TY - THES A1 - Neuendorf, Antje T1 - Studien zur Reinigung, Monomerisierung und Aggragation von Huntingtin : Exon 1 Proteinkonstrukten Y1 - 2010 CY - Potsdam ER - TY - THES A1 - Matthes, Annemarie T1 - Ein neues Verfahren für die Identifikation DNA-bindender Proteine in Chloroplasten Y1 - 2010 CY - Potsdam ER - TY - THES A1 - Ketmaier, Valerio T1 - Molecular biogeography of southern European species : Darstellung der publizierten Forschungsergebnissen unter Berücksichtigung des allgemeinen Kenntnisstandes und Einordnung in den wissenschaftlichen Gesamtzusammenhang Y1 - 2010 CY - Potsdam ER - TY - THES A1 - Petersen, Kerstin T1 - Genexpression in Plastiden: Funktionen plastidärer Introns und Produktion Zellwand-abbauender Enzyme Y1 - 2010 CY - Potsdam ER - TY - THES A1 - Pieritz, Janin T1 - Transport von Proteinen und mikro RNAs im Pholoem von Brassica napus und Arabidopsis thaliana Y1 - 2010 CY - Potsdam ER - TY - THES A1 - Mißler, Christine T1 - Einfluss der (Mikro-)Umgebung auf die Oct-3/4 Expression und das Differenzierungspotential muriner embryonaler Stammzellen (mESC) Y1 - 2010 CY - Potsdam ER - TY - THES A1 - Albus, Christin Anne T1 - Identifizierung und Charakterisierung neuer Proteine mit Funktionen in der Biogenese des Photosyntheseapparates Y1 - 2010 CY - Potsdam ER - TY - THES A1 - Renner, Armin T1 - Entwicklung und Validierung eines mikrofluidischen Systems zur Stimulation und Analyse chemotaktisch migrierender Zellen Y1 - 2010 CY - Potsdam ER - TY - THES A1 - Tan, Chongxiao T1 - Entwicklung von direkten, homogenen Immunoassays als Schnelltests zum Nachweis von Tetrahydrocannabinol in Speichelproben Y1 - 2010 CY - Potsdam ER - TY - THES A1 - Zrenner, Rita T1 - Molekularphysiologische Untersuchung primärer Stoffwechselwege : der Einfluss des Kohlenhydrat- und Nukleotidstoffwechsels auf das Pflanzenwachstum Y1 - 2010 ER - TY - THES A1 - Strehmel, Nadine T1 - GC-TOF-MS basierte Analyse von niedermolekularen Primär- und Sekundärmetaboliten agrarwirtschaftlich bedeutsamer Nutzpflanzen T1 - GC-TOF-MS based metabolite profiling of low molecular weight primary and secondary metabolites of agricultural meaningful crops N2 - Die Qualität von Nutzpflanzen ist von zahlreichen Einflussfaktoren wie beispielsweise Lagerbedingungen und Sorteneigenschaften abhängig. Um Qualitätsmängel zu minimieren und Absatzchancen von Nutzpflanzen zu steigern sind umfangreiche Analysen hinsichtlich ihrer stofflichen Zusammensetzung notwendig. Chromatographische Techniken gekoppelt an ein Massenspektrometer und die Kernspinresonanzspektroskopie wurden dafür bislang verwendet. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Gaschromatograph an ein Flugzeitmassenspektrometer (GC-TOF-MS) gekoppelt, um physiologische Prozesse bzw. Eigenschaften (die Schwarzfleckigkeit, die Chipsbräunung, das Physiologische Alter und die Keimhemmung) von Nutzpflanzen aufzuklären. Als Pflanzenmodell wurde dafür die Kartoffelknolle verwendet. Dazu wurden neue analytische Lösungsansätze entwickelt, die eine zielgerichtete Auswertung einer Vielzahl von Proben, die Etablierung einer umfangreichen Referenzspektrenbibliothek und die sichere Archivierung aller experimentellen Daten umfassen. Das Verfahren der Probenvorbereitung wurde soweit modifiziert, dass gering konzentrierte Substanzen mittels GC-TOF-MS analysiert werden können. Dadurch wurde das durch die Probenvorbereitung limitierte Substanzspektrum erweitert. Anhand dieser Lösungsansätze wurden physiologisch relevante Stoffwechselprodukte identifiziert, welche indikativ (klassifizierend) bzw. prädiktiv (vorhersagend) für die physiologischen Prozesse sind. Für die Schwarzfleckigkeitsneigung und die Chipseignung wurde jeweils ein biochemisches Modell zur Vorhersage dieser Prozesse aufgestellt und auf eine Züchtungspopulation übertragen. Ferner wurden für die Schwarzfleckigkeit Stoffwechselprodukte des Respirationsstoffwechsels identifiziert sowie Aminosäuren, Glycerollipide und Phenylpropanoide