TY - THES A1 - Förste, Stefanie T1 - Assemblierung von Proteinkomplexen in vitro und in vivo T1 - Assembly of protein complexes in vitro and in vivo N2 - Proteine sind an praktisch allen Prozessen in lebenden Zellen maßgeblich beteiligt. Auch in der Biotechnologie werden Proteine in vielfältiger Weise eingesetzt. Ein Protein besteht aus einer Kette von Aminosäuren. Häufig lagern sich mehrere dieser Ketten zu größeren Strukturen und Funktionseinheiten, sogenannten Proteinkomplexen, zusammen. Kürzlich wurde gezeigt, dass eine Proteinkomplexbildung bereits während der Biosynthese der Proteine (co-translational) stattfinden kann und nicht stets erst danach (post-translational) erfolgt. Da Fehlassemblierungen von Proteinen zu Funktionsverlusten und adversen Effekten führen, ist eine präzise und verlässliche Proteinkomplexbildung sowohl für zelluläre Prozesse als auch für biotechnologische Anwendungen essenziell. Mit experimentellen Methoden lassen sich zwar u.a. die Stöchiometrie und die Struktur von Proteinkomplexen bestimmen, jedoch bisher nicht die Dynamik der Komplexbildung auf unterschiedlichen Zeitskalen. Daher sind grundlegende Mechanismen der Proteinkomplexbildung noch nicht vollständig verstanden. Die hier vorgestellte, auf experimentellen Erkenntnissen aufbauende, computergestützte Modellierung der Proteinkomplexbildung erlaubt eine umfassende Analyse des Einflusses physikalisch-chemischer Parameter auf den Assemblierungsprozess. Die Modelle bilden möglichst realistisch die experimentellen Systeme der Kooperationspartner (Bar-Ziv, Weizmann-Institut, Israel; Bukau und Kramer, Universität Heidelberg) ab, um damit die Assemblierung von Proteinkomplexen einerseits in einem quasi-zweidimensionalen synthetischen Expressionssystem (in vitro) und andererseits im Bakterium Escherichia coli (in vivo) untersuchen zu können. Mit Hilfe eines vereinfachten Expressionssystems, in dem die Proteine nur an die Chip-Oberfläche, aber nicht aneinander binden können, wird das theoretische Modell parametrisiert. In diesem vereinfachten in-vitro-System durchläuft die Effizienz der Komplexbildung drei Regime – ein bindedominiertes Regime, ein Mischregime und ein produktionsdominiertes Regime. Ihr Maximum erreicht die Effizienz dabei kurz nach dem Übergang vom bindedominierten ins Mischregime und fällt anschließend monoton ab. Sowohl im nicht-vereinfachten in-vitro- als auch im in-vivo-System koexistieren je zwei konkurrierende Assemblierungspfade: Im in-vitro-System erfolgt die Komplexbildung entweder spontan in wässriger Lösung (Lösungsassemblierung) oder aber in einer definierten Schrittfolge an der Chip-Oberfläche (Oberflächenassemblierung); Im in-vivo-System konkurrieren hingegen die co- und die post-translationale Komplexbildung. Es zeigt sich, dass die Dominanz der Assemblierungspfade im in-vitro-System zeitabhängig ist und u.a. durch die Limitierung und Stärke der Bindestellen auf der Chip-Oberfläche beeinflusst werden kann. Im in-vivo-System hat der räumliche Abstand zwischen den Syntheseorten der beiden Proteinkomponenten nur dann einen Einfluss auf die Komplexbildung, wenn die Untereinheiten schnell degradieren. In diesem Fall dominiert die co-translationale Assemblierung auch auf kurzen Zeitskalen deutlich, wohingegen es bei stabilen Untereinheiten zu einem Wechsel von der Dominanz der post- hin zu einer geringen Dominanz der co-translationalen Assemblierung kommt. Mit den in-silico-Modellen lässt sich neben der Dynamik u.a. auch die Lokalisierung der Komplexbildung und -bindung darstellen, was einen Vergleich der theoretischen Vorhersagen mit experimentellen Daten und somit eine Validierung der Modelle ermöglicht. Der hier präsentierte in-silico Ansatz ergänzt die experimentellen Methoden, und