopy, and solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy suggest the formation of several new bonds in the materials upon reaction of the precursors, thus confirming the formation of a new hybrid material. Thermogravimetric analysis/differential thermal analysis and elemental analysis confirm the presence of carbonaceous matter. The new composite is stable up to 900 degrees C and is an efficient adsorbent for the removal of a water micropollutant, 4-nitrophenol, and a pathogen, E. coli, from an aqueous medium, suggesting applications in water remediation are feasible.
KW  - 4-nitrophenol
KW  - Carica papaya seeds
KW  - clay
KW  - E. coli
KW  - micro/mesoporous
KW  - nanocomposite
KW  - water remediation
Y1  - 2019
U6  - https://doi.org/10.3762/bjnano.10.11
SN  - 2190-4286
VL  - 10
SP  - 119
EP  - 131
PB  - Beilstein-Institut zur Förderung der Chemischen Wissenschaften
CY  - Frankfurt, Main
ER  - 
TY  - THES
A1  - Wenk, Sebastian
T1  - Engineering formatotrophic growth in Escherichia coli
N2  - To meet the demands of a growing world population while reducing carbon dioxide (CO2) emissions, it is necessary to capture CO2 and convert it into value-added compounds. In recent years, metabolic engineering of microbes has gained strong momentum as a strategy for the production of valuable chemicals. As common microbial feedstocks like glucose directly compete with human consumption, the one carbon (C1) compound formate was suggested as an alternative feedstock. Formate can be easily produced by various means including electrochemical reduction of CO2 and could serve as a feedstock for microbial production, hence presenting a novel entry point for CO2 to the biosphere and a storage option for excess electricity. Compared to the gaseous molecule CO2, formate is a highly soluble compound that can be easily handled and stored. It can serve as a carbon and energy source for natural formatotrophs, but these microbes are difficult to cultivate and engineer. In this work, I present the results of several projects that aim to establish efficient formatotrophic growth of E. coli – which cannot naturally grow on formate – via synthetic formate assimilation pathways. In the first study, I establish a workflow for growth-coupled metabolic engineering of E. coli. I demonstrate this approach by presenting an engineering scheme for the PFL-threonine cycle, a synthetic pathway for anaerobic formate assimilation in E. coli. The described methods are intended to create a standardized toolbox for engineers that aim to establish novel metabolic routes in E. coli and related organisms. The second chapter presents a study on the catalytic efficiency of C1-oxidizing enzymes in vivo. As formatotrophic growth requires generation of both energy and biomass from formate, the engineered E. coli strains need to be equipped with a highly efficient formate dehydrogenase, which provides reduction equivalents and ATP for formate assimilation. I engineered a strain that cannot generate reducing power and energy for cellular growth, when fed on acetate. Under this condition, the strain depends on the introduction of an enzymatic system for NADH regeneration, which could further produce ATP via oxidative phosphorylation. I show that the strain presents a valuable testing platform for C1-oxidizing enzymes by testing different NAD-dependent formate and methanol dehydrogenases in the energy auxotroph strain. Using this platform, several candidate enzymes with high in vivo activity, were identified and characterized as potential energy-generating systems for synthetic formatotrophic or methylotrophic growth in E. coli.   In the third chapter, I present the establishment of the serine threonine cycle (STC) – a synthetic formate assimilation pathway – in E. coli. In this pathway, formate is assimilated via formate tetrahydrofolate ligase (FtfL) from Methylobacterium extorquens (M. extorquens). The carbon from formate is attached to glycine to produce serine, which is converted into pyruvate entering central metabolism. Via the natural threonine synthesis and cleavage route, glycine is regenerated and acetyl-CoA is produced as the pathway product. I engineered several selection strains that depend on different STC modules for growth and determined key enzymes that enable high flux through threonine synthesis and cleavage. I could show that expression of an auxiliary formate dehydrogenase was required to achieve growth via threonine synthesis and cleavage on pyruvate. By overexpressing most of the pathway enzymes from the genome, and applying adaptive laboratory evolution, growth on glycine and formate was achieved, indicating the activity of the complete cycle. The fourth chapter shows the establishment of the reductive glycine pathway (rGP) – a short, linear formate assimilation route – in E. coli. As in the STC, formate is assimilated via M. extorquens FtfL. The C1 from formate is condensed with CO2 via the reverse reaction of the glycine cleavage system to produce glycine. Another carbon from formate is attached to glycine to form serine, which is assimilated into central metabolism via pyruvate. The engineered E. coli strain, expressing most of the pathway genes from the genome, can grow via the rGP with formate or methanol as a sole carbon and energy source.
