TY - THES A1 - Cheng, Feng T1 - Evolution and ontogeny of electric organ discharge in African weakly electric fish genus Campylomormyrus: a genomic and transcriptomic perspective N2 - The African weakly electric fishes (Mormyridae) exhibit a remarkable adaptive radiation possibly due to their species-specific electric organ discharges (EODs). It is produced by a muscle-derived electric organ that is located in the caudal peduncle. Divergence in EODs acts as a pre-zygotic isolation mechanism to drive species radiations. However, the mechanism behind the EOD diversification are only partially understood. The aim of this study is to explore the genetic basis of EOD diversification from the gene expression level across Campylomormyrus species/hybrids and ontogeny. I firstly produced a high quality genome of the species C. compressirostris as a valuable resource to understand the electric fish evolution. The next study compared the gene expression pattern between electric organs and skeletal muscles in Campylomormyrus species/hybrids with different types of EOD duration. I identified several candidate genes with an electric organ-specific expression, e.g. KCNA7a, KLF5, KCNJ2, SCN4aa, NDRG3, MEF2. The overall genes expression pattern exhibited a significant association with EOD duration in all analyzed species/hybrids. The expression of several candidate genes, e.g. KCNJ2, KLF5, KCNK6 and KCNQ5, possibly contribute to the regulation of EOD duration in Campylomormyrus due to their increasing or decreasing expression. Several potassium channel genes showed differential expression during ontogeny in species and hybrid with EOD alteration, e.g. KCNJ2. I next explored allele specific expression of intragenus hybrids by crossing the duration EOD species C. compressirostris with the medium duration EOD species C. tshokwe and the elongated duration EOD species C. rhynchophorus. The hybrids exhibited global expression dominance of the C. compressirostris allele in the adult skeletal muscle and electric organ, as well as in the juvenile electric organ. Only the gene KCNJ2 showed dominant expression of the allele from C. rhynchophorus, and this was increasingly dominant during ontogeny. It hence supported our hypothesis that KCNJ2 is a key gene of regulating EOD duration. Our results help us to understand, from a genetic perspective, how gene expression effect the EOD diversification in the African weakly electric fish. N2 - Die Mormyridae, eine Familie afrikanischer schwach elektrischer Süßwasserfische, zeigen eine außergewöhnliche adaptive Radiation. Eine Erklärung für die Diversifizierung dieser Gruppe stellen die artspezifischen elektrischen Organentladungen (EODs) dar. Diese werden von einem elektrischen Organ muskulären Ursprungs im Ansatz der Schwanzflosse erzeugt. Die verschiedenen EODs könnten als präzygotischer Isolationsmechanismus für die Radiation verantwortlich sein. Dennoch ist der Mechanismus hinter der EOD-Diversifizierung bisher nicht vollständig geklärt. Ziel dieser Studie ist es, die genetische Grundlage der EOD-Diversifizierung auf der Ebene der Genexpression bei verschiedenen Campylomormyrus-Arten bzw. -Hybriden und während der Ontogenese zu ermitteln. Zunächst wurde erstmals das Genom der Art C. compressirostris in hoher Qualität sequenziert. Dies bildet eine bedeutende Grundlage für das Verständnis der Evolution der elektrischen Fische. In der zweiten Studie wurden Genexpressionsmuster von elektrischen Organen und Skelettmuskeln bei Campylomormyrus-Arten bzw. -Hybriden mit unterschiedlicher EOD-Dauer verglichen. Dabei konnten mehrere Kandidatengene identifiziert werden, die potentiell Elektroorgan-spezifisch exprimiert sind, i.a. KCNA7a, KLF5, KCNJ2, SCN4aa, NDRG3, MEF2. Bei allen untersuchten Arten/Hybriden wies das Genexpressionsmuster einen signifikanten Zusammenhang mit der EOD-Dauer auf. Die Expression mehrerer Kandidatengene, wie beispielsweise KCNJ2, KLF5, KCNK6 und KCNQ5, trägt möglicherweise zur Regulierung der EOD-Dauer bei Campylomormyrus bei. Bei Arten und Hybriden mit EOD-Unterschieden zeigten Kaliumkanal-Gene wie KCNJ2 eine unterschiedliche Expression während der Ontogenese. Zudem wurde die Allel-spezifische Expression bei Intragenus-Hybriden unter Verwendung der Arten C. compressirostris, C. tshokwe und C. rhynchophorus, die jeweils eine kurze, intermediäre bzw. lange EOD-Dauer aufweisen, untersucht. Die Hybriden wiesen eine generell dominante Expression der Allele von C. compressirostris in der adulten Skelettmuskulatur und im elektrischen Organ sowie im juvenilen elektrischen Organ auf. Einzig im Gen KCNJ2 dominierte das Allel von C. rhynchophorus, mit zunehmender Dominanz mit fortschreitender Ontogenese. Dies stützt unsere Hypothese einer Beteiligung des KCNJ2-Gens an der Regulation der EOD-Dauer. Unsere Ergebnisse stellen einen wesentlichen Beitrag zum Verständnis des Einflusses der Genexpression auf die EOD-Diversifizierung bei afrikanischen schwach elektrischen Fischen dar. KW - tropical freshwater fish KW - weakly electric fish KW - genomics KW - transcriptomics KW - Genomik KW - Transkriptomik KW - tropische Süßwasserfische KW - schwach elektrischer Fisch Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-630172 ER - TY - THES A1 - Stange, Maike T1 - A study on Coronin-A and Aip1 function in motility of Dictyostelium discoideum and on Aip1 interchangeability between Dictyostelium discoideum and Arabidopsis thaliana T1 - Studie über die Funktion von Coronin-A und Aip1 bei der Motilität von Dictyostelium discoideum und zur Aip1-Austauschbarkeit zwischen Dictyostelium discoideum und Arabidopsis thaliana N2 - Actin is one of the most highly conserved proteins in eukaryotes and distinct actin-related proteins with filament-forming properties are even found in prokaryotes. Due to these commonalities, actin-modulating proteins of many species share similar structural properties and proposed functions. The polymerization and depolymerization of actin are critical processes for a cell as they can contribute to shape changes to adapt to its environment and to move and distribute nutrients and cellular components within the cell. However, to what extent functions of actin-binding proteins are conserved between distantly related species, has only been addressed in a few cases. In this work, functions of Coronin-A (CorA) and Actin-interacting protein 1 (Aip1), two proteins involved in actin dynamics, were characterized. In addition, the interchangeability and function of Aip1 were investigated in two phylogenetically distant model organisms. The flowering plant Arabidopsis thaliana (encoding two homologs, AIP1-1 and AIP1-2) and in the amoeba Dictyostelium discoideum (encoding one homolog, DdAip1) were chosen because the functions of their actin cytoskeletons may differ in many aspects. Functional analyses between species were