TY - THES A1 - Nitschke, Felix T1 - Phosphorylation of polyglycans, especially glycogen and starch T1 - Phosphorylierung von Polysacchariden, insbesondere bei Glykogen und Stärke N2 - Functional metabolism of storage carbohydrates is vital to plants and animals. The water-soluble glycogen in animal cells and the amylopectin which is the major component of water-insoluble starch granules residing in plant plastids are chemically similar as they consist of α-1,6 branched α-1,4 glucan chains. Synthesis and degradation of transitory starch and of glycogen are accomplished by a set of enzymatic activities that to some extend are also similar in plants and animals. Chain elongation, branching, and debranching are achieved by synthases, branching enzymes, and debranching enzymes, respectively. Similarly, both types of polyglucans contain low amounts of phosphate esters whose abundance varies depending on species and organs. Starch is selectively phosphorylated by at least two dikinases (GWD and PWD) at the glucosyl carbons C6 and C3 and dephosphorylated by the phosphatase SEX4 and SEX4-like enzymes. In Arabidopsis insufficiency in starch phosphorylation or dephosphorylation results in largely impaired starch turnover, starch accumulation, and often in retardation of growth. In humans the progressive neurodegenerative epilepsy, Lafora disease, is the result of a defective enzyme (laforin) that is functional equivalent to the starch phosphatase SEX4 and capable of glycogen dephosphorylation. Patients lacking laforin progressively accumulate unphysiologically structured insoluble glycogen-derived particles (Lafora bodies) in many tissues including brain. Previous results concerning the carbon position of glycogen phosphate are contradictory. Currently it is believed that glycogen is esterified exclusively at the carbon positions C2 and C3 and that the monophosphate esters, being incorporated via a side reaction of glycogen synthase (GS), lack any specific function but are rather an enzymatic error that needs to be corrected. In this study a versatile and highly sensitive enzymatic cycling assay was established that enables quantification of very small G6P amounts in the presence of high concentrations of non-target compounds as present in hydrolysates of polysaccharides, such as starch, glycogen, or cytosolic heteroglycans in plants. Following validation of the G6P determination by analyzing previously characterized starches G6P was quantified in hydrolysates of various glycogen samples and in plant heteroglycans. Interestingly, glucosyl C6 phosphate is present in all glycogen preparations examined, the abundance varying between glycogens of different sources. Additionally, it was shown that carbon C6 is severely hyperphosphorylated in glycogen of Lafora disease mouse model and that laforin is capable of removing C6 phosphate from glycogen. After enrichment of phosphoglucans from amylolytically degraded glycogen, several techniques of two-dimensional NMR were applied that independently proved the existence of 6-phosphoglucosyl residues in glycogen and confirmed the recently described phosphorylation sites C2 and C3. C6 phosphate is neither Lafora disease- nor species-, or organ-specific as it was demonstrated in liver glycogen from laforin-deficient mice and in that of wild type rabbit skeletal muscle. The distribution of 6-phosphoglucosyl residues was analyzed in glycogen molecules and has been found to be uneven. Gradual degradation experiments revealed that C6 phosphate is more abundant in central parts of the glycogen molecules and in molecules possessing longer glucan chains. Glycogen of Lafora disease mice consistently contains a higher proportion of longer chains while most short chains were reduced as compared to wild type. Together with results recently published (Nitschke et al., 2013) the findings of this work completely unhinge the hypothesis of GS-mediated phosphate incorporation as the respective reaction mechanism excludes phosphorylation of this glucosyl carbon, and as it is difficult to explain an uneven distribution of C6 phosphate by a stochastic event. Indeed the results rather point to a specific function of 6-phosphoglucosyl residues in the metabolism of polysaccharides as they are present in starch, glycogen, and, as described in this study, in heteroglycans of Arabidopsis. In the latter the function of phosphate remains unclear but this study provides evidence that in starch and glycogen it is related to branching. Moreover a role of C6 phosphate in the early stages of glycogen synthesis is suggested. By rejecting the current view on glycogen phosphate to be a stochastic biochemical