TY - THES A1 - Dreymann, Nico T1 - Identification and functional characterization of aptamers targeting human urokinase and NDM-1 for therapeutic and diagnostic applications T1 - Identifizierung und funktionelle Charakterisierung von Aptameren gegen humane Urokinase und NDM-1 für therapeutische und diagnostische Anwendungen N2 - Aptamers are single-stranded DNA (ssDNA) or RNA molecules that can bind specifically and with high affinity to target molecules due to their unique three-dimensional structure. For this reason, they are often compared to antibodies and sometimes even referred to as “chemical antibodies”. They are simple and inexpensive to synthesize, easy to modify, and smaller than conventional antibodies. Enzymes, especially hydrolases, are interesting targets in this context. This class of enzymes is capable of hydrolytically cleaving various macromolecules such as proteins, as well as smaller molecules such as antibiotics. Hence, they play an important role in many biological processes including diseases and their treatment. Hydrolase detection as well as the understanding of their function is therefore of great importance for diagnostics and therapy. Due to their various desirable features compared to antibodies, aptamers are being discussed as alternative agents for analytical and diagnostic use in various applications. The use of aptamers in therapy is also frequently investigated, as the binding of aptamers can have effects on the catalytic activity, protein-protein interactions, or proteolytic cascades. Aptamers are generated by an in vitro selection process. Potential aptamer candidates are selected from a pool of enriched nucleic acid sequences with affinity to the target, and their binding affinity and specificity is investigated. This is one of the most important steps in aptamer generation to obtain specific aptamers with high affinity for use in analytical and diagnostic applications. The binding properties or binding domains and their effects on enzyme functions form the basis for therapeutic applications. In this work, the binding properties of DNA aptamers against two different hydrolases were investigated. In view of their potential utility for analytical methods, aptamers against human urokinase (uPA) and New Delhi metallo-β-lactamase-1 (NDM-1) were evaluated for their binding affinity and specificity using different methods. Using the uPA aptamers, a protocol for measuring the binding kinetics of an aptamer-protein-interaction by surface plasmon resonance spectroscopy (SPR) was developed. Based on the increased expression of uPA in different types of cancer, uPA is discussed as a prognostic and diagnostic tumor marker. As uPA aptamers showed different binding sites on the protein, microtiter plate-based aptamer sandwich assay systems for the detection of uPA were developed. Because of the function of urokinase in cancer cell proliferation and metastasis, uPA is also discussed as a therapeutic target. In this regard, the different binding sites of aptamers showed different effects on uPA function. In vitro experiments demonstrated both inhibition of uPA binding to its receptor as well as the inhibition of uPA catalytic activity for different aptamers. Thus, in addition to their specificity and affinity for their targets, the utility of the aptamers for potential diagnostic and therapeutic applications was demonstrated. First, as an alternative inhibitor of human urokinase for therapeutic purposes, and second, as valuable recognition molecules for the detection of urokinase, as a prognostic and diagnostic marker for cancer, and for NDM-1 to detect resistance to carbapenem antibiotics. N2 - Aptamere sind einzelsträngige DNA- oder RNA-Moleküle, die aufgrund ihrer charakteristischen dreidimensionalen Struktur spezifisch und mit hoher Affinität an Zielmoleküle binden. Häufig werden sie mit Antikörpern verglichen und als „chemische Antikörper“ bezeichnet. Sie sind einfach und kostengünstig zu synthetisieren, leicht zu modifizieren und kleiner als herkömmliche Antikörper. Enzyme, insbesondere Hydrolasen, sind hierbei unter anderem interessante Zielmoleküle. Diese Klasse von Enzymen ist in der Lage verschiedene Makromoleküle wie z.B. Proteine, aber auch kleinere Moleküle, wie z.B. Antibiotika, hydrolytisch zu spalten. Sie spielen in vielen biologischen Prozessen und somit auch in Erkrankungen und deren Behandlung eine wichtige Rolle. Daher ist ihre Detektion, sowie das Verständnis ihrer Funktion für die Diagnostik und Therapie von hoher Bedeutung. Durch ihre Vorteile gegenüber Antikörpern werden Aptamere als Alternativen für den analytischen und diagnostischen Einsatz in verschiedenen Applikationen diskutiert. Der Einsatz von Aptameren in der Therapie wird ebenfalls häufig untersucht, da die Bindung der Aptamere Auswirkungen auf die katalytische Aktivität, Protein-Protein-Interaktionen oder proteolytische Kaskaden haben kann. Aptamere werden mittels in vitro Selektion generiert. Aus einem Pool angereicherter Nukleinsäuren mit Affinität zum Zielmolekül werden anschließend potentielle Aptamerkandidaten identifiziert und ihre Bindung zum Zielmolekül untersucht. Dies ist einer der wichtigsten Schritte in der Aptamergenerierung, um spezifische