TY - THES A1 - AL-Rawi, Shadha T1 - Biochemical studies to determine the role of Early Starvation 1 (ESV1) protein and its homologue Like-Early Starvation 1 (LESV) during starch degradation N2 - Depending on the biochemical and biotechnical approach, the aim of this work was to understand the mechanism of protein-glucan interactions in regulation and control of starch degradation. Although starch degradation starts with the phosphorylation process, the mechanisms by which this process is controlling and adjusting starch degradation are not yet fully understood. Phosphorylation is a major process performed by the two dikinases enzymes α-glucan, water dikinase (GWD) and phosphoglucan water dikinase (PWD). GWD and PWD enzymes phosphorylate the starch granule surface; thereby stimulate starch degradation by hydrolytic enzymes. Despite these important roles for GWD and PWD, so far the biochemical processes by which these enzymes are able to regulate and adjust the rate of phosphate incorporation into starch during the degradation process haven‘t been understood. Recently, some proteins were found associated with the starch granule. Two of these proteins are named Early Starvation Protein 1 (ESV1) and its homologue Like-Early Starvation Protein 1 (LESV). It was supposed that both are involved in the control of starch degradation, but their function has not been clearly known until now. To understand how ESV1 and LESV-glucan interactions are regulated and affect the starch breakdown, it was analyzed the influence of ESV1 and LESV proteins on the phosphorylating enzyme GWD and PWD and hydrolysing enzymes ISA, BAM, and AMY. However, the analysis determined the location of LESV and ESV1 in the chloroplast stroma of Arabidopsis. Mass spectrometry data predicted ESV1and LESV proteins as a product of the At1g42430 and At3g55760 genes with a predicted mass of ~50 kDa and ~66 kDa, respectively. The ChloroP program predicted that ESV1 lacks the chloroplast transit peptide, but it predicted the first 56 amino acids N-terminal region as a chloroplast transit peptide for LESV. Usually, the transit peptide is processed during transport of the proteins into plastids. Given that this processing is critical, two forms of each ESV1 and LESV were generated and purified, a full-length form and a truncated form that lacks the transit peptide, namely, (ESV1and tESV1) and (LESV and tLESV), respectively. Both protein forms were included in the analysis assays, but only slight differences in glucan binding and protein action between ESV1 and tESV1 were observed, while no differences in the glucan binding and effect on the GWD and PWD action were observed between LESV and tLESV. The results revealed that the presence of the N-terminal is not massively altering the action of ESV1 or LESV. Therefore, it was only used the ESV1 and tLESV forms data to explain the function of both proteins. However, the analysis of the results revealed that LESV and ESV1 proteins bind strongly at the starch granule surface. Furthermore, not all of both proteins were released after their incubation with starches after washing the granules with 2% [w/v] SDS indicates to their binding to the deeper layers of the granule surface. Supporting of this finding comes after the binding of both proteins to starches after removing the free glucans chains from the surface by the action of ISA and BAM. Although both proteins are capable of binding to the starch structure, only LESV showed binding to amylose, while in ESV1, binding was not observed. The alteration of glucan structures at the starch granule surface is essential for the incorporation of phosphate into starch granule while the phosphorylation of starch by GWD and PWD increased after removing the free glucan chains by ISA. Furthermore, PWD showed the possibility of starch phosphorylation without prephosphorylation by GWD. Biochemical studies on protein-glucan interactions between LESV or ESV1 with different types of starch showed a potentially important mechanism of regulating and adjusting the phosphorylation process while the binding of LESV and ESV1 leads to altering the glucan structures of starches, hence, render the effect of the action of dikinases enzymes (GWD and PWD) more able to control the rate of starch degradation. Despite the presence of ESV1 which revealed an antagonistic effect on the PWD action as the PWD action was decreased without prephosphorylation by GWD and increased after prephosphorylation by GWD (Chapter 4), PWD showed a significant reduction in its action with or without prephosphorylation by GWD in the presence of ESV1 whether separately or together with LESV (Chapter 5). However, the presence of LESV and ESV1 together revealed the same effect compared to the effect of each one alone on the phosphorylation process, therefore it is difficult to distinguish the specific function between them. However, non-interactions were detected between LESV and ESV1 or between each of them with GWD and PWD or between GWD and PWD indicating the independent work for these proteins. It was also observed that the alteration of the starch structure by LESV and ESV1 plays a role in adjusting starch degradation rates not only by affecting the dikinases but also by affecting some of the hydrolysing enzymes since it was found that the presence of LESV and ESV1leads to the reduction of the action of BAM, but does not abolish it. N2 - Ziel dieser Arbeit war es, den Mechanismus der Protein-Glucan-Wechselwirkungen bei der Regulation und Kontrolle des Stärkeabbaus zu verstehen. Der Stärkeabbau beginnt mit dem Phosphorylierungsprozess, der von den beiden Dikinasen, der a-Glucan, Wasserdikinase (GWD) und der Phosphoglucanwasserdikinase (PWD) durchgeführt wird. Kürzlich wurden einige Proteine gefunden, die mit dem Stärkegranulum assoziiert sind. Zwei dieser Proteine heißen Early Starvation 1 (ESV1) und das Homolog Like-Early Starvation (LESV), Es wurde vorgeschlagen, dass beide an der Kontrolle des Stärkeabbaus beteiligt sind, aber ihre Funktion ist bisher nicht bekannt. Um zu verstehen, wie ESV1- und LESV-Glucan-Wechselwirkungen reguliert werden und den Stärkeabbau beeinflussen, wurde der Einfluss der beiden Proteine auf die Phosphorylierungsenzyme GWD und PWD, sowie die Hydrolasen isoamylase, betaamylase, und alpha-amylase ntersucht. Dabei ergab die Analyse, dass LESV und ESV1 nicht nur stark an der Oberfläche, sondern auch in den tieferen Schichten der Stärkegranula binden. Obwohl beide Proteine in der Lage sind, an die Stärkestruktur zu binden, zeigte nur LESV eine Bindung an Amylose, während für ESV1 keine Bindung beobachtet werden konnte. Die Veränderung der Glucanstrukturen an der Oberfläche der Stärkekörner ist für den Einbau von Phosphat wesentlich, so nahm beispielsweise die Phosphorylierung der Stärke durch GWD und PWD nach Entfernung der freien Glucanketten mittels ISA zu. Darüber hinaus konnte ebenso gezeigt werden, dass PWD auch ohne eine Präphosphorylierung durch GWD die Glucosyleinheiten innerhalb der Stärke phosphorylieren kann. Die Bindung von LESV und ESV1 führt zu einer Veränderung der Glucanstrukturen von Stärken, wodurch die Aktivität der Dikinasen (GWD und PWD) und somit die Geschwindigkeit des Stärkeabbaus wahrscheinlich besser gesteuert werden kann. Es wurden keine Wechselwirkungen zwischen LESV und ESV1 oder zwischen jedem von ihnen mit GWD und PWD oder zwischen GWD und PWD festgestellt, was auf die unabhängige Arbeit von diesen Proteinen hinweist. Es wurde auch beobachtet, dass die Modifikation der Stärkestruktur durch LESV und ESV1 eine Rolle bei der Anpassung der Stärkeabbauraten spielt, nicht nur durch Beeinflussung der Dikinasen, sondern auch durch die Beeinflussung einiger hydrolysierender Enzyme wie BAM. Den so zeigte die Amylase eine eindeutige Reduktion ihrer katalytischen Wirkung in Präsenz von LESV und ESV1. Daraus resumierend kann davon ausgegangen werden, dass die beiden Proteine ESV1 und LESV für die Feinregulation des Stärkeabbaus von höchster Relevanz sind. T2 - Biochemische Studien zur Bestimmung der Rolle des ESV1-Proteins (Early Starvation 1) und seines Homologen Like-Early Starvation 1 (LESV) während des Stärkeabbaus KW - Early starvation protein KW - Like-Early starvation protein KW - Glucan water dikinase KW - Phosphoglucan water dikinase KW - Phosphorylation process KW - Starch metabolism KW - Early Starvation 1 KW - Glucan-Wasser-Dikinase KW - Like-Early Starvation 1 KW - Phosphoglucan-Wasser-Dikinase KW - Phosphorylierungsprozess KW - Stärkestoffwechsel Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-483956 ER - TY - THES A1 - Alirezaeizanjani, Zahra T1 - Movement strategies of a multi-mode bacterial swimmer N2 - Bacteria are one of the most widespread kinds of microorganisms that play essential roles in many biological and ecological processes. Bacteria live either as independent individuals or in organized communities. At the level of single cells, interactions between bacteria, their neighbors, and the surrounding physical and chemical environment are the foundations of microbial processes. Modern microscopy imaging techniques provide attractive and promising means to study the impact of these interactions on the dynamics of bacteria. The aim of this dissertation is to deepen our understanding four fundamental bacterial processes – single-cell motility, chemotaxis, bacterial interactions with environmental constraints, and their communication with neighbors – through a live cell imaging technique. By exploring these processes, we expanded our knowledge on so far unexplained mechanisms of bacterial interactions. Firstly, we studied the motility of the soil bacterium Pseudomonas putida (P. putida), which swims through flagella propulsion, and has a complex, multi-mode swimming tactic. It was recently reported that P. putida exhibits several distinct swimming modes – the flagella can push and pull the cell body or wrap around it. Using a new combined phase-contrast and fluorescence imaging set-up, the swimming mode (push, pull, or wrapped) of each run phase was automatically recorded, which provided the full swimming statistics of the multi-mode swimmer. Furthermore, the investigation of cell interactions with a solid boundary illustrated an asymmetry for the different swimming modes; in contrast to the push and pull modes, the curvature of runs in wrapped mode was not affected by the solid boundary. This finding suggested that having a multi-mode swimming strategy may provide further versatility to react to environmental constraints. Then we determined how P. putida navigates toward chemoattractants, i.e. its chemotaxis strategies. We found that individual run modes show distinct chemotactic responses in nutrition gradients. In particular, P. putida cells exhibited an asymmetry in their chemotactic responsiveness; the wrapped mode (slow swimming mode) was affected by the chemoattractant, whereas the push mode (fast swimming mode) was not. These results can be seen as a starting point to understand more complex chemotaxis strategies of multi-mode swimmers going beyond the well-known paradigm of Escherichia coli, that exhibits only one swimming mode. Finally we considered the cell dynamics in a dense population. Besides physical interactions with their neighbors, cells communicate their activities and orchestrate their population behaviors via quorum-sensing. Molecules that are secreted to the surrounding by the bacterial cells, act as signals and regulate the cell population behaviour. We studied P. putida’s motility in a dense population by exposing the cells to environments with different concentrations of chemical signals. We found that higher amounts of chemical signals in the surrounding influenced the single-cell behaviourr, suggesting that cell-cell communications may also affect the flagellar dynamics. In summary, this dissertation studies the dynamics of a bacterium with a multi-mode swimming tactic and how it is affected by the surrounding environment using microscopy imaging. The detailed description of the bacterial motility in fundamental bacterial processes can provide new insights into the ecology of microorganisms. N2 - Bakterien gehören zu den am weitesten verbreiteten Mikroorganismen mit einer essentiellen Bedeutung in vielen biologischen und okologischen Prozessen. Bakterien können entweder als unabhängige Individuen oder in organisierten Gemeinschaften leben. Auf dem Level einer einzelnen Zelle sind Interaktionen zwischen Bakterien, ihren Nachbarn und des umgebenden physikalischen und chemischen Umwelt die Grundlage von mikrobiellen Prozessen. Mikroskopische Bildgebungs techniken bieten attraktive und vielversprechende Möglichkeiten den Einfluß dieses Interaktionen auf die Dynamik von Bakterien zu untersuchen. Das ziel dieser Dissertation ist es, vier fundamentale bakterielle Prozesse mittels Lebendzell-Mikroskopie besser zu verstehen – die Einzelzellbewegung, die Chemotaxis, die Wechselwirkungen der Bakterien mit der Umgebung und ihre Kommunikation mit Nachbarzellen. Durch die Untersuchung dieser Prozesse konnten wir das Wissen über die bisher ungeklärten Mechanismen der bakteriellen Interaktionen erweitern. Als Erstes untersuchten wir die Fortbewegung des Bodenbakteriums Pseudomonas putida (P. putida), welches mit Hilfe eines Flagellenantriebs schwimmt und eine komplexe multi-mode Schwimmstrategie aufweist. Kürzlich wurde veröffentlich, dass P. putida mehrere unterschiedliche Schwimmmodi besitzt – die Flagellen können den Zellkörper nach vorne drücken (push) oder ziehen (pull) oder sich um ihn wickeln (wrap). Unter Verwendung einer neuen Methode, der kombinierten Phasenkontrast- und Fluoreszenzmikroskopie, konnten die Schwimmmodi (push, pull oder wrap) für jede Schwimmphase automatisch aufgenommen werden, was eine vollständige Schwimmstatistik des multi-mode Schwimmers lieferte. Weiterhin zeigte die Untersuchung von Interaktionen mit einer festen Grenzschicht eine Asymmetrie bezüglich der verschiedenen Schwimmmodi. Im Gegensatz zu push und pull, der wrapped Modus nicht durch die feste Grenzschicht beeinflusst. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass eine multi-mode Schwimmstrategie dem Bakterium weitere möglichkeiten bietet, sich an die Umgebungsbedingungen anzupassen. Als Nächstes haben wir bestimmt, wie P. putida in Richtung eines Lockstoffes navigiert (Chemotaxis). Wir haben herausgefunden, dass einzelne Schwimmmodi eine unterschiedliche chemotaktische Antwort in Nährstoff-gradienten zeigen. P. putida besitzt eine Asymmetrie in seiner chemotaktischen Ansprechbarkeit: der wrapped Modus (langsamer Schwimmmodus) wird vom Lockstoff beeinflusst, der push Modus (schneller Schwimmmodus) hingegen nicht. Diese Ergebnisse können als Ausgangspunkt gesehen werden, um komplexere Chemotaxisstrategien von mulit-mode Schwimmern zu verstehen, die über das bekannte Musterbeispiel Escherichia coli hinaus gehen, des nur einen schwimmmodus aufweist. schließend haben wir die Zelldynamik in dichten Kulturen untersucht. Neben den physikalischen Interaktionen mit den Nachbarzellen, kommunizieren zellen ihre Aktivitäten und organisieren ihr Populationsverhalten über quorum sensing. Moleküle, die von den Bakterienzellen in die Umgebung sekretiert werden, wirken als Signale und regulieren das Verhalten der Zellpopulation. Wir haben die Bewegung von P. putida in hoher Zelldichte untersucht, indem wir die Zellen unterschiedlichen Konzentrationen dieses Moleküle aussetzten. Wir haben festgestellt, dass größere Mengen dieser signalstoffe in der Umgebung die Einzelzelldynamik beeinflusst haben. Dies lässt uns vermuten, dass sich die Zell-Zell-Kommunikation auch auf die Flagellendynamik auswirkt. Zusammenfassend zeigt diese Dissertation mittels Mikroskopie die Dynamik von einem Bakterium mit multi-mode Schwimmstrategie und wie die umgebende Umwelt diese Dynamik beeinflußt. Die detaillierte Beschreibung der Bakterienmotilität in grundlegenden bakteriellen Prozessen kann neue Erkenntnisse für die ökologie der Mikroorganismen bringen. T2 - Bewegungsstrategien von bakteriellenmulti-mode Schwimmern KW - Single-cell motility KW - Einzelzellbewegung KW - Chemotaxis KW - Chemotaxis KW - Flagellen KW - Flagella KW - Bacteria KW - Bakterien Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-475806 ER - TY - THES A1 - Aneley, Gedif Mulugeta T1 - Drought tolerance prediction of potato by automatic phenotyping of morphological and physiological traits T1 - Vorhersage von Trockentoleranz in Kartoffel durch automatische Phänotypisierung morphologischer und physiologischer Eigenschaften N2 - Potato is the 4th most important food crop in the world. Especially in tropical and sub-tropical potato production, drought is a yield limiting factor. Potato is sensitive to water stress. Potato yield loss under water stress could be reduced by using tolerant varieties and adjusted agronomic practices. Direct selection for yield under water-stressed conditions requires long selection cycles. Thus, identification of markers for marker-assisted selection may speed up breeding. The objective of this thesis is to identify morphological markers for drought tolerance by continuously monitoring plant growth and canopy temperature with an automatic phenotyping system. The phenotyping was performed in drought-stress experiments that were conducted in population A with 64 genotypes and population B with 21 genotypes in the screenhouse in 2015 and 2016 (population A) and in 2017 and 2018 (population B). Drought tolerance was quantified as deviation of the relative