TY - THES A1 - Schewe, Bettina T1 - Räumliche und zeitliche Aspekte der intrazellulären pH-Regulation in Epithelien T1 - Spatial and temporal characteristics of intracellular pH-regulation in epithelial cells N2 - Die Speicheldrüsen der Schmeißfliege Calliphora vicina produzieren bei Stimulierung mit dem Neurohormon Serotonin (5-Hydroxytryptamine, 5-HT) einen KCl-reichen Primärspeichel. Der transepitheliale K+-Transport wird durch eine apikal lokalisierte vakuoläre H+-ATPase (V-ATPase) energetisiert. Stimulierung der Speicheldrüsen mit 5-HT aktiviert die apikale V-ATPase, die Protonen aus der Zelle in das Drüsenlumen transportiert. Trotz des auswärts gerichteten Protonentransportes führt die 5-HT-Stimulierung kurioserweise zu einer intrazellulären Ansäuerung. Die Ursachen dieser 5-HT-induzierten Ansäuerung waren unzureichend untersucht. Deshalb war das Ziel dieser Arbeit die Identifikation aller Transporter, die an der intrazellulären pH-(pHi)-Regulation in unstimulierten Speicheldrüsen von Calliphora vicina beteiligt sind und an der Entstehung und Regulation der 5-HT-induzierten pHi-Änderungen mitwirken. Von besonderem Interesse war hierbei die funktionelle Mitwirkung der V-ATPase, deren Beteiligung an der pHi-Regulation in tierischen Zellen bisher wenig untersucht war. Wesentliche Ergebnisse dieser Arbeit waren: • Messungen des pHi-Wertes in der unstimulierten Drüse zeigten, dass vor allem die V-ATPase und mindestens ein Na+-abhängiger HCO3--Transporter an der Aufrechterhaltung des Ruhe-pHi beteiligt sind. • Zur Wiederherstellung des Ruhe-pHi nach einer intrazellulären Ansäuerung (NH4Cl-Vorpuls) tragen ebenfalls im Wesentlichen die V-ATPase und mindestens ein Na+-abhängiger HCO3--Transporter bei. Der Na+/H+-Antiporter hat in der unstimulierten Drüse keinen messbaren Einfluss auf den Ruhe-pHi. • Die Wiederherstellung des Ruhe-pHi nach einer intrazellulären Alkalisierung (Na-acetat-Vorpuls) ist Cl--abhängig, aber auch unter extremen Bedingungen waren die Zellen noch in der Lage sich vollständig von einer intrazellullären Alkalisierung zu erholen. Einen entscheidenden Anteil daran hat offenbar die hohe intrazelluläre Pufferkapazität. • Ein Na+-abhängiger Glutamat-Transporter ist per se kein pHi-regulierender Transporter, seine Aktivität hat jedoch Einfluss auf den Ruhe-pHi in der unstimulierten Speicheldrüse von Calliphora vicina. • 10 nM 5-HT induzieren in den Calliphora Speicheldrüsen eine intrazelluläre Ansäuerung. An dieser Ansäuerung ist der Na+/H+-Antiporter entscheidend beteiligt. Auch eine klare Cl--Abhängigkeit der 5-HT-induzierten Ansäuerung konnte beobachtet werden. Wahrscheinlich ist eine gekoppelte Aktivität von Na+/H+-Antiporter und Cl-/HCO3--Antiporter. • Messungen mit einem O2-empfindlichen Fluoreszenzfarbstoff zeigten, dass Stimulierung der Speicheldrüsen mit 5-HT die Zellatmung aktivierte. Der cAMP- und der IP3/Ca2+-Weg tragen auf komplexe Weise zu der 5-HT-induzierten Aktivierung der Zellatmung und damit auch zu den 5-HT-induzierten pHi-Änderungen bei. • Mit molekularbiologischen Untersuchungen ist es gelungen den Na+-abhängigen Glutamat-Transporter, den Na+/H+-Antiporter, die Carboanhydrase und die Untereinheit C der V-ATPase in den Calliphora Speicheldrüsen direkt nachzuweisen. Zudem konnte erstmals der direkte Nachweis für die Expression eines nH+/K+-Antiporters in den Speicheldrüsen von Calliphora vicina erbracht werden. Diese Arbeit trug ganz wesentlich zum Verständnis der pHi-Regulation in der unstimulierten und stimulierten Speicheldrüse von Calliphora vicina bei. Mechanismen die zur Aufrechterhaltung und Wiederherstellung des Ruhe-pHi nach einer intrazellulären Ansäuerung bzw. Alkalisierung beitragen, konnten mit pHi-Messungen und auch molekularbiologisch nachgewiesen werden. Die Mechanismen, welche die 5-HT-induzierte intrazelluläre Ansäuerung verursachen, konnten ebenfalls aufgeklärt werden. Zudem wurde an den Calliphora Speicheldrüsen eine neue optische Methode zur Messung des O2-Verbrauchs in tierischen Geweben etabliert. N2 - The tubular salivary glands of the blowfly Calliphora vicina consist of a single layer of epithelial cells. Stimulation with the neurohormone serotonin (5-hydroxytryptamine,5-HT) induces the secretion of a KCl-rich primary saliva. Transepithelial K+-transport is energized by a vacuolar-type H+-ATPase (V-ATPase) which is located in the apical membrane. 