TY - THES A1 - Arnold, Anne T1 - Modeling photosynthesis and related metabolic processes : from detailed examination to consideration of the metabolic context T1 - Modellierung von Photosynthese und damit zusammenhängende metabolische Prozesse : von detaillierter Betrachtung hin zur Erörterung im metabolischen Kontext N2 - Mathematical modeling of biological systems is a powerful tool to systematically investigate the functions of biological processes and their relationship with the environment. To obtain accurate and biologically interpretable predictions, a modeling framework has to be devised whose assumptions best approximate the examined scenario and which copes with the trade-off of complexity of the underlying mathematical description: with attention to detail or high coverage. Correspondingly, the system can be examined in detail on a smaller scale or in a simplified manner on a larger scale. In this thesis, the role of photosynthesis and its related biochemical processes in the context of plant metabolism was dissected by employing modeling approaches ranging from kinetic to stoichiometric models. The Calvin-Benson cycle, as primary pathway of carbon fixation in C3 plants, is the initial step for producing starch and sucrose, necessary for plant growth. Based on an integrative analysis for model ranking applied on the largest compendium of (kinetic) models for the Calvin-Benson cycle, those suitable for development of metabolic engineering strategies were identified. Driven by the question why starch rather than sucrose is the predominant transitory carbon storage in higher plants, the metabolic costs for their synthesis were examined. The incorporation of the maintenance costs for the involved enzymes provided a model-based support for the preference of starch as transitory carbon storage, by only exploiting the stoichiometry of synthesis pathways. Many photosynthetic organisms have to cope with processes which compete with carbon fixation, such as photorespiration whose impact on plant metabolism is still controversial. A systematic model-oriented review provided a detailed assessment for the role of this pathway in inhibiting the rate of carbon fixation, bridging carbon and nitrogen metabolism, shaping the C1 metabolism, and influencing redox signal transduction. The demand of understanding photosynthesis in its metabolic context calls for the examination of the related processes of the primary carbon metabolism. To this end, the Arabidopsis core model was assembled via a bottom-up approach. This large-scale model can be used to simulate photoautotrophic biomass production, as an indicator for plant growth, under so-called optimal, carbon-limiting and nitrogen-limiting growth conditions. Finally, the introduced model was employed to investigate the effects of the environment, in particular, nitrogen, carbon and energy sources, on the metabolic behavior. This resulted in a purely stoichiometry-based explanation for the experimental evidence for preferred simultaneous acquisition of nitrogen in both forms, as nitrate and ammonium, for optimal growth in various plant species. The findings presented in this thesis provide new insights into plant system's behavior, further support existing opinions for which mounting experimental evidences arise, and posit novel hypotheses for further directed large-scale experiments. N2 - Mathematische Modellierung biologischer Systeme eröffnet die Möglichkeit systematisch die Funktionsweise biologischer Prozesse und ihrer Wechselwirkungen mit der Umgebung zu untersuchen. Um präzise und biologisch relevante Vorhersagen treffen zu können, muss eine Modellierungsstrategie konzipiert werden, deren Annahmen das untersuchte Szenario bestmöglichst widerspiegelt und die dem Trade-off der Komplexität der zugrunde liegenden mathematischen Beschreibung gerecht wird: Detailtreue gegenüber Größe. Dementsprechend kann das System detailliert, in kleinerem Umfang oder in vereinfachter Darstellung im größeren Maßstab untersucht werden. In dieser Arbeit wird mittels verschiedener Modellierungsansätze, wie kinetischen und stöchiometrischen Modellen, die Rolle der Photosynthese und damit zusammenhängender biochemischer Prozesse im Rahmen des Pflanzenstoffwechsels analysiert. Der Calvin-Benson-Zyklus, als primärer Stoffwechselweg der Kohlenstofffixierung in C3-Pflanzen, ist der erste Schritt der Stärke- und Saccharoseproduktion, welche maßgeblich für das Wachstum von Pflanzen sind. Basierend auf einer integrativen Analyse zur Modellklassifizierung wurden aus der größten bekannten Sammlung von (kinetischen) Modellen des Calvin-Benson-Zyklus diejenigen ermittelt, die für die Entwicklung von Metabolic-Engineering-Strategien geeignet sind. Angeregt von der Fragestellung warum Kohlenstoff transitorisch vorwiegend in Form von Stärke anstatt Saccharose gespeichert wird, wurden die metabolischen Kosten beider Syntheseprozesse genauer betrachtet. Die Einbeziehung der Bereitstellungskosten der beteiligten Enzyme stützt die Tatsache, dass bevorzugt Stärke als temporärer Kohlenstoffspeicher dient. Die entprechende Untersuchung erfolgte einzig auf Grundlage der Stöchiometrie der Synthesewege. In vielen photosynthetisch-aktiven Organismen findet zudem Photorespiration statt, die der Kohlenstofffixierung entgegenwirkt. Die genaue Bedeutung der Photorespiration für den Pflanzenmetabolismus ist noch umstritten. Eine detaillierte Einschätzung der Rolle dieses Stoffwechselweges bezüglich der Inhibierung der Kohlenstofffixierungsrate, der Verknüpfung von Kohlenstoff- und Stickstoffmetabolismus, der Ausprägung des C1-Stoffwechsels sowie die Einflussnahme auf die Signaltransduktion wurde in einer modell-basierten, kritischen Analyse vorgenommen. Um die Photosynthese in ihrem metabolischen Kontext verstehen zu können, ist die Betrachtung der angrenzenden Prozesse des primären Kohlenstoffmetabolismus unverzichtbar. Hierzu wurde in einem Bottom-up Ansatz das Arabidopsis core Modell entworfen, mittels dessen die Biomasseproduktion, als Indikator für Pflanzenwachtum, unter photoautotrophen Bedingungen simuliert werden kann. Neben sogenannten optimalen Wachstumsbedingungen kann dieses großangelegte Modell auch kohlenstoff- und stickstofflimitierende Umweltbedingungen simulieren. Abschließend wurde das vorgestellte Modell zur Untersuchung von Umwelteinflüssen auf das Stoffwechselverhalten herangezogen, im speziellen verschiedene Stickstoff-, Kohlenstoff- und Energiequellen. Diese auschließlich auf der Stöchiometrie basierende Analyse bietet eine Erklärung für die bevorzugte, gleichzeitige Aufnahme von Nitrat und Ammonium, wie sie in verschiedenen Spezies für optimales Wachstum experimentell beobachtet wurde. Die Resultate dieser Arbeit liefern neue Einsichten in das Verhalten von pflanzlichen Systemen, stützen existierende Ansichten, für die zunehmend experimentelle Hinweise vorhanden sind, und postulieren neue Hypothesen für weiterführende großangelegte Experimente. KW - stöchiometrische Modellierung KW - kinetische Modellierung KW - metabolische Netzwerke KW - metabolische Kosten KW - Photosynthese KW - stoichiometric modeling KW - kinetic modeling KW - metabolic networks KW - metabolic costs KW - photosynthesis Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-72277 ER - TY - THES A1 - Arnold, Stefanie T1 - Epitop-Kartierung von PBP2A und Identifizierung MRSA-spezifischer immunodominanter Peptidsequenzen Y1 - 2014 ER - TY - THES A1 - Büchner, Kerstin T1 - Modifizierung und Charakterisierung von Wellenleitermaterialien für Biosensoranwendungen Y1 - 2014 ER - TY - THES A1 - Czesnick, Hjördis T1 - Functional specialization of Arabidopsis poly(A) polymerases in relation to flowering time and stress T1 - Funktionelle Spezialisierung von Arabidopsis Poly(A)-Polymerasen in Hinsicht auf Blühzeit und Stress N2 - Polyadenylation is a decisive 3’ end processing step during the maturation of pre-mRNAs. The length of the poly(A) tail has an impact on mRNA stability, localization and translatability. Accordingly, many eukaryotic organisms encode several copies of canonical poly(A) polymerases (cPAPs). The disruption of cPAPs in mammals results in lethality. In plants, reduced cPAP activity is non-lethal. Arabidopsis encodes three nuclear cPAPs, PAPS1, PAPS2 and PAPS4, which are constitutively expressed throughout the plant. Recently, the detailed analysis of Arabidopsis paps1 mutants revealed a subset of genes that is preferentially polyadenylated by the cPAP isoform PAPS1 (Vi et al. 2013). Thus, the specialization of cPAPs might allow the regulation of different sets of genes in order to optimally face developmental or environmental challenges. To gain insights into the cPAP-based gene regulation in plants, the phenotypes of Arabidopsis cPAPs mutants under different conditions are characterized in detail in the following work. An involvement of all three cPAPs in flowering time regulation and stress response regulation is shown. While paps1 knockdown mutants flower early, paps4 and paps2 paps4 knockout mutants exhibit a moderate late-flowering phenotype. PAPS1 promotes the expression of the major flowering inhibitor FLC, supposedly by specific polyadenylation of an FLC activator. PAPS2 and PAPS4 exhibit partially overlapping functions and ensure timely flowering by repressing FLC and at least one other unidentified flowering inhibitor. The latter two cPAPs act in a novel regulatory pathway downstream of the autonomous pathway component FCA and act independently from the polyadenylation factors and flowering time regulators CstF64 and FY. Moreover, PAPS1 and PAPS2/PAPS4 are implicated in different stress response pathways in Arabidopsis. Reduced activity of the poly(A) polymerase PAPS1 results in enhanced resistance to osmotic and oxidative stress. Simultaneously, paps1 mutants are cold-sensitive. In contrast, PAPS2/PAPS4 are not involved in the regulation of osmotic or cold stress, but paps2 paps4 loss-of-function mutants exhibit enhanced sensitivity to oxidative stress provoked in the chloroplast. Thus, both PAPS1 and PAPS2/PAPS4 are required to maintain a balanced redox state in plants. PAPS1 seems to fulfil this function in concert with CPSF30, a polyadenylation factor that regulates alternative polyadenylation and tolerance to oxidative stress. The individual paps mutant phenotypes and the cPAP-specific genetic interactions support the model of cPAP-dependent polyadenylation of selected mRNAs. The high similarity of the polyadenylation machineries in yeast, mammals and plants suggests that similar regulatory mechanisms might be present in other organism groups. The cPAP-dependent developmental and physiological pathways identified in this work allow the design of targeted experiments to better understand the ecological and molecular context underlying cPAP-specialization. N2 - Polyadenylierung ist ein entscheidender Schritt der 3‘-End-Prozessierung und somit der Reifung von prä-mRNAs. Die Länge des Poly(A)-Schwanzes entscheidet unter anderem über die Stabilität und Lokalisierung von mRNAs. Viele Eukaryoten besitzen mehrere Kopien der kanonischen Poly(A)-Polymerasen (PAP). In Säugetieren ist das Ausknocken dieser Enzyme letal. Pflanzen mit reduzierter PAP-Aktivität sind hingegen überlebensfähig. Arabidopsis exprimiert drei im Zellkern lokalisierte PAPs namens PAPS1, PAPS2 und PAPS4. Kürzlich ergab die Analyse von Arabidopsis paps1-Mutanten, dass eine Gen-Untergruppe vorzugsweise von PAPS1 polyadenyliert wird (Vi et al. 2013). Die Spezialisierung der PAPs könnte der Regulierung verschiedener Gengruppen in Anpassung an die Pflanzenentwicklung und an bestimmte Umweltbedingungen dienen. In der vorliegenden Arbeit werden die Phänotypen von Arabidopsis PAP-Mutanten unter verschiedenen Bedingungen im Detail charakterisiert, um die PAP-basierte Genregulation besser zu verstehen. Es wird gezeigt, dass alle drei PAPs an der Regulation der Blühzeit und an der Regulation von Stressantworten beteiligt sind. Während paps1-Mutanten früh blühen, zeigen paps4- und paps2 paps4-Mutanten einen spät blühenden Phänotypen. PAPS1 fördert die Expression des Blühzeitinhibitors FLC vermutlich über die Polyadenylierung eines FLC-Aktivators. PAPS2 und PAPS4 haben teilweise überlappende Funktionen und unterdrücken die Expression von FLC und mindestens einem weiteren, bisher unbekannten Blühzeitinhibitor. Die beiden PAPs agieren in einem neu entdeckten, genetischen Pfad gemeinsam mit dem Blühzeitregulator FCA, jedoch unabhängig von den Polyadenylierungsfaktoren und Blühzeitregulatoren CstF64 und FY. Des Weiteren regulieren PAPS1 und PAPS2/PAPS4 verschiedene Stressantworten. Das Reduzieren der PAPS1-Aktivität führt zu verstärkter Resistenz gegen osmotischen und oxidativen Stress, bei gleichzeitig erhöhter Kältesensitivität der Pflanzen. PAPS2/PAPS4 sind im Gegensatz dazu nicht an der Regulation von Kälte- oder osmotischem Stress beteiligt. Die paps2 paps4-Mutanten besitzen jedoch reduzierte Toleranz gegen oxidativen Stress in Chloroplasten. Das heißt, sowohl PAPS1 als auch PAPS2/PAPS4 sind nötig, um einen ausgeglichenen Redoxstatus der Pflanzenzellen zu gewährleisten. PAPS1 arbeitet bei dieser Regulation scheinbar mit dem Polyadenylierungsfaktor CPSF30 zusammen. Die individuellen Phänotypen der paps-Mutanten und die spezifischen genetischen Interaktionen der Poly(A)-Polymerasen in Arabidopsis unterstützen das Modell der PAP-abhängigen Polyadenylierung von selektierten mRNAs. Da die Polyadenylierungskomplexe in Hefen, Säugetieren und Pflanzen starke Ähnlichkeiten aufweisen, ist es denkbar, dass dieser Regulierungsmechanismus auch in anderen Organismengruppen präsent ist. Basierend auf den Ergebnissen dieser Arbeit können gezielt weitere Experimente entwickelt werden, um die ökologischen und molekularen Grundlagen der PAP-Spezialisierung zu untersuchen. KW - polyadenylation KW - flowering KW - Polyadenylierung KW - Arabidopsis KW - Poly(A)-Polymerasen KW - Blühzeit Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-78015 ER - TY - THES A1 - Eggers, Ute T1 - Environmental impacts on white stork (Ciconia ciconia) breeding success BT - a long-term study with a focus on effects of weather conditions at the breeding grounds Y1 - 2014 ER - TY - THES A1 - Emadpour, Masoumeh T1 - Development of tools for inducible gene expression in choroplasts Y1 - 2014 ER - TY - THES A1 - Fronton, Ludivine T1 - Modeling approaches to characterize the disposition of monoclonal antibodies T1 - Modellierungsansätze zur Charakterisierung der Verteilung und Eliminierung monoklonaler Antikörper BT - from detailed PBPK models to classical compartment models BT - vom detaillierten PBPK-Model zum klassischen Kompartiment-Model N2 - Monoclonal antibodies (mAbs) are engineered immunoglobulins G (IgG) used for more than 20 years as targeted therapy in oncology, infectious diseases and (auto-)immune disorders. Their protein nature greatly influences