für das Physiologische Alter als relevant erachtet. Das physiologische Altern konnte durch die Anwendung höherer Temperaturen beschleunigt werden. Durch Anwendung von Keimhemmern (Kümmelöl, Chlorpropham) wurde eine Verzögerung des physiologischen Alterns beobachtet. Die Applikation von Kümmelöl erwies sich dabei als besonders vorteilhaft. Kümmelöl behandelte Knollen wiesen im Vergleich zu unbehandelten Knollen nur Veränderungen im Aminosäure-, Zucker- und Sekundärstoffwechsel auf. Chlorpropham behandelte Knollen wiesen einen ähnlichen Stoffwechsel wie die unbehandelten Knollen auf. Für die bislang noch nicht identifizierten Stoffwechselprodukte wurden im Rahmen dieser Arbeit das Verfahren der „gezielten An-/Abreicherung“, der „gepaarten NMR/GC-TOF-MS Analyse“ und das „Entscheidungsbaumverfahren“ entwickelt. Diese ermöglichen eine Klassifizierung von GC-MS Signalen im Hinblick auf ihre chemische Funktionalität. Das Verfahren der gekoppelten NMR/GC-TOF-MS Analyse erwies sich dabei als besonders erfolgversprechend, da es eine Aufklärung bislang unbekannter gaschromatographischer Signale ermöglicht. In der vorliegenden Arbeit wurden neue Stoffwechselprodukte in der Kartoffelknolle identifiziert, wodurch ein wertvoller Beitrag zur Analytik der Metabolomik geleistet wurde. N2 - Several factors influence the quality of crops. These include particular storage conditions and cultivar properties. Minimization of quality defects requires the employment of comprehensive metabolic analysis to enhance the marketing potential of crops. From this point of view chromatographic techniques coupled either with a mass spectrometer or the combination with nuclear magnetic resonance spectroscopy have been successfully applied to solve the main tasks. In the present work, a gas chromatograph was coupled to a time of flight mass spectrometer (GC-TOF-MS) to analyze physiological processes and attitudes of crops like black spot bruising, chips tanning, physiological aging, and sprouting inhibition. For this purpose the potato tuber was employed as a model plant. Therefore, new analytical approaches were developed comprising the targeted analysis of a multitude of samples, the establishment of a comprehensive mass spectral reference library and the built up of a secure archival storage system. Furthermore, the sample preparation protocol was modified to analyze trace components with the help of GC-TOF-MS as well. This helped to extend the discovery of more endogenous metabolites. These analytical approaches were required to identify physiological relevant indicative and predictive metabolites. Consequently, a biochemical model was build up for the process of black spot bruising and chips tanning respectively. These models could be applied to an unknown breeding progeny. Metabolites of the respiratory chain were identified as relevant for the process of black spot bruising whereas amino acids, lipids and phenylpropanoids were of high importance for the process of physiological aging.  The process of physiological aging could be accelerated while applying higher temperatures and could be delayed while applying sprouting inhibitors, like caraway oil and chlorpropham. Compared to chlorpropham, caraway oil exhibited more advantages with respect to storage attitudes although it caused significant changes in the amino acid, sugar and secondary metabolism during a common storage period. However, the chlorpropham treated tubers showed a similar phenotype in comparison to the control tubers. In addition, several methods were developed with respect to the classification of yet unidentified signals. These cover the decision tree process, the targeted enrichment and depletion of specific metabolites with the help of solid phase extraction and the paired NMR and GC-MS analyses. The paired NMR and GC-MS analysis appears very promising because it allows for the identification of unknown GC-MS signals. Thus, this work makes a valuable contribution to the