conducted for AIP1 homologs as flowering plants do not harbor a CorA gene. In the first part of the study, the effect of four different mutation methods on the function of Coronin-A protein and the resulting phenotype in D. discoideum was revealed in two genetic knockouts, one RNAi knockdown and a sudden loss-of-function mutant created by chemical-induced dislocation (CID). The advantages and disadvantages of the different mutation methods on the motility, appearance and development of the amoebae were investigated, and the results showed that not all observed properties were affected with the same intensity. Remarkably, a new combination of Selection-Linked Integration and CID could be established. In the second and third parts of the thesis, the exchange of Aip1 between plant and amoeba was carried out. For A. thaliana, the two homologs (AIP1-1 and AIP1-2) were analyzed for functionality as well as in D. discoideum. In the Aip1-deficient amoeba, rescue with AIP1-1 was more effective than with AIP1-2. The main results in the plant showed that in the aip1-2 mutant background, reintroduced AIP1-2 displayed the most efficient rescue and A. thaliana AIP1-1 rescued better than DdAip1. The choice of the tagging site was important for the function of Aip1 as steric hindrance is a problem. The DdAip1 was less effective when tagged at the C-terminus, while the plant AIP1s showed mixed results depending on the tag position. In conclusion, the foreign proteins partially rescued phenotypes of mutant plants and mutant amoebae, despite the organisms only being very distantly related in evolutionary terms. N2 - Actin ist eines der am stärksten konservierten Proteine in Eukaryoten und sogar Prokaryoten weisen Aktin-ähnliche Proteine mit filamentbildenden Eigenschaften auf. Aufgrund dieser Gemeinsamkeiten teilen Aktin-modulierte Proteine vieler Arten ähnliche strukturelle Eigenschaften und vermutlich auch Funktionen. Die Polymerisierung und Depolymerisation von Aktin sind kritische Prozesse für eine Zelle, da sie zu Zellformänderungen beitragen können, um sich an die Umgebung anzupassen und Nährstoffe sowie zelluläre Komponenten innerhalb der Zelle zu bewegen und zu verteilen. Inwieweit die Funktionen von Aktin-bindenden Proteinen zwischen entfernt verwandten Arten funktionell konserviert sind, wurde jedoch nur in wenigen Fällen untersucht. In dieser Arbeit wurden Funktionen von Coronin-A (CorA) und Actin-interagierendem Protein 1 (AIP1), zweier an der Aktindynamik beteiligter Proteine, charakterisiert. Darüber hinaus wurde die Austauschbarkeit und Funktion von AIP1 in zwei phylogenetisch entfernten Modellorganismen untersucht. Die Blütenpflanze Arabidopsis thaliana (kodiert für zwei Homologe: AIP1-1 und AIP1-2) und die Amöbe Dictyostelium discoideum (kodiert für ein Homolog: DdAip1) wurden ausgewählt, weil die Funktionen ihrer Aktin-Zytoskelette in mehreren Aspekten verschieden sein könnten. Funktionelle Analysen zwischen Arten wurden für AIP1-Homologe durchgeführt, da Blütenpflanzen kein CorA Gen tragen. Im ersten Teil der Arbeit wurde die Wirkung von vier verschiedenen Mutationsmethoden auf die Funktion des CorA-Proteins und des resultierenden Phänotyps in D. discoideum in zwei genetischen Knockouts, einem RNAi Knockdown und einem durch chemisch induzierte Delokalisierung (CID) erzeugten Mutanten geprüft. Die Vor- und Nachteile der Methoden zur Motilität, des Aussehens und der Entwicklung der Amöben wurden untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass nicht alle beobachteten Eigenschaften mit der gleichen Intensität beeinflusst wurden. Hierbei wurde eine neue Methodenkombination aus selektionsgebundener Integration und CID etabliert. Im zweiten und im dritten Teil der Arbeit wurde der Austausch von AIP1 zwischen Pflanze und Amöben durchgeführt. Die zwei A. thaliana-Homologe AIP1-1 und AIP1-2 wurden auf Funktionalität in D. discoideum geprüft. In Aip1-defizienten Amöben war die Rettung mit AIP1-1 effektiver als bei AIP1-2. Die Hauptergebnisse der Arbeit wiesen darauf hin, dass AIP1-2 im aip1.2-1 act7 Mutantenhintergrund die effizienteste Rettung zeigte, während A. thaliana AIP1-1 effizienter rettete als DdAip1. Die Auswahl der Tagging-Site war für die AIP1-Funktion bedeutend, da sterische Hinderung eine Rolle spielen könnte. DdAip1 war weniger effektiv, wenn es am C-Terminus fusioniert war, während die Proteinfusionen der A. thaliana AIP1s je nach Position der „tags“ unterschiedliche Ergebnisse zeigten. Zusammenfassend retteten die fremden Proteine teilweise Phänotypen von mutierten Pflanzen und mutierten Amöben, obwohl die Organismen evolutionär weit entfernt verwandt sind. KW - actin KW - cell motility KW - plant growth KW - selection-linked integration KW - chemically induced dislocation KW - interspecies interchange KW - Aktin KW - Zellmotilität KW - Pflanzenwachstum KW - Selection-Linked Integration KW - chemisch-induzierte Dislokation KW - Austausch zwischen zwei Spezies Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-628569 ER - TY - THES A1 - Schäfer, Marjänn Helena T1 - Untersuchungen zur Evolution der 15-Lipoxygenase (ALOX15) bei Säugetieren und funktionelle Charakterisierung von Knock-in-Mäusen mit humanisierter Reaktionsspezifität der 15-Lipoxygenase-2 (Alox15b) T1 - Studies on the evolution of 15-lipoxygenase (ALOX15) in mammals and functional characterization of Knock-in mice with humanized reaction specificity of 15-lipoxygenase-2 (Alox15b) N2 - Arachidonsäurelipoxygenasen (ALOX-Isoformen) sind Lipid-peroxidierenden Enzyme, die bei der Zelldifferenzierung und bei der Pathogenese verschiedener Erkrankungen bedeutsam sind. Im menschlichen Genom gibt es sechs funktionelle ALOX-Gene, die als Einzelkopiegene vorliegen. Für jedes humane ALOX-Gen gibt es ein orthologes Mausgen. Obwohl sich die sechs humanen ALOX-Isoformen strukturell sehr ähnlich sind, unterscheiden sich ihre funktionellen Eigenschaften deutlich voneinander. In der vorliegenden Arbeit wurden vier unterschiedliche Fragestellungen zum Vorkommen, zur biologischen Rolle und zur Evolutionsabhängigkeit der enzymatischen Eigenschaften von Säugetier-ALOX-Isoformen untersucht: 1) Spitzhörnchen (Tupaiidae) sind evolutionär näher mit dem Menschen verwandt als Nagetiere und wurden deshalb als Alternativmodelle für die Untersuchung menschlicher Erkrankungen vorgeschlagen. In dieser Arbeit wurde erstmals der Arachidonsäurestoffwechsel von Spitzhörnchen untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass im Genom von Tupaia belangeri vier unterschiedliche ALOX15-Gene vorkommen und die Enzyme sich hinsichtlich ihrer katalytischen Eigenschaften ähneln. Diese genomische Vielfalt, die weder beim Menschen noch bei Mäusen vorhanden ist, erschwert die funktionellen Untersuchungen zur biologischen Rolle des ALOX15-Weges. Damit scheint Tupaia belangeri kein geeigneteres Tiermodel für die Untersuchung des ALOX15-Weges des Menschen zu sein. 2) Entsprechend der Evolutionshypothese können Säugetier-ALOX15-Orthologe in Arachidonsäure-12-lipoxygenierende- und Arachidonsäure-15-lipoxygenierende Enzyme eingeteilt werden. Dabei exprimieren Säugetierspezies, die einen höheren Evolutionsgrad als Gibbons aufweisen, Arachidonsäure-15-lipoxygenierende ALOX15-Orthologe, während evolutionär weniger weit entwickelte Säugetiere Arachidonsäure-12 lipoxygenierende Enzyme besitzen. In dieser Arbeit wurden elf neue ALOX15-Orthologe als rekombinante Proteine exprimiert und funktionell charakterisiert. Die erhaltenen Ergebnisse fügen sich widerspruchsfrei in die Evolutionshypothese ein und verbreitern deren experimentelle Basis. Die experimentellen Daten bestätigen auch das Triadenkonzept. 