N2  - Um den steigenden Bedarf einer wachsenden Weltbevölkerung zu decken und gleichzeitig die CO2-Emissionen zu reduzieren, ist es notwendig, CO2 aufzufangen und zu recyceln. Durch gentechnische Veränderungen von Mikroorganismen ist es möglich diese zur Produktion wertvoller organischer Verbindungen zu nutzen. Da mikrobielle Kulturen primär mit Glucose gefüttert werden und somit mit menschlicher Nahrungsversorgung konkurrieren, wurde die C1-Verbindung Formiat als alternativer bakterieller Nährstoff vorgeschlagen.. Formiat kann durch unterschiedliche Verfahren hergestellt werden, unter anderem durch elektrochemische Reduktion von CO2. Dieses Verfahren ermöglicht das Recycling von CO2 und weiterhin eine Speichermöglichkeit für überschüssige Elektrizität. Formiat ist im Vergleich zum gasförmigen CO2 gut wasserlöslich, was den Transport und die Verwendung als mikrobiellen Nährstoff erleichtert. Natürlich vorkommende formatotrophe Mikroorganismen nutzen Formiat als Kohlenstoff- und Energiequelle. Diese lassen sich allerdings meist schwierig kultivieren und genetisch verändern. In dieser Arbeit stelle ich die Ergebnisse verschiedener Projekte vor, die gemeinsam darauf abzielen, effizientes formatotrophes Wachstum von E. coli – welches natürlicherweise nicht auf Formiat wachsen kann – mittels synthetischer Formiat-Assimilierungswege zu ermöglichen. In der ersten Studie stelle ich eine Strategie für wachstumsgekoppeltes Stoffwechsel-Engineering in E. coli vor. Ich erläutere diese Strategie anhand eines Beispiels, der schrittweisen Etablierung eines synthetischen Formiat- Assimilierungswegs, des PFL-Threonin-Zyklus. Die in diesem Kapitel beschriebenen Methoden sollen einen Leitfaden für Ingenieure bereitstellen, die neue Stoffwechselwege in E. coli und verwandten Organismen etablieren wollen. Im zweiten Kapitel stelle ich eine Studie über die katalytische Effizienz von C1-oxidierenden Enzymen vor. Da formatotrophes Wachstum sowohl die Erzeugung von Energie als auch von Biomasse aus Formiat erfordert, müssen synthetisch formatotrophe E. coli Stämme mit einer hocheffizienten Formiat-Dehydrogenase ausgestattet werden, welche Reduktionsäquivalente und ATP für die Assimilierung von Formiat liefert. Um die Effizienz verschiedener Enzyme testen und vergleichen zu können, entwickelte ich einen E. coli Stamm, der aus Acetat weder Reduktionsäquivalente noch Energie für das Zellwachstum erzeugen kann. Dieser „energie-auxotrophe“ Stamm benötigt eines zusätzlichen enzymatischen Systems zur NADH-Regenerierung, um auf Acetat wachsen zu können. Ich testete verschiedene NAD-abhängige Formiat- und Methanol-Dehydrogenasen in diesem Stamm und konnte zeigen, dass Wachstum auf Acetat durch Zugabe von Formiat oder Methanol ermöglicht wurde. Dies zeigt, dass der Stamm eine zuverlässige Testplattform für C1-oxidierende Enzyme darstellt. Unter Verwendung dieser Plattform wurden mehrere Kandidatenenzyme mit hoher in vivo-Aktivität identifiziert und als Kandidatenenzyme für synthetisches formatotrophes oder methylotrophes Wachstum in E. coli charakterisiert.   