their pharmacokinetics (PK), presenting typical linear and non-linear behaviors. While it is common to use empirical modeling to analyze clinical PK data of mAbs, there is neither clear consensus nor guidance to, on one hand, select the structure of classical compartment models and on the other hand, interpret mechanistically PK parameters. The mechanistic knowledge present in physiologically-based PK (PBPK) models is likely to support rational classical model selection and thus, a methodology to link empirical and PBPK models is desirable. However, published PBPK models for mAbs are quite diverse in respect to the physiology of distribution spaces and the parameterization of the non-specific elimination involving the neonatal Fc receptor (FcRn) and endogenous IgG (IgGendo). The remarkable discrepancy between the simplicity of biodistribution data and the complexity of published PBPK models translates in parameter identifiability issues. In this thesis, we address this problem with a simplified PBPK model—derived from a hierarchy of more detailed PBPK models and based on simplifications of tissue distribution model. With the novel tissue model, we are breaking new grounds in mechanistic modeling of mAbs disposition: We demonstrate that binding to FcRn is indeed linear and that it is not possible to infer which tissues are involved in the unspecific elimination of wild-type mAbs. We also provide a new approach to predict tissue partition coefficients based on mechanistic insights: We directly link tissue partition coefficients (Ktis) to data-driven and species-independent published antibody biodistribution coefficients (ABCtis) and thus, we ensure the extrapolation from pre-clinical species to human with the simplified PBPK model. We further extend the simplified PBPK model to account for a target, relevant to characterize the non-linear clearance due to mAb-target interaction. With model reduction techniques, we reduce the dimensionality of the simplified PBPK model to design 2-compartment models, thus guiding classical model development with physiological and mechanistic interpretation of the PK parameters. We finally derive a new scaling approach for anatomical and physiological parameters in PBPK models that translates the inter-individual variability into the design of mechanistic covariate models with direct link to classical compartment models, specially useful for PK population analysis during clinical development. N2 - Monoklonale Antikörper (mAbs) sind gentechnisch hergestellte Immunglobuline G (IgG), die seit mehr als 20 Jahren therapeutisch gezielt gegen spezifische Antigene eingesetzt werden. Die Hauptindikationen sind vor allem die Gebiete Onkologie, Infektions- und (Auto-)Immun-Erkrankungen. Monoklonale Antikörper sind hydrophile und geladene Moleküle mit hoher Affinität und Selektivität für ihr Target. Diese Eigenschaften haben einen groçen Einfluss auf die Pharmacokinetik (PK), wobei oft lineares und nicht-lineares Verhalten beobachtet wird. Mathematische Modelle, wie zum Beispiel empirische Modelle, werden routinemässig in der Forschung und Entwicklung verwendet, um die PK für mAbs zu charakterisieren. Hingegen sind physiologisch-basierte PK (PBPK) Modelle für mAbs nur begrenzt einsetzbar. Zur Identifikation und Quantifizierung der Variabilität in klinischen PK-Daten werden meistens empirische 2-Kompartiment Modelle für populationspharmakokinetischen Analysen eingesetzt. Allerdings gibt es weder einen klaren Konsens noch Richtlinien, um lineare und nicht-lineare Clearances zu erklären und um physiologische und mechanistische PK-Parameter zu interpretieren. Prädiktive PBPK-Modelle, die für mAbs publiziert wurden, sind sehr unterschiedlich in Bezug auf die betrachteten Verteilungsvolumina (vaskulär, interstitiell, endosomal) und die Parametrisierung der nicht-spezifischen Elimination durch den neonatalen Fc-Rezeptor und endogenes IgG. Je detaillierter die Beschreibung dieser Prozesse ist, desto mehr Parameter werden benötigt. Allerdings sind deren Werte oftmals nicht bekannt. Dies führt zu Problemen in der Identifizierbarkeit bei den üblicherweise zur Verfügung stehenden in vivo Verteilungsdaten. In der vorliegenden Doktorarbeit präsentieren wir hierarchisch aufgebaute PBPK Modelle für mAbs. Dazu gehören detaillierte, intermediäre und vereinfachte Modelle, deren Ableitungen auf Simplifizierungen des Gewebe-Verteilungs-Modells basieren. Mit dem neuen, vereinfachten PBPK Modell können wir einen Einblick in die mechanistische Interpretation von Gewebe-Verteilungskoeffizienten geben. Diese können mit publizierten, auf Daten basierenden Antikörper Biodistributions Koeffizienten verglichen werden. Weiterhin erlaubt ein simplifiziertes Modell Parameter Identifizierbarkeit und die Auswahl an Gewebe, die bei der nicht-spezifischen Eliminierung der mAbs eine Rolle spielen. Das vereinfachte PBPK Modell kann nach Bedarf um ein Target erweitert werden, das relevant ist für die nicht-lineare Clearance in Folge einer mAb-Target Interaktion zu erklären. Mit Hilfe von Techniken zur Modell-Reduktion reduzieren wir das vereinfachte PBPK Modell, um Kompartiment-Modelle mit niedriger Dimensionalität zu entwickeln. Dadurch wird die physiologische und mechanistische Interpretation der PK Parameter garantiert. Zuletzt leiten wir eine neue Skalierungsmethode für anatomische und physiologische Parameter ab. Sie ermöglicht die Translation der inter-individuellen Variabilität in das Design eines mechanistischen Covariat-Models mit direktem Link zu klassischen Kompartiment-Modellen. Dies ist vor allem für populationspharmakokinetischen Analysen wÃdhrend der klinischen Entwicklung hilfreich. KW - mAb disposition KW - PBPK KW - extravasation-rate limited tissue model KW - classical compartment model KW - mAb Disposition KW - PBPK KW - Extravasation-rate limited Gewebemodelle KW - Kompartiment-Modelle Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-76537 ER - TY - THES A1 - Girbig, Dorothee T1 - Analysing concerted criteria for local dynamic properties of metabolic systems T1 - Die Analyse koordinierter Kriterien für lokale dynamische Eigenschaften metabolischer Systeme N2 - Metabolic systems tend to exhibit steady states that can be measured in terms of their concentrations and fluxes. These measurements can be regarded as a phenotypic representation of all the complex interactions and regulatory mechanisms taking place in the underlying metabolic network. Such interactions determine the system's response to external perturbations and are responsible, for example, for its asymptotic stability or for oscillatory trajectories around the steady state. However, determining these perturbation responses in the absence of fully specified kinetic models remains an important challenge of computational systems biology. Structural kinetic modeling (SKM) is a framework to analyse whether a metabolic steady state remains stable under perturbation, without requiring detailed knowledge about individual rate equations. It provides a parameterised representation of the system's Jacobian matrix in which the model parameters encode information about the enzyme-metabolite interactions. Stability criteria can be derived by generating a large number of structural kinetic models (SK-models) with randomly sampled parameter sets and evaluating the resulting Jacobian matrices. The parameter space can be analysed statistically in order to detect network positions that