TY - THES A1 - Bühler, Miriam T1 - The role of (xeno)hormone-activated GPER1 for centrosome amplification and whole chromosomal instability in colon cell lines N2 - The G protein-coupled estrogen receptor (GPER1) is acknowledged as an important mediator of estrogen signaling. Given the ubiquitous expression of GPER1, it is likely that the receptor plays a role in a variety of malignancies, not only in the classic hormonally regulated tissues (e.g., breast, ovary, and prostate), but also in the colon. As colorectal cancer (CRC) is the third most common cancer in both men and women worldwide and environmental factors and dietary habits are important risk factors, it is increasingly recognized that natural and synthetic hormones and their associated receptors might play a role in CRC. Through oral consumption, environmental contaminants with endocrine activity are in contact with the gastrointestinal mucosa, where they might exert their toxic effects. Although GPER1 has been shown to be engaged in physiological and pathophysiological processes, its role in CRC remains poorly understood. Thus, pro- as well as anti-tumorigenic effects are described in the literature. This thesis has uncovered novel roles of GPER1 in mediating major CRC-associated phenotypes in transformed and non-transformed colon cell lines. Exposure to the estrogens 17β-estradiol (E2), bisphenol-A (BPA) and diethylstilbestrol (DES) but also the androgen dihydrotestosterone (DHT) resulted in GPER1-dependent induction of supernumerary centrosomes, whole chromosomal instability (w-CIN) and aneuploidy. Indeed, both knockdown and inhibition of GPER1 attenuated the generation of (xeno)hormone-driven supernumerary centrosomes and karyotype instability. Mechanistically, (xeno)hormone-induced centrosome amplification was associated with transient multipolar mitosis and the generation of so called anaphase “lagging” chromosomes. The results of this thesis propose a GPER1/PKA/AKAP9-pathway in regulating centrosome numbers in colorectal cancer cells and the involvement of the centriolar protein centrin. Remarkably, exposure to (xeno)hormones resulted in atypical enlargement and unexpected phosphorylation of the centriole marker centrin in interphase. These findings provide a novel role for GPER1 in key CRC-prone lesions and shed light on underlying mechanisms that involve GPER1 function in the colon. Elucidating to what extent centrosomal proteins are involved in the GPER1-mediated aneugenic effect will be an important task for future studies. The present study was intended to lay a first foundation to understand the molecular basis and potential risk factors of CRC which might help to reduce the use of laboratory animals. Since numerous animal experiments are conducted in biomedical research, the development of alternative methods is indispensable. The Federal Institute for Risk Assessment (BfR) as the German Center for the Protection of Laboratory Animals (Bf3R) addresses this issue by uncovering underlying mechanisms leading to colorectal cancer as necessary prerequisite in order to develop alternative methods. N2 - Der G-Protein-gekoppelte Östrogenrezeptor (GPER1) ist als wichtiger Vermittler von Östrogensignalen bekannt. Angesichts der ubiquitären Expression von GPER1 ist es wahrscheinlich, dass der Rezeptor bei einer Vielzahl von Krebserkrankungen eine Rolle spielt, nicht nur in den klassischen hormonell regulierten Geweben (z. B. Brust, Eierstöcke und Prostata), sondern auch im Darm. Da Darmkrebs (Colorectal cancer, CRC) weltweit die dritthäufigste Krebserkrankung sowohl bei Männern als auch bei Frauen ist und Umweltfaktoren und Ernährungsgewohnheiten wichtige Risikofaktoren darstellen, geht man zunehmend davon aus, dass