analytics of the metabolome, as new metabolites could be identified which are of physiological relevance for the potato tuber. KW - Stoffwechselprodukt KW - Kartoffelknolle KW - Identifizierung KW - analytische Lösungsansätze KW - Biomarker KW - metabolite KW - potato tuber KW - identification KW - analytical approaches KW - biomarker Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-51238 ER - TY - THES A1 - Uhlig, Katja T1 - Untersuchungen PEG-basierter thermo-responsiver Polymeroberflächen zur Steuerung der Zelladhäsion T1 - Analysis of PEG-based thermo-responsive polymer surfaces to control cell adhesion N2 - Moderne Methoden für die Einzelzellanalyse werden dank der fortschreitenden Weiterentwicklung immer sensitiver. Dabei steigen jedoch auch die Anforderungen an das Probenmaterial. Viele Aufbereitungsprotokolle adhärenter Zellen beinhalten eine enzymatische Spaltung der Oberflächenproteine, um die Ablösung vom Zellkultursubstrat zu ermöglichen. Verschiedene Methoden, wie die Patch-Clamp-Technik oder eine auf der Markierung extrazellulärer Domänen von Membranproteinen basierende Durchflusszytometrie können dann nur noch eingeschränkt eingesetzt werden. Daher ist die Etablierung neuer Zellablösemethoden dringend notwendig. In der vorliegenden Arbeit werden erstmals PEG-basierte thermo-responsive Oberflächen erfolgreich für die Zellkultur eingesetzt. Dabei wird das zerstörungsfreie Ablösen verschiedener Zelllinien von den Oberflächen durch Temperatursenkung realisiert. Die Funktionalität der Oberflächen wird durch Variation der Polymerstruktur, sowie der Konzentration der Beschichtungslösung, durch Beschichtung der Oberflächen mit einem zelladhäsionsfördernden Protein (Fibronektin) und durch Adsorption zelladhäsionsvermittelnder Peptide (RGD) optimiert. Um den Zellablösungsprozess detaillierter zu untersuchen, wird hier zum ersten Mal der direkte Zellkontakt mit thermo-responsiven Oberflächen mittels oberflächensensitiver Mikroskopie (TIRAF) sichtbar gemacht. Mit dieser Technik sind die exakte Quantifizierung und die Analyse der Reduktion der Zelladhäsionsfläche während des Abkühlens möglich. Hierbei werden in Abhängigkeit von der Zelllinie Unterschiede im Zellverhalten während des Ablösens festgestellt: Zellen, wie eine Brustkrebszelllinie und eine Ovarzelllinie, die bekanntermaßen stärker mit ihrer Umgebung in Kontakt treten, vergrößern im Verlauf des Beobachtungszeitraumes den Abstand zwischen Zellmembran und Oberfläche, reduzieren jedoch ihre Zell-Substratkontaktfläche kaum. Mausfibroblasten hingegen verkleinern drastisch die Zelladhäsionsfläche. Der Ablösungsprozess wird vermutlich aktiv von den Zellen gesteuert. Diese Annahme wird durch zwei Beobachtungen gestützt: Erstens verläuft die Reduktion der Zelladhäsionsfläche bei Einschränkung des Zellmetabolismus durch eine Temperatursenkung auf 4 °C verzögert. Zweitens hinterlassen die Zellen Spuren, die nach dem Ablösen der Zellen auf den Oberflächen zurückbleiben. Mittels Kombination von TIRAF- und TIRF-Mikroskopie werden die Zelladhäsionsfläche und die Aktinstruktur gleichzeitig beobachtet. Die Verknüpfung beider Methoden stellt eine neue Möglichkeit dar, intrazelluläre Prozesse mit der Zellablösung von thermo-responsiven Oberflächen zu korrelieren. N2 - Modern methods for single-cell analysis are becoming increasingly sensitive. At the same time, requirements for the sample material are on the rise. Today, sample preparation of adherent cells usually includes steps of enzymatic treatment to digest surface proteins thus, inducing cell detachment from culture substrates. This strongly limits the application of different techniques like patch clamp or labelling of extracellular domains of membrane proteins for flow cytometry. Therefore, a new cell detachment method is urgently required. In the present work, new PEG-based thermo-responsive polymers are used for cell culture for the first time. Here, non-destructive detachment of different cell lines