error the results permit a wider view on putative roles of glycogen phosphate and on alternative biochemical ways of glycogen phosphorylation which for many reasons are likely to be mediated by distinct phosphorylating enzymes as it is realized in starch metabolism of plants. Better understanding of the enzymology underlying glycogen phosphorylation implies new possibilities of Lafora disease treatment. N2 - Pflanzen und Tiere speichern Glukose in hochmolekularen Kohlenhydraten, um diese bei Bedarf unter anderem zur Gewinnung von Energie zu nutzen. Amylopectin, der größte Bestandteil des pflanzlichen Speicherkohlenhydrats Stärke, und das tierische Äquivalent Glykogen sind chemisch betrachtet ähnlich, denn sie bestehen aus verzweigten Ketten, deren Bausteine (Glukosylreste) auf identische Weise miteinander verbunden sind. Zudem kommen in beiden Kohlenhydraten kleine aber ähnliche Mengen von Phosphatgruppen vor, die offenbar eine tragende Rolle in Pflanzen und Tieren spielen. Ist in Pflanzen der Einbau oder die Entfernung von Phosphatgruppen in bzw. aus Stärke gestört, so ist oft der gesamte Stärkestoffwechsel beeinträchtigt. Dies zeigt sich unter anderem in der übermäßigen Akkumulation von Stärke und in Wachstumsverzögerungen der gesamten Pflanze. Beim Menschen und anderen Säugern beruht eine schwere Form der Epilepsie (Lafora disease) auf einer Störung des Glykogenstoffwechsels. Sie wird durch das erblich bedingte Fehlen eines Enzyms ausgelöst, das Phosphatgruppen aus dem Glykogen entfernt. Während die Enzyme, die für die Entfernung des Phosphats aus Stärke und Glykogen verantwortlich sind, hohe Ähnlichkeit aufweisen, ist momentan die Ansicht weit verbreitet, dass der Einbau von Phosphat in beide Speicherkohlenhydrate auf höchst unterschiedliche Weise erfolgt. In Pflanzen sind zwei Enzyme bekannt, die Phosphatgruppen an unterschiedlichen Stellen in Glukosylreste einbauen (Kohlenstoffatome 6 und 3). In Tieren soll eine seltene, unvermeidbare und zufällig auftretende Nebenreaktion eines Enzyms, das eigentlich die Ketten des Glykogens verlängert (Glykogen-Synthase), den Einbau von Phosphat bewirken, der somit als unwillkürlich gilt und weithin als „biochemischer Fehler“ (mit fatalen Konsequenzen bei ausbleibender Korrektur) betrachtet wird. In den Glukosylresten des Glykogens sollen ausschließlich die C-Atome 2 und 3 phosphoryliert sein. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen mittels zweier unabhängiger Methoden, dass Glykogen auch am Glukosyl-Kohlenstoff 6 phosphoryliert ist, der Phosphatposition, die in der Stärke am häufigsten vorkommt. Die Tatsache, dass in dieser Arbeit Phosphat neben Stärke auch erstmals an Glukosylresten von anderen pflanzlichen Kohlenhydraten (wasserlösliche Heteroglykane) nachgewiesen werden konnte, lässt vermuten, dass Phosphorylierung ein generelles Phänomen bei Polysacchariden ist. Des Weiteren wiesen die Ergebnisse darauf hin, dass Phosphat im Glykogen, wie auch in der Stärke, einem bestimmten Zweck dient, der im Zusammenhang mit der Regulation von Kettenverzweigung steht, und dass kein zufälliges biochemisches Ereignis für den Einbau verantwortlich sein kann. Aufgrund der grundlegenden Ähnlichkeiten im Stärke- und Glykogenstoffwechsel, liegt es nahe, dass die Phosphorylierung von Glykogen, ähnlich der von Stärke, ebenfalls durch spezifische Enzyme bewirkt wird. Ein besseres Verständnis der Mechanismen, die der Glykogen-Phosphorylierung zugrunde liegen, kann neue Möglichkeiten der Behandlung von Lafora disease aufzeigen. KW - Stärke KW - Glykogen KW - Phosphorylierung KW - NMR KW - Lafora disease KW - starch KW - glycogen KW - phosphorylation KW - NMR KW - Lafora disease Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-67396 ER - TY - THES A1 - Winkler, Henning T1 - Synthese von thermoplastisch verarbeitbaren Fettsäure-Acylderivaten der Stärke und Proteine T1 - Synthesis of thermoplastic processable fatty acid acyl derivatives of starch and proteins N2 - In den vergangenen Jahren wurden stetig wachsende Produktionskapazitäten von Biokunststoffen aus nachwachsenden Rohstoffe nverzeichnet. Trotz großer Produktionskapazitäten und einem geeigneten Eigenschaftsprofil findet Stärke nur als hydrophile, mit Weichmachern verarbeitete thermoplastische Stärke (TPS) in Form von Blends mit z. B. Polyestern Anwendung. Gleiches gilt für Kunststoffe auf Proteinbasis. Die vorliegende Arbeit hat die Entwicklung von Biokunststoffen auf Stärkebasis zum Ziel, welche ohne externe Weichmacher thermoplastisch verarbeitbar und hydrophob sind sowie ein mechanisches Eigenschaftsprofil aufweisen, welches ein Potenzial zur Herstellung von Materialien für eine Anwendung als