3) Da humane und murine ALOX15B-Orthologe unterschiedliche funktionelle Eigenschaften aufweisen, können Ergebnisse aus murinen Krankheitsmodellen zur biologischen Rolle der ALOX15B nicht direkt auf den Menschen übertragen werden. Um die ALOX15B-Orthologen von Maus und Mensch funktionell einander anzugleichen, wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit Knock-in Mäuse durch die In vivo Mutagenese mittels CRISPR/Cas9-Technik hergestellt. Diese exprimieren eine humanisierte Mutante (Doppelmutation von Tyrosin603Asparaginsäure+Histidin604Valin) der murinen Alox15b. Diese Mäuse waren lebens- und fortpflanzungsfähig, zeigten aber geschlechtsspezifische Unterschiede zu ausgekreuzten Wildtyp-Kontrolltieren im Rahmen ihre Individualentwicklung. 4) In vorhergehenden Untersuchungen zur Rolle der ALOX15B in Rahmen der Entzündungsreaktion wurde eine antiinflammatorische Wirkung des Enzyms postuliert. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob eine Humanisierung der murinen Alox15b die Entzündungsreaktion in zwei verschiedenen murinen Entzündungsmodellen beeinflusst. Eine Humanisierung der murinen Alox15b führte zu einer verstärkten Ausbildung von Entzündungssymptomen im induzierten Dextran-Natrium-Sulfat-Kolitismodell. Im Gegensatz dazu bewirkte die Humanisierung der Alox15b eine Abschwächung der Entzündungssymptome im Freund‘schen Adjuvans Pfotenödemmodell. Diese Daten deuten darauf hin, dass sich die Rolle der ALOX15B in verschiedenen Entzündungsmodellen unterscheidet. N2 - Arachidonic acid lipoxygenases (ALOX-isoforms) are lipid peroxidizing enzymes that have been implicated in cell differentiation and in the pathogenesis of different diseases. In the human genome six different ALOX genes have been identified and all of them occur as single copy genes. For each human ALOX gene an ortholog exists in the mouse genome. Although human and mouse ALOX orthologs share a high degree of structural similarity ALOX15 and ALOX15B orthologs exhibit distinct functional characteristics. In the present study addressed four different questions on the occurrence, the biological role and enzyme evolution of mammalian ALOX15 and ALOX15B orthologs. 1) Tupaiidae are more closely related to humans than rodents and therefore these mammals have frequently been suggested as better animal models than mice for investigations into patho-physiological basis of human diseases. This work explored for the first time the arachidonic acid metabolism of a Tupaiidae representative (Tupaia belangeri) and found that this mammal carries four distinct ALOX15 genes in its genome. The enzymes encoded by these four genes share a high degree of functional similarity but the observed genomic multiplicity, which is neither present in mice nor in humans, makes studies into the biological role of ALOX15 orthologs more complex. Thus, Tupaia belangeri is not more suitable than mice for investigations into the biological role of mammalian ALOX15 orthologs since loss-of-function studies on one ALOX15 ortholog may easily be compensated by upregulation of an orthologous gene. 2) According to the Evolutionary Hypothesis mammalian ALOX15 orthologs can be subdivided into arachidonic acid 12-lipoxygenating and arachidonic acid 15-lipoxygenating enzymes. Mammalian species, which are ranked above gibbons express arachidonic acid 15 lipoxygenating ALOX15 orthologs. In contrast mammals ranked below gibbons express arachidonic acid 12-lipoxygenating enzymes. In this study the ALOX15 orthologs of eleven different mammals expressed as recombinant proteins and characterized their functional properties. The results of these experiments were consistent with the Evolutionary Hypothesis and put this theory on a broader experimental basis. Moreover, the obtained in vitro mutagenesis data indicate that the novel enzymes follow Triad Concept. 3) Since human and mouse ALOX15B orthologs exhibit different functional properties, conclusion drawn in mouse models of human diseases may be misleading. To make human and mouse ALOX15B orthologs more like each other were generated Alox15b knock-in mice, which express the humanized Tyr603Asp+His604Val double mutant of mouse Alox15b instead of the endogenous wildtype enzyme employing the CRISPR/Cas9 in vivo mutagenesis strategy. These Alox15b-KI mice are viable, reproduce normally but exhibit gender-specific differences to outbred wildtype control animals when the bodyweight kinetics during adolescence and early adulthood were followed. 4) In previous studies an anti-inflammatory role of ALOX15B in the pathogenesis of inflammation has been suggested. Here we explored whether functional humanization of mouse Alox15b impacts the severity of inflammatory symptoms in two mouse inflammation models. In the dextran-sodium sulfate colitis model humanization of mouse Alox15b induced more severe inflammatory symptoms. In contrast, humanization of this enzyme protected mice in the Freund’s complete adjuvants induced paw edema model. Taken together, these data suggest that the patho-physiological roles of Alox15b may vary depending on the type of the animal inflammation model used. KW - Lipoxygenase KW - ALOX15B KW - Knock in Mäuse KW - enzymatische Reaktionsspezifität KW - Tupaia belangeri KW - DSS-Colitis KW - Pfotenödem Mausmodell KW - mammalian ALOX15 orthologs Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-620340 ER - TY - THES A1 - Hammel, Alexander T1 - Establishing the red microalga Porphyridium purpureum as a novel platform for the production of recombinant proteins T1 - Die Etablierung der roten Mikroalge Porphyridium purpureum als neue Platform für die Herstellung rekombinanter Proteine N2 - Microalgae have been recognized as a promising green production platform for recombinant proteins. The majority of studies on recombinant protein expression have been conducted in the green microalga C. reinhardtii. While promising improvement regarding nuclear transgene expression in this alga has been made, it is still inefficient due to epigenetic silencing, often resulting in low