from polymer-coated surfaces is realised by controlled temperature reduction. The surface functionality is systematically optimised by varying the concentration of the coating solutions, by artificial surface coating of a cell adhesion-mediating protein (fibronectin) and by co-adsorption of a cell adhesion-mediating peptide (RGD). For detailed analysis of the cell detachment process, TIRF microscopy is used to directly visualise the cell contacts on the thermo-responsive surfaces. Using this technique allows both the quantification and analysis of the reduction of the cell adhesion area during sample cooling. Furthermore, for several cell lines, different behaviours in cell detachment are observed. Cells that have close contact to their substrate like MCF-7 breast cancer cell line and CHO-K1 ovary cells increase the distance between cell membrane and surface, but there is only little decrease of cell-substrate adhesion area. In contrast, L929 fibroblasts reduce the cell adhesion area drastically. Furthermore, the hypothesis that the cell detachment is an active process is shown by lowering the cell metabolism by temperature reduction to 4 °C and by the cell traces that are left behind after rinsing the surfaces. A combination of TIRAF and TIRF enables visualising the cell adhesion area and actin structures. Measuring both parameters simultaneously opens up new possibilities to correlate intracellular and cell detachment processes on thermo-responsive surfaces. KW - thermo-responsive Polymere KW - Polyethylenglykol KW - TIRF KW - Zelladhäsion KW - thermo-responsive polymers KW - polyethylene glycol KW - TIRF KW - cell adhesion Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-47784 ER - TY - THES A1 - Fiedler, Christian T1 - Die Strukturbildung der beta-Helix in der Pektatlyase Pel-15 T1 - The structure formation of the beta-helix in the pectate lyase Pel-15 N2 - Pektatlyase (Pel-15) aus dem alkalophilen Bodenbakterium Bacillus spec. KSM-P15 ist mit 197 Aminosäuren eines der kleinsten, bekannten β-3-Solenoidproteine. Sie spaltet Polygalakturonsäurederivate in einem Ca2+-abhängigen β-Eliminierungsprozess. Wie bei allen Proteinen dieser Enzymfamilie ist auch die Polypeptidkette von Pel-15 zu einer einsträngigen, rechtsgängigen, parallelen β-Helix aufgewunden. In diesem Strukturmotiv enthält jede Windung drei β-Stränge, die jeweils durch flexible Schleifenbereiche miteinander verbunden sind. Insgesamt acht Windungen stapeln sich in Pel-15 übereinander und bilden entlang der Helixachse flächige, parallele β-Faltblätter aus. Im Bereich dieser β-Faltblätter existiert ein ausgedehntes Netzwerk von Wasserstoffbrückenbindungen, durch das der hydrophobe Kern, der sich im Inneren der β-Helix befindet, vom umgebenden Lösungsmittel abgeschirmt wird. Besondere Abschlussstrukturen an beiden Enden der β-Helix, wie sie typischerweise bei anderen Ver-tretern dieser Strukturklasse ausgeprägt werden, sind in Pel-15 nicht zu beobachten. Stattdessen sind die terminalen Bereiche der β-Helix über Salzbrücken und hydrophobe Seitenkettenkontakte stabilisiert. In der vorliegenden Dissertation wurde die Pektatlyase Pel-15 hinsichtlich ihres Faltungsgleichgewichtes, ihrer enzymatischen Aktivität und der Kinetik ihrer Strukturbildung charakterisiert. In eine evolutionär konservierte Helixwindung wurden destabilisierende Mutationen eingeführt, und deren Auswirkungen mittels spektroskopischer Methoden analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass Pel-15 in Gegenwart des Denaturierungsmittels Guanidiniumhydrochlorid einen hyperfluoreszenten Gleichgewichtsustand (HF) populiert, der nach Messungen von Faltungs- und Entfaltungskinetiken ein konformationelles Ensemble aus den Zuständen HFslow und HFfast darstellt. Diese HF-Zustände sind durch eine hohe Aktivierungsbarriere voneinander getrennt. In Rückfaltungsexperimenten populieren nur etwa 80 % der faltenden Moleküle den Zwischenzustand HFslow, der mit einer Zeitkonstante