TY - THES A1 - Tenenboim, Yehezkel T1 - Characterization of a Chlamydomonas protein involved in cell division and autophagy T1 - Charakterisierung eines an Zellteilung und Autophagie beteiligten Chlamydomonas-Proteins N2 - The contractile vacuole (CV) is an osmoregulatory organelle found exclusively in algae and protists. In addition to expelling excessive water out of the cell, it also expels ions and other metabolites and thereby contributes to the cell's metabolic homeostasis. The interest in the CV reaches beyond its immediate cellular roles. The CV's function is tightly related to basic cellular processes such as membrane dynamics and vesicle budding and fusion; several physiological processes in animals, such as synaptic neurotransmission and blood filtration in the kidney, are related to the CV's function; and several pathogens, such as the causative agents of sleeping sickness, possess CVs, which may serve as pharmacological targets. The green alga Chlamydomonas reinhardtii has two CVs. They are the smallest known CVs in nature, and they remain relatively untouched in the CV-related literature. Many genes that have been shown to be related to the CV in other organisms have close homologues in C. reinhardtii. We attempted to silence some of these genes and observe the effect on the CV. One of our genes, VMP1, caused striking, severe phenotypes when silenced. Cells exhibited defective cytokinesis and aberrant morphologies. The CV, incidentally, remained unscathed. In addition, mutant cells showed some evidence of disrupted autophagy. Several important regulators of the cell cycle as well as autophagy were found to be underexpressed in the mutant. Lipidomic analysis revealed many meaningful changes between wild-type and mutant cells, reinforcing the compromised-autophagy observation. VMP1 is a singular protein, with homologues in numerous eukaryotic organisms (aside from fungi), but usually with no relatives in each particular genome. Since its first characterization in 2002 it has been associated with several cellular processes and functions, namely autophagy, programmed cell-death, secretion, cell adhesion, and organelle biogenesis. It has been implicated in several human diseases: pancreatitis, diabetes, and several types of cancer. Our results reiterate some of the observations in VMP1's six reported homologues, but, importantly, show for the first time an involvement of this protein in cell division. The mechanisms underlying this involvement in Chlamydomonas, as well as other key aspects, such as VMP1's subcellular localization and interaction partners, still await elucidation. N2 - Die kontraktile Vakuole ist ein osmoregulatorisches Organell, das ausschließlich in Algen und Protisten vorkommt. Zusätzlich zu ihrer Rolle als Ausstoßer überflüßigen Wassers aus der Zelle heraus, stößt sie auch Ionen und andere Metaboliten aus, und trägt dabei zur metabolischen Homöostase der Zelle bei. Das Interesse an der kontraktilen Vakuole erstreckt sich über seine unmittelbare zelluläre Rolle hinaus. Die Funktion der kontraktilen Vakuole ist mit einigen grundsätzlichen zellulären Verfahren, wie Membrandynamik und Vesikelknospung und -fusion, verwandt; einige physiologische Verfahren in Tieren, zum Beispiel synaptische Neurotransmission und das Filtrieren des Blutes in den Nieren, sind mit der Funktion der Vakuole eng verwandt; und einige Pathogene—der Ursacher der Schlafkrankheit als Beispiel—besitzen kontraktile Vakuolen, die als Ziele von Medikamenten dienen könnten. Die grüne Alge Chlamydomonas reinhardtii verfügt über zwei Vakuolen. Sie sind die kleinsten bekannten in der Natur, und bleiben bisher verhältnismäßig unerforscht. Viele Gene, die in anderen Organismen als kontraktile-Vakuole-bezogen erwiesen wurden, haben Homologe in C. reinhardtii. Wir versuchten, diese Gene auszuschalten und den Einfluss auf die Vakuole zu beobachten. Die Ausschaltung eines unserer Gene, VMP1, verursachte starke, beachtliche Phänotype. Die Zellen zeigten gestörte Zytokinese und aberrante Zellformen. Die kontraktile Vakuole blieb jedoch verschont. Des Weiteren zeigten Mutantzellen einige Hinweise auf gestörte Autophagie. Einige wichtige Gene des Zellzyklus und der Autophagie waren unterexprimiert in Mutantzellen. Lipidomische Analyse zeigte mehrere bedeutsame Unterschiede zwischen Wildtyp und Mutant, die die Beobachtungen der gestörten Autophagie verstärkten. VMP1 ist ein singularisches Protein, mit Homologen in zähligen eukaryotischen Organismen (jedoch nicht in Pilzen), aber üblicherweise ohne Verwandte in den jeweiligen Genomen. Seit seiner Erstcharakterisierung 2002 wurde es mit etlichen zellulären Verfahren, wie Autophagie, programmiertem Zelltod, Sekretion, Zelladhäsion, und Biogenese der Organellen, assoziiert. Es wurde auch mit einigen menschlichen Krankheiten wie Diabetes, Pankreatitis, und einigen Arten von Krebs in Verbindung gebracht. Unsere Ergebnisse wiederholen einige Beobachtungen in anderen Organismen, zeigen dennoch zum ersten Mal eine Beteiligung von VMP1 an der Zellteilung. Die unterliegenden Mechanismen dieser Beteiligung in Chlamydomonas, sowie andere wichtige Aspekte, etwa die subzelluläre Lokalisierung von VMP1 und dessen Interaktionspartner, warten noch auf Aufklärung. KW - VMP1 KW - autophagy KW - cytokinesis KW - chlamydomonas Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-70650 ER - TY - THES