yields that are not competitive with other expressor organisms. Other microalgal species might be better suited for high-level protein expression, but are limited in their availability of molecular tools. The red microalga Porphyridium purpureum recently emerged as candidate for the production of recombinant proteins. It is promising in that transformation vectors are episomally maintained as autonomously replicating plasmids in the nucleus at a high copy number, thus leading to high expression values in this red alga. In this work, we expand the genetic tools for P. purpureum and investigate parameters that govern efficient transgene expression. We provide an improved transformation protocol to streamline the generation of transgenic lines in this organism. After being able to efficiently generate transgenic lines, we showed that codon usage is a main determinant of high-level transgene expression, not only at the protein level but also at the level of mRNA accumulation. The optimized expression constructs resulted in YFP accumulation up to an unprecedented 5% of the total soluble protein. Furthermore, we designed new constructs conferring efficient transgene expression into the culture medium, simplifying purification and harvests of recombinant proteins. To further improve transgene expression, we tested endogenous promoters driving the most highly transcribed genes in P. purpureum and found minor increase of YFP accumulation. We employed the previous findings to express complex viral antigens from the hepatitis B virus and the hepatitis C virus in P. purpureum to demonstrate its feasibility as producer of biopharmaceuticals. The viral glycoproteins were successfully produced to high levels and could reach their native confirmation, indicating a functional glycosylation machinery and an appropriate folding environment in this red alga. We could successfully upscale the biomass production of transgenic lines and with that provide enough material for immunization trials in mice that were performed in collaboration. These trials showed no toxicity of neither the biomass nor the purified antigens, and, additionally, the algal-produced antigens were able to elicit a strong and specific immune response. The results presented in this work pave the way for P. purpureum as a new promising producer organism for biopharmaceuticals in the microalgal field. N2 - Biotechnologisch hergestellte Proteine (rekombinante Proteine), wie zum Beispiel monoklonale Antikörper, Insulin oder diverse Impfstoffe, spielen heutzutage eine immer wichtigere Rolle bei der Bekämpfung von Krankheiten. Diese werden hauptsächlich aus genetisch veränderten humanen Zelllinien hergestellt. Die Produktion ist allerdings sehr teuer, anfällig für Kontaminationen und nicht nachhaltig. Als Alternative dazu können Mikroalgen benutzt werden, die viel günstiger kultiviert werden können und viele Vorteile bezüglich des ökologischen Aspekts bieten. Die bisherige Forschung an Mikroalgen als Plattform für die Herstellung rekombinanter Proteine konzentriert sich vor allem auf die grüne Mikroalge Chlamydomonas reinhardtii. Doch vor allem die geringe Proteinausbeute macht diese Alge nicht zum idealen Expressionsorganismus. Kürzlich wurde die rote Mikroalge Porphyridium purpureum als vielversprechende Kandidatin für die Produktion rekombinanter Proteine identifiziert. Besonders interessant ist, dass diese Alge rekombinante Proteine in einem hohen Maß exprimiert. Diese Arbeit beschäftigt sich mit dem Potenzial von Porphyridium purpureum als relativ unerforschte Alge. Es wurden neue genetische Werkzeuge entwickelt und verschiedene Faktoren untersucht, die die Expression von eingebrachten Genen beeinflussen. Durch Optimierung dieser Parameter konnten wir die Proteinausbeute eines gelb fluoreszierenden Proteins auf 5% des löslichen Gesamtproteins steigern. Wir haben das gewonnene Wissen genutzt, um jeweils ein Oberflächenprotein vom Hepatitis B Virus und vom Hepatitis C Virus in dieser roten Mikroalge herzustellen. Diese können als möglicher zukünftiger Impfstoff benutzt werden. Wir konnten zeigen, dass beide Proteine korrekt und in hoher Menge in Porphyridium purpureum hergestellt werden. Anschließend wurden die hergestellten Proteine auf ihre Wirksamkeit und Verträglichkeit an Mäusen getestet. Dabei wurde gezeigt, dass (i) Porphyridium purpureum nicht giftig ist und auch keine giftigen Produkte produziert und (ii) die produzierten Proteine eine effektive Immunantwort gegen die Viren induzieren. Mit dieser Arbeit wurde das Fundament für die biotechnologische Anwendung dieser roten Mikroalge gelegt. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass P. purpureum eine vielversprechende Mikroalgenart für die Produktion von biopharmazeutischen Proteinen ist. KW - microalgae KW - biotechnology KW - subunit vaccine KW - Biotechnologie KW - Mikroalgen KW - Untereinheitenimpfstoff Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-632709 ER - TY - THES A1 - Siebler, Lara T1 - Identifying novel regulators of heat stress memory in Arabidopsis thaliana T1 - Identifikation neuer Regulatoren des Hitzestressgedächtnisses in Arabidopsis thaliana N2 - Heat stress (HS) is a major abiotic stress that negatively affects plant growth and productivity. However, plants have developed various adaptive mechanisms to cope with HS, including the acquisition and maintenance of thermotolerance, which allows them to respond more effectively to subsequent stress episodes. HS memory includes type II transcriptional memory which is characterized by enhanced re-induction of a subset of HS memory genes upon recurrent HS. In this study, new regulators of HS memory in A. thaliana were identified through the characterization of rein mutants. The rein1 mutant carries a premature stop in CYCLIN-DEPENDENT-KINASE 8 (CDK8) which is part of the cyclin kinase module of the Mediator complex. Rein1 seedlings show impaired type II transcriptional memory in multiple heat-responsive genes upon re-exposure to HS. Additionally, the mutants exhibit a significant deficiency in HS memory at the physiological level. Interaction studies conducted in this work indicate that CDK8 associates with the memory HEAT SHOCK FACTORs HSAF2 and HSFA3. The results suggest that CDK8 plays a crucial role in HS memory in plants together with other memory HSFs, which may be potential targets of the CDK8 kinase function. Understanding the role and interaction network of the Mediator complex during HS-induced transcriptional memory will be an exciting aspect of future HS memory research. The second characterized mutant, rein2, was selected based on its strongly impaired pAPX2::LUC re-induction phenotype. In gene expression analysis, the mutant revealed additional defects in the initial induction of HS memory genes. Along with this observation, basal thermotolerance