Aptamere mit hoher Affinität für den späteren Einsatz in analytischen und diagnostischen Applikationen zu erhalten. Die Bindungseigenschaften einschließlich der Bindedomänen und deren Auswirkungen auf die Funktion des Zielmoleküls stellen die Grundlage für spätere therapeutische Anwendungen dar. In dieser Arbeit wurden die Bindungseigenschaften von DNA Aptameren gegen zwei verschiedene Hydrolasen untersucht. Für den potentiellen Nutzen in analytischen Methoden wurden Aptamere gegen die humane Urokinase (uPA), sowie gegen die New-Delhi metallo β-lactamase-1 (NDM-1) mittels molekularbiologischer Methoden auf deren Bindungsaffinität und Spezifität untersucht. Anhand der uPA-Aptamere wurde ein Protokoll für die Messung der Bindungskinetik einer Aptamer-Protein-Bindung mittels Oberflächenplasmonenresonanz Spektroskopie (SPR) entwickelt. Durch die erhöhte Expression von uPA in vielen Krebserkrankungen, wird dieser als prognostischer und diagnostischer Tumormarker diskutiert. Die in dieser Arbeit untersuchten Aptamere gegen die Urokinase zeigten unterschiedliche Bindestellen, wodurch Aptamer-basierte Sandwich Assay Systeme auf Mikrotiterplattenbasis für die Detektion von uPA etabliert werden konnten. Durch die Funktion der Urokinase in der Zellproliferation und Metastasierung in Krebserkrankungen wird uPA ebenfalls als therapeutisches Zielprotein diskutiert. Hierbei zeigten die unterschiedlichen Bindestellen der Aptamere verschiedene Auswirkungen auf die Funktion von uPA. Mittels in vitro Experimenten konnte die Inhibierung der Bindung von uPA zu ihrem Rezeptor, sowie die Inhibierung der katalytischen Aktivität von uPA mit Hilfe verschiedener Aptamere nachgewiesen werden. Somit wurde für die Aptamere, neben ihrer Spezifität und Affinität zu ihren Zielmolekülen, der Nutzen für potentielle diagnostische und therapeutische Anwendungen gezeigt. Zum einen als alternativer Inhibitor der Urokinase für therapeutische Zwecke, als auch als wertvolle Erkennungsmoleküle für den Nachweis von Urokinase, als prognostischer und diagnostischer Marker für Krebserkrankungen, sowie für NDM-1, zum Nachweis der Resistenz gegen Carbapenem-Antibiotika. KW - DNA-Aptamer KW - protein-aptamer interaction KW - Surface Plasmon Resonance (SPR) KW - Microscale Thermophoresis (MST) KW - aptamer-based sandwich assay KW - cancer biomarker KW - cancer therapy KW - cancer detection KW - Urokinase-type Plasminogen Activator (uPA) KW - antibiotic resistance KW - New Delhi metallo-β-lactamase 1 (NDM-1) KW - DNA-Aptamer KW - Microscale Thermophoresis (MST) KW - Neu-Delhi Metallo-Beta-Laktamase 1 (NDM-1) KW - Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie (SPR-Spektroskopie) KW - Urokinase-Typ Plasminogen Aktivator (uPA) KW - Antibiotikaresistenz KW - Sandwich-Assay auf Basis von Aptameren KW - Krebsbiomarker KW - Krebserkennung KW - Krebstherapie KW - Protein-Aptamer Interaktion Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-612919 ER - TY - THES A1 - Münch, Steffen T1 - The relevance of the aeolian transport path for the spread of antibiotic-resistant bacteria on arable fields T1 - Die Bedeutung des äolischen Transportpfads für die Ausbreitung antibiotikaresistenter Bakterien von Ackerböden N2 - The spread of antibiotic-resistant bacteria poses a globally increasing threat to public health care. The excessive use of antibiotics in animal husbandry can develop resistances in the stables. Transmission through direct contact with animals and contamination of food has already been proven. The excrements of the animals combined with a binding material enable a further potential path of spread into the environment, if they are used as organic manure in agricultural landscapes. As most of the airborne bacteria are attached to particulate matter, the focus of the work will be the atmospheric dispersal via the dust fraction. Field measurements on arable lands in Brandenburg, Germany and wind erosion studies in a wind tunnel were conducted to investigate the risk of a potential atmospheric dust-associated spread of antibiotic-resistant bacteria from poultry manure fertilized agricultural soils. The focus was to (i) characterize the conditions for aerosolization and (ii) qualify and quantify dust emissions during agricultural operations and wind erosion. PM10 (PM, particulate matter with an aerodynamic diameter smaller than 10 µm) emission factors and bacterial fluxes for poultry manure application and incorporation have not been previously reported before. The contribution to dust emissions depends on the water content of the manure, which is affected by the manure pretreatment (fresh, composted, stored, dried), as well as by the intensity of manure spreading from the manure spreader. During poultry manure application, PM10 emission ranged between 0.05 kg ha-1 and 8.37 kg ha-1. For comparison, the subsequent land preparation contributes to 0.35 – 1.15 kg ha-1 of PM10 emissions. Manure particles were still part of dust emissions but they were accounted to be less than 1% of total PM10 emissions due to the dilution of poultry manure in the soil after manure incorporation. Bacterial emissions of fecal origin were more relevant during manure application than during the subsequent manure