TY - THES A1 - Ghandour, Rabea T1 - Identification of chloroplast translational feedback regulation and establishment of aptamer based mRNA purification to unravel involved regulatory factors N2 - After endosymbiosis, chloroplasts lost most of their genome. Many former endosymbiotic genes are now nucleus-encoded and the products are re-imported post-translationally. Consequently, photosynthetic complexes are built of nucleus- and plastid-encoded subunits in a well-defined stoichiometry. In Chlamydomonas, the translation of chloroplast-encoded photosynthetic core subunits is feedback-regulated by the assembly state of the complexes they reside in. This process is called Control by Epistasy of Synthesis (CES) and enables the efficient production of photosynthetic core subunits in stoichiometric amounts. In chloroplasts of embryophytes, only Rubisco subunits have been shown to be feedback-regulated. That opens the question if there is additional CES regulation in embryophytes. I analyzed chloroplast gene expression in tobacco and Arabidopsis mutants with assembly defects for each photosynthetic complex to broadly answer this question. My results (i) confirmed CES within Rubisco and hint to potential translational feedback regulation in the synthesis of (ii) cytochrome b6f (Cyt b6f) and (iii) photosystem II (PSII) subunits. This work suggests a CES network in PSII that links psbD, psbA, psbB, psbE, and potentially psbH expression by a feedback mechanism that at least partially differs from that described in Chlamydomonas. Intriguingly, in the Cyt b6f complex, a positive feedback regulation that coordinates the synthesis of PetA and PetB was observed, which was not previously reported in Chlamydomonas. No evidence for CES interactions was found in the expression of NDH and ATP synthase subunits of embryophytes. Altogether, this work provides solid evidence for novel assembly-dependent feedback regulation mechanisms controlling the expression of photosynthetic genes in chloroplasts of embryophytes. In order to obtain a comprehensive inventory of the rbcL and psbA RNA-binding proteomes (including factors that regulate their expression, especially factors involved in CES), an aptamer based affinity purification method was adapted and refined for the specific purification these transcripts from tobacco chloroplasts. To this end, three different aptamers (MS2, Sephadex ,and streptavidin binding) were stably introduced into the 3’ UTRs of psbA and rbcL by chloroplast transformation. RNA aptamer based purification and subsequent chip analysis (RAP Chip) demonstrated a strong enrichment of psbA and rbcL transcripts and currently, ongoing mass spectrometry analyses shall reveal potential regulatory factors. Furthermore, the suborganellar localization of MS2 tagged psbA and rbcL transcripts was analyzed by a combined affinity, immunology, and electron microscopy approach and demonstrated the potential of aptamer tags for the examination of the spatial distribution of chloroplast transcripts. N2 - Nach der Endosymbiose wurde der größte Teil des Chloroplastengenoms in das Kerngenom transferiert. Die entsprechenden Genprodukte werden posttranslational wieder in die Chloroplasten importiert. Dementsprechend sind photosynthetische Proteinkomplexe aus plastidär- und kernkodierten Untereinheiten in definierter Stöchiometrie zusammengesetzt. In der einzelligen Grünalge Chlamydomonas ist die Translation von chloroplastenkodierten photosynthetischen Untereinheiten durch einen Rückkopplungsmechanismus in Abhängigkeit vom Assemblierungsstatus der entsprechenden Komplexe reguliert. Dieser „Control by Epistasy of Synthesis“ (CES) genannte Mechanismus erlaubt die effiziente Synthese von photosynthetischen Untereinheiten in den stöchiometrischen Mengen, die für die Assemblierung der Komplexe benötigt werden. In den Chloroplasten der Embryophyten wurde bisher nur die Translation von Rubisco als CES reguliert beschrieben. Daher stellt sich die Frage, ob derartige CES-Regulationen in Embryophyten auch in anderen Photosynthesekomplexen stattfinden. Um diese Frage zu beantworten, habe ich die chloroplastidäre Genexpression in Tabak- und Arabidopsismutanten mit Defekten in der Assemblierung photosynthetischer Komplexe untersucht. Meine Ergebnisse bestätigen (i) die bekannte CES Regulation von Rubisco und zeigen mögliche weitere assemblierungsabhängige Rückkopplungsregulationen in der Synthese des (ii) Cytochrom b6f (Cyt b6f) Komplexes sowie des (iii) Photosystems II (PSII). Insbesondere weisen meine Ergebnisse auf ein CES-Netzwerk hin, welches die Expressionen von psbD, psbA, psbB, psbE und wahrscheinlich auch psbH steuert und teilweise von der beschriebenen linearen CES-Kaskade in Chlamydomonas abweicht. Für die Synthese des Cyt b6f Komplexes wurde zudem eine positive Feedback-Regulation der Untereinheiten PetA und PetB beobachtet, die in Chlamydomonas nicht gezeigt wurde. Dagegen wurden für die NDH- und ATP Synthase-Komplexe keine Hinweise auf CES-Regulation in Embryophyten gefunden. Zusammenfassend zeigen meine Ergebnisse klare Belege für bisher unbekannte CES-Regulationen, welche die Expression von photosynthetischen Genen in Embryophyten steuern. Um das mRNA-Protein-Interaktom von rbcL und psbA zu bestimmen (einschließlich Faktoren, welche CES regulieren), wurde eine aptamer-basierte Affinitätsreinigungsmethode für die Anreicherung dieser Transkripte aus Tabakchloroplasten adaptiert und optimiert. Dazu wurden mittels Chloroplasten¬transformation drei verschiedene Aptamere (MS2, Sephadex- und Streptavidin-bindende Aptamere) stabil in den 3’UTR der Transkripte integriert. Die aptamer-basierte RNA-Aufreinigung und anschließende Chip-Analyse (RAP-Chip) zeigte die spezifische Anreicherung der psbA- bzw. rbcL-Transkripte. Die aktuell ausgeführte Massenspektrometrie zur Analyse der transkriptgebundenen Proteine soll potenziell regulatorische Faktoren identifizieren. Des Weiteren wurde die Lokalisation der MS2-markierten psbA- und rbcL-Transkripte innerhalb des Chloroplasten mittels Affinitäts¬immunologie und Elektronenmikroskopie untersucht und dabei gezeigt, dass die Aptamer-Markierung geeignet ist, um die Transkriptverteilung innerhalb von Organellen zu untersuchen. T2 - Identifikation translationaler Rückkopplungsregulationen in Chloroplasten und Etablierung einer aptamer-basierten mRNA-Anreicherungsmethode zur Entschlüsselung der beteiligten regulatorischen Faktoren KW - Translation KW - Ribosome profiling KW - Chloroplast gene expression KW - Translation feedback regulation KW - Protein complex assembly KW - Aptamers KW - Chloroplasten-Genexpression KW - Ribosome profiling KW - Proteinkomplexassemblierung KW - Translation KW - Translationsfeedbackregulation KW - Aptamer Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-482896 ER - TY - THES A1 - Hoelscher, Matthijs Pieter T1 - The production of antimicrobial polypeptides in chloroplasts N2 - Plants are an attractive platform for the production of medicinal compounds because of their potential to generate large amounts of biomass cheaply. The use of chloroplast transformation is an attractive way to achieve the recombinant production of proteins in plants, because of the chloroplasts’ high capacity to produce foreign proteins in comparison to nuclear transformed plants. In this thesis, the production of two different types of antimicrobial polypeptides in chloroplasts is explored. The first example is the production of the potent HIV entry inhibitor griffithsin. Griffithsin has the potential to prevent HIV infections by blocking the entry of the virus into human cells. Here the use of transplastomic plants as an inexpensive production method for griffithsin was explored. Transplastomic plants grew healthily and were able to accumulate griffithsin to up to 5% of the total soluble protein. Griffithsin could easily be purified from tobacco leaf tissue and had a similarly high neutralization activity as griffithsin recombinantly produced in bacteria. Griffithsin could be purified from dried tobacco leaves, demonstrating that dried leaves could be used as a storable starting material for griffithsin purification, circumventing the need for immediate purification after harvest. The second example is the production of antimicrobial peptides (AMPs) that have the capacity to kill bacteria and are an attractive alternative to currently used antibiotics that are increasingly becoming ineffective. The production of antimicrobial peptides was considerably more challenging than the production of griffithsin. Small AMPs are prone to degradation in plastids. This problem was overcome by fusing AMPs to generate larger polypeptides. In one approach, AMPs were fused to each other to increase size and combine the mode of action of multiple AMPs. This improved the accumulation of AMPs but also resulted in impaired plant growth. This was solved by the use of two different inducible systems, which could largely restore plant growth. Fusions of multiple AMPs were insoluble and could not be purified. In addition to fusing AMPs to each other, the fusion of AMPs to small ubiquitin-like modifier (SUMO), was tested as an approach to improve the accumulation, facilitate purification, and reduce the toxicity of AMPs to chloroplasts. Fusion of AMPs to SUMO indeed increased accumulation while reducing the toxicity to the plants. SUMO fusions produced inside chloroplasts could be purified, and SUMO could be efficiently cleaved off with the SUMO protease. Such fusions therefore provide a promising strategy for the production of AMPs and other small polypeptides inside chloroplasts. KW - plastid transformation KW - Nicotiana tabacum KW - HIV KW - AIDS KW - antiviral agent KW - micorbicide KW - Griffithsin KW - chloroplast KW - antimicrobial peptide KW - AMP KW - recombinant production KW - transgenic KW - SUMO KW - inducible expression KW - anti bacterial KW - protein fusion KW - polypeptide KW - peptide KW - plant KW - molecular farming Y1 - 2020 ER - TY - THES A1 - Irmscher, Tobias T1 - Enzymatic remodelling of the exopolysaccharide stewartan network BT - implications for the diffusion of nano-sized objects BT - Implikationen für die Diffusion von nanogroßen Objekte N2 - In nature, bacteria are found to reside in multicellular communities encased in self-produced extracellular matrices. Indeed, biofilms are the default lifestyle of the bacteria which cause persistent infections in humans. The biofilm assembly protects bacterial cells from desiccation and limits the effectiveness of antimicrobial treatments. A myriad of biomolecules in the extracellular matrix, including proteins, exopolysaccharides, lipids, extracellular DNA and other, form a dense and viscoelastic three dimensional network. Many studies emphasized that a destabilization of the mechanical integrity of biofilm architectures potentially eliminates the protective shield and renders bacteria more susceptible to the immune system and antibiotics. Pantoea stewartii is a plant pathogen which infects monocotyledons such as maize and sweet corn. These bacteria produce dense biofilms in the xylem of infected plants which cause wilting of plants and crops. Stewartan is an exopolysaccharide which is produced by Pantoea stewartii and secreted as the major component to the extracellular matrix. It consists of heptasaccharide repeating units with a high degree of polymerization (2-4 MDa). In this work, the physicochemical properties of stewartan were investigated to understand the contributions of this exopolysaccharide to the mechanical integrity and cohesiveness of Pantoea stewartii biofilms. Therefore, a coarse-grained model of stewartan was developed with computational techniques to obtain a model for its three dimensional structural features. Here, coarse-grained molecular dynamic simulations revealed that the exopolysaccharide forms a hydrogel in which the exopolysaccharide chains arrange into a three dimensional mesh-like network. Simulations at different concentrations were used to investigate the influence of the water content on the network formation. Stewartan was further purified from 72 h grown Pantoea stewartii biofilms and the diffusion of bacteriophage and differently-sized nanoparticles (which ranged from 1.1 to 193 nm diameter) was analyzed in reconstituted stewartan solutions. Fluorescence correlation spectroscopy and single-particle tracking revealed that the stewartan network impeded the mobility of a set of differently-sized fluorescent particles in a size-dependent manner. Diffusion of these particles became more anomalous, as characterized by fitting the diffusion data to an anomalous diffusion model, with increasing stewartan concentrations. Further bulk and microrheological experiments were used to analyze the transitions in stewartan fluid behavior and stewartan chain entanglements were described. Moreover, it was noticed, that a small fraction of bacteriophage particles was trapped in small-sized pores deviating from classical random walks which highlighted the structural heterogeneity of the stewartan network. Additionally, the mobility of fluorescent particles also depended on the charge of the stewartan exopolysaccharide and a model of a molecular sieve for the stewartan network was proposed. The here reported structural features of the stewartan polymers were used to provide a detailed description of the mechanical properties of typically glycan-based biofilms such as the one from Pantoea stewartii. In addition, the mechanical properties of the biofilm architecture are permanently sensed by the embedded bacteria and enzymatic modifications of the extracellular matrix take place to address environmental cues. Hence, in this work the influence of enzymatic degradation of the stewartan exopolysaccharides on the overall exopolysaccharide network structure was analyzed to describe relevant physiological processes in Pantoea stewartii biofilms. Here, the stewartan hydrolysis kinetics of the tailspike protein from the ΦEa1h bacteriophage, which is naturally found to infect Pantoea stewartii cells, was compared to WceF. The latter protein is expressed from the Pantoea stewartii stewartan biosynthesis gene cluster wce I-III. The degradation of stewartan by the ΦEa1h tailspike protein was shown to be much faster than the