TY - THES A1 - Schlenstedt, Jana T1 - Molekulare und pharmakologische Charakterisierung von Serotonin-Rezeptoren der Honigbiene Apis mellifera T1 - Molecular and pharmacological characterization of serotonin receptors of the honeybee Apis mellifera N2 - Die Honigbiene Apis mellifera gilt seit langem als Modell-Organismus zur Untersuchung von Lern- und Gedächtnisvorgängen sowie zum Studium des Sozialverhaltens und der Arbeitsteilung. Bei der Steuerung und Regulation dieser Verhaltensweisen spielt das Indolalkylamin Serotonin eine wesentliche Rolle. Serotonin entfaltet seine Wirkung durch die Bindung an G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs). In der vorliegenden Arbeit wird der erste Serotonin-Rezeptor aus der Honigbiene molekular charakterisiert. Durch die Anwendung zwei verschiedener Klonierungsstrategien konnten drei cDNA-Sequenzen isoliert werden, die für potentielle Serotonin-Rezeptoren kodieren. Die Sequenzen weisen die größte Ähnlichkeit zu dem 5-HT7- und 5-HT2-Rezeptor von Drosophila melanogaster bzw. dem 5-HT1-Rezeptor von Panulirus interruptus auf. Die isolierten Serotonin-Rezeptoren der Honigbiene wurden dementsprechend Am(Apis mellifera)5-HT1, Am5-HT2 und Am5-HT7 benannt. Das Hydropathieprofil des Am5-HT1-, Am5-HT2- und Am5-HT7-Rezeptors deutet auf das Vorhandensein des charakteristischen heptahelikalen Aufbaus G-Protein-gekoppelter Rezeptoren hin. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen zeigen typische Merkmale biogener Amin-Rezeptoren. Aminosäuren, die eine Bedeutung bei der Bildung der Liganden-Bindungstasche, der Rezeptor-Aktivierung und der Kopplung eines G-Proteins an den Rezeptor haben, sind in allen drei Rezeptoren konserviert. Interessanterweise ist jedoch das in den meisten biogenen Amin-Rezeptoren vorhandene DRY-Motiv in dem Am5-HT2- und Am5-HT7-Rezeptor nicht konserviert. Das Vorhandensein einer PDZ-Domäne in dem Am5-HT1- und Am5-HT7-Rezeptor lässt vermuten, dass diese Rezeptoren als Adapterproteine fungieren, die Signalmoleküle zu einem Signaltransduktionskomplex vereinigen. RT-PCR-Experimente zeigen die Expression der Rezeptoren in verschiedenen Geweben der Honigbiene. Auffallend ist die hohe Expression im Zentralgehirn. Des Weiteren konnte die Expression der Serotonin-Rezeptoren in den optischen Loben, Antennalloben sowie in der Peripherie, d.h. in der Flugmuskulatur und den Malpighischen Gefäßen nachgewiesen werden. Durch in situ Hybridisierungen wurde die Expression in Gefrierschnitten von Gehirnen adulter Sammlerinnen im Detail untersucht. Transkripte der Rezeptoren sind in den Somata von intrinsischen Pilzkörperzellen, Neuronen der optischen Loben und Neuronen der Antennalloben vorhanden. In einem heterologen Expressionssystem wurde der intrazelluläre Signalweg des Am5-HT7-Rezeptors untersucht. Die Aktivierung des stabil exprimierten Rezeptors durch Serotonin führt zur Bildung von cAMP. Der 5-HT7-Rezeptor spezifische Agonist 5-CT zeigt eine mit Serotonin vergleichbare Fähigkeit, die intrazelluläre cAMP-Konzentration zu erhöhen. Am5-HT7 gehört daher funktionell zu der Gruppe der 5-HT7-Rezeptoren. Der EC50-Wert von 1,06~nM (5-HT), ist im Vergleich zu anderen 5-HT7-Rezeptoren äußert niedrig. Des Weiteren wurde gezeigt, dass das basale cAMP-Niveau in den transfizierten Zellen im Vergleich zu nicht transfizierten Zellen deutlich erhöht ist. Das heißt, dass der Rezeptor auch in der Abwesenheit eines Liganden aktiv ist. Diese konstitutive Aktivität ist auch von anderen biogenen Amin-Rezeptoren bekannt. Methiothepin wurde als wirksamer inverser Agonist des Am5-HT7-Rezeptors identifiziert, da es in der Lage ist, der konstitutiven Aktivität entgegenzuwirken. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit deuten darauf hin, dass die Serotonin-Rezeptoren in verschiedenen Regionen des ZNS der Honigbiene an der Informationsverarbeitung beteiligt sind. Es kann eine Beeinflussung von Lern- und Gedächtnisprozessen sowie des olfaktorischen und visuellen Systems durch diese Rezeptoren vermutet werden. Mit der Klonierung und funktionellen Charakterisierung des ersten Serotonin-Rezeptors der Honigbiene ist eine Grundlage für die Untersuchung der molekularen Mechanismen der serotonergen Signaltransduktion geschaffen worden. N2 - The honeybee Apis mellifera is a model organism for studying insect division of labor, learning and memory. An important substance that has been implicated in the control and regulation of these phenomena is the indolalkylamine serotonin (5-hydroxytryptamine, 5-HT) Pharmacological and functional studies indicate, that serotonin activates various receptor subtypes which predominantly belong to the family of G protein-coupled receptors (GPCRs). Using a homology based screening approach on a brain-specific cDNA library of the honeybee and a PCR-based strategy we have isolated cDNAs encoding three putative serotonin receptors. The deduced amino acid sequences of these putative honeybee serotonin receptors show the highest homology to a 5-HT7 and a 5-HT2 receptor from Drosophila melanogaster and a 5-HT1 receptor from Panulirus interruptus, respectively. We have studied the distribution of the respective 5-HT receptor mRNAs in several tissues of the honeybee by RT-PCR. The analysis revealed a high amount in the central brain. By using in situ-hybridization we detected receptor encoding mRNA in cryostat sections of honeybee brain. We could prove receptor transcripts in neurons of the optic lobes, intrinsic mushroom body neurons, and deutocerebral neurons. In a HEK 293 cell line, stably expressing the 5-HT7 receptor protein, we investigated the intracellular signalling pathway. When activated by serotonin, the heterologous expressed 5-HT7 receptor induces an increase in intracellular cAMP levels ([cAMP]i). The stimulation with other biogenic amines (octopamine, tyramine, and dopamine) did not induce a significant change in [cAMP]i Furthermore, Am5-HT7 causes a significant increase in the non-agonist stimulated cAMP levels relative to those of non-transfected cells. Therefore, the Am5-HT7 receptor displays agonist-independent (constitutive) activity which has also been demonstrated for many other GPCRs. A specific affinity-purified anti-Am5-HT7 antibody detected a protein band of the expected size of ~66 kDa in homogenates of honeybee brains and HEK 293 cells expressing the Am5-HT7 receptor. KW - Biogene Amine KW - Serotonin KW - Serotoninrezeptor KW - Biene KW - Pharmakologie KW - Lernen und Gedächtnis KW - pharmakologisches Profil KW - Gewebsverteilung KW - serotonin KW - biogenic amine KW - receptor KW - honeybee KW - pharmacology Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-7203 ER - TY - THES A1 - Krach, Christian T1 - Biogene Aminrezeptoren der Schabe Periplaneta americana : Identifizierung, Charakterisierung und Lokalisierung von PeaTYR1 und PeaDOP2 T1 - Biogenic amine receptors of Periplaneta americana : identification, characterization and localization of PeaTYR1 and PeaDOP2 N2 - Biogene Amine sind eine Substanzklasse, die bei Vertebraten und Invertebraten eine wichtige Komponente des endokrinen Systems darstellen. Sie binden an spezifische Rezeptoren der Gruppe der G-Protein gekoppelten Rezeptoren. In dieser Arbeit wurden zwei neue Rezeptoren aus der Schabe Periplaneta americana kloniert. Durch verschiedene Ansätze konnten zwei vollständige cDNA-Sequenzen isoliert werden. Die Aminosäuresequenzen weisen die größte Ähnlichkeit zu bereits bekannten Tyraminrezeptoren aus Locusta/Bombyx bzw. zu Dopaminrezeptoren aus Apis/Drosophila auf. Entsprechend wurden diese Rezeptoren Pea (P. americana) TYR1 und PeaDOP2 genannt. Deutliche Hinweise auf ihre Funktion lassen sich an den