von ca. 100 s zu HFfast weiterreagiert. Die Denaturierungsmittelabhängigkeit dieser Reaktion ist sehr gering, was eine trans-/cis-Prolylisomerisierung als geschwindigkeitslimitierenden Schritt nahelegt. Die Existenz eines cis-Peptides in der nativen Struktur macht es erforderlich, den denaturierten Zustand als ein Ensemble kinetisch separierter Konformationen, kurz: DSE, zu betrachten, das durch die Spezies Ufast und Uslow populiert wird. Nach dem in dieser Arbeit aufgestellten „Minimalmodell der Pel-15 Faltung“ stehen die HF-Spezies (HFslow, HFfast) mit den Konformationen des DSE in einem thermodynamischen Kreisprozess. Das Modell positioniert HFfast und die native Konformation N auf die „native Seite“ der Aktivierungsbarriere und trägt damit der Tatsache Rechnung, dass die Gleichgewichtseinstellung zwischen diesen Spezies zu schnell ist, um mit manuellen Techniken erfasst zu werden. Die hochaffine Bindung von Ca2+ (Kd = 10 μM) verschiebt sich das Faltungsgleichgewicht bereits in Gegenwart von 1 mM CaCl2 soweit auf die Seite des nativen Zustandes, das HFfast nicht länger nachweisbar ist. Entgegen anfänglicher Vermutungen kommt einer lokalen, evolutionär konservierten Disulfidbrücke im Zentrum der β-Helix eine wichtige Stabilisierungsfunktion zu. Die Disulfidbrücke befindet sich in einem kurzen Schleifenbereich der β-Helix nahe dem aktiven Zentrum. Obwohl ihr Austausch gegen die Reste Val und Ala die freie Stabilisierungsenthalpie des Proteins um ca. 10 kJ/mol reduziert, lässt die Struktur im Bereich der Mutationsstelle keine gravierende Veränderung erkennen. Auch die katalytisch relevante Ca2+-Bindungsaffinität bleibt unbeeinflusst; dennoch zeigen Enzymaktivitätstests für VA-Mutanten eine Reduktion der enzymatischen Aktivität um fast 50 % an. Die evolutionär konservierte Helixwindung im Allgemeinen und die in ihr enthaltene Disulfidbrücke im Besonderen müssen nach den vorliegenden Ergebnissen also eine zentrale Funktion sowohl für die Struktur des katalytischen Zentrums als auch für die Strukturbildung der β-Helix während der Faltungsreaktion besitzen. Die Ergebnisse dieser Arbeit finden in mehreren Punkten Anklang an Faltungseigenschaften, die für andere β -Helixproteine beschrieben wurden. Vor allem aber prädestinieren sie Pel-15 als ein neues, β-helikales Modellprotein. Aufgrund seiner einfachen Topologie, seiner niedrigen Windungszahl und seiner hohen thermodynamischen Stabilität ist Pel-15 sehr gut geeignet, die Determinanten von Stabilität und Strukturbildung des parallelen β-Helix-Motivs in einer Auflösung zu studieren, die aufgrund der Komplexität bestehender β-helikaler Modellsysteme bislang nicht zur Verfügung stand. N2 - Pectate lyase Pel-15 was isolated from alcaliphlic Bacillus spec. strain KSM-P15. Like all pectate lyases Pel-15 binds and subsequently cleaves polygalacturonic acid, the main pectic compound in plant cell walls and middle lamellae, in a Ca2+ dependent beta-elimination reaction. With 197 amino acids and a molecular mass of only 21 kDa the protein is one of the smallest right-handed parallel beta-helical proteins known today. Polypeptide chains that are classified into this structural family adopt super-helical folds in which each “solenoid stack” consists of three beta-structured regions that are connected by flexible turn segments. Along its longitudinal axis the right-handed parallel beta-helix thus comprises three elongated parallel beta-sheets that are stabilized by an extensive network of hydrogen bonds wrapping around the densely packed hydrophobic core. Together with the shield-like arrangement of hydrogen bonds this hydrophobic core is considered as the main contributor to an exceptionally high stability that is a common feature of all beta-helical proteins. In contrast to most right-handed parallel beta-helices, Pel-15 is devoid of any terminal capping domains and laterally associated secondary structure. Therefore, this protein is considered to be a promising model protein