contribute significantly to the perturbation response. Because the sampled parameters are equivalent to the elasticities used in metabolic control analysis (MCA), the results are easy to interpret biologically. In this project, the SKM framework was extended by several novel methodological improvements. These improvements were evaluated in a simulation study using a set of small example pathways with simple Michaelis Menten rate laws. Afterwards, a detailed analysis of the dynamic properties of the neuronal TCA cycle was performed in order to demonstrate how the new insights obtained in this work could be used for the study of complex metabolic systems. The first improvement was achieved by examining the biological feasibility of the elasticity combinations created during Monte Carlo sampling. Using a set of small example systems, the findings showed that the majority of sampled SK-models would yield negative kinetic parameters if they were translated back into kinetic models. To overcome this problem, a simple criterion was formulated that mitigates such infeasible models and the application of this criterion changed the conclusions of the SKM experiment. The second improvement of this work was the application of supervised machine-learning approaches in order to analyse SKM experiments. So far, SKM experiments have focused on the detection of individual enzymes to identify single reactions important for maintaining the stability or oscillatory trajectories. In this work, this approach was extended by demonstrating how SKM enables the detection of ensembles of enzymes or metabolites that act together in an orchestrated manner to coordinate the pathways response to perturbations. In doing so, stable and unstable states served as class labels, and classifiers were trained to detect elasticity regions associated with stability and instability. Classification was performed using decision trees and relevance vector machines (RVMs). The decision trees produced good classification accuracy in terms of model bias and generalizability. RVMs outperformed decision trees when applied to small models, but encountered severe problems when applied to larger systems because of their high runtime requirements. The decision tree rulesets were analysed statistically and individually in order to explore the role of individual enzymes or metabolites in controlling the system's trajectories around steady states. The third improvement of this work was the establishment of a relationship between the SKM framework and the related field of MCA. In particular, it was shown how the sampled elasticities could be converted to flux control coefficients, which were then investigated for their predictive information content in classifier training. After evaluation on the small example pathways, the methodology was used to study two steady states of the neuronal TCA cycle with respect to their intrinsic mechanisms responsible for stability or instability. The findings showed that several elasticities were jointly coordinated to control stability and that the main source for potential instabilities were mutations in the enzyme alpha-ketoglutarate dehydrogenase. N2 - Metabolische Systeme neigen zur Ausbildung von Fließgleichgewichten, deren Konzentrationen und Reaktionsflüsse experimentell charakterisierbar sind. Derartige Messungen bieten eine phänotypische Repräsentation der zahlreichen Interaktionen und regulatorischen Mechanismen des zugrundeliegenden metabolischen Netzwerks. Diese Interaktionen bestimmen die Reaktion des Systems auf externe Perturbationen, wie z.B. dessen asymptotische Stabilität und Oszillationen. Die Charakterisierung solcher Eigenschaften ist jedoch schwierig, wenn kein entsprechendes kinetisches Modell mit allen Ratengleichungen und kinetischen Parametern für das untersuchte System zur Verfügung steht. Die strukturelle kinetische Modellierung (SKM) ermöglicht die Untersuchung dynamischer Eigenschaften wie Stabilität oder Oszillationen, ohne die Ratengleichungen und zugehörigen Parameter im Detail zu kennen. Statt dessen liefert sie eine parametrisierte Repräsentation der Jacobimatrix, in welcher die einzelnen Parameter Informationen über die Sättigung der Enzyme des Systems mit ihren Substraten kodieren. Die Parameter entsprechen dabei den Elastizitäten aus der metabolischen Kontrollanalyse, was ihre biologische Interpretation vereinfacht. Stabilitätskriterien werden durch Monte Carlo Verfahren hergeleitet, wobei zunächst eine große Anzahl struktureller kinetische Modelle (SK-Modelle) mit zufällig gezogenen Parametermengen generiert, und anschließend die resultierenden Jacobimatrizen evaluiert werden. Im Anschluss kann der Parameterraum statistisch analysiert werden, um Enzyme und Metabolite mit signifikantem Einfluss auf die Stabilität zu detektieren. In der vorliegenden Arbeit wurde das bisherige SKM-Verfahren durch neue methodische Verbesserungen erweitert. Diese Verbesserungen wurden anhand einer Simulationsstudie evaluiert, welche auf kleinen Beispielsystemen mit einfachen Michaelis Menten Kinetiken basierte. Im Anschluss wurden sie für eine detaillierte Analyse der dynamischen Eigenschaften des Zitratzyklus verwendet. Die erste Erweiterung der bestehenden Methodik wurde durch Untersuchung der biologischen Machbarkeit der zufällig erzeugten Elastizitäten erreicht. Es konnte gezeigt werden, dass die Mehrheit der zufällig erzeugten SK-Modelle zu negativen Michaeliskonstanten führt. Um dieses Problem anzugehen, wurde ein einfaches Kriterium formuliert, welches das Auftreten solcher biologisch unrealistischer SK-Modelle verhindert. Es konnte gezeigt werden, dass die Anwendung des Kriteriums die Ergebnisse von SKM Experimenten stark beeinflussen kann. Der zweite Beitrag bezog sich auf die Analyse von SKM-Experimenten mit Hilfe überwachter maschineller Lernverfahren. Bisherige SKM-Studien konzentrierten sich meist auf die Detektion individueller Elastizitäten, um einzelne Reaktionen mit Einfluss auf das Stabilitäts- oder oszillatorische Verhalten zu identifizieren. In dieser Arbeit wurde demonstriert, wie SKM Experimente im Hinblick auf multivariate Muster analysiert werden können, um Elastizitäten zu entdecken, die gemeinsam auf orchestrierte und koordinierte Weise die Eigenschaften des Systems bestimmen. Sowohl Entscheidungsbäume als auch Relevanzvektormaschinen (RVMs) wurden als Klassifikatoren eingesetzt. Während Entscheidungsbäume im allgemeinen gute Klassifikationsergebnisse lieferten, scheiterten RVMs an ihren großen Laufzeitbedürfnissen bei Anwendung auf ein komplexes System wie den Zitratzyklus. Hergeleitete Entscheidungsbaumregeln wurden sowohl statistisch als auch individuell analysiert, um die Koordination von Enzymen und Metaboliten in der Kontrolle von Trajektorien des Systems zu untersuchen. Der dritte Beitrag, welcher in dieser Arbeit vorgestellt wurde, war die Etablierung der Beziehung zwischen SKM und der metabolischer Kontrollanalyse. Insbesondere wurde gezeigt, wie die zufällig generierten Elastizitäten in Flusskontrollkoeffizienten umgewandelt werden. Diese wurden im Anschluss bezüglich ihres Informationsgehaltes zum Klassifikationstraining untersucht. Nach der Evaluierung anhand einiger kleiner Beispielsysteme wurde die neue Methodik auf die Studie zweier Fließgleichgewichte des neuronalen Zitratzyklus angewandt, um intrinsische Mechanismen für Stabilität oder Instabilität zu finden. Die Ergebnisse identifizierten Mutationen