A1 - Korovila, Ioanna T1 - Role of proteolytic systems in lipotoxicity-induced hepatocellular damage T1 - Lipotoxizität und Leberzellschädigung - Die Rolle der proteolytischen Systeme N2 - Scope: Several studies show that excessive lipid intake can cause hepatic steatosis. To investigate lipotoxicity on cellular level, palmitate (PA) is often used to highly increase lipid droplets (LDs). One way to remove LDs is autophagy, while it is controversially discussed if autophagy is also affected by PA. It is aimed to investigate whether PA-induced LD accumulation can impair autophagy and punicalagin, a natural autophagy inducer from pomegranate, can improve it. Methods and results: To verify the role of autophagy in LD degradation, HepG2 cells are treated with PA and analyzed for LD and perilipin 2 content in presence of autophagy inducer Torin 1 and inhibitor 3-Methyladenine. PA alone seems to initially induce autophagy-related proteins but impairs autophagic-flux in a time-dependent manner, considering 6 and 24 h PA. To examine whether punicalagin can prevent autophagy impairment, cells are cotreated for 24 h with PA and punicalagin. Results show that punicalagin preserves expression of autophagy-related proteins and autophagic flux, while simultaneously decreasing LDs and perilipin 2. Conclusion: Data provide new insights into the role of PA-induced excessive LD content on autophagy and suggest autophagy-inducing properties of punicalagin, indicating that punicalagin can be a health-beneficial compound for future research on lipotoxicity in liver. N2 - Lebersteatose entsteht durch eine übermäßige Zufuhr von Nahrungslipiden und ist durch eine chronische Ansammlung von Lipidtröpfchen (LD) in der Leber gekennzeichnet, die wiederum zu einer hepatozellulären Dysfunktion führen. Dieser pathogene Zustand ist ein grundlegendes Merkmal der nichtalkoholischen Fettleber (NAFLD) und ein Risikofaktor für viele weit verbreitete Stoffwechselerkrankungen, einschließlich Fettleibigkeit und Typ-2-Diabetes. Abgesehen von der Menge der aufgenommenen Nahrungsfette wird die Entwicklung der Lebersteatose auch stark von der Art der Fettsäure beeinflusst. Palmitat (PA) ist die am häufigsten vorkommende gesättigte Fettsäure und spielt eine bedeutende Rolle bei der Pathogenese der Lebersteatose. Sie wird häufig verwendet, um Lipotoxizität zu induzieren und die Entwicklung von LDs auf zellulärer Ebene zu untersuchen. Die beiden wichtigsten intrazellulären proteolytischen Systeme, das Ubiquitin-Proteasom-System und das Autophagie-Lysosom-System, sind am LD-Abbau beteiligt und kontrollieren das Gleichgewicht der Lipidhomöostase. Der Einfluss der Lipotoxizität auf ihre Funktion ist jedoch noch umstritten. Das Ziel der vorliegenden Dissertation ist es zu untersuchen, ob eine erhöhte LD-Akkumulation die Funktion der proteolytischen Systeme beeinträchtigt und ob die Effekte durch Kontrolle ihrer Aktivität umgekehrt werden können. In-vivo Untersuchungen an New Zealand Obese (NZO) Mäusen, einem polygenen Modell für Fettleibigkeit, zeigten, dass eine fettreiche Ernährung eine Akkumulation von LDs und hepatozelluläre Schäden verursacht. Diese Effekte wurden von einem Verlust der Autophagieeffizienz und einer verminderten Expression der Proteasomaler Untereinheiten begleitet. Ähnliche Effekte wurden in vitro in PA-beladenen HepG2-Zellen beobachtet. PA induziert LD-Akkumulation und verändert den Redoxstatus in Mitochondrien und im Endoplasmatische Retikulum (ER). Zusätzlich beeinflusst PA die Funktion beider proteolytischer Systeme (proteasomal und lysosomal) zeitabhängig nach 6- und 24-stündiger Behandlung. Um die Rolle des Proteasome und der Autophagie beim LD-Abbau unter PAinduzierten lipotoxischen Bedingungen zu untersuchen, wurden beide Systeme inhibiert oder induziert und die Veränderungen des LD-Gehalts analysiert. Dazu wurden die HepG2 Zellen wurden mit PA in Gegenwart des Autophagie-Aktivators Torin 1, des Autophagie-Inhibitors 3-Methyladenin, des Proteasom-Aktivators Ursolsäure und des Proteasom-Inhibitors Lactacystin behandelt. Die erhaltenen Daten aus unseren Modellen belegen, dass vorrangig Autophagie am Abbau der LDs beteiligt ist. Die PA-vermittelte Lipidakkumulation könnte auf ein Versagen der Autophagie hinweisen und zu einer Störung der Proteostase sowie einer weiteren LD-Stabilisierung und Anreicherung beitragen. Experimente mit dem natürlichen Autophagie-Aktivator Punicalagin weisen darauf hin, dass die PA-vermittelten lipotoxischen Wirkungen reduziert werden können. Insbesondere zeigen die Ergebnisse, dass Punicalagin die Expression von Autophagie-Proteinen erhält und durch PA-beeinträchtigten autophagischen Fluss wiederherstellt. Parallel dazu wird der durch PA-induzierte Gehalt an LD durch Punicalagin verringert. Zusammenfassend, liefern die Daten dieser Dissertation neue Einblicke in die Rolle des Proteasoms und des Autophagie-Lysosomalen Systems bei der PA-induzierten Lipotoxizität. Zudem werden die Autophagie-induzierenden Eigenschaften von Punicalagin aufgezeigt, die einen vielversprechenden Ansatz für die zukünftige Forschung zur hepatischen Lipotoxizität bieten. KW - HepG2 hepatocytes KW - autophagy KW - lipophagy KW - lysosome KW - palmitate KW - punicalagin KW - HepG2-Zellen KW - Autophagie KW - Lipophagie KW - Lysosom KW - Palmitat KW - Punicalagin Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-552385 ER -