Im dritten Kapitel stelle ich die Etablierung des Serin-Threonin-Zyklus (STZ) – eines synthetischen Formiat-Assimilationswegs – in E. coli vor. In diesem Stoffwechselweg wird Formiat über die Formiat-Tetrahydrofolat-Ligase (FtfL) aus Methylobacterium extorquens (M. extorquens) assimiliert. Der Kohlenstoff aus Formiat wird an Glycin gebunden, um Serin zu produzieren, welches im nächsten Schritt in Pyruvat umgewandelt wird und so in den zentralen Kohlenstoffmetabolismus gelangt. Über den natürlichen Threonin-Synthese- und Spaltweg wird Glycin regeneriert und Acetyl-CoA als Produkt des Stoffwechselwegs generiert. Ich entwickelte mehrere E. coli Selektionsstämme, deren Wachstum von verschiedenen STZ-Modulen abhängt, und konnte Schlüsselenzyme bestimmen, die einen hohen Reaktionsfluss durch die Threonin-Synthese und -Spaltung ermöglichen. Ich konnte zeigen, dass die Expression einer Formiat-Dehydrogenase erforderlich ist, um Wachstum auf Pyruvat über Threonin zu erreichen. Durch Integration und Überexpression der meisten Enzyme des STZ auf Genomebene und Anwendung adaptiver Laborevolution wurde Wachstum auf Glycin und Formiat erreicht, was bedeutet, dass der gesamte Serin-Threonin-Zyklus in E. coli aktiv ist. Das vierte Kapitel zeigt die Etablierung des reduktiven Glycinwegs (rGW) – eines kurzen, linearen Formiat-Assimilierungswegs – in E. coli. Wie im STZ wird Formiat über M. extorquens FtfL assimiliert. Dabei wird das Kohlenstoffatom aus Formiat mit CO2 über die umgekehrte Reaktion des Glycin-Spaltungssystems zu Glycin kondensiert. Ein weiteres Kohlenstoffatom aus Formiat wird an Glycin gebunden, um Serin zu bilden, welches über Pyruvat in den Zentralstoffwechsel gelangt. Durch Expression der rGW Enzyme auf Genomebene und adaptive Laborevolution wurde ein E. coli Stamm erzeugt welcher über den rGW auf Formiat oder Methanol als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle wachsen kann.
KW  - metabolic engineering
KW  - E. coli
KW  - formate assimilation
KW  - methanol assimilation
KW  - energy metabolism
Y1  - 2020
ER  - 
TY  - GEN
A1  - Seyrich, Maximilian
A1  - Alirezaeizanjani, Zahra
A1  - Beta, Carsten
A1  - Stark, Holger
T1  - Statistical parameter inference of bacterial swimming strategies
T2  - Postprints der Universität Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe
N2  - We provide a detailed stochastic description of the swimming motion of an E. coli bacterium in two dimension, where we resolve tumble events in time. For this purpose, we set up two Langevin equations for the orientation angle and speed dynamics. Calculating moments, distribution and autocorrelation functions from both Langevin equations and matching them to the same quantities determined from data recorded in experiments, we infer the swimming parameters of E. coli. They are the tumble rate lambda, the tumble time r(-1), the swimming speed v(0), the strength of speed fluctuations sigma, the relative height of speed jumps eta, the thermal value for the rotational diffusion coefficient D-0, and the enhanced rotational diffusivity during tumbling D-T. Conditioning the observables on the swimming direction relative to the gradient of a chemoattractant, we infer the chemotaxis strategies of E. coli. We confirm the classical strategy of a lower tumble rate for swimming up the gradient but also a smaller mean tumble angle (angle bias). The latter is realized by shorter tumbles as well as a slower diffusive reorientation. We also find that speed fluctuations are increased by about 30% when swimming up the gradient compared to the reversed direction.
T3  - Zweitveröffentlichungen der Universität Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe - 914 
KW  - E. coli
KW  - run and tumble
KW  - chemotaxis
KW  - stochastic processes
KW  - bacterial swimming strategies
KW  - parameter inference
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-446214
SN  - 1866-8372
IS  - 914
ER  - 
TY  - GEN
A1  - Unuabonah, Emmanuel I.
