TY - THES A1 - Martin, Johannes T1 - Synthesis of protein-polymer conjugates and block copolymers via sortase-mediated ligation N2 - In den vergangenen Jahrzehnten haben therapeutische Proteine in der pharmazeutischen Industrie mehr und mehr an Bedeutung gewonnen. Werden Proteine nichtmenschlichen Ursprungs verwendet, kann es jedoch zu einer Immunreaktion kommen, sodass das Protein sehr schnell aus dem Körper ausgeschieden oder abgebaut wird. Um die Zirkulationszeit im Blut signifikant zu verlängern, werden die Proteine mit synthetischen Polymeren modifiziert (Protein-Polymer-Konjugate). Die Proteine aller heute auf dem Markt erhältlichen Medikamente dieser Art tragen eine oder mehrere Polymerketten aus Poly(ethylenglycol) (PEG). Ein Nachteil der PEGylierung ist, dass viele Patienten bei regelmäßiger Einnahme dieser Medikamente Antikörper gegen PEG entwickeln, die den effizienzsteigernden Effekt der PEGylierung wieder aufheben. Ein weiterer Nachteil der PEGylierung ist die oftmals deutlich verringerte Aktivität der Konjugate im Vergleich zum nativen Protein. Der Grund dafür ist die Herstellungsmethode der Konjugate, bei der meist die primären Amine der Lysin-Seitenketten und der N-Terminus des Proteins genutzt werden. Da die meisten Proteine mehrere gut zugängliche Lysine aufweisen, werden oft unterschiedliche und teilweise mehrere Lysine mit PEG funktionalisiert, was zu einer Mischung an Regioisomeren führt. Je nach Position der PEG-Kette kann das aktive Zentrum abgeschirmt oder die 3D-Struktur des Proteins verändert werden, was zu einem teilweise drastischen Aktivitätsabfall führt. In dieser Arbeit wurde eine neuartige Methode zur Ligation von Makromolekülen untersucht. Die Verwendung eines Enzyms als Katalysator zur Verbindung zweier Makromoleküle ist bisher wenig untersucht und ineffizient. Als Enzym wurde Sortase A ausgewählt, eine gut untersuchte Ligase aus der Familie der Transpeptidasen, welche die Ligation zweier Peptide katalysieren kann. Ein Nachteil dieser Sortase-vermittelten Ligation ist, dass es sich um eine Gleichgewichtsreaktion handelt, wodurch hohe Ausbeuten schwierig zu erreichen sind. Im Rahmen dieser Dissertation wurden zwei zuvor entwickelte Methoden zur Verschiebung des Gleichgewichts ohne Einsatz eines großen Überschusses von einem Edukt für Makromoleküle überprüft. Zur Durchführung der Sortase-vermittelten Ligation werden zwei komplementäre Peptidsequenzen verwendet, die Erkennungssequenz und das Nukleophil. Um eine systematische Untersuchung durchführen zu können, wurden alle nötigen Bausteine (Protein-Erkennungssequenz zur Reaktion mit Nukleophil-Polymer und Polymer-Erkennungssequenz mit Nukleophil-Protein) hergestellt. Als Polymerisationstechnik wurde die radikalische Polymerisation mit reversibler Deaktivierung (im Detail, Atom Transfer Radical Polymerization, ATRP und Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer, RAFT polymerization) gewählt, um eine enge Molmassenverteilung zu erreichen. Die Herstellung der Bausteine begann mit der Synthese der Peptide via automatisierter Festphasen-Peptidsynthese, um eine einfache Änderung der Peptidsequenz zu gewährleisten und um eine Modifizierung der Polymerkette nach der Polymerisation zu umgehen. Um die benötigte unterschiedliche Funktionalität der zwei Peptidsequenzen (freier C-Terminus bei der Erkennungssequenz bzw. freier N-Terminus bei dem Nukleophil) zu erreichen, wurden verschiedene Linker zwischen Harz und Peptid verwendet. Danach wurde der Kettenüberträger (chain transfer agent, CTA) zur Kontrolle der Polymerisation mit dem auf dem Harz befindlichen Peptid gekoppelt. Die für die anschließende Polymerisation verwendeten Monomere basierten auf Acrylamiden und Acrylaten und wurden anhand ihrer Eignung als Alternativen zu PEG ausgewählt. Es wurde eine kürzlich entwickelte Technik basierend auf der RAFT-Polymerisation (xanthate-supported photo-iniferter RAFT, XPI-RAFT) verwendet um eine Reihe an Peptid-Polymeren mit unterschiedlichen Molekulargewichten und engen Molekulargewichtsverteilungen herzustellen. Nach Entfernung der Schutzgruppen der Peptid-Seitenketten wurden die Peptid-Polymere zunächst genutzt, um mittels Sortase-vermittelter Ligation zwei Polymerketten zu einem Blockcopolymer zu verbinden. Unter Verwendung von Ni2+-Ionen in Kombination mit einer Verlängerung der Erkennungssequenz um ein Histidin zur Unterdrückung der Rückreaktion konnte