incorporation, although PM10 emissions of manure incorporation were larger than PM10 emissions of manure application for the non-dried manure variants. Wind erosion leads to preferred detachment of manure particles from sandy soils, when poultry manure has been recently incorporated. Sorting effects were determined between the low-density organic particles of manure origin and the soil particles of mineral origin close above the threshold of 7 m s-1. In dependence to the wind speed, potential erosion rates between 101 and 854 kg ha-1 were identified, if 6 t ha-1 of poultry manure were applied. Microbial investigation showed that manure bacteria got detached more easily from the soil surface during wind erosion, due to their attachment on manure particles. Although antibiotic-resistant bacteria (ESBL-producing E. coli) were still found in the poultry barns, no further contamination could be detected with them in the manure, fertilized soils or in the dust generated by manure application, land preparation or wind erosion. Parallel studies of this project showed that storage of poultry manure for a few days (36 – 72 h) is sufficient to inactivate ESBL-producing E. coli. Further antibiotic-resistant bacteria, i.e. MRSA and VRE, were only found sporadically in the stables and not at all in the dust. Therefore, based on the results of this work, the risk of a potential infection by dust-associated antibiotic-resistant bacteria can be considered as low. N2 - Die Ausbreitung antibiotikaresistenter Bakterien stellt eine global zunehmende Gefahr für die öffentliche Gesundheitsfürsorge dar. Über den unsachgemäßen Einsatz von Antibiotika in der Tierhaltung können sich in den Ställen Resistenzen entwickeln. Übertragungen über den direkten Kontakt mit Tieren und der Kontaminierung von Lebensmitteln wurden bisher schon nachgewiesen. Die Exkremente der Tiere in Verbindung mit einem Bindemedium ermöglichen einen weiteren potentiellen Ausbreitungspfad in die Umwelt, wenn sie als organische Wirtschaftsdünger in Agrarlandschaften verwendet werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Feld- und Windkanalmessungen durchgeführt, um dem von den Ackerflächen ausgehenden potentiellen Risiko einer partikulären Ausbreitung antibiotikaresistenter Bakterien nachzugehen. Kern der Arbeit ist zum einen die Bedingungen zu charakterisieren, die zu Staubemissionen während der Prozesskette (Düngerausbringung mit Geflügelmist, nachfolgende Feldbearbeitungen, Winderosion) führen, zum anderen Staubemissionen dieser Prozesskette zu klassifizieren und quantifizieren. Flächenbezogene Emissionen für PM10 als ein Teil des Schwebstaubs (sogenannte PM10 Emissionsfaktoren) wurden zum ersten Mal für die Düngerausbringung mit Geflügelmist bestimmt. Sie lagen zwischen 0,05 und 8,37 kg ha-1 PM10 und waren abhängig vom Wassergehalt des Materials, der durch die Vorbehandlungen (frisch, kompostiert, gelagert, getrocknet) der Düngervarianten bestimmt war. Im Vergleich dazu wurden für die nachfolgenden Bodenbearbeitungen zwischen 0,35 kg ha-1 und 1,15 kg ha-1 PM10 freigesetzt. Zwar waren Mistpartikel weiterhin Bestanteil der Staubemissionen während der Bodenbearbeitung, jedoch sank ihr Anteil durch die Verdünnung des Düngers im Boden nach der Düngereinarbeitung auf unter 1 % ab. Ähnliche Tendenzen ergaben sich bei der mikrobiellen Betrachtung der freigesetzten Bakterien während der Ausbringung und Einarbeitung des Geflügelmists. Trotz eines höheren PM10 Austrags während der Düngereinarbeitung, verglichen mit der Ausbringung des Düngers, waren die Bakterienemissionen während der Düngerausbringung relevanter als bei der Düngereinarbeitung. Winderosion sorgt für eine bevorzugte Verfrachtung des Geflügelmists auf sandigen Böden, nachdem der Dünger frisch eingearbeitet wurde. Da vor allem organische Bestandteile im Boden durch ihre geringe Dichte von der Auswehung betroffen sind, führt Winderosion auch bei mit Geflügelmist gedüngten Böden bereits kurz nach Erreichen der Schwellenwindgeschwindigkeit von 7 m s-1 zu einer Entmischung der eingebrachten organischen Mistpartikel und der mineralischen Bestandteile des Bodens. Diese Effekte treten vor allem dann auf, wenn in trockenen Böden der Gefügezustand zwischen mineralischen und organischen Partikeln kaum oder nicht vorhanden ist. In Abhängigkeit der Windgeschwindigkeit konnten potentielle Austräge zwischen 101 und 854 kg ha-1 bei einer eingebrachten Düngermenge von 6 t ha-1 bestimmt werden. Der bevorzugte Austrag von Mistpartikeln bedingt auch einen bevorzugten Austrag von Bakterien fäkalen Ursprungs, da diese nach der Einarbeitung an den Mistpartikeln mit geringerer Dichte anhaften. Obwohl in den Geflügelställen antibiotikaresistente Bakterien in Form von ESBL bildenden Escherichia Coli (E. coli) in hohen Keimzahlen gefunden wurden, konnten keine weiteren Kontaminationen mit resistenten E.coli im Mist, in gedüngten Böden oder im Staub nachgewiesen werden. Parallelstudien aus dem Projekt zeigten, dass eine mehrtägige Lagerung von Hühnerstreu ausreichend ist (36 – 72 h), die Mehrzahl resistenter E.coli zu reduzieren, sodass sie sich nach der Düngerausbringung nicht mehr über Agrarflächen ausbreiten konnten. Weitere antibiotikaresistente Bakterien (MRSA, VRE) wurden