TY - THES A1 - Schmidt, Ruth Maria T1 - Signalkaskaden und Steuermechanismen in den Speicheldrüsen von Dipteren T1 - Signalling pathways and control mechanisms in the salivary glands of Diptera N2 - Flüssigkeitssekretion und Proteinsekretion werden in Speicheldrüsen von Insekten über Hormone und Neurotransmitter gesteuert. Diese entfalten ihre physiologische Wirkung in den sekretorischen Drüsenzellen hauptsächlich über den zyklischen Adenosinmonophosphat (cAMP)-Signalweg und den Inositoltrisphosphat (IP3) / Ca2+-Signalweg. Die Mechanismen möglicher Wechselwirkungen zwischen diesen Signalwegen und ihre physiologischen Auswirkungen sind unzureichend bekannt. Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand die Frage, ob und wie sich der Ca2+-Signalweg und der cAMP-Signalweg in der Speicheldrüse der Diptere Calliphora vicina beeinflussen. Substanzen wie 5-Fluoro-α-Methyltryptamin und Histamin wurden in früheren Arbei-ten als Agonisten genutzt, um in den Speicheldrüsen von C. vicina selektiv den cAMP-Signalweg (getrennt vom IP3/Ca2+-Signalweg) zu aktivieren. Es zeigte sich in transepithelialen Potentialmessungen und mikrofluorometrischen Ca2+-Untersuchungen, dass beide Substanzen sowohl den cAMP-Weg als auch den Ca2+-Signalweg aktivierten. Die physiologischen Ursachen der Histamin-induzierten Ca2+-Erhöhung wurden genauer untersucht. Zusammengefasst zeigten diese Untersuchungen, dass Histamin wie 5-HT den cAMP-Weg und die Phosphoinositidkaskade aktivierte. Im Gegensatz zu den 5-HT-induzierten Ca2+-Oszillationen, welche durch interzelluläre Ca2+-Wellen synchronisiert werden, verursachte Histamin bei niedrigen Konzentrationen lokale Ca2+-Oszillationen in einzelnen Zellen (keine Wellen). Bei höheren Histamin-Konzentrationen war eine anhaltende Ca2+-Erhöhung oder ein synchrones Ca2+-beating in der gesamten Drüse zu beobachten. Des Weiteren wurde die Frage untersucht, ob eine Erhöhung der intrazellulären cAMP-Konzentration den IP3 Ca2+-Signalweg in den Epithelzellen der Speicheldrüse beeinflussen kann. Es zeigte sich, dass cAMP den durch schwellennahe 5-HT-Konzentrationen induzierten Ca2+-Anstieg verstärkte. Diese Verstärkung wurde durch eine PKA-vermittelte Sensitivierung des IP3-Rezeptor/Ca2+-Kanals für IP3 verursacht. Immunzytochemische Untersuchungen deuten dar-auf hin, dass die Proteinkinase A eng mit dem IP3-Rezeptor/Ca2+-Kanal assoziiert ist. Diese Messungen zeigen erstmals, dass auch bei Invertebraten der Botenstoff cAMP, PKA-vermittelt, den IP3-Rezeptor/Ca2+-Kanal des ER für IP3 sensitiviert. N2 - Fluid- and protein-secretion in the salivary glands of insects are controlled by hormones or neurotransmitters. These agonists activate two signalling cascades: the cAMP-pathway and the IP>sub>3/Ca-pathway. The functional crosstalk between these two signalling pathways is poorly understood. Functional crosstalk between cAMP-pathway and IP3/Ca2+-pathway was investigated in the salivary glands of the blowfly, Calliphora vicina. Histamine and 5-alpha-methyltryptamine were used in an attempt to activate the cAMP-pathway selectively, as suggested previously. By using transepithelial potential-measurements and microfluorometric Ca2+-imaging it was demonstrated that both substances activate the cAMP- and the IP3/Ca2+-pathway. The physiological effects of histamine were investigated in detail. These experiments show that histamine causes an intracellular Ca2+-elevation that, in some preparations exhibits oscillations with concentration-dependent frequencies. In contrast to 5-HT induced intracellular Ca2+-oscillations and propagating intercellular Ca2+-waves histamine produces local Ca2+-oscillations in single cells or synchronous Ca2+-beating in the whole gland. In addition the effects of increasing cAMP on the IP3/Ca2+-pathway in the salivary glands of the blowfly were studied. It could be demonstrated that cAMP augments the 5-HT-induced Ca2+-increase in glands stimulated with low doses of 5-HT. This