natürliche und synthetische Hormone und ihre zugehörigen Rezeptoren eine Rolle im Darmkrebs spielen könnten. Durch orale Aufnahme kommen Umweltschadstoffe mit endokriner Aktivität mit der Magen-Darm-Schleimhaut in Kontakt, wo sie ihre toxischen Wirkungen entfalten könnten. Obwohl gezeigt wurde, dass GPER1 an physiologischen und pathophysiologischen Prozessen beteiligt ist, ist seine Rolle im Darmkrebs nach wie vor unzureichend geklärt. So werden in der Literatur sowohl Tumor-fördernde als auch -hemmende Wirkungen beschrieben werden. In dieser Arbeit wurden neue Rollen von GPER1 bei der Vermittlung wichtiger Darmkrebs-assoziierter Phänotypen in transformierten und nicht-transformierten Kolonzelllinien aufgedeckt. Die Exposition gegenüber den Östrogenen 17β-Östradiol (E2), Bisphenol-A (BPA) und Diethylstilbestrol (DES), aber auch dem Androgen Dihydrotestosteron (DHT) führte zu einer GPER1-abhängigen Induktion von überzähligen Zentrosomen, chromosomaler Instabilität (w-CIN) und Aneuploidie. Sowohl der Knockdown, als auch die Inhibierung von GPER1 verringerten die Entstehung von (xeno)hormon-bedingten überzähligen Zentrosomen und Karyotyp Instabilität. Mechanistisch gesehen war die (Xeno-)Hormon-induzierte Zentrosomen Amplifikation mit einer vorübergehenden multipolaren Mitose und der Bildung von sogenannten Anaphasen „lagging“ Chromosomen verbunden. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten auf einen GPER1/PKA/AKAP9-Weg zur Regulierung der Zentrosomenzahl in Darmkrebszellen und eine Beteiligung des zentriolären Proteins Zentrin hin. Bemerkenswerterweise führte die Exposition gegenüber (Xeno-)Hormonen zu einer atypischen Vergrößerung und unerwarteten Phosphorylierung des Zentriolen Markers Centrin in der Interphase. Diese Ergebnisse enthüllen eine neue Rolle für GPER1 in wichtigen, mit Darmkrebs assoziierten Läsionen und geben Aufschluss auf die zugrundeliegenden Mechanismen der GPER1-Funktion im Darm. Die Aufklärung zu welchem Ausmaßes zentrosomale Proteine an der GPER1-vermittelten aneugenischen Wirkung beteiligt sind, wird eine wichtige Aufgabe für zukünftige Studien sein. Mit der vorliegenden Studie sollte eine erste Grundlage für das Verständnis der molekularen Grundlagen und potenziellen Risikofaktoren von Darmkrebs geschaffen werden, was dazu beitragen könnte, den Einsatz von Versuchstieren zu reduzieren. Da in der biomedizinischen Forschung zahlreiche Tierversuche durchgeführt werden, ist die Entwicklung von Alternativmethoden unerlässlich. Das Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR) als Deutsches Zentrum zum Schutz von Versuchstieren (Bf3R) widmet sich diesem Thema, indem es die zugrundeliegenden Mechanismen, die zu Darmkrebs führen, als notwendige Voraussetzung für die Entwicklung alternativer Methoden aufdeckt. KW - centrosome amplification KW - colon cancer KW - G protein-coupled estrogen receptor KW - whole chromosomal instability KW - (xeno)hormones KW - Zentrosomen Amplifikation KW - Darmkrebs KW - G protein-gekoppelter Östrogen Rezeptor KW - chromosomale Instabilität KW - (Xeno)Hormone Y1 - 2023 ER - TY - THES A1 - Bertz, Martin T1 - Funktion von Selenoproteinen  während der kolorektalen Karzinogenese T1 - The role of selenoproteins in colorectal carcinogenesis N2 - Kolorektalkrebs (CRC) ist die dritthäufigste Tumorerkrankung weltweit. Neben dem Alter spielt auch die Ernährung eine wichtige Rolle bei der Entstehung der Krankheit. Eine vermutlich krebspräventive Wirkung wird dabei dem Spurenelement Selen zugeschrieben, das fast ausschließlich über Lebensmittel aufgenommen wird. So hängt beispielsweise ein niedriger Selenstatus mit dem Risiko, im Laufe des Lebens an CRC zu erkranken, zusammen. Seine Funktionen vermittelt Selen dabei überwiegend