was impaired similarly as HS memory at the physiological level in rein2. Sequencing of backcrossed bulk segregants with subsequent fine mapping narrowed the location of REIN2 to a 1 Mb region on chromosome 1. This interval contains the At1g65440 gene, which encodes the histone chaperone SPT6L. SPT6L interacts with chromatin remodelers and bridges them to the transcription machinery to regulate nucleosome and Pol II occupancy around the transcriptional start site. The EMS-induced missense mutation in SPT6L may cause altered HS-induced gene expression in rein2, possibly triggered by changes in the chromatin environment resulting from altered histone chaperone function. Expanding research on screen-derived factors that modify type II transcriptional memory has the potential to enhance our understanding of HS memory in plants. Discovering connections between previously identified memory factors will help to elucidate the underlying network of HS memory. This knowledge can initiate new approaches to improve heat resilience in crops. N2 - Hitzestress ist ein abiotischer Stressfaktor, der Pflanzenwachstum und Ertragsfähigkeit negativ beeinflusst. Pflanzen haben Anpassungsmechanismen entwickelt, einschließlich des Erwerbs und der Aufrechterhaltung von Thermotoleranz, die es ihnen ermöglichen auf wiederholte Stressereignisse effektiver zu reagieren. Das Hitzestress-Gedächtnis umfasst unter anderem verstärkte Re-Induktion von Gedächtnisgenen nach wiederholter Exposition (Typ II). In dieser Arbeit wurden anhand der Charakterisierung von Re-Induktionsmutanten (rein Mutanten) neue Regulatoren des Typ II Hitzestress-Gedächtnisses in A. thaliana identifiziert. Die rein1 Mutante weist ein vorzeitiges Stoppcodon in CDK8 auf, einer Untereinheit im Kinasemodul des Mediator Komplexes. Rein1 Keimlinge zeigen ein beeinträchtigtes Hitzstress-Transkriptionsgedächtnis, sowie Defekte in der Aufrechterhaltung der Thermotoleranz auf physiologischer Ebene. Mittels Interaktionsstudien konnte gezeigt werden, dass CDK8 mit den im Hitzestress-Gedächtnis fungierenden Hitzeschockfaktoren HSAF2 und HSFA3 interagiert. Die Ergebnisse legen nahe, dass CDK8 zusammen mit HSFs eine Rolle bei der Aufrechterhaltung des Hitzestress-Gedächtnisses spielt, wobei letztere potenzielle Ziele der Kinasefunktion von CDK8 darstellen. Die Rolle und das Interaktionsnetzwerk des Mediatorkomplexes während der durch Hitzstress-induzierten transkriptionellen Gedächtnis-bildung und Aufrechterhaltung ist ein aufregender Aspekt zukünftiger Forschung. Die zweite rein Mutante (rein2) wurde aufgrund einer stark beeinträchtigten transkriptionellen Re-Induktion nach wiederholtem Hitzestress für weitere Charakterisierungen ausgewählt. Dabei wurden zusätzliche Defekte in der initialen Induktion von Hitzestress-Gedächtnisgenen festgestellt. Die basale Thermotoleranz in rein2 war in ähnlicher Weise beeinträchtigt wie das Hitzestress-Gedächtnis. Die Position von REIN2 wurde mithilfe von Sequenzierung und Feinkartierung auf eine 1 Mb große Region auf Chromosom 1 eingegrenzt. Dieses Intervall enthält das Gen At1g65440, das für Histon-Chaperon SPT6L kodiert. Die Missense-Mutation in SPT6L könnte die Ursache für das veränderte Hitzestress-induzierte Transkriptionsmuster in rein2 sein, möglicherweise aufgrund von einer abweichenden Chaperonfunktion und folglich Veränderung in der Chromatinumgebung. Die Ausweitung der Forschung zu den in diesem Screening ermittelten Faktoren, die das Typ II Transkriptionsgedächtnis beeinflussen, hat das Potenzial, unser derzeitiges Verständnis des Hitzestress-Gedächtnisses in Pflanzen zu verbessern und Verbindungen zwischen zuvor entdeckten Gedächtnisregulatoren herzustellen. Dieses Wissen kann dazu beitragen neue Ansätze zur Verbesserung der Hitzeresilienz bei Nutzpflanzen anzustoßen. KW - epigenetics KW - heat stress KW - molecular biology KW - genetic screen KW - Epigenetik KW - Hitzestress KW - Molekularbiologie KW - genetischer Screen Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-634477 ER - TY - THES A1 - Freimuth, Nina T1 - Elucidating the suppression of root hair formation by a member of a novel, short ENTH protein family in Arabidopsis thaliana T1 - Untersuchungen der Unterdrückung der Wurzelhaarbildung durch ein Mitglied einer neuen, kurzen ENTH-Proteinfamilie in Arabidopsis thaliana N2 - This work analyzed functional and regulatory aspects of the so far little characterized EPSIN N-terminal Homology (ENTH) domain-containing protein EPSINOID2 in Arabidopsis thaliana. ENTH domain proteins play accessory roles in the formation of clathrin-coated vesicles (CCVs) (Zouhar and Sauer 2014). Their ENTH domain interacts with membranes and their typically long, unstructured C-terminus contains binding motifs for adaptor protein complexes and clathrin itself. There are seven ENTH domain proteins in Arabidopsis. Four of them possess the canonical long C-terminus and participate in various, presumably CCV-related intracellular transport processes (Song et al. 2006; Lee et al. 2007; Sauer et al. 2013; Collins et al. 2020; Heinze et al. 2020; Mason et al. 2023). The remaining three ENTH domain proteins, however, have severely truncated C-termini and were termed EPSINOIDs (Zouhar and Sauer 2014; Freimuth 2015). Their functions are currently unclear. Preceding studies focusing on EPSINOID2 indicated a role in root hair formation: epsinoid2 T DNA mutants exhibited an increased root hair density and EPSINOID2-GFP was specifically located in non-hair cell files in the Arabidopsis root epidermis (Freimuth 2015, 2019). In this work, it was clearly shown that loss of EPSINOID2 leads to an increase in root hair density through analyses of three independent mutant alleles, including a newly generated CRISPR/Cas9 full deletion mutant. The ectopic root hairs emerging from non-hair positions in all epsinoid2 mutant alleles are most likely not a consequence of altered cell fate, because extensive genetic analyses placed EPSINOID2 downstream of the established epidermal patterning network. Thus, EPSINOID2 seems to act as a cell autonomous inhibitor of root hair formation. Attempts to confirm this hypothesis by ectopically overexpressing EPSINOID2 led to the discovery of post-transcriptional and -translational regulation through different mechanisms. One involves the little characterized miRNA844-3p. Interference with this pathway resulted in ectopic EPSINOID2 overexpression and decreased root hair density, confirming it as negative factor in root hair formation. A second mechanism likely involves proteasomal degradation. Treatment with proteasomal inhibitor MG132 led to EPSINOID2-GFP accumulation, and a KEN box degron motif was identified in the EPSINOID2 sequence associated with degradation through a ubiquitin/proteasome-dependent pathway. In line with a tight dose regulation, genetic analyses of all