5-HT stimulates the apical V-ATPase which transports protons out of the cells into the lumen of the glands. Despite this outward directed proton transport, 5-HT stimulation leads to an intracellular acidification. The causes of this intracellular acidification were poorly understood. Therefore the aim of this thesis was the identification of all pHi regulating transporters which are involved in pHi regulation in the unstimulated salivary glands of Calliphora vicina and which contribute to the 5-HT-induced pHi changes. Of special interest was the functional role of the V-ATPase,whose contribution to pHi regulation in animal cells is, as yet, not well studied. Key results were: • pHi measurements in unstimulated glands showed that mainly the V-ATPase and at least one Na+-dependent HCO3--transporter are involved in maintenance of resting pHi. • V-ATPase and at least one Na+-dependent HCO3--transporter are also necessary for the recovery from an intracellular acidification (NH4Cl prepulse). • Recovery from an intracellular alkali load (Na-acetate prepulse) is partially Cl--dependent. • A Na+ dependent gluatamate-transporter is present in Calliphora salivary glands and its activity affects the resting pHi. • 10 nM 5-HT induce an intracellular acidification. This acidification is Na+-dependent, EIPA-sensitive and also Cl--dependent. No DIDS-sensitivity was observed. A coupled activity of a Na+/H+-antiporter and a Cl-/HCO3- -antiporter was suggested. • Using O2-sensitive fluorescent microbeads I could show that 5-HT stimulation of the Calliphora salivary glands activates cellular respiration. The cAMP and Ca2+-signalling pathways contribute in a complex manner to the 5-HT-induced activation of cellular respiration and consequently, also to the 5-HT-induced intracellular acidification. • The expression of a Na+ dependent glutamate-transporter, a Na+/H+-antiporter, a carbonic anhydrase, subunit C of the V-ATPase and a nH+/K+-antiporter were determined on mRNA level by RT-PCR. This thesis contributes significantly to the understanding of pHi regulation in unstimulated and stimulated salivary glands of Calliphora vicina. Mechanisms which contribute to the maintenance and recovery of resting pHi were identified by using pHi measurements and molecular biological techniques. Mechanisms which are responsible for the 5-HT-induced intracellular acidification were also clarified. Furthermore a new optical method for measuring O2 consumption in animals cells was established by using the Calliphora salivary glands as a model. KW - pH-Regulation KW - V-ATPase KW - Speichelsekretion KW - Epithelien KW - Calliphora KW - pH-regulation KW - V-ATPase KW - saliva secretion KW - epithelia KW - Calliphora Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-26879 ER - TY - THES A1 - Voß, Martin T1 - Regulation der vakuolären H(+)-ATPase durch reversible Proteinphosphorylierung T1 - Regulation of the vacuolar H(+)-ATPase by reversible protein phosphorylation N2 - Die vakuoläre Protonen-ATPase, kurz V-ATPase, ist ein multimerer Enzymkomplex, der in fast jeder eukaryotischen Zelle zu finden ist und den aktiven elektrogenen Transport von Protonen über Membranen katalysiert. Die Aktivität der V-ATPase ist essentiell für eine Vielzahl physiologischer Prozesse. Ein grundlegender Mechanismus zur Regulation der V-ATPase-Aktivität ist die reversible Dissoziation des Holoenzyms in den integralen VO-Komplex, der als Protonenkanal dient, und den cytosolischen V1-Komplex, der ATP hydrolysiert und somit den Protonentransport energetisiert. Die Untereinheit C, die im dissoziierten Zustand der V-ATPase als einzige Untereinheit isoliert im Cytoplasma vorliegt, scheint bei der Bildung des aktiven Holoenzyms eine Schlüsselrolle zu übernehmen. In den Speicheldrüsen der Schmeißfliege Calliphora vicina ist die V-ATPase an der Speichelsekretion beteiligt. In den sekretorischen Zellen wird die Bildung des V-ATPase-Holoenzyms in der apikalen Plasmamembran durch das Neurohormon Serotonin (5-HT) stimuliert. Der Effekt von 5-HT auf die V-ATPase wird intrazellulär durch die Proteinkinase A (PKA) vermittelt und hält nur für die Dauer der Stimulierung an. In der vorliegenden Arbeit wurde mittels Phosphoproteinfärbungen und 2D-Elektrophorese nachgewiesen, dass infolge einer Stimulierung der Drüsenzellen mit 5-HT die Untereinheit C der V-ATPase durch die PKA reversibel phosphoryliert wird. Die Phosphorylierung geht einher mit einer Umverteilung der Untereinheit C aus dem Cytoplasma zur apikalen Plasmamembran und der Bildung des aktiven Holoenzyms. Immuncytochemische Untersuchungen zeigten, dass die katalytische Untereinheit der PKA ebenfalls umverteilt wird