TY  - THES
A1  - Frömmel, Ulrike
T1  - Vergleichende geno- und phänotypische Charakterisierung von Escherichia coli aus Menschen, Hausschweinen und Wildtieren
T1  - Comparative genotypic and phenotypic characterization of Escherichia coli from humans, domestic pigs and wild animals
N2  - Escherichia (E.) coli ist als kommensales Bakterium ein wichtiger Bestandteil des Mikrobioms von Säugern, jedoch zudem der häufigste Infektionserreger des Menschen. Entsprechend des Infektionsortes werden intestinal (InPEC) und extraintestinal pathogene E. coli (ExPEC) unterschieden. Die Pathogenese von E. coli-Infektionen ist durch Virulenzfaktoren determiniert, welche von jeweils spezifischen virulenzassoziierten Genen (inVAGs und exVAGs) kodiert werden. Häufig werden exVAGs auch in E. coli-Isolaten aus dem Darm gesunder Wirte nachgewiesen. Dies führte zu der Vermutung, dass exVAGs die intestinale Kolonisierung des Wirtes durch E. coli unterstützen. Das Hauptziel dieser Arbeit bestand darin, das Wissen über den Einfluss von exVAGs auf die Besiedlung und damit die Adhäsion von E. coli an Epithelzellen des Darmtraktes zu erweitern. Die Durchführung einer solch umfassenden E. coli-Populationsstudie erforderte die Etablierung neuer Screeningmethoden. Für die genotypische Charakterisierung wurden mikropartikelbasierte Multiplex-PCR-Assays zum Nachweis von 44 VAGs und der Phylogenie etabliert. Für die phänotypische Charakterisierung wurden Adhäsions- und Zytotoxizitätsassays etabliert. Die Screeningmethoden basieren auf der VideoScan-Technologie, einem automatisierten bildbasierten Multifluoreszenzdetektionssystem. Es wurden 398 E. coli-Isolate aus 13 Wildsäugerarten und 5 Wildvogelarten sowie aus gesunden und harnwegserkrankten Menschen und Hausschweinen charakterisiert. Die Adhäsionsassays hatten zum Ziel, sowohl die Adhäsionsraten als auch die Adhäsionsmuster der 317 nicht hämolytischen Isolate auf 5 Epithelzelllinien zu bestimmen. Die Zytotoxizität der 81 hämolytischen Isolate wurde in Abhängigkeit der Inkubationszeit auf 4 Epithelzelllinien geprüft. In den E. coli-Isolaten wurde eine Reihe von VAGs nachgewiesen. Potentielle InPEC, insbesondere shigatoxinproduzierende und enteropathogene E. coli wurden aus Menschen, Hausschweinen und Wildtieren, vor allem aus Rehen und Feldhasen isoliert. exVAGs wurden mit stark variierender Prävalenz in Isolaten aus allen Arten detektiert. Die größte Anzahl und das breiteste Spektrum an exVAGs wurde in Isolaten aus Urin harnwegserkrankter Menschen, gefolgt von Isolaten aus Dachsen und Rehen nachgewiesen. In Isolaten der phylogenetischen Gruppe B2 wurden mehr exVAGs detektiert als in den Isolaten der phylogenetischen Gruppen A, B1 und D. Die Ergebnisse der Adhäsionsassays zeigten, dass die meisten Isolate zelllinien-, gewebe- oder wirtsspezifisch adhärierten. Ein Drittel der Isolate adhärierte an keiner Zelllinie und nur zwei Isolate adhärierten stark an allen Zelllinien. Grundsätzlich adhärierten mehr Isolate an humanen sowie an intestinalen Zelllinien. Besonders Isolate aus Eichhörnchen und Amseln sowie aus Urin harnwegserkrankter Menschen und Hausschweine waren in der Lage, stark zu adhärieren. Hierbei bildeten die Isolate als Adhäsionsmuster diffuse Adhäsion, Mikrokolonien, Ketten und Agglomerationen. Mittels statistischer Analysen wurden Assoziationen zwischen exVAGs und einer hohen Adhäsionsrate ersichtlich. So war beispielsweise das Vorkommen von afa/dra mit einer höheren Adhäsionsrate auf Caco-2- und 5637-Zellen und von sfa/foc auf IPEC-J2-Zellen assoziiert. Die Ergebnisse der Zytotoxizitätsassays zeigten eine sehr starke und zeitabhängige Zerstörung der Monolayer aller Epithelzelllinien durch die α-Hämolysin-positiven Isolate. Auffallend war die hohe Toxizität hämolytischer Isolate aus Wildtieren gegenüber den humanen Zelllinien. Mit den innerhalb dieser Arbeit entwickelten Screeningmethoden war es möglich, große Mengen an Bakterien zu charakterisieren. Es konnte ein Überblick über die Verbreitung von VAGs in E. coli aus unterschiedlichen Wirten gewonnen werden. Besonders Wildtiere wurden sowohl durch den Nachweis von VAGs in den entsprechenden Isolaten, verbunden mit deren Adhäsionsfähigkeit und ausgeprägter Zytotoxizität als Reservoire pathogener E. coli identifiziert. Ebenso wurde eine zelllinienspezifische Adhäsion von Isolaten mit bestimmten exVAGs deutlich. Damit konnte der mögliche Einfluss von exVAGs auf die intestinale Kolonisierung bestätigt werden. In weiterführenden Arbeiten sind jedoch Expressions- und Funktionsanalysen der entsprechenden Proteine unerlässlich. Es wird anhand der Mikrokoloniebildung durch kommensale E. coli vermutet, dass Adhäsionsmuster und demzufolge Kolonisierungsstrategien, die bisher pathogenen E. coli zugeschrieben wurden, eher als generelle Kolonisierungsstrategien zu betrachten sind. Das E. coli-α-Hämolysin wirkt im Allgemeinen zytotoxisch auf Epithelzellen. Ein in der Fachliteratur diskutierter adhäsionsunterstützender Mechanismus dieses Toxins ist demnach fragwürdig. Innerhalb dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die entwickelten Screeningmethoden umfassende Analysen einer großen Anzahl an E. coli-Isolaten ermöglichen.
