TY  - THES
A1  - Bringmann, Martin
T1  - Identification of novel components that connect cellulose synthases to the cytoskeleton
T1  - Identifikation neuer Proteine als Bindeglieder zwischen den Zellulosesynthasen und dem Zytoskelett
N2  - Cellulose is the most abundant biopolymer on earth and the main load-bearing structure in plant cell walls. Cellulose microfibrils are laid down in a tight parallel array, surrounding plant cells like a corset. Orientation of microfibrils determines the direction of growth by directing turgor pressure to points of expansion (Somerville et al., 2004). Hence, cellulose deficient mutants usually show cell and organ swelling due to disturbed anisotropic cell expansion (reviewed in Endler and Persson, 2011). How do cellulose microfibrils gain their parallel orientation? First experiments in the 1960s suggested, that cortical microtubules aid the cellulose synthases on their way around the cell (Green, 1962; Ledbetter and Porter, 1963). This was proofed in 2006 through life cell imaging (Paredez et al., 2006). However, how this guidance was facilitated, remained unknown. Through a combinatory approach, including forward and reverse genetics together with advanced co-expression analysis, we identified pom2 as a cellulose deficient mutant. Map- based cloning revealed that the gene locus of POM2 corresponded to CELLULOSE SYNTHASE INTERACTING 1 (CSI1). Intriguingly, we previously found the CSI1 protein to interact with the putative cytosolic part of the primary cellulose synthases in a yeast-two-hybrid screen (Gu et al., 2010). Exhaustive cell biological analysis of the POM2/CSI1 protein allowed to determine its cellular function. Using spinning disc confocal microscopy, we could show that in the absence of POM2/CSI1, cellulose synthase complexes lose their microtubule-dependent trajectories in the plasma membrane. The loss of POM2/CSI1, however does not influence microtubule- dependent delivery of cellulose synthases (Bringmann et al., 2012). Consequently, POM2/CSI1 acts as a bridging protein between active cellulose synthases and cortical microtubules. This thesis summarizes three publications of the author, regarding the identification of proteins that connect cellulose synthases to the cytoskeleton. This involves the development of bioinformatics tools allowing candidate gene prediction through co-expression studies (Mutwil et al., 2009), identification of candidate genes through interaction studies (Gu et al., 2010), and determination of the cellular function of the candidate gene (Bringmann et al., 2012).
N2  - Zellulose ist das abundanteste Biopolymer der Erde und verleiht pflanzlichen Zellwänden ihre enorme Tragkraft. Mit der Reißfestigkeit von Stahl umwickeln Zellulosefibrillen pflanzliche Zellwände wie ein Korsett. Die Orientierung der Zellulosefibrillen bestimmt zugleich die Wachstumsrichtung, indem sie den Zellinnendruck (Turgor) in die entsprechende Ausdehnungsrichtung dirigiert (Somerville et al.,2004).Folglich zeigen Mutanten mit gestörter Zellulosesynthese oft geschwollene Organe und Zellen, die sich nicht mehr gerichtet ausdehnen können (zusammengefasst von Endler und Persson,2011). Wie aber erhalten die Zellulosefibrillen ihre parallele Orientierung? Erste Experimente aus den1960ern führten zur Vermutung, kortikale Mikrotubuli leiten die Zellulosesynthasen auf ringförmigen Bahnen um die Zellen herum (Green, 1962; Ledbetter and Porter, 1963). Diese Theorie wurde 2006 mit Hilfe moderner mikroskopischer Methoden bestätigt (Paredez et al., 2006). Wie jedoch dieser Leitmechanismus funktioniert, blieb bisher unentdeckt. Durch die Kombination verschiedener genetischer und bioinformatischer Methoden, konnten wir pom2 als Zellulose defiziente Mutante identifizieren. Die Ermittlung des Genlocus durch Map-based cloning zeigte, dass es sich bei POM2 um CELLULOSE SYNTHASE INTERACTING 1 (CSI1) handelt, ein Gen, dessen korrespondierendes Protein, wie vorher von uns gezeigt, mit dem zytosolischen Teil der primären Zellulosesynthasen interagiert (Gu et al., 2010). Durch ausführliche zellbiologische Charakterisierung von POM2/CSI1 konnten wir seine zelluläre Funktion entschlüsseln. Mit Hilfe konfokaler Spinning- Disc-Mikroskopie konnten wir zeigen, dass in Abwesenheit von POM2/CSI1, Zellulosesynthasen von den Mikrotubuli- Bahnen abweichen. Der ebenfalls von den Mikrotubuli abhängige Transport der Zellulosesynthasen zur Zellmembran hingegen, war nicht beeinflusst (Bringmann et al., 2012). Demzufolge ist POM2/CSI1 das gesuchte Bindeglied zwischen aktiven Zellulosesynthasen und Mikrotubuli. In dieser Dissertationsschrift werden drei Publikationen des Autors zusammengefasst, die wa ̈hrend der Arbeit an der Dissertiation entstanden sind. Sie beinhalten die Entwicklung bioinformatischer Methoden zur Ko- Expressionsanalyse, um Kandidatengene zu ermitteln (Mutwil et al., 2009), die Identifikaton des Kandidatengens POM2/CSI1 in einer Interaktionsstudie (Gu et al., 2010), sowie die Bestimmung der zellula ̈ren Funktion des korrespondieren- den Proteins POM2/CSI1 (Bringmann et al., 2012).
