TY - THES A1 - Roder, Phillip T1 - Kombination von Fluoreszenzmikroskopie und Rasterkraftmikroskopie zur Aufklärung physiologischer Prozesse in lebenden Zellen T1 - Combination of fluorescence microscopy and atomic force microscopy for the investigation of physiological processes in living cells BT - Charakterisierung und Anwendung einer neuartigen lokalen Mikromanipulationstechnik BT - characterisation and application of a novel local micromanipulation technique N2 - Innerhalb dieser Doktorarbeit wurde eine neuartige Mikromanipulationstechnik für die lokale Flüssigkeitsabgabe am komplexen Drüsengewebe der Schabe P. americana charakterisiert und für die damit verbundene gezielte Manipulation von einzelnen Zellen in einem Zellkomplex (Gewebe) angewandt. Bei dieser Mikromanipulationstechnik handelt es sich um die seit 2009 bekannte nanofluidische Rasterkraftmikroskopie (FluidFM = fluidic force microscopy). Dabei werden sehr kleine mikrokanälige Rasterkraftspitzen bzw. Mikro-/Nanopipetten mit einer Öffnung zwischen 300 nm und 2 µm verwendet, mit denen es möglich ist, sehr kleine Volumina im Pikoliter- bis Femtoliter-Bereich (10-12 L – 10-15 L) gezielt und ortsgenau abzugeben. Das Ziel dieser Arbeit war die Analyse zellulärer Prozesse, wie z. B. Zell-Zell-Kommunikation oder Signalweiterleitung, zwischen benachbarten Zellen unter Zuhilfenahme der Fluoreszenzmikroskopie. Mit dieser Methode können die Zellen und ihre Bestandteile mittels vorheriger Farbstoffbeladung unter einem Mikroskop mit hohem Kontrast optisch dargestellt werden. Mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie sollten schlussendlich die zellulären Reaktionen innerhalb des Gewebes nach der lokalen Manipulation visualisiert werden. Zunächst wurde die Anwendung des Systems an Luft und wässriger Umgebung beschrieben. In diesem Zusammenhang wurde eine Reinigungs- und Beladungsmethode entwickelt, mit der es möglich war, die kostspieligen Mikro-/Nanopipetten zu reinigen und anschließend mehrmals wiederzuverwenden. Hierzu wurde eine alternative Methode getestet, mit der das Diffusionsverhalten von Farbstoffmolekülen in unterschiedlichen Medien untersucht werden kann. Des Weiteren wurden die Systemparameter optimiert, welche nötig sind, um zwischen der Probenoberfläche und der Pipette einen guten Pipettenöffnungs-abschluss zu erhalten. Dieser Abschluss ist essentiell, damit die abgegebene Flüssigkeit ausschließlich in der Abgaberegion mit der Probe wechselwirkt und die darauffolgenden Reaktionen nur innerhalb des Gewebes erfolgen, da ansonsten die Zell-Zell-Signalweiterleitung zwischen den Zellen nicht eindeutig nachvollzogen werden kann. Diese interzelluläre Kommunikation wurde anhand zweier sekundärer Botenstoffe (Ca2+ und NO) untersucht. Hierbei war es möglich einzelne lokale Reaktionen zu detektieren, welche sich über weitere Zellen ausbreiteten. Schlussendlich wurde die Fertigung einer speziellen Injektionspipette beschrieben, welche an zwei biologischen Systemen getestet wurde. N2 - Within this thesis, a novel micromanipulation technique was characterised for the local liquid delivery at the complex salivary glands tissue of the cockroach P. americana and was applied for the associated targeted manipulation of single cells in a cell complex (tissue). This micromanipulation technique is known since 2009 as the fluidic force microscopy (FluidFM) technique. In this case, very small microchanneled AFM tips or rather micro-/nanopipettes with an opening between 300 nm and 2 μm are used to deliver very small volumes in the picoliter to femtoliter range (10-12 L - 10-15 L) targeted and accurate. The aim of this work was the analysis of cellular processes, such as cell-cell communication or signal transduction, between adjacent cells using fluorescence microscopy. Using this method, the cells and their components can be optically visualised by prior dye loading under a microscope with high contrast. Using fluorescence microscopy, the cellular responses within the tissue were finally visualised after local manipulation. First, the application of the system in air and aqueous environment was described. In this context, a cleaning and loading method was developed which allows the cleaning and the repeated reuse of the expensive micro-/nanopipettes. For this purpose, an alternative method has been tested, with which the diffusion of dye molecules in different media can be examined. Furthermore, the system parameters needed to obtain a good pipette opening sealing between the sample surface and the pipette have been optimised. This sealing is essential to ensure that the delivered liquid interacts only with the sample in the delivery region and that subsequent reactions occur only within the tissue, otherwise cell-cell signaling between the cells can not be clearly understood. This intercellular communication was studied by means of two secondary messengers (Ca2+ and NO). Here it was possible to detect individual local reactions that spread over more cells. Finally, the production of a special injection pipette was described, which was tested on two biological systems. KW - Rasterkraftmikroskopie KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Mikromanipulation KW - Zellgewebe KW - Diffusion KW - atomic force microscopy KW - fluorescence microscopy KW - micromanipulation KW - cellular tissue KW - diffusion Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-419806 ER - TY - JOUR A1 - Roder, Phillip A1 - Hille, Carsten T1 - Local tissue manipulation via a force- and pressure-controlled AFM micropipette for analysis of cellular processes JF - Scientific reports N2 - Local manipulation of complex tissues at the single-cell level is challenging and requires excellent sealing between the specimen and the micromanipulation device. Here, biological applications for a recently developed loading technique for a force-and pressure-controlled fluidic force microscope micropipette are described. This technique allows for the exact positioning and precise spatiotemporal control of liquid delivery. The feasibility of a local loading technique for tissue applications was investigated using two fluorescent dyes, with which local loading behaviour could be optically visualised. Thus, homogeneous intracellular distribution of CellTracker Red and accumulation of SYTO 9 Green within nuclei was realised in single cells of a tissue preparation. Subsequently, physiological micromanipulation experiments were performed. Salivary gland tissue was pre-incubated with the Ca2+-sensitive dye OGB-1. An intracellular Ca2+ rise was then initiated at the single-cell level by applying dopamine via micropipette. When pre-incubating tissue with the nitric oxide (NO)-sensitive dye DAF-FM, NO release and intercellular NO diffusion was observed after local application of the NO donor SNP. Finally, local micromanipulation of a well-defined area along irregularly shaped cell surfaces of complex biosystems was shown for the first time for the fluidic force microscope micropipette. Thus, this technique is a promising tool for the investigation of the spatiotemporal effects of locally applied substances in complex tissues. Y1 - 2018 U6 - https://doi.org/10.1038/s41598-018-24255-9 SN - 2045-2322 VL - 8 PB - Nature Publ. Group CY - London ER -