three mutant alleles indicate that EPSINOID2 is haploinsufficient. Lastly, it was revealed that, although EPSINOID2 promoter activity was found in all epidermal cells, protein accumulation was observed in N-cells only, hinting at yet another layer of regulation. N2 - In der vorliegenden Arbeit wurden funktionelle und regulatorische Aspekte des bisher wenig charakterisierten EPSIN N-Terminal Homology (ENTH)-Domäne-enthaltenden Proteins EPSINOID2 in Arabidopsis thaliana untersucht. ENTH-Domänen Proteine spielen akzessorische Rollen in der Bildung von Clathrin-umhüllten Vesikeln (CCVs) (Zouhar and Sauer 2014). Ihre ENTH-Domäne interagiert mit Membranen und ihr typischerweise langer, unstrukturierter C-Terminus enthält Bindungsmotive für Adapterproteinkomplexe und Clathrin selbst. In Arabidopsis gibt es sieben ENTH-Domänen Proteine. Vier von ihnen besitzen den langen C-Terminus und sind an verschiedenen, vermutlich CCV-bezogenen intrazellulären Transportprozessen beteiligt (Song et al. 2006; Lee et al. 2007; Sauer et al. 2013; Heinze et al. 2020; Collins et al. 2020; Mason et al. 2023). Die verbleibenden drei ENTH-Domänen Proteine haben jedoch stark verkürzte C-Termini und wurden als EPSINOIDe bezeichnet (Zouhar and Sauer 2014; Freimuth 2015). Ihre Funktion ist derzeit unklar. Vorangegangene Studien, die sich auf EPSINOID2 konzentrierten, deuteten auf eine Rolle bei der Wurzelhaarbildung hin: epsinoid2 T-DNA-Mutanten zeigten eine erhöhte Wurzelhaardichte und EPSINOID2-GFP war speziell in Nicht-Haarzellen in der Wurzelepidermis von Arabidopsis lokalisiert (Freimuth 2015, 2019). In dieser Arbeit wurde durch Analysen von drei unabhängigen mutierten Allelen, einschließlich einer neu generierten CRISPR/Cas9-Deletionsmutante, klar gezeigt, dass der Verlust von EPSINOID2 zu einer Erhöhung der Wurzelhaardichte führt. Die ektopischen Wurzelhaare, die in allen epsinoid2 Allelen aus Nicht-Haar-Positionen hervorgehen, sind höchstwahrscheinlich keine Folge eines veränderten Zellschicksals, da umfangreiche genetische Analysen EPSINOID2 dem etablierten Netzwerk zur Ausbildung der epidermalen Identität nachgeschaltet platziert haben. Somit scheint EPSINOID2 als zellautonomer Inhibitor der Wurzelhaarbildung zu wirken. Versuche, diese Hypothese durch ektopische Überexpression von EPSINOID2 zu bestätigen, führten zur Entdeckung einer post-transkriptionellen und translationalen Regulation durch verschiedene Mechanismen. Bei einem davon handelt es sich um die wenig charakterisierte miRNA844-3p. Eine Beeinträchtigung dieses Signalwegs führte zu einer ektopischen Überexpression von EPSINOID2 und einer verringerten Wurzelhaardichte, was bestätigt, dass es sich um einen negativen Faktor bei der Wurzelhaarbildung handelt. Ein zweiter Mechanismus beinhaltet wahrscheinlich den proteasomalen Abbau. Die Behandlung mit dem proteasomalen Inhibitor MG132 führte zur Akkumulation von EPSINOID2-GFP, und in der Sequenz von EPSINOID2 wurde ein KEN-Box Degron Motiv identifiziert, das mit dem Abbau über einen Ubiquitin/Proteasom-abhängigen Weg verbunden ist. Im Einklang mit einer strengen Dosisregulierung zeigten genetische Analysen aller drei mutierten Allele, dass EPSINOID2 haploinsuffizient ist. Abschließend wurde festgestellt, dass die Aktivität des EPSINOID2 Promotors zwar in allen Epidermiszellen zu finden war, eine Proteinakkumulation jedoch nur in Nicht-Haarzellen beobachtet wurde, was auf eine weitere Ebene der Regulation hindeutet. KW - ENTH domain proteins KW - ENTH-Domänen Proteine KW - root hair formation KW - Wurzelhaarbildung KW - miRNA regulation KW - miRNA Regulation Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-634994 ER - TY - THES A1 - Hippel, Barbara von T1 - Long-term bacteria-fungi-plant associations in permafrost soils inferred from palaeometagenomics N2 - The arctic is warming 2 – 4 times faster than the global average, resulting in a strong feedback on northern ecosystems such as boreal forests, which cover a vast area of the high northern latitudes. With ongoing global warming, the treeline subsequently migrates northwards into tundra areas. The consequences of turning ecosystems are complex: on the one hand, boreal forests are storing large amounts of global terrestrial carbon and act as a carbon sink, dragging carbon dioxide out of the global carbon cycle, suggesting an enhanced carbon uptake with increased tree cover. On the other hand, with the establishment of trees, the albedo effect of tundra decreases, leading to enhanced soil warming. Meanwhile, permafrost thaws, releasing large amounts of previously stored carbon into the atmosphere. So far, mainly vegetation dynamics have been assessed when studying the impact of warming onto ecosystems. Most land plants are living in close symbiosis with bacterial and fungal communities, sustaining their growth in nutrient poor habitats. However, the impact of climate change on these subsoil communities alongside changing vegetation cover remains poorly understood. Therefore, a better understanding of soil community dynamics on multi millennial timescales is inevitable when addressing the development of entire ecosystems. Unravelling long-term cross-kingdom dependencies between plant, fungi, and bacteria is not only a milestone for the assessment of warming on boreal ecosystems. On top, it also is the basis for agriculture strategies to sustain society with sufficient food in a future warming world. The first objective of this thesis was to assess ancient DNA as a proxy for reconstructing the soil microbiome (Manuscripts I, II, III, IV). Research findings across these projects enable a comprehensive new insight into the relationships of soil microorganisms to the surrounding vegetation. First, this was achieved by establishing (Manuscript I) and applying (Manuscript II) a primer pair for the selective amplification of ancient fungal DNA from lake sediment samples with the metabarcoding approach. To assess fungal and plant co-variation, the selected primer combination (ITS67, 5.8S) amplifying the ITS1 region was applied on samples from five boreal and arctic lakes. The obtained data showed that the establishment of fungal communities is impacted by warming as the functional ecological groups are shifting. Yeast and saprotroph dominance during the Late Glacial declined with warming, while the abundance of mycorrhizae and parasites increased with warming. The overall species richness was also alternating. The results were compared to shotgun sequencing data reconstructing fungi and bacteria (Manuscripts III, IV), yielding overall comparable results to the metabarcoding approach. Nonetheless, the comparison also pointed out a bias in the metabarcoding, potentially due to varying ITS lengths or copy numbers per genome. The second objective was to trace fungus-plant interaction changes over time (Manuscripts