A1  - Nöske, Robert
A1  - Weber, Jens
A1  - Günter, Christina
A1  - Taubert, Andreas
T1  - New micro/mesoporous nanocomposite material from low-cost sources for the efficient removal of aromatic and pathogenic pollutants from water
T2  - Postprints der Universität Potsdam Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe
N2  - A new micro/mesoporous hybrid clay nanocomposite prepared from kaolinite clay, Carica papaya seeds, and ZnCl2 via calcination in an inert atmosphere is presented. Regardless of the synthesis temperature, the specific surface area of the nanocomposite material is between ≈150 and 300 m2/g. The material contains both micro- and mesopores in roughly equal amounts. X-ray diffraction, infrared spectroscopy, and solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy suggest the formation of several new bonds in the materials upon reaction of the precursors, thus confirming the formation of a new hybrid material. Thermogravimetric analysis/differential thermal analysis and elemental analysis confirm the presence of carbonaceous matter. The new composite is stable up to 900 °C and is an efficient adsorbent for the removal of a water micropollutant, 4-nitrophenol, and a pathogen, E. coli, from an aqueous medium, suggesting applications in water remediation are feasible.
T3  - Zweitveröffentlichungen der Universität Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe - 720 
KW  - 4-nitrophenol
KW  - Carica papaya seeds
KW  - clay
KW  - E. coli
KW  - micro/mesoporous
KW  - nanocomposite
KW  - water remediation
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-426214
IS  - 720
SP  - 119
EP  - 131
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Fedyunin, Ivan
A1  - Lehnhardt, Lothar
A1  - Böhmer, Nadine
A1  - Kaufmann, Paul
A1  - Zhang, Gong
A1  - Ignatova, Zoya
T1  - tRNA concentration fine tunes protein solubility
JF  - FEBS letters : the journal for rapid publication of short reports in molecular biosciences
N2  - Clusters of codons pairing to low-abundance tRNAs synchronize the translation with co-translational folding of single domains in multidomain proteins. Although proven with some examples, the impact of the ribosomal speed on the folding and solubility on a global, cell-wide level remains elusive. Here we show that upregulation of three low-abundance tRNAs in Escherichia coil increased the aggregation propensity of several cellular proteins as a result of an accelerated elongation rate. Intriguingly, alterations in the concentration of the natural tRNA pool compromised the solubility of various chaperones consequently rendering the solubility of some chaperone-dependent proteins.
KW  - Protein translation
KW  - Protein misfolding
KW  - tRNA
KW  - E. coli
Y1  - 2012
U6  - https://doi.org/10.1016/j.febslet.2012.07.012
SN  - 0014-5793
VL  - 586
IS  - 19
SP  - 3336
EP  - 3340
PB  - Elsevier
CY  - Amsterdam
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schumann, Sara
T1  - Influence of intestinal inflammation on bacterial protein expression in monoassociated mice
T1  - Der Einfluss chronisch-entzündlicher Darmerkrankungen auf die Proteinexpression intestinaler E. coli
N2  - Background: Increased numbers of intestinal E. coli are observed in inflammatory bowel disease, but the reasons for this proliferation and it exact role in intestinal inflammation are unknown. Aim of this PhD-project was to identify E. coli proteins involved in E. coli’s adaptation to the inflammatory conditions in the gut and to investigate whether these factors affect the host. Furthermore, the molecular basis for strain-specific differences between probiotic and harmful E. coli in their response to intestinal inflammation was investigated. Methods: Using mice monoassociated either with the adherent-invasive E. coli (AIEC) strain UNC or the probiotic E. coli Nissle, two different mouse models of intestinal inflammation were analysed: On the one hand, severe inflammation was induced by treating mice with 3.5% dextran sodium sulphate (DSS). On the other hand, a very mild intestinal inflammation was generated by associating interleukin 10-deficient (IL-10-/-) mice with E. coli. Differentially expressed proteins in the E. coli strains collected from caecal contents of these mice were identified by