abgeleiteten Aminosäuresequenzen ablesen. Aminosäuren, die wichtig bei der Bildung der Bindungstasche, der Rezeptoraktivierung und der Kopplung eines G-Proteins sind, treten bei beiden Rezeptoren auf. Sequenzalignments stellen die Rezeptoren in die Gruppe anderer Tyraminrezeptoren bzw. der Invertebraten-Typ Dopaminrezeptoren. Das Transkript der beiden Rezeptoren konnte durch RT-PCR in verschiedenen Geweben nachgewiesen werden. Ein Ziel der Arbeit war die Gewinnung eines polyklonalen Antiserums gegen PeaTYR1. Dieses Serum detektiert im Homogenat von Gehirnen mehrere Banden, darunter auch eine mit der kalkulierten Masse von PeaTYR1. Präabsorption des Serums mit dem Peptid, welches zur Reinigung verwendet wurde, zeigt dessen Spezifität. An Gehirnschnitten markiert das Serum große Teile des Protocerebrums aber auch feinere Strukturen der Antennalloben, der optischen Loben und des Zentralkomplexes. Ein weiteres Serum gegen Tyramin führte zu einer Markierung von mehreren Neuronengruppen, welche sich in die optischen Loben und den Zentralkomplex verzweigen. Der αPeaTYR1-CPL3 Antikörper markierte die Plasmamembran von transfizierten HEK293-Zellen. Die Lokalisierung von Rezeptor und Ligand deuten darauf hin, dass Tyramin die optische und olfaktorische Wahrnehmung beeinflussen könnte. N2 - Biogenic amines form a group of substances which play an important role in the endocrine system of invertebrates and vertebrates. They bind to specific receptors of the G-protein coupled type. In this work two new receptors from Periplaneta americana were cloned. By several approaches two full-length cDNA sequences were obtained. The amino acid sequence is very similar to known tyramine receptors of Locusta/Bombyx or dopamine receptors from Apis/Drosophila, respectively. Therefore they were named PeaTYR1 and PeaDOP2. Residues which are important for forming the binding pocket, activation of the receptor or G-protein coupling could be identified in both receptors. Sequence alignments group them together with other tyramine receptors or insect-type dopamine receptors. The corresponding mRNA can be detected in different tissues by RT-PCR. One aim of this work was the preparation of a polyclonal antiserum against PeaTYR1. This serum detects several bands in a brain homogenate; one has the calculated mass of PeaTYR1. Its specificity was proven by praeabsorption. On brain slices the serum labels large regions in the protocerebrum, but also fine structures in the antennal lobes, the optic lobes or the central complex. Another serum against tyramine labels several cell clusters, which ramify within the optic lobes and the central complex. On transfected HEK293 cells the receptor can be detected on the plasma membrane. The localization of receptor and ligand may indicate a role of tyramine in optical/olfactory perception. KW - Rezeptor KW - Tyramin KW - Dopamin KW - Periplaneta americana KW - receptor KW - tyramine KW - dopamine KW - Periplaneta americana Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-15561 ER - TY - THES A1 - Bufe, Bernd T1 - Identifizierung und Charakterisierung von Bitterrezeptoren N2 - Menschen nehmen Tausende von Stoffen als bitter wahr. Die chemische Struktur der verschiedenen Bitterstoffe ist sehr vielfältig: Sie reicht von kleinen Molekülen wie Kaliumchlorid oder Harnstoff, bis zu sehr komplexen organischen Verbindungen. Die Größe der einzigen bekannten menschlichen Familie von Bitterrezeptoren (TAS2Rs) wurde auf nur ca. 80-120 Mitglieder geschätzt. In Anbetracht der hohen Zahl und Komplexität der Bitterstoffe erscheint die Zahl von Rezeptoren als sehr gering. Dies führt natürlich zu einer Reihe von Fragen: Wie viele Mitglieder hat die menschliche TAS2R-Genfamilie? Wie viele verschiedene Substanzen können denselben Rezeptor aktivieren? Scheint die Zahl der TAS2R-Rezeptoren ausreichend, alle