im Enzym alpha-ketoglutarate dehydrogenase als wahrscheinlichste Quelle füur Instabilitäten. KW - Systembiologie KW - mathematische Modellierung KW - systems biology KW - mathematical modeling Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-72017 ER - TY - THES A1 - Heise, Robert T1 - Estimation of photosynthetic carbon fluxes in intact plants Y1 - 2014 PB - Universitätsverlag Potsdam CY - Potsdam ER - TY - THES A1 - Hübner, Sandra T1 - Molekulare Grundlagen der Bittergeschmackswahrnehmung in der Maus T1 - Molecular basics of bitter taste perception in mice N2 - Der Bittergeschmack dient Säugern vermutlich zur Wahrnehmung und Vermeidung toxischer Substanzen. Bitterstoffe können jedoch auch gesund sein oder werden oft bereitwillig mit der Nahrung aufgenommen. Ob sie geschmacklich unterschieden werden können, ist allerdings umstritten. Detektiert werden Bitterstoffe von oralen Bittergeschmacksrezeptoren, den TAS2R (human) bzw. Tas2r (murin). In der Literatur gibt es aber immer mehr Hinweise darauf, dass überdies Tas2r nicht nur in extragustatorischen Organen exprimiert werden, sondern dort auch wichtige Aufgaben erfüllen könnten, was wiederum die Aufklärung ihrer noch nicht vollständig entschlüsselten Funktionsweisen erfordert. So ist noch unbekannt, ob alle bisher als funktionell identifizierten Tas2r wirklich gustatorische Funktionen erfüllen. Im Rahmen der Charakterisierung neu generierter, im Locus des Bittergeschmacksrezeptors Tas2r131 genetisch modifizierter Mauslinien, wurde in vorliegender Arbeit die gustatorische sowie extragustatorische Expression von Tas2r131 untersucht. Dass Tas2r131 nicht nur in Pilzpapillen, Wall- und Blätterpapillen (VP+FoP), Gaumen, Ductus nasopalatinus, Vomeronasalorgan und Kehldeckel, sondern auch in Thymus, Testes und Nebenhodenkopf, in Gehirnarealen sowie im Ganglion geniculatum nachgewiesen wurde, bildete die Grundlage für weiterführende Studien. Die vorliegende Arbeit zeigt außerdem, dass Tas2r108, Tas2r126, Tas2r135, Tas2r137 und Tas2r143 in Blut exprimiert werden, was auf eine heterogene Funktion der Tas2r hindeutet. Dass zusätzlich erstmals die Expression aller 35 als funktionell beschriebenen Tas2r im gustatorischen VP+FoP-Epithel von C57BL/6-Mäusen nachgewiesen wurde, verweist auf deren Relevanz als funktionelle Geschmacksrezeptoren. Weiter zeigten Untersuchungen zur Aufklärung eines möglichen Bitter-Unterscheidungsvermögens in Geschmackspapillen von Mäusen mit fluoreszenzmarkierten oder ablatierten Tas2r131-Zellen, dass Tas2r131 exprimierende Zellen eine Tas2r-Zellsubpopulation bilden. Darüber hinaus existieren innerhalb der Bitterzellen geordnete Tas2r-Expressionsmuster, die sich nach der chromosomalen Lage ihrer Gene richten. Isolierte Bitterzellen reagieren heterogen auf bekannte Bitterstoffe. Und Mäuse mit ablatierter Tas2r131-Zellpopulation besitzen noch andere Tas2r-Zellen und schmecken damit einige Bitterstoffe kaum noch, andere aber noch sehr gut. Diese Befunde belegen die Existenz verschiedener gustatorischer Tas2r-Zellpopulationen, welche die Voraussetzung bilden, Bitterstoffe heterogen zu detektieren. Ob dies die Grundlage für ein divergierendes Verhalten gegenüber unverträglichen und harmlosen oder gar nützlichen Bitterstoffen darstellt, kann mit Hilfe der dargelegten Tas2r-Expressionsmuster künftig in Verhaltensexperimenten geprüft werden. Die Bittergeschmackswahrnehmung in Säugetieren stellt sich als ein hochkomplexer Mechanismus dar, dessen Vielschichtigkeit durch die hier neu aufgezeigten heterogenen Tas2r-Expressions- und Funktionsmuster erneut verdeutlicht wird. N2 - In mammals bitter taste is assumed to serve as warning sensor and therefore prevent organisms from ingesting toxic substances. But bitter compounds can also be beneficial and often are readily consumed with food. However, it is disputed if they can be distinguished by taste. Bitter compounds are detected by oral bitter taste receptors, the TAS2Rs (human) or Tas2rs (murine). Moreover, literature provides more and more evidence that Tas2rs not only are expressed in extragustatory organs, but also appear to fulfill relevant functions there. This in turn requires elucidation of their modes of action, which are incompletely understood. Thus it is unknown, if all potentially functional Tas2rs really perform gustatory functions. Within present thesis, newly generated mouse lines with a genetically modified locus of bitter taste receptor Tas2r131 have been characterized by analyzing gustatory as well as extragustatory expression of Tas2r131. The detection of Tas2r131 in fungiform papillae, vallate and foliate papillae (VP+FoP), palate, naso-incisor duct, vomeronasal organ and epiglottis, as well as in thymus, testis and epididymis, in brain and in Ganglion geniculatum, provided the basis for further studies. In addition, present thesis shows expression of Tas2r108, Tas2r126, Tas2r135, Tas2r137, and Tas2r143 in blood, indicating heterogeneous function of Tas2rs. Nevertheless, the presently for the first time proven expression of all 35 potentially functional Tas2rs in gustatory VP+FoP tissue of C57BL/6 mice points to their role as functional taste receptors. To investigate the possibility of a bitter discrimination, further studies were performed in mice with fluorescent-labeled or ablated Tas2r131 cells. It could be demonstrated, that Tas2r131-expressing cells form a subpopulation of the whole Tas2r-expressing cell population. In addition, within bitter cells stable Tas2r expression patterns exist, that comply with chromosomal location of their genes. Single bitter cells respond heterogeneously to common bitter compounds. And mice with ablated Tas2r131 bitter cell population still posses further bitter cells and thereby hardly recognize some bitter substances, but well recognize others. These findings substantiate the existence of different gustatory Tas2r-expressing cell subpopulations, which built the prerequisite for a heterogeneous bitter compound detection. The demonstrated Tas2r expression patterns offer the basis for future behavioral experiments to clarify, if mice are able to distinguish between different bitter tastants. Bitter taste perception in mammals turns out to be a highly complex mechanism, which is again substantiated by the herein demonstrated heterogeneous Tas2r expression and functional patterns. KW - Geschmackswahrnehmung KW - Bittergeschmack KW - Bittergeschmacksrezeptor KW - Tas2r KW - taste KW - Tas2r-Expression KW - bitter taste perception KW - Tas2rs KW - Tas2r expression KW - murine Tas2rs Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-77720 ER - TY - THES A1 - Jüppner, Jessica T1 - Characterization of metabolomic dynamics in synchronized Chlamydomonas reinhardtii cell cultures and the impact of TOR inhibition on cell cycle, proliferation and growth T1 - Charakterisierung der metabolischen Dynamik in synchronisierten Chlamydomonas reinhardtii Zellkulturen und der Einfluss der TOR-Inhibition auf Zellzyklus, Proliferation und Wachstum N2 - The adaptation of cell growth and proliferation to environmental changes is essential for the surviving of biological systems. The evolutionary conserved Ser/Thr protein kinase “Target of Rapamycin” (TOR) has emerged as a major signaling node that integrates the sensing of numerous growth signals to the coordinated regulation of cellular metabolism and growth. Although the TOR signaling pathway has been widely studied in heterotrophic organisms, the