tuber starch yield from the experimental median (DRYM) and parent median (DRYMp). Relative tuber starch yield is starch yield under drought stress relative to the average starch yield of the respective cultivar under control conditions in the same experiment. The specific DRYM value was calculated based on the yield data of the same experiment or the global DRYM that was calculated from yield data derived from data combined over yeas of respective population or across multiple experiments including VALDIS and TROST experiments (2011-2016). Analysis of variance found a significant effect of genotype on DRYM indicating that the tolerance variation required for marker identification was given in both populations. Canopy growth was monitored continuously six times a day over five to ten weeks by a laser scanner system and yielded information on leaf area, plant height and leaf angle for population A and additionally on leaf inclination and light penetration depth for population B. Canopy temperature was measured 48 times a day over six to seven weeks by infrared thermometry in population B. From the continuous IRT surface temperature data set, the canopy temperature for each plant was selected by matching the time stamp of the IRT data with laser scanner data. Mean, maximum, range and growth rate values were calculated from continuous laser scanner measurements of respective canopy parameters. Among the canopy parameters, the maximum and mean values in long-term stress conditions showed better correlation with DRYM values calculated in the same experiment than growth rate and diurnal range values. Therefore, drought tolerance index prediction was done from maximum and mean values of canopy parameters. The tolerance index in specific experiment condition was linearly predicted by simple regression model from different single canopy parameters under long-term stress condition in population A (2016) and population B (2017 and 2018). Among the canopy parameters maximum light penetration depth (2017), mean leaf angle (2017, 2018, and 2016), mean leaf inclination or mean canopy temperature depression (2017 and 2018), maximum plant height (2017) were selected as tolerance predictors. However, no single parameters were sufficient to predict DRYM. Therefore, several independent parameters were integrated in a multiple regression model. In multiple regression model, specific experiment DRYM values in population A was predicted from mean leaf angle (2016). In population B, specific tolerance could be predicted from maximum light penetration depth and mean leaf inclination (2017) and mean leaf inclination (2018) or mean canopy temperature depression and mean leaf angle (2018). In data combined over season of population A, the multiple linear regression model selected maximum plant height and mean leaf angle as tolerance predictor. In Population B, mean leaf inclination was selected as tolerance predictor. However, in population A, the variation explained by the final model was too low. Furthermore, the average tolerances respective to parent median (2011-2018) across FGH plants or all plants (FGH and field) were predicted from maximum plant height (population A) and maximum plant height and mean leaf inclination (population B). Altogether, canopy parameters could be used as markers for drought tolerance. Therefore, water stress breeding in potato could be speed up through using leaf inclination, light penetration depth, plant height and canopy temperature depression as markers for drought tolerance, especially in long-term stress conditions. N2 - Die Kartoffel ist die viertwichtigste Nahrungspflanze der Welt. Besonders in den Tropen und Subtropen ist Trockenheit ein ertragsbegrenzender Faktor für die Kartoffelproduktion. Kartoffeln sind empfindlich gegen Trockenstress. Der Ertragsverlust von Kartoffeln unter Wasserstress könnte durch die Verwendung von toleranten Sorten und angepasste Anbaupraxis verringert werden. Die direkte Selektion für Ertrag unter Trockenstressbedingungen erfordert lange Selektionszyklen. Daher kann die Identifizierung von Markern für marker-assisted Selektion die Züchtung beschleunigen. Das Ziel dieser Arbeit ist es, morphologische Marker für Trockentoleranz mit Hilfe von kontinuierlichen Messungen von Pflanzenwachstum und Bestandstemperatur mittels automatischer Phänotypisierung zu identifizieren. Die Phänotypisierung wurde in Trockenstressexperimenten durchgeführt, welche mit 64 Genotypen aus Population A und 21 Genotypen aus Population B in einem Foliengewächshaus in 2015 und 2016 (Population A) bzw. 2017 und 2018 (Population B) stattgefunden haben. Die Trockentoleranz wurde als Abweichung des relativen Stärkeertrags der Knollen vom experimentellen Median (DRYM) und dem Elternmedian (DRYMp) quantifiziert. Der relative Stärkeertrag ist der Stärkeertrag unter Trockenstress relativ zum mittleren Stärkeertrag der Sorte unter optimaler Bewässerung im gleichen Experiment. Der spezifische DRYM wurde auf der Basis der Ertragsdaten des gleichen Experiments berechnet oder der globale DRYM wurde auf der Basis der Ertragsdaten kombinierter Experimente aus mehreren Jahren für die gleiche Population oder für mehrere Experimente auch aus VALDIS und TROST (2011-2016) berechnet. Die Varianzanalyse zeigte einen signifikanten Effekt des Genotyps auf DRYM, so dass die für die Identifizierung von Markern erforderliche Toleranzvariation in beiden Populationen gegeben war. Die Bestandsentwicklung wurde mit einem Laserscanner-System kontinuierlich sechsmal täglich über fünf bis zehn Wochen gemessen und lieferte Informationen zu Blattfläche, Pflanzenhöhe und Blattwinkel für Population A sowie zusätzlich Blattneigung und Lichteinfalltiefe für Population B. Die Oberflächentemperatur wurde 48mal täglich für sechs bis sieben Wochen mittels Infrarot-Thermometrie in Population B gemessen. Aus dem kontinuierlichen IRT-Oberflächentemperatur-Datensatz wurde die Oberflächentemperatur jeder Pflanze bestimmt, indem die Zeitstempel der IRT-Daten mit denen der Laserscannerdaten abgeglichen wurden. Mittelwert, Maximum, Streubereich (range) und Wachstumsrate wurden für die Bestandsparameter der Laserscannermessungen bestimmt. Unter den Bestandsparametern zeigten die Maxima und Mittelwerte unter Langzeitstress die bessere Korrelation mit dem Toleranzindex DRYM, der aus dem gleichen Experiment berechnet wurde, als die Wachstumsrate und der Streubereich. Die Trockentoleranzprognose wurde daher aus den Maxima und Mittelwerte der Bestandsparameter gemacht. Der Toleranzindex spezifischer Versuche wurde linear mit einem einfachen Regressionsmodell aus verschiedenen einzelnen Bestandparameters unter Langzeitstressbedingungen in Population A (2016) und Population (B) (2017 und 2018) vorhergesagt. Toleranz-Prognoseparameter wurden unter den Bestandparametern maximale Lichteinfalltiefe (2017), mittlerer Blattwinkel (2017, 2018 und 2016), mittlere Blattneigung und mittlere Oberflächentemperatur-Abweichung (2017 und 2018), maximale Pflanzenhöhe (2017) ausgewählt. Kein einzelner Parameter war jedoch ausreichend um DRYM vorherzusagen. Daher wurden mehrere unabhängige Parameter in einem multiplen Regressionsmodell integriert. Im multiplen Regressionsmodel wurde der spezifische Experiment-DRYM in Population A aus dem mittleren Blattwinkel (2016) vorhergesagt. In Population B konnte die spezifische Toleranz aus der maximalen Lichteinfalltiefe, der maximalen Blattneigung (2017) und der mittleren Blattneigung (2018) oder der mittleren Oberflächentemperatur-Abweichung und dem mittleren Blattwinkel (2018) vorhergesagt werden. In Daten aus mehreren Anbauperioden von Population A wählte das multiple lineare Regressionsmodel maximale Pflanzenhöhe und mittleren Blattwinkel als Prognoseparameter für Toleranz aus. In Population B wurde mittlere Blattneigung als Prognoseparameter für Toleranz ausgewählt. In Population A war jedoch die Variation, die durch das Endmodell erklärt wurde, zu niedrig. Die mittlere Toleranz hinsichtlich des Medians der Eltern (2011 – 2018) über alle FGH Pflanzen oder alle Pflanzen (FGH und Feld) wurde ferner aus der maximalen Pflanzenhöhe (Population A) und der maximalen Pflanzenhöhe und mittleren Blattneigung (Population) vorhergesagt. Insgesamt konnten Bestandsparameter als Marker für Trockentoleranz genutzt werden. Dementsprechend könnte Trockenstresszucht in Kartoffeln beschleunigt werden, indem Blattneigung, Lichteinfalltiefe, Pflanzenhöhe und Oberflächentemperatur-Abweichung als Marker für Trockentoleranz, insbesondere unter Langzeitstressbedingungen, genutzt werden. (Übersetzung Karin Köhl, 4.6.2020). KW - Canopy parameters KW - Drought tolerance KW - DRYM KW - Bestandsparameter KW - Trockentoleranz KW - DRYM Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-486836 ER - TY - THES A1 - Autenrieth, Marijke T1 - Population genomics of two odontocetes in the North Atlantic and adjacent waters BT - Evolutionary history and conservation implications N2 - Due to continuously intensifying human usage of the marine environment worldwide ranging cetaceans face an increasing number of threats. Besides whaling, overfishing and by-catch, new technical developments increase the water and noise pollution, which can negatively affect marine species. Cetaceans are especially prone to these influences, being at the top of the food chain and therefore accumulating toxins and contaminants. Furthermore, they are extremely noise sensitive due to their highly developed hearing sense and echolocation ability. As a result, several cetacean species were brought to extinction during the last century or are now classified as critically endangered. This work focuses on two odontocetes. It applies and compares different molecular methods for inference of population status and adaptation, with implications for conservation. The worldwide distributed sperm whale (Physeter macrocephalus) shows a matrilineal population structure with predominant male dispersal. A recently stranded group of male sperm whales provided a unique opportunity to investigate male grouping for the first time. Based on the mitochondrial control region, I was able to infer that male bachelor groups comprise multiple matrilines, hence derive from different social groups, and that they represent the genetic variability of the entire North Atlantic. The harbor porpoise (Phocoena phocoena) occurs only in the northern hemisphere. By being small and occurring mostly in coastal habitats it is especially prone to human disturbance. Since some subspecies and subpopulations are critically endangered, it is important to generate and provide genetic markers with high resolution to facilitate population assignment and subsequent protection measurements. Here, I provide the first harbour porpoise whole genome, in high quality and including a draft annotation. Using it for mapping ddRAD seq data, I identify genome wide SNPs and, together with a fragment of the mitochondrial control region, inferred the population structure of its North Atlantic distribution range. The Belt Sea harbors a distinct subpopulation oppose to the North Atlantic, with a transition zone in the Kattegat. Within the North Atlantic I could detect subtle genetic differentiation between western (Canada-Iceland) and eastern (North Sea) regions, with support for a German North Sea breading ground around the Isle of Sylt. Further, I was able to detect six outlier loci which show isolation by distance across the investigated sampling areas. In employing different markers, I could show that single maker systems as well as genome wide data can unravel new information about population affinities of odontocetes. Genome wide data can facilitate investigation of adaptations and evolutionary history of the species and its populations. Moreover, they facilitate population genetic investigations, providing a high resolution, and hence allowing for detection of subtle population structuring especially important for highly mobile cetaceans. N2 - Mit der immer stärker zunehmenden Nutzung des marinen Lebensraumes durch den Menschen, häufen sich auch die Bedrohungen, wie beispielsweise Lebensraumzerstörungen, denen Cetacea ausgesetzt sind. Die Folgen aus Walfang, Überfischung und Beifang, wie auch die stärkere Verschmutzung der Meere sowie die Zunahme des generellen Lärmpegels, haben negative Effekte auf eine Vielzahl mariner Arten. Cetacea sind besonders anfällig für diese Störungen, da sie einerseits am Ende der Nahrungskette stehen und somit besonders Schadstoffe, wie bspw. PBEs, in ihren Körpern akkumulieren und andererseits durch ihr hoch angepasstes Gehör äußerst sensibel gegenüber Geräuschstörungen sind. Im Laufe des letzten Jahrhunderts wurden einige marine Säugetiere bereits ausgerottet oder fast bis an den Rand des Aussterbens gebracht. Diese Arbeit konzentriert sich auf zwei Zahnwalarten, die in ihrer Biologie und Populationsstruktur sehr verschieden sind. Sie bieten die Möglichkeit, verschiedene Methoden der Naturschutz- und Populationsgenetik anzuwenden und zu vergleichen. Der weltweit verbreitete Pottwal ist matrilineal organisiert mit Weibchen, die in sozialen Gruppen in der Nähe des Äquators leben, und Männchen, die in kleinen Gruppen zu den Polen migrieren. Zum Jahresbeginn 2016 strandete eine Gruppe junger männlicher Pottwale entlang der Nordsee. Dieses Ereignis bot die einzigartige Chance, erstmals die genetische Zusammensetzung einer männlichen Pottwalgruppe zu untersuchen. Basierend auf der mitochondrialen Kontrollregion, konnte ich zeigen, dass sie von mehreren Matrilinien abstammen und in ihrer Gesamtheit die genetische Vielfalt der nordatlantischen Gesamtpopulation repräsentieren. Der Schweinswal ist innerhalb der nördlichen Hemisphäre weit verbreitet. Durch seine kleine Körpergrösse und die Präferenz für küstennahe Habitate ist er besonders anfällig gegenüber negativen anthropogenen Einflüssen. Da sowohl eine seiner Unterarten als auch einige Subpopulationen durch die IUCN als stark bedroht klassifiziert sind, ist es besonders wichtig die genetische Struktur dieser Art und ihrer Populationen zu erfassen und hochauflösende Markersysteme zu generieren, um verlässliche Informationen zum Status lokaler Populationen für weiterführende Naturschutzmaßnahmen bereitzustellen. In dieser Arbeit konnte ich die erste komplette Genomsequenz des Schweinwal in hoher Qualität bereitstellen und sie für die Analyse von ddRAD-Daten als Referenz nutzen. Mittles genomweit verteilter SNPs, sowie einem Abschnitt der mitochondrialen Kontrollregion zeigte sich, dass die Schweinswale in der Beltsee eine eigenständige Population bilden, mit einer Transitionszone zum Nord-Atlantik im Kattegat. Innerhalb des Nord-Atlantiks zeigten sich Unterschiede zwischen West (Kanada-Island) und Ost (Nordsee), sowie eine Abgrenzung deutscher Schweinswale um die Insel Sylt. Außerdem konnte ich sechs SNPs identifizieren, welche die populationsgenetische Auflösung im Nordatlantik und geographischen Distanz wiederspiegeln. Durch den Vergleich verschiedener Markersysteme konnte ich zeigen, dass sowohl einzelne Marker als auch genomweite Marker neue Erkenntnisse zu Populationsstrukturen und Anpassungen von Zahnwalen liefern. Durch die hohe Mobilität und den schwer zugänglichen Lebensraum mariner Säugetiere sind hochauflösende genetische Markersysteme der Schlüssel für ein besseres Verständnis und den Schutz dieser Arten. KW - genomics KW - population genetics KW - conservation KW - evolution KW - whole genome KW - toothed whales KW - Genomik KW - Populationsgenetik KW - Naturschutz KW - Evolution KW - Zahnwale Y1 - 2020 ER - TY - THES A1 - Banerjee, Pallavi T1 - Glycosylphosphatidylinositols (GPIs) and GPI-anchored proteins tethered to lipid bilayers BT - modelling a complex interplay of carbohydrates, proteins and lipids BT - Modellierung eines komplexen Zusammenspiels von Kohlenhydraten, Proteinen und Lipiden N2 - Glycosylphosphatidylinositols (GPIs) are highly complex glycolipids that serve as membrane anchors to a large variety of eukaryotic proteins. These are covalently attached to a group of peripheral proteins called GPI-anchored proteins (GPI-APs) through a post-translational modification in the endoplasmic reticulum. The GPI anchor is a unique structure composed of a glycan, with phospholipid tail at one end and a phosphoethanolamine linker at the other where the protein attaches. The glycan part of the GPI comprises a conserved pseudopentasaccharide core that could branch out to carry additional glycosyl or phosphoethanolamine units. GPI-APs are involved in a diverse range of cellular processes, few of which are signal transduction, protein trafficking, pathogenesis by protozoan parasites like the malaria- causing parasite Plasmodium falciparum. GPIs can also exist freely on the membrane surface without an attached protein such as those found in parasites like Toxoplasma gondii, the causative agent of Toxoplasmosis. These molecules are both structurally and functionally diverse, however, their structure-function relationship is still poorly understood. This is mainly because no clear picture exists regarding how the protein and the glycan arrange with respect to the lipid layer. Direct experimental evidence is rather scarce, due to which inconclusive pictures have emerged, especially regarding the orientation of GPIs and GPI-APs on membrane surfaces and the role of GPIs in membrane organization. It appears that computational modelling through molecular dynamics simulations would be a useful method to make progress. In this thesis, we attempt