TY  - THES
A1  - Nell, Sandra
T1  - Vitamin E und der vesikuläre Transport : Untersuchungen zu den genregulatorischen Funktionen von Vitamin E mittels Microarray- und real time PCR-Analysen in der Maus und funktionellen in vitro Assays in RBL-2H3 Zellen
T1  - Vitamin E and the vesicular transport : examination of the generegulatory functions of vitamin E using microarrays and real time PCR analyses in the mouse and functional in vitro assays in RBL-2H3 cells
N2  - Vitamin E wird immer noch als das wichtigste lipophile Antioxidanz in biologischen Membranen betrachtet. In den letzten Jahren hat sich jedoch der Schwerpunkt der Vitamin E-Forschung hin zu den nicht-antioxidativen Funktionen verlagert. Besonderes Interesse gilt dabei dem α-Tocopherol, der häufigsten Vitamin E-Form im Gewebe von Säugetieren, und seiner Rolle bei der Regulation der Genexpression. Das Ziel dieser Dissertation war die Untersuchung der genregulatorischen Funktionen von α-Tocoperol und die Identifizierung α-Tocopherol-sensitiver Gene in vivo. Zu diesem Zweck wurden Mäuse mit verschiedenen Mengen α-Tocopherol gefüttert. Die Analyse der hepatischen Genexpression mit Hilfe von DNA-Microarrays identifizierte 387 α-Tocopherol-sensitive Gene. Funktionelle Clusteranalysen der differentiell exprimierten Gene zeigten einen Einfluss von α-Tocooherol auf zelluläre Transportprozesse. Besonders solche Gene, die an vesikulären Transportvorgängen beteiligt sind, wurden größtenteils durch α-Tocopherol hochreguliert. Für Syntaxin 1C, Vesicle-associated membrane protein 1, N-ethylmaleimide-sensitive factor and Syntaxin binding protein 1 konnte eine erhöhte Expression mittels real time PCR bestätigt werden. Ein funktioneller Einfluss von α-Tocopherol auf vesikuläre Transportprozesse konnte mit Hilfe des in vitro β-Hexosaminidase Assays in der sekretorischen Mastzelllinie RBL-2H3 gezeigt werden. Die Inkubation der Zellen mit α-Tocopherol resultierte in einer konzentrationsabhängigen Erhöhung der PMA/Ionomycin-stimulierten Sekretion der β-Hexosaminidase. Eine erhöhte Expression ausgewählter Gene, die an der Degranulation beteiligt sind, konnte nicht beobachtet werden. Damit schien ein direkter genregulatorischer Effekt von α-Tocopherol eher unwahrscheinlich. Da eine erhöhte Sekretion auch mit β-Tocopherol aber nicht mit Trolox, einem hydrophilen Vitamin E-Analogon, gefunden wurde, wurde vermutet, dass α-Tocopherol die Degranulation möglicherweise durch seine membranständige Lokalisation beeinflussen könnte. Die Inkubation der Zellen mit α-Tocopherol resultierte in einer veränderten Verteilung des Gangliosids GM1, einem Lipid raft Marker. Es wird angenommen, dass diese Membranmikrodomänen als Plattformen für Signaltransduktionsvorgänge fungieren. Ein möglicher Einfluss von Vitamin E auf die Rekrutierung/Translokation von Signalproteinen in Membranmikrodomänen könnte die beobachteten Effekte erklären. Eine Rolle von α-Tocopherol im vesikulären Transport könnte nicht nur seine eigene Absorption und seinen Transport beeinflussen, sondern auch eine Erklärung für die bei schwerer Vitamin E-Defizienz auftretenden neuronalen Dysfunktionen bieten. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die α-Tocopheroltransferprotein (Ttpa) Knockout-Maus als genetisches Modell für Vitamin E-Defizienz verwendet, um den Effekt von Ttpa auf die Genexpression und die Gewebeverteilung von α-Tocopherol zu analysieren. Ttpa ist ein cytosolisches Protein, das für die selektive Retention von α-Tocopherol in der Leber verantwortlich ist. Die Ttpa-Defizienz resultierte in sehr geringen α-Tocopherol-Konzentrationen im Plasma und den extrahepatischen Geweben. Die Analyse der α-Tocopherol-Gehalte im Gehirn wies auf eine Rolle von Ttpa bei der α-Tocopherol-Aufnahme ins Gehirn hin.