erlaubt so, deren Ergebnisse zu interpretieren und neue Erkenntnisse davon abzuleiten. KW - Assemblierung KW - Proteine KW - Multiproteinkomplexbildung KW - co-translationale Assemblierung KW - post-translationale Assemblierung KW - Lösung KW - Oberfläche KW - Lösungsassemblierung KW - Oberflächenassemblierung KW - co-translational KW - post-translational KW - assembly KW - proteins KW - multi protein complex formation Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-550742 ER - TY - THES A1 - Laux, Eva-Maria T1 - Electric field-assisted immobilization and alignment of biomolecules T1 - Immobilisierung und Ausrichtung von Biomolekülen mit elektrischen Wechselfeldern N2 - In this dissertation, an electric field-assisted method was developed and applied to achieve immobilization and alignment of biomolecules on metal electrodes in a simple one-step experiment. Neither modifications of the biomolecule nor of the electrodes were needed. The two major electrokinetic effects that lead to molecule motion in the chosen electrode configurations used were identified as dielectrophoresis and AC electroosmotic flow. To minimize AC electroosmotic flow, a new 3D electrode configuration was designed. Thus, the influence of experimental parameters on the dielectrophoretic force and the associated molecule movement could be studied. Permanent immobilization of proteins was examined and quantified absolutely using an atomic force microscope. By measuring the volumes of the immobilized protein deposits, a maximal number of proteins contained therein was calculated. This was possible since the proteins adhered to the tungsten electrodes even after switching off the electric field. The permanent immobilization of functional proteins on surfaces or electrodes is one crucial prerequisite for the fabrication of biosensors. Furthermore, the biofunctionality of the proteins must be retained after immobilization. Due to the chemical or physical modifications on the proteins caused by immobilization, their biofunctionality is sometimes hampered. The activity of dielectrophoretically immobilized proteins, however, was proven here for an enzyme for the first time. The enzyme horseradish peroxidase was used exemplarily, and its activity was demonstrated with the oxidation of dihydrorhodamine 123, a non-fluorescent precursor of the fluorescence dye rhodamine 123. Molecular alignment and immobilization - reversible and permanent - was achieved under the influence of inhomogeneous AC electric fields. For orientational investigations, a fluorescence microscope setup, a reliable experimental procedure and an evaluation protocol were developed and validated using self-made control samples of aligned acridine orange molecules in a liquid crystal. Lambda-DNA strands were stretched and aligned temporarily between adjacent interdigitated electrodes, and the orientation of PicoGreen molecules, which intercalate into the DNA strands, was determined. Similarly, the aligned immobilization of enhanced Green Fluorescent Protein was demonstrated exploiting the protein's fluorescence and structural properties. For this protein, the angle of the chromophore with respect to the protein's geometrical axis was determined in good agreement with X-ray crystallographic data. Permanent immobilization with simultaneous alignment of the proteins was achieved along the edges, tips and on the surface of interdigitated electrodes. This was the first demonstration of aligned immobilization of proteins by electric fields. Thus, the presented electric field-assisted immobilization method is promising with regard to enhanced antibody binding capacities and enzymatic activities, which is a requirement for industrial biosensor production, as well as for