hydrolysis kinetics of WceF, although both enzymes cleaved the β D GalIII(1→3)-α-D-GalI glycosidic linkage from the stewartan backbone. Oligosaccharide fragments which were produced during the stewartan cleavage, were analyzed in size-exclusion chromatography and capillary electrophoresis. Bioinformatic studies and the analysis of a WceF crystal structure revealed a remarkably high structural similarity of both proteins thus unveiling WceF as a bacterial tailspike-like protein. As a consequence, WceF might play a role in stewartan chain length control in Pantoea stewartii biofilms. N2 - In der Natur lagern sich Bakterien zu großen und komplexen Gemeinschaften zusammen, die als Biofilme bezeichnet werden. Diese multizellulären Biofilme sind der Ursprung vieler langlebiger und gefährlicher Infektionskrankheiten. Die bakteriellen Zellen produzieren und umgeben sich mit einen biofilm-spezifischen Schleim, der aus einer Unzahl von Biomolekülen, wie z.B. Exopolysaccharide, Lipide und extrazelluläre DNA, besteht. Diese Biofilmarchitektur schützt Bakterien vor Austrocknung und begrenzen die Wirksamkeit von antimikrobiellen Wirkstoffen (z.B. Antibiotika). Viele Studien haben gezeigt, dass die Destabilisierung der mechanischen Festigkeit des Biofilmapparates eine neue Behandlungsstrategie darstellt, in der das bakterielle Schutzschild eliminiert wird, sodass die Zellen wieder anfälliger gegenüber dem menschlichen Immunsystem oder Antibiotika werden. Pantoea stewartii ist ein Pflanzenpathogen, welches Mais und Süßmais befällt. Diese Bakterien produzieren Biofilme im Inneren der Pflanze, sodass der freie Wassertransport gestört wird. Daraufhin verwelken die Blätter und Früchte. In dieser Arbeit wurde das Exopolysaccharid Stewartan untersucht, welches lange Ketten ausbildet und als häufigste Komponente in den Biofilmen von Pantoea stewartii vorkommt. Dabei wurden die mechanischen Eigenschaften von Stewartan untersucht, um zu verstehen, wie diese den Biofilm beeinflussen. Dafür wurde eine Lösung aus mehreren Stewartan Molekülen computergestützt simuliert. Hierbei konnte beobachtet werden, dass die Stewartan Ketten ein dreidimensionales Netzwerk ausbilden, welches Poren aufweist. Außerdem wurde Stewartan aus Pantoea stewartii Biofilmen isoliert und die Diffusion von verschieden großen Nanopartikeln in dem Exopolysaccharidnetzwerk untersucht. Je höher die Stewartankonzentration war, desto mehr wurde die Diffusion der Nanopartikeln abgebremst. Außerdem wurden große Partikel stärker von dem Netzwerk zurückgehalten. Diese Untersuchungen wurden auf die Diffusion von Bakteriophagen, das sind Viren, die spezifisch Bakterien infizieren, ausgeweitet. Infolgedessen wurde gezeigt, dass Bakteriophagen in kleine Stewartanporen feststecken können. Die Diffusion all dieser Partikeln war aber auch abhängig von der Oberflächenladung des Partikels. Folglich bildet Stewartan ein Netzwerk aus, welches ganz spezifisch den Transport von Molekülen mit bestimmten Eigenschaften unterbindet. Außerdem ist bekannt, dass die Bakterien in der Lage sind, die mechanischen Eigenschaften des Biofilms zu modulieren, um sie an Veränderungen in der Umgebung anzupassen. Dies geschieht über bakterielle Enzyme. Daher wurde in dieser Arbeit der enzymatische Abbau von Stewartan untersucht, der eine dramatische Änderung der Eigenschaften des Biofilms zufolge haben kann. Dabei wurde die Stewartan Spaltung durch das Enzym WceF untersucht, welches von Pantoea stewartii produziert wird. Dieses Enzym spaltete die Stewartanketten nur sehr langsamen, sodass das Stewartannetzwerk erhalten blieb. Die Ergebnisse wurden mit dem tailspike Protein verglichen, welches von dem ΦEa1h Bakteriophagen produziert wird, dem natürlichen Feind des Bakteriums. Im Gegensatz zu WceF, baute das tailspike Protein Stewartan deutlich schneller ab und die gesamte mechanische Festigkeit des Netzwerkes wurde beseitigt. Beide Enzyme, trotz der unterschiedlichen Aktivität, besitzen eine sehr ähnliche Struktur, was vermuten lässt, dass sie von einem gleichen Vorgängerprotein abstammen. In dieser Arbeit wird vorgeschlagen, dass WceF möglicherweise in der Kettenlängekontrolle von Stewartan involviert ist. T2 - Enzymatische Remodellierung des Exopolysaccharid-Stewartan-Netzwerkes KW - biofilm KW - Pantoea stewartii KW - stewartan KW - exopolysaccharide KW - coarse grained molecular dynamics KW - microviscosity KW - Mikroviskosität KW - coarse grained Molekulardynamiken Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-472486 ER - TY - THES A1 - Jing, Yue T1 - Characterization of Serine Carboxypeptidase-like (SCPL) gene family in Brassicaceae Y1 - 2020 ER - TY - THES A1 - Kožul, Danijela T1 - Systematic identification of loci determining chloroplast and nuclear genome incompatibility in the evening primrose (Oenothera) Y1 - 2020 ER - TY - THES A1 - Kubis, Armin T1 - Synthetic carbon neutral photorespiration bypasses BT - implementation and testing in Escherichia coli N2 - With populations growing worldwide and climate change threatening food production there is an urgent need to find ways to ensure food security. Increasing carbon fixation rate in plants is a promising approach to boost crop yields. The carbon-fixing enzyme Rubisco catalyzes, beside the carboxylation reaction, also an oxygenation reaction that generates glycolate-2P, which needs to be recycled via a metabolic route termed photorespiration. Photorespiration dissipates energy and most importantly releases previously fixed CO2, thus significantly lowering carbon fixation rate and yield. Engineering plants to omit photorespiratory CO2 release is the goal of the FutureAgriculture consortium and this thesis is part of this collaboration. The consortium aims to establish alternative glycolate-2P recycling routes that do not release CO2. Ultimately, they are expected to increase carbon fixation rates and crop yields. Natural and novel reactions, which require enzyme engineering, were considered in the pathway design process. Here I describe the engineering of two pathways, the arabinose-5P and the erythrulose shunt. They were designed to recycle glycolate-2P via glycolaldehyde into a sugar phosphate and thereby reassimilate glycolate-2P to the Calvin cycle. I used Escherichia coli gene deletion strains to validate and characterize the activity of both synthetic shunts. The strains’ auxotrophies can be alleviated by the activity of the synthetic route, thus providing a direct way to select for pathway activity. I introduced all pathway components to these dedicated selection strains and discovered inhibitions, limitations and metabolic cross talk interfering with pathway activity. After resolving these issues, I was able to show the in vivo activity of all pathway components and combine them into functional modules.. Specifically, I demonstrate the activity of a new-to-nature module of glycolate reduction to glycolaldehyde. Also, I successfully show a new glycolaldehyde assimilation route via arabinose-5P to ribulose-5P. In addition, all necessary enzymes for glycolaldehyde assimilation via L-erythrulose were shown to be active and an L-threitol assimilation route via L-erythrulose was established in E. coli. On their own, these findings demonstrate the power of using an easily engineerable microbe to test novel pathways; combined, they will form the basis for implementing photorespiration bypasses in plants. KW - Synthetic Biology KW - Photorespiration KW - Metabolic Engineering KW - Escherichia coli Y1 - 2020 ER - TY - THES A1 - Küken, Anika T1 - Predictions from constraint-based approaches including enzyme kinetics N2 - The metabolic state of an organism reflects the entire phenotype that is jointly affected by genetic and environmental changes. Due to the complexity of metabolism, system-level modelling approaches have become indispensable tools to obtain new insights into biological functions. In particular, simulation and analysis of metabolic networks using constraint-based modelling approaches have helped the analysis of metabolic fluxes. However, despite ongoing improvements in prediction of reaction flux through a system, approaches to directly predict metabolite concentrations from large-scale metabolic networks remain elusive. In this thesis, we present a computational approach for inferring concentration ranges from genome-scale metabolic models endowed with mass action kinetics. The findings specify a molecular mechanism underling facile control of concentration ranges for components in large-scale metabolic networks. Most importantly, an extended version of the approach can be used to predict concentration ranges without knowledge of kinetic parameters, provided measurements of concentrations in a reference state. We show that the approach is applicable with large-scale kinetic and stoichiometric metabolic models of organisms from different kingdoms of life. By challenging the predictions of concentration ranges in the genome-scale metabolic network of Escherichia coli with real-world data sets, we further demonstrate the prediction power and limitations of the approach. To predict concentration ranges in other species, e.g. model plant species Arabidopsis thaliana, we would rely on estimates of kinetic parameters (i.e. enzyme catalytic rates) since plant-specific enzyme catalytic rates are poorly documented. Using the constraint-based approach of Davidi et al. for estimation of enzyme catalytic rates, we obtain values for 168 plant enzymes. The approach depends on quantitative proteomics data and flux estimates obtained from constraint-based model of plant leaf metabolism integrating maximal rates of selected enzymes, plant-specific constraints on fluxes through canonical pathways, and growth measurements from Arabidopsis thaliana rosette under ten conditions. We demonstrate a low degree of plant enzyme saturation, supported by the agreement between concentrations of nicotinamide adenine dinucleotide, adenosine triphosphate, and glyceraldehyde 3-phosphate, based on our maximal in vivo catalytic rates, and available quantitative metabolomics data. Hence, our results show genome-wide estimation for plant-specific enzyme catalytic rates is feasible. These can now be readily employed to study resource allocation, to predict enzyme and metabolite concentrations using recent constrained-based modelling approaches. Constraint-based methods do not directly account for kinetic mechanisms and corresponding parameters. Therefore, a number of workflows have already been proposed to approximate reaction kinetics and to parameterize genome-scale kinetic models. We present a systems biology strategy to build a fully parameterized large-scale model of Chlamydomonas reinhardtii accounting for microcompartmentalization in the chloroplast stroma. Eukaryotic algae comprise a microcompartment, the pyrenoid, essential for the carbon concentrating mechanism (CCM) that improves their photosynthetic performance. Since the experimental study of the effects of microcompartmentation on metabolic pathways is challenging, we employ our model to investigate compartmentation of fluxes through the Calvin-Benson cycle between pyrenoid and stroma. Our model predicts that ribulose-1,5-bisphosphate, the substrate of Rubisco, and 3-phosphoglycerate, its product, diffuse in and out of the pyrenoid. We also find that there is no major diffusional barrier to metabolic flux between the pyrenoid and stroma. Therefore, our computational approach represents a stepping stone towards understanding of microcompartmentalized CCM in other organisms. This thesis provides novel strategies to use genome-scale metabolic networks to predict and integrate metabolite concentrations. Therefore, the presented approaches represent an important step in broadening the applicability of large-scale metabolic models to a range of biotechnological and medical applications. N2 - Der Stoffwechsel eines Organismus spiegelt den gesamten Phänotyp wieder, welcher durch genetische und umweltbedingte Veränderungen beeinflusst wird. Aufgrund der Komplexität des Stoffwechsels sind Modellierungsansätze, welche das ganzheitliches System betrachten, zu unverzichtbaren Instrumenten geworden, um neue Einblicke in biologische Funktionen zu erhalten. Insbesondere die Simulation und Analyse von Stoffwechselnetzwerken mithilfe von Constraint-basierten Modellierungsansätzen hat die Analyse von Stoffwechselflüssen erleichtert. Trotz kontinuierlicher Verbesserungen bei der Vorhersage des Reaktionsflusses durch ein System, sind Ansätze zur direkten Vorhersage von Metabolitkonzentrationen aus metabolischen Netzwerken kaum vorhanden. In dieser Arbeit stellen wir einen Ansatz vor, mit welchem Konzentrationsbereiche aus genomweiten metabolischen Netzwerken, die mit einer Massenwirkungskinetik ausgestattet sind, abgeleitet werden können. Die Ergebnisse zeigen einen molekularen Mechanismus auf, welcher der Steuerung von Konzentrationsbereichen für Komponenten in metabolischen Netzwerken zugrunde liegt. Eine erweiterte Version des Ansatzes kann verwendet werden, um Konzentrationsbereiche ohne Kenntnis der kinetischen Parameter vorherzusagen, vorausgesetzt, dass Messungen von Konzentrationen in einem Referenzzustand vorhanden sind. Wir zeigen, dass der Ansatz mit kinetischen und stöchiometrischen Stoffwechselmodellen von Organismen aus verschiedenen taxonomischen Reichen anwendbar ist. Indem wir die Vorhersagen von Konzentrationsbereichen im genomweiten Stoffwechselnetzwerk von Escherichia coli mit realen Datensätzen validieren, demonstrieren wir die Vorhersagekraft und die Grenzen des Ansatzes. Um Konzentrationsbereiche in anderen Spezies vorherzusagen, z.B. der Modellpflanzenspezies Arabidopsis thaliana, stützen wir uns auf Schätzungen der kinetischen Parameter (d.h. der katalytischen Enzymraten), da tatsächlich gemessene, pflanzenspezifische katalytische Enzymraten nur unzureichend dokumentiert sind. Unter Verwendung des Constraint-basierten Ansatzes von Davidi et al. zur Abschätzung der katalytischen Enzymraten erhalten wir Werte für 168 pflanzliche Enzyme. Der Ansatz hängt von quantitativen Proteomikdaten und Schätzungen des Reaktionsflusses ab, die aus einem Constraint-basierten Modell des Pflanzenblattmetabolismus unter Einbeziehung der maximalen Raten ausgewählter Enzyme, pflanzenspezifischen