N2  - Vitamin E is still considered the most important lipid-soluble antioxidant within biological membranes. However, in the last years the non-antioxidant functions of vitamin E have become the focus of vitamin E research. From the eight members of the vitamin E family, specific emphasis is given to α-tocopherol, the most abundant vitamin E form in mammalian tissues, and its role in the regulation of gene expression. The aim of this thesis was the analysis of the gene regulatory functions of α-tocopherol and the identification of α-tocopherol sensitive genes in vivo. For this purpose mice were fed diets differing in α-tocopherol content. The analysis of hepatic gene expression using DNA microarrays identified 387 α-tocopherol-sensitive genes. Functional cluster analyses of these differentially expressed genes demonstrated an influence of α-tocopherol on cellular transport processes. Especially the expression of genes involved in vesicular trafficking was largely upregulated by α-tocopherol. Upregulation of syntaxin 1C, vesicle-associated membrane protein 1, N-ethylmaleimide-sensitive factor and syntaxin binding protein 1 was verified by real time PCR. A role of α-tocopherol in exocytosis was shown by the in vitro β-hexosaminidase release assay in the secretory mast cell line RBL-2H3. Incubation with α-tocopherol resulted in a concentration dependent increase of PMA/ionomycin-stimulated secretion of β-hexosaminidase. Induction of selected genes involved in degranulation was not observed at any time point. Thus, a direct gene-regulatory effect of α-tocopherol seemed rather unlikely. Since increased secretion was also observed with ß-tocopherol but not with trolox, a water-soluble analog of vitamin E, it was hypothesized that α-tocopherol might affect degranulation through its localization at the plasma membrane. Incubation of cells with α-tocopherol changed the distribution of the gangliosid GM1, a Lipid raft marker. These membrane microdomains are assumed to function as signaling platforms. An possible influence of vitamin E on the recruitment/translocation of signaling proteins into membrane microdomains could explain the observed effects. A role of α-tocopherol in the vesicular transport might not only affect its own absorption and transport but also explain the neural dysfunctions observed in severe α-tocopherol deficiency. In the second part of this dissertation the α-tocopherol transfer protein (Ttpa) knockout-mouse as a model of genetic vitamin E deficiency was used to analyze the effect of Ttpa gene expression and tissue distribution of α-tocopherol. Ttpa is a cytosolic protein, which is responsible for the selective retention of α-tocopherol in the liver. Its deficiency resulted in very low α-tocopherol concentrations in plasma and extrahepatic tissues. Analysis of α-tocopherol contents in brain indicated a role for Ttpa in the uptake of α-tocopherol into the brain.
KW  - Vitamin E
KW  - Microarray
KW  - Genregulation
KW  - vesikulärer Transport
KW  - α-Tocopheroltransferprotein (Ttpa)
KW  - vitamin E
KW  - microarray
KW  - gene regulation
KW  - vesicular transport
KW  - alpha-tocopherol transfer protein (Ttpa)
Y1  - 2009
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-35710
ER  - 
TY  - THES
A1  - Boeuf, Stéphane
T1  - Comparative study of gene expression during the differentiation of white and brown preadipocytes
N2  - Einleitung Säugetiere haben zwei verschiedene Arten von Fettgewebe: das weiße Fettgewebe, welches vorwiegend zur Lipidspeicherung dient, und das braune Fettgewebe, welches sich durch seine Fähigkeit zur zitterfreien Thermogenese auszeichnet. Weiße und braune Adipozyten sind beide mesodermalen Ursprungs. Die Mechanismen, die zur Entwicklung von Vorläuferzellen in den weißen oder braunen Fettzellphenotyp führen, sind jedoch unbekannt. Durch verschiedene experimentelle Ansätze konnte gezeigt werden, daß diese Adipocyten vermutlich durch die Differenzierung zweier Typen unterschiedlicher Vorläuferzellen entstehen: weiße und braune Preadipozyten. Von dieser Hypothese ausgehend, war das Ziel dieser Studie, die Genexpression weißer und brauner Preadipozyten auf Unterschiede systematisch zu analysieren.  Methoden Die zu vergleichenden Zellen wurden aus primären Zellkulturen weißer und brauner Preadipozyten des dsungarischen Zwerghamsters gewonnen. „Representational Difference Analysis“ wurde angewandt, um potentiell unterschiedlich exprimierte Gene zu isolieren. Die daraus resultierenden cDNA Fragmente von Kandidatengenen wurden mit Hilfe der Microarraytechnik untersucht. Die Expression dieser Gene wurde in braunen und weißen Fettzellen in verschiedenen Differenzierungsstadien und in braunem und weißem Fettgewebe verglichen.  