KW  - Zellwand
KW  - Zytoskelett
KW  - Mikrotubuli
KW  - CESA Komplex
KW  - Polysaccharide
KW  - cell wall
KW  - cytoskeleton
KW  - microtubules
KW  - cesa complex
KW  - polysaccharides
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-61478
ER  - 
TY  - THES
A1  - Nikolovski, Nino
T1  - Pectin: New insights from an old polymer through pectinase-based genetic screens
T1  - Pektin: Neue Einblicke in ein altes Polymer durch Pektinase-basierte genetische Screens
N2  - Pectic polysaccharides, a class of plant cell wall polymers, form one of the most complex networks known in nature. Despite their complex structure and their importance in plant biology, little is known about the molecular mechanism of their biosynthesis, modification, and turnover, particularly their structure-function relationship. One way to gain insight into pectin metabolism is the identification of mutants with an altered pectin structure. Those were obtained by a recently developed pectinase-based genetic screen. Arabidopsis thaliana seedlings grown in liquid medium containing pectinase solutions exhibited particular phenotypes: they were dwarfed and slightly chlorotic. However, when genetically different A. thaliana seed populations (random T-DNA insertional populations as well as EMS-mutagenized populations and natural variations) were subjected to this treatment, individuals were identified that exhibit a different visible phenotype compared to wild type or other ecotypes and may thus contain a different pectin structure (pec-mutants). After confirming that the altered phenotype occurs only when the pectinase is present, the EMS mutants were subjected to a detailed cell wall analysis with particular emphasis on pectins. This suite of mutants identified in this study is a valuable resource for further analysis on how the pectin network is regulated, synthesized and modified. Flanking sequences of some of the T-DNA lines have pointed toward several interesting genes, one of which is PEC100. This gene encodes a putative sugar transporter gene, which, based on our data, is implicated in rhamnogalacturonan-I synthesis. The subcellular localization of PEC100 was studied by GFP fusion and this protein was found to be localized to the Golgi apparatus, the organelle where pectin biosynthesis occurs. Arabidopsis ecotype C24 was identified as a susceptible one when grown with pectinases in liquid culture and had a different oligogalacturonide mass profile when compared to ecotype Col-0. Pectic oligosaccharides have been postulated to be signal molecules involved in plant pathogen defense mechanisms. Indeed, C24 showed elevated accumulation of reactive oxygen species upon pectinase elicitation and had altered response to the pathogen Alternaria brassicicola in comparison to Col-0. Using a recombinant inbred line population three major QTLs were identified to be responsible for the susceptibility of C24 to pectinases. In a reverse genetic approach members of the qua2 (putative pectin methyltransferase) family were tested for potential target genes that affect pectin methyl-esterification. The list of these genes was determined by in silico study of the pattern of expression and co-expression of all 34 members of this family resulting in 6 candidate genes. For only for one of the 6 analyzed genes a difference in the oligogalacturonide mass profile was observed in the corresponding knock-out lines, confirming the hypothesis that the methyl-esterification pattern of pectin is fine tuned by members of this gene family. This study of pectic polysaccharides through forward and reverse genetic screens gave new insight into how pectin structure is regulated and modified, and how these modifications could influence pectin mediated signalling and pathogenicity.