nur vereinzelt in den Ställen und überhaupt nicht im Staub nachgewiesen. Aus unseren Versuchen kann daher das Risiko einer möglichen Infektion durch staubassoziierte antibiotikaresistente Bakterien als gering eingeschätzt werden. KW - wind erosion KW - dust emission KW - PM10 KW - manure application KW - tillage KW - sandy soils KW - poultry manure KW - antibiotic resistance KW - airborne bacteria KW - agricultural KW - fecal contamination KW - fertilization KW - PM10 KW - landwirtschaftlich KW - luftgetragene Bakterien KW - Antibiotikaresistenz KW - Staubemission KW - fäkale Kontamination KW - Düngung KW - Mistausbringung KW - Geflügelmist KW - sandige Böden KW - Bodenbearbeitung KW - Winderosion Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-536089 ER - TY - THES A1 - Mogrovejo Arias, Diana Carolina T1 - Assessment of the frequency and relevance of potentially pathogenic phenotypes in microbial isolates from Arctic environments N2 - The Arctic environments constitute rich and dynamic ecosystems, dominated by microorganisms extremely well adapted to survive and function under severe conditions. A range of physiological adaptations allow the microbiota in these habitats to withstand low temperatures, low water and nutrient availability, high levels of UV radiation, etc. In addition, other adaptations of clear competitive nature are directed at not only surviving but thriving in these environments, by disrupting the metabolism of neighboring cells and affecting intermicrobial communication. Since Arctic microbes are bioindicators which amplify climate alterations in the environment, the Arctic region presents the opportunity to study local microbiota and carry out research about interesting, potentially virulent phenotypes that could be dispersed into other habitats around the globe as a consequence of accelerating climate change. In this context, exploration of Arctic habitats as well as descriptions of the microbes inhabiting them are abundant but microbial competitive strategies commonly associated with virulence and pathogens are rarely reported. In this project, environmental samples from the Arctic region were collected and microorganisms (bacteria and fungi) were isolated. The clinical relevance of these microorganisms was assessed by observing the following virulence markers: ability to grow at a range of temperatures, expression of antimicrobial resistance and production of hemolysins. The aim of this project is to determine the frequency and relevance of these characteristics in an effort to understand microbial adaptations in habitats threatened by climate change. The isolates obtained and described here were able to grow at a range of temperatures, in some cases more than 30 °C higher than their original isolation temperature. A considerable number of them consistently expressed compounds capable of lysing sheep and bovine erythrocytes on blood agar at different incubation temperatures. Ethanolic extracts of these bacteria were able to cause rapid and complete lysis of erythrocyte suspensions and might even be hemolytic when assayed on human blood. In silico analyses showed a variety of resistance elements, some of them novel, against natural and synthetic antimicrobial compounds. In vitro experiments against a number of antimicrobial compounds showed resistance phenotypes belonging to wild-type populations and some non-wild type which clearly denote human influence in the acquisition of antimicrobial resistance. The results of this project demonstrate the presence of virulence-associated factors expressed by microorganisms of natural, non-clinical environments. This study contains some of the first reports, to the best of our knowledge, of hemolytic microbes isolated from the Arctic region. In addition, it provides additional information about the presence and expression of intrinsic and acquired antimicrobial resistance in environmental isolates, contributing to the understanding of the evolution of relevant pathogenic species and opportunistic pathogens. Finally, this study highlights some of the potential risks associated with changes in the polar regions (habitat melting and destruction, ecosystem transition and re-colonization) as important indirect consequences of global warming and altered climatic conditions around the planet. N2 - Die Arktis ist ein reiches und dynamisches Ökosystem, welches von Mikroorganismen dominiert wird, die unter extremen Bedingungen überleben und funktionieren können. Eine Reihe physiologischer Anpassungen ermöglichen es der Mikrobiota, in diesem Lebensraum zu überdauern niedrige Temperaturen, geringe Wasser- und Nährstoffverfügbarkeit, hohe UV-Strahlung, usw. standzuhalten. Andere Fähigkeiten zielen darauf ab, sich einen Konkurrenzvorteil zu verschaffen, indem sie mit antimikrobiellen Substanzen benachbarte Mikroorganismen stören und die intermikrobielle Kommunikation beeinflussen. Arktische Mikroorganismen sind Bioindikatoren, die Klimaveränderungen anzeigen können. Die Arktis bietet Möglichkeiten, die lokale Mikrobiota zu untersuchen, um Rückschlüsse auf den Klimawandel zu ziehen. Insbesondere Forschung über potenziell pathogene Phänotypen, die infolge der Beschleunigung des Klimawandels in andere