to explore characteristics of GPI anchors and GPI-APs embedded in lipid bilayers by constructing molecular models at two different resolutions – all-atom and coarse-grained. First, we show how to construct a modular molecular model of GPIs and GPI-anchored proteins that can be readily extended to a broad variety of systems, addressing the micro-heterogeneity of GPIs. We do so by creating a hybrid link to which GPIs of diverse branching and lipid tails of varying saturation with their optimized force fields, GLYCAM06 and Lipid14 respectively, can be attached. Using microsecond simulations, we demonstrate that GPI prefers to “flop-down” on the membrane, thereby, strongly interacting with the lipid heads, over standing upright like a “lollipop”. Secondly, we extend the model of the GPI core to carry out a systematic study of the structural aspects of GPIs carrying different side chains (parasitic and human GPI variants) inserted in lipid bilayers. Our results demonstrate the importance of the side branch residues as these are the most accessible, and thereby, recognizable epitopes. This finding qualitatively agrees with experimental observations that highlight the role of the side branches in immunogenicity of GPIs and the specificity thereof. The overall flop-down orientation of the GPIs with respect to the bilayer surface presents the side chain residues to face the solvent. Upon attaching the green fluorescent protein (GFP) to the GPI, it is seen to lie in close proximity to the bilayer, interacting both with the lipid heads and glycan part of the GPI. However the orientation of GFP is sensitive to the type of GPI it is attached to. Finally, we construct a coarse-grained model of the GPI and GPI-anchored GFP using a modified version of the MARTINI force-field, using which the timescale is enhanced by at least an order of magnitude compared to the atomistic system. This study provides a theoretical perspective on the conformational behavior of the GPI core and some of its branched variations in presence of lipid bilayers, as well as draws comparisons with experimental observations. Our modular atomistic model of GPI can be further employed to study GPIs of variable branching, and thereby, aid in designing future experiments especially in the area of vaccines and drug therapies. Our coarse-grained model can be used to study dynamic aspects of GPIs and GPI-APs w.r.t plasma membrane organization. Furthermore, the backmapping technique of converting coarse-grained trajectory back to the atomistic model would enable in-depth structural analysis with ample conformational sampling. N2 - Glykosylphosphatidyl-Inositole (GPIs) sind komplex Glykolipide, die insbesondere auf der Oberfläche eukaryotischer Zellen als Verankerung einer Reihe unterschiedlicher Proteine dienen. GPIs werden den Proteinen als post-translationale Modifikationen im endoplasmotischen Reticulum hinzugefügt. Die Verankerung in der Membran wird durch einen Phospholipidrest hergestellt, das Protein ist dann über ein sich daran anschließendes Pseudo-Pentasaccharid und einen Phospoethanolaminrest kovalent an den GPI Anker gebunden. Das Pseudo-Pentasaccharid ist dabei proteinunabhängig eine invariante Struktur, kann aber an bestimmten Stellen durch weitere Carbohydratseitenketten und/oder Phosphoethanolaminreste wesentlich erweitert werden. GPI-verankerte Proteine (engl. GPI-anchored proteins, GPI-APs) sind an einer Reihe zellulärer Prozesse beteiligt; einige davon betreffen intra- und interzelluläre Signalübermittlung oder Proteintransport auf der Zelloberfläche; die Pathogenese vieler Parasiten, wie etwa Plasmodium falciparum (Malaria) wird entscheidend durch GPI-APs bestimmt; es können aber auch die bei vielen parasitischen Einzellern freien, ohne Protein auftretenden GPIs pathogene Wirkung entfalten wie etwa bei der Toxoplasmose (Toxoplasma gondii). Der allgemeine Zusammenhang von Struktur eines GPI-AP und seiner Funktion ist allerdings bis heute zum größten Teil unbekannt. Dies liegt zum einen daran, dass sich kein klares Bild zeichnen lässt, wie ein GPI-AP relativ zur Zellmembran exponiert wird. Die relevanten Zeit- und Längenskalen sind experimentell unzugänglich, und entsprechende in vivo oder in vitro Untersuchungen liefern lediglich indirekte Hinweise. Der Fall GPI-verankerter Proteine ist daher ein Beispiel, in dem computergestützte Modellierung einen wesentlichen Beitrag zur Aufklärung leisten kann. In der vorliegenden Arbeit wird zunächst ein atomistisches, molekulardynamisches Modell für GPIs und GPI-APs konstruiert und vorgestellt, mit dem sich GPI-APs auf der Längenskala einiger 10 Nanometer und einer Zeitskala von etwa 10 Mikrosekunden effizient untersuchen lassen. Modularität des Modells ist hierbei ein entscheidender Aspekt: mit den entwickelten Modellen lassen sich eine breite Palette von GPI Variationen darstellen. GPIs weisen, wie auch andere Proteinglykolysierungen eine sogenannte Mikroheterogenität auf; die Modifikation durch den Zucker kann sich zwischen den Kopien ein und desselben Proteins unterscheiden. Die technische Umsetzung erfolgt im Rahmen der sogenannten AMBER- Familie atomistischer Kraftfelder, die nach einem bestimmten Schema für biomolekulare Simulationen entwickelt wurden. Dabei werden existierende Modelle für Zucker (GLYCAM06) und Lipide (Lipid14) durch die Optimierung und Herleitung fehlender Parameter so angepasst, dass sich ein vollständiges GPI-AP in einer Lipid-Doppelschicht darstellen lässt. Dabei zeigt sich, dass das Protein vermittelt über den flexiblen Anker über einen beachtlichen Bewegungsspielraum verfügt. Im Falle des hier betrachteten Green Fluorescent Protein (GFP) kann man daher das Bild einer festen Orientierung des Proteins in Bezug auf die Lipidoberfläche verwerfen; wie in der Mehrzahl der Simulationen beobachtet, kann das GFP sogar vollständig auf der Lipidschicht zu liegen kommen. Weiterhin konnte nachgewiesen werden, dass eine Reihe möglicher Seitenketten des GPI Ankers, die zu Parasiten wie Toxoplasma gondii gehören und bei entsprechenden Immunreaktionen relevant sind, tatsächlich so exponiert werden, dass ihre Rolle als Rezeptoren unterstrichen wird. Das Pseudopentasaccharid selbst ist dabei teilweise in die Kopfgruppenregion der Lipidschicht eingebettet. Des Weiteren wurde hier das atomistische Modell auf eine vergröberte Darstellung im Rahmen des MARTINI Kraftfelds projiziert, um die zugänglichen Zeit- und Längenskalen noch einmal um einen Faktor 10 zu erweitern. Somit werden auch Studien GPI-APs möglich, bei denen sich ihre Dynamik in heterogenen Lipidschichten untersuchen lässt, etwa um Fragen zu beantworten, wie diese Proteine mit verschiedenen Membrandomänen assoziieren. Insgesamt werden mit dieser Arbeit eine Reihe von Ansätzen aufgezeigt, wie sich GPI verankerte Proteine möglicherweise effektiver in speziell angepassten Experimenten und in größerem Detail untersuchen lassen, als dies bisher möglich war. T2 - Glykosylphosphatidylinositole (GPIs) und GPI-verankerte Proteine, die an Lipid-Doppelschichten gebunden sind KW - GPI KW - carbohydrates KW - membrane KW - protein KW - molecular dynamics KW - coarse-graining KW - martini KW - GPI KW - Kohlenhydrate KW - grobkörnig KW - martini KW - Membran KW - Molekular-dynamik KW - Protein Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-489561 ER - TY - THES A1 - Calzadiaz Ramirez, Liliana T1 - Engineering highly efficient NADP-dependent formate dehydrogenases using a NADPH biosensor Escherichia coli strain N2 - NADPH is an essential cofactor that drives biosynthetic reactions in all living organisms. It is a reducing agent and thus electron donor of anabolic reactions that produce major cellular components as well as many products in biotechnology. Indeed, the engineering of metabolic pathways for the production of many products is often limited by the availability of NADPH. One common strategy to address this issue is to swap cofactor specificity from NADH to NADPH of enzymes. However, this process is time consuming and challenging because multiple parameters need to be engineered in parallel. Therefore, the first aim of this project is to establish an efficient metabolic biosensor to select enzymes that can reduce NADP+. An NADPH auxotroph strain was constructed by deleting major reactions involved in NADPH biosynthesis in E. coli’s central carbon metabolism with the exception of 6-phosphogluconate dehydrogenase. To validate this strain, two enzymes were tested in the presence of several carbon sources: a dihydrolipoamide dehydrogenase variant of E. coli harboring seven mutations and a formate dehydrogenase (FDH) from Mycobacterium vaccae N10 harboring four mutations were found to support NADPH biosynthesis and growth. The strain was subjected to adaptive laboratory evolution with the goal of testing its robustness under different carbon sources. Our evolution experiment resulted in the random mutagenesis of the malic enzyme (maeA), enabling it to produce NADPH. The additional deletion of maeA rendered a more robust second-generation biosensor strain for NADP+ reduction. We devised a structure-guided directed evolution approach to change cofactor specificity in Pseudomonas sp. 101 FDH. To this end, a library of >106 variants was tested using in vivo selection. Compared to the best engineered enzymes reported, our best variant carrying five mutations shows 5-fold higher catalytic efficiency and 13-fold higher specificity towards NADP+, as well as 2-fold higher affinity towards formate. In conclusion, we demonstrate the potential of in vivo selection and evolution-guided approaches to develop better NADPH biosensors and to engineer cofactor specificity by the simultaneous improvement of multiple parameters (kinetic efficiency with NADP+, specificity towards NADP+, and affinity towards formate), which is a major challenge in protein engineering due to the existence of tradeoffs and epistasis. N2 - NADPH ist ein essentieller Kofaktor, der biosynthetische Reaktionen in allen lebenden Organismen antreibt. Es ist ein Reduktionsmittel und damit Elektronenspender für anabole Reaktionen, die wichtige Zellkomponenten sowie viele Produkte in der Biotechnologie erzeugen. In der Tat ist das Engineering von Stoffwechselwegen in Mikroben für die Herstellung vieler Produkte oft durch die Verfügbarkeit von NADPH begrenzt. Eine gängige Strategie zur Lösung dieses Problems ist der Austausch der Kofaktor-Spezifität von NADH gegen NADPH in Enzymen von Stoffwechselwegen, da der erstgenannte Kofaktor reichlicher vorhanden ist als der letztere. Dieser Prozess ist jedoch zeitaufwendig und schwierig, da mehrere Parameter parallel entwickelt werden müssen. Daher ist das erste Ziel dieses Projekts die Etablierung eines effizienten metabolischen Biosensors zur Auswahl von Enzymen, die NADP+ reduzieren können. Ein auxotropher NADPH-Stamm wurde durch die Entfernung der wichtigsten Reaktionen, die an der NADPH-Biosynthese im zentralen Kohlenstoffmetabolismus von E. coli beteiligt sind, mit Ausnahme der 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase, konstruiert. Um diesen Stamm zu validieren, wurden zwei Enzyme in Gegenwart mehrerer Kohlenstoffquellen getestet: eine Dihydrolipoamid-Dehydrogenase-Variante von E. coli mit sieben Mutationen und Formiat-Dehydrogenase (FDH) aus Mycobacterium vaccae N10 mit vier Mutationen wurden gefunden, die die NADPH-Biosynthese und das Wachstum unterstützen. Der Stamm wurde dann einer adaptiven Laborentwicklung unterzogen mit dem Ziel, seine Robustheit unter verschiedenen Kohlenstoffquellen zu testen. Unser Evolutionsexperiment führte zu einer zufälligen Mutagenese des Apfelsäure-Enzyms (maeA), die es ihm ermöglicht, NADPH zu produzieren. Die zusätzliche Entfernung von maeA machte einen robusteren Biosensor-Stamm der zweiten Generation für die NADP+-Reduktion möglich. Wir entwickelten einen strukturgesteuerten Evolutionsansatz zur Änderung der Kofaktorspezifität von Pseudomonas sp. 101 FDH. Zu diesem Zweck wurde eine Bibliothek von >106 Varianten mit Hilfe der in vivo-Selektion getestet. Im Vergleich zu den am besten entwickelten Enzymen über die berichtet wurde, zeigt unsere beste Variante mit fünf Mutationen eine 5-fach höhere katalytische Effizienz und eine 13-fach höhere Spezifität gegenüber NADP+ sowie eine 2-fach höhere Affinität gegenüber Formiat. Zusammenfassend zeigen wir das Potenzial der in vivo-Selektion und evolutionsgesteuerten Ansätze zur Entwicklung 14 besserer NADPH-Biosensoren und zur Entwicklung der Kofaktor-Spezifität durch die gleichzeitige Verbesserung mehrerer Parameter (kinetische Effizienz mit NADP+, Spezifität gegenüber NADP+ und Affinität zu Formiat), was aufgrund der Existenz von Zielkonflikten und Epistase eine große Herausforderung im Protein-Engineering darstellt. KW - formate dehydrogenases Y1 - 2020 ER - TY - THES A1 - Crawford, Michael Scott T1 - Using individual-based modeling to understand grassland diversity and resilience in the Anthropocene N2 - The world’s grassland systems are increasingly threatened by anthropogenic change. Susceptible to a variety of different stressors, from land-use intensification to climate change, understanding the mechanisms driving the maintenance of these systems’ biodiversity and stability, and how these mechanisms may shift under human-mediated disturbance, is thus critical for successfully navigating the next century. Within this dissertation, I use an individual-based and spatially-explicit model of grassland community assembly (IBC-grass) to examine several processes, thought key to understanding their biodiversity and stability and how it changes under stress. In the first chapter of my thesis, I examine the conditions under which intraspecific trait variation influences the diversity of simulated grassland communities. In the second and third chapters of my thesis, I shift focus towards understanding how belowground herbivores influence the stability of these grassland systems to either a disturbance that results in increased, stochastic, plant mortality, or eutrophication. Intraspecific trait variation (ITV), or variation in trait values between individuals of the same species, is fundamental to the structure of ecological communities. However, because it has historically been difficult to incorporate into theoretical and statistical models, it has remained largely overlooked in community-level analyses. This reality is quickly shifting, however, as a consensus of research suggests that it may compose a sizeable proportion of the total variation within an ecological community and that it may play a critical role in determining if species coexist. Despite this increasing awareness that ITV matters, there is little consensus of the magnitude and direction of its influence. Therefore, to better understand how ITV changes the assembly of grassland communities, in the first chapter of my thesis, I incorporate it into an established, individual-based grassland community model, simulating both pairwise invasion experiments as well as the assembly of communities with varying initial diversities. By varying the amount of ITV in these species’ functional traits, I examine the magnitude and direction of ITV’s influence on pairwise invasibility and community coexistence. During pairwise invasion, ITV enables the weakest species to more frequently invade the competitively superior species, however, this influence does not generally scale to the community level. Indeed, unless the community has low alpha- and beta- diversity, there will be little effect of ITV in bolstering diversity. In these situations, since the trait axis is sparsely filled, the competitively inferior may suffer less competition and therefore ITV may buffer the persistence and abundance of these species for some time. In the second and third chapters of my thesis, I model how one of the most ubiquitous trophic interactions within grasslands, herbivory belowground, influences their diversity and stability. Until recently, the fundamental difficulty in studying a process within the soil has left belowground herbivory “out of sight, out of mind.” This dilemma presents an opportunity for simulation models to explore how this understudied process may alter community dynamics. In the second chapter of my thesis, I implement belowground herbivory – represented by the weekly removal of plant biomass – into IBC-grass. Then, by introducing a pulse disturbance, modelled as the stochastic mortality of some percentage of the plant community, I observe how the presence of belowground herbivores influences the resistance and recovery of Shannon diversity in these communities. I find that high resource, low diversity, communities are significantly more destabilized by the presence of belowground herbivores after disturbance. Depending on the timing of the disturbance and whether the grassland’s seed bank persists for more than one season, the impact of the disturbance – and subsequently the influence of the herbivores – can be greatly reduced. However, because human-mediated eutrophication increases the amount of resources in the soil, thus pressuring grassland systems, our results suggest that the influence of these herbivores may become more important over time. In the third chapter of my thesis, I delve further into understanding the mechanistic underpinnings of belowground herbivores on the diversity of grasslands by replicating an empirical mesocosm experiment that crosses the presence of herbivores above- and below-ground with eutrophication. I show that while aboveground herbivory, as