TY - JOUR A1 - Benina, Maria A1 - Ribeiro, Dimas Mendes A1 - Gechev, Tsanko S. A1 - Müller-Röber, Bernd A1 - Schippers, Jos H. M. T1 - A cell type-specific view on the translation of mRNAs from ROS-responsive genes upon paraquat treatment of Arabidopsis thaliana leaves JF - Plant, cell & environment : cell physiology, whole-plant physiology, community physiology N2 - Oxidative stress causes dramatic changes in the expression levels of many genes. The formation of a functional protein through successful mRNA translation is central to a coordinated cellular response. To what extent the response towards reactive oxygen species (ROS) is regulated at the translational level is poorly understood. Here we analysed leaf- and tissue-specific translatomes using a set of transgenic Arabidopsis thaliana lines expressing a FLAG-tagged ribosomal protein to immunopurify polysome-bound mRNAs before and after oxidative stress. We determined transcript levels of 171 ROS-responsive genes upon paraquat treatment, which causes formation of superoxide radicals, at the whole-organ level. Furthermore, the translation of mRNAs was determined for five cell types: mesophyll, bundle sheath, phloem companion, epidermal and guard cells. Mesophyll and bundle sheath cells showed the strongest response to paraquat treatment. Interestingly, several ROS-responsive transcription factors displayed cell type-specific translation patterns, while others were translated in all cell types. In part, cell type-specific translation could be explained by the length of the 5-untranslated region (5-UTR) and the presence of upstream open reading frames (uORFs). Our analysis reveals insights into the translational regulation of ROS-responsive genes, which is important to understanding cell-specific responses and functions during oxidative stress. The study illustrates the response of different Arabidopsis thaliana leaf cells and tissues to oxidative stress at the translational level, an aspect of reactive oxygen species (ROS) biology that has been little studied in the past. Our data reveal insights into how translational regulation of ROS-responsive genes is fine-tuned at the cellular level, a phenomenon contributing to the integrated physiological response of leaves to stresses involving changes in ROS levels. KW - Arabidopsis KW - gene regulation KW - oxidative stress KW - tissue-specific KW - translation Y1 - 2015 U6 - https://doi.org/10.1111/pce.12355 SN - 0140-7791 SN - 1365-3040 VL - 38 IS - 2 SP - 349 EP - 363 PB - Wiley-Blackwell CY - Hoboken ER - TY - JOUR A1 - Hoffmann, Stefan A. A1 - Hao, Nan A1 - Shearwin, Keith E. A1 - Arndt, Katja Maren T1 - Characterizing transcriptional interference between converging genes in bacteria JF - ACS synthetic biology N2 - Antisense transcription is common in naturally occurring genomes and is increasingly being used in synthetic genetic circuitry as a tool for gene expression control. Mutual influence on the expression of convergent genes can be mediated by antisense RNA effects and by transcriptional interference (TI). We aimed to quantitatively characterize long-range TI between convergent genes with untranslated intergenic spacers of increasing length. After controlling for antisense RNA-mediated effects, which contributed about half of the observed total expression inhibition, the TI effect was modeled. To achieve model convergence, RNA polymerase processivity and collision resistance were assumed to be modulated by ribosome trailing. The spontaneous transcription termination rate in regions of untranslated DNA was experimentally determined. Our modeling suggests that an elongating RNA polymerase with a trailing ribosome is about 13 times more likely to resume transcription than an opposing RNA polymerase without a trailing ribosome, upon head-on collision of the two. KW - gene regulation KW - antisense transcription KW - transcriptional interference KW - mathematical modeling KW - Escherichia coli Y1 - 2019 U6 - https://doi.org/10.1021/acssynbio.8b00477 SN - 2161-5063 VL - 8 IS - 3 SP - 466 EP - 473 PB - American Chemical Society CY - Washington ER - TY - THES A1 - Mauri, Marco T1 - A model for sigma factor competition in bacterial cells N2 - Bacteria respond to changing environmental conditions by switching the global pattern of expressed genes. In response to specific environmental stresses the cell activates several stress-specific molecules such as sigma factors. They reversibly bind the RNA polymerase to form the so-called holoenzyme and direct it towards the appropriate stress response genes. In exponentially growing E. coli cells, the majority of the transcriptional activity is carried out by the housekeeping sigma factor, while stress responses are often under the control of alternative sigma factors. Different sigma factors compete for binding to a limited pool of RNA polymerase (RNAP) core enzymes, providing a mechanism for cross talk between genes or gene classes via the sharing of expression machinery. To quantitatively analyze the contribution of sigma factor competition to global changes