ein maximaler Umsatz von 70 % erreicht werden. Dabei zeigte sich ein oberes Limit von durchschnittlich 100 Wiederholungseinheiten; die Ligation von längeren Polymeren war nicht erfolgreich. Danach wurden ein Modellprotein und ein Nanobody mit vielversprechenden medizinischen Eigenschaften mit den für die enzymkatalysierte Ligation benötigten Peptidsequenzen für die Kopplung mit den zuvor hergestellten Peptid-Polymeren verwendet. Dabei konnte bei Verwendung des Modellproteins keine Bildung von Protein-Polymer-Konjugaten beobachtet werden. Der Nanobody konnte dagegen C-terminal mit einem Polymer funktionalisiert werden. Dabei wurde eine ähnliche Limitierung in der Polymer-Kettenlänge beobachtet wie zuvor. Die auf Ni-Ionen basierte Strategie zur Gleichgewichtsverschiebung hatte hier keinen ausschlaggebenden Effekt, während die Verwendung von einem Überschuss an Polymer zur vollständigen Umsetzung des Edukt-Nanobody führte. Die erhaltenen Daten aus diesem Projekt bilden eine gute Basis für weitere Forschung in dem vielversprechenden Feld der enzymkatalysierten Herstellung von Protein-Polymer-Konjugaten und Blockcopolymeren. Langfristig könnte diese Herangehensweise eine vielseitig einsetzbare Herstellungsmethode von ortsspezifischen therapeutischen Protein-Polymer Konjugaten darstellen, welche sowohl eine hohe Aktivität als auch eine lange Zirkulationszeit im Blut aufweisen. N2 - During the last decades, therapeutical proteins have risen to great significance in the pharmaceutical industry. As non-human proteins that are introduced into the human body cause a distinct immune system reaction that triggers their rapid clearance, most newly approved protein pharmaceuticals are shielded by modification with synthetic polymers to significantly improve their blood circulation time. All such clinically approved protein-polymer conjugates contain polyethylene glycol (PEG) and its conjugation is denoted as PEGylation. However, many patients develop anti-PEG antibodies which cause a rapid clearance of PEGylated molecules upon repeated administration. Therefore, the search for alternative polymers that can replace PEG in therapeutic applications has become important. In addition, although the blood circulation time is significantly prolonged, the therapeutic activity of some conjugates is decreased compared to the unmodified protein. The reason is that these conjugates are formed by the traditional conjugation method that addresses the protein's lysine side chains. As proteins have many solvent exposed lysines, this results in a somewhat uncontrolled attachment of polymer chains, leading to a mixture of regioisomers, with some of them eventually affecting the therapeutic performance. This thesis investigates a novel method for ligating macromolecules in a site-specific manner, using enzymatic catalysis. Sortase A is used as the enzyme: It is a well-studied transpeptidase which is able to catalyze the intermolecular ligation of two peptides. This process is commonly referred to as sortase-mediated ligation (SML). SML constitutes an equilibrium reaction, which limits product yield. Two previously reported methods to overcome this major limitation were tested with polymers without using an excessive amount of one reactant. Specific C- or N-terminal peptide sequences (recognition sequence and nucleophile) as part of the protein are required for SML. The complementary peptide was located at the polymer chain end. Grafting-to was used to avoid damaging the protein during polymerization. To be able to investigate all possible combinations (protein-recognition sequence and nucleophile-protein as well as polymer-recognition sequence and nucleophile-polymer) all necessary building blocks were synthesized. Polymerization via reversible deactivation radical polymerization (RDRP) was used to achieve a narrow molecular weight distribution of the polymers, which is required for therapeutic use. The synthesis of the polymeric building blocks was started by synthesizing the peptide via automated solid-phase peptide synthesis (SPPS) to avoid post-polymerization attachment and to enable easy adaptation of changes in the peptide sequence. To account for the different functionalities (free N- or C-terminus) required for SML, different linker molecules between resin and peptide were used. To facilitate purification, the chain transfer agent (CTA) for reversible