TY - THES A1 - Burkhardt, Wiebke T1 - Role of dietary sulfonates in the stimulation of gut bacteria promoting intestinal inflammation T1 - Die Rolle nahrungsrelevanter Sulfonate bei der Stimulation von entzündungsfördernden Darmbakterien N2 - The interplay between intestinal microbiota and host has increasingly been recognized as a major factor impacting health. Studies indicate that diet is the most influential determinant affecting the gut microbiota. A diet rich in saturated fat was shown to stimulate the growth of the colitogenic bacterium Bilophila wadsworthia by enhancing the secretion of the bile acid taurocholate (TC). The sulfonated taurine moiety of TC is utilized as a substrate by B. wadsworthia. The resulting overgrowth of B. wadsworthia was accompanied by an increased incidence and severity of colitis in interleukin (IL)-10-deficient mice, which are genetically prone to develop inflammation. Based on these findings, the question arose whether the intake of dietary sulfonates also stimulates the growth of B. wadsworthia and thereby promotes intestinal inflammation in genetically susceptible mice. Dietary sources of sulfonates include green vegetables and cyanobacteria, which contain the sulfolipids sulfoquinovosyl diacylglycerols (SQDG) in considerable amounts. Based on literature reports, the gut commensal Escherichia coli is able to release sulfoquinovose (SQ) from SQDG and in further steps, convert SQ to 2,3-dihydroxypropane-1-sulfonate (DHPS) and dihydroxyacetone phosphate. DHPS may then be utilized as a growth substrate by B. wadsworthia, which results in the formation of sulfide. Both, sulfide formation and a high abundance of B. wadsworthia have been associated with intestinal inflammation. In the present study, conventional IL-10-deficient mice were fed either a diet supplemented with the SQDG-rich cyanobacterium Spirulina (20%, SD) or a control diet. In addition SQ, TC, or water were orally applied to conventional or gnotobiotic IL-10-deficient mice. The gnotobiotic mice harbored a simplified human intestinal microbiota (SIHUMI) either with or without B. wadsworthia. During the intervention period, the body weight of the mice was monitored, the colon permeability was assessed and fecal samples were collected. After the three-week intervention, the animals were examined with regard to inflammatory parameters, microbiota composition and sulfonate concentrations in different intestinal sites. None of the mice treated with the above-mentioned sulfonates showed weight loss or intestinal inflammation. Solely mice fed SD or gavaged with TC displayed a slight immune response. These mice also displayed an altered microbiota composition, which was not observed in mice gavaged with SQ. The abundance of B. wadsworthia was strongly reduced in mice fed SD, while that of mice treated with SQ or TC was in part slightly increased. The intestinal SQ-concentration was elevated in mice orally treated with SD or SQ, whereas neither TC nor taurine concentrations were consistently elevated in mice gavaged with TC. Additional colonization of SIHUMI mice with B. wadsworthia resulted in a mild inflammatory response, but only in mice treated with TC. In general, TC-mediated effects on the immune system and abundance of B. wadsworthia were not as strong as described in the literature. In summary, neither the tested dietary sulfonates nor TC led to bacteria-induced intestinal inflammation in the IL-10-deficient mouse model, which was consistently observed in both conventional and gnotobiotic mice. For humans, this means that foods containing SQDG, such as spinach or Spirulina, do not increase the risk of intestinal inflammation. N2 - Die mikrobielle Lebensgemeinschaft im Darm des Menschen, die intestinale Mikrobiota, übt einen beträchtlichen Einfluss auf die Gesundheit des Wirts aus. Der Wirt wiederum beeinflusst die intestinale Mikrobiota durch seine Ernährung. Bei Mäusen wurde beobachtet, dass eine Ernährung reich an gesättigten Fettsäuren zu Darmentzündung führen kann, wenn die Tiere Interleukin (IL)-10-defizient sind, was sie empfänglich für Entzündungen macht. Durch die fettreiche Ernährung wurde vermehrt die sulfonierte Gallensäure Taurocholat (TC) sekretiert, welche wiederum das Wachstum des entzündungsfördernden Bakteriums Bilophila wadsworthia stimulierte. Aufgrund dieser Beobachtung stellte sich die Frage, ob auch nahrungsrelevante