of a pure beta-helix which will help to understand the determinants of both parallel beta-sheet formation and stability. In the dissertation at hand optical spectroscopic methods were used to assess the enzymatic activity, the folding/unfolding equilibrium and the kinetic mechanism of structure formation in neutral buffered solutions. Results indicate that Pel-15 populates a hyper-fluorescent equilibrium intermediate (HF) that is effectively populated in presence of the denaturing agent guanidinium hydrochloride (GdmCl). According to kinetic folding and unfolding experiments HF is not only an essential on-pathway intermediate but has to be considered as a conformational ensemble in which several hyperfluorescent states are in thermodynamic equilibrium with each other. According to their existence in kinetic folding trajectories these different HF-species were termed HFslow and HFfast. The activation energy between both states is remarkably high leading to a time constant of about 100 seconds for the reaction HFslow ⇆ HFfast. Since native Pel-15 contains an energetically disfavoured cis-prolyl peptide between A59 and P60 it is proposed that HFslow and HFfast differ in their prolyl peptide conformations. Two main results emerge from this dissertation. First, an extensive study of the Pel-15 folding- and unfolding behaviour facilitated the proposal of a “minimal folding model”. According to this model the HF-states and the according denatured species Uslow and Ufast are aligned into a thermodynamic circle. This implies that unfolded polypeptide chains reach the HF-ensemble via parallel folding trajectories. Since the native conformation N together with HFfast are on the same side of the activation barrier, it is the reaction HFslow ⇆ HFfast that is the rate limiting step in the folding reaction of Pel-15. Second, the importance of an evolutionarily conserved disulfide bond in the central region of Pel-15 was tested by site directed mutagenesis and subsequent spectroscopic characterization. The exchange of the disulfide against a hydrophobic pair of alanine and valine decreases the folding free energy by about 10 kJ/mol. Although this value is unexpectedly high, structural perturbations around both mutational positions are small as was deduced from X-Ray crystallography. Interestingly, the stability decrease is accompanied by a major loss of enzymatic activity while the Ca2+ binding affinity is not significantly affected. It is therefore concluded that the allosterically relevant disulfide bond stabilizes long-range interactions that stabilize several adjacent solenoid turns near the N-terminus of the protein. Indeed, planar stacking interactions are perturbed and flexibility of N-terminal loops is increased once the disulfide bond is removed. This dissertation establishes Pel-15 as a novel beta-helical model protein and – even more important – smoothes the way for a generally accepted perspective on the formation and stability of parallel beta-sheet proteins. KW - Rechtsgängige parallele beta-Helix KW - Pektatlyase KW - thermodynamische Stabilität KW - Dreizustandsmodell KW - right-handed parallel beta-helix KW - thermodynamic stability KW - protein folding KW - pectate lyase KW - three-state model Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-47250 ER - TY - THES A1 - Lengefeld, Jan T1 - Zirkulardichroismus-Messungen mit Synchrotronstrahlung am BESSY : Möglichkeiten und Grenzen bei der Untersuchung biologischer Proben T1 - Synchrotron radiation circular dichroism measurements at BESSY : potentials and limitations investigating biological samples N2 - In dieser Arbeit wurden die Möglichkeiten und Grenzen für Zirkulardichroismus-Messungen mit Synchrotronstrahlung untersucht. Dazu wurde ein Messaufbau für Zirkulardichroismus-Messungen an zwei Strahlrohren am Berliner Elektronenspeicherring für Synchrotronstrahlung eingesetzt, die für Messungen im Bereich des ultravioletten Lichts geeignet sind. Eigenschaften