general interaction studies of proteins. N2 - In dieser Doktorarbeit wurde eine Methode entwickelt, mit der Biomoleküle unter dem Einfluss von elektrischen Feldern auf Metallelektroden immobilisiert und ausgerichtet werden können. Für die Immobilisierung wurden weder Modifikationen an den Biomolekülen noch an den Elektroden benötigt. Zwei elektrokinetische Effekte, die Dielektrophorese und der AC-elektroosmotische Fluss, wurden als verantwortliche Effekte für die Molekülbewegung identifiziert. Mit einer neuen 3D Elektrodenkonfiguration wurde der AC-elektroosmotische Fluss minimiert. Damit konnte der Einfluss der experimentellen Parameter auf die Dielektrophoresekraft und deren Auswirkungen auf die Moleküle untersucht werden: Die permanente Immobilisierung von Proteinen wurde mit einem Rasterkraftmikroskop quantifiziert, indem die Volumina der immobilisierten Proteinablagerungen gemessen wurden, und daraus die maximal darin enthaltene Anzahl an Proteinen berechnet wurde. Diese Art der absoluten Quantifizierung war nur möglich, da die Proteine auch nach Abschalten des elektrischen Feldes auf den Wolframelektroden hafteten. Eine solche permanente Immobilisierung funktioneller Proteine auf Elektroden oder Oberflächen im Allgemeinen ist eine wichtige Voraussetzung für die Herstellung von Biosensoren. Des Weiteren muss die Biofunktion der Proteine nach der Immobilisierung erhalten bleiben. Da die Proteine durch die Immobilisierung chemisch oder physikalisch verändert werden, ist auch ihre Biofunktion häufig eingeschränkt. In dieser Arbeit wurde erstmals der Erhalt der Aktivität dielektrophoretisch immobilisierter Enzyme gezeigt. Hierfür wurde das Enzym Meerrettichperoxidase exemplarisch verwendet, dessen Aktivität über die Oxidation von Dihydrorhodamin 123, einem nicht-fluoreszentem Vorläufer des Fluoreszenzfarbstoffes Rhodamin 123, nachgewiesen wurde. Molekulare Ausrichtung und Immobilisierung – sowohl reversibel als auch permanent – wurde unter dem Einfluss inhomogener elektrischer Wechselfelder erreicht. Für die Bestimmung der Molekülausrichtung wurde mit ein Messaufbau entwickelt, der auf einem Fluoreszenzmikroskop basiert. Der Aufbau, das Messprotokoll und die Auswertungsmethode wurden mit einer selbst hergestellten Kontrollprobe, die aus ausgerichteten Acridinorangemolekülen in einem Flüssigkristall bestand, validiert. Lambda-DNA Doppelstränge wurden zwischen benachbarten Interdigitalelektroden gestreckt und temporär ausgerichtet. Die Ausrichtung von interkalierten PicoGreen-Molekülen im rechten Winkel zur Längsachse der Doppelstränge konnte hier gezeigt werden. Zudem konnte die ausgerichtete Immobilisierung des enhanced Green Fluorescent Protein nachgewiesen werden, indem die Fluoreszenz des Proteins und seine Struktureigenschaften ausgenutzt wurden. Aus den Messungen konnte der Winkel des Chromophors relativ zur Proteinlängsachse mit guter Übereinstimmung mit Röntgenkristallstrukturdaten bestimmt werden. Eine permanente Immobilisierung mit gleichzeitiger Ausrichtung der Proteine wurde entlang der Kanten, an den Spitzen und auf der Oberfläche von Interdigitalelektroden erzielt. Damit wurde zum ersten Mal eine ausgerichtete Immobilisierung von Proteinen mit elektrischen Wechselfeldern gezeigt. Diese Methode ist vielversprechend für die Immobilisierung von Antikörpern oder Enzymen mit einheitlicher Ausrichtung und dadurch verbessertem Zugang zu den aktiven Zentren, was nicht nur für die industrielle Biosensorherstellung von Interesse ist, sondern genauso für allgemeine Wechselwirkungsstudien von Proteinen. KW - dielectrophoresis KW - electrokinetics KW - proteins KW - immobilization KW - alignment KW - Dielektrophorese KW - elektrokinetische Effekte KW - Proteine KW - Immobilisierung KW - Ausrichtung Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-90271 ER - TY - THES A1 - Schröder, Christine T1 - Identifizierung und Charakterisierung der Isoflavon-umsetzenden Enzyme aus dem humanen Darmbakterium Slackia isoflavoniconvertens T1 - Identification and characterization of isoflavone-converting enzymes of the human gut bacterium Slackia isoflavoniconvertens N2 - Aufgrund ihrer potenziell gesundheitsfördernden Wirkung sind die polyphenolischen Isoflavone für die menschliche Ernährung von großem Interesse. Eine Vielzahl an experimentellen und epidemiologischen Studien zeigen für die in Soja enthaltenen Isoflavone Daidzein und Genistein eine präventive Wirkung bezüglich hormon-abhängiger und altersbedingter Erkrankungen, wie Brust- und Prostatakrebs, Osteoporose, Herz-Kreislauf-Erkrankungen sowie des menopausalen Syndroms. Die Metabolisierung und Bioaktivierung dieser sekundären Pflanzenstoffe durch die humane intestinale Darmmikrobiota ist individuell unterschiedlich. Nur in einem geringen Teil der westlichen Bevölkerung wird der Daidzein-Metabolit Equol durch spezifische Darmbakterien gebildet. Ein isoliertes Equol-produzierendes Bakterium des menschlichen Darmtrakts ist Slackia isoflavoniconvertens. Anhand dieser Spezies sollten die bislang unbekannten, an der Umsetzung von Daidzein und Genistein beteiligten Enzyme identifiziert und charakterisiert werden. Fermentationsexperimente mit S. isoflavoniconvertens zeigten, dass die Gene der Daidzein und Genistein-umsetzenden Enzyme nicht konstitutiv exprimiert werden, sondern induziert werden müssen. Mit Hilfe der zweidimensionalen differentiellen Gelelektrophorese wurden sechs Proteine detektiert, welche in einer S. isoflavoniconvertens-Kultur in Anwesenheit von Daidzein induziert wurden. Auf Grundlage einzelner Peptidsequenzen erfolgte die Sequenzierung eines Genkomplexes mit den in gleicher Orientierung angeordneten Genen der durch Daidzein induzierten Proteine. Sequenzvergleiche identifizierten zudem äquivalente Genprodukte zu den Proteinen von S. isoflavoniconvertens in anderen Equolproduzierenden Bakterien. Nach der heterologen Expression in Escherichia coli wurden drei dieser Gene durch enzymatische Aktivitätstests als Daidzein-Reduktase (DZNR), Dihydrodaidzein-Reduktase (DHDR) und Tetrahydrodaidzein-Reduktase (THDR) identifiziert. Die Kombination der E. coli-Zellextrakte führte zur vollständigen Umsetzung von Daidzein über Dihydrodaidzein zu Equol. Neben Daidzein setzte die DZNR auch Genistein zu Dihydrogenistein um. Dies erfolgte mit einer größeren Umsatzgeschwindigkeit im Vergleich zur Reduktion von Daidzein zu Dihydrodaidzein. Enzymatische Aktivitätstests mit dem Zellextrakt von S. isoflavoniconvertens zeigten ebenfalls eine schnellere Umsetzung von Genistein. Die Kombination der rekombinanten DHDR und THDR führte zur Umsetzung von Dihydrodaidzein zu Equol. Der korrespondierende Metabolit 5-Hydroxyequol konnte als Endprodukt des Genistein-Metabolismus nicht detektiert werden. Zur Reinigung der drei identifizierten Reduktasen wurden diese genetisch an ein Strep-tag fusioniert und mittels Affinitätschromatographie gereinigt. Die übrigen durch Daidzein induzierten Proteine IfcA, IfcBC und IfcE wurden ebenfalls in E. coli exprimiert und als Strep-Fusionsproteine gereinigt. Vergleichende Aktivitätstests identifizierten das induzierte Protein IfcA als Dihydrodaidzein-Racemase. Diese katalysierte die Umsetzung des (R)- und (S)-Enantiomers von Dihydrodaidzein und Dihydrogenistein zum korrespondierenden Racemat. Neben dem Elektronentransfer-Flavoprotein IfcBC wurden auch die THDR, DZNR und IfcE als FAD-haltige Flavoproteine identifiziert. Zudem handelte es sich bei IfcE um ein Eisen-Schwefel-Protein. Nach Induktion der für die