Lebensräume auf der ganzen Welt verteilt werden könnten, ist hier von herausragender Bedeutung. In diesem Zusammenhang gibt es zahlreiche Untersuchungen zur Erforschung arktischer Lebensräume sowie Beschreibungen der in ihnen lebenden Mikroben, während über bakterielle Konkurrenzstrategien, die üblicherweise mit Virulenz und Krankheitserregern verbunden sind, bisher wenig geforscht wurde. In diesem Projekt wurden Umweltproben aus der Arktis entnommen und Bakterien und Pilze isoliert. Die klinische Relevanz dieser Mikroorganismen wurde durch Untersuchung der folgenden Virulenzmarker bewertet: Fähigkeit, in einem bestimmten Temperaturbereich zu wachsen, Expression von Antibiotikaresistenz und Produktion von Hämolysinen. Ziel dieses Projekts war es, das Vorkommen dieser Eigenschaften zu bestimmen, um die mikrobiellen Anpassungen in vom Klimawandel bedrohten Lebensräumen zu verstehen. Die beschriebenen Bakterienisolate konnten in einem relevanten Temperaturbereich wachsen, in einigen Fällen von mehr als 30 °C höher als ihre ursprüngliche Isolationstemperatur. Eine beträchtliche Anzahl der Isolate exprimierte konsistent Verbindungen, die Schaf- und Rindererythrozyten auf Blutagar bei verschiedenen Inkubationstemperaturen lysieren können. Die Extrakte einiger dieser Bakterien konnten eine schnelle und vollständige Lyse von Schaf- und Rindererythrozytensuspensionen verursachen und sind möglicherweise sogar hämolytisch gegenüber humanem Blut. Darüber hinaus zeigten Genomanalysen eine Vielzahl von Resistenzgenen gegen natürliche und synthetische antimikrobielle Verbindungen, einige neuartige. In-vitro-Experimente zeigten, dass einige Resistenzphänotypen zu Wildtyp-Populationen während andere zu Nicht-Wildtyp gehören, was auf einen menschlichen Einfluss auf den Erwerb von Antibiotikaresistenzen in der Umwelt eindeutig hindeutet. Die Ergebnisse dieses Projekts zeigen das Vorhandensein von Virulenz-assoziierten Faktoren, die von Mikroorganismen natürlicher, nicht klinischer Umgebungen exprimiert werden. Diese Studie enthält nach unserem besten Wissen einige der ersten Berichte über hämolytische Mikroben, die aus der Arktis isoliert wurden. Darüber hinaus liefert es zusätzliche Informationen über das Vorhandensein und die Expression von intrinsischer und erworbener antimikrobieller Resistenz in Umweltisolaten und trägt zum Verständnis der Entwicklung relevanter pathogener Spezies und opportunistischer Pathogene bei. Schließlich beleuchtet diese Studie einige der potenziellen Risiken, die mit Veränderungen in den Polarregionen (Schmelzen und Zerstörung des Lebensraums, Übergang des Ökosystems und Wiederbesiedlung) als wichtige indirekte Folgen der globalen Erwärmung und veränderter klimatischer Bedingungen auf dem Planeten verbunden sind. KW - Arctic KW - pathogens KW - virulence KW - hemolysis KW - antimicrobial resistance KW - climate change KW - bacteria KW - fungi KW - thermotolerance KW - antibiotic resistance KW - Arktis KW - Krankheitserreger KW - Virulenz KW - Hämolyse KW - Antibiotikaresistenz KW - Klimawandel KW - Bakterien KW - Pilze KW - Thermotoleranz Y1 - 2021 N1 - The author would like to acknowledge that the project leading to this doctoral dissertation has received funding from the European Union’s Horizon 2020 research and innovation programme under the Marie Skłodowska-Curie grant agreement No. 675546, research project “Microorganisms in Warming Arctic Environments - MicroArctic”. ER - TY - THES A1 - Vossenkuhl, Birgit T1 - Transmission of MRSA along the meat supply chain BT - A methodological concept from farm to fork N2 - Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) zählen zu den bedeutendsten antibiotikaresistenten Pathogenen, die vor allem in Krankenhäusern aber auch außerhalb von Einrichtungen des Gesundheitswesens weit verbreitet sind. Seit einigen Jahren ist eine neue Generation von MRSA auf dem Vormarsch, die vor allem Nutztierbestände als neue Nische besiedelt. Diese sogenannten Nutztier-assoziierten MRSA wurden wiederholt bei wirtschaftlich bedeutenden Nutztieren sowie daraus gewonnenem Fleisch nachgewiesen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein methodischer Ansatz verfolgt, um die Hypothese einer möglichen Übertragung von Nutztier-assoziierten MRSA entlang der Lebensmittelkette vom Tier auf dessen Fleisch zu bestätigen. Angepasst an die Unterschiede in den verfügbaren Daten wurden dafür zwei neue Konzepte erstellt. Zur Analyse der Übertragung von MRSA entlang der Schlachtkette wurde ein mathematisches Modell des Schweineschlachtprozesses entwickelt, welches dazu geeignet ist, den Verlauf der MRSA-Prävalenz entlang der Schlachtkette zu quantifizieren sowie kritische Prozessschritte für eine MRSA-Übertragung zu identifizieren. Anhand von Prävalenzdaten ist es dem Modell möglich, die durchschnittlichen MRSA-Eliminations- und Kontaminationsraten jedes einzelnen Prozessschrittes zu schätzen, die anschließend in eine Monte-Carlo-Simulation einfließen. Im Ergebnis konnte gezeigt werden, dass es generell möglich ist, die MRSA Prävalenz im Laufe des Schlachtprozesses auf ein niedriges finales Niveau zwischen 0,15 bis 1,15% zu reduzieren. Vor allem das Brühen und Abflämmen der Schlachtkörper wurden als kritische Prozesse im