Einschränkungen des Flusses durch kanonische Pfade und Wachstumsmessungen aus Rosetten von Arabidopsis thaliana unter zehn Bedingungen erhalten wurden. Wir fanden einen niedrigen Grad an Sättigung der Pflanzenenzyme, der durch die Übereinstimmung zwischen den Konzentrationen von Nicotinamidadenindinukleotid, Adenosintriphosphat und Glycerinaldehyd-3-phosphat auf der Grundlage unserer maximalen in vivo katalytischen Raten und den verfügbaren quantitativen Metabolomikdaten gestützt wird. Daher zeigen unsere Ergebnisse, dass genomweite Schätzungen für pflanzenspezifische Enzymkatalyseraten möglich sind. Diese können nun leicht verwendet werden, um die Ressourcenzuweisung zu untersuchen und die Enzym- und Metabolitenkonzentrationen unter Verwendung neuerer Constraint-basierter Modellierungsansätze vorherzusagen. Constraint-basierte Methoden berücksichtigen kinetische Mechanismen und entsprechende Parameter nicht direkt. Daher wurden einige Methoden entwickelt, welche die Reaktionskinetik approximieren und systemumfassende kinetische Modelle zu parametrisieren. Wir präsentieren eine systembiologische Strategie zur Erstellung eines vollständig parametrisierten Modells von Chlamydomonas reinhardtii, welches die Mikrokompartimentierung im Chloroplaststroma berücksichtigt. Eukaryotische Algen besitzen ein Mikrokompartiment, den Pyrenoiden, der für den Kohlenstoffkonzentrationsmechanismus (KKM) unerlässlich ist und die Photosyntheseleistung verbessert. Die experimentelle Untersuchung der Auswirkungen der Mikrokompartimentierung auf Stoffwechselwege stellt eine Herausforderung dar. Daher verwenden wir unser Modell um die Kompartimentierung von Reaktionsflüssen durch den Calvin-Benson-Zyklus zwischen Pyrenoid und Stroma zu untersuchen. Unser Modell sagt voraus, dass Ribulose-1,5-Bisphosphat, das Substrat von Rubisco, und 3-Phosphoglycerat , das Produkt, in den Pyrenoid hinein und aus ihm heraus diffundieren. Weiter stellen wir fest, dass es keine wesentliche Diffusionsbarriere zwischen dem Pyrenoid und dem Stroma gibt. Somit bietet unser Ansatz eine Möglichkeit um ein Verständnis des mikrokompartimentierten KKM auch in anderen Organismen zu erlangen. Diese Dissertation zeigt neue Strategien um metabolische Netzwerke zur Vorhersage von Metabolitkonzentrationen zu nutzen und selbige zu integrieren. Daher stellen die Ansätze einen wichtigen Schritt zur Anwendbarkeit von genomweiten Stoffwechselmodellen auf eine Reihe von biotechnologischen und medizinischen Anwendungen dar. KW - constraint-based modeling KW - metabolism KW - metabolic networks Y1 - 2020 ER - TY - THES A1 - Liu, Qi T1 - Influence of CO2 degassing on microbial community distribution and activity in the Hartoušov degassing system, western Eger Rift (Czech Republic) N2 - The Cheb Basin (CZ) is a shallow Neogene intracontinental basin located in the western Eger Rift. The Cheb Basin is characterized by active seismicity and diffuse degassing of mantle-derived CO2 in mofette fields. Within the Cheb Basin, the Hartoušov mofette field shows a daily CO2 flux of 23–97 tons. More than 99% of CO2 released over an area of 0.35 km2. Seismic active periods have been observed in 2000 and 2014 in the Hartoušov mofette field. Due to the active geodynamic processes, the Cheb Basin is considered to be an ideal region for the continental deep biosphere research focussing on the interaction of biological processes with geological processes. To study the influence of CO2 degassing on microbial community in the surface and subsurface environments, two 3-m shallow drillings and a 108.5-m deep scientific drilling were conducted in 2015 and 2016 respectively. Additionally, the fluid retrieved from the deep drilling borehole was also recovered. The different ecosystems were compared regarding their geochemical properties, microbial abundances, and microbial community structures. The geochemistry of the mofette is characterized by low pH, high TOC, and sulfate contents while the subsurface environment shows a neutral pH, and various TOC and sulfate contents in different lithological settings. Striking differences in the microbial community highlight the substantial impact of elevated CO2 concentrations and high saline groundwater on microbial processes. In general, the microorganisms had low abundance in the deep subsurface sediment compared with the shallow mofette. However, within the mofette and the deep subsurface sediment, the abundance of microbes does not show a typical decrease with depth, indicating that the uprising CO2-rich groundwater has a strong influence on the microbial communities via providing sufficient substrate for anaerobic chemolithoautotrophic microorganisms. Illumina MiSeq sequencing of the 16S rRNA genes and multivariate statistics reveals that the pH strongly influences the microbial community composition in the mofette, while the subsurface microbial community is significantly influenced by the groundwater which motivated by the degassing CO2. Acidophilic microorganisms show a much higher relative abundance in the mofette. Meanwhile, the OTUs assigned to family Comamonadaceae are the dominant taxa which characterize the subsurface communities. Additionally, taxa involved in sulfur cycling characterizing the microbial communities in both mofette and CO2 dominated subsurface environments. Another investigated important geo–bio interaction is the influence of the seismic activity. During seismic events, released H2 may serve as the electron donor for microbial hydrogenotrophic processes, such as methanogenesis. To determine whether the seismic events can potentially trigger methanogenesis by the elevated geogenic H2 concentration, we performed laboratory simulation experiments with sediments retrieved from the drillings. The simulation results indicate that after the addition of hydrogen, substantial amounts of methane were produced in incubated mofette sediments and deep subsurface sediments. The methanogenic hydrogenotrophic genera Methanobacterium was highly enriched during the incubation. The modeling of the in-situ observation of the earthquake swarm period in 2000 at the Novy Kostel focal area/Czech Republic and our laboratory simulation experiments reveals a close relation between seismic activities and microbial methane production via earthquake-induced H2 release. We thus conclude that H2 – which is released during seismic activity – can potentially trigger methanogenic activity in the deep subsurface. Based on this conclusion, we further hypothesize that the hydrogenotrophic early life on Earth was boosted by the Late Heavy Bombardment induced seismic activity in approximately 4.2 to 3.8 Ga. N2 - Das Eger-Becken (CZ) ist ein flaches, intrakontinentales neogenes Becken im westlichen Eger-Graben. Das Eger-Becken zeichnet sich durch aktive Seismizität und die diffuse Entgasung von aus dem Mantel stammenden CO2 in Mofettenfeldern aus. Das Mofettenfeld von Hartoušov weist einen täglichen CO2-Fluss von 23-97 Tonnen auf. Mehr als 99% des CO2 werden auf einer Fläche von 0,35 km2 freigesetzt. Im Untersuchungsgebiet wurden in den Jahren 2000 und 2014 seismisch aktive Perioden beobachtet. Aufgrund der aktiven geodynamischen Prozesse gilt das Egerer Becken als ideale Region für die kontinentale Tiefenbiosphärenforschung, die sich auf die Wechselwirkung von biologischen Prozessen mit geologischen Prozessen konzentriert. Zur Untersuchung des Einflusses der CO2-Entgasung auf die mikrobielle Gemeinschaft in der ober- und unterirdischen Umwelt wurden 2015 und 2016 zwei 3 m tiefe Flachbohrungen und eine 108,5 m tiefe wissenschaftliche Bohrung durchgeführt. Zusätzlich wurde auch aus dem Tiefbohrloch Flüssigkeit gewonnen. Die verschiedenen Ökosysteme wurden hinsichtlich ihrer geochemischen Eigenschaften, der mikrobiellen Abundanzen und der mikrobiellen Gemeinschaftsstrukturen verglichen. Die Geochemie der Mofetten zeichnet sich durch einen niedrigen pH-Wert und hohe TOC- und Sulfatgehalte aus, während das unterirdische Milieu einen neutralen pH-Wert und verschiedene TOC- und Sulfatgehalte in unterschiedlichen lithologischen Umgebungen aufweist. Auffällige Unterschiede in der mikrobiellen Gemeinschaft unterstreichen den erheblichen Einfluss erhöhter CO2-Konzentrationen und stark salzhaltigen Grundwassers auf mikrobielle Prozesse. Generell waren die mikrobiellen Abundanzen in dem tiefen Untergrundsediment im Vergleich zur flachen Mofette gering. Innerhalb der Mofette und des tiefen unterirdischen Sediments zeigt die Häufigkeit der Mikroorganismen jedoch keine typische Abnahme mit der Tiefe, was darauf hinweist, dass das aufsteigende CO2-reiche Grundwasser einen starken Einfluss auf die mikrobiellen Gemeinschaften hat, indem es genügend Substrat für anaerobe chemolithoautotrophe Mikroorganismen bietet. Die Illumina-MiSeq-Sequenzierung der 16S rRNA-Gene und die multivariate Statistik zeigen, dass der pH-Wert die Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft in der Mofette signifikant bestimmt, während die unterirdische mikrobielle Gemeinschaft signifikant vom Grundwasser beeinflusst wird, das durch das ausgasende CO2 geprägt ist. Azidophile Mikroorganismen zeigen eine viel höhere relative Abundanz in der Mofette, wohingegen die der Familie Comamonadaceae zugeordneten OTUs die dominierenden Taxa der unterirdischen Gemeinschaften darstellen. Zusätzlich charakterisieren Taxa, die am Schwefelzyklus beteiligt sind, die mikrobiellen Gemeinschaften sowohl in der Mofette als auch in der CO2-dominierten unterirdischen Umwelt. Eine weitere wichtige Untersuchung der Geo-Bio-Interaktion ist der Einfluss der seismischen Aktivität. Während seismischer Ereignisse kann freigesetztes H2 als Elektronendonator für mikrobielle hydrogenotrophe Prozesse, wie z.B. die Methanogenese, dienen. Um zu bestimmen, ob die seismischen Ereignisse durch die erhöhten geogenen H2-Konzentrationen möglicherweise methanogene Prozesse auslösen können, führten wir Laborsimulationsexperimente mit Sedimenten durch, die aus den Bohrungen gewonnen wurden. Die Simulationsexperimente weisen darauf hin, dass nach der Zugabe von Wasserstoff beträchtliche Mengen an Methan in inkubierten Mofettensedimenten und tiefen unterirdischen Sedimenten produziert wurden. Die methanogene hydrogenotrophe Gattung Methanobacterium wurde während der Inkubation stark angereichert. Die Modellierung der in-situ-Beobachtung der Erdbeben-Schwarmzeit im Jahr 2000 im Schwerpunktgebiet Novy Kostel/Tschechische Republik und unsere Laborsimulationsexperimente zeigen einen engen Zusammenhang zwischen seismischen Aktivitäten und der biotischen Methanproduktion durch erdbebeninduzierte H2-Freisetzung. Wir kommen daher zu dem Schluss, dass H2 - dass bei seismischer Aktivität freigesetzt wird - möglicherweise methanogene Aktivität im tiefen Untergrund auslösen kann. Basierend auf dieser Schlussfolgerung gehen wir weiter davon aus, dass das frühe hydrogenotrophe Leben, durch die durch Late Heavy Bombardment induzierte seismische Aktivität in etwa 4,2 bis 3,8 Ga verstärkt wurde. T2 - Einfluss der CO2-Entgasung auf die Verteilung und Aktivität der mikrobiellen Gemeinschaft im Hartoušov-Entgasungssystem im westlichen Eger-Graben (Tschechische Republik) KW - CO2 degassing KW - western Eger Rift KW - microbial community KW - microbial activity KW - earthquake KW - seismic activity KW - deep biosphere KW - CO2-Entgasung KW - tiefe Biosphäre KW - Erdbeben KW - mikrobielle Aktivität KW - mikrobielle Gemeinschaft KW - seismische Aktivität KW - westlichen Eger-Graben Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-475341 ER - TY - THES A1 - Mavrothalassiti, Eleni T1 - A.thaliana root and shoot single-cell transcriptomes and detection of mobile transcripts Y1 - 2020 ER - TY - THES A1 - Mitzscherling, Julia T1 - Microbial communities in submarine permafrost and their response to permafrost degradation and warming N2 - The Arctic region is especially impacted by global warming as temperatures in high latitude regions have increased and are predicted to further rise at levels above the global average. This is crucial to Arctic soils and the shallow shelves of the Arctic Ocean as they are underlain by permafrost. Perennially frozen ground is a habitat for a large number and great diversity of viable microorganisms, which can remain active even under freezing conditions. Warming and thawing of permafrost makes trapped soil organic carbon more accessible to microorganisms. They can transform it to the greenhouse gases carbon dioxide, methane and nitrous oxide. On the other hand, it is assumed that thawing of the frozen ground stimulates microbial activity and carbon turnover. This can lead to a positive feedback loop of warming and greenhouse gas release. Submarine permafrost covers most areas of the Siberian Arctic Shelf and contains a large though unquantified carbon pool. However, submarine permafrost is not only affected by changes in the thermal regime but by drastic changes in the geochemical composition as it formed under terrestrial conditions and was inundated by Holocene sea level rise and coastal erosion. Seawater infiltration into permafrost sediments resulted in an increase of the pore water salinity and, thus, in thawing of permafrost in the upper sediment layers even at subzero temperatures. The permafrost below, which was not affected by seawater, remained ice-bonded, but warmed through seawater heat fluxes. The objective of this thesis was to study microbial communities in submarine permafrost with a focus on their response to seawater influence and long-term warming using a combined approach of molecular biological and physicochemical analyses. The microbial abundance, community composition and structure as well as the diversity were investigated in drill cores from two locations in the Laptev Sea, which were subjected to submarine conditions for centuries to millennia. The microbial abundance was measured through total cell counts and copy numbers of the 16S rRNA gene and of functional genes. The latter comprised genes which are indicative for methane production (mcrA) and sulfate reduction (dsrB). The microbial community was characterized by high-throughput-sequencing of the 16S rRNA gene. Physicochemical analyses included the determination of the pore water geochemical and stable isotopic