N2  - Pektin Polysaccharide, eine Klasse pflanzlicher Zellwand Polymere, formen eine der komplexesten natürlichen Strukturen. Trotz seiner immensen Bedeutung in der Biologie der Pflanzen sind die Kenntisse über die molekularen Mechanismen der Pektin Biosynthese, dessen Modifikation und Abbau überraschend gering. Eine Möglichkeit neue Einblicke in den pflanzlichen Pektin Metabolismus zu erhalten, ist die Identifizierung von Mutanten mit veränderter Pektinstruktur. Solche Mutanten konnten durch ein neuatiges Selektionsverfahren gefunden werden. Zieht man Keimlinge der Ackerschmalwand (Arabidopsis thaliana) in Flüssigmedium mit Pektinase an, so lässt sich ein typischer Phänotyp beobachten: Die Pflanzen sind kleinwüchsig und leicht chlorotisch. Diesem Verfahren wurden Populationen verschiedener Genotypen (Insertions Linien, EMS Mutanten, natürlich vorkommende Varianten) ausgesetzt. Auf diese Weise wurden Individuen identifiziert, die gegenüber der Pektinase Behandlung eine verminderte oder erhöhte Resistenz aufweisen, was auf eine veränderte Pektinstruktur hindeutet. Die EMS Mutanten wurden einer detaillierten Zellwand Analyse unterzogen. die so in dieser Arbeit identifizierte Kollektion von Mutanten stellt eine wertvolle Ressource für weitere Forschungsansätze zur Regulation, Biosynthese und Modifikation des Pektins dar. Die Lokalisation der Insertionen in den T-DNA Linien führte zur Identifikation interessanter Gene, zu denen der putative Zuckertransporter PEC100 gehört. Dieses Gen steht vermutlich in Verbindung mit der Synthese von Rhamnogalakturonan-I, einem Bestandteil des Pektins. In dieser Arbeit konnte PEC100 im Golgi Apparat, dem Ort der Pektin Biosynthese, lokalisiert werden. Die natürlich vorkommende Variante C24 ist besonders empfindlich gegenüber der Pektinase. Diese Empfindlichkeit konnte anhand rekombinanter Inzucht Linien auf drei bedeutende quantitative Merkmalsloci (QTL) eingegrenzt werden. C24 zeigte zudem ein gegenüber der Referenz verändertes Massenprofil der Oligogalakturonide. Diese werden derzeit als Signalmoleküle in der pflanzlichen Pathogenabwehr diskutiert, was mit der in dieser Arbeit geseigten Resistenz von C24 gegenüber Schwarzfleckigkeit verursachende Pilz (Alternaria brassicicola) korreliert. In einem revers-genetischen Ansatz wurden zudem Mitglieder der Pektin Methyltransferase Familie als potentielle Enzyme getestet, die die Pektin Methylesterifikation beeinflussen könnten. Diese Mutation in einer dieser Methyltransferasen führte zu Veränderungen des Oligogalakturonid Massenprofils. Dies bestätigt die Hypothese, dass Mitglieder dieser Genfamilie an der Regulation der Methylesterifikation von Pektin beteiligt sind. Die vorliegende Studie, in der ein genetishen Selektionverfahren und Methoden der reversen Genetik kombiniert wurden, hat neue Einblicke in die Regulation und Modifikation von Pektin geliefert.