addition-fragmentation chain-transfer (RAFT) polymerization was coupled to the resin-immobilized recognition sequence peptide. The acrylamide and acrylate-based monomers used in this thesis were chosen for their potential to replace PEG. Following that, surface-initiated (SI) ATRP and RAFT polymerization were attempted, but failed. As a result, the newly developed method of xanthate-supported photo-iniferter (XPI) RAFT polymerization in solution was used successfully to obtain a library of various peptide-polymer conjugates with different chain lengths and narrow molar mass distributions. After peptide side chain deprotection, these constructs were used first to ligate two polymers via SML, which was successful but revealed a limit in polymer chain length (max. 100 repeat units). When utilizing equimolar amounts of reactants, the use of Ni2+ ions in combination with a histidine after the recognition sequence to remove the cleaved peptide from the equilibrium maximized product formation with conversions of up to 70 %. Finally, a model protein and a nanobody with promising properties for therapeutical use were biotechnologically modified to contain the peptide sequences required for SML. Using the model protein for C- or N-terminal SML with various polymers did not result in protein-polymer conjugates. The reason is most likely the lack of accessibility of the protein termini to the enzyme. Using the nanobody for C-terminal SML, on the other hand, was successful. However, a similar polymer chain length limit was observed as in polymer-polymer SML. Furthermore, in case of the synthesis of protein-polymer conjugates, it was more effective to shift the SML equilibrium by using an excess of polymer than by employing the Ni2+ ion strategy. Overall, the experimental data from this work provides a good foundation for future research in this promising field; however, more research is required to fully understand the potential and limitations of using SML for protein-polymer synthesis. In future, the method explored in this dissertation could prove to be a very versatile pathway to obtain therapeutic protein-polymer conjugates that exhibit high activities and long blood circulation times. KW - biohybrid molecules KW - sortaseA KW - polymerization KW - RAFT KW - ATRP KW - peptide synthesis KW - enzymatic conjugation KW - sortagging Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-645669 ER - TY - THES A1 - Vacogne, Charlotte D. T1 - New synthetic routes towards well-defined polypeptides, morphologies and hydrogels T1 - Neue Syntheserouten zu wohldefinierten Polypeptiden, Morphologien und Hydrogelen N2 - Proteins are natural polypeptides produced by cells; they can be found in both animals and plants, and possess a variety of functions. One of these functions is to provide structural support to the surrounding cells and tissues. For example, collagen (which is found in skin, cartilage, tendons and bones) and keratin (which is found in hair and nails) are structural proteins. When a tissue is damaged, however, the supporting matrix formed by structural proteins cannot always spontaneously regenerate. Tailor-made synthetic polypeptides can be used to help heal and restore tissue formation. Synthetic polypeptides are typically synthesized by the so-called ring opening polymerization (ROP) of α-amino acid N-carboxyanhydrides (NCA). Such synthetic polypeptides are generally non-sequence-controlled and thus less complex than proteins. As such, synthetic polypeptides are rarely as efficient as proteins in their ability to self-assemble and form hierarchical or structural supramolecular assemblies in water, and thus, often require rational designing. In this doctoral work, two types of amino acids, γ-benzyl-L/D-glutamate (BLG / BDG) and allylglycine (AG), were selected to synthesize a series of (co)polypeptides of different compositions and molar masses. A new and versatile synthetic route to prepare polypeptides was developed, and its mechanism and kinetics were investigated. The polypeptide properties were thoroughly studied and new materials were developed from them. In particular, these polypeptides were able to aggregate (or self-assemble) in solution into microscopic fibres, very similar to those formed by collagen. By doing so, they formed robust physical networks and organogels which could be processed into high water-content, pH-responsive