composition, which were used to describe the degree of seawater influence. One major outcome of the thesis is that the submarine permafrost stratified into different so-called pore water units centuries as well as millennia after inundation: (i) sediments that were mixed with seafloor sediments, (ii) sediments that were infiltrated with seawater, and (iii) sediments that were unaffected by seawater. This stratification was reflected in the submarine permafrost microbial community composition only millennia after inundation but not on time-scales of centuries. Changes in the community composition as well as abundance were used as a measure for microbial activity and the microbial response to changing thermal and geochemical conditions. The results were discussed in the context of permafrost temperature, pore water composition, paleo-climatic proxies and sediment age. The combination of permafrost warming and increasing salinity as well as permafrost warming alone resulted in a disturbance of the microbial communities at least on time-scales of centuries. This was expressed by a loss of microbial abundance and bacterial diversity. At the same time, the bacterial community of seawater unaffected but warmed permafrost was mainly determined by environmental and climatic conditions at the time of sediment deposition. A stimulating effect of warming was observed only in seawater unaffected permafrost after millennia-scale inundation, visible through increased microbial abundance and reduced amounts of substrate. Despite submarine exposure for centuries to millennia, the community of bacteria in submarine permafrost still generally resembled the community of terrestrial permafrost. It was dominated by phyla like Actinobacteria, Chloroflexi, Firmicutes, Gemmatimonadetes and Proteobacteria, which can be active under freezing conditions. Moreover, the archaeal communities of both study sites were found to harbor high abundances of marine and terrestrial anaerobic methane oxidizing archaea (ANME). Results also suggested ANME populations to be active under in situ conditions at subzero temperatures. Modeling showed that potential anaerobic oxidation of methane (AOM) could mitigate the release of almost all stored or microbially produced methane from thawing submarine permafrost. Based on the findings presented in this thesis, permafrost warming and thawing under submarine conditions as well as permafrost warming without thaw are supposed to have marginal effects on the microbial abundance and community composition, and therefore likely also on carbon mobilization and the formation of methane. Thawing under submarine conditions even stimulates AOM and thus mitigates the release of methane. N2 - Die globale Erwärmung beeinträchtigt die Arktische Region besonders stark. Im Vergleich zum globalen Mittel sind die Temperaturen in den hohen Breitengraden am stärksten gestiegen und werden voraussichtlich auch weiterhin am stärksten ansteigen. Das ist äußerst kritisch, da arktische Böden und die flachen Schelfgebiete des Arktischen Ozeans von Permafrost geprägt sind. Dieser mehrjährig gefrorene Boden ist ein Habitat für eine große Anzahl und Diversität von Mikroorganismen, die lebensfähig sind und auch unter gefrorenen Bedingungen aktiv sein können. Einerseits machen eine Erwärmung und das Tauen des Permafrosts gespeicherten organischen Kohlenstoff zugänglicher für die Mikroorganismen. Diese können den Kohlenstoff in die Treibhausgase Kohlenstoffdioxid, Methan und Distickstoffoxid umwandeln. Andererseits stimuliert das Tauen des gefrorenen Bodens die mikrobielle Aktivität und den Kohlenstoffumsatz. Das kann zu einem sich verstärkenden Rückkopplungsprozess aus Erwärmung und Freisetzung von Treibhausgasen führen. Submariner Permafrost umfasst den größten Teil des Ostsibirischen Arktisschelfs und enthält ein großes, wenn auch nicht quantifiziertes Kohlenstoffreservoir. Der submarine Permafrost wird jedoch nicht nur durch Veränderungen des Wärmehaushalts beeinflusst, sondern auch durch drastische Veränderungen in der geochemischen Zusammensetzung. Durch den holozänen Meeresspiegelanstieg und durch Küstenerosion wurde der unter terrestrischen Bedingungen gebildete Permafrost überflutet. Ein Eindringen von Meerwasser führte in den Permafrostsedimenten zu einem Anstieg der Porenwasser-Salinität und dadurch zum Tauen des Permafrosts in den oberen Schichten, sogar bei Temperaturen unter 0 °C. Tiefer liegende Permafrostsedimente, die (noch) nicht vom Meerwasser beeinflusst wurden, blieben eis-gebunden, aber begannen sich durch den Wärmestrom des Meerwassers zu erwärmen. Das Ziel dieser Dissertation war es, die mikrobiellen Gemeinschaften in submarinem Permafrost zu untersuchen. Der Fokus lag dabei auf der Reaktion der Gemeinschaften auf den Einfluss des Meerwassers und die Langzeiterwärmung. Die Arbeit nutzt dafür einen kombinierten Ansatz aus molekularbiologischen und physikochemischen Analysen. Die mikrobielle Abundanz, Gemeinschaftszusammensetzung und -struktur sowie die Diversität wurden in Sedimentbohrkernen zweier Standorte in der Laptew See untersucht, welche seit Jahrhunderten bis Jahrtausenden submarinen Bedingungen ausgesetzt waren. Die mikrobielle Abundanz wurde mit Hilfe von Zellzahlen und Kopienzahlen des 16S rRNA Gens sowie funktioneller Gene bestimmt, die kennzeichnend für die Methanproduktion (mcrA) und Sulfatreduktion (dsrB) sind. Die mikrobielle Gemeinschaft wurde mit Hilfe der Hochdurchsatz-Sequenzierung des 16S rRNA Gens charakterisiert. Physikochemische Analysen beinhalteten die Untersuchung der geochemischen Zusammensetzung der Porenwassers und der stabilen Wasserisotopen. Beide Zusammensetzungen wurden genutzt, um den Grad des Meerwassereinflusses auf die Permafrostsedimente zu beschreiben. Ein Hauptergebnis der Arbeit ist, dass sich submariner Permafrost sowohl nach Jahrhunderten als auch nach Jahrtausenden der Überflutung in verschiedene Schichten, sogenannte Porenwassereinheiten, unterteilen lässt: (i) Sedimente, die sich mit dem Meeresboden vermischt haben, (ii) Sedimente, die vom Meerwasser infiltriert wurden und (iii) Sedimente, die vom Meerwasser unbeeinflusst sind. Diese Schichtenbildung spiegelt sich erst nach jahrtausendelanger Überflutung auch in der mikrobiellen Gemeinschaftszusammensetzung wider, nicht jedoch nach Jahrhunderten. Änderungen sowohl in der Gemeinschaftszusammensetzung als auch in der Abundanz wurden als Maß für mikrobielle Aktivität und die mikrobielle Reaktion auf die sich ändernden thermischen und geochemischen Bedingungen genutzt. Die Ergebnisse wurden im Kontext von Permafrosttemperatur, Porenwasserzusammensetzung, paleoklimatischen Proxys und dem Sedimentalter diskutiert. Die Kombination aus Permafrosterwärmung und steigender Salinität, sowie die Permafrosterwärmung allein, resultierten auf Zeitskalen von Jahrhunderten in einer Störung der mikrobiellen Gemeinschaft. Dies drückte sich durch einen Verlust der mikrobiellen Abundanz und der bakteriellen Diversität aus. Gleichzeitig wurde die bakterielle Gemeinschaft im vom Meerwasser unbeeinflussten, aber erwärmten Permafrost hauptsächlich durch die Umweltbedingungen und das Klima zur Zeit der Sedimentablagerung geprägt. Ein stimulierender Einfluss der Erwärmung konnte im vom Meerwasser unbeeinflussten Permafrost erst nach jahrtausendelanger Überflutung beobachtet werden. Dies wurde durch einen Anstieg in der mikrobiellen Abundanz und einer Abnahme der organischen Substrate sichtbar. Obwohl die bakteriellen Gemeinschaften des Permafrostes submarinen Bedingungen für Jahrhunderte bis Jahrtausende ausgesetzt waren, unterschieden sie sich kaum von den Gemeinschaften im terrestrischen Permafrost. Die Gemeinschaft des submarinen Permafrosts wurde von Phyla wie Actinobacteria, Chloroflexi, Firmicutes, Gemmatimonadetes und Proteobacteria dominiert, welche auch unter gefrorenen Bedingungen aktiv sein können. Darüber hinaus enthielten die archaellen Gemeinschaften an beiden Standorten eine hohe Anzahl von marinen und terrestrischen anaerob methan-oxidierenden Archaeen (ANME), bei denen eine Aktivität unter in situ Bedingungen bei Minusgraden angenommen wird. Eine Modellierung zeigte, dass die anaerobe Oxidation von Methan (AOM) potenziell fast die gesamte Menge des gespeicherten und mikrobiell produzierten Methans in tauendem submarinem Permafrost reduzieren könnte. Die Ergebnisse der Arbeit deuten darauf hin, dass das Tauen von Permafrost unter submarinen Bedingungen sowie eine Erwärmung ohne Tauen marginale Effekte auf die Abundanz und Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaften und somit wahrscheinlich auch auf die Mobilisierung von Kohlenstoff in Form von Methan hat. Das Tauen unter submarinen Bedingungen stimuliert sogar AOM und reduziert somit den Ausstoß von Methan. T2 - Mikrobielle Gemeinschaften in submarinem Permafrost and ihre Reaktion auf die Degradierung und Erwärmung des Permafrosts KW - Microbial communities KW - Subsea permafrost KW - Arctic KW - Mikrobielle Gemeinschaften KW - Submariner Permafrost KW - Arktis KW - Submarine permafrost KW - next generation sequencing KW - Hochdurchsatzsequenzierung KW - Permafrostdegradation KW - permafrost degradation Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-471240 ER - TY - THES A1 - Moratti, Fabio Giulio T1 - Structural analysis of DYW proteins and identification of the mitochondrial DNA-binding proteome of Arabidopsis thaliana Y1 - 2020 ER - TY - THES A1 - Naake, Thomas T1 - Strategies to investigate the natural variation of plant specialized metabolism Y1 - 2020 ER - TY - THES A1 - Nowak, Jacqueline T1 - Devising computational tools to quantify the actin cytoskeleton and pavement cell shape using network-based approaches N2 - Recent advances in microscopy have led to an improved visualization of different cell processes. Yet, this also leads to a higher demand of tools which can process images in an automated and quantitative fashion. Here, we present two applications that were developed to quantify different processes in eukaryotic cells which rely on the organization and dynamics of the cytoskeleton.. In plant cells, microtubules and actin filaments form the backbone of the cytoskeleton. These structures support cytoplasmic streaming, cell wall organization and tracking of cellular material to and from the plasma membrane. To better understand the underlying mechanisms of cytoskeletal organization, dynamics and coordination, frameworks for the quantification are needed. While this is fairly well established for the microtubules, the actin cytoskeleton has remained difficult to study due to its highly dynamic behaviour. One aim of this thesis was therefore to provide an automated framework to quantify and describe actin organization and dynamics. We used the framework to represent actin structures as networks and examined the transport efficiency in Arabidopsis thaliana hypocotyl cells. Furthermore, we applied the framework to determine the growth mode of cotton fibers and compared the actin organization in wild-type and mutant cells of rice. Finally, we developed a graphical user interface for easy usage. Microtubules and the actin cytoskeleton also play a major role in the morphogenesis of epidermal leaf pavement cells. These cells have highly complex and interdigitated shapes which are hard to describe in a quantitative way. While the relationship between microtubules, the actin cytoskeleton and shape formation is the object of many studies, it is still not clear how and if the cytoskeletal components predefine indentations and protrusions in pavement cell shapes. To understand the underlying cell processes which coordinate cell morphogenesis, a quantitative shape descriptor is needed. Therefore, the second aim of this thesis was the development of a network-based shape descriptor which captures global and local shape features, facilitates shape comparison and can be used to evaluate shape complexity. We demonstrated that our framework can be used to describe and compare shapes from various domains. In addition, we showed that the framework accurately detects local shape features of pavement cells and outperform contending approaches. In the third part of the thesis, we extended the shape description framework to describe pavement cell shape features on tissue-level by proposing different network representations of the underlying imaging data. N2 - Aktuelle Entwicklungen in der Mikroskopie haben zu einer verbesserten Visualisierung von verschiedenen Zellprozessen geführt. Dennoch führt das auch zu einem höheren Bedarf an Werkzeugen, die Bilder in einer automatisierten und quantitativen Weise bearbeiten und analysieren können. Hier präsentieren wir zwei Anwendungen, die entwickelt wurden, um verschiedene Prozesse in eukaryotischen Zellen zu quantifizieren, welche von der Organisation und Dynamik des Zytoskeletts abhängig sind. In Pflanzenzellen bilden Mircotubuli und Aktinfilamente das Rückgrat des Zytoskeletts. Diese Strukturen unterstützen die Zytoplasmaströmung, die Organisation der Zellwand und den Transport von zellulärem Material zu und von der Plasmamembran. Um die zugrundeliegenden Mechanismen der Organisation, Dynamik und Koordination des Zytoskeletts zu verstehen, sind Hilfsmittel zur Quantifizierung notwendig. Während das ziemlich ausführlich für Microtubuli getan wurde, bleibt das Aktin-Zytoskelett schwer zu studieren aufgrund seines hoch dynamischen Verhaltens. Das erste Ziel dieser Arbeit war es daher, einen automatisierten Framework zu entwickeln, der die Aktin-Organisation und Dynamik quantifiziert und beschreibt. Wir haben diesen Framework genutzt, um Aktin-Strukturen als Netzwerke zu repräsentieren und haben damit die Transporteffizienz in Arabidopsis thaliana Hypocotylzellen untersucht. Des Weiteren haben wir den Framework genutzt, um den Wachstumsmodus in Baumwollfasern zu bestimmen und um die Aktin-Organisation in Reis-Wildtyp und Mutanten zu vergleichen. Zuletzt haben wir eine grafische Benutzeroberfläche zur einfacheren Benutzung entwickelt. Microtubuli und das Aktin-Zytoskelett spielen auch eine große Rolle in der Morphogenese von epidermalen Blattzellen. Diese Zellen haben hochkomplexe und interdigitale Formen, welche sehr schwer in einer quantitativen Art zu beschreiben sind. Während die Beziehung zwischen Microtubuli, dem Aktin-Zytoskelett und Formgestaltung der Zellen in vielen Studien untersucht wurde, ist es immer noch nicht ganz klar wie und ob die Zytoskelettkomponenten die Ein- und Ausbuchtungen in Blattzellen vorherbestimmen. Um die zugrundeliegenden Zellprozesse zu verstehen, die die Zellmorphogenese koordinieren, sind quantitative Beschreiber von Formen notwendig. Daher war das zweite Ziel dieser Arbeit die Entwicklung eines netzwerkbasierten Gestaltbeschreibers, welcher globale und lokale Gestaltmerkmale erfasst, einen Gestaltvergleich ermöglich und die Komplexität von Formen evaluieren kann. Wir haben nachgewiesen, dass unser Framework benutzt werden kann, um Formen aus verschiedenen Bereichen zu beschreiben und zu vergleichen. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass der Framework lokale Gestaltmerkmale in Blattzellen akkurat ermittelt und andere konkurrierende Methoden hinter sich lässt. Im dritten Teil der Arbeit haben wir den Gestaltbeschreiber erweitert, um Gestaltmerkmale von Blattzellen, bezogen auf das ganze Zellgewebe, zu beschreiben, indem wir verschiedene Netzwerkrepräsentationen der zugrundeliegenden Bilddaten vorstellen. KW - Netzwerke KW - Bildanalyse KW - Pflanzenzellen KW - Aktinzytoskelett KW - Zellform KW - pavement cells image analysis KW - cell shape KW - cell morphogenesis KW - actin cytoskeleton machine KW - learning networks plant KW - cells epidermis Y1 - 2020 ER - TY - THES A1 - Saplaoura, Eleftheria T1 - Escaping the plant cell BT - a study on m5C RNA methylation and tRNA-like structures as mRNA mobility signals Y1 - 2020 ER - TY - THES A1 - Schuster, Maja T1 - High resolution decoding of the tobacco chloroplast translatome and its dynamics during light-intensity acclimation N2 - Chloroplasts are the photosynthetic organelles in plant and algae cells that enable photoautotrophic growth. Due to their prokaryotic origin, modern-day chloroplast genomes harbor 100 to 200 genes. These genes encode for core components of the photosynthetic complexes and the chloroplast gene expression machinery, making most of them essential for the viability of the organism. The regulation of those genes is predominated by translational adjustments. The powerful technique of ribosome profiling was successfully used to generate highly resolved pictures of the translational landscape of Arabidopsis thaliana cytosol, identifying translation of upstream open reading frames and long non-coding transcripts. In addition, differences in plastidial translation and ribosomal pausing sites were addressed with this method. However, a highly resolved picture of the chloroplast translatome is missing. Here, with the use of chloroplast isolation and targeted ribosome affinity purification, I generated highly enriched ribosome profiling datasets of the chloroplasts translatome for Nicotiana tabacum in the dark and light. Chloroplast isolation was found unsuitable for the unbiased analysis of translation in the chloroplast but adequate to identify potential co-translational import. Affinity purification was performed for the small and large ribosomal subunit independently. The enriched datasets mirrored the results obtained from whole-cell ribosome profiling. Enhanced translational activity was detected for psbA in the light. An alternative translation initiation mechanism was not identified by selective enrichment of small ribosomal subunit footprints. In sum, this is the first study that used enrichment strategies to obtain high-depth ribosome profiling datasets of chloroplasts to study ribosome subunit distribution and chloroplast associated translation. Ever-changing light intensities are challenging the photosynthetic capacity of photosynthetic organism. Increased light intensities may lead to over-excitation of photosynthetic reaction centers resulting in damage of the photosystem core subunits. Additional to an expensive repair mechanism for the photosystem II core protein D1, photosynthetic organisms developed various features to reduce or prevent photodamage. In the long-term, photosynthetic complex contents are adjusted for the efficient use of experienced irradiation. However, the contribution of chloroplastic gene expression in the acclimation process remained largely unknown. Here, comparative transcriptome and ribosome profiling was performed for the early time points of high-light acclimation in Nicotiana tabacum chloroplasts in a genome-wide scale. The time- course data revealed stable transcript level and only minor changes in translational activity of specific chloroplast genes during high-light acclimation. Yet, psbA translation was increased by two-fold in the high light from shortly after the shift until the end of the experiment. A stress-inducing shift from low- to high light exhibited increased translation only of psbA. This study indicate that acclimation fails to start in the observed time frame and only short-term responses to reduce photoinhibition were observed. N2 - Chloroplasten sind die photosynthetischen Organellen in Pflanzen- und Algenzellen, die photoautotrophes Wachstum ermöglichen. Aufgrund ihrer prokaryotischen Herkunft besitzen moderne Chloroplasten ein Genom mit 100 bis 200 Gene. Diese kodieren für zentrale Komponenten der Photosynthesekomplexe und des Genexpressionsapparates, was sie für die Lebensfähigkeit des gesamten Organismus essenziell macht. Die leistungsstarke Methode Ribosome Profiling wurde bereits erfolgreich eingesetzt, um hochaufgelöste Bilder der zytosolischen Translationslandschaft von Arabidopsis thaliana zu erstellen, wobei Translation von der Hauptsequenz vorgelagerten, kodierenden Sequenzen und langen, nicht-kodierenden Transkripten identifiziert wurde. Ferner wurden mit dieser Technik Regulationen der Plastidentranslation und spezifische Regionen mit unterschiedlicher Elongationsgeschwindigkeit aufgedeckt. Es fehlen jedoch hochaufgelöste Datensätze des Chloroplasten-Translatoms. Chloroplastenisolation und Affinitätsaufreinigung chloroplastidiärer Ribosomen wurde verwendet, um hochangereicherte Ribosome Profiling-Datensätze des Chloroplastentranslatoms für Nicotiana tabacum im Dunkeln und unter Licht zu erzeugen. Wenngleich sich die Chloroplastenisolation als ungeeignet für eine unverfälschte Analyse der Translation im Chloroplast erwies, ermöglichte sie die Identifizierung von potentiellem co-translationalen Proteinimport. Die entsprechenden Datensätze spiegelten die Ergebnisse des zellulären Ribosome Profilings wider. Für psbA wurde im Licht erhöhte Translationsaktivität festgestellt. Alternative Initiationsmechanismen konnten durch spezifische Anreicherung der kleinen ribosomalen Untereinheit nicht verifiziert werden. Zusammenfassend, dies ist die erste Studie, die mittels Anreicherungsstrategien hochaufgelöste Ribosome Profiling-Datensätze zur Analyse von Ribosomuntereinheitsverteilungen und Chloroplast-assoziierter Translation nutzte. Ständig wechselnde Lichtintensitäten stellen die Photosynthesekapazität von photosynthetischen Organismen auf die Probe. Erhöhte Lichtintensitäten können zu einer Überreizung der photosynthetischen Reaktionszentren führen, was Beschädigungen von zentralen Komplexeinheiten der Photosysteme verursacht. Neben einem aufwändigen Reparaturmechanismus für das Photosystem II-Protein D1 entwickelte der photosynthetische Organismus verschiedene Mechanismen um lichtinduzierte Schäden zu reduzieren oder zu verhindern. Langfristig kommt es zu einer Anreicherung spezifischer Photosynthesekomplexen um eine effiziente Ausnutzung der erhöhten Strahlung zu gewährleisten. Der Beitrag der chloroplastidiäeren Genexpressionsregulation zum Akklimatisierungsprozess ist jedoch weitgehend unbekannt. Hier wurde ein vergleichendes Transkript- und Ribosomen Profiling für die frühen Zeitpunkte der Akklimatisierung unter Starklicht in Tabakchloroplasten in einem genomweiten Maßstab durchgeführt. Die Zeitverlaufsdaten zeigten ein unverändertes Transkriptniveau und nur geringe Änderungen der translationalen Aktivität von chloroplastidiären Genen im Hochlicht im Vergleich zu Kontrollproben. Die psbA-Translation war jedoch unter Hochlicht schon kurz nach Beginn bis zum Ende des Experiments um etwa das Zweifache erhöht. Der stressinduzierende Wechsel von Schwach- zu Hochlicht bewirkte ebenfalls eine auf psbA-beschränkt, erhöhte Translation. Die Ergebnisse zeigen, dass die Akklimatisierung im beobachteten Zeitrahmen nicht begonnen hatte und nur kurzfristige Reaktionen zur Verringerung der Photoinhibition wirksam gewesen sein konnten. KW - translation KW - chloroplast KW - high light KW - ribosome profiling Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-512680 ER - TY - THES A1 - Schälicke, Svenja T1 - Consumer traits and trait variation under the influence of biochemical food quality T1 - Merkmale und Merkmalsvariationen von Konsumenten unter dem Einfluss biochemischer Nahrungsqualität N2 - The earth’s ecosystems undergo considerable changes characterized by human-induced alterations of environmental factors. In order to develop conservation goals for vulnerable ecosystems, research on ecosystem functioning is required.. Therefore, it is crucial to explore organismal interactions, such as trophic interaction or competition, which are decisive for key processes in ecosystems. These interactions are determined by the performance responses of organisms to environmental changes, which in turn, are shaped by the organism’s functional traits. Exploring traits, their variation, and the environmental factors that act on them may provide insights on how ecological interactions affect populations, community structures and dynamics, and thus ecosystem functioning. In aquatic ecosystems, global warming intensifies phytoplankton blooms, which are more frequently dominated by cyanobacteria. As cyanobacteria are poor in polyunsaturated fatty acids (PUFA) and sterols, this compositional change alters the biochemical food quality of phytoplankton for consumer species with potential effects on ecological interactions. Within this thesis, I studied the effects of biochemical food quality on consumer traits and performance responses at the phytoplankton-zooplankton interface using different strains of two closely related generalist rotifer species Brachionus calyciflorus and Brachionus fernandoi and three phytoplankton species that differ in their biochemical food quality, i.e. in their content and composition of PUFA and sterols. In a series of laboratory feeding experiments I found that biochemical food quality affected rotifer’s performance, i.e. fecundity, survival, and population growth, across a broad range of food quantities. Biochemical food quality constraints, which are often underestimated as influencing environmental factors, had strong impacts on performance responses. I further explored the potential of biochemical food quality in mediating consumer response variation between species and among strains of one species. Co-limitation by food quantity and biochemical food quality resulted in differences in performance responses, which were more pronounced within than between rotifer species. Furthermore, I demonstrated that the body PUFA compositions of rotifer species and strains were differently affected by the dietary PUFA supply, which indicates inter- and intraspecific differences in physiological traits, such as PUFA retention, allocation, and/or bioconversion capacity, within the genus Brachionus. This indicates that dietary PUFA are involved in shaping traits and performance responses of rotifers. This thesis reveals that biochemical food quality is an environmental factor with strong effects on individual traits and performance responses of consumers. Biochemical food quality constraints can further mediate trait and response variation among species or strains. Consequently, they carry the potential to shape ecological interactions and evolutionary processes with effects on community structures and dynamics. Trait-based approaches, which include food quality research, thus may provide further insights into the linkage between functional diversity and the maintenance of crucial ecosystem functions. N2 - Die Ökosysteme der Erde sind einem ständigen Wandel unterworfen, der immer stärker durch anthropogen veränderte Umweltfaktoren geprägt ist. Um Schutzziele für gefährdete Ökosysteme verfolgen zu können, ist es erforderlich Ökosystemfunktionen zu verstehen. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, die Interaktionen zwischen Organismen zu erforschen, wie z.B. trophische Interaktionen, die für Schlüsselprozesse in Ökosystemen entscheidend sind. Diese Interaktionen werden durch die Fitnessreaktionen der Organismen auf Umweltveränderungen bestimmt, die wiederum durch die funktionellen Merkmale des Organismus, den sogenannten Traits, geprägt werden. Das Erforschen von Traits, ihrer Variation und der auf sie einwirkenden Umweltfaktoren kann Erkenntnisse darüber liefern, wie sich ökologische Interaktionen auf Populationen, Gemeinschaftsstrukturen und -dynamiken und damit auf Ökosystemfunktionen auswirken können. In aquatischen Ökosystemen fördert der Klimawandel die Bildung von Phytoplanktonblüten, welche immer häufiger von Cyanobakterien dominiert werden. Da Cyanobakterien arm an mehrfach ungesättigten Fettsäuren (PUFA) und Sterolen sind, beeinflusst diese veränderte Zusammensetzung des Phytoplanktons die biochemische Nahrungsqualität für die Konsumenten mit potentiellen Auswirkungen auf ökologische Interaktionen. Im Rahmen meiner Doktorarbeit untersuchte ich Effekte der biochemischen Nahrungsqualität von Phytoplankton auf die Traits und Fitnessreaktionen von Zooplankton.. Als Modellorganismen dienten verschiedene Stämme von den zwei verwandten Rotatorienarten Brachionus calyciflorus und Brachionus fernandoi und drei Phytoplanktonarten, die sich in ihrer biochemischen Nahrungsqualität, d.h. in ihrer PUFA- und Sterolzusammensetzung, unterscheiden. In einer Reihe von Laborexperimenten konnte ich herausstellen, dass die biochemische Nahrungsqualität die Fitness der Rotatorien, d.h. ihre Fekundität, Überlebensraten und Populationswachstumsraten, über ein breites Spektrum von Nahrungsquantitäten hinweg beeinflusst. Die Limitierung durch biochemische Nahrungsqualität, die als Einflussfaktor oft unterschätzt wird, zeigte starke Effekte auf die Fitnessreaktionen. Darüber hinaus konnte ich zeigen, dass die Verfügbarkeit biochemischer Nährstoffe Fitnessvariationen zwischen Arten und zwischen Stämmen einer Art beeinflussen kann. Eine Co-Limitierung durch die Nahrungsquantität und die biochemische Nahrungsqualität führte zu Variationen in Fitnessreaktionen der Rotatorien, die innerhalb einer Art größer waren als zwischen den Arten. Ich konnte außerdem nachweisen, dass sich in Abhängigkeit von der Verfügbarkeit der PUFA in der Nahrung auch die PUFA-Zusammensetzung in den Rotatorien zwischen Arten und Stämmen unterscheiden. Dies weist auf inter- und intraspezifische Unterschiede in physiologischen Traits, wie z.B. der Retentions-, Allokations- oder Biokonversionskapazität von PUFA, innerhalb der Gattung Brachionus hin. In der Nahrung verfügbare PUFA stellen demnach wichtige Einflussfaktoren für Fitnessreaktionen von Rotatorien dar. Diese Doktorarbeit belegt, dass die biochemische Nahrungsqualität ein Umweltfaktor ist, der starke Auswirkungen auf Traits und Fitnessreaktionen von Konsumenten haben kann. Darüber hinaus kann die Verfügbarkeit von biochemischen Nährstoffen die Variation von Traits und Fitnessreaktionen zwischen Arten oder Stämmen vermitteln. Folglich hat die biochemische Nahrungsqualität das Potenzial, sowohl ökologische Interaktionen als auch evolutionäre Prozesse zu beeinflussen. Dies hat Auswirkungen auf Gemeinschaftsstrukturen und -dynamiken. Trait-basierte Forschungsansätze, die Nahrungsqualitätskomponenten berücksichtigen, können daher erweiterte Einblicke in den Zusammenhang zwischen funktioneller Diversität und der Aufrechterhaltung wichtiger Ökosystemfunktionen liefern. Y1 - 2020 ER - TY - THES A1 - Siemiatkowska, Beata T1 - Redox signalling in plants N2 - Once proteins are synthesized, they can additionally be modified by post-translational modifications (PTMs). Proteins containing reactive cysteine thiols, stabilized in their deprotonated form due to their local environment as thiolates (RS-), serve as redox sensors by undergoing a multitude of oxidative PTMs (Ox-PTMs). Ox-PTMs such as S-nitrosylation or formation of inter- or intra-disulfide bridges induce functional changes in these proteins. Proteins containing cysteines, whose thiol oxidation state regulates their functions, belong to the so-called redoxome. Such Ox-PTMs are controlled by site-specific cellular events that play a crucial role in protein regulation, affecting enzyme catalytic sites, ligand binding affinity, protein-protein interactions or protein stability. Reversible protein thiol oxidation is an essential regulatory mechanism of photosynthesis, metabolism, and gene expression in all photosynthetic organisms. Therefore, studying PTMs will remain crucial for understanding plant adaptation to external stimuli like fluctuating light conditions. Optimizing methods suitable for studying plants Ox-PTMs is of high importance for elucidation of the redoxome in plants. This study focusses on thiol modifications occurring in plant and provides novel insight into in vivo redoxome of Arabidopsis thaliana in response to light vs. dark. This was achieved by utilizing a resin-assisted thiol enrichment approach. Furthermore, confirmation of candidates on the single protein level was carried out by a differential labelling approach. The thiols and disulfides were differentially labelled, and the protein levels were detected using immunoblot analysis. Further analysis was focused on light-reduced proteins. By the enrichment approach many well studied redox-regulated proteins were identified. Amongst those were fructose 1,6-bisphosphatase (FBPase) and sedoheptulose-1,7-bisphosphatase (SBPase) which have previously been described as thioredoxin system targeted enzymes. The redox regulated proteins identified in the current study were compared to several published, independent results showing redox regulated proteins in Arabidopsis leaves, root, mitochondria and specifically S-nitrosylated proteins. These proteins were excluded as potential new candidates but remain as a proof-of-concept to the enrichment experiments to be effective. Additionally, CSP41A and CSP41B proteins, which emerged from this study as potential targets of redox-regulation, were analyzed by Ribo-Seq. The active translatome study of csp41a mutant vs. wild-type showed most of the significant changes at end of the night, similarly as csp41b. Yet, in both mutants only several chloroplast-encoded genes were altered. Further studies of CSP41A and CSP41B proteins are needed to reveal their functions and elucidate the role of redox regulation of these proteins. N2 - Wenn Proteine synthetisiert sind, können sie zusätzlich noch post-translationelle Modifikationen (PTM) aufweisen. Proteine, die wegen ihres lokalen Umfeldes reaktive Cysteinthiole in ihrer stabilen deprotonierten Thiolat-Form aufweisen, dienen als Redoxsensoren indem sie eine Vielzahl von oxidativen PTMs (Ox-PTMs) enthalten können. Ox-PTMs wie die S-Nitrosylierung oder die Bildung von Inter- oder Intradisulfidbrücken induzieren funktionelle Veränderungen in diesen Proteinen. Cystein-haltige Proteine, deren Funktion durch diese Thioloxidierung gesteuert werden, gehören zu dem so genannten Redoxom. Die Ox-PTMs werden durch ortsspezifische zelluläre Prozesse gesteuert, die eine essentielle Rolle bei der Proteinregulation spielen und welche das katalytische Zentrum, die Ligandenbindungsaffinität, Protein-Protein-Interaktionen oder die Proteinstabilität beeinflussen können. Die umkehrbare Proteinthioloxidierung ist ein essentieller regulatorischer Mechanismus in der Photosynthese, dem Metabolismus und der Genexpression photosynthetischer Organismen. Es ist demnach wichtig PTMs zu untersuchen, um zu verstehen wie sich Pflanzen an externe Stimuli wie das Licht anpassen können. Es ist von großer Bedeutung für das Redoxom-Forschungsgebiet Methoden zur Untersuchung von pflanzlichen Ox-PTMs zu verbessern. Die vorliegende Arbeit konzentriert sich auf Thiolveränderungen, die in Pflanzen auftreten, und gibt einen Einblick in das in vivo Redoxom von Arabidopsis thaliana als Reaktion auf Licht oder Dunkelheit. Dieses wurde ermöglicht durch eine auf Harz-basierende Thiol-Anreicherung. Darüber hinaus konnten Kandidaten auf dem Einzelproteinlevel durch eine Differentialmarkierungsmethode bestätigt werden. Thiole und Disulfide wurden unterschiedlich markiert und die Proteine durch spezifische Antikörper mittels Proteinblotanalyse erkannt. Weitere Analysen fokussierten sich auf im Licht reduzierte Proteine. Durch die Anreicherungsmethode konnten viele bereits untersuchte redox-regulierte Proteine identifiziert werden. Unter diesen waren unter anderem die Fruktose-1,6-Bisphosphatase (FBPase) sowie die Seduheptulose-1,7-Bisphosphatase (SBPase), welche als Thioredoxin-gesteuerte Enzyme beschrieben sind. Die redox-regulierten Proteine, die in dieser Studie identifiziert werden konnten, wurden mit veröffentlichten unabhängigen Ergebnissen verglichen und dieses führte zu einer Vielzahl an redox-regulierten Proteinen in Arabidopsisblättern, -Wurzeln und -Mitochondrien sowie S-nitrosylierten Proteinen. Diese Proteine wurden zwar als neue potentielle Kandidaten ausgeschlossen, zeigten allerdings die Effektivität der Anreicherungsmethode. Darüber hinaus wurden die Proteine CSP41 A and CSP41 B, welche in dieser Studie als potentielle Ziele der Redox-Regulation identifiziert wurden, durch Ribo-seq analysiert. T2 - Redoxsignalisierung in Pflanzen KW - redox KW - signalling KW - plants KW - enrichments methods KW - post-translational modifications KW - oxidative protein modifications KW - Redox KW - Signalübertragung KW - Pflanzen KW - Anreicherungsmethoden KW - posttranslationale Modifikationen KW - oxidative Proteinmodifikationen Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-489119 ER - TY - THES A1 - Tunn, Isabell T1 - From single molecules to bulk materials: tuning the viscoelastic properties of coiled coil cross-linked hydrogels N2 - The development of bioinspired self-assembling materials, such as hydrogels, with promising applications in cell culture, tissue engineering and drug delivery is a current focus in material science. Biogenic or bioinspired proteins and peptides are frequently used as versatile building blocks for extracellular matrix (ECM) mimicking hydrogels. However, precisely controlling and reversibly tuning the properties of these building blocks and the resulting hydrogels remains challenging. Precise control over the viscoelastic properties and self-healing abilities of hydrogels are key factors for developing intelligent materials to investigate cell matrix interactions. Thus, there is a need to develop building blocks that are self-healing, tunable and self-reporting. This thesis aims at the development of α-helical peptide building blocks, called coiled coils (CCs), which integrate these desired properties. Self-healing is a direct result of the fast self-assembly of these building blocks when used as material cross-links. Tunability is realized by means of reversible histidine (His)-metal coordination bonds. Lastly, implementing a fluorescent readout, which indicates the CC assembly state, self-reporting hydrogels are obtained. Coiled coils are abundant protein folding motifs in Nature, which often have mechanical function, such as in myosin or fibrin. Coiled coils are superhelices made up of two or more α-helices wound around each other. The assembly of CCs is based on their repetitive sequence of seven amino acids, so-called heptads (abcdefg). Hydrophobic amino acids in the a and d position of each heptad form the core of the CC, while charged amino acids in the e and g position form ionic interactions. The solvent-exposed positions b, c and f are excellent targets for modifications since they are more variable. His-metal coordination bonds are strong, yet reversible interactions formed between the amino acid histidine and transition metal ions (e.g. Ni2+, Cu2+ or Zn2+). His-metal coordination bonds essentially contribute to the mechanical stability of various high-performance proteinaceous materials, such as spider fangs, Nereis worm jaws and mussel byssal threads. Therefore, I bioengineered reversible His-metal coordination sites into a well-characterized heterodimeric CC that served as tunable material cross-link. Specifically, I took two distinct approaches facilitating either intramolecular (Chapter 4.2) and/or intermolecular (Chapter 4.3) His-metal coordination. Previous research suggested that force-induced CC unfolding in shear geometry starts from the points of force application. In order to tune the stability of a heterodimeric CC in shear geometry, I inserted His in the b and f position at the termini of force application (Chapter 4.2). The spacing of His is such that intra-CC His-metal coordination bonds can form to bridge one helical turn within the same helix, but also inter-CC coordination bonds are not generally excluded. Starting with Ni2+ ions, Raman spectroscopy showed that the CC maintained its helical structure and the His residues were able to coordinate Ni2+. Circular dichroism (CD) spectroscopy revealed that the melting temperature of the CC increased by 4 °C in the presence of Ni2+. Using atomic force microscope (AFM)-based single molecule force spectroscopy, the energy landscape parameters of the CC were characterized in the absence and the presence of Ni2+. His-Ni2+ coordination increased the rupture force by ~10 pN, accompanied by a decrease of the dissociation rate constant. To test if this stabilizing effect can be transferred from the single molecule level to the bulk viscoelastic material properties, the CC building block was used as a non-covalent cross-link for star-shaped poly(ethylene glycol) (star-PEG) hydrogels. Shear rheology revealed a 3-fold higher relaxation time in His-Ni2+ coordinating hydrogels compared to the hydrogel without metal ions. This stabilizing effect was fully reversible when using an excess of the metal chelator ethylenediaminetetraacetate (EDTA). The hydrogel properties were further investigated using different metal ions, i.e. Cu2+, Co2+ and Zn2+. Overall, these results suggest that Ni2+, Cu2+ and Co2+ primarily form intra-CC coordination bonds while Zn2+ also participates in inter-CC coordination bonds. This may be a direct result of its different coordination geometry. Intermolecular His-metal coordination bonds in the terminal regions of the protein building blocks of mussel byssal threads are primarily formed by Zn2+ and were found to be intimately linked to higher-order assembly and self-healing of the thread. In the above example, the contribution of intra-CC and inter-CC His-Zn2+ cannot be disentangled. In Chapter 4.3, I redesigned the CC to prohibit the formation of intra-CC His-Zn2+ coordination bonds, focusing only on inter-CC interactions. Specifically, I inserted His in the solvent-exposed f positions of the CC to focus on the effect of metal-induced higher-order assembly of CC cross-links. Raman and CD spectroscopy revealed that this CC building block forms α-helical Zn2+ cross-linked aggregates. Using this CC as a cross-link for star-PEG hydrogels, I showed that the material properties can be switched from viscoelastic in the absence of Zn2+ to elastic-like in the presence of Zn2+. Moreover, the relaxation time of the hydrogel was tunable over three orders of magnitude when using different Zn2+:His ratios. This tunability is attributed to a progressive transformation of single CC cross-links into His-Zn2+ cross-linked aggregates, with inter-CC His-Zn2+ coordination bonds serving as an additional, cross-linking mode. Rheological characterization of the hydrogels with inter-CC His-Zn2+ coordination raised the question whether the His-Zn2+ coordination bonds between CCs or also the CCs themselves rupture when shear strain is applied. In general, the amount of CC cross-links initially formed in the hydrogel as well as the amount of CC cross-links breaking under force remains to be elucidated. In order to more deeply probe these questions and monitor the state of the CC cross-links when force is applied, a fluorescent reporter system based on Förster resonance energy transfer (FRET) was introduced into the CC (Chapter 4.4). For this