potentiation is the result of a PKA-mediated sensitisation of the IP3-receptor/Ca2+-channel for IP3. Results of immunocytochemical analyses show that the PKA is spatially associated with the ER. These results show for the first time that in invertebrates as well as in vertebrates the second messenger cAMP sensitises the IP3-receptor/Ca2+-channel for IP3 by the action of a PKA. KW - Speichel KW - Speicheldrüse KW - Insekten KW - Calcium-Imaging KW - transepitheliales Potential KW - Signalkakaden KW - IP3 KW - cAMP KW - PKA KW - IP3-Rezeptor KW - salivary gland KW - blowfly KW - signalling pathways KW - IP3 KW - cyclic AMP KW - IP3-receptor Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-7714 ER - TY - THES A1 - Hille, Carsten T1 - Charakterisierung von Transportmechanismen in der Speicheldrüse der Schabe Periplaneta americana T1 - Characterisation of transport mechanisms in salivary glands of the cockroach Periplaneta americana N2 - Die Aktivierung der Speichelsekretion erfolgt in der innervierten Speicheldrüse der Schabe Periplaneta americana durch die biogenen Amine Dopamin (DA) und Serotonin (5-HT). Die Acini der Speicheldrüse sezernieren einen Primärspeichel, der in den Ausführgängen modifiziert wird. Die durch DA und 5-HT aktivierten Signalwege sowie die an der Elektrolyt- und Flüssigkeitssekretion bzw. Speichel-modifikation beteiligten Transportmechanismen sind weitgehend unbekannt. Mikrofluorometrische Ca2+-, Na+- und pH-Messungen in Kombination mit pharmakologischen Experimenten, biochemische Messungen der Aktivitäten von Ionentransport-ATPasen sowie videomikroskopische Analysen zu transepithelialen Wasserbewegungen wurden in dieser Arbeit durchgeführt. Sie sollten Informationen über die an der Speichelbildung und -modifikation beteiligten Transportmechanismen und die Signalwege liefern, welche durch DA und/oder 5-HT aktiviert werden. Wesentliche Ergebnisse dieser Arbeit waren:
  • Messungen des intrazellulären pH (pHi) in Gangzellen zeigten, dass isolierte Ausführgänge mit Acini bei Stimulierung mit DA und 5-HT stark ansäuerten. In isolierten Ausführgängen ohne Acini verursachte nur DA eine schwache Ansäuerung. Da nur die Ausführgänge dopaminerg innerviert sind, die Acini jedoch dopaminerg und serotonerg, zeigt dieses Ergebnis, dass die DA- und/oder 5-HT-induzierte Primärspeichelbildung die Ursache für die pHi-Änderungen in den Gangzellen ist. pHi-Messungen in den Gangzellen geben also auch Hinweise auf Transportvorgänge in den Acini.
  • Der Na+-K+-2Cl--Symporter und der Cl--HCO3--Antiporter, gekoppelt mit dem Na+ H+-Antiporter (NHE) waren an der NaCl-Aufnahme in die peripheren Zellen der Acini zur Bildung des NaCl-reichen Primärspeichels beteiligt. Die Aktivität dieser Transporter hing von der CO2/HCO3--Verfügbarkeit ab und war Ca2+-abhängig.
  • Die starke Ansäuerung in den Gangzellen hing nicht von der Aktivität der apikalen vakuolären Protonen-ATPase (V-H+-ATPase), aber von der Aktivität der basolateralen Na+-K+-ATPase ab, die anscheinend in den Ausführgängen die Speichelmodifikation energetisiert.
  • In isolierten Ausführgängen mit Acini waren die V-H+-ATPase und Na+-abhängige Transporter (u. a. NHE) an der Erholung von einer DA-induzierten oder einer NH4Cl-Vorpuls-induzierten Ansäuerung in den Gangzellen beteiligt. Bei der Regulation des pHi in unstimulierten Gangzellen spielten diese Transporter keine Rolle.
  • In isolierten Ausführgängen mit Acini induzierte DA in den Gangzellen einen Anstieg der [Na+]i und, zeitlich verzögert, auch der [Ca2+]i. Der [Na+]i-Anstieg war von der Aktivität der Acini abhängig und erfolgte möglicherweise über apikale Na+-Kanäle. Der [Ca2+]i-Anstieg war graduiert und tonisch. Der DA-induzierte [Na+]i-Anstieg in den Gangzellen und deren Depolarisation führten dazu, dass der basolaterale Na+-Ca2+-Antiporter in den Ca2+-Influx-Modus umkehrte. Die daraus resultierende tonische [Ca2+]i-Erhöhung könnte an der Regulation der Na+-Rückresorption beteiligt sein.