II, III). To address this, metabarcoding targeting the ITS1 region for fungi and the chloroplast P6 loop for plants for the selective DNA amplification was applied (Manuscript II). Further, shotgun sequencing data was compared to the metabarcoding results (Manuscript III). Overall, the results between the metabarcoding and the shotgun approaches were comparable, though a bias in the metabarcoding was assumed. We demonstrated that fungal shifts were coinciding with changes in the vegetation. Yeast and lichen were mainly dominant during the Late Glacial with tundra vegetation, while warming in the Holocene lead to the expansion of boreal forests with increasing mycorrhizae and parasite abundance. Aside, we highlighted that Pinaceae establishment is dependent on mycorrhizal fungi such as Suillineae, Inocybaceae, or Hyaloscypha species also on long-term scales. The third objective of the thesis was to assess soil community development on a temporal gradient (Manuscripts III, IV). Shotgun sequencing was applied on sediment samples from the northern Siberian lake Lama and the soil microbial community dynamics compared to ecosystem turnover. Alongside, podzolization processes from basaltic bedrock were recovered (Manuscript III). Additionally, the recovered soil microbiome was compared to shotgun data from granite and sandstone catchments (Manuscript IV, Appendix). We assessed if the establishment of the soil microbiome is dependent on the plant taxon and as such comparable between multiple geographic locations or if the community establishment is driven by abiotic soil properties and as such the bedrock area. We showed that the development of soil communities is to a great extent driven by the vegetation changes and temperature variation, while time only plays a minor role. The analyses showed general ecological similarities especially between the granite and basalt locations, while the microbiome on species-level was rather site-specific. A greater number of correlated soil taxa was detected for deep-rooting boreal taxa in comparison to grasses with shallower roots. Additionally, differences between herbaceous taxa of the late Glacial compared to taxa of the Holocene were revealed. With this thesis, I demonstrate the necessity to investigate subsoil community dynamics on millennial time scales as it enables further understanding of long-term ecosystem as well as soil development processes and such plant establishment. Further, I trace long-term processes leading to podzolization which supports the development of applied carbon capture strategies under future global warming. N2 - Die Arktis erwärmt sich schneller als der weltweite Durschnitt, was die dortigen Ökosysteme wie die borealen Nadelwälder stark beeinflusst. Die Baumgrenze verschiebt sich durch veränderte Wachstumsbedingungen nach Norden und breitet sich in Tundra-Gegenden aus. Das führt zu komplexen Auswirkungen auf den Kohlenstoffkreislauf, da durch das Baumwachstum vermehrt CO2 im Boden gespeichert wird. Andererseits wird der Albedo-Effekt der Tundra verringert und der Boden erwärmt sich verstärkt. Das wiederum führt zum Tauen von Permafrost und setzt große Mengen an gespeichertem Kohlenstoff frei. Bislang wurde vor allem die Auswirkung der Erwärmung auf Vegetationsdynamiken untersucht. Für ein gesundes Pflanzenwachstum stehen die meisten Landpflanzen in engem Austausch mit einer Vielzahl an Bakterien und Pilzen. Es ist bislang wenig verstanden, wie diese Bodengemeinschaften durch den Klimawandel beeinflusst werden. Es ist deshalb notwendig, verstärkt auch die Langzeitabhängigkeiten der Pflanzen von Mikroorganismen zu betrachten. Dies ist nicht nur ein Meilenstein bei der Untersuchung des Klimawandels auf arktische Ökosysteme. Zudem wird so die Entwicklung angepasster Strategien im Bereich der Landwirtschaft ermöglicht, was die Grundlage dafür ist, die wachsende Bevölkerung auch in Zukunft mit ausreichend Nahrungsmitteln versorgen zu können. Im ersten Teil meiner Arbeit untersuche ich das Potential, die Dynamiken von Bodenmikroorganismen aus Seesedimenten zu rekonstruieren. Ich habe gezeigt, dass molekulargenetische Analysen das sowohl für Pilze als auch Bakterien auf großen Zeitskalen ermöglichen. Eine Zuweisung der Mikroorganismen zu ihren Funktionen im Ökosystem ermöglichte, Dynamiken in den Nährstoffkreisläufen sowie in Pilzökologien zu verstehen. Die Analyse der komplexen Assoziationen von Pilzen und Pflanzen bildete den zweiten Teil meiner Arbeit. Hier konnte ich zeigen, dass Pilze und Pflanzen spezifische Muster in ihren Vorkommen miteinander zeigen und dass die Vegetation das Pilzvorkommen auch auf großen Zeitskalen beeinflusst. Die Tundravegetation des Spätglazials war vor allem von Flechten und Hefevorkommen dominiert, während die Einwanderung von borealen Wäldern in die untersuchten Gebiete zu zunehmder Mykorrhiza- und Parasitenverbreitung führte. Ich habe auch gezeigt, dass die Etablierung von Pinaceen langfristig von spezifischen Mykorrhiza-Pilzen wie Suillineae, Inocybaceae oder Hyaloscypha-Arten abhängt. Das dritte Ziel meiner Arbeit war es, zeitliche Dynamiken in der Zusammensetzung von Bodenorganismen im Bezug zur Entstehung von Böden zu rekonstruieren. Mir gelang es, die Verwitterung von Basalt nachzuvollziehen und daraus die Entstehung von Podsol abzuleiten. Ein Vergleich zu Bodengesellschaften aus Granit- und Sandstein-Einzugsgebieten zeigte, dass sich die Granit- und Basalt-Bodeneigenschaften ähneln. Allerdings zeigten die Pflanzen an den Standorten ein sehr ortsspezifisches Mikrobiom und somit eine lokale Anpassung an die Wachstumsbedingungen. Ich konnte mit dieser Arbeit zeigen, dass die Rekonstruktion von Bodenmikroorganismen im Vergleich zur Vegetation einen Einblick in Ökosystemdynamiken unter Klimawandel ermöglicht. Dies ermöglicht ein besseres Verständnis von Bodenentstehungsprozessen und vereinfacht die Entwicklung angewandter carbon capture Strategien. KW - sedimentary ancient DNA KW - ecology KW - lake sediment KW - Arctic KW - ecosystem reconstruction KW - climate change KW - treeline dynamics KW - microbial soil communities KW - plant-microbe interactions KW - Arktis KW - Klimawandel KW - Ökologie KW - Ökosystem-Rekonstruktion KW - Seesediment KW - mikrobielle Bodengemeinschaften KW - Pflanzen-Mikroben-Interaktionen KW - sedimentary ancient DNA KW - Baumgrenzen-Dynamik Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-636009 ER - TY - THES A1 - Kiss, Andrea T1 - Moss-associated bacterial and archaeal communities of northern peatlands: key taxa, environmental drivers and potential functions T1 - Moos-assoziierte bakterielle und archaelle Gemeinschaften nördlicher Moore: Schlüsselspezies, beeinflussende Umweltfaktoren und potentielle Funktionen N2 - Moss-microbe associations are often characterised by syntrophic interactions between the microorganisms and