TY - THES A1 - Thamm, Markus T1 - Charakterisierung der Serotonin-Rezeptoren der Honigbiene Apis mellifera : von den Genen zum Verhalten T1 - Characterization of serotonin receptors in the honeybee Apis mellifera : from genes to behavior N2 - Das serotonerge System besitzt sowohl bei Invertebraten als auch bei Vertebraten eine große Bedeutung für die Kontrolle und Modulation vieler physiologischer Prozesse und Verhaltensleistungen. Bei der Honigbiene Apis mellifera spielt Serotonin (5-Hydroxytryptamin, 5-HT) eine wichtige Rolle bei der Arbeitsteilung und dem Lernen. Die 5-HT-Rezeptoren, die überwiegend zur Familie der G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) gehören, besitzen eine Schlüsselstellung für das Verständnis der molekularen Mechanismen der serotonergen Signalweiterleitung. Ziel dieser Arbeit war es, 5-HT-Rezeptoren der Honigbiene zu charakterisieren. Dazu zählt die Identifizierung der molekularen Struktur, die Ermittlung der intrazellulären Signalwege, die Erstellung von pharmakologischen Profilen, die Ermittlung der Expressionsmuster und die Ermittlung der physiologischen Funktionen der Rezeptoren. Mit Hilfe der Informationen aus dem Honey Bee Genome Project, konnten drei RezeptorcDNAs kloniert werden. Vergleiche der abgeleiteten Aminosäuresequenzen mit den Aminosäuresequenzen bereits charakterisierter Rezeptoren legten nahe, dass es sich dabei um einen 5-HT1- (Am5-HT1) und zwei 5-HT2-Rezeptoren (Am5-HT2α und Am5-HT2β) handelt. Die strukturelle Analyse der abgeleiteten Aminosäuresequenz dieser Rezeptoren postuliert das Vorhandensein der charakteristischen heptahelikalen Architektur von GPCRs und zeigt starkkonservierte Motive, die bedeutend für die Ligandenbindung, die Rezeptoraktivierung und die Kopplung an G-Proteine sind. Für die beiden 5 HT2-Rezeptoren konnte zudem alternatives Spleißen nachgewiesen werden. Mit den cDNAs des Am5-HT1- und des Am5-HT2α-Rezeptors wurden HEK293-Zellen stabil transfiziert und anschließend die Rezeptoren funktionell und pharmakologisch analysiert. Am5-HT1 hemmt bei Aktivierung abhängig von der 5-HT-Konzentration die cAMPProduktion.Die Substanzen 5-Methoxytryptamin (5-MT) und 5-Carboxamidotryptamin konnten als Agonisten identifiziert werden. Methiothepin dagegen blockiert die 5-HTWirkung vollständig. Prazosin und WAY100635 stellen partielle Antagonisten des Am5-HT1-Rezeptors dar. Der Am5-HT2_-Rezeptor stimuliert bei Aktivierung die Synthese des sekundären Botenstoffs Inositoltrisphosphat, was wiederum zu einer messbaren Erhöhung der intrazellulären Ca2+-Konzentration führt. 5-MT und 8-OH-DPAT zeigen eine deutliche agonistische Wirkung auf Am5-HT2α. Dagegen besitzen Clozapin, Methiothepin, Mianserin und Cyproheptadin die Fähigkeit, die 5-HT-Wirkung um 51-64 % zu vermindern. Die bereits erwähnte alternative Spleißvariante von Am5-HT2α wurde ebenfalls in HEK293-Zellen exprimiert und analysiert, scheint jedoch eigenständig nicht funktionell zu sein. Gegen die dritte cytoplasmatische Schleife (CPL3) wurde ein polyklonales Antiserum generiert. Dieses erkennt in Western-Blot-Analysen ein Protein mit einer Masse von ca. 50 kDa. Durch immunhistochemische Analysen am Bienengehirn wurde die Verteilung des Rezeptors genauer untersucht. Dabei zeigten die optischen Neuropile, besonders die Lamina und die Ocellarnerven, stets eine starke Markierung. Außerdem wird der Rezeptor in den α- und β-Loben sowie der Lippe, dem Basalring und dem Pedunculus der Pilzkörper exprimiert. Doppelmarkierungen zeigen stets eine enge Nachbarschaft von serotonergen Fasern und dem Am5-HT1-Rezeptor. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass der Am5-HT1-Rezeptor sehr wahrscheinlich an der Regulation des phototaktischen Verhalten der Honigbiene beteiligt ist. Verfütterung von 5-HT hat eine deutlich negative Wirkung auf das phototaktischen Verhalten. Diese kann durch den Am5-HT1-Rezeptor-Agonisten 5-CT imitiert werden. Schließlich konnte gezeigt werden, dass der Am5-HT1-Antagonist Prazosin die 5-HT-Wirkung deutlich vermindern kann. N2 - The serotonergic system plays an important role in the control and modulation of many physiological and behavioral processes in both vertebrates and invertebrates. In the honeybee Apis mellifera, serotonin (5-hydroxytryptamine, 5-HT) has been implicated in the control and regulation of division of labor as well as learning and memory. A key role in understanding the serotonergic