in gene expression, we develop a thermodynamic model that describes binding between sigma factors and core RNAP at equilibrium, transcription, non-specific binding to DNA and the modulation of the availability of the molecular components. Association of housekeeping sigma factor to RNAP is generally favored by its abundance and higher binding affinity to the core. In order to promote transcription by alternative sigma subunits, the bacterial cell modulates the transcriptional efficiency in a reversible manner through several strategies such as anti-sigma factors, 6S RNA and generally any kind of transcriptional regulators (e.g. activators or inhibitors). By shifting the outcome of sigma factor competition for the core, these modulators bias the transcriptional program of the cell. The model is validated by comparison with in vitro competition experiments, with which excellent agreement is found. We observe that transcription is affected via the modulation of the concentrations of the different types of holoenzymes, so saturated promoters are only weakly affected by sigma factor competition. However, in case of overlapping promoters or promoters recognized by two types of sigma factors, we find that even saturated promoters are strongly affected. Active transcription effectively lowers the affinity between the sigma factor driving it and the core RNAP, resulting in complex cross talk effects and raising the question of how their in vitro measure is relevant in the cell. We also estimate that sigma factor competition is not strongly affected by non-specific binding of core RNAPs, sigma factors, and holoenzymes to DNA. Finally, we analyze the role of increased core RNAP availability upon the shut-down of ribosomal RNA transcription during stringent response. We find that passive up-regulation of alternative sigma-dependent transcription is not only possible, but also displays hypersensitivity based on the sigma factor competition. Our theoretical analysis thus provides support for a significant role of passive control during that global switch of the gene expression program and gives new insights into RNAP partitioning in the cell. N2 - Bakterien reagieren auf Aenderungen in ihren Umgebungsbedingungen indem sie global das Genexpressionsprogramm umschalten. Die Zelle aktiviert, als spezifische Reaktion auf Stressbedingungen, mehrere charakteristische Molekuele wie zum Beispiel die Sigmafaktoren. Diese binden reversibel an die RNA Polymerase (RNAP), mit der sie einen Komplex bilden das sogenannte Holoenzym und steuern sie als Reaktion auf den Stress zu den entsprechenden Genen. In exponentiell wachsenden E. Coli Zellen wird das Meiste der Transkription von einem sogenannten Haushaltssigmafaktor organisiert. Wohingegen Stressreaktionen haeufig von alternativen Sigmafaktoren kontrolliert werden. Die verschiedenen Sigmafaktoren konkurrieren um einen begrenzten Pool von RNAP Coreenzymen, womit die Expression einzelner Gene oder Genklassen beeinflusst wird, da sie sich die Maschienerie teilen. Um den Beitrag der Sigmafaktorkonkurrenz an der gesamten Veraenderung der Genexpression quantitativ zu analysieren, haben wir ein theoretisches Modell entwickelt, welches das Binden von Sigmafaktoren mit RNAP Coreenzymen im gleichgewicht, die Transkription, das nichtspezifische Binden an die DNA sowie die Modulation verfuegbarer molekularer Komponenten beschreibt. Normalerweise wird die Assoziation des Haushaltssigmafaktors mit dem RNAP Coreenzym beguenstigt durch dessen grosse Anzahl und die hohe Bindungsaffinitaet. Daher nutzen bakterielle Zellen verschiedene, reversibele Strategien um die Transkription durch alternative Holoenzyme zu foerdern. Dazu gehoeren Anti-Sigmafaktoren, 6S RNA und generell beliebige Transkriptionsregulatoren (z.B.: Aktivatoren oder Repressoren). Sie beeinflussen das Transkriptionsprogramm der Zelle indem sie das Resultat der Sigmafaktorkonkurrenz um die RNAP Coreenzyme zugunsten eines der Sigmafaktoren verschieben. Das Modell kann validiert werden durch Vergleiche mit in vitro Konkurrenzexperimenten, die exzellente uebereinstimmung zeigen. Wir koennen feststellen, dass die Transkription durch Konzentrationsaenderungen der verschiedenen Holoenzyme beeinflusst wird, daher ist der Effekt der Sigmafaktorkonkurrenz klein bei saturierten Promotoren. Was sich jedoch aendert bei sich ueberlappenden Promotoren oder Promotoren, die von zwei verschiedenen Sigmafaktoren erkannt werden. In diesen Faellen sehen wir einen grossen Effekt. Transkription fuehrt zu effektiv abgesekten Affinitaet zwischen den zugehoerigen Sigmafaktoren und den RNAP Coreenzymen, was zu komplizierten Verhalten fuehrt und die Frage aufwirft, inwieweit in vitro gemessenen Effekte in der Zelle wiederzufinden sind. Wir koennen den Einfluss nichtspezifischen Bindens der RNAPs, der Sigmafaktoren und der Holoenzyme an die DNA abschaetzen. Als letztes analysieren wir die Konkurrenz waehrend der "Stringent Response". Hierbei wird die Transkription der ribosomalen RNA unterbrochen was die Anzahl der freien RNAP Coreenzyme stark erhoeht. Wir