predicted by theory and frequently observed in experiments, mitigates the impact of eutrophication on species diversity, belowground herbivores counterintuitively reduce biodiversity. Indeed, this influence positively interacts with the eutrophication process, amplifying its negative impact on diversity. I discovered the mechanism underlying this surprising pattern to be that, as the herbivores consume roots, they increase the proportion of root resources to root biomass. Because root competition is often symmetric, herbivory fails to mitigate any asymmetries in the plants’ competitive dynamics. However, since the remaining roots have more abundant access to resources, the plants’ competition shifts aboveground, towards asymmetric competition for light. This leads the community towards a low-diversity state, composed of mostly high-performance, large plant species. We further argue that this pattern will emerge unless the plants’ root competition is asymmetric, in which case, like its counterpart aboveground, belowground herbivory may buffer diversity by reducing this asymmetry between the competitively superior and inferior plants. I conclude my dissertation by discussing the implications of my research on the state of the art in intraspecific trait variation and belowground herbivory, with emphasis on the necessity of more diverse theory development in the study of these fundamental interactions. My results suggest that the influence of these processes on the biodiversity and stability of grassland systems is underappreciated and multidimensional, and must be thoroughly explored if researchers wish to predict how the world’s grasslands will respond to anthropogenic change. Further, should researchers myopically focus on understanding central ecological interactions through only mathematically tractable analyses, they may miss entire suites of potential coexistence mechanisms that can increase the coviability of species, potentially leading to coexistence over ecologically-significant timespans. Individual-based modelling, therefore, with its focus on individual interactions, will prove a critical tool in the coming decades for understanding how local interactions scale to larger contexts, and how these interactions shape ecological communities and further predicting how these systems will change under human-mediated stress. N2 - Grasland ist durch anthropogene Veränderungen bedroht. Im Rahmen dieser Dissertation verwende ich ein individuelles und räumlich-explizites Modell der Grasland-Gemeinschaftsversammlung (IBC-Gras), um verschiedene Prozesse zu untersuchen, die als Schlüssel zum Verständnis ihrer Biodiversität und Stabilität und deren Veränderung unter Stress gelten. Im ersten Kapitel meiner Dissertation untersuche ich die Bedingungen, unter denen eine intraspezifische Merkmalsvariation die Vielfalt der simulierten Graslandgemeinschaften beeinflusst. Im zweiten und dritten Kapitel meiner Dissertation verlege ich den Schwerpunkt auf das Verständnis, wie unterirdische Pflanzenfresser die Stabilität dieser Grünlandsysteme beeinflussen, und zwar entweder durch eine Störung, die zu erhöhter, stochastischer Pflanzensterblichkeit oder Eutrophierung führt. Intraspezifische Merkmalsvariation (ITV) oder Variation der Merkmalswerte zwischen Individuen derselben Art ist für die Struktur ökologischer Gemeinschaften von grundlegender Bedeutung. Da sie sich jedoch historisch gesehen nur schwer in theoretische und statistische Modelle einbauen lässt, wurde sie bei Analysen auf Gemeindeebene weitgehend übersehen. Diese Realität ändert sich jedoch schnell, da ein Forschungskonsens darauf hindeutet, dass sie einen beträchtlichen Anteil der Gesamtvariation innerhalb einer ökologischen Gemeinschaft ausmachen kann und dass sie eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung der Koexistenz von Arten spielen kann. Trotz dieses zunehmenden Bewusstseins, dass das ITV von Bedeutung ist, gibt es kaum einen Konsens über das Ausmaß und die Richtung seines Einflusses. Um besser zu verstehen, wie ITV die Zusammensetzung von Grünlandgesellschaften verändert, beziehe ich daher im ersten Kapitel meiner Dissertation diese in ein etabliertes, auf dem Individuum basierendes Modell der Grünlandgesellschaften ein. Indem ich die Menge an ITV in den funktionellen Merkmalen dieser Arten variiere, untersuche ich das Ausmaß und die Richtung des Einflusses von ITV auf die paarweise Unsichtbarkeit und die Koexistenz von Gemeinschaften. Im zweiten und dritten Kapitel meiner Dissertation modelliere ich, wie eine der allgegenwärtigsten trophischen Interaktionen innerhalb von Grasland, die Pflanzenfresserei unter der Erde, deren Vielfalt und Stabilität beeinflusst. Bis vor kurzem hat die grundlegende Schwierigkeit, einen Prozess im Boden zu untersuchen, dazu geführt, dass Pflanzenfresser unter der Erde "aus den Augen, aus dem Sinn" geraten sind. Dieses Dilemma bietet eine Gelegenheit für Simulationsmodelle zu erforschen, wie dieser noch nicht untersuchte Prozess die Dynamik von Gemeinschaften verändern kann. Im zweiten Kapitel meiner Dissertation implementiere ich unterirdische Pflanzenfresserei - repräsentiert durch die wöchentliche Entfernung von pflanzlicher Biomasse - in IBC-Gras. Dann beobachte ich durch die Einführung einer Pulsstörung, die als stochastische Mortalität eines gewissen Prozentsatzes der Pflanzengemeinschaft modelliert wird, wie die Anwesenheit von unterirdischen Pflanzenfressern die Resistenz und Erholung der Shannon-Diversität in diesen Gemeinschaften beeinflusst. Ich stelle fest, dass Gemeinschaften mit hohen Ressourcen und geringer Diversität durch die Anwesenheit von unterirdischen Pflanzenfressern nach einer Störung wesentlich stärker destabilisiert werden. Abhängig vom Zeitpunkt der Störung und davon, ob die Saatgutbank des Graslandes länger als eine Saison besteht, können die Auswirkungen der Störung - und damit der Einfluss der Pflanzenfresser - stark reduziert werden. Im dritten Kapitel meiner Dissertation vertiefe ich das Verständnis der mechanistischen Grundlagen der unterirdischen Herbivoren für die Diversität von Grasland, indem ich ein empirisches Mesokosmos-Experiment repliziere, das die Anwesenheit von Herbivoren über- und unterirdisch mit Eutrophierung kreuzt. Ich zeige, dass, während oberirdische Pflanzenfresser, wie von der Theorie vorhergesagt und häufig in Experimenten beobachtet, die Auswirkungen der Eutrophierung auf die Artenvielfalt abschwächen, unterirdische Pflanzenfresser die Artenvielfalt kontraintuitiv reduzieren. Tatsächlich interagiert dieser Einfluss positiv mit dem Eutrophierungsprozess und verstärkt seine negativen Auswirkungen auf die Vielfalt. Ich schließe meine Dissertation mit einer Erörterung der Auswirkungen meiner Forschung auf den Stand der Technik bei der Variation intraspezifischer Merkmale und der unterirdischen Pflanzenfresserei, wobei der Schwerpunkt auf der Notwendigkeit einer vielfältigeren Theorieentwicklung bei der Untersuchung dieser grundlegenden Wechselwirkungen liegt. Meine Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Einfluss dieser Prozesse auf die biologische Vielfalt und Stabilität von Graslandsystemen unterschätzt wird und mehrdimensional ist und gründlich erforscht werden muss, wenn Forscher vorhersagen wollen, wie die Grasländer der Welt auf anthropogene Veränderungen reagieren werden. Sollten sich Forscherinnen und Forscher darüber hinaus myopisch darauf konzentrieren, zentrale ökologische Wechselwirkungen nur durch mathematisch nachvollziehbare Analysen zu verstehen, könnten sie ganze Suiten potenzieller Koexistenzmechanismen übersehen, die die Begehrlichkeit von Arten erhöhen können und möglicherweise zu einer Koexistenz über ökologisch signifikante Zeitspannen hinweg führen. Daher wird sich die individuenbasierte Modellierung mit ihrem Schwerpunkt auf individuellen Interaktionen in den kommenden Jahrzehnten als ein entscheidendes Instrument erweisen, um zu verstehen, wie lokale Interaktionen sich auf größere Zusammenhänge ausdehnen und wie diese Interaktionen ökologische Gemeinschaften formen, und um weiter vorherzusagen, wie sich diese Systeme unter vom Menschen verursachtem Stress verändern werden. T2 - Einsatz von individualbasierten Modellen zum Verständnis der Grasland-Diversität und -Resilienz im Anthropozän KW - intraspecific trait variation KW - eutrophication KW - belowground herbivory KW - grassland KW - ecological modelling KW - intraspezifische Merkmalsvariation KW - Eutrophierung KW - Grasland KW - ökologische Modellierung KW - unterirdische Pflanzenfresser Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-479414 ER - TY - THES A1 - Dehm, Daniel T1 - Development of concepts for the genomic mining of novel secondary metabolites in symbiotic cyanobacteria N2 - Naturstoffe sind seit der goldenen Ära der Antibiotika von immer größerem Interesse, sowohl für die Grundlagenforschung als auch die Angewandten Wissenschaften, da sie die Hauptquelle für neuartige Pharmazeutika mit starken antibiotischen, anti-entzündlichen und Antitumor-Aktivitäten darstellen. Neben den technologischen Fortschritten im Bereich der Hochdurchsatz Genomsequenzierung und dem verbesserten Verständnis des modularen Aufbaus der Biosynthesewege von Sekundärmetaboliten, kam es auch zu einem Wechsel vom labor-gestützten Screening aktiver Zellextrakte hin zum Algorithmen-basierten in silico Screening nach neuen Naturstoff-Biosyntheseclustern. Obwohl die steigende Zahl verfügbarer Genomsequenzen zeigte, dass nicht-ribosomale Peptid-Synthetasen (NRPS), Polyketid-Synthasen (PKS), und ribosomal synthetisierte und posttranslational modifizierte Peptide (RiPPs) ubiquitär in allen Sparten des Lebens gefunden werden können, so zeigen einige Phyla wie Actinobakterien oder Cyanobakterien eine besonders hohe Dichte an Sekundärmetabolitclustern. Der fakultativ symbiotische, N2-fixierende Modellorganismus N. punctiforme PCC73102 ist ein terrestrisches typ-IV Cyanobakterium, welches nicht nur einen besonders hohen Anteil seines Genoms der Produktion von Sekundärmetaboliten widmet, sondern zusätzlich noch genetisch modifizierbar ist. Eine AntiSMASH Analyse des Genoms zeigte, dass N. punctiforme insgesamt sechzehn potentielle Sekundärmetabolitcluster besitzt, von denen aber bis heute nur zweien ein spezifisches Produkt zugewiesen werden konnte. Das macht N. punctiforme zu einem perfekten Testorganismus für die Entwicklung eines neuartigen kombinatorischen Genomic Mining Ansatzes zur Detektion von bislang unbeschriebenen Naturstoffen. Der neuartige Ansatz, der im Rahmen dieser Studie entwickelt wurde, stellt eine Kombination aus Genomic Mining, unabhängigen Monitoring-Techniken sowie modifizierten Kultivierungsbedingungen dar und führte nicht nur zu neuen Erkenntnissen im Bereich cyanobakterieller Naturstoffsynthese, sondern letztlich auch zur Entdeckung eines neuen, von N. punctiforme produzierten, Naturstoffs. Die Herstellung und Untersuchung einer Reporterstamm Bibliothek, bestehend aus je einem CFP-produzierenden Transkriptionsreporter für jedes der sechzehn Sekundärmetabolitcluster von N. punctiforme, zeigte, dass im Gegensatz zur Erwartung nicht alle Biosynthesecluster für die man kein Produkt nachweisen kann auch nicht exprimiert werden. Stattdessen konnten klar definierbare Expressionsmuster beschrieben werden, was deutlich machte, dass die Naturstoffproduktion einer engen Regulation unterliegt und nur ein kleiner Teil der Biosynthesecluster unter Standardbedingungen tatsächlich still sind. Darüber hinaus führte die Erhöhung der Lichtintensität sowie der Kohlenstoffdioxid-Verfügbarkeit zusammen mit der Kultivierung von N. punctiforme zu extrem hohen Zelldichten zu einer starken Erhöhung der gesamten metabolischen Aktivität des Organismus. Nähere Untersuchungen der Zellextrakte dieser hoch-dichte Kultivierungen führten letztlich zur Entdeckung einer neuartigen Gruppe von Microviridinen mit verlängerter Peptidsequenz, welche Microviridin N3-N9 genannt wurden. Sowohl die Kultivierung der Transkriptionsreporter als auch die RTqPCR-basierte Untersuchung der Transkriptionslevel der verschiedenen Biosynthesecluster zeigten, dass die hoch-Zelldichte Kultivierung von N. punctiforme zu einer Aktivierung von 50% der vorhandenen Sekundärmetabolitcluster führt. Im Gegensatz zu dieser sehr breit-gefächerten Aktivierung, führt die Co-Kultivierung von N. punctiforme in chemischen oder physischen Kontakt zu einer N-gehungerten Wirtspflanze (Blasia pusilla) zu einer sehr spezifischen Aktivierung der RIPP4 und RiPP3 Biosynthesecluster. Obwohl dieser Effekt mittels verschiedener unabhängiger Methoden bestätigt werden konnte und trotz intensiver Analysebemühungen, konnte jedoch keinem der beiden Cluster ein Produkt zugeordnet werden. Diese Studie stellt die erste weitreichende, systematische Analyse eines cyanobakteriellen Sekundärmetaboloms durch einen kombinatorischen Ansatz aus Genomic Mining und unabhängigen Monitoring-Techniken dar und kann als neue strategische Herangehensweise für die Untersuchung anderer Organismen hinsichtlich ihrer Sekundärmetabolit-Produktion dienen. Obwohl es bereits gut beschriebene einzelne Sekundärmetabolite gibt, wie beispielweise den Zelldifferenzierungsfaktor PatS in Anabaena sp. PCC7120, so ist der Grad an Regulation der in dieser Studie gezeigt werden konnte bislang beispiellos und die Entschlüsselung dieser Mechanismen könnte die Entdeckung neuer Naturstoffe stark beschleunigen. Daneben lassen die Ergebnisse aber auch darauf schließen, dass die Induktion der Biosynthesewege nicht das eigentliche Problem darstellt, sondern vielmehr die verlässliche Detektion deren Produkte. Die Erarbeitung neuer Analytik-Strategien könnte somit auch einen deutlichen Einfluss auf die Geschwindigkeit der Entdeckung neuer Naturstoffe haben. N2 - Since the golden era of antibiotics natural products are of ever growing interest to both basic research and applied sciences as they are the main source of new bioactive compounds delivering lead structures for new pharmaceuticals with potent antibiotic, anti-inflammatory or anti-cancer activities. Alongside the technological advances in high-throughput genome sequencing and the better understanding of the general organization of those modular biosynthetic assembly lines of secondary metabolites, there was also a shift from wet-lab screening of active cell extracts towards algorithm-based in silico screening for new natural product biosynthesis gene clusters (BGCs). Although the increasing availability of full genome sequences revealed that such non-ribosomal peptide synthetases (NRPS), polyketide synthases (PKS) and ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides (RiPPs) can be found in all three kingdoms of life, certain phyla like actinobacteria and cyanobacteria show a very high density of these secondary metabolite BGCs. The facultative symbiotic, N2-fixing model organism N. punctiforme PCC73102 is a terrestrial type IV cyanobacterium that not only dedicates are very large fraction of its genome to secondary metabolite production but is also amenable to genetic modification. AntiSMASH analysis of the genome showed that there are sixteen potential secondary metabolite BGCs encoded in N. punctiforme, but until now there were only two compounds assigned to their respective BGC leaving the remaining fourteen orphan. This makes the organism a perfect subject for the establishment of a novel combinatorial genomic mining approach for the detection of new natural products. In the course of this study a combinatorial approach of genomic mining, independent monitoring techniques and alteration of cultivation conditions lead to new insights in cyanobacterial natural product biosynthesis and ultimately to the description of a novel compound produced by N. punctiforme. With the generation and investigation of a reporter strain library consisting of CFP-producing transcriptional reporter mutants for every predicted secondary metabolite BGC of N. punctiforme, it could be shown that natural product expression is in fact not silent for all those BGCs where no compound can be detected. Instead several distinct expression patterns could be described highlighting that secondary metabolite production is under tight regulation and only a minor fraction of these BGCs is in fact silent under standard laboratory conditions. Furthermore, increasing light intensity and carbon dioxide availability and cultivating N. punctiforme to very high cell densities had a tremendous impact on the overall metabolic activity of the organism. Investigation of high density cultivated cell extracts ultimately lead to the detection of a so far undescribed set of microviridins with unusual extended peptide sequences named Microviridin N3 – N9. Both cultivation of the transcriptional reporter mutants as well as RTqPCR-based detection of secondary metabolite BGC transcription levels revealed that in fact 50% of N. punctiforme’s natural product BGCs are upregulated under high cell density conditions. In contrast to this very broad response, co-cultivation of N. punctiforme in chemical or physical contact with a N-deprived host plant (Blasia pusilla) lead to a very specific upregulation of two natural product BGCs, namely RIPP3 and RIPP4. Although this response could be confirmed by various independent monitoring techniques and heavy analytical efforts were spent, no compound could be assigned to either of these BGCs. This study is the first in-depth systematic investigation of a cyanobacterial secondary metabolome by a combinatorial approach of