research on TOR in photosynthetic eukaryotes has been hampered by the reported land plant resistance to rapamycin. Thus, the finding that Chlamydomonas reinhardtii is sensitive to rapamycin, establish this unicellular green alga as a useful model system to investigate TOR signaling in photosynthetic eukaryotes. The observation that rapamycin does not fully arrest Chlamydomonas growth, which is different from observations made in other organisms, prompted us to investigate the regulatory function of TOR in Chlamydomonas in context of the cell cycle. Therefore, a growth system that allowed synchronously growth under widely unperturbed cultivation in a fermenter system was set up and the synchronized cells were characterized in detail. In a highly resolved kinetic study, the synchronized cells were analyzed for their changes in cytological parameters as cell number and size distribution and their starch content. Furthermore, we applied mass spectrometric analysis for profiling of primary and lipid metabolism. This system was then used to analyze the response dynamics of the Chlamydomonas metabolome and lipidome to TOR-inhibition by rapamycin The results show that TOR inhibition reduces cell growth, delays cell division and daughter cell release and results in a 50% reduced cell number at the end of the cell cycle. Consistent with the growth phenotype we observed strong changes in carbon and nitrogen partitioning in the direction of rapid conversion into carbon and nitrogen storage through an accumulation of starch, triacylglycerol and arginine. Interestingly, it seems that the conversion of carbon into triacylglycerol occurred faster than into starch after TOR inhibition, which may indicate a more dominant role of TOR in the regulation of TAG biosynthesis than in the regulation of starch. This study clearly shows, for the first time, a complex picture of metabolic and lipidomic dynamically changes during the cell cycle of Chlamydomonas reinhardtii and furthermore reveals a complex regulation and adjustment of metabolite pools and lipid composition in response to TOR inhibition. N2 - Die Anpassung der Wachstumsrate an Umweltveränderungen ist essentiell für das Überleben biologischer Systeme. Mit der Identifikation der evolutionär konservierten Serin/Threonin Kinase “Target of Rapamycin” (TOR) war ein zentraler Regulator gefunden, der in Abhängigkeit einer Vielzahl von Wachstumsfaktoren den zellulären Metabolismus und das Wachstum reguliert. Während zum heutigen Zeitpunkt schon relativ gute Kenntnisse über die Funktionen und Signalwege dieser Kinase in heterotrophen Organismen gewonnen werden konnten, wurden die Untersuchungen des TOR-Signalweges in photoautotrophen Organismen durch deren Resistenz gegenüber dem TOR-spezifischen Inhibitor Rapamycin für lange Zeit erschwert. Daher bietet die Entdeckung, dass die einzelligen Grünalge Chlamydomonas reinhardtii eine natürliche Sensitivität gegenüber Rapamycin aufweist, eine gute Grundlage zur Erforschung des TOR-Signalweges in photosynthetisch aktiven Eukaryoten. Aufgrund der Beobachtung, dass das Wachstum von Chlamydomonas nicht vollständig durch Rapamycin inhibiert werden konnte, was im Gegensatz zu Beobachtungen in anderen Organismen steht, entschieden wir uns für eine detailliertere Analyse des Einflusses von TOR auf den Zellzyklus. Dazu wurde ein System etabliert das eine Synchronisation der Zellen unter weitestgehend ungestörten Bedingungen in einem Fermenter-system erlaubte. Dieses System wurde dann für eine detaillierte Charakterisierung der synchronisierten Zellen genutzt. Mittels einer hochaufgelösten Zeitreihe wurden Veränderungen zytologischer Parameter (Zellzahl und Zellgrößenverteilung) und des Stärkegehalts analysiert. Zusätzlich wurden massenspektrometrische Verfahren zur Analyse des Primär- und Lipidmetabolismus verwendet. Dieses System wurde des Weiteren dazu genutzt dynamische Veränderungen im Metabolom und Lipidom von Chlamydomonas nach Inhibition der TOR Kinase durch Rapamycin zu untersuchen Die Ergebnisse der TOR-Inhibition zeigen ein vermindertes Wachstum, eine Verzögerung in der Zellteilung und der Entlassung der Tochterzellen und resultieren in einer um 50% verringerten Zellzahl am Ende des Zellzyklus. Des Weiteren konnte eine Akkumulation von Kohlenstoff– und Stickstoff-Reserven in Form von Stärke und Triacylglyceriden, sowie Arginin beobachtet werden. Dabei ist vor allem interessant, dass die der Einbau von Kohlenstoff in Triacylglyceride offenbar schneller erfolgt als der in Stärke, was auf eine dominantere Rolle von TOR in der Regulation der Triacylglycerid-Biosynthese gegenüber der Stärkesynthese hindeutet. Diese Studie zeigt zum ersten Mal eine komplexe Analyse der dynamischen Veränderungen im Primär- und Lipidmetabolismus im Verlauf des Zellzyklus von Chlamydomonas und zeigt weiterhin die komplexe Regulation und Adjustierung des Metabolit-Pools und der Lipidzusammensetzung als Antwort auf die Inhibition von TOR. KW - chlamydomonas reinhardtii KW - metabolites KW - Metaboliten KW - lipids KW - Lipide Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-76923 ER - TY - THES A1 - Kamprad, Fanny T1 - Einfluss von Zink auf die intestinale Mikrobiota im Ferkel und der mono-assoziirten Maus Y1 - 2014 PB - Universitätsverlag Potsdam CY - Potsdam ER - TY - THES A1 - Li, Xia T1 - Global warming - high night temperature, heat and drought - affects enzyme activity, transcriptome and metabolome in rice cultivars with different tolerance Y1 - 2014 CY - Potsdam ER - TY - THES A1 - Lotkowska, Magda Ewa T1 - Functional analysis of MYB112 transcription factor in the model plant Arabidopsis thaliana T1 - Funktionelle Charakterisierung von MYB112 Transkriptionsfaktor aus der Modellpflanze Arabidopsis thaliana N2 - Transcription factors (TFs) are ubiquitous gene expression regulators and play essential roles in almost all biological processes. This Ph.D. project is primarily focused on the functional characterisation of MYB112 - a member of the R2R3-MYB TF family from the model plant Arabidopsis thaliana. This gene was selected due to its increased expression during senescence based on previous qRT-PCR expression profiling experiments of 1880 TFs in Arabidopsis leaves at three developmental stages (15 mm leaf, 30 mm leaf and 20% yellowing leaf). MYB112 promoter GUS fusion lines were generated to further investigate the expression pattern of MYB112. Employing transgenic approaches in combination with metabolomics and transcriptomics we demonstrate that MYB112 exerts a major role in regulation of plant flavonoid metabolism. We report enhanced and impaired anthocyanin accumulation in MYB112 overexpressors and MYB112-deficient mutants, respectively. Expression profiling reveals that MYB112 acts as a positive regulator of the transcription factor PAP1 leading to increased anthocyanin biosynthesis, and as a negative regulator of MYB12 and MYB111, which both control flavonol biosynthesis. We also identify MYB112 early responsive genes using a combination of several approaches. These include gene expression profiling (Affymetrix ATH1 micro-arrays and qRT-PCR) and transactivation assays in leaf mesophyll cell protoplasts. We show that MYB112 binds to an 8-bp DNA fragment containing the core sequence (A/T/G)(A/C)CC(A/T)(A/G/T)(A/C)(T/C). By electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and chromatin immunoprecipitation coupled to qPCR (ChIP-qPCR) we demonstrate that MYB112 binds