der Strahlrohre und des Messaufbau wurden in einigen wichtigen Punkten mit kommerziellen Zirkulardichroismus-Spektrometern verglichen. Der Schwerpunkt lag auf der Ausdehnung des zugänglichen Wellenlängenbereichs unterhalb von 180 nm zur Untersuchung des Zirkulardichroismus von Proteinen in diesem Bereich. In diesem Bereich ist es nicht nur die Lichtquelle sondern vor allem die Absorption des Lichts durch Wasser, die den Messbereich bei der Messung biologischer Proben in wässriger Lösung einschränkt. Es wurden Bedingungen gefunden, unter denen der Messbereich auf etwa 160 nm, in einigen Fällen bis auf 130 nm ausgedehnt werden konnte. Dazu musste die Pfadlänge deutlich reduziert werden und verschieden Probenküvetten wurden getestet. Der Einfluss der dabei auftretenden Spannungsdoppelbrechung in den Probenküvetten auf das Messsignal konnte mit einem alternativen Messaufbau deutlich reduziert werden. Systematische Fehler im Messsignal und auftretende Strahlenschäden begrenzen jedoch die Zuverlässigkeit der gemessenen Spektren. Bei Proteinfilmen schränkt die Absorption von Wasser den Messbereich kaum ein. Es wurden jedoch meist deutliche Unterschiede zwischen den Spektren von Proteinfilmen und den Spektren von Proteinen in wässriger Lösung festgestellt. Solange diese Unterschiede nicht minimiert werden können, stellen Proteinfilme keine praktikable Alternative zu Messungen in wässriger Lösung dar. N2 - The possibilities and limitations for synchrotron radiation circular dichroism measurements were investigated in this thesis. Therefore an experimental setup to measure circular dichroism was used at two beamlines at the “Berliner Elektronenspeicherring für Synchrotronstrahlung”(BESSY), which were suitable in the ultraviolet range of light. Properties of the beamlines and the experimental setup were compared to those of commercial circular dichroism spectrometer in some important points. The focus was on the extension of the accessible wavelength range below 180 nm, with the aim to investigate the circular dichroism of proteins in that range. It is not only the light source that limits measurements with aqueous solutions in that range, but mainly the absorption of the light by water. Conditions were found under which the wavelength range was extended to about 160 nm, in some cases even to 130 nm. To achieve this, a significant reduction of the pathlength was necessary. Several sample cells were tested for their usability. The effect of birefringence within the sample cells on the circular dichroism signal could be reduced strongly with an alternative experimental setup. However systematic errors in the circular dichroism signal and appearing radiation damage of the proteins limits the reliability of the measured spectra. By using protein films, the light absorption by water is not a problem anymore. However, significant differences between the circular dichroism spectra of protein films and proteins in aqueous solution occurred in most of the cases. Unless these differences can be eliminated, measuring protein films is not an alternative to measurements in aqueous solution. KW - Synchrotronstrahlung KW - Zirkulardichroismus KW - BESSY KW - Wasserabsorption KW - Protein KW - synchrotron radiation KW - circular dichroism KW - BESSY KW - water absorbance KW - protein Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-44263 ER - TY - THES A1 - Sieber, Matthias T1 - Modulatoren des Calcineurin-NFATc-Signalweges in humanen TH-Zellen T1 - Modulators of the calcineurin-NFATc signalling pathway in human T helper cells N2 - Die Ca2+/Calmodulin-aktivierte Serin/Threonin-Phosphatase Calcineurin ist ein Schlüsselmolekül des T-Zell-Rezeptorabhängigen Signalnetzwerkes. Calcineurin aktiviert die Transkriptionsfaktoren der NFATc-Familie durch Dephosphorylierung und reguliert darüber die Expression wichtiger Zytokine und Oberflächenproteine. Die Aktivität von Calcineurin wird durch zahlreiche endogene Proteine moduliert und