N2  - Escherichia (E.) coli is as commensal bacterium an important component of the microbiome of humans and animals, but also the most common infectious agent of human. According to the site of infection intestinal pathogenic (InPEC) and extraintestinal pathogenic E. coli (ExPEC) are differentiated. The pathogenesis of E. coli infections is determined by virulence factors encoded by specific virulence-associated genes (inVAGs and exVAGs). Frequently, exVAGs also be detected in E. coli isolates from the intestine of clinically healthy hosts. This led to the assumption that exVAGs support the intestinal colonization of the host by E. coli. The main objective of this work was to extend the knowledge about the influence of exVAGs on the settlement and adhesion of E. coli to epithelial cells of the intestinal tract. The implementation of such a comprehensive E. coli population study required the establishment of new screening methods. For the genotypic characterization novel microbead-based multiplex PCR assays were established to detect 44 VAGs and phylogeny. For the phenotypic characterization novel in vitro adhesion and cytotoxicity assays were established. These screening methods based on the VideoScan technology, which is an automated image-based multi-fluorescence detection system. There have been characterized 398 E. coli isolates from 13 wild mammal species and 5 species of wild birds as well as from healthy and urinary diseased humans and domestic pigs. The adhesion assays were aimed at both the adhesion rates and the adhesion patterns of the 317 non-hemolytic isolates on intestinal human Caco-2 and porcine IPEC-J2 cells and on human urinary bladder 5637, porcine kidney PK-15 epithelial and HEp-2 cells. The cytotoxicity of 81 hemolytic isolates was compared on the human intestinal epithelium LoVo, and on 5637, IPEC-J2 and PK-15 according to the incubation period. The E. coli isolates showed a series of VAGs. Potential InPEC, especially shigatoxin-producing and enteropathogenic E. coli were isolated from humans, domestic pigs and wild animals, especially from deers (Capreolus capreolus) and hares (Lepus europaeus). exVAGs were detected with widely varying prevalence in E. coli isolates from all species studied. The largest number and the widest range of exVAGs were shown in isolates from urine of urinary diseased patients, followed by isolates from badgers (Meles meles) and deer. Within the isolates of the phylogenetic group B2 more exVAGs were detected as within the isolates of the phylogenetic groups A, B1, and D. Adhesion of the E. coli isolates was specific to cells, host, and tissue, though it was also unspecific. A third of the isolates adhered to any cell line and only two isolates adhered strongly to all cell lines. Basically, more bacteria adhered to human as well as to intestinal cell lines. Especially isolates from squirrels (Sciurus vulgaris) and blackbirds (Turdus merula) and from the urine of urinary diseased humans and domestic pigs were able to strongly adhere. Commensal and pathogenic isolates can adhere in various forms, including diffuse distribution, microcolonies, chains and clumps. Using statistical analyzes associations between the occurrence of some VAGs and a high adhesion rates were seen. Several known adhesins were associated with host cell specific adhesion. Other new potential adhesion genes were described. The results of the cytotoxicity assays showed a very strong and time-dependent degradation of the epithelial cell monolayer of all the α-hemolysin-positive E. coli isolates. The high toxicity of hemolytic isolates from wild animals against the human cell lines was striking. The screening methods enabled both, the genotypic and phenotypic characterisation of large amounts of bacterial isolates. An overview of the distribution of VAGs in E. coli from different hosts was obtained. Especially wild animals were either by the detection of VAGs in the corresponding E. coli isolates, combined with the adhesion and marked cytotoxicity identified as reservoirs of pathogenic E. coli. As well, a cell-line specific adhesion of E. coli isolates with certain exVAGs became clear. Thus, the possible influence on the intestinal colonization of exVAGs could be confirmed. In further work, however, expression and functional analysis of the corresponding proteins are essential. It is suspected on the basis of microcolony formation by commensal E. coli that adhesion patterns and consequently colonization strategies that were previously attributed to pathogenic E. coli, are to be regarded rather as a general colonization strategy. The E. coli α-hemolysin acts generally cytotoxic to epithelial cells. An in the literature discussed adhesion supporting mechanism of this toxin is therefore questionable. Within this work it was shown that the developed screening methods enable comprehensive analyzes of a large number of E. coli isolates.