durch Selenoproteine, in denen es in Form von Selenocystein eingebaut wird. Zu den bisher am besten untersuchten Selenoproteinen mit möglicher Funktion während CRC zählen die Glutathionperoxidasen (GPXen). Die Mitglieder dieser Familie tragen aufgrund ihrer Hydroperoxid-reduzierenden Eigenschaften entscheidend zum Schutz der Zellen vor oxidativem Stress bei. Dies kann je nach Art und Stadium des Tumors entweder krebshemmend oder -fördernd wirken, da auch transformierte Zellen von dieser Schutzfunktion profitieren. In dieser Arbeit wurde die GPX2 in HT29-Darmkrebszellen mithilfe stabil-transfizierter shRNA herunterreguliert, um die Funktion des Enzyms vor allem in Hinblick auf regulierte Signalwege zu untersuchen. Ein Knockdowns (KD) der strukturell ähnlichen GPX1 kam ebenfalls zum Einsatz, um gezielt Isoform-spezifische Funktionen unterscheiden zu können. Anhand eines PCR-Arrays wurden Signalwege identifiziert, die auf einen Einfluss der beiden Proteine im Zellwachstum hindeuteten. Anschließende Untersuchungen ließen auf einen verminderten Differenzierungsstatus in den GPX1- und GPX2-KDs aufgrund einer geringeren Aktivität der Alkalischen Phosphatase schließen. Zudem war die Zellviabilität im Neutralrot-Assay (NRU) bei Fehlen der GPX1 bzw. GPX2 im Vergleich zur Kontrolle reduziert. Die Ergebnisse des PCR-Arrays, und speziell für die GPX2 frühere Untersuchungen der Arbeitsgruppe, wiesen weiterhin auf eine Rolle der beiden Proteine in der entzündungsgetriebenen Karzinogenese hin. Daher wurden auch mögliche Interaktionen mit dem NFκB-Signalweg analysiert. Eine Stimulation der Zellen mit dem proinflammatorischen Zytokin IL1β ging mit einer verstärkten Aktivierung der MAP-Kinasen ERK1/2 in den Zellen mit GPX1- bzw. GPX2-KD einher. Die gleichzeitige Behandlung mit dem Antioxidans NAC führte nicht zur Rücknahme der Effekte in den KDs, sodass möglicherweise nicht nur die antioxidativen Eigenschaften der Enzyme bei der Interaktion mit diesen Signalwegsproteinen relevant sind. Weiterhin wurden Analysen zum Substratspektrum der GPX2 in HCT116-Zellen mit einer Überexpression des Proteins durchgeführt. Dabei zeigte sich mittels NRU-Assay und DNA-Laddering, dass die GPX2 besonders vor den proapoptotischen Effekten einer Behandlung mit den Lipidhydroperoxiden HPODE und HPETE schützt. Im Gegensatz zur GPX2 lässt sich Selenoprotein H (SELENOH) stärker durch die alimentäre Selenzufuhr beeinflussen. Einer möglichen Nutzung als Biomarker oder gar als Ansatzpunkt bei der Prävention bzw. Behandlung von CRC steht allerdings unvollständiges Wissen über die Funktion des Proteins gegenüber. Zur genaueren Charakterisierung von SELENOH wurden daher stabil-transfizierte KD-Klone in HT29- und Caco2-Zellen hergestellt und zunächst auf ihre Tumorigenität untersucht. Zellen mit SELENOH-KD bildeten mehr und größere Kolonien im Soft Agar und zeigten ein erhöhtes Proliferations- und Migrationspotenzial im Vergleich zur Kontrolle. Ein Xenograft in Nacktmäusen resultierte zudem in einer stärkeren Tumorbildung nach Injektion von KD-Zellen. Untersuchungen zur Beteiligung von SELENOH an der Zellzyklusregulation deuten auf eine hemmende Rolle des Proteins in der G1/S-Phase hin. Die weiterhin beobachtete Hochregulation von SELENOH in humanen Adenokarzinomen und präkanzerösem Mausgewebe lässt sich möglicherweise mit der postulierten Schutzfunktion vor oxidativen Zell- und DNA-Schäden erklären. In gesunden Darmepithelzellen war das Protein vorrangig am Kryptengrund lokalisiert, was zu einer potenziellen Rolle während der gastrointestinalen Differenzierung passt. N2 - Colorectal cancer (CRC) is the third most common cancer worldwide. In addition to age, diet also plays an important role in the onset of the disease. The trace