Sulfonate bei IL-10-defizienten Mäusen zu einer bakteriell induzierten Darmentzündung führen können. Bei den in dieser Arbeit untersuchten Sulfonaten handelt es sich um die Sulfolipide Sulfoquinovosyldiacylglycerole (SQDG), welche in den meisten photosynthetischen Organismen wie Pflanzen, Moosen und Cyanobakterien vorkommen. Aus der Literatur ist bekannt, dass SQDG durch das kommensale Darmbakterium Escherichia coli zu Sulfoquinovose (SQ) und in weiteren Schritten zu 2,3-Dihydroxypropan-1-sulfonat (DHPS) und Dihydroxyacetonphosphat gespalten werden kann. DHPS kann von B. wadsworthia wiederum als Wachstumssubstrat verwendet und zu Sulfid reduziert werden. Sowohl für B. wadsworthia als auch für Sulfid wird angenommen, dass sie zur Entstehung von Darmentzündungen beitragen. Um diese Hypothese zu untersuchen, wurden konventionelle IL-10-defiziente Mäuse für drei Wochen mit einem Futter gefüttert, welches das SQDG-reiche Cyanobakterium Spirulina (20%, SD) enthielt. Weiterhin wurde IL-10-defizienten Mäusen mit einer komplexen oder minimalen intestinalen Mikrobiota für drei Wochen SQ oder TC oral verabreicht. Die Tiere mit der minimalen Mikrobiota waren mit einer simplifizierten humanen intestinalen Mikrobiota (SIHUMI) mit oder ohne B. wadsworthia besiedelt. Während der Versuche wurden die Tiere gewogen, Fäzesproben wurden gesammelt und ein Darm-Permeabilitätstest wurde durchgeführt. Nach der dreiwöchigen Intervention wurden Entzündungsparameter, Mikrobiotazusammensetzung und Sulfonatkonzentrationen in den einzelnen Darmabschnitten der Mäuse untersucht. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigten, dass keines der getesteten Sulfonate zu Gewichtsverlust oder Darmentzündung führte. Lediglich die Mäuse, die mit SD gefüttert oder denen TC appliziert wurde, zeigten Anzeichen einer schwachen Immunantwort. Auch wiesen diese Mäuse Veränderungen in der Zusammensetzung der Darmmikrobiota auf, was bei den mit SQ behandelten Mäusen nicht der Fall war. Die Zellzahl von B. wadsworthia war in SD-gefütterten Mäusen deutlich reduziert, während die Zellzahl dieses Bakteriums in den Mäuse, die mit SQ oder TC behandelt wurden, nur teilweise leicht erhöht war. Die SQ-Konzentrationen in den Inhalten einzelner Darmabschnitte waren bei den mit SD oder SQ behandelten Mäusen erhöht. Die Taurin- und TC-Konzentrationen glichen bei mit TC behandelten Mäusen überwiegend denen der Kontrolltiere. Die zusätzliche Besiedlung der SIHUMI-Mäuse mit B. wadsworthia führte nur in Tieren, denen TC appliziert wurde, zu leicht erhöhten Entzündungswerten. Allgemein übte die orale Applikation von TC weniger starke Effekte auf das Entzündungsgeschehen und die Mikrobiotazusammensetzung der Mäuse aus als in der Literatur beschrieben. Die Ergebnisse dieser Studie legen nahe, dass weder das SQDG-reiche Futter noch die orale Applikation von SQ oder TC zu einer bakteriell induzierten Darmentzündung bei IL-10-defizienten Mäusen führt. Für den Menschen bedeutet dies, dass SQDG-haltige Lebensmittel wie Spinat oder Spirulina das Risiko für Darmentzündungen nicht erhöhen. KW - Bilophila wadsworthia KW - Dietary sulfonates KW - Inflammatory bowel disease KW - Bilophila wadsworthia KW - Nahrungssulfonate KW - chronisch-entzündliche Darmerkrankungen Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-513685 ER - TY - THES A1 - Schumann, Sara T1 - Influence of intestinal inflammation on bacterial protein expression in monoassociated mice T1 - Der Einfluss chronisch-entzündlicher Darmerkrankungen auf die Proteinexpression intestinaler E. coli N2 - Background: Increased numbers of intestinal E. coli are observed in inflammatory bowel disease, but the reasons for this proliferation and it exact role in intestinal inflammation are unknown. Aim of this PhD-project was to identify E. coli proteins involved in E. coli’s adaptation to the inflammatory conditions in the gut and to investigate whether these factors affect the host. Furthermore, the molecular basis for strain-specific differences between probiotic and harmful E. coli in their response to intestinal inflammation was investigated. Methods: Using mice monoassociated either with the adherent-invasive E. coli (AIEC) strain UNC or the probiotic E. coli Nissle, two different mouse models of intestinal inflammation were analysed: On the one hand, severe inflammation was induced by treating mice with 3.5% dextran sodium sulphate (DSS). On the