TY  - THES
A1  - Kopka, Joachim
T1  - Applied metabolome analysis : exploration, development and application of gas chromatography-mass spectrometry based metabolite profiling technologies
T1  - Angewandte Metabolom Analyse : Erforschung, Entwicklung und Anwendung von auf Gaschromatographie-Massenspektrometrie basierenden
N2  - The uptake of nutrients and their subsequent chemical conversion by reactions which provide energy and building blocks for growth and propagation is a fundamental property of life. This property is termed metabolism. In the course of evolution life has been dependent on chemical reactions which generate molecules that are common and indispensable to all life forms. These molecules are the so-called primary metabolites. In addition, life has evolved highly diverse biochemical reactions. These reactions allow organisms to produce unique molecules, the so-called secondary metabolites, which provide a competitive advantage for survival. The sum of all metabolites produced by the complex network of reactions within an organism has since 1998 been called the metabolome. The size of the metabolome can only be estimated and may range from less than 1,000 metabolites in unicellular organisms to approximately 200,000 in the whole plant kingdom. In current biology, three additional types of molecules are thought to be important to the understanding of the phenomena of life: (1) the proteins, in other words the proteome, including enzymes which perform the metabolic reactions, (2) the ribonucleic acids (RNAs) which constitute the so-called transcriptome, and (3) all genes of the genome which are encoded within the double strands of desoxyribonucleic acid (DNA). Investigations of each of these molecular levels of life require analytical technologies which should best enable the comprehensive analysis of all proteins, RNAs, et cetera. At the beginning of this thesis such analytical technologies were available for DNA, RNA and proteins, but not for metabolites. Therefore, this thesis was dedicated to the implementation of the gas chromatography – mass spectrometry technology, in short GC-MS, for the in-parallel analysis of as many metabolites as possible. Today GC-MS is one of the most widely applied technologies and indispensable for the efficient profiling of primary metabolites. The main achievements and research topics of this work can be divided into technological advances and novel insights into the metabolic mechanisms which allow plants to cope with environmental stresses. Firstly, the GC-MS profiling technology has been highly automated and standardized. The major technological achievements were (1) substantial contributions to the development of automated and, within the limits of GC-MS, comprehensive chemical analysis, (2) contributions to the implementation of time of flight mass spectrometry for GC-MS based metabolite profiling, (3) the creation of a software platform for reproducible GC-MS data processing, named TagFinder, and (4) the establishment of an internationally coordinated library of mass spectra which allows the identification of metabolites in diverse and complex biological samples. In addition, the Golm Metabolome Database (GMD) has been initiated to harbor this library and to cope with the increasing amount of generated profiling data. This database makes publicly available all chemical information essential for GC-MS profiling and has been extended to a global resource of GC-MS based metabolite profiles. Querying the concentration changes of hundreds of known and yet non-identified metabolites has recently been enabled by uploading standardized, TagFinder-processed data. Long-term technological aims have been pursued with the central aims (1) to enhance the precision of absolute and relative quantification and (2) to enable the combined analysis of metabolite concentrations and metabolic flux. In contrast to concentrations which provide information on metabolite amounts, flux analysis provides information on the speed of biochemical reactions or reaction sequences, for example on the rate of CO2 conversion into metabolites. This conversion is an essential function of plants which is the basis of life on earth. Secondly, GC-MS based metabolite profiling technology has been continuously applied to advance plant stress physiology. These efforts have yielded a detailed description of and new functional insights into metabolic changes in response to high and low temperatures as well as common and divergent responses to salt stress among higher plants, such as Arabidopsis thaliana, Lotus japonicus and rice (Oryza sativa). Time course analysis after temperature stress and investigations into salt dosage responses indicated that metabolism changed in a gradual manner rather than by stepwise transitions between fixed states. In agreement with these observations, metabolite profiles of the model plant Lotus japonicus, when exposed to increased soil salinity, were demonstrated to have a highly predictive power for both NaCl accumulation and plant biomass. Thus, it may be possible to use GC-MS based metabolite profiling as a breeding tool to support the selection of individual plants that cope best with salt stress or other environmental challenges.