sehen, dass das passive Hochregeln des alternativen sigmafaktorabhaengigen Transkriptionsprogramms durch Sigmafaktorkokurrenz moeglich und sogar hypersensitiv ist. Unsere theoretische Analyse zeigt, dass die passive Kontrolle in diesem Fall eine signifikante Rolle im globalen umschalten des Transkriptionsprogramms spielt und liefert neue Erkenntnisse zur RNAP Partitionierung in der Zelle. T2 - Ein Modell für die Konkurrenz zwischen Sigmafaktoren in Bakterienzellen KW - biophysics KW - systems biology KW - gene regulation KW - stress response KW - Biophysik KW - Systembiologie KW - Genregulation KW - Stressantwort Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-72098 ER - TY - THES A1 - Schönheit, Jörg T1 - A phagocyte-specific Irf8 gene enhancer establishes early conventional dendritic cell commitment T1 - Ein Phagozyten spezifischer Enhancer des Irf8 Gens steuert die Entwicklung konventioneller dendritischer Zellen N2 - Haematopoietic development is a complex process that is strictly hierarchically organized. Here, the phagocyte lineages are a very heterogeneous cell compartment with specialized functions in innate immunity and induction of adaptive immune responses. Their generation from a common precursor must be tightly controlled. Interference within lineage formation programs for example by mutation or change in expression levels of transcription factors (TF) is causative to leukaemia. However, the molecular mechanisms driving specification into distinct phagocytes remain poorly understood. In the present study I identify the transcription factor Interferon Regulatory Factor 8 (IRF8) as the specification factor of dendritic cell (DC) commitment in early phagocyte precursors. Employing an IRF8 reporter mouse, I showed the distinct Irf8 expression in haematopoietic lineage diversification and isolated a novel bone marrow resident progenitor which selectively differentiates into CD8α+ conventional dendritic cells (cDCs) in vivo. This progenitor strictly depends on Irf8 expression to properly establish its transcriptional DC program while suppressing a lineage-inappropriate neutrophile program. Moreover, I demonstrated that Irf8 expression during this cDC commitment-step depends on a newly discovered myeloid-specific cis-enhancer which is controlled by the haematopoietic transcription factors PU.1 and RUNX1. Interference with their binding leads to abrogation of Irf8 expression, subsequently to disturbed cell fate decisions, demonstrating the importance of these factors for proper phagocyte cell development. Collectively, these data delineate a transcriptional program establishing cDC fate choice with IRF8 in its center. N2 - Die Differenzierung von hämatopoietischen Zellen ist ein komplexer Prozess, der strikt hierarchisch organisiert ist. Dabei stellen die Phagozyten eine sehr heterogene Zellpopulation dar, mit hochspezialisierten Funktionen im angeborenen Immunsystem sowie während der Initialisierung der adaptiven Immunreaktion. Ihre Entwicklung, ausgehend von einer gemeinsamen Vorläuferzelle, unterliegt einer strikten Kontrolle. Die Beeinträchtigung dieser Linienentscheidungsprogramme, z.B. durch Mutationen oder Änderungen der Expressionslevel von Transkriptionsfaktoren kann Leukämie auslösen. Die molekularen Mechanismen, welche die linienspezifische Entwicklung steuern, sind allerdings noch nicht im Detail bekannt. In dieser Arbeit zeige ich den maßgeblichen Einfluss des Transkriptionsfaktors Interferon Regulierender Faktor 8 (IRF8) auf die Entwicklung von dendritischen Zellen (DC) innerhalb der Phagozyten. Mittels einer IRF8-Reporter Maus stellte ich die sehr differenziellen Expressionsmuster von Irf8 in der hämatopoietischen Entwicklung dar. Dabei konnte ich eine neue, im Knochenmark lokalisierte, Vorläuferpopulation isolieren, die in vivo spezifisch Differenzierung in CD8α+ konventionelle dendritische Zellen (cDC) steuert. Dieser Vorläufer ist dabei absolut von der Expression von Irf8 abhängig und etabliert auf transkriptioneller Ebene die dendritische Zellentwicklung, während gleichzeitig die Entwicklung neutrophiler Zellen unterdrückt wird. Darüber hinaus zeigte ich, dass Irf8 Expression während der cDC Entwicklung von einem neu charakterisierten cis-regulatorischen Enhancer abhängt, der spezifisch in myeloiden Zellen agiert. Ich konnte zeigen, dass die hämatopoietischen Transkriptionfaktoren PU.1 und RUNX1 mittels dieses Enhancers die Irf8 Expression steuern. Können diese beiden Faktoren nicht mit dem Enhancer interagieren, führt das zu stark verminderter Irf8 Expression, damit zu Veränderungen in den Differnzierungsprogrammen der Zellen, was die Bedeutung dieses regulatorischen Mechanismus unterstreicht. Zusammengefasst beschreiben diese Daten die Etablierung der frühen cDC Entwicklung, in der IRF8 die zentrale Rolle spielt. KW - Hämatopoiese KW - dendritische Zelle KW - Immunologie KW - Transkiptionsfaktor KW - Genregulation KW - haematopoiesis KW - dendritic cell KW - immunology KW - transcription factor KW - gene regulation Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-55482 ER -