genome mining and independent monitoring techniques that can serve as a new strategic approach to gain further insight into natural product synthesis of various organisms. Although there are single well described examples of secondary metabolites like the cell differentiation factor PatS in Anabaena sp. strain PCC 7120, the level and extent of regulation observed in this study is unprecedented and understanding of these mechanisms might be the key to streamline natural product discovery. However, the results of this study also highlight that induction of secondary metabolite BGCs is not the real challenge. Instead the new insights point towards analytical issues being a severe hurdle and finding reliable strategies to overcome these problems might as well drive natural product discovery. T2 - Entwicklung von Konzepten für das Genomic Mining von neuartigen Sekundärmetaboliten in symbiotischen Cyanobakterien KW - Cyanobacteria KW - Cyanobakterien KW - Natural Products KW - Naturstoffe KW - Genomic Mining KW - Secondary Metabolites KW - Sekundärmetabolite KW - Nostoc punctiforme Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-478342 ER - TY - THES A1 - Folkertsma, Remco T1 - Evolutionary adaptation to climate in microtine mammals N2 - Understanding how organisms adapt to their local environment is a major focus of evolutionary biology. Local adaptation occurs when the forces of divergent natural selection are strong enough compared to the action of other evolutionary forces. An improved understanding of the genetic basis of local adaptation can inform about the evolutionary processes in populations and is of major importance because of its relevance to altered selection pressures due to climate change. So far, most insights have been gained by studying model organisms, but our understanding about the genetic basis of local adaptation in wild populations of species with little genomic resources is still limited. With the work presented in this thesis I therefore set out to provide insights into the genetic basis of local adaptation in populations of two voles species: the common vole (Microtus arvalis) and the bank vole (Myodes glareolus). Both voles species are small mammals, they have a high evolutionary potential compared to their dispersal capabilities and are thus likely to show genetic responses to local conditions, moreover, they have a wide distribution in which they experience a broad range of different environmental conditions, this makes them an ideal species to study local adaptation. The first study focused on producing a novel mitochondrial genome to facilitate further research in M. arvalis. To this end, I generated the first mitochondrial genome of M. arvalis using shotgun sequencing and an iterative mapping approach. This was subsequently used in a phylogenetic analysis that produced novel insights into the phylogenetic relationships of the Arvicolinae. The following two studies then focused on the genetic basis of local adaptation using ddRAD-sequencing data and genome scan methods. The first of these involved sequencing the genomic DNA of individuals from three low-altitude and three high-altitude M. arvalis study sites in the Swiss Alps. High-altitude environments with their low temperatures and low levels of oxygen (hypoxia) pose considerable challenges for small mammals. With their small body size and proportional large body surface they have to sustain high rates of aerobic metabolism to support thermogenesis and locomotion, which can be restricted with only limited levels of oxygen available. To generate insights into high-altitude adaptation I identified a large number of single nucleotide polymorphisms (SNPs). These data were first used to identify high levels of differentiation between study sites and a clear pattern of population structure, in line with a signal of isolation by distance. Using genome scan methods, I then identified signals of selection associated with differences in altitude in genes with functions related to oxygen transport into tissue and genes related to aerobic metabolic pathways. This indicates that hypoxia is an important selection pressure driving local adaptation at high altitude in M. arvalis. A number of these genes were linked with high-altitude adaptation in other species before, which lead to the suggestion that high-altitude populations of several species have evolved in a similar manner as a response to the unique conditions at high altitude The next study also involved the genetic basis of local adaptation, here I provided insights into climate-related adaptation in M. glareolus across its European distribution. Climate is an important environmental factor affecting the physiology of all organisms. In this study I identified a large number of SNPs in individuals from twelve M. glareolus populations distributed across Europe. I used these, to first establish that populations are highly differentiated and found a strong pattern of population structure with signal of isolation by distance. I then employed genome scan methods to identify candidate loci showing signals of selection associated with climate, with a particular emphasis on polygenic loci. A multivariate analysis was used to determine that temperature was the most important climate variable responsible for adaptive genetic variation among all variables tested. By using novel methods and genome annotation of related species I identified the function of genes of candidate loci. This showed that genes under selection have functions related to energy homeostasis and immune processes. Suggesting that M. glareolus populations have evolved in response to local temperature and specific local pathogenic selection pressures. The studies presented in this thesis provide evidence for the genetic basis of local adaptation in two vole species across different environmental gradients, suggesting that the identified genes are involved in local adaptation. This demonstrates that with the help of novel methods the study of wild populations, which often have little genomic resources available, can provide unique insights into evolutionary processes. N2 - Ein Schwerpunkt der Evolutionsbiologie besteht darin, zu verstehen, wie sich Organismen an ihre lokale Umgebung anpassen. Lokale Anpassung tritt ein, wenn die Kräfte der divergierenden natürlichen Selektion im Vergleich zu anderen evolutionären Kräften stark genug sind. Ein verbessertes Verständnis der genetischen Grundlagen der lokalen Anpassung kann Informationen über die Evolutionsprozesse in Populationen liefern und ist durch seine Relevanz für durch den Klimawandel bedingte veränderte Selektionsdrücke von großer Bedeutung. Bisher wurden die meisten Erkenntnisse durch Untersuchungen an Modellorganismen gewonnen. Jedoch ist das Verständnis der genetischen Grundlagen der lokalen Anpassung in Wildpopulationen von Arten mit geringen genomischen Ressourcen noch immer begrenzt. Mit den in dieser Doktorarbeit vorgestellten Untersuchungen war es daher mein Ziel, Einblicke in die genetischen Grundlagen der lokalen Anpassung in Populationen von zwei Wühlmausarten zu geben: der Feldmaus (Microtus arvalis) und der Rötelmaus (Myodes glareolus). Bei beiden handelt es sich um kleine Säugetiere mit einem, im Vergleich zu ihrer Ausbreitungsfähigkeit, hohen Evolutionspotential. Daher ist anzunehmen, dass sie genetische Reaktionen auf lokale Bedingungen zeigen. Hinzu kommt, dass sie aufgrund ihrer großen Verbreitung ein großes Spektrum an verschiedenen Umweltbedingungen erfahren, was sie zu einer idealen Spezies, für die Untersuchung lokaler Anpassung macht. Die erste Studie dieser Arbeit konzentrierte sich auf die Erstellung eines bisher nicht verfügbaren mitochondriellen Genoms, um die weitere Forschung an M. arvalis zu erleichtern. Dies wurde mittels Shotgun-Sequenzierung und eines iterativen Kartierungsansatzes erreicht. Anschließend wurde es in einer phylogenetischen Analyse verwendet, die neue Erkenntnisse über die phylogenetischen Beziehungen der Arvicolinae lieferte. Die folgenden zwei Studien konzentrierten sich auf die genetische Basis der lokalen Anpassung unter Verwendung von ddRAD-Sequenzierungsdaten und Genom-Scan-Methoden. Die erste umfasste die Sequenzierung der genomischen DNA von Individuen aus drei M. arvalis-Untersuchungsgebieten in geringer Höhe und drei in großer Höhe in den Schweizer Alpen. Umgebungen in großer Höhe mit niedrigen Temperaturen und niedrigem Sauerstoffgehalt (Hypoxie) stellen kleine Säugetiere vor erhebliche Herausforderungen. Aufgrund ihrer geringen Körpergröße und proportional großen Körperoberfläche müssen sie hohe aerobe Stoffwechselraten aufrechterhalten, um die Thermogenese und Fortbewegung zu unterstützen, die mit begrenzter Sauerstoffverfügbarkeit eingeschränkt sein können. Um Einblicke in die Höhenanpassung zu erhalten, habe ich eine große Anzahl von Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs) identifiziert. Mit Hilfe dieser Daten wurden ein hohes Maß an Differenzierung zwischen den Untersuchungsorten und ein klares Muster der Populationsstruktur zusammen mit einem isolation-by-distance Signal identifiziert. Unter Verwendung von Genom-Scan-Methoden identifizierte ich Selektionssignale in Genen, die mit Höhenunterschieden verbunden werden. Diese besitzen Funktionen, die mit dem Sauerstofftransport in das Gewebe sowie mit aeroben Stoffwechselwegen zusammenhängen. Dies weist darauf hin, dass Hypoxie ein wichtiger Selektionsdruck für die lokale Anpassung in großer Höhe für M. arvalis ist. Einige dieser Gene sind bereits früher mit der Höhenanpassung bei anderen Arten in Verbindung gebracht worden. Dies führte zu der Annahme, dass sich Populationen in großer Höhe lebender verschiedener Arten in Anpassung an die einzigartigen Bedingungen in großer Höhe auf ähnliche Weise entwickelt haben. Die nächste Studie befasste sich ebenfalls mit den genetischen Grundlagen der lokalen Anpassung. Hier stellte ich Erkenntnisse über die klimabedingte Anpassung von M. glareolus in ihrem europäischen Verbreitungsgebiet vor. Das Klima ist ein wichtiger Umweltfaktor, der die Physiologie aller Organismen beeinflusst. In dieser Studie identifizierte ich zehntausende SNPs bei Individuen aus zwölf in ganz Europa verteilten M. glareolus-Populationen. Diese ergaben eine starke Differenzierung der Populationen mit deutlicher Populationsstruktur und einem Signal für isolation-by-distance. Anschließend verwendete ich Genom-Scan-Methoden, um mögliche Loci zu identifizieren, die mit dem Klima verbundene Selektionssignale aufweisen, wobei der Schwerpunkt dabei auf polygenen Loci lag. Eine Multivariaten Analysemethode ermittelte, dass die Temperatur die wichtigste Klimavariable unter allen getesteten Variablen ist, die für die adaptive genetische Variation verantwortlich ist. Mit Hilfe neuartiger Methoden und der Annotation von Genomen verwandter Spezies identifizierte ich die Funktion von Genen an Kandidatenloci. Diese zeigten, dass die unter Selektion stehenden Gene Funktionen im Zusammenhang mit der Energiehomöostase und den Immunprozessen ausüben. Dies wiederum deutet darauf hin, dass sich die Populationen von M. glareolus in Reaktion auf die lokale Temperatur und den spezifischen lokalen Selektionsdruck für Krankheitserreger entwickelt haben. Die in dieser Arbeit vorgestellten Studien liefern Belege für die genetische Basis der lokalen Anpassung auf verschiedene Umweltgradienten in zwei Wühlmausarten. Dies deutet darauf hin, dass die identifizierten Gene an der lokalen Anpassung beteiligt sind. Darüber hinaus zeigt dies, dass Untersuchungen wildlebender Populationen mit geringen genomischen Ressourcen durch den Einsatz neuartiger Methoden einzigartige Einblicke in evolutionäre Prozesse ermöglichen können. T2 - Evolutionäre Klimaanpassungen bei Wühlmausarten KW - Genomics KW - Local adaptation KW - Altitude KW - Climate KW - Microtus arvalis KW - Myodus glareolus KW - Höhe KW - Klima KW - Genomik KW - lokale Anpassung KW - Feldmaus KW - Rötelmaus Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-476807 ER - TY - THES A1 - Fontana, Federica T1 - Antagonistic activities of Vegfr3/Flt4 and Notch1b fine-tune mechanosensitive signaling during zebrafish cardiac valvulogenesis N2 - Cardiac valves are essential for the continuous and unidirectional flow of blood throughout the body. During embryonic development, their formation is strictly connected to the mechanical forces exerted by blood flow. The endocardium that lines the interior of the heart is a specialized endothelial tissue and is highly sensitive to fluid shear stress. Endocardial cells harbor a signal transduction machinery required for the translation of these forces into biochemical signaling, which strongly impacts cardiac morphogenesis and physiology. To date, we lack a solid understanding on the mechanisms by which endocardial cells sense the dynamic mechanical stimuli and how they trigger different cellular responses. In the zebrafish embryo, endocardial cells at the atrioventricular canal respond to blood flow by rearranging from a monolayer to a double-layer, composed of a luminal cell population subjected to blood flow and an abluminal one that is not exposed to it. These early morphological changes lead to the formation of an immature valve leaflet. While previous studies mainly focused on genes that are positively regulated by shear stress, the mechanisms regulating cell behaviors and fates in cells that lack the stimulus of blood flow are largely unknown. One key discovery of my work is that the flow-sensitive Notch receptor and Krüppel-like factor (Klf) 2, one of the best characterized flow-regulated transcriptional factors, are activated by shear stress but that they function in two parallel signal transduction pathways. Each of these two pathways is essential for the rearrangement of atrioventricular cells into an immature double-layered valve leaflets. A second key discovery of my study is the finding that both Notch and Klf2 signaling negatively regulate the expression of the angiogenesis receptor Vegfr3/Flt4, which becomes restricted to abluminal endocardial cells of the valve leaflet. Within these cells, Flt4 downregulates the expressions of the cell adhesion proteins Alcam and VE-cadherin. A loss of Flt4 causes abluminal endocardial cells to ectopically express Notch, which is normally restricted to luminal cells, and impairs valve morphology. My study suggests that abluminal endocardial cells that do not experience mechanical stimuli loose Notch expression and this triggers expression of Flt4. In turn, Flt4 negatively regulates Notch on the abluminal side of the valve leaflet. These antagonistic signaling activities and fine-tuned gene regulatory mechanisms ultimately shape cardiac valve leaflets by inducing unique differences in the fates of endocardial cells. N2 - Herzklappen sind essentiell für den kontinuierlichen und gerichteten Blutfluss durch den Körper. Während der Embryonalentwicklung ist die Bildung der Herzklappen stark von vom Blutfluss generierten, mechanischen Kräften abhängig. Das Endokard, ein endotheliales Gewebe, das das Herz im Inneren auskleidet, reagiert sehr sensibel auf biomechanische Einwirkungen. Endokardzellen weisen eine Signaltransduktionsmaschinerie auf, welche die Umwandlung dieser Kräfte in biochemische und elektrische Signale ermöglicht und somit unverzichtbar für die Herzmorphogenese und -physiologie ist. Allerdings fehlt uns noch immer das Verständnis der Mechanismen, mit denen Endokardzellen dynamische, biomechanische Signale wahrnehmen und wie verschiedene zelluläre Antworten ausgelöst werden können. Im Zebrafischembryo reagieren Endokardzellen im atrioventrikulärem Kanal auf Blutfluss induzierte Schubspannung mit einer Umorganisation, wobei sich aus einer Einzelschicht an Zellen eine Doppelschicht bildet. Letztere besteht aus einer luminalen Zellpopulation, die dem Blutstrom ausgesetzt ist und einer abluminalen Population, der der Kontakt zum Blut fehlt. Diese initialen morphologischen Veränderungen führen zur Ausbildung des frühen Herzklappensegels. Bisherige Studien berichteten im Besonderen über Gene die positiv von einer veränderten Schubspannung in Endokardzellen reguliert werden. Allerdings sind die Mechanismen, die das Verhalten und die Spezifizierung von den Zellen regulieren, die nicht in Kontakt mit dem Blutfluss sind, weitgehend unbekannt. Eine meiner Schlüsselentdeckungen in dieser Arbeit ist, dass zwei der am besten charakterisierten, durch Blutfluss transkriptional regulierten Faktoren, der Notch Rezeptor und der Krüppel-like factor (Klf) 2, durch Schubspannung aktiviert werden. Dies funktioniert auf zwei parallelen mechanosensitiven Signaltransduktionswegen und beide Kaskaden sind essentiell für die Umorganisation der atrioventrikulären Zellen während der Bildung der frühen zweischichtigen Klappensegeln. Eine zweite wichtige Entdeckung meiner Studien ist, dass die Expression des angiogenen Faktors Vegfr3/Flt4, die auf abluminale Endokardzellen im frühen Klappensegel beschränk ist, von beiden Signalwegen, Notch und KLf2, negativ reguliert wird. Außerdem veringert Flt4 die Expression der Zelladhäsionsproteine Alcam und VE-cadherin in abluminalen Zellen und führt die Herzklappenmorphogenese herbei. Der Verlust von Flt4 wiederum führt zu einer ektopischen Expression von Notch in abluminalen Endokardzellen, welche sonst nur in luminalen Zellen auftritt. Daher zeigt meine Arbeit, dass abluminale Endokardzellen, die keinem mechanischem Reiz ausgesetzt sind, Notch herunterregulieren und damit die Expression