TY - THES A1 - Schlenstedt, Jana T1 - Molekulare und pharmakologische Charakterisierung von Serotonin-Rezeptoren der Honigbiene Apis mellifera T1 - Molecular and pharmacological characterization of serotonin receptors of the honeybee Apis mellifera N2 - Die Honigbiene Apis mellifera gilt seit langem als Modell-Organismus zur Untersuchung von Lern- und Gedächtnisvorgängen sowie zum Studium des Sozialverhaltens und der Arbeitsteilung. Bei der Steuerung und Regulation dieser Verhaltensweisen spielt das Indolalkylamin Serotonin eine wesentliche Rolle. Serotonin entfaltet seine Wirkung durch die Bindung an G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs). In der vorliegenden Arbeit wird der erste Serotonin-Rezeptor aus der Honigbiene molekular charakterisiert. Durch die Anwendung zwei verschiedener Klonierungsstrategien konnten drei cDNA-Sequenzen isoliert werden, die für potentielle Serotonin-Rezeptoren kodieren. Die Sequenzen weisen die größte Ähnlichkeit zu dem 5-HT7- und 5-HT2-Rezeptor von Drosophila melanogaster bzw. dem 5-HT1-Rezeptor von Panulirus interruptus auf. Die isolierten Serotonin-Rezeptoren der Honigbiene wurden dementsprechend Am(Apis mellifera)5-HT1, Am5-HT2 und Am5-HT7 benannt. Das Hydropathieprofil des Am5-HT1-, Am5-HT2- und Am5-HT7-Rezeptors deutet auf das Vorhandensein des charakteristischen heptahelikalen Aufbaus G-Protein-gekoppelter Rezeptoren hin. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen zeigen typische Merkmale biogener Amin-Rezeptoren. Aminosäuren, die eine Bedeutung bei der Bildung der Liganden-Bindungstasche, der Rezeptor-Aktivierung und der Kopplung eines G-Proteins an den Rezeptor haben, sind in allen drei Rezeptoren konserviert. Interessanterweise ist jedoch das in den meisten biogenen Amin-Rezeptoren vorhandene DRY-Motiv in dem Am5-HT2- und Am5-HT7-Rezeptor nicht konserviert. Das Vorhandensein einer PDZ-Domäne in dem Am5-HT1- und Am5-HT7-Rezeptor lässt vermuten, dass diese Rezeptoren als Adapterproteine fungieren, die Signalmoleküle zu einem Signaltransduktionskomplex vereinigen. RT-PCR-Experimente zeigen die Expression der Rezeptoren in verschiedenen Geweben der Honigbiene. Auffallend ist die hohe Expression im Zentralgehirn. Des Weiteren konnte die Expression der Serotonin-Rezeptoren in den optischen Loben, Antennalloben sowie in der Peripherie, d.h. in der Flugmuskulatur und den Malpighischen Gefäßen nachgewiesen werden. Durch in situ Hybridisierungen wurde die Expression in Gefrierschnitten von Gehirnen adulter Sammlerinnen im Detail untersucht. Transkripte der Rezeptoren sind in den Somata von intrinsischen Pilzkörperzellen, Neuronen der optischen Loben und Neuronen der Antennalloben vorhanden. In einem heterologen Expressionssystem wurde der intrazelluläre Signalweg des Am5-HT7-Rezeptors untersucht. Die Aktivierung des stabil exprimierten Rezeptors durch Serotonin führt zur Bildung von cAMP. Der 5-HT7-Rezeptor spezifische Agonist 5-CT zeigt eine mit Serotonin vergleichbare Fähigkeit, die intrazelluläre cAMP-Konzentration zu erhöhen. Am5-HT7 gehört daher funktionell zu der Gruppe der 5-HT7-Rezeptoren. Der EC50-Wert von 1,06~nM (5-HT), ist im Vergleich zu anderen 5-HT7-Rezeptoren äußert niedrig. Des Weiteren wurde gezeigt, dass das basale cAMP-Niveau in den transfizierten Zellen im Vergleich zu nicht transfizierten Zellen deutlich erhöht ist. Das heißt, dass der Rezeptor auch in der Abwesenheit eines Liganden aktiv ist. Diese konstitutive Aktivität ist auch von anderen biogenen Amin-Rezeptoren bekannt. Methiothepin wurde als wirksamer inverser Agonist des Am5-HT7-Rezeptors identifiziert, da es in der Lage ist, der konstitutiven Aktivität entgegenzuwirken. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit deuten darauf hin, dass die Serotonin-Rezeptoren in verschiedenen Regionen des ZNS der Honigbiene an der Informationsverarbeitung beteiligt sind. Es kann eine Beeinflussung von Lern- und Gedächtnisprozessen sowie des olfaktorischen und visuellen Systems durch diese Rezeptoren vermutet werden. Mit der Klonierung und funktionellen Charakterisierung des ersten Serotonin-Rezeptors der Honigbiene ist eine Grundlage für die Untersuchung der molekularen Mechanismen der serotonergen Signaltransduktion geschaffen worden. N2 - The honeybee Apis mellifera is a model organism for studying insect division of labor, learning and memory. An important substance that has been implicated in the control and regulation of these phenomena is the indolalkylamine serotonin (5-hydroxytryptamine, 5-HT) Pharmacological and functional studies indicate, that serotonin activates various receptor subtypes which predominantly belong to the family of G protein-coupled receptors (GPCRs). Using a homology based screening approach on a brain-specific cDNA library of the honeybee and a PCR-based strategy we have isolated cDNAs encoding three putative serotonin receptors. The deduced amino acid sequences of these putative honeybee serotonin receptors show the highest homology to a 5-HT7 and a 5-HT2 receptor from Drosophila melanogaster and a 5-HT1 receptor from Panulirus interruptus, respectively. We have studied the distribution of the respective 5-HT receptor mRNAs in several tissues of the honeybee by RT-PCR. The analysis revealed a high amount in the central brain. By using in situ-hybridization we detected receptor encoding mRNA in cryostat sections of honeybee brain. We could prove receptor transcripts in neurons of the optic lobes, intrinsic mushroom body neurons, and deutocerebral neurons. In a HEK 293 cell line, stably expressing the 5-HT7 receptor protein, we investigated the intracellular signalling pathway. When activated by serotonin, the heterologous expressed 5-HT7 receptor induces an increase in intracellular cAMP levels ([cAMP]i). The stimulation with other biogenic amines (octopamine, tyramine, and dopamine) did not induce a significant change in [cAMP]i Furthermore, Am5-HT7 causes a significant increase in the non-agonist stimulated cAMP levels relative to those of non-transfected cells. Therefore, the Am5-HT7 receptor displays agonist-independent (constitutive) activity which has also been demonstrated for many other GPCRs. A specific affinity-purified anti-Am5-HT7 antibody detected a protein band of the expected size of ~66 kDa in homogenates of honeybee brains and HEK 293 cells expressing the Am5-HT7 receptor. KW - Biogene Amine KW - Serotonin KW - Serotoninrezeptor KW - Biene KW - Pharmakologie KW - Lernen und Gedächtnis KW - pharmakologisches Profil KW - Gewebsverteilung KW - serotonin KW - biogenic amine KW - receptor KW - honeybee KW - pharmacology Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-7203 ER - TY - THES A1 - Blenau, Wolfgang T1 - Aminerge Signaltransduktion bei Insekten T1 - Aminergic signal transduction in insects N2 - Biogene Amine sind kleine organische Verbindungen, die sowohl bei Wirbeltieren als auch bei Wirbellosen als Neurotransmitter, Neuromodulatoren und/oder Neurohormone wirken können. Sie bilden eine bedeutende Gruppe von Botenstoffen und entfalten ihre Wirkungen über die Bindung an eine bestimmte Klasse von Rezeptorproteinen, die als G-Protein-gekoppelte Rezeptoren bezeichnet werden. Bei Insekten gehören zur Substanzklasse der biogenen Amine die Botenstoffe Dopamin, Tyramin, Octopamin, Serotonin und Histamin. Neben vielen anderen Wirkung ist z.B. gezeigt worden, daß einige dieser biogenen Amine bei der Honigbiene (Apis mellifera) die Geschmacksempfindlichkeit für Zuckerwasser-Reize modulieren können. Ich habe verschiedene Aspekte der aminergen Signaltransduktion an den „Modellorganismen“ Honigbiene und Amerikanische Großschabe (Periplaneta americana) untersucht. Aus der Honigbiene, einem „Modellorganismus“ für das Studium von Lern- und Gedächtnisvorgängen, wurden zwei Dopamin-Rezeptoren, ein Tyramin-Rezeptor, ein Octopamin-Rezeptor und ein Serotonin-Rezeptor charakterisiert. Die Rezeptoren wurden in kultivierten Säugerzellen exprimiert, um ihre pharmakologischen und funktionellen Eigenschaften (Kopplung an intrazelluläre Botenstoffwege) zu analysieren. Weiterhin wurde