system plays the molecular and functional characterization of 5-HT receptor subtypes. In most cases, serotonin receptors represent G protein-coupled receptors (GPCRs). This work describes the characterization of honeybee serotonin receptors. This comprises the identification of their molecular structure, intracellular second messenger pathways, pharmacological properties, expression profiles and functions. By screening the honeybee genome, we found three candidate genes encoding for putative serotonin receptors. The cDNAs of these genes were cloned and the deduced amino acid sequences were analysed. The sequence information was used to isolate the cDNAs encoding for these three receptors. Comparison of the deduced amino acid sequences with sequences of other known receptors suggests that one receptor belongs to the 5-HT1 (Am5-HT1) and the other two receptors to the 5-HT2 receptor class (Am5-HT2α and Am5-HT2β). Major characteristics common to all GPCRs (e.g. the heptahelical architecture) were confirmed by structural analyses of the deduced amino acid sequences. Furthermore, truncated receptor transcripts representing alternative splice variants of both 5-HT2 receptors could be detected. HEK293 cells were stably transfected with the cDNAs of Am5-HT1 or Am5-HT2_ and functionally and pharmacologically analysed. The activation of Am5-HT1 by 5-HT results in the dose dependent attenuation of adenylyl cyclase activity. 5-methoxytryptamine (5-MT) and 5-carboxamidotryptamine are able to imitate the 5-HT effect. In contrast, methiothepin is able to block the entire 5-HT effect, whereas prazosine and WAY100635 block the 5-HT effect only partially. The Am5-HT2α receptor stimulates the synthesis of the second messenger inositol trisphosphate which in turn mediates an increase in the intracellular Ca2+. The substances 5-MT and 8-OH-DPAT were identified as agonists of the Am5-HT2α receptor. In contrast, clozapine, methiothepine, mianserine, and cyproheptadine show strong antagonistic actions. A truncated alternative splice variant of the Am5-HT2α-receptor was also analysed but didn’t show any functional coupling by itself. An antiserum was raised against the third cytoplasmic loop (CPL3) of the Am5-HT1 receptor. This antiserum detects a protein with a molecular mass of 50 kDa in western blot analyses. The expression of the Am5-HT1 receptor was studied in detail using immunohistochemistry. Strong Am5-HT1-like immunofluorescence was observed in the ocellar nerve, in the three optic ganglia and in the α- and β-lobes, the pedunculi, the lip and the basal ring of the mushroom bodies. Furthermore, co-labeling with an antibody against 5-HT showed that this receptor is expressed in close vicinity to serotonergic neurons. Finally, behavioral experiments suggest a possible role of the Am5-HT1 receptor in phototactic behavior. Feeding of 5-HT to worker honeybees results in a decrease of phototactic behavior. This 5-HT action could be mimiced by feeding of the Am5-HT1 agonist 5-CT. In contrast, the Am5-HT1 antagonist prazosine prevents the 5-HT-induced decrease in phototaxis. KW - Serotonin KW - Honigbiene KW - GPCR KW - serotonin KW - honeybee KW - GPCR Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-40736 ER - TY - THES A1 - Rolke, Daniel T1 - Räumliche und zeitliche Expressionsmuster sowie Funktionen der Serotonin-Rezeptor-Subtypen der Honigbiene, Apis mellifera L., 1758 T1 - Spatial and temporal expression patterns as well as functions of the serotonin-receptor-subtypes in the honey bee, Apis mellifera L., 1758 N2 - Das biogene Amin Serotonin (5-Hydroxytryptamin, 5-HT) agiert als wichtiger chemischer Botenstoff bei einer Vielzahl von Organismen. Das durch 5 HT vermittelte Signal wird dabei durch spezifische Rezeptoren wahrgenommen und in eine zelluläre Reaktion umgesetzt. Diese 5 HT Rezeptoren gehören überwiegend zur Familie der G Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCRs). Die Honigbiene Apis mellifera bietet unter anderem aufgrund ihrer eusozialen Lebensweise vielfältige Ansatzpunkte zur Erforschung der Funktionen des serotonergen Systems in Insekten. Bei A. mellifera wurden bereits vier 5-HT-Rezeptor-Subtypen beschrieben und molekular sowie pharmakologisch charakterisiert: Am5 HT1A, Am5 HT2α, Am5 HT2β und Am5 HT7. Ziel dieser Arbeit war es, gewebespezifische sowie alters- und tageszeitabhängige Expressionsmuster der 5 HT Rezeptor-Subtypen