KW  - Pektin
KW  - Pektinase
KW  - genetischer Screen
KW  - Arabidopsis thaliana
KW  - Zellwand
KW  - pectin
KW  - pectinase
KW  - genetic screen
KW  - Arabidopsis thaliana
KW  - cell wall
Y1  - 2009
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-35255
ER  - 
TY  - THES
A1  - Usadel, Björn
T1  - Untersuchungen zur Biosynthese der pflanzlichen Zellwand = [Identification and characterization of genes involved in plant cell wall synthesis]
T1  - Untersuchungen zur Biosynthese der pflanzlichen Zellwand
N2  - Even though the structure of the plant cell wall is by and large quite well characterized, its synthesis and regulation remains largely obscure. However, it is accepted that the building blocks of the polysaccharidic part of the plant cell wall are nucleotide sugars. Thus to gain more insight into the cell wall biosynthesis, in the first part of this thesis, plant genes possibly involved in the nucleotide sugar interconversion pathway were identified using a bioinformatics approach and characterized in plants, mainly in Arabidopsis. For the computational identification profile hidden markov models were extracted from the Pfam and TIGR databases. Mainly with these, plant genes were identified facilitating the “hmmer” program. Several gene families were identified and three were further characterized, the UDP-rhamnose synthase (RHM), UDP-glucuronic acid epimerase (GAE) and the myo-inositol oxygenase (MIOX) families. For the three-membered RHM family relative ubiquitous expression was shown using variuos methods. For one of these genes, RHM2, T-DNA lines could be obtained. Moreover, the transcription of the whole family was downregulated facilitating an RNAi approach. In both cases a alteration of cell wall typic polysaccharides and developmental changes could be shown. In the case of the rhm2 mutant these were restricted to the seed or the seed mucilage, whereas the RNAi plants showed profound changes in the whole plant. In the case of the six-membered GAE family, the gene expressed to the highest level (GAE6) was cloned, expressed heterologously and its function was characterized. Thus, it could be shown that GAE6 encodes for an enzyme responsible for the conversion of UDP-glucuronic acid to UDP-galacturonic acid. However, a change in transcript level of variuos GAE family members achieved by T-DNA insertions (gae2, gae5, gae6), overexpression (GAE6) or an RNAi approach, targeting the whole family, did not reveal any robust changes in the cell wall. Contrary to the other two families the MIOX gene family had to be identified using a BLAST based approach due to the lack of enough suitable candidate genes for building a hidden markov model. An initial bioinformatic characterization was performed which will lead to further insights into this pathway. In total it was possible to identify the two gene families which are involved in the synthesis of the two pectin backbone sugars galacturonic acid and rhamnose. Moreover with the identification of the MIOX genes a genefamily, important for the supply of nucleotide sugar precursors was identified. In a second part of this thesis publicly available microarray datasets were analyzed with respect to co-responsive behavior of transcripts on a global basis using nearly 10,000 genes. The data has been made available to the community in form of a database providing additional statistical and visualization tools (http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de). Using the framework of the database to identify nucleotide sugar converting genes indicated that co-response might be used for identification of novel genes involved in cell wall synthesis based on already known genes.