two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis. Results DSS-experiment: All DSS-treated mice revealed signs of a moderate caecal and a severe colonic inflammation. However, mice monoassociated with E. coli Nissle were less affected. In both E. coli strains, acute inflammation led to a downregulation of pathways involved in carbohydrate breakdown and energy generation. Accordingly, DSS-treated mice had lower caecal concentrations of bacterial fermentation products than the control mice. Differentially expressed proteins also included the Fe-S cluster repair protein NfuA, the tryptophanase TnaA, and the uncharacterised protein YggE. NfuA was upregulated nearly 3-fold in both E. coli strains after DSS administration. Reactive oxygen species produced during intestinal inflammation damage Fe-S clusters and thereby lead to an inactivation of Fe-S proteins. In vitro data indicated that the repair of Fe-S proteins by NfuA is a central mechanism in E. coli to survive oxidative stress. Expression of YggE, which has been reported to reduce the intracellular level of reactive oxygen species, was 4- to 8-fold higher in E. coli Nissle than in E. coli UNC under control and inflammatory conditions. In vitro growth experiments confirmed these results, indicating that E. coli Nissle is better equipped to cope with oxidative stress than E. coli UNC. Additionally, E. coli Nissle isolated from DSS-treated and control mice had TnaA levels 4- to 7-fold higher than E. coli UNC. In turn, caecal indole concentrations resulting from cleavage of tryptophan by TnaA were higher in E. coli Nissle- associated control mice than in the respective mice associated with E. coli UNC. Because of its anti-inflammatory effect, indole is hypothesised to be involved in the extension of the remission phase in ulcerative colitis described for E. coli Nissle. Results IL-10-/--experiment: Only IL-10-/- mice monoassociated with E. coli UNC for 8 weeks exhibited signs of a very mild caecal inflammation. In agreement with this weak inflammation, the variations in the bacterial proteome were small. Similar to the DSS-experiment, proteins downregulated by inflammation belong mainly to the central energy metabolism. In contrast to the DSS-experiment, no upregulation of chaperone proteins and NfuA were observed, indicating that these are strategies to overcome adverse effects of strong intestinal inflammation. The inhibitor of vertebrate C-type lysozyme, Ivy, was 2- to 3-fold upregulated on mRNA and protein level in E. coli Nissle in comparison to E. coli UNC isolated from IL-10-/- mice. By overexpressing ivy, it was demonstrated in vitro that Ivy contributes to a higher lysozyme resistance observed for E. coli Nissle, supporting the role of Ivy as a potential fitness factor in this E. coli strain. Conclusions: The results of this PhD-study demonstrate that intestinal bacteria sense even minimal changes in the health status of the host. While some bacterial adaptations to the inflammatory conditions are equal in response to strong and mild intestinal inflammation, other reactions are unique to a specific disease state. In addition, probiotic and colitogenic E. coli differ in their response to the intestinal inflammation and thereby may influence the host in different ways.
N2  - Hintergrund: Chronisch entzündliche Darmerkrankungen zeichnen sich unter anderem durch eine starke Proliferation intestinaler E. coli aus. Unbekannt ist jedoch, ob diese Vermehrung eine Ursache oder eine Folge der Erkrankung darstellt. Ziel der vorliegenden Doktorarbeit war es daher, E. coli-Proteine zu identifizieren, welche der Anpassung an die entzündlichen Bedingungen im Darmtrakt dienen und unter Umständen einen Effekt auf den Gesundheitszustand des Wirtes haben. Weiterhin sollten die molekularen Ursachen für stammesspezifische Unterschiede zwischen probiotischen und gesundheitsschädlichen E. coli näher untersucht werden. Methoden: In den tierexperimentellen Analysen wurden keimfreie Mäuse entweder mit dem probiotischen E. coli Nissle oder dem adhärent-invasiven E. coli UNC monoassoziiert und in zwei verschiedenen Entzündungsmodellen näher untersucht. Einerseits wurde eine starke Darmentzündung durch die Gabe von 3,5% Natrium-Dextransulfat (DSS) ausgelöst. Andererseits wurde in