Daidzein-Umsetzung kodierenden Gene wurden mehrere verschieden lange mRNA-Transkripte gebildet. Dies zeigte, dass die Transkription des durch Daidzein induzierten Genkomplexes in S. isoflavoniconvertens nicht in Form eines einzelnen Operonsystems erfolgte. Auf Grundlage der identifizierten Daidzein-umsetzenden Enzyme kann der Mechanismus der bakteriellen Umsetzung von Isoflavonen durch S. isoflavoniconvertens eingehend erforscht werden. Die ermittelten Gensequenzen der durch Daidzein induzierten Proteine sowie die korrespondierenden Gene weiterer Equol-produzierender Bakterien bieten zudem die Möglichkeit der mikrobiellen Metagenomanalyse im humanen Darmtrakt. N2 - Gut bacteria play a crucial role in the metabolism of dietary isoflavones which have been implicated in the prevention of hormone-dependent and age-related diseases. Only the intestinal bacteria are able to catalyze the bioactivation of the main soybean isoflavones daidzein and genistein to equol and 5-hydroxy-equol, respectively. Although several equolforming gut bacteria have been isolated in recent years, the knowledge on the involved enzymes is still scarce. Slackia isoflavoniconvertens represents one of the few equol-forming gut bacteria isolated from humans. Growth experiments with S. isoflavoniconvertens indicated that the enzymes catalyzing the conversion of daidzein and genistein were inducible by these isoflavones. Using two-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE), several proteins were found to be upregulated in S. isoflavoniconvertens cells grown in the presence of daidzein. Based on selected protein sequences, a cluster of eight genes was identified encoding the daidzeininduced proteins. Sequence analysis revealed also similarities of daidzein-induced proteins to corresponding enzymes from other equol-forming human gut bacteria. The heterologous expression of three of those proteins in Escherichia coli and enzyme activity tests identified them as a daidzein reductase (DZNR), a dihydrodaidzein reductase (DHDR) and a tetrahydrodaidzein reductase (THDR). The combined cell extracts catalyzed the complete conversion of daidzein to equol. The recombinant DZNR also converted genistein to the intermediate dihydrogenistein at higher rates than observed for the conversion of daidzein to dihydrodaidzein. Higher rates were also observed with S. isoflavoniconvertens cell extracts. In combination, the recombinant DHDR and THDR catalyzed the reduction of dihydrodaidzein to equol, while the corresponding formation product 5-hydroxy-equol was not observed. The three reductases were functionally expressed as Strep-tag fusion proteins and purified by a one-step affinity chromatography. In addition, the remaining daidzein-induced proteins IfcA, IfcBC and IfcE were successfully expressed in E. coli and purified. In a comparative enzyme activity test, IfcA was identified as a dihydrodaidzein racemase, which converts the (R)- and (S)-enantiomers of dihydrodaidzein and dihydrogenistein to the corresponding racemate. Flavin analysis revealed flavin adenine dinucleotide (FAD) as the cofactor of THDR, DZNR, IfcE and also of the putative heterodimeric electron tansfer flavoprotein IfcBC. In addition, IfcE was identified as iron-sulfur enzyme. The analysis of intergenic regions and gene expression indicated a non-operon genetic structure of daidzein-induced proteins, because mRNA expression occurs at different transcriptional units. Furthermore, the transcription start site was determined for ifcA as the first gene of daidzein-induced gene cluster. In summary, the identification and incipient characterization of the daidzein-induced enzymes provides the basis for detection corresponding genes in other equol-forming gut bacteria