other hand, a very mild intestinal inflammation was generated by associating interleukin 10-deficient (IL-10-/-) mice with E. coli. Differentially expressed proteins in the E. coli strains collected from caecal contents of these mice were identified by two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis. Results DSS-experiment: All DSS-treated mice revealed signs of a moderate caecal and a severe colonic inflammation. However, mice monoassociated with E. coli Nissle were less affected. In both E. coli strains, acute inflammation led to a downregulation of pathways involved in carbohydrate breakdown and energy generation. Accordingly, DSS-treated mice had lower caecal concentrations of bacterial fermentation products than the control mice. Differentially expressed proteins also included the Fe-S cluster repair protein NfuA, the tryptophanase TnaA, and the uncharacterised protein YggE. NfuA was upregulated nearly 3-fold in both E. coli strains after DSS administration. Reactive oxygen species produced during intestinal inflammation damage Fe-S clusters and thereby lead to an inactivation of Fe-S proteins. In vitro data indicated that the repair of Fe-S proteins by NfuA is a central mechanism in E. coli to survive oxidative stress. Expression of YggE, which has been reported to reduce the intracellular level of reactive oxygen species, was 4- to 8-fold higher in E. coli Nissle than in E. coli UNC under control and inflammatory conditions. In vitro growth experiments confirmed these results, indicating that E. coli Nissle is better equipped to cope with oxidative stress than E. coli UNC. Additionally, E. coli Nissle isolated from DSS-treated and control mice had TnaA levels 4- to 7-fold higher than E. coli UNC. In turn, caecal indole concentrations resulting from cleavage of tryptophan by TnaA were higher in E. coli Nissle- associated control mice than in the respective mice associated with E. coli UNC. Because of its anti-inflammatory effect, indole is hypothesised to be involved in the extension of the remission phase in ulcerative colitis described for E. coli Nissle. Results IL-10-/--experiment: Only IL-10-/- mice monoassociated with E. coli UNC for 8 weeks exhibited signs of a very mild caecal inflammation. In agreement with this weak inflammation, the variations in the bacterial proteome were small. Similar to the DSS-experiment, proteins downregulated by inflammation belong mainly to the central energy metabolism. In contrast to the DSS-experiment, no upregulation of chaperone proteins and NfuA were observed, indicating that these are strategies to overcome adverse effects of strong intestinal inflammation. The inhibitor of vertebrate C-type lysozyme, Ivy, was 2- to 3-fold upregulated on mRNA and protein level in E. coli Nissle in comparison to E. coli UNC isolated from IL-10-/- mice. By overexpressing ivy, it was demonstrated in vitro that Ivy contributes to a higher lysozyme resistance observed for E. coli Nissle, supporting the role of Ivy as a potential fitness factor in this E. coli strain. Conclusions: The results of this PhD-study demonstrate that intestinal bacteria sense even minimal changes in the health status of the host. While some bacterial adaptations to the inflammatory conditions are equal in response to strong and mild intestinal inflammation, other reactions are unique to a specific disease state. In addition, probiotic and colitogenic E. coli differ in their response to the intestinal inflammation and thereby may influence the host in different ways. N2 - Hintergrund: Chronisch entzündliche Darmerkrankungen zeichnen sich unter anderem durch eine starke Proliferation intestinaler E. coli aus. Unbekannt ist jedoch, ob diese Vermehrung eine Ursache oder eine Folge der Erkrankung darstellt. Ziel der vorliegenden Doktorarbeit war es daher, E. coli-Proteine zu identifizieren, welche der Anpassung an die entzündlichen Bedingungen im Darmtrakt dienen und unter Umständen einen Effekt auf den Gesundheitszustand des Wirtes haben. Weiterhin sollten die molekularen Ursachen für stammesspezifische Unterschiede zwischen probiotischen und gesundheitsschädlichen E. coli näher untersucht werden. Methoden: In den tierexperimentellen Analysen wurden keimfreie Mäuse entweder mit dem probiotischen E. coli Nissle oder dem adhärent-invasiven E. coli UNC monoassoziiert und in zwei verschiedenen Entzündungsmodellen näher