purpose, the donor-acceptor pair carboxyfluorescein and tetramethylrhodamine was used. The resulting self-reporting CC showed a FRET efficiency of 77 % in solution. Using this fluorescently labeled CC as a self-reporting, reversible cross-link in an otherwise covalently cross-linked star-PEG hydrogel enabled the detection of the FRET efficiency change under compression force. This proof-of-principle result sets the stage for implementing the fluorescently labeled CCs as molecular force sensors in non-covalently cross-linked hydrogels. In summary, this thesis highlights that rationally designed CCs are excellent reversibly tunable, self-healing and self-reporting hydrogel cross-links with high application potential in bioengineering and biomedicine. For the first time, I demonstrated that His-metal coordination-based stabilization can be transferred from the single CC level to the bulk material with clear viscoelastic consequences. Insertion of His in specific sequence positions was used to implement a second non-covalent cross-linking mode via intermolecular His-metal coordination. This His-metal binding induced aggregation of the CCs enabled for reversibly tuning the hydrogel properties from viscoelastic to elastic-like. As a proof-of-principle to establish self-reporting CCs as material cross-links, I labeled a CC with a FRET pair. The fluorescently labelled CC acts as a molecular force sensor and first preliminary results suggest that the CC enables the detection of hydrogel cross-link failure under compression force. In the future, fluorescently labeled CC force sensors will likely not only be used as intelligent cross-links to study the failure of hydrogels but also to investigate cell-matrix interactions in 3D down to the single molecule level. N2 - Die Entwicklung von biomimetischen Materialien, wie Hydrogelen, zur Anwendung in der Zellkultur und der regenerativen Medizin bildet einen aktuellen Schwerpunkt der Materialwissenschaften. Häufig werden natürlich vorkommende oder neu entwickelte Proteine als biomimetische Bausteine für Hydrogele genutzt, welche die extrazelluläre Umgebung von Zellen nachahmen. Gegenwärtig bleibt es jedoch eine Herausforderung, die Eigenschaften dieser Bausteine und der daraus entwickelten Materialien genau zu kontrollieren und gezielt maßzuschneidern. Jedoch stellen präzise kontrollierbare Materialeigenschaften einen Schlüsselfaktor für die Herstellung von intelligenten Materialen für die Zellkultur dar. Das Ziel dieser Arbeit ist die Entwicklung von α-helikalen Protein-Bausteinen, so genannter Coiled Coils (CCs), mit maßgeschneiderten, reversibel veränderbaren Eigenschaften. Dazu wurden reversible Histidin (His)-Metall-Koordinationsbindungen in ein CC Heterodimer eingefügt. Des Weiteren wurden Fluoreszenz-markierte CCs entwickelt, um das Verhalten der CC-Bausteine in Hydrogelen unter Krafteinwirkung zu untersuchen. In der Natur kommen CCs oft als Faltungsmotive in Proteinen vor, die eine mechanische Funktion haben, z.B. Myosin oder Fibrin. CCs bestehen aus zwei bis sieben α-Helices, die eine Superhelix bilden. Die Aminosäuresequenz von CCs ist hoch repetitiv und besteht aus sieben sich wiederholenden Aminosäurepositionen (abcdefg). In den Positionen a und d befinden sich aliphatische Aminosäuren, die den hydrophoben Kern des CCs bilden. Die Positionen e und g werden durch geladene Aminosäuren besetzt, die ionische Bindungen eingehen. In den Lösungsmittel-exponierten Positionen, können diverse Aminosäure platziert werden. Daher sind diese Positionen für Modifikationen gut geeignet. His-Metall-Koordinationsbindungen sind stabile Bindungen der Aminosäure His mit Übergangsmetallionen, wie Ni2+, Cu2+ oder Zn2+. His-Metall-Koordinationsbindungen tragen entscheidend zur mechanischen Stabilität von verschiedenen Protein-basierten Biomaterialien bei, z.B. in den Fangzähnen von Spinnen oder in Byssusfäden von Miesmuscheln. Daher wurden His-Metall-Koordinationsstellen in dieser Arbeit verwendet, um ein gut charakterisiertes CC Heterodimer zu stabilisieren. Zwei verschiedene Ansätze wurden zur Stabilisierung des CCs, und den daraus synthetisierten Materialien, genutzt. Zum einen wurden die His-Metall-Koordinationsbindungen so im CC platziert, dass primär Koordination innerhalb einer Helix stattfindet (intra-CC) (Kapitel 4.2). Zum anderen wurde His in Positionen eingefügt, die nur Metall-Koordinationsbindungen zwischen den CCs erlauben (inter-CC) (Kapitel 4.3). Bisherige Forschungsergebnisse zur mechanischen Entfaltung von CCs in der Schergeometrie lassen vermuten, dass die Entfaltung am Angriffspunkt der Kraft beginnt. Um die Stabilität einzelner CC Heterodimere in der Schergeometrie zu erhöhen, habe ich His-Metall Koordinationsbindungen in den Positionen b und f an den Enden der CC-Peptide einfügt (intra-CC), an denen die Scherkraft angreift (Kapitel 4.2). Mittels Raman Spektroskopie konnte ich zeigen, dass das His-modifizierte CC α-helikal bleibt und Ni2+ koordiniert. Zirkulardichroismus Spektroskopie wurde genutzt, um die thermodynamische Stabilität mit und ohne Ni2+ zu ermitteln. Unter Zugabe von Ni2+ erhöhte sich die Schmelztemperatur des CCs um 4 °C. Um die Energielandschaft der Entfaltung zu untersuchen, wurde Einzelmolekülkraftspektroskopie mit dem Rasterkraftmikroskop durchgeführt. His-Ni2+-Koordination führte zu einer Erhöhung der Abrisskraft um 10 pN und einer 10-fach verringerten Dissoziationskonstante. Die Koordination von Ni2+ führt demnach zu einer Stabilisierung des CCs. Um zu testen, ob der stabilisierende Effekt vom Einzelmolekül auf die viskoelastischen Eigenschaften von Hydrogelen übertragbar ist, wurde das CC als Vernetzungs-Baustein für sternförmiges Polyethylenglykol genutzt. Scherrheologie zeigte, dass die Relaxationszeit der CC-Hydrogele bei Zugabe von Ni2+ um das 3-fache erhöht ist. Dieser stabilisierende Effekt war vollkommen reversibel, wenn Metallchelatoren, wie Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) zugegeben wurden. Des Weiteren konnte ich zeigen, dass Cu2+ und Co2+ intra-CC Koordinationsbindungen eingehen und einen ähnlichen Effekt auf die Relaxationszeit haben wie Ni2+, wohingegen Zn2+ auch zwischen verschiedenen CCs (inter-CC) koordiniert wurde. Intermolekulare His-Zn2+-Koordination an den Enden der Protein-Bausteine von Byssusfäden ist essentiell für deren hierarchische Struktur und Selbstheilung nach mechanischer Belastung. Im oben beschriebenen CC kann der Effekt der intra- und inter-CC His-Zn2+-Koordination nicht klar voneinander getrennt werden. In Kapitel 4.3 wurden die His daher mit größerem Abstand in das CC eingefügt, so dass nur inter-CC Zn2+-Koordination möglich war. Raman und Zirkulardichroismus Spektroskopie zeigten, dass dieses CC unter Zugabe von Zn2+ aggregiert. Während sich die CC-Hydrogele ohne Zn2+ viskoelastisch verhielten, führte die Zugabe von Zn2+ zu annähernd elastischem Verhalten. Unter Verwendung von verschiedenen His:Zn2+ Verhältnissen, konnte die Relaxationszeit in einem großen Bereich gezielt verändert werden. Diese maßgeschneiderten Materialeigenschaften sind auf die schrittweise Umwandlung von einzelnen CC-Vernetzungen zu CC-Aggregaten mit inter-CC His-Zn2+-Koordination zurückzuführen. Die Rheologiemessungen mit den His-Zn2+-vernetzten CC-Aggregaten werfen die Frage auf, ob die inter-CC His-Zn2+-Koordinationsbindungen oder die CCs selbst brechen, wenn eine Kraft wirkt. Im Allgemeinen sind die Mechanismen der Dissoziation von Vernetzern im Hydrogel unter Krafteinwirkung größtenteils unerforscht. Um diese zu beleuchten, wurde das CC mit einem Fluoreszenz-Reportersystem ausgestattet (Kapitel 4.4). Genauer gesagt, wurde ein Förster Resonanzenergietransfer (FRET) Paar (Carboxyfluorescein-Tetramethylrhodamin) an das CC gekoppelt. Die Effizienz des Energietransfers gibt in diesem System Aufschluss darüber, ob das CC assoziiert oder dissoziiert ist. Das FRET-markierte CC wurde als nicht-kovalenter, reversibler molekularer Kraftsensor in einem ansonsten kovalent vernetzten Hydrogel eingesetzt. Unter Kompression verringerte sich die FRET-Effizienz, was einen ersten Hinweise auf die Dissoziation des CCs darstellt. Dieses Ergebnis verdeutlicht, dass CCs hervorragende molekulare Kraftsensoren für biomimetische Materialien darstellen. Diese Arbeit demonstriert, dass CCs mit maßgeschneiderten, reversibel manipulierbaren Eigenschaften exzellente Bausteine für Hydrogele sind, die in der Zellkultur und der regenerativen Medizin Verwendung finden können. Es konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass einzelne CCs durch His-Metall-Koordinationsbindungen reversibel stabilisiert werden können und dass diese molekulare Stabilisierung direkt auf die viskoelastischen Materialeigenschaften von Hydrogelen übertragbar ist. Durch gezieltes Einfügen von intermolekularen His-Metall-Koordinationsbindungen gelang es, CC-Hydrogele mit einem zweiten übergeordneten His-Zn2+ basierten Vernetzungsmodus herzustellen. So konnte die Relaxationszeit der Hydrogele über einen weiten Bereich maßgeschneidert kontrolliert werden. Um CCs als molekulare Kraftsensoren in Materialien zu etablieren, wurde das CC Heterodimer mit einem FRET-Reportersystem ausgestattet. Erste Experimente deuten darauf hin, dass die Dissoziation des CCs im Hydrogel unter Krafteinwirkung optisch verfolgt werden kann. Zukünftig können CCs mit maßgeschneiderter Stabilität nicht nur als molekulare Kraftsensoren für Materialien, sondern auch zur Erforschung von Zell-Matrix Wechselwirkungen eingesetzt werden. T2 - Von Molekülen zu Materialien: Coiled Coil-vernetzte Hydrogele mit maßgeschneiderten viskoelastischen Eigenschaften KW - biochemistry KW - coiled coil KW - histidine-metal coordination KW - Förster resonance energy transfer (FRET) KW - rheology KW - single-molecule force spectroscopy KW - Biochemie KW - Coiled Coil KW - Hydrogel KW - Histidin-Metall Koordination KW - Förster Resonanz Energie Transfer (FRET) KW - Rheologie KW - Einzelmolekülkraftspektroskopie Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-475955 ER - TY - THES A1 - Wen, Xi T1 - Distribution patterns and environmental drivers of methane-cycling microorganisms in natural environments and restored wetlands N2 - Methane is an important greenhouse gas contributing to global climate change. Natural environments and restored wetlands contribute a large proportion to the global methane budget. Methanogenic archaea (methanogens) and methane oxidizing bacteria (methanotrophs), the biogenic producers and consumers of methane, play key roles in the methane cycle in those environments. A large number of studies revealed the distribution, diversity and composition of these microorganisms in individual habitats. However, uncertainties exist in predicting the response and feedback of methane-cycling microorganisms to future climate changes and related environmental changes due to the limited spatial scales considered so far, and due to a poor recognition of the biogeography of these important microorganisms combining global and local scales. With the aim of improving our understanding about whether and how methane-cycling microbial communities will be affected by a series of dynamic environmental factors in response to climate change, this PhD thesis investigates the biogeographic patterns of methane-cycling communities, and the driving factors which define these patterns at different spatial scales. At the global scale, a meta-analysis was performed by implementing 94 globally distributed public datasets together with environmental data from various natural environments including soils, lake sediments, estuaries, marine sediments, hydrothermal sediments and mud volcanos. In combination with a global biogeographic map of methanogenic archaea from multiple natural environments, this thesis revealed that biogeographic patterns of methanogens exist. The terrestrial habitats showed higher alpha diversities than marine environments. Methanoculleus and Methanosaeta (Methanothrix) are the most frequently detected taxa in marine habitats, while Methanoregula prevails in terrestrial habitats. Estuary ecosystems, the transition zones between marine and terrestrial/limnic ecosystems, have the highest methanogenic richness but comparably low methane emission rates. At the local scale, this study compared two rewetted fens with known high methane emissions in northeastern Germany, a coastal brackish fen (Hütelmoor) and a freshwater riparian fen (Polder Zarnekow). Consistent with different geochemical conditions and land-use history, the two rewetted fens exhibit dissimilar methanogenic and, especially, methanotrophic community compositions. The methanotrophic community was generally under-represented among the prokaryotic communities and both fens show similarly low ratios of methanotrophic to methanogenic abundances. Since few studies have characterized methane-cycling microorganisms in rewetted fens, this study provides first evidence that the rapid and well re-established methanogenic community in combination with the low and incomplete re-establishment of the methanotrophic community after rewetting contributes to elevated sustained methane fluxes following rewetting. Finally, this thesis demonstrates that dispersal limitation only slightly regulates the biogeographic distribution patterns of methanogenic microorganisms in natural environments and restored wetlands. Instead, their existence, adaption and establishment are more associated with the selective pressures under different environmental conditions. Salinity, pH and temperature are identified as the most important factors in shaping microbial community structure at different spatial scales (global versus terrestrial environments). Predicted changes in climate, such as increasing temperature, changes in precipitation patterns and increasing frequency of flooding events, are likely to induce a series of environmental alterations, which will either directly or indirectly affect the driving environmental forces of methanogenic communities, leading to changes in their community composition and thus potentially also in methane emission patterns in the future. N2 - Methan ist ein wichtiges Treibhausgas, das zum globalen Klimawandel beiträgt. Bedeutend für das globale Methanbudget sind unter anderem natürliche und wiedervernäßte