hydrogels. Particles with highly regular and chiral spiral morphologies were also obtained by emulsifying these polypeptides. Such polypeptides and the materials derived from them are, therefore, promising candidates for biomedical applications. N2 - Proteine, auch Polypeptide genannt, sind große Biomoleküle, die aus kleineren Aminosäuren bestehen. Diese sind zu langen Ketten miteinander verbunden, wie die Perlen auf einer Perlenkette. Sie werden in Zellen produziert, können in Tieren und Pflanzen gefunden werden und haben vielfältige Funktionen. Eine dieser Funktionen ist es, die umgebenen Zellen und Gewebe wie ein Gerüst zu stützen. Kollagen (welches in Haut, Knorpel, Sehnen und Knochen zu finden ist) und Keratin (welches in Haaren und Nägeln vorkommt) gehören zu diesen Strukturproteinen. Jedoch wenn ein Gewebe beschädigt ist, beispielsweise als Folge eines Unfalls, kann sich das Grundgerüst aus diesen Strukturproteinen manchmal nicht mehr selbst regenerieren. Maßgefertigte synthetische Polypeptide, können dafür verwendet werden, die Heilung und Wiederherstellung des Gewebes zu Unterstützen. Diese Polypeptide werden mit einer Reihe an chemischen Reaktionen synthetisiert, welche hauptsächlich darauf abzielen Aminosäuren miteinander zu verknüpfen. Synthetische Polypeptide sind weniger Komplex als die von Zellen hergestellten, natürlichen Polypeptide (Proteine). Während in den natürlichen Polypeptiden die Aminosäuren in einer von der DNA definierten Reihenfolge, welche als Sequenz bezeichnet wird, angeordnet sind, sind sie in synthetischen Polypeptiden zumeist zufällig verteilt. Die Konsequenz daraus ist, dass synthetische Polypeptide nicht immer so Leistungsfähig sind wie natürliche Proteine und ein durchdachtes Design benötigen. Zwei Aminosäuren wurden in dieser Dissertation sorgfältig ausgewählt und verwendet um eine Serie an Polypeptiden mit unterschiedlicher Zusammensetzung und Länge zu synthetisieren. Ein neuer und vielseitiger Syntheseweg wurde ebenfalls entwickelt und der zugrundeliegende Mechanismus untersucht. Die Polypeptide wurden gründlich analysiert und neue Materialien wurden aus ihnen entwickelt. In Lösung gebracht formten diese Fasern, ähnlich denen von Kollagen, welche sich wiederum zu robusten Netzwerken anordneten. Aus diesen Netzwerken ließen sich Hydrogele herstellen, welche in der Lage waren große Mengen an Wasser aufzunehmen. Diese Hydrogele wiederum stellen vielversprechende Kandidaten für biomedizinische Anwendungen dar. KW - polymer KW - chemistry KW - biomaterial KW - polymerization KW - kinetics KW - polypeptide KW - colloid KW - gelation KW - hydrogel KW - organogel KW - secondary structure KW - physical KW - NCA KW - N-carboxyanhydride KW - Polymer KW - Chemie KW - Biomaterial KW - Polymerisation KW - Kinetik KW - Polypeptid KW - Kolloid KW - Gelieren KW - Hydrogel KW - Organogel KW - Sekundärstruktur KW - physikalisch KW - NCA KW - N-carboxyanhydrid Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-396366 ER - TY - THES A1 - Ramírez Ríos, Liliana Patricia T1 - Superpara- and paramagnetic polymer colloids by miniemulsion processes N2 - Polymerverkapselte magnetische Nanopartikel versprechen, in der Zukunft sehr erfolgreich bei Anwendungen in der Biologie und der Medizin eingesetzt werden zu können z. B. in der Krebstherapie und als Kontrastmittel bei der magnetischen Kernspinresonanztomographie. Diese Arbeit zeigt, dass durch die interdisziplinäre Kombination verschiedener Techniken Herstellungsverfahren und Eigenschaften solcher Partikel verbessert werden können. Unter Miniemulsionen versteht man wässrige Dispersionen relativ stabiler Öltröpfchen, zwischen 30 und 50 nm Größe. Ein Nanometer (nm) ist der 1.000.000.000ste Teil eines Meters. Ein Haar ist ungefähr 60.000 Nanometer breit. Hergestellt werden Miniemulsionen durch Scherung eines Systems bestehend aus Öl, Wasser, Tensid (Seife) und einer weiteren Komponente, dem Hydrophob, das die Tröpfchen stabilisieren soll. Die Polymerisation von Miniemulsionen ermöglicht die Verkapselung anorganischer Materialen z. B. magnetischer Teilchen oder Gadolinium-haltiger Komponenten. Zu Optimierung des Verkapselung, ist es notwendig, die richtige Menge eines geeigneten Tensids zu finden. Die magnetischen polymerverkapselten Nanopartikel, die in einer wässrigen Trägerflüssigkeit dispergiert sind, zeigen in Abhängigkeit von Partikelgröße, Zusammensetzung, elektronischer