N2  - Die Aufnahme von Nährstoffen und ihre chemische Umwandlung mittels Reaktionen, die Energie und Baustoffe für Wachstum und Vermehrung bereitstellen, ist eine grundlegende Eigenschaft des Lebens. Diese Eigenschaft wird Stoffwechsel oder, wie im Folgenden, Metabolismus genannt. Im Verlauf der Evolution war alles Leben abhängig von solchen Reaktionen, die essentielle und allen Lebensformen gemeinsame Moleküle erzeugen. Über diese sogenannten Primärmetabolite hinaus sind hochdiverse Reaktionen entstanden. Diese erlauben Organismen, einzigartige sogenannte Sekundärmetabolite zu produzieren, die in der Regel einen zusätzlichen Überlebensvorteil vermitteln. Die Gesamtheit aller Metabolite, die von dem komplexen Reaktionsnetzwerk in Organismen erzeugt werden, nennt man seit 1998 das Metabolom. Die Größe des Metaboloms kann nur geschätzt werden. Neben der Gesamtheit aller Metabolite werden heute drei weitere Arten an Molekülen als wesentlich betrachtet, um die Phänomene des Lebens zu verstehen: erstens die Proteine, deren Summe, das Proteom, auch die Enzyme einschließt, die die obigen metabolischen Reaktionen durchführen, zweitens die Ribonukleinsäuren (RNS), deren Gesamtheit als Transkriptom bezeichnet wird, und drittens die doppelsträngige Desoxyribonukleinsäure (DNS), die das Genom, die Summe aller Gene eines Organismus, ausmacht. Die Untersuchung aller dieser vier molekularen Ebenen des Lebens erfordert Technologien, die idealerweise die vollständige Analyse der Gesamtheit aller DNS-, RNS-, Protein-Moleküle, bzw. Metabolite erlauben. Zu Beginn meiner Arbeiten waren solche Technologien für DNS, RNS, und Proteine verfügbar, aber nicht für Metabolite. Aus diesem Grund habe ich meine Forschungstätigkeit auf das Ziel ausgerichtet, so viele Metabolite wie irgend möglich in einer gemeinsamen Analyse zu erfassen. Zu diesem Zweck habe ich mich auf eine einzelne Technik, nämlich die gekoppelte Gaschromatographie und Massenspektrometrie, kurz GC-MS, konzentriert. Nicht zuletzt durch meine Arbeiten ist GC-MS heute eine der am häufigsten angewandten Technologien und unverzichtbar für das breite Durchmustern der Metabolite. Neben der Etablierung der grundlegenden GC-MS-Profilanalyse-Technologie liegen die Haupterrungenschaften meiner Arbeiten sowohl in den technischen Neuerungen als auch in den Einsichten in metabolische Mechanismen, die es Pflanzen erlauben, erfolgreich auf Umwelteinflüsse zu reagieren. Die technologischen Errungenschaften waren erstens wesentliche Beiträge zur Labor-Automatisierung und zur Auswertung von modernen, auf Flugzeitmassenspektrometrie beruhenden, GC-MS-Profilanalysen, zweitens die Entwicklung einer entsprechenden Prozessierungs-Software, genannt TagFinder, und drittens die Etablierung einer internationalen Datensammlung zur Metabolitidentifizierung aus komplexen Mischungen. Diese massenspektralen und gaschromatographischen Daten haben seit 2005 Eingang in die von mir initiierte Entwicklung der Golm Metabolom Datenbank (GMD) gefunden, die die zunehmend wachsenden GC-MS-Referenzdaten wie auch die Metabolitprofildaten verwaltet und öffentlich zugänglich macht. Darüber hinaus wurden die langfristigen Ziele einer verbesserten Präzision für relative und absolute Quantifizierung wie auch einer Kopplung von Konzentrationsbestimmung und metabolischen Flussanalysen mittels GC-MS verfolgt. Sowohl die Stoffmengen als auch die Geschwindigkeit der Stoffaufnahme und der chemischen Umsetzung, d.h. der metabolische Fluss, sind wesentlich für neue biologische Einsichten. In diesem Zusammenhang wurde von mir die Aufnahme von CO2 durch Pflanzen, der Basis allen Lebens auf der Erde, untersucht. Angewandt auf das Temperaturstress- und Salzstressverhalten von Modell- und