Moore. Methanogene Archaeen (Methanogene) und Methan-oxidierende Bakterien (Methanotrophe) sind die biogenen Produzenten und Konsumenten von Methan. Daher nehmen sie global, und speziell in Mooren, eine Schlüsselrolle für das Methanbudget ein. Eine Vielzahl von Studien hat die Verteilung, Vielfalt und Zusammensetzung dieser Mikroorganismen in einzelnen Lebensräumen untersucht. Es bestehen jedoch Unsicherheiten in der Vorhersage, wie sie auf den globalen Wandel und auf die damit verbundenen Umweltveränderungen reagieren werden. Diese Unsicherheiten basieren unter anderem auf bislang fehlenden biogeographischen Untersuchungen, die globale und lokale Skalen kombinieren, und auf einem unzureichenden Verständnis dazu, ob und welche Umweltfaktoren speziell methanogene Gemeinschaften beeinflussen. Zudem gibt es trotz der Bedeutung von Projekten zur Moorwiedervernässung für das regionale und globale Treibhausgasbudget nahezu keine Untersuchungen zur Zusammensetzung und Verbreitung von methanogenen und methanotrophen Gemeinschaften in degradierten wiedervernäßten, eutrophen Niedermooren. Das Ziel dieser Doktorarbeit ist es, unser Verständnis zur Reaktion der am Methanbudget beteiligten mikrobiellen Gemeinschaften auf den globalen Wandel und auf die damit einhergehenden Umweltänderungen zu verbessern. Die Arbeit untersucht daher zum einen die biogeographischen Muster methanogener Gemeinschaften und die ihnen zugrunde liegenden Umweltfaktoren auf verschiedenen räumlichen Skalen. Auf globaler Ebene wurde eine Meta-Analyse durchgeführt, die auf 94 global verteilten, öffentlichen Sequenzdatensätzen sowie den dazugehörigen Umweltdaten aus verschiedenen natürlichen Ökosystemen basiert. Hierzu gehören Böden, Seesedimente, Ästuare, marine Sedimente, hydrothermale Sedimente und Schlammvulkane. In Kombination mit einer globalen biogeographischen Karte zur Verbreitung methanogener Archaeen konnte diese Arbeit zeigen, dass biogeographische Muster von Methanogenen existieren. Terrestrische Ökosysteme zeigen zudem eine höhere Diversität als marine Ökosysteme. Ästuare, Übergangszonen zwischen marinen und terrestrischen/ limnischen Ökosystemen, weisen die größte methanogene Diversität bei jedoch vergleichsweise geringen Methanemissionen auf. Methanoculleus und Methanosaeta (Methanothrix) sind die am häufigsten nachgewiesenen Taxa in marinen Lebensräumen, während Methanoregula in terrestrischen Ökosystemen dominiert. Auf lokaler Ebene wurden in dieser Arbeit zwei wiedervernässte, eutrophe Niedermoore im Nordosten Deutschlands verglichen, das von der Ostsee beeinflusste „Hütelmoor“ und das Durchströmungsmoor „Polder Zarnekow“. Beide Moore sind durch hohe Methanemissionen infolge der Wiedervernässung charakterisiert. Einhergehend mit unterschiedlichen geochemischen Bedingungen und unterschiedlicher Nutzungshistorie weisen diese beiden wiedervernässten Standorte in ihrer Zusammensetzung unterschiedliche methanogene und methanotrophe Gemeinschaften auf lokaler Ebene auf. Zudem ist die Gruppe der Methanotrophen innerhalb der prokaryotischen Gemeinschaften jeweils unterrepräsentiert und beide Moore zeigen ein vergleichbar niedriges Verhältnis von Methanotrophen im Vergleich zu Methanogenen. Diese Arbeit liefert erste Hinweise darauf, dass die schnelle und erfolgreiche Wiederbesiedlung durch Methanogene in Kombination mit einer offenbar schlecht etablierten methanotrophen Gemeinschaft zu den erhöhten Methanflüssen in beiden Mooren nach Wiedervernässung beiträgt. Abschließend zeigt diese Arbeit, dass eine eingeschränkte Migration („dispersal limitation“) die biogeographischen Verteilungsmuster von Methanogenen in natürlichen Ökosystemen kaum beeinflusst. Stattdessen werden Vorkommen und Anpassung von methanogenen Gemeinschaften vor allem durch den selektiven Druck verschiedener Umweltbedingungen reguliert. Die Umweltparameter Salzgehalt, pH-Wert und Temperatur wurden dabei als wichtigste Faktoren identifiziert, die die Verbreitung methanogener Gemeinschaften global bzw. speziell in terrestrischen Standorten beeinflussen. Es ist daher wahrscheinlich, dass prognostizierte Klimaveränderungen wie steigende Temperatur, Änderungen der Niederschlagsmuster und zunehmende Häufigkeit von Überschwemmungsereignissen zu Änderungen in der Zusammensetzung methanogener Gemeinschaften führen, die möglicherweise auch die Methanemissionsmuster beeinflussen werden. T2 - Verteilungsmuster Methan produzierender und Methan oxidierender Mikroorganismen und deren Abhängigkeit von Umweltfaktoren in natürlichen Ökosystemen und wiedervernäßten Mooren KW - biogeography KW - Biogeographie KW - methanogens KW - methanotrophs KW - Methanogene KW - Methanotrophe KW - distribution pattern KW - Verteilungsmuster KW - methane KW - Methane Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-471770 ER - TY - THES A1 - Wenk, Sebastian T1 - Engineering formatotrophic growth in Escherichia coli N2 - To meet the demands of a growing world population while reducing carbon dioxide (CO2) emissions, it is necessary to capture CO2 and convert it into value-added compounds. In recent years, metabolic engineering of microbes has gained strong momentum as a strategy for the production of valuable chemicals. As common microbial feedstocks like glucose directly compete with human consumption, the one carbon (C1) compound formate was suggested as an alternative feedstock. Formate can be easily produced by various means including electrochemical reduction of CO2 and could serve as a feedstock for microbial production, hence presenting a novel entry point for CO2 to the biosphere and a storage option for excess electricity. Compared to the gaseous molecule CO2, formate is a highly soluble compound that can be easily handled and stored. It can serve as a carbon and energy source for natural formatotrophs, but these microbes are difficult to cultivate and engineer. In this work, I present the results of several projects that aim to establish efficient formatotrophic growth of E. coli – which cannot naturally grow on formate – via synthetic formate assimilation pathways. In the first study, I establish a workflow for growth-coupled metabolic engineering of E. coli. I demonstrate this approach by presenting an engineering scheme for the PFL-threonine cycle, a synthetic pathway for anaerobic formate assimilation in E. coli. The described methods are intended to create a standardized toolbox for engineers that aim to establish novel metabolic routes in E. coli and related organisms. The second chapter presents a study on the catalytic efficiency of C1-oxidizing enzymes in vivo. As formatotrophic growth requires generation of both energy and biomass from formate, the engineered E. coli strains need to be equipped with a highly efficient formate dehydrogenase, which provides reduction equivalents and ATP for formate assimilation. I engineered a strain that cannot generate reducing power and energy for cellular growth, when fed on acetate. Under this condition, the strain depends on the introduction of an enzymatic system for NADH regeneration, which could further produce ATP via oxidative phosphorylation. I show that the strain presents a valuable testing platform for C1-oxidizing enzymes by testing different NAD-dependent formate and methanol dehydrogenases in the energy auxotroph strain. Using this platform, several candidate enzymes with high in vivo activity, were identified and characterized as potential energy-generating systems for synthetic formatotrophic or methylotrophic growth in E. coli.   In the third chapter, I present the establishment of the serine threonine cycle (STC) – a synthetic formate assimilation pathway – in E. coli. In this pathway, formate is assimilated via formate tetrahydrofolate ligase (FtfL) from Methylobacterium extorquens (M. extorquens). The carbon from formate is attached to glycine to produce serine, which is converted into pyruvate entering central metabolism. Via the natural threonine synthesis and cleavage route, glycine is regenerated and acetyl-CoA is produced as the pathway product. I engineered several selection strains that depend on different STC modules for growth and determined key enzymes that enable high flux through threonine synthesis and cleavage. I could show that expression of an auxiliary formate dehydrogenase was required to achieve growth via threonine synthesis and cleavage on pyruvate. By overexpressing most of the pathway enzymes from the genome, and applying adaptive laboratory evolution, growth on glycine and formate was achieved, indicating the activity of the complete cycle. The fourth chapter shows the establishment of the reductive glycine pathway (rGP) – a short, linear formate assimilation route – in E. coli. As in the STC, formate is assimilated via M. extorquens FtfL. The C1 from formate is condensed with CO2 via the reverse reaction of the glycine cleavage system to produce glycine. Another carbon from formate is attached to glycine to form serine, which is assimilated into central metabolism via pyruvate. The engineered E. coli strain, expressing most of the pathway genes from the genome, can grow via the rGP with formate or methanol as a sole carbon and energy source. N2 - Um den steigenden Bedarf einer wachsenden Weltbevölkerung zu decken und gleichzeitig die CO2-Emissionen zu reduzieren, ist es notwendig, CO2 aufzufangen und zu recyceln. Durch gentechnische Veränderungen von Mikroorganismen ist es möglich diese zur Produktion wertvoller organischer Verbindungen zu nutzen. Da mikrobielle Kulturen primär mit Glucose gefüttert werden und somit mit menschlicher Nahrungsversorgung konkurrieren, wurde die C1-Verbindung Formiat als alternativer bakterieller Nährstoff vorgeschlagen.. Formiat kann durch unterschiedliche Verfahren hergestellt werden, unter anderem durch elektrochemische Reduktion von CO2. Dieses Verfahren ermöglicht das Recycling von CO2 und weiterhin eine Speichermöglichkeit für überschüssige Elektrizität. Formiat ist im Vergleich zum gasförmigen CO2 gut wasserlöslich, was den Transport und die Verwendung als mikrobiellen Nährstoff erleichtert. Natürlich vorkommende formatotrophe Mikroorganismen nutzen Formiat als Kohlenstoff- und Energiequelle. Diese lassen sich allerdings meist schwierig kultivieren und genetisch verändern. In dieser Arbeit stelle ich die Ergebnisse verschiedener Projekte vor, die gemeinsam darauf abzielen, effizientes formatotrophes Wachstum von E. coli – welches natürlicherweise nicht auf Formiat wachsen kann – mittels synthetischer Formiat-Assimilierungswege zu ermöglichen. In der ersten Studie stelle ich eine Strategie für wachstumsgekoppeltes Stoffwechsel-Engineering in E. coli vor. Ich erläutere diese Strategie anhand eines Beispiels, der schrittweisen Etablierung eines synthetischen Formiat- Assimilierungswegs, des PFL-Threonin-Zyklus. Die in diesem Kapitel beschriebenen Methoden sollen einen Leitfaden für Ingenieure bereitstellen, die neue Stoffwechselwege in E. coli und verwandten Organismen etablieren wollen. Im zweiten Kapitel stelle ich eine Studie über die katalytische Effizienz von C1-oxidierenden Enzymen vor. Da formatotrophes Wachstum sowohl die Erzeugung von Energie als auch von Biomasse aus Formiat erfordert, müssen synthetisch formatotrophe E. coli Stämme mit einer hocheffizienten Formiat-Dehydrogenase ausgestattet werden, welche Reduktionsäquivalente und ATP für die Assimilierung von Formiat liefert. Um die Effizienz verschiedener Enzyme testen und vergleichen zu können, entwickelte ich einen E. coli Stamm, der aus Acetat weder Reduktionsäquivalente noch Energie für das Zellwachstum erzeugen kann. Dieser „energie-auxotrophe“ Stamm benötigt eines zusätzlichen enzymatischen Systems zur NADH-Regenerierung, um auf Acetat wachsen zu können. Ich testete verschiedene NAD-abhängige Formiat- und Methanol-Dehydrogenasen in diesem Stamm und konnte zeigen, dass Wachstum auf Acetat durch Zugabe von Formiat oder Methanol ermöglicht wurde. Dies zeigt, dass der Stamm eine zuverlässige Testplattform für C1-oxidierende Enzyme darstellt. Unter Verwendung dieser Plattform wurden mehrere Kandidatenenzyme mit hoher in vivo-Aktivität identifiziert und als Kandidatenenzyme für synthetisches formatotrophes oder methylotrophes Wachstum in E. coli charakterisiert.   Im dritten Kapitel stelle ich die Etablierung des Serin-Threonin-Zyklus (STZ) – eines synthetischen Formiat-Assimilationswegs – in E. coli vor. In diesem Stoffwechselweg wird Formiat über die Formiat-Tetrahydrofolat-Ligase (FtfL) aus Methylobacterium extorquens (M. extorquens) assimiliert. Der Kohlenstoff aus Formiat wird an Glycin gebunden, um Serin zu produzieren, welches im nächsten Schritt in Pyruvat umgewandelt wird und so in den zentralen Kohlenstoffmetabolismus gelangt. Über den natürlichen Threonin-Synthese- und Spaltweg wird Glycin regeneriert und Acetyl-CoA als Produkt des Stoffwechselwegs generiert. Ich entwickelte mehrere E. coli Selektionsstämme, deren Wachstum von verschiedenen STZ-Modulen abhängt, und konnte Schlüsselenzyme bestimmen, die einen hohen Reaktionsfluss durch die Threonin-Synthese und -Spaltung ermöglichen. Ich konnte zeigen, dass die Expression einer Formiat-Dehydrogenase erforderlich ist, um Wachstum auf Pyruvat über Threonin zu erreichen. Durch Integration und Überexpression der meisten Enzyme des STZ auf Genomebene und Anwendung adaptiver Laborevolution wurde Wachstum auf Glycin und Formiat erreicht, was bedeutet, dass der gesamte Serin-Threonin-Zyklus in E. coli aktiv ist. Das vierte Kapitel zeigt die Etablierung des reduktiven Glycinwegs (rGW) – eines kurzen, linearen Formiat-Assimilierungswegs – in E. coli. Wie im STZ wird Formiat über M. extorquens FtfL assimiliert. Dabei wird das Kohlenstoffatom aus Formiat mit CO2 über die umgekehrte Reaktion des Glycin-Spaltungssystems zu Glycin kondensiert. Ein weiteres Kohlenstoffatom aus Formiat wird an Glycin gebunden, um Serin zu bilden, welches über Pyruvat in den Zentralstoffwechsel gelangt. Durch Expression der rGW Enzyme auf Genomebene und adaptive Laborevolution wurde ein E. coli Stamm erzeugt welcher über den rGW auf Formiat oder Methanol als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle wachsen kann. KW - metabolic engineering KW - E. coli KW - formate assimilation KW - methanol assimilation KW - energy metabolism Y1 - 2020 ER -