von Flt4 auslösen. Flt4 wiederum blockiert dann zusätzlich den Notch Signalweg in dieser Zellpopulation. Diese antagonistischen Signalaktivitäten und fein abgestimmte Genregulationsmechanismen sorgen für Unterschiede in der Spezifizierung der Endokardzellen und formen so schließlich die Segelklappen im Herz. KW - heart development KW - cardiac valves KW - zebrafish KW - mechanosensation KW - Herzklappe KW - Herzentwicklung KW - Mechanosensation KW - Zebrafisch Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-487517 ER - TY - THES A1 - Ghandour, Rabea T1 - Identification of chloroplast translational feedback regulation and establishment of aptamer based mRNA purification to unravel involved regulatory factors N2 - After endosymbiosis, chloroplasts lost most of their genome. Many former endosymbiotic genes are now nucleus-encoded and the products are re-imported post-translationally. Consequently, photosynthetic complexes are built of nucleus- and plastid-encoded subunits in a well-defined stoichiometry. In Chlamydomonas, the translation of chloroplast-encoded photosynthetic core subunits is feedback-regulated by the assembly state of the complexes they reside in. This process is called Control by Epistasy of Synthesis (CES) and enables the efficient production of photosynthetic core subunits in stoichiometric amounts. In chloroplasts of embryophytes, only Rubisco subunits have been shown to be feedback-regulated. That opens the question if there is additional CES regulation in embryophytes. I analyzed chloroplast gene expression in tobacco and Arabidopsis mutants with assembly defects for each photosynthetic complex to broadly answer this question. My results (i) confirmed CES within Rubisco and hint to potential translational feedback regulation in the synthesis of (ii) cytochrome b6f (Cyt b6f) and (iii) photosystem II (PSII) subunits. This work suggests a CES network in PSII that links psbD, psbA, psbB, psbE, and potentially psbH expression by a feedback mechanism that at least partially differs from that described in Chlamydomonas. Intriguingly, in the Cyt b6f complex, a positive feedback regulation that coordinates the synthesis of PetA and PetB was observed, which was not previously reported in Chlamydomonas. No evidence for CES interactions was found in the expression of NDH and ATP synthase subunits of embryophytes. Altogether, this work provides solid evidence for novel assembly-dependent feedback regulation mechanisms controlling the expression of photosynthetic genes in chloroplasts of embryophytes. In order to obtain a comprehensive inventory of the rbcL and psbA RNA-binding proteomes (including factors that regulate their expression, especially factors involved in CES), an aptamer based affinity purification method was adapted and refined for the specific purification these transcripts from tobacco chloroplasts. To this end, three different aptamers (MS2, Sephadex ,and streptavidin binding) were stably introduced into the 3’ UTRs of psbA and rbcL by chloroplast transformation. RNA aptamer based purification and subsequent chip analysis (RAP Chip) demonstrated a strong enrichment of psbA and rbcL transcripts and currently, ongoing mass spectrometry analyses shall reveal potential regulatory factors. Furthermore, the suborganellar localization of MS2 tagged psbA and rbcL transcripts was analyzed by a combined affinity, immunology, and electron microscopy approach and demonstrated the potential of aptamer tags for the examination of the spatial distribution of chloroplast transcripts. N2 - Nach der Endosymbiose wurde der größte Teil des Chloroplastengenoms in das Kerngenom transferiert. Die entsprechenden Genprodukte werden posttranslational wieder in die Chloroplasten importiert. Dementsprechend sind photosynthetische Proteinkomplexe aus plastidär- und kernkodierten Untereinheiten in definierter Stöchiometrie zusammengesetzt. In der einzelligen Grünalge Chlamydomonas ist die Translation von chloroplastenkodierten photosynthetischen Untereinheiten durch einen Rückkopplungsmechanismus in Abhängigkeit vom Assemblierungsstatus der entsprechenden Komplexe reguliert. Dieser „Control by Epistasy of Synthesis“ (CES) genannte Mechanismus erlaubt die effiziente Synthese von photosynthetischen Untereinheiten in den stöchiometrischen Mengen, die für die Assemblierung der Komplexe benötigt werden. In den Chloroplasten der Embryophyten wurde bisher nur die Translation von Rubisco als CES reguliert beschrieben. Daher stellt sich die Frage, ob derartige CES-Regulationen in Embryophyten auch in anderen Photosynthesekomplexen stattfinden. Um diese Frage zu beantworten, habe ich die chloroplastidäre Genexpression in Tabak- und Arabidopsismutanten mit Defekten in der Assemblierung photosynthetischer Komplexe untersucht. Meine Ergebnisse bestätigen (i) die bekannte CES Regulation von Rubisco und zeigen mögliche weitere assemblierungsabhängige Rückkopplungsregulationen in der Synthese des (ii) Cytochrom b6f (Cyt b6f) Komplexes sowie des (iii) Photosystems II (PSII). Insbesondere weisen meine Ergebnisse auf ein CES-Netzwerk hin, welches die Expressionen von psbD, psbA, psbB, psbE und wahrscheinlich auch psbH steuert und teilweise von der beschriebenen linearen CES-Kaskade in Chlamydomonas abweicht. Für die Synthese des Cyt b6f Komplexes wurde zudem eine positive Feedback-Regulation der Untereinheiten PetA und PetB beobachtet, die in Chlamydomonas nicht gezeigt wurde. Dagegen wurden für die NDH- und ATP Synthase-Komplexe keine Hinweise auf CES-Regulation in Embryophyten gefunden. Zusammenfassend zeigen meine Ergebnisse klare Belege für bisher unbekannte CES-Regulationen, welche die Expression von photosynthetischen Genen in Embryophyten steuern. Um das mRNA-Protein-Interaktom von rbcL und psbA zu bestimmen (einschließlich Faktoren, welche CES regulieren), wurde eine aptamer-basierte Affinitätsreinigungsmethode für die Anreicherung dieser Transkripte aus Tabakchloroplasten adaptiert und optimiert. Dazu wurden mittels Chloroplasten¬transformation drei verschiedene Aptamere (MS2, Sephadex- und Streptavidin-bindende Aptamere) stabil in den 3’UTR der Transkripte integriert. Die aptamer-basierte RNA-Aufreinigung und anschließende Chip-Analyse (RAP-Chip) zeigte die spezifische Anreicherung der psbA- bzw. rbcL-Transkripte. Die aktuell ausgeführte Massenspektrometrie zur Analyse der transkriptgebundenen Proteine soll potenziell regulatorische Faktoren identifizieren. Des Weiteren wurde die Lokalisation der MS2-markierten psbA- und rbcL-Transkripte innerhalb des Chloroplasten mittels Affinitäts¬immunologie und Elektronenmikroskopie untersucht und dabei gezeigt, dass die Aptamer-Markierung geeignet ist, um die Transkriptverteilung innerhalb von Organellen zu untersuchen. T2 - Identifikation translationaler Rückkopplungsregulationen in Chloroplasten und Etablierung einer aptamer-basierten mRNA-Anreicherungsmethode zur Entschlüsselung der beteiligten regulatorischen Faktoren KW - Translation KW - Ribosome profiling KW - Chloroplast gene expression KW - Translation feedback regulation KW - Protein complex assembly KW - Aptamers KW - Chloroplasten-Genexpression KW - Ribosome profiling KW - Proteinkomplexassemblierung KW - Translation KW - Translationsfeedbackregulation KW - Aptamer Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-482896 ER - TY - THES A1 - Hoelscher, Matthijs Pieter T1 - The production of antimicrobial polypeptides in chloroplasts N2 - Plants are an attractive platform for the production of medicinal compounds because of their potential to generate large amounts of biomass cheaply. The use of chloroplast transformation is an attractive way to achieve the recombinant production of proteins in plants, because of the chloroplasts’ high capacity to produce foreign proteins in comparison to nuclear transformed plants. In this thesis, the production of two different types of antimicrobial polypeptides in chloroplasts is explored. The first example is the production of the potent HIV entry inhibitor griffithsin. Griffithsin has the potential to prevent HIV infections by blocking the entry of the virus into human cells. Here the use of transplastomic plants as an inexpensive production method for griffithsin was explored. Transplastomic plants grew healthily and were able to accumulate griffithsin to up to 5% of the total soluble protein. Griffithsin could easily be purified from tobacco leaf tissue and had a similarly high neutralization activity as griffithsin recombinantly produced in bacteria. Griffithsin could be purified from dried tobacco leaves, demonstrating that dried leaves could be used as a storable starting material for griffithsin purification, circumventing the need for immediate purification after harvest. The second example is the production of antimicrobial peptides (AMPs) that have the capacity to kill bacteria and are an attractive alternative to currently used antibiotics that are increasingly becoming ineffective. The production of antimicrobial peptides was considerably more challenging than the production of griffithsin. Small AMPs are prone to degradation in plastids. This problem was overcome by fusing AMPs to generate larger polypeptides. In one approach, AMPs were fused to each other to increase size and combine the mode of action of multiple AMPs. This improved the accumulation of AMPs but also resulted in impaired plant growth. This was solved by the use of two different inducible systems, which could largely restore plant growth. Fusions of multiple AMPs were insoluble and could not be purified. In addition to fusing AMPs to each other, the fusion of AMPs to small ubiquitin-like modifier (SUMO), was tested as an approach to improve the accumulation, facilitate purification, and reduce the toxicity of AMPs to chloroplasts. Fusion of AMPs to SUMO indeed increased accumulation while reducing the toxicity to the plants. SUMO fusions produced inside chloroplasts could be purified, and SUMO could be efficiently cleaved off with the SUMO protease. Such fusions therefore provide a promising strategy for the production of AMPs and other small polypeptides inside chloroplasts. KW - plastid transformation KW - Nicotiana tabacum KW - HIV KW - AIDS KW - antiviral agent KW - micorbicide KW - Griffithsin KW - chloroplast KW - antimicrobial peptide KW - AMP KW - recombinant production KW - transgenic KW - SUMO KW - inducible expression KW - anti bacterial KW - protein fusion KW - polypeptide KW - peptide KW - plant KW - molecular farming Y1 - 2020 ER - TY - THES A1 - Irmscher, Tobias T1 - Enzymatic remodelling of the exopolysaccharide stewartan network BT - implications for the diffusion of nano-sized objects BT - Implikationen für die Diffusion von nanogroßen Objekte N2 - In nature, bacteria are found to reside in multicellular communities encased in self-produced extracellular matrices. Indeed, biofilms are the default lifestyle of the bacteria which cause persistent infections in humans. The biofilm assembly protects bacterial cells from desiccation and limits the effectiveness of antimicrobial treatments. A myriad of biomolecules in the extracellular matrix, including proteins, exopolysaccharides, lipids, extracellular DNA and other, form a dense and viscoelastic three dimensional network. Many studies emphasized that a destabilization of the mechanical integrity of biofilm architectures potentially eliminates the protective shield and renders bacteria more susceptible to the immune system and antibiotics. Pantoea stewartii is a plant pathogen which infects monocotyledons such as maize and sweet corn. These bacteria produce dense biofilms in the xylem of infected plants which cause wilting of plants and crops. Stewartan is an exopolysaccharide which is produced by Pantoea stewartii and secreted as the major component to the extracellular matrix. It consists of heptasaccharide repeating units with a high degree of polymerization (2-4 MDa). In this work, the physicochemical properties of stewartan were investigated to understand the contributions of this exopolysaccharide to the mechanical integrity and cohesiveness of Pantoea stewartii biofilms. Therefore, a coarse-grained model of stewartan was developed with computational techniques to obtain a model for its three dimensional structural features. Here, coarse-grained molecular dynamic simulations revealed that the exopolysaccharide forms a hydrogel in which the exopolysaccharide chains arrange into a three dimensional mesh-like network. Simulations at different concentrations were used to investigate the influence of the water content on the network formation. Stewartan was further purified from 72 h grown Pantoea stewartii biofilms and the diffusion of bacteriophage and differently-sized nanoparticles (which ranged from 1.1 to 193 nm diameter) was analyzed in reconstituted stewartan solutions. Fluorescence correlation spectroscopy and single-particle tracking revealed that the stewartan network impeded the mobility of a set of differently-sized fluorescent particles in a size-dependent manner. Diffusion of these particles became more anomalous, as characterized by fitting the diffusion data to an anomalous diffusion model, with increasing stewartan concentrations. Further bulk and microrheological experiments were used to analyze the transitions in stewartan fluid behavior and stewartan chain entanglements were described. Moreover, it was noticed, that a small fraction of bacteriophage particles was trapped in small-sized pores deviating from classical random walks which highlighted the structural heterogeneity of the stewartan network. Additionally, the mobility of fluorescent particles also depended on the charge of the stewartan exopolysaccharide and a model of a molecular sieve for the stewartan network was proposed. The here reported structural features of the stewartan polymers were used to provide a detailed description of the mechanical properties of typically glycan-based biofilms such as the one from Pantoea stewartii. In addition, the mechanical properties of the biofilm architecture are permanently sensed by the embedded bacteria and enzymatic modifications of the extracellular matrix take place to address environmental cues. Hence, in this work the influence of enzymatic degradation of the stewartan exopolysaccharides on the overall exopolysaccharide network structure was analyzed to describe relevant physiological processes in Pantoea stewartii biofilms. Here, the stewartan hydrolysis kinetics of the tailspike protein from the ΦEa1h bacteriophage, which is naturally found to infect Pantoea stewartii cells, was compared to WceF. The latter protein is expressed from the Pantoea stewartii stewartan biosynthesis gene cluster wce I-III. The degradation of stewartan by the ΦEa1h tailspike protein was shown to be much faster than the hydrolysis kinetics of WceF, although both enzymes cleaved the β D GalIII(1→3)-α-D-GalI glycosidic linkage from the stewartan backbone. Oligosaccharide fragments which were produced during the stewartan cleavage, were analyzed in size-exclusion chromatography and capillary electrophoresis. Bioinformatic studies and the analysis of a WceF crystal structure revealed a remarkably high structural similarity of both proteins thus unveiling WceF as a bacterial tailspike-like protein. As a consequence, WceF might play a role in stewartan chain length control in Pantoea stewartii biofilms. N2 - In der Natur lagern sich Bakterien zu großen und komplexen Gemeinschaften zusammen, die als Biofilme bezeichnet werden. Diese multizellulären Biofilme sind der Ursprung vieler langlebiger und gefährlicher Infektionskrankheiten. Die bakteriellen Zellen produzieren und umgeben sich mit einen biofilm-spezifischen Schleim, der aus einer Unzahl von Biomolekülen, wie z.B. Exopolysaccharide, Lipide und extrazelluläre DNA, besteht. Diese Biofilmarchitektur schützt Bakterien vor Austrocknung und begrenzen die Wirksamkeit von antimikrobiellen Wirkstoffen (z.B. Antibiotika). Viele Studien haben gezeigt, dass die Destabilisierung der mechanischen Festigkeit des Biofilmapparates eine neue Behandlungsstrategie darstellt, in der das bakterielle Schutzschild eliminiert wird, sodass die Zellen wieder anfälliger gegenüber dem menschlichen Immunsystem oder Antibiotika werden. Pantoea stewartii ist ein Pflanzenpathogen, welches Mais und Süßmais befällt. Diese Bakterien produzieren Biofilme im Inneren der Pflanze, sodass der freie Wassertransport gestört wird. Daraufhin verwelken die Blätter und Früchte. In dieser Arbeit wurde das Exopolysaccharid Stewartan untersucht, welches lange Ketten ausbildet und als häufigste Komponente in den Biofilmen von Pantoea stewartii vorkommt. Dabei wurden die mechanischen Eigenschaften von Stewartan untersucht, um zu verstehen, wie diese den Biofilm beeinflussen. Dafür wurde eine Lösung aus mehreren Stewartan Molekülen computergestützt simuliert. Hierbei konnte beobachtet werden, dass die Stewartan Ketten ein dreidimensionales Netzwerk ausbilden, welches Poren aufweist. Außerdem wurde Stewartan aus Pantoea stewartii Biofilmen isoliert und die Diffusion von verschieden großen Nanopartikeln in dem Exopolysaccharidnetzwerk untersucht. Je höher die Stewartankonzentration war, desto mehr wurde die Diffusion der Nanopartikeln abgebremst. Außerdem wurden große Partikel stärker von dem Netzwerk zurückgehalten. Diese Untersuchungen wurden auf die Diffusion von Bakteriophagen, das sind Viren, die spezifisch Bakterien infizieren, ausgeweitet. Infolgedessen wurde gezeigt, dass Bakteriophagen in kleine