KW  - Escherichia coli
KW  - Adhäsion
KW  - virulenzassoziierte Gene
KW  - Hämolyse
KW  - ExPEC
KW  - Escherichia coli
KW  - adhesion
KW  - virulence-associated genes
KW  - hemolysis
KW  - ExPEC
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-69147
ER  - 
TY  - THES
A1  - Mogrovejo Arias, Diana Carolina
T1  - Assessment of the frequency and relevance of potentially pathogenic phenotypes in microbial isolates from Arctic environments
N2  - The Arctic environments constitute rich and dynamic ecosystems, dominated by microorganisms extremely well adapted to survive and function under severe conditions. A range of physiological adaptations allow the microbiota in these habitats to withstand low temperatures, low water and nutrient availability, high levels of UV radiation, etc. In addition, other adaptations of clear competitive nature are directed at not only surviving but thriving in these environments, by disrupting the metabolism of neighboring cells and affecting intermicrobial communication. Since Arctic microbes are bioindicators which amplify climate alterations in the environment, the Arctic region presents the opportunity to study local microbiota and carry out research about interesting, potentially virulent phenotypes that could be dispersed into other habitats around the globe as a consequence of accelerating climate change. In this context, exploration of Arctic habitats as well as descriptions of the microbes inhabiting them are abundant but microbial competitive strategies commonly associated with virulence and pathogens are rarely reported. In this project, environmental samples from the Arctic region were collected and microorganisms (bacteria and fungi) were isolated. The clinical relevance of these microorganisms was assessed by observing the following virulence markers: ability to grow at a range of temperatures, expression of antimicrobial resistance and production of hemolysins. The aim of this project is to determine the frequency and relevance of these characteristics in an effort to understand microbial adaptations in habitats threatened by climate change. The isolates obtained and described here were able to grow at a range of temperatures, in some cases more than 30 °C higher than their original isolation temperature. A considerable number of them consistently expressed compounds capable of lysing sheep and bovine erythrocytes on blood agar at different incubation temperatures. Ethanolic extracts of these bacteria were able to cause rapid and complete lysis of erythrocyte suspensions and might even be hemolytic when assayed on human blood. In silico analyses showed a variety of resistance elements, some of them novel, against natural and synthetic antimicrobial compounds. In vitro experiments against a number of antimicrobial compounds showed resistance phenotypes belonging to wild-type populations and some non-wild type which clearly denote human influence in the acquisition of antimicrobial resistance. The results of this project demonstrate the presence of virulence-associated factors expressed by microorganisms of natural, non-clinical environments. This study contains some of the first reports, to the best of our knowledge, of hemolytic microbes isolated from the Arctic region. In addition, it provides additional information about the presence and expression of intrinsic and acquired antimicrobial resistance in environmental isolates, contributing to the understanding of the evolution of relevant pathogenic species and opportunistic pathogens. Finally, this study highlights some of the potential risks associated with changes in the polar regions (habitat melting and destruction, ecosystem transition and re-colonization) as important indirect consequences of global warming and altered climatic conditions around the planet.