Hinblick auf eine MRSA-Dekontamination identifiziert. In Deutschland werden regelmäßig MRSA-Prävalenz und Typisierungsdaten auf allen Stufen der Lebensmittelkette verschiedener Nutztiere erfasst. Um die MRSA-Daten dieser Querschnittstudie hinsichtlich einer möglichen Übertragung entlang der Kette zu analysieren, wurde ein neuer statistischer Ansatz entwickelt. Hierfür wurde eine Chi-Quadrat-Statistik mit der Berechnung des Czekanowski-Ähnlichkeitsindex kombiniert, um Unterschiede in der Verteilung stammspezifischer Eigenschaften zwischen MRSA aus dem Stall, von Karkassen nach der Schlachtung und aus Fleisch im Einzelhandel zu quantifizieren. Die Methode wurde am Beispiel der Putenfleischkette implementiert und zudem bei der Analyse der Kalbfleischkette angewendet. Die durchgehend hohen Ähnlichkeitswerte zwischen den einzelnen Proben weisen auf eine mögliche Übertragung von MRSA entlang der Lebensmittelkette hin. Die erarbeiteten Methoden sind nicht spezifisch bezüglich Prozessketten und Pathogenen. Sie bieten somit einen großen Anwendungsbereich und erweitern das Methodenspektrum zur Bewertung bakterieller Übertragungswege. N2 - Methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is one of the most important antibiotic-resistant pathogens in hospitals and the community. Recently, a new generation of MRSA, the so called livestock associated (LA) MRSA, has emerged occupying food producing animals as a new niche. LA-MRSA can be regularly isolated from economically important live-stock species including corresponding meats. The present thesis takes a methodological approach to confirm the hypothesis that LA-MRSA are transmitted along the pork, poultry and beef production chain from animals at farm to meat on consumers` table. Therefore two new concepts were developed, adapted to differing data sets. A mathematical model of the pig slaughter process was developed which simulates the change in MRSA carcass prevalence during slaughter with special emphasis on identifying critical process steps for MRSA transmission. Based on prevalences as sole input variables the model framework is able to estimate the average value range of both the MRSA elimination and contamination rate of each of the slaughter steps. These rates are then used to set up a Monte Carlo simulation of the slaughter process chain. The model concludes that regardless of the initial extent of MRSA contamination low outcome prevalences ranging between 0.15 and 1.15 % can be achieved among carcasses at the end of slaughter. Thus, the model demonstrates that the standard procedure of pig slaughtering in principle includes process steps with the capacity to limit MRSA cross contamination. Scalding and singeing were identified as critical process steps for a significant reduction of superficial MRSA contamination. In the course of the German national monitoring program for zoonotic agents MRSA prevalence and typing data are regularly collected covering the key steps of different food production chains. A new statistical approach has been proposed for analyzing this cross sectional set of MRSA data with regard to show potential farm to fork transmission. For this purpose, chi squared statistics was combined with the calculation of the Czekanowski similarity index to compare the distributions of strain specific characteristics between the samples from farm, carcasses after slaughter and meat at retail. The method was implemented on the turkey and veal production chains and the consistently high degrees of similarity which have been revealed between all sample pairs indicate MRSA transmission along the chain. As the proposed methods are not specific to process chains or pathogens they offer a broad field of application and extend the spectrum of methods for bacterial transmission assessment. KW - MRSA KW - Antibiotikaresistenz KW - Modell KW - Lebensmittelkette KW - Übertragung KW - MRSA KW - Resistance KW - Model KW - Food Chain KW - Transmission Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-85918 ER - TY - THES A1 - Patra, Pintu T1 - Population dynamics of bacterial persistence T1 - Populationsdynamik von Bakterielle Persistenz N2 - The life of microorganisms is characterized by two main tasks, rapid growth under conditions permitting growth and survival under stressful conditions. The environments, in which microorganisms dwell, vary in space and time. The microorganisms innovate diverse strategies to readily adapt to the regularly fluctuating environments. Phenotypic heterogeneity is one such strategy, where an isogenic population splits into subpopulations that respond differently under identical environments. Bacterial persistence is a prime example of such phenotypic heterogeneity, whereby a population survives under an antibiotic attack, by keeping a fraction of population in a drug tolerant state, the persister state. Specifically, persister cells grow more slowly than normal cells under growth conditions, but survive longer under stress conditions such as the antibiotic administrations. Bacterial persistence is identified experimentally by examining the population survival upon an antibiotic treatment and the population resuscitation in a growth medium. The underlying population