in vitro and in vivo to MYB7 and MYB32 promoters revealing them as direct downstream target genes. MYB TFs were previously reported to play an important role in controlling flavonoid biosynthesis in plants. Many factors acting upstream of the anthocyanin biosynthesis pathway show enhanced expression levels during nitrogen limitation, or elevated sucrose content. In addition to the mentioned conditions, other environmental parameters including salinity or high light stress may trigger anthocyanin accumulation. In contrast to several other MYB TFs affecting anthocyanin biosynthesis pathway genes, MYB112 expression is not controlled by nitrogen limitation, or carbon excess, but rather is stimulated by salinity and high light stress. Thus, MYB112 constitutes a previously uncharacterised regulatory factor that modifies anthocyanin accumulation under conditions of abiotic stress. N2 - Transkriptionsfaktoren (TFs) sind ubiquitäre Regulatoren der Genexpression und spielen eine essentielle Rolle in nahezu allen biologischen Prozessen. Diese Doktorarbeit hat vor allem die funktionelle Charakterisierung von MYB112 zum Thema, einem Mitglied der R2R3-MYB-TF-Familie aus der Modellpflanze Arabidopsis thaliana. Ausgesucht wurde das Gen aufgrund seiner erhöhten Expression in seneszenten Blättern, basierend auf vorangegangenen qRT-PCR Expressions-Profiling Experimenten für 1880 TFs in Arabidopsis Blättern aus drei Entwicklungsstadien (15 mm Blatt, 30 mm Blatt und 20 % vergilbtes Blatt). MYB112-Promotor-GUS-Fusionslinien wurden generiert um das Expressionsmuster von MYB112 detailliert zu untersuchen. Unter Zuhilfenahme transgener Ansätze in Kombination mit Metabolomics und Transcriptomics können wir zeigen, dass MYB112 eine wichtige Rolle in der Regulation des pflanzlichen Flavonoid-Metabolismus spielt. In MYB112 Überexpressoren und MYB112-defizienten Mutanten kommt es zu erhöhter bzw. verminderter Anthocyanin-Akkumulation. Expressions-Profiling zeigt, dass MYB112 einerseits als ein positiver Regulator des Transkriptionsfaktors PAP1 fungiert, was zu einer erhöhten Anthocyanin-Biosynthese führt, andererseits als negativer Regulator von MYB12 und MYB111 auftritt, welche beide die Flavonol-Biosynthese kontrollieren. Wir haben früh auf MYB112 reagierende Gene durch eine Kombination verschiedener Ansätze identifiziert. Diese umfassen Genexpressions-Profiling (Affymetrix ATH1 Microarrays und qRT-PCR) und Transaktivierungs-Experimente in Mesophyll-Protoplasten aus Blättern. Wir zeigen, dass MYB112 an eine 8-bp DNA-Fragment, welches die Kernsequenz (A/T/G)(A/C)CC(A/T)(A/G/T)(A/C)(T/C) aufweist. Mit Hilfe von Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) und Chromatin-Immunopräzipitation gekoppelt mit qPCR (ChIP-qPCR) zeigen wir, dass MYB112 in vitro und in vivo an die Promotoren von MYB7 und MYB32 bindet was sie damit als direkte Zielgene von MYB112 identifiziert. Es wurde bereits gezeigt, dass MYB TFs eine wichtige Rolle bei der Kontrolle der Flavonoid-Biosynthese in Pflanzen haben. Viele Faktoren, die oberhalb des Anthocyanin-Biosyntheseweges agieren, werden bei Stickstofflimitierung oder erhöhter Saccharose-Konzentration auch verstärkt exprimiert. Außer den erwähnten Bedingungen können auch andere Umweltparameter, wie z. B. erhöhter Salzgehalt und Starklicht zu erhöhter Expression führen. Im Gegensatz jedoch zu einigen anderen MYB TFs, die einen Einfluss auf Gene des Anthocyanin-Biosyntheseweges ausüben, ist die Expression von MYB112 nicht durch Stickstoff-Limitierung oder Kohlenstoffüberfluss kontrolliert, sondern wird durch erhöhten Salzgehalt sowie Starklicht stimuliert. Somit ist MYB112 ein neuer Regulator, der eine Anthocyanin-Akkumulation unter abiotischen Stressbedingungen kontrolliert. KW - Transkriptionsfaktoren KW - Flavonoid-Metabolismus KW - Stress KW - Transaktivierungs-Experimente KW - Chromatin-Immunopräzipitation KW - transcription factors KW - flavonoid biosynthesis KW - stress KW - transactivation assay KW - chromatin immunoprecipitation Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-72131 ER - TY - THES A1 - Lukas, Marcus T1 - To breath or not to breathe - carbon budget regulation in Daphnia Y1 - 2014 CY - Potsdam ER - TY - THES A1 - Mathew, Simi T1 - Polymeric microparticles as vaccine carriers Y1 - 2014 CY - Potsdam ER - TY - THES A1 - Meissner, Sven T1 - Implications of Microcystin Production in Microcystis aeruginosa PCC 7806 T1 - Effekte der Produktion von Microcystin in Microcystis aeruginosa PCC 7806 N2 - Cyanobacteria produce about 40 percent of the world’s primary biomass, but also a variety of often toxic peptides such as microcystin. Mass developments, so called blooms, can pose a real threat to the drinking water supply in many parts of the world. This study aimed at characterizing the biological function of microcystin production in one of the most common bloom-forming cyanobacterium Microcystis aeruginosa. In a first attempt, the effect of elevated light intensity on microcystin production and its binding to cellular proteins was studied. Therefore, conventional microcystin quantification techniques were combined with protein-biochemical methods. RubisCO, the key enzyme for primary carbon fixation was a major microcystin interaction partner. High light exposition strongly stimulated microcystin-protein interactions. Up to 60 percent of the total cellular microcystin was detected bound to proteins, i.e. inaccessible for standard quantification procedures. Underestimation of total microcystin contents when neglecting the protein fraction was also demonstrated in field samples. Finally, an immuno-fluorescence based method was developed to identify microcystin producing cyanobacteria in mixed populations. The high light induced microcystin interaction with proteins suggested an impact of the secondary metabolite on the primary metabolism of Microcystis by e.g. modulating the activity of enzymes. For addressing that question, a comprehensive GC/MS-based approach was conducted to compare the accumulation of metabolites in the wild-type of Microcystis aeruginosa PCC 7806 and the microcystin deficient ΔmcyB mutant. From all 501 detected non-redundant metabolites 85 (17 percent) accumulated significantly different in either of both genotypes upon high light exposition. Accumulation of compatible solutes in the ΔmcyB mutant suggests a role of microcystin in fine-tuning the metabolic flow to prevent stress related to excess light, high oxygen concentration and carbon limitation. Co-analysis of the widely used model cyanobacterium Synechocystis PCC 6803 revealed profound metabolic differences between species of cyanobacteria. Whereas Microcystis channeled more resources towards carbohydrate synthesis, Synechocystis invested more in amino acids. These findings were supported by electron microscopy of high light treated cells and the quantification of storage compounds. While Microcystis accumulated mainly glycogen to about 8.5 percent of its fresh weight within three hours, Synechocystis produced higher amounts of cyanophycin. The results showed that the characterization of species-specific metabolic features should gain more attention with regard to the biotechnological use of cyanobacteria. N2 - Cyanobakterien produzieren etwa 40 Prozent der primären Biomasse auf der Welt aber auch giftige Peptide wie das leberschädigende Microcystin. Massenvorkommen, so genannte Blaualgenblüten, gefährden vielerorts regelmäßig die