TY  - THES
A1  - Riewe, David
T1  - The relevance of adenylate levels and adenylate converting enzymes on metabolism and development of potato (Solanum tuberosum L.) tubers
T1  - Einfluss der Adenylate und Adenylat-umsetzender Enzyme auf Entwicklung und Stoffwechsel der Kartoffelknolle (Solanum Tuberosum L.)
N2  - Adenylates are metabolites with essential function in metabolism and signaling in all living organisms. As Cofactors, they enable thermodynamically unfavorable reactions to be catalyzed enzymatically within cells. Outside the cell, adenylates are involved in signalling processes in animals and emerging evidence suggests similar signaling mechanisms in the plants’ apoplast. Presumably, apoplastic apyrases are involved in this signaling by hydrolyzing the signal mediating molecules ATP and ADP to AMP. This PhD thesis focused on the role of adenylates on metabolism and development of potato (Solanum tuberosum) by using reverse genetics and biochemical approaches. To study the short and long term effect of cellular ATP and the adenylate energy charge on potato tuber metabolism, an apyrase from Escherichia coli targeted into the amyloplast was expressed inducibly and constitutively. Both approaches led to the identification of adaptations to reduced ATP/energy charge levels on the molecular and developmental level. These comprised a reduction of metabolites and pathway fluxes that require significant amounts of ATP, like amino acid or starch synthesis, and an activation of processes that produce ATP, like respiration and an immense increase in the surface-to-volume ratio. To identify extracellular enzymes involved in adenylate conversion, green fluorescent protein and activity localization studies in potato tissue were carried out. It was found that extracellular ATP is imported into the cell by an apoplastic enzyme complement consisting of apyrase, unspecific phosphatase, adenosine nucleosidase and an adenine transport system. By changing the expression of a potato specific apyrase via transgenic approaches, it was found that this enzyme has strong impact on plant and particular tuber development in potato. Whereas metabolite levels were hardly altered, transcript profiling of tubers with reduced apyrase activity revealed a significant upregulation of genes coding for extensins, which are associated with polar growth. The results are discussed in context of adaptive responses of plants to changes in the adenylate levels and the proposed role of apyrase in apoplastic purinergic signaling and ATP salvaging. In summary, this thesis provides insight into adenylate regulated processes within and outside non-photosynthetic plant cells.
N2  - Adenylate haben essentielle Funktionen in Stoffwechselprozessen und fungieren als Signalmoleküle in allen Organismen. Als Cofaktoren ermöglichen sie die Katalyse thermodynamisch ungünstiger Reaktionen innerhalb der Zelle, und außerhalb der Zelle wirken sie als Signalmoleküle in Tieren und nach neueren Forschungsergebnissen wohl auch in Pflanzen. Vermutlich wird die Signalwirkung von ATP und ADP durch Hydrolyse zu AMP unter Beteiligung apoplastische Apyrasen terminiert. Diese Arbeit behandelt den Einfluss der Adenylate auf Stoffwechsel- und Entwicklungsprozesse in der Kartoffelpflanze (Solanum tuberosum) mittels biochemischer und revers-genetischer Ansätze. Um kurzfristige und langfristige Einflüsse zellulären ATPs und der Energieladung auf den Stoffwechsel von Kartoffelknollen zu untersuchen, wurde eine mit einem plastidären Transitpeptid fusionierte Apyrase aus Escherichia coli induzierbar und dauerhaft exprimiert. Beide Ansätze führten zur Identifizierung von Anpassungen an eine reduzierte ATP Verfügbarkeit bzw. verringerte Energieladung. Die Anpassungen beinhalteten eine Reduzierung von ATP-verbrauchenden Stoffwechselaktivitäten und Stoffwechselprodukten, wie die Aminosäure- oder Stärkesynthese, und eine Aktivierung von Prozessen, welche die ATP-Bildung oder eine effizientere ATP-Bildung ermöglichen, wie Zellatmung und die Vergrößerung des Oberfächen/Volumen-Verhältnisses der Kartoffelknolle. Extrazelluläre Adenylat-umsetzende Enzyme wurden mit Hilfe des grün fluoreszierenden Proteins und Aktivitätsmessungen identifiziert und charakterisiert. Es wurde ein potentieller ATP Bergungsstoffwechselweg gefunden, der ATP über die Enzyme Apyrase, unspezifische Phosphatase und Adenosin-Nukleosidase zu Adenin umsetzt, welches über eine Purin-Permease in die Zelle transportiert wird. Transgene Manipulation der Aktivität der kartoffelspezifischen Apyrase zeigte, dass dieses Enzym einen großen Einfluss auf die Pflanzen-, insbesondere die Knollenentwicklung hat. Obwohl sich Stoffwechselaktivitäten kaum verändert hatten, führte die Verringerung der Apyrase Aktivität in den Knollen zur übermäßigen Expression von Extensin-Genen, die eine Funktion im polaren Wachstum von Pflanzenzellen besitzen. Die Ergebnisse wurden mit Hinblick auf Anpassungen der Pflanze an veränderte Adenylat-Spiegel und der potentiellen Beteiligung der endogenen Apyrase an einem apoplastischen ATP-Signalweg bzw. ATP-Bergungsstoffwechselweg diskutiert. Zusammengefasst, präsentiert diese Arbeit neue Einsichten in Adenylat-regulierte Prozesse in- und außerhalb nicht-photosynthetischer Pflanzenzellen.