Interleukin 10-defizienten (IL-10-/-) Mäusen eine sehr milde Form der Entzündung durch Besiedlung mit E. coli induziert. Die E. coli Bakterien wurden am Ende der Versuche aus den Caecuminhalten der Mäuse isoliert und die bakterielle Proteinexpression wurde mittels zwei-dimensionaler Gelelektrophorese analysiert. Ergebnisse des DSS-Versuchs: Alle Tiere des DSS-Versuchs entwickelten unabhängig vom E. coli Stamm, mit dem sie besiedelt waren, eine moderate Entzündung im Caecum und eine starke im Colon, wobei die Entzündungsreaktion durch die Monoassoziation mit E. coli Nissle leicht abgeschwächt wurde. In beiden E. coli Stämmen führte die Darmentzündung zu einer verringerten Expression von Enzymen des Kohlenhydratabbaus und der Energiegewinnung. In Folge dessen waren die intestinalen Konzentrationen bakterieller Fermentationsprodukte in den entzündeten Tieren geringer als in den gesunden Kontrolltieren. Weitere differentiell exprimierte Proteine umfassen das Fe-S- Cluster Reparaturprotein NfuA, die Tryptophanase TnaA und das uncharakterisierte Protein YggE. In beiden E. coli Stämmen, welche aus den DSS-Tieren isoliert wurden, war das NfuA Protein dreifach höher exprimiert. Eine Darmentzündung führt zu einer vermehrten Bildung reaktiver Sauerstoffspezies, welche die Fe-S-Cluster in Eisen-Schwefel-Proteinen zerstören und damit zu einer Inaktivierung dieser Proteine führen. In vitro Untersuchungen bestätigten, dass die Reparatur der Eisen-Schwefel-Proteine durch NfuA ein wichtiger Mechanismus ist um oxidativem Stress entgegenzuwirken. Das YggE Protein, welches laut Literaturangaben einen hemmenden Einfluss auf die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies hat, war in E. coli Nissle 4- bis 8-fach erhöht (verglichen mit E. coli UNC unter Kontroll- und Entzündungsbedingungen). In vitro Versuche bestätigten diese Daten und zeigten, dass E. coli Nissle im Vergleich zu E. coli UNC eine erhöhte Resistenz gegenüber oxidativem Stress aufweist. Außerdem wurde im Vergleich E. coli Nissle vs. E. coli UNC (unter Entzündungs- und Kontrollbedingungen) ein 4- bis 7-fach erhöhter TnaA-Gehalt nachgewiesen. Indol, das Produkt der TnaA-katalysierten Tryptophanspaltung wurde in erhöhten Mengen im Intestinaltrakt E. coli Nissle-assoziierter Kontrolltiere detektiert. Seit längerem werden entzündungshemmende Eigenschaften für Indol postuliert, die aufgrund der Ergebnisse dieser Doktorarbeit nun auch mit den gesundheitsfördenden Eigenschaften von E. coli Nissle in Zusammenhang gebracht werden können. Ergebnisse des IL-10-/-- Versuchs: Nach einer 8-wöchigen Assoziationsdauer wurde nur in den mit E. coli UNC besiedelten IL-10-/- Tieren eine schwache Entzündungsreaktion nachgewiesen. Bedingt durch diese sehr schwach ausgeprägte Entzündungsantwort waren auch die Veränderungen im bakteriellen Proteom von E. coli UNC nur gering. Wie im DSS-Versuch waren Proteine des bakteriellen Energiestoffwechsels reprimiert, allerdings wurde keine Induktion von NfuA beobachtet. Daher scheint die Induktion von NfuA nur der Anpassung an eine starke Entzündung zu dienen. Weiterhin wurde nachgewiesen, dass E. coli Nissle aus IL-10-/- Tieren den Hemmer für das vertebrate C-Typ Lysozym (Ivy) sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene stärker exprimiert als E. coli UNC. Überexpression von Ivy unter in vitro Bedingungen zeigte, dass es an der erhöhten Lysozymresistenz von E. coli Nissle beteiligt ist und somit eine Rolle als möglicher Fitnessfaktor von E. coli Nissle spielt. Schlussfolgerungen: In dieser Doktorarbeit wurde gezeigt, dass Darmentzündungen die Proteinexpression eines im Darm lebenden Bakteriums beeinflussen. Einige der aufgedeckten bakteriellen Anpassungsreaktionen werden sowohl bei einer starken als auch bei einer schwachen Entzündung ausgelöst; andere wiederum sind spezifisch für nur einen dieser Entzündungszustände. Weiterhin wurde deutlich, dass sich E. coli-Stämme hinsichtlich ihrer Reaktion auf eine Darmentzündung unterscheiden und damit möglicherweise den Wirt beeinflussen. 
KW  - E. coli
KW  - chronisch-entzündliche Darmerkrankungen
KW  - Proteom
KW  - Ivy
KW  - Probiotika
KW  - E. coli
KW  - inflammatory bowel disease
KW  - proteomics
KW  - Ivy
KW  - probiotics
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-67757
ER  -