dynamics is explained with a two state model for reversible phenotype switching in a cell within the population. We study this existing model with a new theoretical approach and present analytical expressions for the time scale observed in population growth and resuscitation, that can be easily used to extract underlying model parameters of bacterial persistence. In addition, we recapitulate previously known results on the evolution of such structured population under periodically fluctuating environment using our simple approximation method. Using our analysis, we determine model parameters for Staphylococcus aureus population under several antibiotics and interpret the outcome of cross-drug treatment. Next, we consider the expansion of a population exhibiting phenotype switching in a spatially structured environment consisting of two growth permitting patches separated by an antibiotic patch. The dynamic interplay of growth, death and migration of cells in different patches leads to distinct regimes in population propagation speed as a function of migration rate. We map out the region in parameter space of phenotype switching and migration rate to observe the condition under which persistence is beneficial. Furthermore, we present an extended model that allows mutation from the two phenotypic states to a resistant state. We find that the presence of persister cells may enhance the probability of resistant mutation in a population. Using this model, we explain the experimental results showing the emergence of antibiotic resistance in a Staphylococcus aureus population upon tobramycin treatment. In summary, we identify several roles of bacterial persistence, such as help in spatial expansion, development of multidrug tolerance and emergence of antibiotic resistance. Our study provides a theoretical perspective on the dynamics of bacterial persistence in different environmental conditions. These results can be utilized to design further experiments, and to develop novel strategies to eradicate persistent infections. N2 - Das Leben von Mikroorganismen kann in zwei charakteristische Phasen unterteilt werde, schnelles Wachstum unter Wachstumsbedingungen und Überleben unter schwierigen Bedingungen. Die Bedingungen, in denen sich die Mikroorganismen aufhalten, verändern sich in Raum und Zeit. Um sich schnell an die ständig wechselnden Bedingungen anzupassen entwickeln die Mikroorganismen diverse Strategien. Phänotypische Heterogenität ist eine solche Strategie, bei der sich eine isogene Popolation in Untergruppen aufteilt, die unter identischen Bedingungen verschieden reagieren. Bakterielle Persistenz ist ein Paradebeispiel einer solchen phänotypischen Heterogenität. Hierbei überlebt eine Popolation die Behandlung mit einem Antibiotikum, indem sie einen Teil der Bevölkerung in einem, dem Antibiotikum gegenüber tolerant Zustand lässt, der sogenannte "persister Zustand". Persister-Zellen wachsen unter Wachstumsbedingungen langsamer als normale Zellen, jedoch überleben sie länger in Stress-Bedingungen, wie bei Antibiotikaapplikation. Bakterielle Persistenz wird experimentell erkannt indem man überprüft ob die Population eine Behandlung mit Antibiotika überlebt und sich in einem Wachstumsmedium reaktiviert. Die zugrunde liegende Popolationsdynamik kann mit einem Zwei-Zustands-Modell für reversibles Wechseln des Phänotyps einer Zelle in der Bevölkerung erklärt werden. Wir untersuchen das bestehende Modell mit einem neuen theoretischen Ansatz und präsentieren analytische Ausdrücke für die Zeitskalen die für das Bevölkerungswachstums und die Reaktivierung beobachtet werden. Diese können dann einfach benutzt werden um die Parameter des zugrunde liegenden bakteriellen Persistenz-Modells zu bestimmen. Darüber hinaus rekapitulieren wir bisher bekannten Ergebnisse über die Entwicklung solch strukturierter Bevölkerungen unter periodisch schwankenden Bedingungen mithilfe unseres einfachen Näherungsverfahrens. Mit unserer Analysemethode bestimmen wir Modellparameter für eine Staphylococcus aureus-Popolation unter dem Einfluss mehrerer Antibiotika und interpretieren die Ergebnisse der Behandlung mit zwei Antibiotika in Folge. Als nächstes betrachten wir die Ausbreitung einer Popolation mit Phänotypen-Wechsel in einer räumlich strukturierten Umgebung. Diese besteht aus zwei Bereichen, in denen Wachstum möglich ist und einem Bereich mit Antibiotikum der die beiden trennt. Das dynamische Zusammenspiel von Wachstum, Tod und Migration von Zellen in den verschiedenen Bereichen führt zu unterschiedlichen Regimen der Populationsausbreitungsgeschwindigkeit als Funktion der Migrationsrate. Wir bestimmen die Region im Parameterraum der Phänotyp Schalt-und Migrationsraten, in der die Bedingungen Persistenz begünstigen. Darüber hinaus präsentieren wir ein erweitertes Modell, das Mutation aus den beiden phänotypischen Zuständen zu einem resistenten Zustand erlaubt. Wir stellen fest, dass die Anwesenheit persistenter Zellen die Wahrscheinlichkeit von resistenten Mutationen in einer Population erhöht. Mit diesem Modell, erklären wir die experimentell beobachtete Entstehung von Antibiotika- Resistenz in einer Staphylococcus aureus Popolation infolge einer Tobramycin Behandlung. Wir finden also