KW  - Apyrase
KW  - ATP
KW  - Kartoffel
KW  - Stoffwechsel
KW  - Nukleosidase
KW  - apyrase
KW  - ATP
KW  - potato
KW  - metabolism
KW  - nucleosidase
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-27323
ER  - 
TY  - THES
A1  - Dethloff, Frederik
T1  - In vivo 13C stable isotope tracing of single leaf development in the cold
T1  - Stabile 13C Isotopenmarkierung zur in vivo Untersuchung der Einzelblattentwicklung in der Kälte
N2  - Measuring the metabolite profile of plants can be a strong phenotyping tool, but the changes of metabolite pool sizes are often difficult to interpret, not least because metabolite pool sizes may stay constant while carbon flows are altered and vice versa. Hence, measuring the carbon allocation of metabolites enables a better understanding of the metabolic phenotype. The main challenge of such measurements is the in vivo integration of a stable or radioactive label into a plant without perturbation of the system. To follow the carbon flow of a precursor metabolite, a method is developed in this work that is based on metabolite profiling of primary metabolites measured with a mass spectrometer preceded by a gas chromatograph (Wagner et al. 2003; Erban et al. 2007; Dethloff et al. submitted). This method generates stable isotope profiling data, besides conventional metabolite profiling data. In order to allow the feeding of a 13C sucrose solution into the plant, a petiole and a hypocotyl feeding assay are developed. To enable the processing of large numbers of single leaf samples, their preparation and extraction are simplified and optimised. The metabolite profiles of primary metabolites are measured, and a simple relative calculation is done to gain information on carbon allocation from 13C sucrose. This method is tested examining single leaves of one rosette in different developmental stages, both metabolically and regarding carbon allocation from 13C sucrose. It is revealed that some metabolite pool sizes and 13C pools are tightly associated to relative leaf growth, i.e. to the developmental stage of the leaf. Fumaric acid turns out to be the most interesting candidate for further studies because pool size and 13C pool diverge considerably. In addition, the analyses are also performed on plants grown in the cold, and the initial results show a different metabolite pool size pattern across single leaves of one Arabidopsis rosette, compared to the plants grown under normal temperatures. Lastly, in situ expression of REIL genes in the cold is examined using promotor-GUS plants. Initial results suggest that single leaf metabolite profiles of reil2 differ from those of the WT.
N2  - Messungen des pflanzlichen Metaboloms können ein hilfreiches Werkzeug sein, um Pflanzen zu phänotypisieren. Jedoch sind die Änderungen der Poolgrößen teilweise schwer zu interpretieren, weil sich nicht nur die Poolgrößen sondern auch die Kohlenstoffflüsse unabhängig voneinander ändern können. Werden nun zusätzlich Informationen über die Flüsse ermittelt, kann der pflanzliche Phänotyp deutlich genauer beschrieben werden. Die größte Herausforderung für diese Messungen ist die In-vivo-Integration einer stabilen oder radioaktiven Markierung in einer Pflanze, ohne das System dabei zu stören. In dieser Arbeit wird ein Verfahren entwickelt, um die Verteilung von Kohlenstoffen aus einer gefütterten Vorstufe zu messen. Die Messung basiert dabei auf einem Primärmetabolitenprofil, das mit Hilfe eines Massenspektrometers mit vorgeschaltetem Gaschromatographen erstellt wird (Wagner et al. 2003; Erban et al. 2007; Dethloff et al. eingereicht). Mit dieser Methode ist es einfach möglich, stabile Isotopenprofildaten neben herkömmlichen Metabolitprofildaten zu erzeugen. Die Vorstufe, in diesem Fall 13C Saccharose, wird dazu mit Hilfe eines neuen Petiolen- und Hypokotyl-Fütterungs-Assay in die Pflanze gefüttert. Um die große Menge an Einzelblattproben aufzuarbeiten, die dabei anfallen, wird eine vereinfachte und optimierte Extraktion angewendet. Mit Hilfe einer einfachen Berechnung kann aus den Messdaten eine relative Verteilung des Kohlenstoffs aus 13C Saccharose bestimmt werden. Die Funktionalität dieses Verfahrens wird an Einzelblättern von Arabidopsis-Rosetten gezeigt, wobei sowohl Primärmetabolitenprofile als auch stabile Isotopenprofile erzeugt und untersucht werden. Es kann hierbei gezeigt werden, dass konventionelle Poolgrößen und 13C Poolgrößen einiger Metaboliten eng mit dem relativen Wachstum einzelner Blattpositionen bzw. mit dem jeweiligen Entwicklungsstadium der Blätter zusammenhängen. Anders als bei den meisten anderen Metaboliten zeigen die konventionellen Poolgrößen und 13C Poolgrößen von Fumarsäure ein unterschiedliches Verhalten in den einzelnen Blättern, was Fumarsäure zum interessantesten Kandidaten für weitere Studien macht. Die beschriebenen Untersuchungen werden weiterhin an in Kälte gewachsenen Pflanzen durchgeführt, wobei erste Ergebnisse ein verändertes Metabolitenprofil in den einzelnen Blättern zeigen. Des Weiteren wird die In-situ-Expression von REIL-Genen mit Hilfe von Promotor-GUS-Reportern untersucht. Erste Ergebnisse von Einzelblatt-Metabolitenprofilen der reil2 zeigen einen deutlichen Unterschied zum WT.
KW  - stable isotope tracing
KW  - metabolism
KW  - sucrose
KW  - carbon flow
KW  - qualitative pathway interpretation
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-70486
ER  -