untersucht. Einerseits wurde eine starke Darmentzündung durch die Gabe von 3,5% Natrium-Dextransulfat (DSS) ausgelöst. Andererseits wurde in Interleukin 10-defizienten (IL-10-/-) Mäusen eine sehr milde Form der Entzündung durch Besiedlung mit E. coli induziert. Die E. coli Bakterien wurden am Ende der Versuche aus den Caecuminhalten der Mäuse isoliert und die bakterielle Proteinexpression wurde mittels zwei-dimensionaler Gelelektrophorese analysiert. Ergebnisse des DSS-Versuchs: Alle Tiere des DSS-Versuchs entwickelten unabhängig vom E. coli Stamm, mit dem sie besiedelt waren, eine moderate Entzündung im Caecum und eine starke im Colon, wobei die Entzündungsreaktion durch die Monoassoziation mit E. coli Nissle leicht abgeschwächt wurde. In beiden E. coli Stämmen führte die Darmentzündung zu einer verringerten Expression von Enzymen des Kohlenhydratabbaus und der Energiegewinnung. In Folge dessen waren die intestinalen Konzentrationen bakterieller Fermentationsprodukte in den entzündeten Tieren geringer als in den gesunden Kontrolltieren. Weitere differentiell exprimierte Proteine umfassen das Fe-S- Cluster Reparaturprotein NfuA, die Tryptophanase TnaA und das uncharakterisierte Protein YggE. In beiden E. coli Stämmen, welche aus den DSS-Tieren isoliert wurden, war das NfuA Protein dreifach höher exprimiert. Eine Darmentzündung führt zu einer vermehrten Bildung reaktiver Sauerstoffspezies, welche die Fe-S-Cluster in Eisen-Schwefel-Proteinen zerstören und damit zu einer Inaktivierung dieser Proteine führen. In vitro Untersuchungen bestätigten, dass die Reparatur der Eisen-Schwefel-Proteine durch NfuA ein wichtiger Mechanismus ist um oxidativem Stress entgegenzuwirken. Das YggE Protein, welches laut Literaturangaben einen hemmenden Einfluss auf die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies hat, war in E. coli Nissle 4- bis 8-fach erhöht (verglichen mit E. coli UNC unter Kontroll- und Entzündungsbedingungen). In vitro Versuche bestätigten diese Daten und zeigten, dass E. coli Nissle im Vergleich zu E. coli UNC eine erhöhte Resistenz gegenüber oxidativem Stress aufweist. Außerdem wurde im Vergleich E. coli Nissle vs. E. coli UNC (unter Entzündungs- und Kontrollbedingungen) ein 4- bis 7-fach erhöhter TnaA-Gehalt nachgewiesen. Indol, das Produkt der TnaA-katalysierten Tryptophanspaltung wurde in erhöhten Mengen im Intestinaltrakt E. coli Nissle-assoziierter Kontrolltiere detektiert. Seit längerem werden entzündungshemmende Eigenschaften für Indol postuliert, die aufgrund der Ergebnisse dieser Doktorarbeit nun auch mit den gesundheitsfördenden Eigenschaften von E. coli Nissle in Zusammenhang gebracht werden können. Ergebnisse des IL-10-/-- Versuchs: Nach einer 8-wöchigen Assoziationsdauer wurde nur in den mit E. coli UNC besiedelten IL-10-/- Tieren eine schwache Entzündungsreaktion nachgewiesen. Bedingt durch diese sehr schwach ausgeprägte Entzündungsantwort waren auch die Veränderungen im bakteriellen Proteom von E. coli UNC nur gering. Wie im DSS-Versuch waren Proteine des bakteriellen Energiestoffwechsels reprimiert, allerdings wurde keine Induktion von NfuA beobachtet. Daher scheint die Induktion von NfuA nur der Anpassung an eine starke Entzündung zu dienen. Weiterhin wurde nachgewiesen, dass E. coli Nissle aus IL-10-/- Tieren den Hemmer für das vertebrate C-Typ Lysozym (Ivy) sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene stärker exprimiert als E. coli UNC. Überexpression von Ivy unter in vitro Bedingungen zeigte, dass es an der erhöhten Lysozymresistenz von E. coli Nissle beteiligt ist und somit eine Rolle als möglicher Fitnessfaktor von E. coli Nissle spielt. Schlussfolgerungen: In dieser Doktorarbeit wurde gezeigt, dass Darmentzündungen die Proteinexpression eines im Darm lebenden Bakteriums beeinflussen. Einige der aufgedeckten bakteriellen Anpassungsreaktionen werden sowohl bei einer starken als auch bei einer schwachen Entzündung ausgelöst; andere wiederum sind spezifisch für nur einen dieser Entzündungszustände. Weiterhin wurde deutlich, dass sich E. coli-Stämme hinsichtlich ihrer Reaktion auf eine Darmentzündung unterscheiden und damit möglicherweise den Wirt beeinflussen.  KW - E. coli KW - chronisch-entzündliche Darmerkrankungen KW - Proteom KW - Ivy KW - Probiotika KW - E. coli KW - inflammatory bowel disease KW - proteomics KW - Ivy KW - probiotics Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-67757 ER -