mit Hilfe verschiedener Techniken (RT-PCR, Northern-Blotting, in situ-Hybridisierung) untersucht, wo und wann während der Entwicklung die entsprechenden Rezeptor-mRNAs im Gehirn der Honigbiene exprimiert werden. Als Modellobjekt zur Untersuchung der zellulären Wirkungen biogener Amine wurden die Speicheldrüsen der Amerikanischen Großschabe genutzt. An isolierten Speicheldrüsen läßt sich sowohl mit Dopamin als auch mit Serotonin Speichelproduktion auslösen, wobei Speichelarten unterschiedlicher Zusammensetzung gebildet werden. Dopamin induziert die Bildung eines völlig proteinfreien, wäßrigen Speichels. Serotonin bewirkt die Sekretion eines proteinhaltigen Speichels. Die Serotonin-induzierte Proteinsekretion wird durch eine Erhöhung der Konzentration des intrazellulären Botenstoffs cAMP vermittelt. Es wurden die pharmakologischen Eigenschaften der Dopamin-Rezeptoren der Schaben-Speicheldrüsen untersucht sowie mit der molekularen Charakterisierung putativer aminerger Rezeptoren der Schabe begonnen. Weiterhin habe ich das ebony-Gen der Schabe charakterisiert. Dieses Gen kodiert für ein Enzym, das wahrscheinlich bei der Schabe (wie bei anderen Insekten) an der Inaktivierung biogener Amine beteiligt ist und im Gehirn und in den Speicheldrüsen der Schabe exprimiert wird. N2 - Biogenic amines are small organic compounds that act as neurotransmitters, neuromodulators and/or neurohormones in vertebrates and in invertebrates. They form an important group of messenger substances and mediate their diverse effects by binding to membrane receptors that primarily belong to the large gene-family of G protein-coupled receptors. In insects, the group of biogenic amine messengers consists of five members: dopamine, tyramine, octopamine, serotonin, and histamine. Besides many other effects, some of these biogenic amines were shown, for example, to modulate gustatory sensitivity to sucrose stimuli in the honeybee (Apis mellifera). I have investigated various aspects of the aminergic signal transduction in the “model organisms” honeybee and American cockroach (Periplaneta americana). So far, I have characterized two dopamine receptors, a tyramine receptor, an octopamine receptor and a serotonin receptor of the honeybee, which is well-known for its learning and memory capacities. The receptors where expressed in cultivated mammalian cells in order to analyze their pharmacological and functional (i.e., second messenger coupling) properties. The spatiotemporal expression patterns of the respective receptor mRNA were investigated in the honeybee brain by using different techniques (RT PCR, Northern blotting, in situ-hybridization). The salivary glands of the American cockroach were used as a model object in order to investigate the cellular effects of biogenic amines. Both dopamine and serotonin trigger salivary secretion in isolated salivary glands. The quality of the secreted saliva is, however, different. Stimulation of the glands by serotonin results in the production of a protein-rich saliva, whereas stimulation by dopamine results in saliva that is protein-free. Serotonin-induced protein secretion is mediated by an increase in the intracellular concentration of cAMP. The pharmacological properties of dopamine receptors associated with cockroach salivary glands were investigated and the molecular characterization of putative aminergic receptors of the cockroach was initiated. Furthermore, I have characterized the ebony gene of the cockroach. This gene encodes an enzyme that is probably involved in the inactivation of biogenic amines in the cockroach (as in other insects). The ebony gene is expressed in the brain and in the salivary glands of the cockroach. KW - Neurotransmitter-Rezeptor KW - Dopamin KW - Tyramin KW - Octopamin KW - Serotonin KW - Insekten KW - Biene KW - Amerikanische Schabe KW - Biogene Amine KW - G-Protein-gekoppelte-Rezeptoren KW - biogenic amines KW - G protein-coupled receptors KW - honeybee KW - salivary gland Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-7568 ER -