Kulturpflanzen, nämlich des Ackerschmalwands (Arabidopsis thaliana), des Hornklees (Lotus japonicus) und der global bedeutendsten Nutzpflanze Reis (Oryza sativa), wurden detaillierte und vergleichende neue metabolische Einsichten in den Zeitverlauf der Temperaturanpassung und die Anpassung an zunehmend salzhaltige Böden erzielt. Metabolismus verändert sich unter diesen Bedingungen allmählich fortschreitend und nicht in plötzlichen Übergängen. Am Beispiel des Hornklees konnte gezeigt werden, dass Metabolitprofilanalysen eine hohe Vorhersagekraft für die Biomasseerzeugung unter Salzeinfluss wie auch für die Aufnahme von Salz durch die Pflanze haben. So mag es in Zukunft möglich werden, GC-MS-Profilanaysen anzuwenden, um den Züchtungsprozess von Kulturpflanzen zu beschleunigen.
KW  - Metabolomics
KW  - Metaboliten
KW  - Profilanalysen
KW  - Gaschromatographie
KW  - Massenspektrometrie
KW  - Metabolomics
KW  - Metabolites
KW  - Profiling
KW  - Gas Chromatography
KW  - Mass Spectrometry
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-40597
ER  - 
TY  - THES
A1  - Jüppner, Jessica
T1  - Characterization of metabolomic dynamics in synchronized Chlamydomonas reinhardtii cell cultures and the impact of TOR inhibition on cell cycle, proliferation and growth
T1  - Charakterisierung der metabolischen Dynamik in synchronisierten Chlamydomonas reinhardtii Zellkulturen und der Einfluss der TOR-Inhibition auf Zellzyklus, Proliferation und Wachstum
N2  - The adaptation of cell growth and proliferation to environmental changes is essential for the surviving of biological systems. The evolutionary conserved Ser/Thr protein kinase “Target of Rapamycin” (TOR) has emerged as a major signaling node that integrates the sensing of numerous growth signals to the coordinated regulation of cellular metabolism and growth. Although the TOR signaling pathway has been widely studied in heterotrophic organisms, the research on TOR in photosynthetic eukaryotes has been hampered by the reported land plant resistance to rapamycin. Thus, the finding that Chlamydomonas reinhardtii is sensitive to rapamycin, establish this unicellular green alga as a useful model system to investigate TOR signaling in photosynthetic eukaryotes. 
The observation that rapamycin does not fully arrest Chlamydomonas growth, which is different from observations made in other organisms, prompted us to investigate the regulatory function of TOR in Chlamydomonas in context of the cell cycle. Therefore, a growth system that allowed synchronously growth under widely unperturbed cultivation in a fermenter system was set up and the synchronized cells were characterized in detail. In a highly resolved kinetic study, the synchronized cells were analyzed for their changes in cytological parameters as cell number and size distribution and their starch content. Furthermore, we applied mass spectrometric analysis for profiling of primary and lipid metabolism. This system was then used to analyze the response dynamics of the Chlamydomonas metabolome and lipidome to TOR-inhibition by rapamycin 
The results show that TOR inhibition reduces cell growth, delays cell division and daughter cell release and results in a 50% reduced cell number at the end of the cell cycle. Consistent with the growth phenotype we observed strong changes in carbon and nitrogen partitioning in the direction of rapid conversion into carbon and nitrogen storage through an accumulation of starch, triacylglycerol and arginine. Interestingly, it seems that the conversion of carbon into triacylglycerol occurred faster than into starch after TOR inhibition, which may indicate a more dominant role of TOR in the regulation of TAG biosynthesis than in the regulation of starch. 