verschiedene Funktionen bakterieller Persistenz. Sie unterstützt die räumliche Ausbreitung der Bakterien, die Entwicklung von Toleranz gegenüber mehreren Medikamenten und Entwicklung von Resistenz gegenüber Antibiotika. Unsere Beschreibung liefert eine theoretische Betrachtungsweise der Dynamik bakterieller Persistenz bei verschiedenen Bedingungen. Die Resultate könnten als Grundlage neuer Experimente und der Entwicklung neuer Strategien zur Ausmerzung persistenter Infekte dienen. KW - Populationsdynamik KW - Antibiotikaresistenz KW - Antibiotika-Toleranz KW - Phänotypische Heterogenität KW - population dynamics KW - drug tolerance KW - antibiotic resistance KW - phenotypic heterogeneity Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-69253 ER - TY - THES A1 - Oey, Melanie T1 - Chloroplasts as bioreactors : high-yield production of active bacteriolytic protein antibiotics T1 - Chloroplasten als Bioreaktoren : hocheffiziente Produktion von aktiven, bakteriolytischen Proteinantibiotika N2 - Plants, more precisely their chloroplasts with their bacterial-like expression machinery inherited from their cyanobacterial ancestors, can potentially offer a cheap expression system for proteinaceous pharmaceuticals. This system would be easily scalable and provides appropriate safety due to chloroplasts maternal inheritance. In this work, it was shown that three phage lytic enzymes (Pal, Cpl-1 and PlyGBS) could be successfully expressed at very high levels and with high stability in tobacco chloroplasts. PlyGBS expression reached an amount of foreign protein accumulation (> 70% TSP) that has never been obtained before. Although the high expression levels of PlyGBS caused a pale green phenotype with retarded growth, presumably due to exhaustion of plastid protein synthesis capacity, development and seed production were not impaired under greenhouse conditions. Since Pal and Cpl-1 showed toxic effects when expressed in E. coli, a special plastid transformation vector (pTox) was constructed to allow DNA amplification in bacteria. The construction of the pTox transformation vector allowing a recombinase-mediated deletion of an E. coli transcription block in the chloroplast, leading to an increase of foreign protein accumulation to up to 40% of TSP for Pal and 20% of TSP for Cpl-1. High dose-dependent bactericidal efficiency was shown for all three plant-derived lytic enzymes using their pathogenic target bacteria S. pyogenes and S. pneumoniae. Confirmation of specificity was obtained for the endotoxic proteins Pal and Cpl-1 by application to E. coli cultures. These results establish tobacco chloroplasts as a new cost-efficient and convenient production platform for phage lytic enzymes and address the greatest obstacle for clinical application. The present study is the first report of lysin production in a non-bacterial system. The properties of chloroplast-produced lysins described in this work, their stability, high accumulation rate and biological activity make them highly attractive candidates for future antibiotics. N2 - Lytische Enzyme aus Bakteriophagen bieten Eigenschaften, die sie zu vielversprechenden Medikamenten im Einsatz gegen bakterielle Krankheiten machen. Obwohl sie speziell beim Einsatz gegen bakterielle Infektionen, welche durch Antibiotika resistente Erreger hervorgerufen werden, eine maßgebende Rolle spielen könnten, waren bisher die hohen Produktionskosten ein Hindernis für die medizinische Anwendung. Ein kostengünstiges und einfach zu handhabendes System, wie beispielsweise Chloroplasten in Pflanzen, würde diese lytischen Enzyme zu einer effizienten Alternative zu herkömmlichen Antibiotika machen. In dieser Arbeit wird erstmals die erfolgreiche Produktion von lytischen Enzymen in Tabak-Chloroplasten vorgestellt, welche mit einem Fremdproteingehalt von mehr als 70% des gesamtlöslichen Proteins der Pflanze eine Menge beschreibt, die bisher mit diesem Verfahren noch nicht erreicht wurde. Alle in Chloroplasten hergestellten lytischen Enzyme zeigten hohe spezifische bakteriolytische Aktivität gegen die gewählten Humanpathogene und waren innerhalb von Minuten in der Lage diese Bakterien abzutöten. Zur Herstellung von zwei lytischen Enzymen wurde in dieser Arbeit ein spezieller Shuttle-Vektor entworfen, der die Expression von toxischen Genen innerhalb von E. coli Zellen im Zuge der DNA Replikation vermeidet, jedoch die Herstellung einer ungehinderten Expression der toxischen Gene in den Chloroplasten nach Beseitigung des Selektionsmarkers erlaubte. Ein Vergleich zwischen einem herkömmlich verwendeten Transformationsvektor und dem Shuttle-Vektor mittels eines Reportergens zeigte, dass das neu entwickelte System bis zu 4 mal mehr Protein produzierte. Diese Ergebnisse zeigen das Potential von Chloroplasten als kostengünstige und leicht zu handhabende Produktionsplattform für lytische Enzyme, welche als neue Generation von Antibiotika attraktive Alternativen zu herkömmlichen Therapien bieten. KW - Phagenlysine KW - Chloroplastentransformation KW - Antibiotikaersatz KW - Antibiotikaresistenz KW - Phage lysins KW - Chloroplast transformation KW - Antibiotic alternatives KW - Antibiotic resistance Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-28950 ER -