ist Angriffspunkt der immunsuppressiven Substanzen Cyclosporin A und FK506. In dieser Arbeit wurde der alternative niedermolekulare Calcineurin-NFATc-Inhibitor NCI3 hinsichtlich seiner Effekte auf T-Zell-Rezeptor-abhängige Signalwege charakterisiert. Die Ergebnisse zeigen, daß das Pyrazolopyrimidinderivat NCI3 nichttoxisch und zellmembranpermeabel ist. In T-Zell-Rezeptor-stimulierten primären humanen TH-Zellen unterdrückt NCI3 die Proliferation und IL-2-Produktion (IC50-Wert ~4 µM), da die Dephosphorylierung von NFATc und die anschließende nukleäre Translokation gehemmt wird. NCI3 inhibiert die calcineurinabhängige NFAT- und NF-κB-, aber nicht die AP-1-kontrollierte Reprtergenexpression, in mikromolaren Konzentrationen (IC50-Werte 2 bzw. 7 µM). Im Gegensatz zu Cyclosporin A stört NCI3 nicht die Phosphataseaktivität von Calcineurin, sondern interferiert mit der Calcineurin-NFATc-Bindung. Ein wichtiges endogenes Modulatorprotein für die Calcineurinaktivität ist RCAN1, das vermutlich den Calcineurin-NFATc-Signalweg über einen negativen Rückkopplungsmechanismus reguliert. Hier wurde gezeigt, daß RCAN1 in humanen TH-Zellen exprimiert wird. Die Spleißvariante RCAN1-1 ist in ruhenden T-Zellen basal exprimiert und wird nicht durch T-Zell-Rezeptor-Stimulierung in seiner Expression verändert. RCAN1-4 dagegen ist in ruhenden Zellen kaum zu detektieren und wird stimulierungsabhängig induziert. Durch die Verwendung Calcineurin-NFATc-spezifischer Inhibitoren wie NCI3 wurde gezeigt, daß die RCAN1-4-Induktion durch diesen Signalweg limitiert ist. Die in dieser Arbeit gewonnenen Daten und Erkenntnisse tragen dazu bei, das Verständnis der Funktion und Regulation von Calcineurin in T-Zellen zu vertiefen. N2 - The Ca2+/calmodulin dependent serine/threonine phosphatase calcineurin is a key molecule in the T cell receptor dependent signalling network. Calcineurin dephosphorylates and thereby activates the transcription factors of the NFATc family that, among others, control the expression of important cytokines and cell surface molecules. The activity of Calcineurin is modulated by several endogenous proteins and is inhibited by the immunosuppressants cyclosporine A and FK506. Here, the novel low molecular weight inhibitor NCI3 was characterized in respect to its effects on T cell receptor dependent signalling. The results of this work show, that the pyrazolopyrimidine derivate NCI3 is nontoxic and permeates the cell membrane. Upon TCR stimulation NCI3 suppresses T cell proliferation and IL-2 production of primary human TH cells with IC50 values of ~4 µM by blocking the dephosphorylation and subsequent nuclear translocation of NFATc. NCI3 conse-quently inhibits calcineurin dependent NFAT- and NF-κB-, but not AP-1-controlled reporter gene expression, in micromolar concentrations (IC50 values 2 and 7 µM, respectively). In opposite to cyclosporine A and FK506, NCI3 does not interfere with the phosphatase activity of calcineurin but rather disturbs the calcineurin-NFATc interaction. A major endogenous modulator of calcineurin is the protein RCAN1, which is supposed to regulate calcineurin-NFATc signalling in a negative feedback loop. The presented data show that RCAN1 is expressed in human TH cells. The splice variant RCAN1-1 is basally expressed in resting T cells, and its expression levels are not changed by T cell receptor stimulation. Expression of RCAN1-4, on the other hand, is nearly undetectable in resting TH cells and is induced upon cell stimulation. By using calcineurin-NFATc specific inhibitors such as NCI3 it could be shown that RCAN1-4 induction is limited by this pathway. This work provides a comprehensive characterization of the novel inhibitor NCI3 and insights into the regulation of calcineurin by RCAN1 in human TH cells. KW - Calcineurin KW - NFAT KW - RCAN1 KW - Cyclosporin A KW - NCI3 KW - calcineurin KW - NFAT KW - RCAN1 KW - cyclosporin A KW - NCI3 Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-44676 ER -