Ergebnisse 12 Gene, die in braunen und weißen Preadipozyten unterschiedlich exprimiert werden, konnten identifiziert werden. Drei Komplement Faktoren und eine Fettsäuren Desaturase werden in weißen Preadipozyten höher exprimiert; drei Struktur Gene (Fibronectin, Metargidin und a Actinin 4), drei Gene verbunden mit transkriptioneller Regulation (Necdin, Vigilin und das „small nuclear ribonucleoprotein polypeptide A“) sowie zwei Gene unbekannter Funktion werden in braunen Preadipozyten höher exprimiert. Mittels Clusteranalyse (oder Gruppenanalyse) wurden die gesamten Genexpressionsdaten charakterisiert. Dabei konnten die Gene in 4 typischen Expressionsmuster aufgeteilt werden: in weißen Preadipozyten höher exprimierte Gene, in braunen Preadipozyten höher exprimierte Gene, während der Differenzierung herunter regulierte Gene und während der Differenzierung hoch regulierte Gene.  Schlußfolgerungen In dieser Studie konnte gezeigt werden, daß weiße und braune Preadipozyten aufgrund der Expression verschiedener Gene unterschieden werden können. Es wurden mehrere Kandidatengene zur Bestimmung weißer und brauner Preadipozyten identifiziert. Außerdem geht aus den Genexpressionsdaten hervor, daß funktionell unterschiedliche Gruppen von Genen eine wichtige Rolle bei der Differenzierung von weißen und braunen Preadipozyten spielen könnten, wie z.B. Gene des Komplementsystems und der extrazellulären Matrix.
N2  - Introduction Mammals have two types of adipose tissue: the lipid storing white adipose tissue and the brown adipose tissue characterised by its capacity for non-shivering thermogenesis. White and brown adipocytes have the same origin in mesodermal stem cells. Yet nothing is known so far about the commitment of precursor cells to the white and brown adipose lineage. Several experimental approaches indicate that they originate from the differentiation of two distinct types of precursor cells, white and brown preadipocytes. Based on this hypothesis, the aim of this study was to analyse the gene expression of white and brown preadipocytes in a systematic approach.   Experimental approach The white and brown preadipocytes to compare were obtained from primary cell cultures of preadipocytes from the Djungarian dwarf hamster. Representational difference analysis was used to isolate genes potentially differentially expressed between the two cell types. The thus obtained cDNA libraries were spotted on microarrays for a large scale gene expression analysis in cultured preadipocytes and adipocytes and in tissue samples.  Results 4 genes with higher expression in white preadipocytes (3 members of the complement system and a fatty acid desaturase) and 8 with higher expression in brown preadipocytes were identified. From the latter 3 coded for structural proteins (fibronectin, metargidin and a actinin 4), 3 for proteins involved in transcriptional regulation (necdin, vigilin and the small nuclear ribonucleoprotein polypeptide A) and 2 are of unknown function. Cluster analysis was applied to the gene expression data in order to characterise them and led to the identification of four major typical expression profiles: genes up-regulated during differentiation, genes down-regulated during differentiation, genes higher expressed in white preadipocytes and genes higher expressed in brown preadipocytes.  Conclusion This study shows that white and brown preadipocytes can be distinguished by different expression levels of several genes. These results draw attention to interesting candidate genes for the determination of white and brown preadipocytes (necdin, vigilin and others) and furthermore indicate that potential importance of several functional groups in the differentiation of white and brown preadipocytes, mainly the complement system and extracellular matrix.
KW  - Säugetiere ; Fettgewebe ; Zelldifferenzierung ; Genexpression
KW  - Preadipozyt
KW  - Adipozyt
KW  - Fettzelle
KW  - braunes Fettgewebe
KW  - Differenzierung
KW  - Genexpression
KW  - Microarray
KW  - preadipocyte
KW  - adipocyte
KW  - brown adipose tissue
KW  - differentiation
KW  - gene expression
KW  - microarray
Y1  - 2002
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0000542
ER  -