Bitterstoffe wahrnehmen zu können oder muss es noch andere Bitterrezeptorfamilien geben? Diese Fragen zu beantworten, ist das Ziel der vorliegenden Arbeit. Hier durchgeführte Analysen des menschlichen Genomprojektes zeigen, dass Menschen ca. 25 TAS2R-Rezeptoren besitzt, die eine sehr divergente Aminosäurestruktur aufweisen. Diese Rezeptoren wurden in eine neu entwickelte Expressionskassette kloniert, die den Transport des Rezeptors an die Zelloberfläche ermöglicht. Um Liganden für die menschliche TAS2R-Rezeptoren zu identifizieren, wurden die Rezeptoren in HEK293 Zellen exprimiert und mit verschiedenen Bitterstoffen stimuliert. Der Nachweis der Rezeptoraktivierung erfolgte durch Calcium-Imaging. Es konnte gezeigt werden, dass hTAS2R16 der menschliche Rezeptor zur Wahrnehmung von Salicin und verwandten bitteren Pyranosiden ist. So wird hTAS2R16 in HEK293 Zellen durch Salicin und chemisch verwandte Substanzen aktiviert. Ein Vergleich der in diesem Messsystem erhaltenen Daten mit psychophysikalisch ermittelten Geschmackswahrnehmungen beim Menschen, ergab eine hohe Übereinstimmung. Die Ergebnisse deuten auch darauf hin, dass die Desensitiverung einzelner Rezeptoren die Ursache für die Adaption des Bittergeschmacks ist. Der Nachweis der Expression des Rezeptors in menschlichen Geschmackspapillen, sowie die festgestellte Assoziation des G/A Polymorpphismus an Position 665 des hTAS2R16 Gens mit einer reduzierten Salicinwahrnehmung, sind weitere unabhängige Beweise für diese These. Ein anderer menschlicher Rezeptor, hTAS2R10, wird durch die Bitterstoffe Strychnin, Brucin und Denatonium aktiviert. Dies sowie die Tatsache, dass die zur Aktivierung benutzten Konzentrationen eine sinnvolle Korrelation zu dem menschlichen Geschmacksschwellwert von Strychnin zeigen, sind starke Hinweise, dass hTAS2R10 der menschliche Rezeptor zur Wahrnehmung von Strychnin und verwandten Substanzen ist. Die vorliegenden Daten zeigen eindeutig, dass die TAS2R-Rezeptoren auch beim Menschen Bitterrezeptoren darstellen. Sowohl hTAS2R16, als auch hTAS2R10 werden durch ein Spektrum strukturell sehr unterschiedlicher Bitterstoffe aktiviert. Falls die anderen Mitglieder der TAS2R-Familie ebenfalls dieses Verhalten zeigen, wäre es möglich, dass die nur ca. 25 Mitglieder umfassende TAS2R-Rezeptorfamilie des Menschen tatsächlich zur Wahrnehmung aller Bitterstoffe ausreicht. N2 - Bitter taste generally is aversive and protects vertebrates from ingestion of toxic substances, but bitter tastants also contribute to the enjoyment and palatability of food influencing human nutritional habits. Although bitter taste has been extensively studied, receptor mechanisms are still poorly understood. Anatomic, functional and genetic evidence from rodents suggested, however, that the T2R genes encode a family of bitter receptors while definite proof is missing in humans 6. We here report that the hT2R16 receptor is present in vallate papilla taste buds of the human tongue and activated by bitter b-glucopyranosides. These phytonutrients did not activate any other human T2R and showed similar concentration-response relations and cross-desensitization in hT2R16 expressing cells and psychobiological experiments. hT2R16 is broadly tuned. It binds bitter compounds that share only a b-glycosidic bond and a glucose residue. The broad tuning of T2Rs could explain how a limited number of receptors permits the perception and coding of numerous and different bitter substances. Together our data identify the hT2R16 as a broadly tuned, genuine human bitter receptor for b-glucopyranosides. KW - Geschmack KW - Bitter KW - Rezeptoren KW - TAS2R KW - Salicin KW - HEK293 KW - calcium imaging KW - taste KW - bitter KW - receptor KW - TAS2R KW - HEK293 KW - Salicin KW - calcium imaging Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0001130 ER -