und in stimulierten Zellen im Bereich der apikalen Plasmamembran konzentriert vorliegt. Um herauszufinden welche Proteinphosphatase der PKA entgegenwirkt, wurden luminale pH-Messungen durchgeführt und der Effekt von spezifischen Proteinphosphatase-Inhibitoren und veresterten Komplexbildnern zweiwertiger Kationen auf die V-ATPase-Aktivität untersucht. Diese Messungen führten zu der Schlussfolgerung, dass eine Proteinphosphatase des Typs 2C an der Inaktivierung der V-ATPase beteiligt ist. Mit weiteren Phosphoproteinfärbungen konnte gezeigt werden, dass die Dephosphorylierung der Untereinheit C ebenfalls durch eine Proteinphosphatase 2C katalysiert wird und dies vermutlich die Dissoziation des VO- und V1-Komplexes begünstigt. Darüber hinaus konnte durch luminale pH-Messungen und ergänzende biochemische Untersuchungen eine Calcineurin-vermittelte Modulation des cAMP/PKA-Signalweges durch den parallel aktivierten IP3/Ca2+-Signalweg und damit einhergehend eine Beeinflussung der V-ATPase-Aktivität durch den [Ca2+]-Spiegel nachgewiesen werden. N2 - The vacuolar-type H+-ATPase (V-ATPase) is a multimeric enzyme that can be found in nearly every eukaryotic cell. It catalyses the active electrogenic transport of protons across membranes and is essential for a multitude of physiological processes. A fundamental mechanism to regulate V-ATPase activity is the reversible dissociation of the holoenzyme into an integral proton conducting VO-complex and a cytosolic V1-complex that hydrolyses ATP and thus energises proton translocation. Subunit C occurs isolated in the cytoplasm upon dissociation of the V-ATPase complexes and seems to be critical for the formation of active holoenzymes. In the salivary glands of the blowfly Calliphora vicina the V-ATPase is involved in fluid secretion. In secretory cells, formation of the V-ATPase holoenzyme is stimulated by the hormone serotonin (5-HT). The effect of 5-HT on V-ATPase activity is mediated by protein kinase A (PKA) and persists for the duration of the 5-HT stimulus. In this study, it was shown by phosphoprotein stainings and two-dimensional electrophoresis that subunit C of the V-ATPase becomes phosphorylated by PKA upon exposure of blowfly salivary glands to 5-HT. Parallel to the phosphorylation event, subunit C translocates from the cytoplasm to the apical plasma membrane for the assembly of active V-ATPase holoenzymes. Using immunofluorescence staining, it could be shown that PKA catalytic subunit translocates as well to the apical membrane upon 5-HT stimulation. To examine which protein phosphatase counteracts PKA, luminal pH-measurements were carried out. Based on the results with protein phosphatase inhibitors and esterified chelating agents of bivalent cations, it may be concluded that a protein phosphatase 2C is involved in the process leading to V-ATPase inactivation. Phosphoprotein stainings revealed that dephosphorylation of subunit C is likewise catalysed by a protein phosphatase 2C. Therefore the dephosphorylation of subunit C seems to promote dissociation of VO- and V1-complexes. Finally, luminal pH-measurements and supplemental biochemical experiments revealed a Ca2+/calcineurin-mediated modulation of the cAMP/PKA signalling cascade and an influence of intracellular calcium on the V-ATPase activity. KW - V-ATPase KW - PKA KW - Proteinphosphorylierung KW - Proteinphosphatasen KW - V-ATPase KW - PKA KW - protein phosphorylation KW - protein phosphatases Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-19617 ER - TY - GEN A1 - Klauß, André A1 - König, Marcelle A1 - Hille, Carsten T1 - Upgrade of a scanning confocal microscope to a single-beam path STED microscope T2 - PLoS ONE N2 - By overcoming the diffraction limit in light microscopy, super-resolution techniques, such as stimulated emission depletion (STED) microscopy, are experiencing an increasing impact on life sciences. High costs and technically demanding setups, however, may still hinder a wider distribution of this innovation in biomedical research laboratories. As far-field microscopy is the most widely employed microscopy modality in the life sciences, upgrading already existing systems seems to be an attractive option for achieving diffraction-unlimited fluorescence microscopy in a cost-effective manner. Here, we demonstrate the successful upgrade of a commercial time-resolved confocal fluorescence microscope to an easy-to-align STED microscope in the single-beam path layout, previously proposed as "easy-STED", achieving lateral resolution