within the microbial metagenome of the human gut. The results enable also further studies to elucidate the catalytic mechanism underlying the isoflavone bioactivation by S. isoflavoniconvertens and to clarify the regulation of enzyme induction. KW - Isoflavone KW - Darmbakterium KW - Equol KW - Proteine KW - Reduktase KW - isoflavones KW - gut microbiota KW - equol KW - protein KW - reductase Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-80065 ER - TY - THES A1 - Himmel, Mirko T1 - Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen und der in vivo Phosphorylierung des Sarkomerproteins Myomesin T1 - Analysis of Protein-Protein Interactions and in vivo Phosphorylation of the Sarcomeric Protein Myomesin N2 - Für ein tiefergehendes Verständnis von Entwicklung und Funktion der quergestreiften Muskulatur ist eine Betrachtung der am Aufbau der Myofibrillen, den kontraktilen Organellen, beteiligten Proteine essentiell. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit Myomesin, einem Protein der sarkomeren M-Bande. Zunächst wurde die cDNA des humanen Myomesins vollständig kloniert, sequenziert und nachfolgend die komplette Größe der aminoterminalen Kopfdomäne bestimmt. Es konnte gezeigt werden, daß Myomesin in vitro mit den Domänen 1 und 12 an Myosin bindet. Die muskelspezifische Isoform der Kreatinkinase bindet an die Domänen 7 und 8. Stimulations- und Inhibitionsexperimente belegen, daß Myomesin an Serin 618 in vivo durch die Proteinkinase A phosphoryliert wird und daß diese Phosphorylierung durch Aktivierung beta2-adrenerger Rezeptoren stimulierbar ist. In Muskelgewebeproben von Patienten, die an der Hypertrophen Kardiomyopathie, einer genetisch bedingten Herzmuskelkrankheit, erkrankt sind, konnte mit einem neu hergestellten phosphorylierungsabhängigen Antikörper eine Verminderung der Menge phosphorylierten Myomesins nachgewiesen werden. Mögliche Ursachen werden diskutiert. Myomesin bildet Dimere, wie durch hefegenetische und biochemische Experimente gezeigt werden konnte. Die Dimerisierung von Myomesin könnte eine zentrale Rolle für den Einbau der Myosinfilamente in die naszierende Myofibrille haben. Anhand der gewonnenen Daten wurde ein verbessertes Modell der zentralen M-Bande erstellt. N2 - A deep understanding of the development and function of the sarcomeric muscle depends on the careful study of proteins involved in the assembly of myofibrills, the contractile organelles in cross-striated muscle. This thesis deals with the sarcomeric M-band protein myomesin. First, the complete cDNA of human myomesin was cloned, sequenced, and subsequently the size of the aminoterminal head domain of myomesin was determined. Myomesin binds to myosin in vitro via domains 1 and 12. Musclespecific creatine kinase is binding to the domains 7 and 8 of myomesin. Stimulation and inhibition experiments revealed, that serin 618 in human myomesin is phosphorylated in vivo by protein kinase A and that this phosphorylation can be stimulated by activation of beta2-adrenergic receptors. In muscle tissue of patients showing symptoms of the hypertrophic cardiomyopathy, a cardiac disease caused by genetic defects, the amount of phosphorylated myomesin was lowered as detected by a phosphospecific antibody which was established new. Myomesin dimerizes as shown by yeast two hybrid and biochemical experiments. Myomesin dimerization could be a central point in myofibrillogenesis, when myosin filaments were incorporated in nascent myofibrills. Taking all the data together, an improved model of the central M-band was developed. KW - Proteine KW - Myofibrille KW - Sarkomer KW - Phosphorylierung KW - M-Bandenmodell KW - PKA KW - M-band model KW - PKA Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-5153 ER -