N2  - Die Arktis ist ein reiches und dynamisches Ökosystem, welches von Mikroorganismen dominiert wird, die unter extremen Bedingungen überleben und funktionieren können. Eine Reihe physiologischer Anpassungen ermöglichen es der Mikrobiota, in diesem Lebensraum zu überdauern niedrige Temperaturen, geringe Wasser- und Nährstoffverfügbarkeit, hohe UV-Strahlung, usw. standzuhalten. Andere Fähigkeiten zielen darauf ab, sich einen Konkurrenzvorteil zu verschaffen, indem sie mit antimikrobiellen Substanzen benachbarte Mikroorganismen stören und die intermikrobielle Kommunikation beeinflussen. Arktische Mikroorganismen sind Bioindikatoren, die Klimaveränderungen anzeigen können. Die Arktis bietet Möglichkeiten, die lokale Mikrobiota zu untersuchen, um Rückschlüsse auf den Klimawandel zu ziehen. Insbesondere Forschung über potenziell pathogene Phänotypen, die infolge der Beschleunigung des Klimawandels in andere Lebensräume auf der ganzen Welt verteilt werden könnten, ist hier von herausragender Bedeutung. In diesem Zusammenhang gibt es zahlreiche Untersuchungen zur Erforschung arktischer Lebensräume sowie Beschreibungen der in ihnen lebenden Mikroben, während über bakterielle Konkurrenzstrategien, die üblicherweise mit Virulenz und Krankheitserregern verbunden sind, bisher wenig geforscht wurde. In diesem Projekt wurden Umweltproben aus der Arktis entnommen und Bakterien und Pilze isoliert. Die klinische Relevanz dieser Mikroorganismen wurde durch Untersuchung der folgenden Virulenzmarker bewertet: Fähigkeit, in einem bestimmten Temperaturbereich zu wachsen, Expression von Antibiotikaresistenz und Produktion von Hämolysinen. Ziel dieses Projekts war es, das Vorkommen dieser Eigenschaften zu bestimmen, um die mikrobiellen Anpassungen in vom Klimawandel bedrohten Lebensräumen zu verstehen. Die beschriebenen Bakterienisolate konnten in einem relevanten Temperaturbereich wachsen, in einigen Fällen von mehr als 30 °C höher als ihre ursprüngliche Isolationstemperatur. Eine beträchtliche Anzahl der Isolate exprimierte konsistent Verbindungen, die Schaf- und Rindererythrozyten auf Blutagar bei verschiedenen Inkubationstemperaturen lysieren können. Die Extrakte einiger dieser Bakterien konnten eine schnelle und vollständige Lyse von Schaf- und Rindererythrozytensuspensionen verursachen und sind möglicherweise sogar hämolytisch gegenüber humanem Blut. Darüber hinaus zeigten Genomanalysen eine Vielzahl von Resistenzgenen gegen natürliche und synthetische antimikrobielle Verbindungen, einige neuartige. In-vitro-Experimente zeigten, dass einige Resistenzphänotypen zu Wildtyp-Populationen während andere zu Nicht-Wildtyp gehören, was auf einen menschlichen Einfluss auf den Erwerb von Antibiotikaresistenzen in der Umwelt eindeutig hindeutet. Die Ergebnisse dieses Projekts zeigen das Vorhandensein von Virulenz-assoziierten Faktoren, die von Mikroorganismen natürlicher, nicht klinischer Umgebungen exprimiert werden. Diese Studie enthält nach unserem besten Wissen einige der ersten Berichte über hämolytische Mikroben, die aus der Arktis isoliert wurden. Darüber hinaus liefert es zusätzliche Informationen über das Vorhandensein und die Expression von intrinsischer und erworbener antimikrobieller Resistenz in Umweltisolaten und trägt zum Verständnis der Entwicklung relevanter pathogener Spezies und opportunistischer Pathogene bei. Schließlich beleuchtet diese Studie einige der potenziellen Risiken, die mit Veränderungen in den Polarregionen (Schmelzen und Zerstörung des Lebensraums, Übergang des Ökosystems und Wiederbesiedlung) als wichtige indirekte Folgen der globalen Erwärmung und veränderter klimatischer Bedingungen auf dem Planeten verbunden sind.
KW  - Arctic
KW  - pathogens
KW  - virulence
KW  - hemolysis
KW  - antimicrobial resistance
KW  - climate change
KW  - bacteria
KW  - fungi
KW  - thermotolerance
KW  - antibiotic resistance
KW  - Arktis
KW  - Krankheitserreger
KW  - Virulenz
KW  - Hämolyse
KW  - Antibiotikaresistenz
KW  - Klimawandel
KW  - Bakterien
KW  - Pilze
KW  - Thermotoleranz
Y1  - 2021
N1  - The author would like to acknowledge that the project leading to this doctoral dissertation has received funding from the European Union’s Horizon 2020 research and innovation programme under the Marie Skłodowska-Curie grant agreement No. 675546, research project “Microorganisms in Warming Arctic Environments - MicroArctic”.
ER  -