Trinkwasserversorgung. Diese Arbeit hatte zum Ziel, den Einfluss der Microcystinproduktion auf physiologische Abläufe in dem weit verbreiteten blütenbildenden Cyanobakterium Microcystis aeruginosa zu charakterisieren. Zum einen, wurde hierfür der Einfluss der Beleuchtungsintensität auf die Produktion von Microcystin und dessen Bindung an zelluläre Proteine ermittelt. Hierzu wurden etablierte Quantifizierungstechniken mit biochemischen Methoden kombiniert. RubisCO, das Schlüsselenzym zur primären Kohlenstofffixierung, war ein Hauptinteraktionspartner von Microcystin. Hohe Beleuchtungsintensität erhöhte die Menge von an Proteine gebundenem Microcystin. Bis zu 60 Prozent des gesamten zellulären Microcystins lag an Proteine gebunden vor, d.h. es wurde durch Standardquantifizierungsmethoden nicht erfasst. Die Notwendigkeit, zur Quantifizierung des gesamten Microcystins die Proteinfraktion mit einzubeziehen, wurde auch in Freilandproben demonstriert. Die Entwicklung einer immunofluoreszenzbasierten Methode erlaubte die Unterscheidung von toxischen und nichttoxischen Microcystis-Kolonien in Freilandproben. Die starklichtinduzierte Interaktion von Microcystin mit Proteinen deutete auf einen möglichen Einfluss des Sekundärmetabolits auf den Primärstoffwechsel von Microcystis hin. Um dieser Frage nachzugehen, wurde ein umfassender GC/MS-basierter Versuch durchgeführt, um die Akkumulation von Metaboliten im Microcystin produzierenden Stamm Microcystis aeruginosa PCC 7806 und dessen microcystinfreier ΔmcyB-mutierten Variante vergleichen zu können. Es zeigte sich, dass Microcystin einen Einfluss auf die Akkumulation von 85 (17 Prozent) aller 501 detektierten Metaboliten unter erhöhter Beleuchtungsstärke hatte. Besonders die vermehrte Synthese osmotisch aktiver Substanzen in der ΔmcyB Mutante, verstanden als generelle Reaktion auf allgemeinen Stress, deutete auf eine Beteiligung von Microcystin in der metabolischen Justierung von Microcystis hin. Die Parallelanalyse des Modellstamms Synechocystis PCC 6803 offenbarte grundsätzliche metabolische Unterschiede zwischen verschiedenen Cyanobakterienspezies. Demnach produzierte Microcystis vor allem Kohlehydrate und Synechocystis eher Aminosäuren. Die GC/MS-basierten Ergebnisse wurden durch elektronmikroskopische Aufnahmen und die Quantifizierung von Speichermetaboliten gestützt. Innerhalb drei Stunden bewirkte Starklicht die Akkumulation von Glykogen in Microcystis auf ca. 8.5 Prozent des Frischgewichts, wohingegen Synechocystis mehr Cyanophycin produzierte. Die Ergebnisse zeigten, dass im Hinblick auf die biotechnologische Nutzung von Cyanobakterien, die Charakterisierung speziesspezifischer metabolischer Eigenschaften mehr Beachtung finden sollte. KW - microcystin KW - Microcystin KW - cyanobacteria KW - Cyanobakterien Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-75199 ER - TY - THES A1 - Memczak, Henry T1 - Entwicklung influenzabindender Peptide für die Biosensorik T1 - Engineering of influenza-binding peptides for biosensing N2 - Das Influenzavirus infiziert Säugetiere und Vögel. Der erste Schritt im Infektionszyklus ist die Anbindung des Viruses über sein Oberflächenprotein Hämagglutinin (HA) an Zuckerstrukturen auf Epithelzellen des respiratorischen Traktes im Wirtsorganismus. Aus den drei komplementaritätsbestimmenden Regionen (complementarity determining regions, CDRs) der schweren Kette eines monoklonalen Hämagglutinin-bindenden Antikörpers wurden drei lineare Peptide abgeleitet. Die Bindungseigenschaften der drei Peptide wurden experimentell mittels Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie untersucht. Es zeigte sich, dass in Übereinstimmung mit begleitenden Molekulardynamik-Simulationen zwei der drei Peptide (PeB und PeC) analog zur Bindefähigkeit des Antikörpers in der Lage sind, Influenzaviren vom Stamm X31 (H3N2 A/Aichi/2/1968) zu binden. Die Interaktion des Peptids PeB, welches potentiell mit der konservierten Rezeptorbindestelle im HA interagiert, wurde anschließend näher charakterisiert. Die Detektion der Influenzaviren war unter geeigneten Immobilisationsbedingungen im diagnostisch relevanten Bereich möglich. Die Spezifität der PeB-Virus-Bindung wurde mittels geeigneter Kontrollen auf der Seite des Analyten und des Liganden nachgewiesen. Des Weiteren war das Peptid PeB in der Lage die Bindung von X31-Viren an Mimetika seines natürlichen Rezeptors zu inhibieren, was die spezifische Interaktion mit der Rezeptorbindungsstelle im Hämagglutinin belegt. Anschließend wurde die Primärsequenz von PeB durch eine vollständige Substitutionsanalyse im Microarray-Format hinsichtlich der Struktur-Aktivitäts-Beziehungen charakterisiert. Dies führte außerdem zu verbesserten Peptidvarianten mit erhöhter Affinität und breiterer Spezifität gegen aktuelle Influenzastämme verschiedener Serotypen (z.B. H1N1/2009, H5N1/2004, H7N1/2013). Schließlich konnte durch Verwendung einer in der Primärsequenz angepassten höher affinen Peptidvariante die Influenzainfektion in vitro inhibiert werden. Damit stellen die vom ursprünglichen Peptid PeB abgeleiteten Varianten Rezeptormoleküle in biosensorischen Testsystemen sowie potentielle Wirkstoffe dar. N2 - The influenza virus infects mammals and birds. The first step of the infection cycle comprises the attachment of the viral surface protein hemagglutinin (HA) on glycan structures on epithelial cells within the respiratory tract of the host organism. Starting from the complementarity determining regions (CDRs) of the heavy chain of a monoclonal hemagglutinin-binding antibody three linear peptides were derived. The binding properties of these peptides was characterized experimentally using surface plasmon resonance spectroscopy. In accordance with accompanying molecular dynamics simulation it was shown, that two of the three peptides (PeB and PeC) were able to bind the influenza virus of the strain X31 (H3N2 A/Aichi/2/1968) comparably to the antibody itself. The interaction of peptide PeB, which was supposed to bind to the conserved receptor binding site at the HA, was then characterized more in detail. The detection of influenza viruses was achieved within the diagnostically relevant concentration range using defined immobilization conditions. The specificity of the peptide-virus-binding was proven by appropriate control experiments. Additionally, peptide PeB was able to inhibit the binding of X31 viruses to mimics of its natural receptor. Furthermore the structure-activity-relationship within all the amino acids of peptide PeB was characterized using a full substitutional analysis in a microarray format. This led to improved peptidic variants, which were able to bind different influenza serotypes and inhibit the influenza infection in vitro. The found peptides and their variants can now be used as receptor molecules in biosensors and also represent potential drug candidates. KW - Influenza KW - Peptid KW - Biosensor KW - Virus KW - Interaktionsstudie KW - influenza KW - peptide KW - biosensor KW - virus KW - interaction analysis Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-72470 ER - TY - THES A1 - Müller, Jörg T1 - Response of bryophyte diversity to land-use and management in forest and grassland habitats Y1 - 2014 ER - TY - THES A1 - Omidbakhshfard, Mohammad Amin T1 - Functional analysis of the role of GRF9 in leaf development and establishment of Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements (FAIRE) in Arabidopsis thaliana Y1 - 2014 ER -