  • Zum Nachweis transepithelialer Flüssigkeitsbewegungen in isolierten Ausführgängen wurde eine videomikroskopische Methode entwickelt. Isolierte Ausführgänge ohne Acini resorbierten im unstimulierten Zustand Flüssigkeit aus dem Ausführganglumen. Möglicherweise sezernieren die Acini auch im unstimulierten Zustand mit geringerer Rate einen Primärspeichel, der in den Ausführgängen resorbiert wird. Die Resorption war ATP-abhängig. Der ATP-verbrauchende Transportmechanismus konnte nicht identifiziert werden. Weder die Na+-K+-ATPase noch die V-H+-ATPase waren an der Resorption beteiligt.
Diese Arbeit trug zur Kenntnis der komplexen Funktionsweise von Speicheldrüsen in Insekten bei und erweiterte das lückenhafte Wissen über die zellulären Wirkungen biogener Amine in Insekten. Zudem wurden in dieser Arbeit viele Parallelen zu Funktionsweisen der Speicheldrüsen in Vertebraten deutlich. N2 - The acinar salivary glands in the cockroach Periplaneta americana are innervated by dopaminergic and serotonergic fibers and secrete a NaCl-rich primary saliva upon stimulation with the biogenic amines dopamine (DA) or serotonin (5-HT). The ducts downstream of the acini are thought to modify the primary saliva by Na+ reabsorption and K+ secretion. The electrolyte and fluid transport processes activated by DA and 5-HT as well as the second messenger pathways mediating between the biogenic amine receptors and the effector transport mechanisms are poorly understood.In this sudy, microfluorometrical Ca2+, Na+ and pH measurements were performed in combination with pharmacological experiments. Furthermore, ATPase activity assays and microscopical analyses of transepithelial fluid transport were done. The aim of this work has been the characterisation of the DA-induced transport mechanisms in the cockroach salivary glands in order to improve our understanding of the cellular actions of biogenic amines in insects. Intracellular pH measurements in duct cells of isolated small lobes of salivary glands consiting of several acini and ducts showed a strong intracellular acidification upon DA or 5-HT stimulation. On the other hand, only a small intracellular acidification could be recognised in isolated ducts without acini. The acini are innervated by dopaminergic and serotonergic fibers, whereas the ducts are innervated only by dopaminergic fibers. Thus, this result demonstrates, that the DA- or 5-HT-induced production of primary saliva in the acini causes the intracellular pH changes in the ducts. Consequently, intracellular pH measurements in ducts are also useful to characterise transport processes in the acini. The Na+-K+-2Cl- cotransport and/or the Cl--HCO3- exchange combined with the Na+ H+ exchange (NHE) were responsible for the NaCl uptake at the basolateral membrane in the peripheral cells of the acini during production of primary saliva. The activity of these transporters was regulated by the CO2/HCO3--availability and was Ca2+-dependent. The activity of the basolateral Na+-K+-ATPase, but not of the apical vacuolar-type proton pump (V-H+-ATPase) in the duct cells was necessary for the strong intracellular acidification in the ducts with acini. Thus, the Na+-K+-ATPase seems to energise the saliva modification in the ducts. In ducts with acini, the V-H+-ATPase and Na+-dependent transporters (e.g. NHE) were responsible for the pH-recovery after a DA- or NH4Cl-induced intracellular acidification in the duct cells. In the regulation of the intracellular resting pH these transporters played a minor role. In addition, DA induced an increase in the intracellular Na+ concentration, followed by an increase in the intracellular Ca2+ concentration in duct cells with acini, but never in duct cells without acini. The Na+ elevation was probably the result of the activity of apical Na+ channels. The DA-induced Na+ elevation and a depolarisation of the basolateral membrane of the duct cells reversed a Na+-Ca2+ exchange activity into the reverse mode causing a graded Ca2+ elevation in duct cells. The Ca2+ elevation is probably involved in the regulation of the Na+ reabsorption during saliva modification. Transepithelial fluid transport in isolated ducts was detected with a fluorescent microscopical method. Already unstimulated isolated ducts reabsorbed fluid from the duct lumen to the bath side. Perhaps unstimulated acini possess a basic secretion rate and this primary saliva is than reabsorbed in the ducts. The fluid reabsorption was ATP-dependent, but the ATP-consuming transport mechanism could not be identified. Neither the basolateral Na+-K+-ATPase, nor the apical V-H+-ATPase were involved in fluid reabsorption. This work extends our knowledge about the complex function of insect salivary glands and about the cellular action of biogenic amines in insects. Additionally, it indicates lots of similarities between the functions of salivary glands in vertebrates and invertebrates. KW - Speicheldrüse KW - Amerikanische Schabe KW - Insekten KW - Speichel KW - epithelialer Transport KW - ratiometric imaging KW - Signalkaskaden KW - biogene Amine KW - Dopamin KW - Serotonin KW - salivary glands KW - epithelial transport KW - biogenic amines KW - dopamine KW - serotonin KW - cockroach KW - insects Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-9422 ER -