zu untersuchen, um zu einem umfassenden Verständnis des serotonergen Systems der Honigbiene beizutragen und eine Basis zur Hypothesenentwicklung für mögliche physiologische Funktionen zu schaffen. Es wurde die Expression der 5 HT Rezeptorgene sowohl im zentralen Nervensystem, als auch in Teilen des Verdauungs-, Exkretions- und Speicheldrüsensystems gemessen. Dabei konnte gezeigt werden, dass die untersuchten 5-HT-Rezeptor-Subtypen generell weit im Organismus der Honigbiene verbreitet sind. Interessanterweise unterschieden sich die untersuchten Gewebe hinsichtlich der mRNA-Expressionsmuster der untersuchten Rezeptoren. Während beispielsweise im Gehirn Am5 ht1A und Am5 ht7 stärker als Am5 ht2α und Am5 ht2β exprimiert wurden, zeigte sich in Darmgewebe ein umgekehrtes Muster. Es war bereits bekannt, dass es bei der Expression der Am5-ht2-Gene zu alternativem Spleißen kommt. Dies führt zur Entstehung der verkürzten mRNA-Varianten Am5 ht2αΔIII und Am5 ht2βΔII. Die daraus resultierenden Proteine können nicht als funktionelle GPCRs agieren. Es konnte gezeigt werden, dass diese verkürzten Spleißvarianten dennoch ubiquitär in der Honigbiene exprimiert werden. Bemerkenswerterweise wurden gewebeübergreifende Ähnlichkeiten der Expressionsmuster der Spleißvarianten gegenüber deren zugehörigen Volllängenvarianten festgestellt, welche auf Funktionen der verkürzten Varianten in vivo hindeuten. Im Hinblick auf die bei A. mellifera hauptsächlich altersbedingte Arbeitsteilung wurde die Expression der 5 HT Rezeptor-Subtypen in Gehirnen von unterschiedlich alten Arbeiterinnen mit unterschiedlichen sozialen Rollen verglichen. Während auf mRNA-Ebene keines der vier 5 HT Rezeptor-Subtypen eine altersabhängig unterschiedliche Expression zeigte, konnte für das Am5-HT1A-Protein eine höhere Konzentration in den Gehirnen älterer Tiere gefunden werden. Dies deutet auf eine posttranskriptionale Regulation der 5 HT1A Rezeptorexpression hin, welche im Zusammenhang mit der Arbeitsteilung stehen könnte. Es erfolgte die Untersuchung tageszeitlicher Änderungen sowohl der Expression der 5 HT Rezeptor-Subtypen, als auch des biogenen Amins 5 HT selbst. Während es in den Gehirnen von Arbeiterinnen, welche unter natürlichen Bedingungen gehalten wurden, zu keiner tageszeitabhängigen Veränderung des 5 HT-Titers kam, zeigte die mRNA-Expression von Am5-ht2α und Am5-ht2β eine periodische Oszillation mit Zunahme während des Tages und Abnahme während der Nacht. Diese Regulation wird durch externe Faktoren hervorgerufen und ist nicht auf einen endogenen circadianen Rhythmus zurückzuführen. Dies ging aus der Wiederholung der Expressionsmessungen an Gehirnen von Bienen, welche unter konstanten Laborbedingungen gehalten wurden, hervor. Weiterhin wurde die Beteiligung des serotonergen Systems an der Steuerung von Aspekten des circadianen lokomotorischen Aktivitätsrhythmus anhand von Verhaltensexperimenten untersucht. Mit 5 HT gefütterte Arbeiterinnen zeigten dabei unter konstanten Bedingungen eine längere Periode des Aktivitätsrhythmus als Kontrolltiere. Dies deutet auf einen Einfluss von 5 HT auf die Modulation der Synchronisation der inneren Uhr hin. Die vorliegenden Ergebnisse tragen wesentlich zum tieferen Verständnis des serotonergen Systems der Honigbiene bei und bieten Ansatzpunkte für weitergehende Studien zur Funktion von 5 HT im Zusammenhang mit der Modulation von physiologischen Prozessen, Arbeitsteilung und circadianen Rhythmen. N2 - The biogenic amine serotonin (5-hydroxytryptamine, 5-HT) acts as an important chemical messenger in a variety of organisms. The 5 HT-mediated signal is perceived by specific receptors and converted to a cellular response. This 5 HT receptors mainly belong to the family of G protein-coupled receptors (GPCRs). The honeybee offers various starting points to explore the functions of the serotonergic system in insects, among other things because of their eusocial lifestyle. In A. mellifera four 5-HT receptor subtypes have been described and molecularly and pharmacologically characterized: Am5 HT1A, Am5 HT2α, Am5 HT2β and Am5 HT7. The aim of this study was to investigate the tissue-specific and age- and daytime-dependent expression patterns of the 5 HT receptor subtypes in order to contribute to a comprehensive understanding of the serotonergic system in A. mellifera. The expression of the 5 HT receptor genes was measured in the central nervous system, as