Verpackungsmittel bietet. Um die Rohstoffbasis für Biokunststoffe zu erweitern, soll das erarbeitete Konzept auf zwei industriell verfügbare Proteintypen, Zein und Molkenproteinisolat (WPI), übertragen werden. Als geeignete Materialklasse wurden Fettsäureester der Stärke herausgearbeitet. Zunächst fand ein Vergleich der Säurechlorid-Veresterung und der Umesterung von Fettsäurevinylestern statt, woraus letztere als geeignetere Methode hervorging. Durch Variation der Reaktionsparameter konnte diese optimiert und auf eine Serie der Fettsäurevinylester von Butanoat bis Stearat für DS-Werte bis zu 2,2-2,6 angewandt werden. Möglich war somit eine systematische Studie unter Variation der veresterten Fettsäure sowie des Substitutionsgrades (DS). Sämtliche Produkte mit einem DS ab 1,5 wiesen eine ausgprägte Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln auf wodurch sowohl die Aufnahme von NMR-Spektren als auch Molmassenbestimmung mittels Größenausschlusschromatographie mit gekoppelter Mehrwinkel-Laserlichtstreuung (GPC-MALLS) möglich waren. Durch dynamische Lichtstreuung (DLS) wurde das Löslichkeitsverhalten veranschaulicht. Sämtliche Produkte konnten zu Filmen verarbeitet werden, wobei Materialien mit DS 1,5-1,7 hohe Zugfestigkeiten (bis zu 42 MPa) und Elastizitätsmodule (bis 1390 MPa) aufwiesen. Insbesondere Stärkehexanoat mit DS <2 sowie Stärkebutanoat mit DS >2 hatten ein mechanisches Eigenschaftsprofil, welches insbesondere in Bezug auf die Festigkeit/Steifigkeit vergleichbar mit Verpackungsmaterialien wie Polyethylen war (Zugfestigkeit: 15-32 MPa, E-Modul: 300-1300 MPa). Zugfestigkeit und Elastizitätsmodul nahmen mit steigender Kettenlänge der veresterten Fettsäure ab. Ester längerkettiger Fettsäuren (C16-C18) waren spröde. Über Weitwinkel-Röntgenstreuung (WAXS) und Infrarotspektroskopie (ATR-FTIR) konnte der Verlauf der Festigkeiten mit einer zunehmenden Distanz der Stärke im Material begründet werden. Es konnten von DS und Kettenlänge abhängige Glasübergänge detektiert werden, die kristallinen Strukturen der langkettigen Fettsäuren zeigten einen Schmelzpeak. Die Hydrophobie der Filme wurde anhand von Kontaktwinkeln >95° gegen Wasser dargestellt. Blends mit biobasierten Polyterpenen sowie den in der Arbeit hergestellten Zein-Acylderivaten ermöglichten eine weitere Verbesserung der Zugfestigkeit bzw. des Elastizitätsmoduls hochsubstituierter Produkte. Eine thermoplastische Verarbeitung mittels Spritzgießen war sowohl für Produkte mit hohem als auch mittlerem DS-Wert ohne jeglichen Zusatz von Weichmachern möglich. Es entstanden homogene, transparente Prüfstäbe. Untersuchungen der Härte ergaben auch hier für Stärkehexanoat und –butanoat mit Polyethylen vergleichbare Werte. Ausgewählte Produkte wurden zu Fasern nach dem Schmelzspinnverfahren verarbeitet. Hierbei wurden insbesondere für hochsubstituierte Derivate homogenen Fasern erstellt, welche im Vergleich zur Gießfolie signifikant höhere Zugfestigkeiten aufwiesen. Stärkeester mit mittlerem DS ließen sich ebenfalls verarbeiten. Zunächst wurden für eine Übertragung des Konzeptes auf die Proteine Zein und WPI verschiedene Synthesemethoden verglichen. Die Veresterung mit Säurechloriden ergab hierbei die höchsten Werte. Im Hinblick auf eine gute Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln wurde für WPI die Veresterung mit carbonyldiimidazol (CDI)-aktivierten Fettsäuren in DMSO und für Zein die Veresterung mit Säu-rechloriden in Pyridin bevorzugt. Es stellte sich heraus, dass acyliertes WPI zwar hydrophob, jedoch ohne Weichmacher nicht thermoplastisch verarbeitet werden konnte. Die Erstellung von Gießfolien führte zu Sprödbruchverhalten. Unter Zugabe der biobasierten Ölsäure wurde die Anwendung von acyliertem WPI als thermoplastischer Filler z. B. in Blends mit Stärkeestern dargestellt. Im Gegensatz hierzu zeigte acyliertes Zein Glasübergänge <100 °C bei ausreichender Stabilität (150-200 °C). Zeinoleat konnte ohne Weichmacher zu einer transparenten Gießfolie verarbeitet werden. Sämtliche Derivate erwiesen sich als ausgeprägt hydrophob. Zeinoleat konnte über das Schmelzspinnverfahren zu thermoplastischen Fasern verarbeitet werden. N2 - In recent years, a steadily growing production capacity of bioplastic based on renewable resources was noticed. Despite its huge production capacities and an appropriate property profile (ubiquitous occurrence, easy extraction), starch is only applied in addition of plasticizers in a hydrophilic, thermoplastic form in blends with e. g. polyesters. The same applies to bioplastics based on proteins. The actual study has the aim to develop starch-based bioplastics, which are hydrophobic, thermoplastic without the