Stewartanporen feststecken können. Die Diffusion all dieser Partikeln war aber auch abhängig von der Oberflächenladung des Partikels. Folglich bildet Stewartan ein Netzwerk aus, welches ganz spezifisch den Transport von Molekülen mit bestimmten Eigenschaften unterbindet. Außerdem ist bekannt, dass die Bakterien in der Lage sind, die mechanischen Eigenschaften des Biofilms zu modulieren, um sie an Veränderungen in der Umgebung anzupassen. Dies geschieht über bakterielle Enzyme. Daher wurde in dieser Arbeit der enzymatische Abbau von Stewartan untersucht, der eine dramatische Änderung der Eigenschaften des Biofilms zufolge haben kann. Dabei wurde die Stewartan Spaltung durch das Enzym WceF untersucht, welches von Pantoea stewartii produziert wird. Dieses Enzym spaltete die Stewartanketten nur sehr langsamen, sodass das Stewartannetzwerk erhalten blieb. Die Ergebnisse wurden mit dem tailspike Protein verglichen, welches von dem ΦEa1h Bakteriophagen produziert wird, dem natürlichen Feind des Bakteriums. Im Gegensatz zu WceF, baute das tailspike Protein Stewartan deutlich schneller ab und die gesamte mechanische Festigkeit des Netzwerkes wurde beseitigt. Beide Enzyme, trotz der unterschiedlichen Aktivität, besitzen eine sehr ähnliche Struktur, was vermuten lässt, dass sie von einem gleichen Vorgängerprotein abstammen. In dieser Arbeit wird vorgeschlagen, dass WceF möglicherweise in der Kettenlängekontrolle von Stewartan involviert ist. T2 - Enzymatische Remodellierung des Exopolysaccharid-Stewartan-Netzwerkes KW - biofilm KW - Pantoea stewartii KW - stewartan KW - exopolysaccharide KW - coarse grained molecular dynamics KW - microviscosity KW - Mikroviskosität KW - coarse grained Molekulardynamiken Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-472486 ER - TY - THES A1 - Jing, Yue T1 - Characterization of Serine Carboxypeptidase-like (SCPL) gene family in Brassicaceae Y1 - 2020 ER - TY - THES A1 - Kožul, Danijela T1 - Systematic identification of loci determining chloroplast and nuclear genome incompatibility in the evening primrose (Oenothera) Y1 - 2020 ER - TY - THES A1 - Kubis, Armin T1 - Synthetic carbon neutral photorespiration bypasses BT - implementation and testing in Escherichia coli N2 - With populations growing worldwide and climate change threatening food production there is an urgent need to find ways to ensure food security. Increasing carbon fixation rate in plants is a promising approach to boost crop yields. The carbon-fixing enzyme Rubisco catalyzes, beside the carboxylation reaction, also an oxygenation reaction that generates glycolate-2P, which needs to be recycled via a metabolic route termed photorespiration. Photorespiration dissipates energy and most importantly releases previously fixed CO2, thus significantly lowering carbon fixation rate and yield. Engineering plants to omit photorespiratory CO2 release is the goal of the FutureAgriculture consortium and this thesis is part of this collaboration. The consortium aims to establish alternative glycolate-2P recycling routes that do not release CO2. Ultimately, they are expected to increase carbon fixation rates and crop yields. Natural and novel reactions, which require enzyme engineering, were considered in the pathway design process. Here I describe the engineering of two pathways, the arabinose-5P and the erythrulose shunt. They were designed to recycle glycolate-2P via glycolaldehyde into a sugar phosphate and thereby reassimilate glycolate-2P to the Calvin cycle. I used Escherichia coli gene deletion strains to validate and characterize the activity of both synthetic shunts. The strains’ auxotrophies can be alleviated by the activity of the synthetic route, thus providing a direct way to select for pathway activity. I introduced all pathway components to these dedicated selection strains and discovered inhibitions, limitations and metabolic cross talk interfering with pathway activity. After resolving these issues, I was able to show the in vivo activity of all pathway components and combine them into functional modules.. Specifically, I demonstrate the activity of a new-to-nature module of glycolate reduction to glycolaldehyde. Also, I successfully show a new glycolaldehyde assimilation route via arabinose-5P to ribulose-5P. In addition, all necessary enzymes for glycolaldehyde assimilation via L-erythrulose were shown to be active and an L-threitol assimilation route via L-erythrulose was established in E. coli. On their own, these findings demonstrate the power of using an easily engineerable microbe to test novel pathways; combined, they will form the basis for implementing photorespiration bypasses in plants. KW - Synthetic Biology KW - Photorespiration KW - Metabolic Engineering KW - Escherichia coli Y1 - 2020 ER - TY - THES A1 - Küken, Anika T1 - Predictions from constraint-based approaches including enzyme kinetics N2 - The metabolic state of an organism reflects the entire phenotype that is jointly affected by genetic and environmental changes. Due to the complexity of metabolism, system-level modelling approaches have become indispensable tools to obtain new insights into biological functions. In particular, simulation and analysis of metabolic networks using constraint-based modelling approaches have helped the analysis of metabolic fluxes. However, despite ongoing improvements in prediction of reaction flux through a system, approaches to directly predict metabolite concentrations from large-scale metabolic networks remain elusive. In this thesis, we present a computational approach for inferring concentration ranges from genome-scale metabolic models endowed with mass action kinetics. The findings specify a molecular mechanism underling facile control of concentration ranges for components in large-scale metabolic networks. Most importantly, an extended version of the approach can be used to predict concentration ranges without knowledge of kinetic parameters, provided measurements of concentrations in a reference state. We show that the approach is applicable with large-scale kinetic and stoichiometric metabolic models of organisms from different kingdoms of life. By challenging the predictions of concentration ranges in the genome-scale metabolic network of Escherichia coli with real-world data sets, we further demonstrate the prediction power and limitations of the approach. To predict concentration ranges in other species, e.g. model plant species Arabidopsis thaliana, we would rely on estimates of kinetic parameters (i.e. enzyme catalytic rates) since plant-specific enzyme catalytic rates are poorly documented. Using the constraint-based approach of Davidi et al. for estimation of enzyme catalytic rates, we obtain values for 168 plant enzymes. The approach depends on quantitative proteomics data and flux estimates obtained from constraint-based model of plant leaf metabolism integrating maximal rates of selected enzymes, plant-specific constraints on fluxes through canonical pathways, and growth measurements from Arabidopsis thaliana rosette under ten conditions. We demonstrate a low degree of plant enzyme saturation, supported by the agreement between concentrations of nicotinamide adenine dinucleotide, adenosine triphosphate, and glyceraldehyde 3-phosphate, based on our maximal in vivo catalytic rates, and available quantitative metabolomics data. Hence, our results show genome-wide estimation for plant-specific enzyme catalytic rates is feasible. These can now be readily employed to study resource allocation, to predict enzyme and metabolite concentrations using recent constrained-based modelling approaches. Constraint-based methods do not directly account for kinetic mechanisms and corresponding parameters. Therefore, a number of workflows have already been proposed to approximate reaction kinetics and to parameterize genome-scale kinetic models. We present a systems biology strategy to build a fully parameterized large-scale model of Chlamydomonas reinhardtii accounting for microcompartmentalization in the chloroplast stroma. Eukaryotic algae comprise a microcompartment, the pyrenoid, essential for the carbon concentrating mechanism (CCM) that improves their photosynthetic performance. Since the experimental study of the effects of microcompartmentation on metabolic pathways is challenging, we employ our model to investigate compartmentation of fluxes through the Calvin-Benson cycle between pyrenoid and stroma. Our model predicts that ribulose-1,5-bisphosphate, the substrate of Rubisco, and 3-phosphoglycerate, its product, diffuse in and out of the pyrenoid. We also find that there is no major diffusional barrier to metabolic flux between the pyrenoid and stroma. Therefore, our computational approach represents a stepping stone towards understanding of microcompartmentalized CCM in other organisms. This thesis provides novel strategies to use genome-scale metabolic networks to predict and integrate metabolite concentrations. Therefore, the presented approaches represent an important step in broadening the applicability of large-scale metabolic models to a range of biotechnological and medical applications. N2 - Der Stoffwechsel eines Organismus spiegelt den gesamten Phänotyp wieder, welcher durch genetische und umweltbedingte Veränderungen beeinflusst wird. Aufgrund der Komplexität des Stoffwechsels sind Modellierungsansätze, welche das ganzheitliches System betrachten, zu unverzichtbaren Instrumenten geworden, um neue Einblicke in biologische Funktionen zu erhalten. Insbesondere die Simulation und Analyse von Stoffwechselnetzwerken mithilfe von Constraint-basierten Modellierungsansätzen hat die Analyse von Stoffwechselflüssen erleichtert. Trotz kontinuierlicher Verbesserungen bei der Vorhersage des Reaktionsflusses durch ein System, sind Ansätze zur direkten Vorhersage von Metabolitkonzentrationen aus metabolischen Netzwerken kaum vorhanden. In dieser Arbeit stellen wir einen Ansatz vor, mit welchem Konzentrationsbereiche aus genomweiten metabolischen Netzwerken, die mit einer Massenwirkungskinetik ausgestattet sind, abgeleitet werden können. Die Ergebnisse zeigen einen molekularen Mechanismus auf, welcher der Steuerung von Konzentrationsbereichen für Komponenten in metabolischen Netzwerken zugrunde liegt. Eine erweiterte Version des Ansatzes kann verwendet werden, um Konzentrationsbereiche ohne Kenntnis der kinetischen Parameter vorherzusagen, vorausgesetzt, dass Messungen von Konzentrationen in einem Referenzzustand vorhanden sind. Wir zeigen, dass der Ansatz mit kinetischen und stöchiometrischen Stoffwechselmodellen von Organismen aus verschiedenen taxonomischen Reichen anwendbar ist. Indem wir die Vorhersagen von Konzentrationsbereichen im genomweiten Stoffwechselnetzwerk von Escherichia coli mit realen Datensätzen validieren, demonstrieren wir die Vorhersagekraft und die Grenzen des Ansatzes. Um Konzentrationsbereiche in anderen Spezies vorherzusagen, z.B. der Modellpflanzenspezies Arabidopsis thaliana, stützen wir uns auf Schätzungen der kinetischen Parameter (d.h. der katalytischen Enzymraten), da tatsächlich gemessene, pflanzenspezifische katalytische Enzymraten nur unzureichend dokumentiert sind. Unter Verwendung des Constraint-basierten Ansatzes von Davidi et al. zur Abschätzung der katalytischen Enzymraten erhalten wir Werte für 168 pflanzliche Enzyme. Der Ansatz hängt von quantitativen Proteomikdaten und Schätzungen des Reaktionsflusses ab, die aus einem Constraint-basierten Modell des Pflanzenblattmetabolismus unter Einbeziehung der maximalen Raten ausgewählter Enzyme, pflanzenspezifischen Einschränkungen des Flusses durch kanonische Pfade und Wachstumsmessungen aus Rosetten von Arabidopsis thaliana unter zehn Bedingungen erhalten wurden. Wir fanden einen niedrigen Grad an Sättigung der Pflanzenenzyme, der durch die Übereinstimmung zwischen den Konzentrationen von Nicotinamidadenindinukleotid, Adenosintriphosphat und Glycerinaldehyd-3-phosphat auf der Grundlage unserer maximalen in vivo katalytischen Raten und den verfügbaren quantitativen Metabolomikdaten gestützt wird. Daher zeigen unsere Ergebnisse, dass genomweite Schätzungen für pflanzenspezifische Enzymkatalyseraten möglich sind. Diese können nun leicht verwendet werden, um die Ressourcenzuweisung zu untersuchen und die Enzym- und Metabolitenkonzentrationen unter Verwendung neuerer Constraint-basierter Modellierungsansätze vorherzusagen. Constraint-basierte Methoden berücksichtigen kinetische Mechanismen und entsprechende Parameter nicht direkt. Daher wurden einige Methoden entwickelt, welche die Reaktionskinetik approximieren und systemumfassende kinetische Modelle zu parametrisieren. Wir präsentieren eine systembiologische Strategie zur Erstellung eines vollständig parametrisierten Modells von Chlamydomonas reinhardtii, welches die Mikrokompartimentierung im Chloroplaststroma berücksichtigt. Eukaryotische Algen besitzen ein Mikrokompartiment, den Pyrenoiden, der für den Kohlenstoffkonzentrationsmechanismus (KKM) unerlässlich ist und die Photosyntheseleistung verbessert. Die experimentelle Untersuchung der Auswirkungen der Mikrokompartimentierung auf Stoffwechselwege stellt eine Herausforderung dar. Daher verwenden wir unser Modell um die Kompartimentierung von Reaktionsflüssen durch den Calvin-Benson-Zyklus zwischen Pyrenoid und Stroma zu untersuchen. Unser Modell sagt voraus, dass Ribulose-1,5-Bisphosphat, das Substrat von Rubisco, und 3-Phosphoglycerat , das Produkt, in den Pyrenoid hinein und aus ihm heraus diffundieren. Weiter stellen wir fest, dass es keine wesentliche Diffusionsbarriere zwischen dem Pyrenoid und dem Stroma gibt. Somit bietet unser Ansatz eine Möglichkeit um ein Verständnis des mikrokompartimentierten KKM auch in anderen Organismen zu erlangen. Diese Dissertation zeigt neue Strategien um metabolische Netzwerke zur Vorhersage von Metabolitkonzentrationen zu nutzen und selbige zu integrieren. Daher stellen die Ansätze einen wichtigen Schritt zur Anwendbarkeit von genomweiten Stoffwechselmodellen auf eine Reihe von biotechnologischen und medizinischen Anwendungen dar. KW - constraint-based modeling KW - metabolism KW - metabolic networks Y1 - 2020 ER - TY - THES A1 - Liu, Qi T1 - Influence of CO2 degassing on microbial community distribution and activity in the Hartoušov degassing system, western Eger Rift (Czech Republic) N2 - The Cheb Basin (CZ) is a shallow Neogene intracontinental basin located in the western Eger Rift. The Cheb Basin is characterized by active seismicity and diffuse degassing of mantle-derived CO2 in mofette fields. Within the Cheb Basin, the Hartoušov mofette field shows a daily CO2 flux of 23–97 tons. More than 99% of CO2 released over an area of 0.35 km2. Seismic active periods have been observed in 2000 and 2014 in the Hartoušov mofette field. Due to the active geodynamic processes, the Cheb Basin is considered to be an ideal region for the continental deep biosphere research focussing on the interaction of biological processes with geological processes. To study the influence of CO2 degassing on microbial community in the surface and subsurface environments, two 3-m shallow drillings and a 108.5-m deep scientific drilling were conducted in 2015 and 2016 respectively. Additionally, the fluid retrieved from the deep drilling borehole was also recovered. The different ecosystems were compared regarding their geochemical properties, microbial abundances, and microbial community structures. The geochemistry of the mofette is characterized by low pH, high TOC, and sulfate contents while the subsurface environment shows a neutral pH, and various TOC and sulfate contents in different lithological settings. Striking differences in the microbial community highlight the substantial impact of elevated CO2 concentrations and high saline groundwater on microbial processes. In general, the microorganisms had low abundance in the deep subsurface sediment compared with the shallow mofette. However, within the mofette and the deep subsurface sediment, the abundance of microbes does not show a typical decrease with depth, indicating that the uprising CO2-rich groundwater has a strong influence on the microbial communities via providing sufficient substrate for anaerobic chemolithoautotrophic microorganisms. Illumina MiSeq sequencing of the 16S rRNA genes and multivariate statistics reveals that the pH strongly influences the microbial community composition in the mofette, while the subsurface microbial community is significantly influenced by the groundwater which motivated by the degassing CO2. Acidophilic microorganisms show a much higher relative abundance in the mofette. Meanwhile, the OTUs assigned to family Comamonadaceae are the dominant taxa which characterize the subsurface communities. Additionally, taxa involved in sulfur cycling characterizing the microbial communities in both mofette and CO2 dominated subsurface environments. Another investigated important geo–bio interaction is the influence of the seismic activity. During seismic events, released H2 may serve as the electron donor for microbial hydrogenotrophic processes, such as methanogenesis. To determine whether the seismic events can potentially trigger methanogenesis by the elevated geogenic H2 concentration, we performed laboratory simulation experiments with sediments retrieved from the drillings. The simulation results indicate that after the addition of hydrogen, substantial amounts of methane were produced in incubated mofette sediments and deep subsurface sediments. The methanogenic hydrogenotrophic genera