well as in parts of the digestive, excretory and salivary system. It was shown that the investigated 5-HT receptor subtypes are widely distributed in the honeybee. Interestingly, the tissues examined differed with regard to the mRNA expression pattern of the studied receptors. While in the brain the expression of Am5 ht1A and Am5 ht7 was higher than that of Am5 ht2α and Am5 ht2β, the opposite held true for intestinal tissue. It was already known that alternative splicing occurs in the expression of both Am5-ht2 genes. This leads to the formation of the truncated mRNA variants Am5 ht2αΔIII and Am5 ht2βΔII. The resulting proteins cannot act as functional GPCRs. However, it was demonstrated that these truncated splice variants are still ubiquitously expressed in the honeybee. Remarkably, similarities in the expression patterns of the shortened splice variants towards their corresponding full length variants were found throughout different tissues that indicate in vivo functions of the shortened variants. In view of the mainly age related division of labor in A. mellifera, the expression of the 5 HT receptor subtypes was compared in brains of different aged workers with different social roles. While none of the four 5 HT receptor subtypes showed an age-dependent differential expression at the mRNA level, a higher concentration in the brains of older animals could be found for the Am5-HT1A protein. This points to a post-transcriptional regulation of 5 HT1A receptor expression, which could be associated with the division of labor. It was carried out the investigation of diurnal changes in both the expression of the 5 HT receptor subtypes, and of the biogenic amine 5 HT itself. While in the brains of workers, which were kept under natural conditions, no daytime-dependent changes of the 5 HT titer could be found, the mRNA expression of Am5 ht2α and Am5-ht2β showed a periodic oscillation with an increase during the day and a decrease at night. This regulation is caused by external factors and not due to an endogenous circadian rhythm. That was shown by the repetition of the expression measurements on brains of bees, which were kept under constant laboratory conditions. Furthermore, the involvement of the serotonergic system in controlling aspects of circadian locomotor activity rhythm was investigated in behavioral experiments. Under constant conditions, worker bees which were fed with 5 HT showed a longer period of locomotor rhythm than control animals. This suggests an influence of 5 HT in the modulation of the synchronization of the internal clock. In conclusion, the present results contribute to a more detailed understanding of the serotonergic system of the honeybee and provide a basis for further studies on the function of 5 HT in connection with the modulation of physiological processes, division of labor and circadian rhythms. KW - Serotonin KW - Rezeptor KW - Honigbiene KW - serotonin KW - receptors KW - honey bee Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-96667 ER - TY - THES A1 - Reim, Tina T1 - Biogene Aminrezeptoren bei der Honigbiene Apis mellifera T1 - Biogenic amine receptors in the honey bee Apis mellifera BT - Charakterisierung des Tyramin 2-Rezeptors und die Beteiligung der Octopamin- und Tyraminrezeptoren an der Steuerung der altersabhängigen Arbeitsteilung N2 - Die Honigbiene Apis mellifera zeigt innerhalb einer Kolonie eine an das Alter gekoppelte Arbeitsteilung. Junge Honigbienen versorgen die Brut (Ammenbienen), während ältere Honigbienen (Sammlerinnen) außerhalb des Stocks Pollen und Nektar eintragen. Die biogenen Amine Octopamin und Tyramin sind an der Steuerung der Arbeitsteilung maßgeblich beteiligt. Sie interagieren mit Zielzellen über die Bindung an G Protein gekoppelte Rezeptoren. A. mellifera besitzt fünf charakterisierte Octopaminrezeptoren (AmOctαR1, AmOctβR1-4), einen charakterisierten Tyraminrezeptor (AmTyr1) sowie einen weiteren putativen Tyraminrezeptor. In der vorliegenden Arbeit wurde dieser putative Aminrezeptor als zweiter Tyraminrezeptor (AmTyr2) identifiziert, lokalisiert und pharmakologisch charakterisiert. Die von der cDNA abgeleitete Aminosäuresequenz weist strukturelle Eigenschaften und konservierte Motive von G Protein gekoppelten Rezeptoren auf. Phylogenetisch ordnet sich der AmTyr2 Rezeptor bei den Tyramin 2 Rezeptoren anderer Insekten ein. Die funktionelle und pharmakologische