addition of any plasticizer and have mechanical properties to be a suitable alternative material in the area of food packaging. To obtain a variation of the raw materials for bioplastics, the concept shall be applied to two types of industrial available proteins, whey protein isolate (WPI) and Zein. Fatty acid esters of starch came out to be a suitable class of materials. Initially, the methods of esterifying acid chlorides and the transesterification of fatty acid vinyl esters were compared with the latter being more appropriate. Reaction parameters of this method were optimized and it was applied to a complete series of vinyl ester reagents (butanoate to stearate), leading to degree of substitution (DS)-values up to 2.2-2.6. With that, a systematic study of the variation of the fatty acid ester chain as well as the DS became possible. It came out that all products with a DS >1.5 showed a well-marked solubility in organic solvents, whereby solution NMR-studies as well as measurements of the molecular weight distributions by using size exclusion chroma-tography with multi-angle laser light scattering (SEC-MALLS) were possible. The different solution behavior was studied by dynamic light scattering (DLS). All soluble products could be formed into films via casting, where materials with a DS of 1.5-1.7 showed the highest values concerning tensile strength (up to 42 MPa) and Youngs modulus (up to 1390 MPa). Especially starch hexanoate with DS <2 and starch butanoate with a DS >2 revealed mechanical properties which are comparable to usually applied polymers for food packaging, e. g. polyethylene (tensile strength: 15-20 MPa, E-Mod: 300-1300 MPa). Tensile strength and Youngs modulus were reduced with increasing length of the esterified fatty acid. Wide-angle X-Ray scattering (WAXS) and infrared spectroscopy (ATR-FTIR) explained this tendency by an increasing intermolecular distance of the starch in the material. Glassy transitions of the materials were detected and showed a dependency on the type of esterified fatty acid and the DS. The crystalline structures of the esterified long-chain fatty acids revealed a melting peak. All films came out to be hydrophobic with contact angles against water >95°. The tensile strength and the Youngs modulus of the highly substituted products could be further improved by blending them with biobased polyterpenes as well as the acylated Zein. A thermoplastic processing without the use of any plasticizer additives was possible for products with a medium and high DS. Homogeneous, transparent testing specimens were obtained. The specific mechanical values were comparable with the casted films, although the highest values for the tensile strength and the elongation were lower. Investigations of the hardness showed comparable values to polyethylene. Selected samples were further processed to fibers by melt spinning. Especially starch esters with high DS revealed homogeneous fibers with a significant increase in the tensile strength compared to the film or testing specimen. Even fatty acid starch esters with a medium DS were processed by the melt-spinning, but their higher glassy transition lead to a reduced softening behavior. To transfer this concept to the class of proteins, different methods of synthesis were studied in the first step, which differed in their amount of acylation. The acylation using fatty acid chlorides lead to highest values. With regard to a well-marked organic solvent solubility, in the case of WPI the acylation with carbonyldiimidazol (CDI)-activated fatty acid was established. For Zein, the acid chloride acylation in pyridine gave the desired results. It came out the fatty acid acylated soluble WPI could not be thermoplastic processed without additional plasticizers. By using biobased oleic acid as additive, the potential of acylated WPI as a thermoplastic filler in blends with e. g. fatty acid esters of starch was shown. In contrast, fatty acid acyl derivatives of Zein revealed well marked glassy transitions <100 °C with an adequate thermal stability. While Zeinoleate could be formed into transparent films via solvent casting without any plasticizer additives, low amounts of tall oil enabled film-forming in the case of acyl derivatives with shorter fatty acids as well. All derivatives revealed a well-marked hydrophobicity. Finally, Zeinoleate was thermoplastically processed into fibers by melt-spinning without any further additives. KW - Stärke KW - Proteine KW - thermoplastisch KW - Gießfolien KW - Fasern KW - starch KW - proteins KW - thermoplastic KW - films KW - casted-films KW - fibres Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-71089 ER -