This study clearly shows, for the first time, a complex picture of metabolic and lipidomic dynamically changes during the cell cycle of Chlamydomonas reinhardtii and furthermore reveals a complex regulation and adjustment of metabolite pools and lipid composition in response to TOR inhibition.
N2  - Die Anpassung der Wachstumsrate an Umweltveränderungen ist essentiell für das Überleben biologischer Systeme. Mit der Identifikation der evolutionär konservierten Serin/Threonin Kinase “Target of Rapamycin” (TOR) war ein zentraler Regulator gefunden, der in Abhängigkeit einer Vielzahl von Wachstumsfaktoren den zellulären Metabolismus und das Wachstum reguliert. Während zum heutigen Zeitpunkt schon relativ gute Kenntnisse über die Funktionen und Signalwege dieser Kinase in heterotrophen Organismen gewonnen werden konnten, wurden die Untersuchungen des TOR-Signalweges in photoautotrophen Organismen durch deren Resistenz gegenüber dem TOR-spezifischen Inhibitor Rapamycin für lange Zeit erschwert. Daher bietet die Entdeckung, dass die einzelligen Grünalge Chlamydomonas reinhardtii eine natürliche Sensitivität gegenüber Rapamycin aufweist, eine gute Grundlage zur Erforschung des TOR-Signalweges in photosynthetisch aktiven Eukaryoten.
Aufgrund der Beobachtung, dass das Wachstum von Chlamydomonas nicht vollständig durch Rapamycin inhibiert werden konnte, was im Gegensatz zu Beobachtungen in anderen Organismen steht, entschieden wir uns für eine detailliertere Analyse des Einflusses von TOR auf den Zellzyklus. Dazu wurde ein System etabliert das eine Synchronisation der Zellen unter weitestgehend ungestörten Bedingungen in einem Fermenter-system erlaubte. Dieses System wurde dann für eine detaillierte Charakterisierung der synchronisierten Zellen genutzt. Mittels einer hochaufgelösten Zeitreihe wurden Veränderungen zytologischer Parameter (Zellzahl und Zellgrößenverteilung) und des Stärkegehalts analysiert. Zusätzlich wurden massenspektrometrische Verfahren zur Analyse des Primär- und Lipidmetabolismus verwendet. Dieses System wurde des Weiteren dazu genutzt dynamische Veränderungen im Metabolom und Lipidom von Chlamydomonas nach Inhibition der TOR Kinase durch Rapamycin zu untersuchen
Die Ergebnisse der TOR-Inhibition zeigen ein vermindertes Wachstum, eine Verzögerung in der Zellteilung und der Entlassung der Tochterzellen und resultieren in einer um 50% verringerten Zellzahl am Ende des Zellzyklus. Des Weiteren konnte eine Akkumulation von Kohlenstoff– und Stickstoff-Reserven in Form von Stärke und Triacylglyceriden, sowie Arginin beobachtet werden. Dabei ist vor allem interessant, dass die der Einbau von Kohlenstoff in Triacylglyceride offenbar schneller erfolgt als der in Stärke, was auf eine dominantere Rolle von TOR in der Regulation der Triacylglycerid-Biosynthese gegenüber der Stärkesynthese hindeutet. 
Diese Studie zeigt zum ersten Mal eine komplexe Analyse der dynamischen Veränderungen im Primär- und Lipidmetabolismus im Verlauf des Zellzyklus von Chlamydomonas und zeigt weiterhin die komplexe Regulation und Adjustierung des Metabolit-Pools und der Lipidzusammensetzung als Antwort auf die Inhibition von TOR.
KW  - chlamydomonas reinhardtii
KW  - metabolites
KW  - Metaboliten
KW  - lipids
KW  - Lipide
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-76923
ER  -