Charakterisierung des putativen Tyraminrezeptors erfolgte in modifizierten HEK293 Zellen, die mit der Rezeptor cDNA transfiziert wurden. Die Applikation von Tyramin aktiviert Adenylylcyclasen in diesen Zellen und resultiert in einem Anstieg des intrazellulären cAMP Gehalts. Der AmTyr2 Rezeptor kann durch Tyramin in nanomolaren Konzentrationen halbmaximal aktiviert werden. Während es sich bei Octopamin um einen wirkungsvollen Agonisten des Rezeptors handelt, sind Mianserin und Yohimbin effektive Antagonisten. Für die Lokalisierung des Rezeptorproteins wurde ein polyklonaler Antikörper generiert. Eine AmTyr2-ähnliche Immunreaktivität zeigt sich im Gehirn in den optischen Loben, den Antennalloben, dem Zentralkomplex und in den Kenyon Zellen der Pilzkörper. Des Weiteren wurde die Rolle der Octopamin- und Tyraminrezeptoren bei der Steuerung der altersabhängigen Arbeitsteilung analysiert. Die Genexpression des AmOctαR1 in verschiedenen Gehirnteilen korreliert unabhängig vom Alter mit der sozialen Rolle, während sich die Genexpression von AmOctβR3/4 und den Tyraminrezeptoren AmTyr1 und AmTyr2 maximal mit dem Alter aber nicht der sozialen Rolle ändert. Sammlerinnen weisen einen höheren Octopamingehalt im Gesamtgehirn auf als Ammenbienen; bei Tyramin zeigen sich keine Unterschiede. Während Tyramin offensichtlich keine direkte Rolle spielt, werden durch Octopamin gesteuerte Prozesse der altersabhängigen Arbeitsteilung bei der Honigbiene vermutlich über den AmOctαR1 vermittelt. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen die wichtige Rolle von biogenen Aminen, insbesondere Octopamin bei der sozialen Organisation von Insektenstaaten. N2 - The honey bee Apis mellifera exhibits an age-dependent division of labour. Young bees take care of the brood (nurse bees), while older honey bees (foragers) leave the hive to provide the colony with pollen and nectar. The biogenic amines octopamine and tyramine are significantly involved in regulating the division of labour. They interact with target cells via binding to G protein-coupled receptors. A. mellifera has five characterised octopamine receptors (AmOctαR1, AmOctβR1-4), one characterised tyramine receptor (AmTyr1) and an additional putative tyramine receptor. In the present study, the putative amine receptor was identified as a second tyramine receptor (AmTyr2), was localized and characterised pharmacologically. The deduced amino acid sequence shows structural properties and conserved motifs of G protein-coupled receptors. Phylogenetically the AmTyr2 receptor clusters with tyramine 2 receptors from other insect species. Functional and pharmacological characterisation of the putative tyramine receptor was carried out using modified HEK293 cells trans¬fected with the receptor cDNA. Application of tyramine activates adenylyl cyclases in these cells, which leads to an elevated intracellular cAMP level. Half maximal activation can be achieved by applying tyramine with concentrations in the nanomolar range. While octopa¬mine is an effective agonist of the receptor, mianserin and yohimbine are the most effective antagonists. A polyclonal antibody was generated for the localisation of the receptor protein. AmTyr2 like immunoreactivity can be observed in the optic lobes, the Kenyon cells of the mushroom bodies, the antennal lobes and the central complex of the brain. Furthermore, the role of the octopamine and tyramine receptors in regulating the age-dependent division of labour was analysed. The gene expression of the AmOctαR1 in different brain neuropiles correlates with the social role of the honey bee, while the gene expression of AmOctβR3/4, AmTyr1 and AmTyr2 mostly changes with age but not social role. Additionally, foragers have higher octopamine brain titres than nurse bees. No differences can be observed for the titre of tyramine. Octopamine-regulated processes in age-dependent division of labour are probably mediated via the AmOctαR1. Tyramine has obviously no direct impact on the age-dependent division of labour. The present study shows the important role of biogenic amines, particularly octopamine in the social organisation of insect societies. KW - Apis mellifera KW - honey bee KW - Honigbiene KW - biogene Amine KW - biogenic amines KW - Octopamin KW - octopamine KW - Tyramin KW - tyramine KW - Arbeitsteilung KW - division of labor Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-80982 ER -