element selenium, which is absorbed almost exclusively from food, has been accredited with a cancer-preventive effect. For instance, a low selenium status is associated with the risk of developing CRC. The biological functions of selenium are predominantly mediated by selenoproteins, in which the element is incorporated in the form of selenocysteine. Glutathione peroxidases (GPXs) are among the most studied selenoproteins with potential functions during CRC. The members of this family are crucial for protecting cells from oxidative stress due to their hydroperoxide- reducing properties. These properties can either be anti- or procarcinogenic, depending on the type and stage of the tumor, since transformed cells may also benefit from this protection. In the course of this thesis, GPX2 was downregulated in HT29 colon cancer cells using stably transfected shRNA to investigate the proteins’ function, with particular respect to potentially regulated signaling pathways. A knockdown (KD) of the structurally similar GPX1 was also utilised to discriminate between isoform-specific effects. Signaling pathways related to cell growth were shown to be influenced by the KDs in a PCR array. Subsequent studies revealed a decreased differentiation status (lower activity of the enzyme alkaline phosphatase) in cells lacking GPX1 or GPX2. In addition, cell viability was reduced in the absence of either protein compared to the control when testing the neutral red uptake (NRU). Results of the PCR array as well as earlier findings of our research group suggested a role of both GPX1 and GPX2 in inflammation-driven carcinogenesis. Therefore, potential interactions with the NFκB signaling pathway were analyzed. Treatment using the proinflammatory cytokine IL1β was accompanied by an increased activation of the MAP kinases ERK1/2 in cells with a KD of GPX1 and GPX2, respectively. Concomitant administration of the antioxidant NAC did not reverse the observed effects, indicating that maybe not only the antioxidant properties of the enzymes were relevant for the interaction with these signaling proteins. Also, the substrate spectrum of GPX2 was analysed in HCT116 cells overexpressing the enzyme. By means of NRU assay and DNA laddering it was shown that GPX2 preferably protected cancer cells against the proapoptotic effects of the lipid hydroperoxides HPODE and HPETE. In contrast to GPX2, selenoprotein H (SELENOH) might be more easily influenced by the selenium content in the diet. Due to incomplete knowledge about the function of the protein, a prospective use as a biomarker or even as a target in the prevention or treatment of CRC has not been feasible. Therefore, stably transfected SELENOH-KD clones in HT29 and Caco2 cells were created to further characterise the protein. Interestingly, SELENOH-KD cells formed more and larger colonies in soft agar assay and showed increased proliferation as well as migration potential compared to control cells. Injecting tumour cells into nude mice resulted in larger tumour growth with the protein being knocked down. SELENOH was further shown to regulate the cell cycle by potentially inhibiting the transition from G1 to S phase. The observed upregulation of SELENOH in human adenocarcinomas and precancerous mouse tissue was consistent with the postulated role of the protein in protecting cells from oxidative DNA damage. In healthy intestinal epithelial cells, the protein was located predominantly at the crypt base, suggesting a function during gastrointestinal differentiation. KW - GPX KW - Selen KW - SELENOH KW - CRC KW - Darmkrebs KW - glutathione peroxidase KW - selenium KW - SELENOH KW - CRC KW - colorectal cancer Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-427808 ER -