Methanobacterium was highly enriched during the incubation. The modeling of the in-situ observation of the earthquake swarm period in 2000 at the Novy Kostel focal area/Czech Republic and our laboratory simulation experiments reveals a close relation between seismic activities and microbial methane production via earthquake-induced H2 release. We thus conclude that H2 – which is released during seismic activity – can potentially trigger methanogenic activity in the deep subsurface. Based on this conclusion, we further hypothesize that the hydrogenotrophic early life on Earth was boosted by the Late Heavy Bombardment induced seismic activity in approximately 4.2 to 3.8 Ga. N2 - Das Eger-Becken (CZ) ist ein flaches, intrakontinentales neogenes Becken im westlichen Eger-Graben. Das Eger-Becken zeichnet sich durch aktive Seismizität und die diffuse Entgasung von aus dem Mantel stammenden CO2 in Mofettenfeldern aus. Das Mofettenfeld von Hartoušov weist einen täglichen CO2-Fluss von 23-97 Tonnen auf. Mehr als 99% des CO2 werden auf einer Fläche von 0,35 km2 freigesetzt. Im Untersuchungsgebiet wurden in den Jahren 2000 und 2014 seismisch aktive Perioden beobachtet. Aufgrund der aktiven geodynamischen Prozesse gilt das Egerer Becken als ideale Region für die kontinentale Tiefenbiosphärenforschung, die sich auf die Wechselwirkung von biologischen Prozessen mit geologischen Prozessen konzentriert. Zur Untersuchung des Einflusses der CO2-Entgasung auf die mikrobielle Gemeinschaft in der ober- und unterirdischen Umwelt wurden 2015 und 2016 zwei 3 m tiefe Flachbohrungen und eine 108,5 m tiefe wissenschaftliche Bohrung durchgeführt. Zusätzlich wurde auch aus dem Tiefbohrloch Flüssigkeit gewonnen. Die verschiedenen Ökosysteme wurden hinsichtlich ihrer geochemischen Eigenschaften, der mikrobiellen Abundanzen und der mikrobiellen Gemeinschaftsstrukturen verglichen. Die Geochemie der Mofetten zeichnet sich durch einen niedrigen pH-Wert und hohe TOC- und Sulfatgehalte aus, während das unterirdische Milieu einen neutralen pH-Wert und verschiedene TOC- und Sulfatgehalte in unterschiedlichen lithologischen Umgebungen aufweist. Auffällige Unterschiede in der mikrobiellen Gemeinschaft unterstreichen den erheblichen Einfluss erhöhter CO2-Konzentrationen und stark salzhaltigen Grundwassers auf mikrobielle Prozesse. Generell waren die mikrobiellen Abundanzen in dem tiefen Untergrundsediment im Vergleich zur flachen Mofette gering. Innerhalb der Mofette und des tiefen unterirdischen Sediments zeigt die Häufigkeit der Mikroorganismen jedoch keine typische Abnahme mit der Tiefe, was darauf hinweist, dass das aufsteigende CO2-reiche Grundwasser einen starken Einfluss auf die mikrobiellen Gemeinschaften hat, indem es genügend Substrat für anaerobe chemolithoautotrophe Mikroorganismen bietet. Die Illumina-MiSeq-Sequenzierung der 16S rRNA-Gene und die multivariate Statistik zeigen, dass der pH-Wert die Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft in der Mofette signifikant bestimmt, während die unterirdische mikrobielle Gemeinschaft signifikant vom Grundwasser beeinflusst wird, das durch das ausgasende CO2 geprägt ist. Azidophile Mikroorganismen zeigen eine viel höhere relative Abundanz in der Mofette, wohingegen die der Familie Comamonadaceae zugeordneten OTUs die dominierenden Taxa der unterirdischen Gemeinschaften darstellen. Zusätzlich charakterisieren Taxa, die am Schwefelzyklus beteiligt sind, die mikrobiellen Gemeinschaften sowohl in der Mofette als auch in der CO2-dominierten unterirdischen Umwelt. Eine weitere wichtige Untersuchung der Geo-Bio-Interaktion ist der Einfluss der seismischen Aktivität. Während seismischer Ereignisse kann freigesetztes H2 als Elektronendonator für mikrobielle hydrogenotrophe Prozesse, wie z.B. die Methanogenese, dienen. Um zu bestimmen, ob die seismischen Ereignisse durch die erhöhten geogenen H2-Konzentrationen möglicherweise methanogene Prozesse auslösen können, führten wir Laborsimulationsexperimente mit Sedimenten durch, die aus den Bohrungen gewonnen wurden. Die Simulationsexperimente weisen darauf hin, dass nach der Zugabe von Wasserstoff beträchtliche Mengen an Methan in inkubierten Mofettensedimenten und tiefen unterirdischen Sedimenten produziert wurden. Die methanogene hydrogenotrophe Gattung Methanobacterium wurde während der Inkubation stark angereichert. Die Modellierung der in-situ-Beobachtung der Erdbeben-Schwarmzeit im Jahr 2000 im Schwerpunktgebiet Novy Kostel/Tschechische Republik und unsere Laborsimulationsexperimente zeigen einen engen Zusammenhang zwischen seismischen Aktivitäten und der biotischen Methanproduktion durch erdbebeninduzierte H2-Freisetzung. Wir kommen daher zu dem Schluss, dass H2 - dass bei seismischer Aktivität freigesetzt wird - möglicherweise methanogene Aktivität im tiefen Untergrund auslösen kann. Basierend auf dieser Schlussfolgerung gehen wir weiter davon aus, dass das frühe hydrogenotrophe Leben, durch die durch Late Heavy Bombardment induzierte seismische Aktivität in etwa 4,2 bis 3,8 Ga verstärkt wurde. T2 - Einfluss der CO2-Entgasung auf die Verteilung und Aktivität der mikrobiellen Gemeinschaft im Hartoušov-Entgasungssystem im westlichen Eger-Graben (Tschechische Republik) KW - CO2 degassing KW - western Eger Rift KW - microbial community KW - microbial activity KW - earthquake KW - seismic activity KW - deep biosphere KW - CO2-Entgasung KW - tiefe Biosphäre KW - Erdbeben KW - mikrobielle Aktivität KW - mikrobielle Gemeinschaft KW - seismische Aktivität KW - westlichen Eger-Graben Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-475341 ER - TY - THES A1 - Mavrothalassiti, Eleni T1 - A.thaliana root and shoot single-cell transcriptomes and detection of mobile transcripts Y1 - 2020 ER - TY - THES A1 - Mitzscherling, Julia T1 - Microbial communities in submarine permafrost and their response to permafrost degradation and warming N2 - The Arctic region is especially impacted by global warming as temperatures in high latitude regions have increased and are predicted to further rise at levels above the global average. This is crucial to Arctic soils and the shallow shelves of the Arctic Ocean as they are underlain by permafrost. Perennially frozen ground is a habitat for a large number and great diversity of viable microorganisms, which can remain active even under freezing conditions. Warming and thawing of permafrost makes trapped soil organic carbon more accessible to microorganisms. They can transform it to the greenhouse gases carbon dioxide, methane and nitrous oxide. On the other hand, it is assumed that thawing of the frozen ground stimulates microbial activity and carbon turnover. This can lead to a positive feedback loop of warming and greenhouse gas release. Submarine permafrost covers most areas of the Siberian Arctic Shelf and contains a large though unquantified carbon pool. However, submarine permafrost is not only affected by changes in the thermal regime but by drastic changes in the geochemical composition as it formed under terrestrial conditions and was inundated by Holocene sea level rise and coastal erosion. Seawater infiltration into permafrost sediments resulted in an increase of the pore water salinity and, thus, in thawing of permafrost in the upper sediment layers even at subzero temperatures. The permafrost below, which was not affected by seawater, remained ice-bonded, but warmed through seawater heat fluxes. The objective of this thesis was to study microbial communities in submarine permafrost with a focus on their response to seawater influence and long-term warming using a combined approach of molecular biological and physicochemical analyses. The microbial abundance, community composition and structure as well as the diversity were investigated in drill cores from two locations in the Laptev Sea, which were subjected to submarine conditions for centuries to millennia. The microbial abundance was measured through total cell counts and copy numbers of the 16S rRNA gene and of functional genes. The latter comprised genes which are indicative for methane production (mcrA) and sulfate reduction (dsrB). The microbial community was characterized by high-throughput-sequencing of the 16S rRNA gene. Physicochemical analyses included the determination of the pore water geochemical and stable isotopic composition, which were used to describe the degree of seawater influence. One major outcome of the thesis is that the submarine permafrost stratified into different so-called pore water units centuries as well as millennia after inundation: (i) sediments that were mixed with seafloor sediments, (ii) sediments that were infiltrated with seawater, and (iii) sediments that were unaffected by seawater. This stratification was reflected in the submarine permafrost microbial community composition only millennia after inundation but not on time-scales of centuries. Changes in the community composition as well as abundance were used as a measure for microbial activity and the microbial response to changing thermal and geochemical conditions. The results were discussed in the context of permafrost temperature, pore water composition, paleo-climatic proxies and sediment age. The combination of permafrost warming and increasing salinity as well as permafrost warming alone resulted in a disturbance of the microbial communities at least on time-scales of centuries. This was expressed by a loss of microbial abundance and bacterial diversity. At the same time, the bacterial community of seawater unaffected but warmed permafrost was mainly determined by environmental and climatic conditions at the time of sediment deposition. A stimulating effect of warming was observed only in seawater unaffected permafrost after millennia-scale inundation, visible through increased microbial abundance and reduced amounts of substrate. Despite submarine exposure for centuries to millennia, the community of bacteria in submarine permafrost still generally resembled the community of terrestrial permafrost. It was dominated by phyla like Actinobacteria, Chloroflexi, Firmicutes, Gemmatimonadetes and Proteobacteria, which can be active under freezing conditions. Moreover, the archaeal communities of both study sites were found to harbor high abundances of marine and terrestrial anaerobic methane oxidizing archaea (ANME). Results also suggested ANME populations to be active under in situ conditions at subzero temperatures. Modeling showed that potential anaerobic oxidation of methane (AOM) could mitigate the release of almost all stored or microbially produced methane from thawing submarine permafrost. Based on the findings presented in this thesis, permafrost warming and thawing under submarine conditions as well as permafrost warming without thaw are supposed to have marginal effects on the microbial abundance and community composition, and therefore likely also on carbon mobilization and the formation of methane. Thawing under submarine conditions even stimulates AOM and thus mitigates the release of methane. N2 - Die globale Erwärmung beeinträchtigt die Arktische Region besonders stark. Im Vergleich zum globalen Mittel sind die Temperaturen in den hohen Breitengraden am stärksten gestiegen und werden voraussichtlich auch weiterhin am stärksten ansteigen. Das ist äußerst kritisch, da arktische Böden und die flachen Schelfgebiete des Arktischen Ozeans von Permafrost geprägt sind. Dieser mehrjährig gefrorene Boden ist ein Habitat für eine große Anzahl und Diversität von Mikroorganismen, die lebensfähig sind und auch unter gefrorenen Bedingungen aktiv sein können. Einerseits machen eine Erwärmung und das Tauen des Permafrosts gespeicherten organischen Kohlenstoff zugänglicher für die Mikroorganismen. Diese können den Kohlenstoff in die Treibhausgase Kohlenstoffdioxid, Methan und Distickstoffoxid umwandeln. Andererseits stimuliert das Tauen des gefrorenen Bodens die mikrobielle Aktivität und den Kohlenstoffumsatz. Das kann zu einem sich verstärkenden Rückkopplungsprozess aus Erwärmung und Freisetzung von Treibhausgasen führen. Submariner Permafrost umfasst den größten Teil des Ostsibirischen Arktisschelfs und enthält ein großes, wenn auch nicht quantifiziertes Kohlenstoffreservoir. Der submarine Permafrost wird jedoch nicht nur durch Veränderungen des Wärmehaushalts beeinflusst, sondern auch durch drastische Veränderungen in der geochemischen Zusammensetzung. Durch den holozänen Meeresspiegelanstieg und durch Küstenerosion wurde der unter terrestrischen Bedingungen gebildete Permafrost überflutet. Ein Eindringen von Meerwasser führte in den Permafrostsedimenten zu einem Anstieg der Porenwasser-Salinität und dadurch zum Tauen des Permafrosts in den oberen Schichten, sogar bei Temperaturen unter 0 °C. Tiefer liegende Permafrostsedimente, die (noch) nicht vom Meerwasser beeinflusst wurden, blieben eis-gebunden, aber begannen sich durch den Wärmestrom des Meerwassers zu erwärmen. Das Ziel dieser Dissertation war es, die mikrobiellen Gemeinschaften in submarinem Permafrost zu untersuchen. Der Fokus lag dabei auf der Reaktion der Gemeinschaften auf den Einfluss des Meerwassers und die Langzeiterwärmung. Die Arbeit nutzt dafür einen kombinierten Ansatz aus molekularbiologischen und physikochemischen Analysen. Die mikrobielle Abundanz, Gemeinschaftszusammensetzung und -struktur sowie die Diversität wurden in Sedimentbohrkernen zweier Standorte in der Laptew See untersucht, welche seit Jahrhunderten bis Jahrtausenden submarinen Bedingungen ausgesetzt waren. Die mikrobielle Abundanz wurde mit Hilfe von Zellzahlen und Kopienzahlen des 16S rRNA Gens sowie funktioneller Gene bestimmt, die kennzeichnend für die Methanproduktion (mcrA) und Sulfatreduktion (dsrB) sind. Die mikrobielle Gemeinschaft wurde mit Hilfe der Hochdurchsatz-Sequenzierung des 16S rRNA Gens charakterisiert. Physikochemische Analysen beinhalteten die Untersuchung der geochemischen Zusammensetzung der Porenwassers und der stabilen Wasserisotopen. Beide Zusammensetzungen wurden genutzt, um den Grad des Meerwassereinflusses auf die Permafrostsedimente zu beschreiben. Ein Hauptergebnis der Arbeit ist, dass sich submariner Permafrost sowohl nach Jahrhunderten als auch nach Jahrtausenden der Überflutung in verschiedene Schichten, sogenannte Porenwassereinheiten, unterteilen lässt: (i) Sedimente, die sich mit dem Meeresboden vermischt haben, (ii) Sedimente, die vom Meerwasser infiltriert wurden und (iii) Sedimente, die vom Meerwasser unbeeinflusst sind. Diese Schichtenbildung spiegelt sich erst nach jahrtausendelanger Überflutung auch in der mikrobiellen Gemeinschaftszusammensetzung wider, nicht jedoch nach Jahrhunderten. Änderungen sowohl in der Gemeinschaftszusammensetzung als auch in der Abundanz wurden als Maß für mikrobielle Aktivität und die mikrobielle Reaktion auf die sich ändernden thermischen und geochemischen Bedingungen genutzt. Die Ergebnisse wurden im Kontext von Permafrosttemperatur, Porenwasserzusammensetzung, paleoklimatischen Proxys und dem Sedimentalter diskutiert. Die Kombination aus Permafrosterwärmung und steigender Salinität, sowie die Permafrosterwärmung allein, resultierten auf Zeitskalen von Jahrhunderten in einer Störung der mikrobiellen Gemeinschaft. Dies drückte sich durch einen Verlust der mikrobiellen Abundanz und der bakteriellen Diversität aus. Gleichzeitig wurde die bakterielle Gemeinschaft im vom Meerwasser unbeeinflussten, aber erwärmten Permafrost hauptsächlich durch die Umweltbedingungen und das Klima zur Zeit der Sedimentablagerung geprägt. Ein stimulierender Einfluss der Erwärmung konnte im vom Meerwasser unbeeinflussten Permafrost erst nach jahrtausendelanger Überflutung beobachtet werden. Dies wurde durch einen Anstieg in der mikrobiellen Abundanz und einer Abnahme der organischen Substrate sichtbar. Obwohl die bakteriellen Gemeinschaften des Permafrostes submarinen Bedingungen für Jahrhunderte bis Jahrtausende ausgesetzt waren, unterschieden sie sich kaum von den Gemeinschaften im terrestrischen Permafrost. Die Gemeinschaft des submarinen Permafrosts wurde von Phyla wie Actinobacteria, Chloroflexi, Firmicutes, Gemmatimonadetes und Proteobacteria dominiert, welche auch unter gefrorenen Bedingungen aktiv sein können. Darüber hinaus enthielten die archaellen Gemeinschaften an beiden Standorten eine hohe Anzahl von marinen und terrestrischen anaerob methan-oxidierenden Archaeen (ANME), bei denen eine Aktivität unter in situ Bedingungen bei Minusgraden angenommen wird. Eine Modellierung zeigte, dass die anaerobe Oxidation von Methan (AOM) potenziell fast die gesamte Menge des gespeicherten und mikrobiell produzierten Methans in tauendem submarinem Permafrost reduzieren könnte. Die Ergebnisse der Arbeit deuten darauf hin, dass das Tauen von Permafrost unter submarinen Bedingungen sowie eine Erwärmung ohne Tauen marginale Effekte auf die Abundanz und Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaften und somit wahrscheinlich auch auf die Mobilisierung von Kohlenstoff in Form von Methan hat. Das Tauen unter submarinen Bedingungen stimuliert sogar AOM und reduziert somit den Ausstoß von Methan. T2 - Mikrobielle Gemeinschaften in submarinem Permafrost and ihre Reaktion auf die Degradierung und Erwärmung des Permafrosts KW - Microbial communities KW - Subsea permafrost KW - Arctic KW - Mikrobielle Gemeinschaften KW - Submariner Permafrost KW - Arktis KW - Submarine permafrost KW - next generation sequencing KW - Hochdurchsatzsequenzierung KW - Permafrostdegradation KW - permafrost degradation Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-471240 ER -