N2  - Obwohl der Aufbau der pflanzlichen Zellwand im Großen und Ganzen relativ gut charakterisiert ist, ist relativ wenig über ihre Synthese bekannt. Allgemein akzeptiert ist jedoch, dass die Nukleotidzucker die Vorstufe für den polysaccharidären Teil der Zellwand stellen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden neue Kandidatengene für die Zellwandbiosynthese mittels bioinformatorischer Analysen ermittelt und deren Rolle in Pflanzen, hauptsächlich Arabidopsis thaliana untersucht. Zur Identifizierung von Arabidopsis thaliana Kandidatengenen des Nukleotidzucker-Stoffwechselweges wurden „hidden Markov Modelle“ für Gene desselben aus den Datenbanken Pfam und TIGR extrahiert. Unter anderem wurden diese dann unter Zuhilfenahme des Programms hmmer zur Identifikation von pflanzlichen Genen benutzt. Es wurden einige Genfamilien identifiziert und drei von diesen wurden weiter charakterisiert. Hierbei handelte sich um eine UDP-Rhamnose Synthase Familie (RHM), eine UDP-Glucuronsäurepimerase Familie (GAE) und eine myo-Inositol Oxygenase Familie (MIOX). Für die RHM Kandidatengenfamilie, mit drei Mitgliedern, wurde die relativ ubiquitäre Expression aller Gene mittels verschiedener Methoden gezeigt und für eines der Gene, RHM2, konnten T-DNA Linien bezogen werden. Außerdem wurde die Transkription der gesamten Familie mittels eines RNAi Konstruktes herunter geregelt. In beiden Fällen konnte eine Veränderung von zellwandtypischen Polysacchariden sowie schwere Entwicklungsstörungen gezeigt werden. Diese waren bei der rhm2 Funktionsverlustpflanze auf den Samenschleim bzw. den Samen reduziert, bei den RNAi Pflanzen hingegen war die gesamte Pflanze betroffen. Im Falle der zweiten Kandidatengenfamilie, GAE, wurde das höchst-exprimierte Gen (GAE6) kloniert, heterolog exprimiert und die Funktion charakterisiert. So konnte gezeigt werden, dass GAE6 für ein Enzym kodiert, welches UDP-Glukuronsäure in UDP-Galakturonsäure wandelt. Allerdings zeigten Pflanzen mit veränderter Transkriptmenge, erreicht durch T-DNA Insertionen (gae2, gae5, gae6), Überexpression (GAE6) oder RNAi , keine robuste Veränderung der Zellwand. Die letzte betrachtete Kandiatengenfamilie myo-Inositol Oxygenase wurde im Gegensatz zu den beiden anderen Familien, durch eine BLAST Suche gefunden, da zur Zeit der Durchführung noch zu wenig myo-inositol Oxygenasen bekannt waren, um daraus „hidden Markov Modelle“ abzuleiten. Dennoch konnten erste bioinformatorische Analysen zu dieser Genfamilie gemacht werden. Insgesamt gesehen wurden in diesem Teil der Arbeit die beiden Genfamilien identifiziert und charkterisiert, die bei der Synthese der beiden Pektinrückgradzucker Rhamnose und Galakturonsäure die tragende Rolle spielen. Weiterhin wurde mit der Identifizierung der MIOX Genfamilie, eine Genfamilie identifiziert, die wichtige Vorstufen in der Synthese der Nukleotidzucker liefert. In einem zweiten Teil der Arbeit wurden öffentlich zugängliche Mikroarray-Daten durch ihr Gleich -oder Ungleichverhalten charakterisiert. Dieses erfolgte auf globaler Ebene für zunächst fast 10.000 Gene. Die Daten wurden in Form einer allgemein zugänglichen Datenbank der Allgemeinheit zur Verfügung gestellt (http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de). Eine Anwendung der Methode auf Gene des Nukleotidzuckerstoffwechsels, deutet darauf hin, dass so neue Kandiatengene, die bei der Zellwandsynthese eine Rolle spielen, von bereits bekannten Genen abgeleitet werden können.
T2  - Identification and Characterization of Genes Involved in Plant Cell Wall Synthesis
KW  - Zellwand
KW  - Rhamnose
KW  - Galacturonsäure
KW  - Pektinsäure
KW  - Pektine
KW  - Inosite
KW  - Korrelationsanalyse
KW  - plant cell wall biosynthesis
KW  - udp-rhamnose
KW  - udp-galacturonic acid
KW  - correlation networks
Y1  - 2004
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-2947
ER  -