Beschaffenheit, etc. ein sogenanntes superpara- oder paramagnetisches Verhalten. Superpara- oder paramagnetisches Verhalten bedeutet, dass die Flüssigkeiten in Anwesenheit äußerer Magnetfeldern ihre Fließfähigkeit beibehalten. Wenn das Magnetfeld entfernt wird, haben sie keine Erinnerung mehr daran, unter dem Einfluss eines Magnetfeldes gestanden zu haben, d. h., dass sie nach Abschalten des Magnetfeldes selbst nicht mehr magnetisch sind. Die Vorteile des Miniemulsionsverfahrens sind der hohe Gehalt und die homogene Verteilung magnetischer Teilchen in den einzelnen Nanopartikeln. Außerdem ermöglicht dieses Verfahren nanostrukturierte Kompositpartikel herzustellen, wie z. B polymerverkapselte Nanopartikel mit Nanoschichten bestehend aus magnetischen Molekülen. N2 - Combining the magnetic properties of a given material with the tremendous advantages of colloids can exponentially increase the advantages of both systems. This thesis deals with the field of magnetic nanotechnology. Thus, the design and characterization of new magnetic colloids with fascinating properties compared with the bulk materials is presented. Ferrofluids are referred to either as water or organic stable dispersions of superparamagnetic nanoparticles which respond to the application of an external magnetic field but lose their magnetization in the absence of a magnetic field. In the first part of this thesis, a three-step synthesis for the fabrication of a novel water-based ferrofluid is presented. The encapsulation of high amounts of magnetite into polystyrene particles can efficiently be achieved by a new process including two miniemulsion processes. The ferrofluids consist of novel magnetite polystyrene nanoparticles dispersed in water which are obtained by three-step process including coprecipitation of magnetite, its hydrophobization and further surfactant coating to enable the redispersion in water and the posterior encapsulation into polystyrene by miniemulsion polymerization. It is a desire to take advantage of a potential thermodynamic control for the design of nanoparticles, and the concept of "nanoreactors" where the essential ingredients for the formation of the nanoparticles are already in the beginning. The formulation and application of polymer particles and hybrid particles composed of polymeric and magnetic material is of high interest for biomedical applications. Ferrofluids can for instance be used in medicine for cancer therapy and magnetic resonance imaging. Superparamagnetic or paramagnetic colloids containing iron or gadolinium are also used as magnetic resonance imaging contrast agent, for example as a important tool in the diagnosis of cancer, since they enhance the relaxation of the water of the neighbouring zones. New nanostructured composites by the thermal decomposition of iron pentacarbonyl in the monomer phase and thereafter the formation of paramagnetic nanocomposites by miniemulsion polymerization are discussed in the second part of this thesis. In order to obtain the confined paramagnetic nanocomposites a two-step process was used. In the first step, the thermal decomposition of the iron pentacarbonyl was obtained in the monomer phase using oleic acid as stabilizer. In the second step, this iron-containing monomer dispersion was used for making a miniemulsion polymerization thereof. The addition of lanthanide complexes to ester-containing monomers such as butyl acrylate and subsequent polymerization leading to the spontaneous formation of highly organized layered nanocomposites is presented in the final part of this thesis. By an one-step miniemulsion process, the formation of a lamellar structure within the polymer nanoparticles is achieved. The magnetization and the NMR relaxation measurements have shown these new layered nanocomposites to be very apt for application as contrast agent in magnetic resonance imaging. T2 - Superpara- and paramagnetic polymer colloids by miniemulsion processes KW - Magnetisch KW - superparamagnetisch KW - paramagnetisch KW - Kolloid KW - Miniemulsion KW - Polymerisation KW - Ferrofluid KW - Überstrukturierte Komposite KW - Gadolinium KW - Lanthano KW - Magnetic KW - superparamagnetic KW - paramagnetic KW - colloid KW - miniemulsion KW - polymerization KW - ferrofluid KW - nanostructured composite KW - gadolinium KW - lanthanide Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0001267 ER -