their hosts, but the structure of the microbial consortia and their role in peatland development remain unknown. In order to study microbial communities of dominant peatland mosses, Sphagnum and brown mosses, and the respective environmental drivers, four study sites representing different successional stages of natural northern peatlands were chosen on a large geographical scale: two brown moss-dominated, circumneutral peatlands from the Arctic and two Sphagnum-dominated, acidic peat bogs from subarctic and temperate zones. The family Acetobacteraceae represented the dominant bacterial taxon of Sphagnum mosses from various geographical origins and displayed an integral part of the moss core community. This core community was shared among all investigated bryophytes and consisted of few but highly abundant prokaryotes, of which many appear as endophytes of Sphagnum mosses. Moreover, brown mosses and Sphagnum mosses represent habitats for archaea which were not studied in association with peatland mosses so far. Euryarchaeota that are capable of methane production (methanogens) displayed the majority of the moss-associated archaeal communities. Moss-associated methanogenesis was detected for the first time, but it was mostly negligible under laboratory conditions. Contrarily, substantial moss-associated methane oxidation was measured on both, brown mosses and Sphagnum mosses, supporting that methanotrophic bacteria as part of the moss microbiome may contribute to the reduction of methane emissions from pristine and rewetted peatlands of the northern hemisphere. Among the investigated abiotic and biotic environmental parameters, the peatland type and the host moss taxon were identified to have a major impact on the structure of moss-associated bacterial communities, contrarily to archaeal communities whose structures were similar among the investigated bryophytes. For the first time it was shown that different bog development stages harbour distinct bacterial communities, while at the same time a small core community is shared among all investigated bryophytes independent of geography and peatland type. The present thesis displays the first large-scale, systematic assessment of bacterial and archaeal communities associated both with brown mosses and Sphagnum mosses. It suggests that some host-specific moss taxa have the potential to play a key role in host moss establishment and peatland development. N2 - Während die Beziehungen zwischen Moosen und den mit ihnen assoziierten Mikroorganismen oft durch syntrophische Wechselwirkungen charakterisiert sind, ist die Struktur der Moos-assoziierten mikrobiellen Gemeinschaften sowie deren Rolle bei der Entstehung von Mooren weitgehend unbekannt. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit mikrobiellen Gemeinschaften, die mit Moosen nördlicher, naturnaher Moore assoziiert sind, sowie mit den Umweltfaktoren, die sie beeinflussen. Entlang eines groß angelegten geographischen Gradienten, der von der Hocharktis bis zur gemäßigten Klimazone reicht, wurden vier naturbelassene Moore als Probenstandorte ausgesucht, die stellvertretend für verschiedene Stadien der Moorentwicklung stehen: zwei Braunmoos-dominierte Niedermoore mit nahezu neutralem pH-Wert sowie zwei Sphagnum-dominierte Torfmoore mit saurem pH-Wert. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit machen deutlich, dass die zu den Bakterien zählenden Acetobacteraceae das vorherrschende mikrobielle Taxon der Sphagnum-Moose gleich welchen geographischen Ursprungs darstellen und insbesondere innerhalb des Wirtsmoosgewebes dominieren. Gleichzeitig gehörten die Acetobacteraceae zum wesentlichen Bestandteil der mikrobiellen Kerngemeinschaft aller untersuchten Moose, die sich aus einigen wenigen Arten, dafür zahlreich vorkommenden Prokaryoten zusammensetzt. Die vorliegende Arbeit zeigt zudem erstmals, dass sowohl Braunmoose als auch Torfmoose ein Habitat für Archaeen darstellen. Die Mehrheit der Moos-assoziierten Archaeen gehörte dabei zu den methanbildenden Gruppen, wenngleich die metabolischen Aktivitätsraten unter Laborbedingungen meistens kaum messbar waren. Im Gegensatz hierzu konnte die Bakterien-vermittelte Methanoxidation sowohl an Braunmoosen als auch an Sphagnum-Moosen gemessen werden. Dies zeigt eindrucksvoll, dass Moos-assoziierte Bakterien potenziell zur Minderung von Methanemissionen aus nördlichen, aber auch wiedervernässten Mooren beitragen können. Ein weiteres wichtiges Resultat der vorliegenden Arbeit ist die Bedeutung des Moortyps (Niedermoor oder Torfmoor), aber auch der Wirtsmoosart selbst für die Struktur der Moos-assoziierten Bakteriengemeinschaften, während die archaeellen Gemeinschaftsstrukturen weder vom Moortyp noch von der Wirtsmoosart beeinflusst wurden und sich insgesamt deutlich ähnlicher waren als die der Bakterien. Darüber hinaus konnte erstmalig gezeigt werden, dass sich die bakteriellen Gemeinschaften innerhalb der unterschiedlichen Moorsukzessionsstadien zwar ganz erheblich voneinander unterscheiden, ein kleiner Teil der Bakterien dennoch Kerngemeinschaften bilden, die mit allen untersuchten Moosarten assoziiert waren. Bei der hier präsentierten Arbeit handelt es sich um die erste systematische Studie, die sich auf einer großen geographischen Skala mit den bakteriellen und archaeellen Gemeinschaften von Braunmoosen und Torfmoosen aus naturbelassenen nördlichen Mooren befasst. Die vorliegenden Ergebnisse machen deutlich, dass die untersuchten Moose ein ganz spezifisches mikrobielles Konsortium beherbergen, welches mutmaßlich eine Schlüsselrolle bei der Etablierung der Wirtspflanzen am Anfang der Moorentwicklung spielt und darüber hinaus das Potential hat, die charakteristischen Eigenschaften von Mooren sowie deren weitere Entwicklung zu prägen. KW - moss-microbe-interactions KW - moss-associated bacteria KW - moss-associated archaea KW - northern peatlands KW - peatland core microbiome KW - Acetobacteraceae KW - moss-associated methanotrophy KW - moss-associated methanogenesis KW - Sphagnum KW - Amblystegiaceae KW - endophytes KW - brown mosses KW - epiphytes KW - peatland development KW - bryophytes KW - host-specificity KW - large-scale study KW - methanotrophic bacteria KW - methanogenic archaea KW - Essigsäurebakterien KW - Amblystegiaceae KW - Torfmoose KW - Braunmoose KW - Bryophyten KW - Endophyten KW - Epiphyten KW - Wirtsspezifität KW - geographische Großstudie KW - methanproduzierende Archaeen KW - methanoxidierende Bakterien KW - Moos-assoziierte Methanproduktion KW - Moos-assoziierte Methanoxidation KW - Moos-Mikroben-Interaktion KW - nördliche Moore KW - mikrobielle Moor-Kerngemeinschaft KW - Moorsukzession Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-630641 ER - TY - THES A1 - Martinez-Seidel, Federico T1 - Ribosome Heterogeneity and Specialization during Temperature Acclimation in Plants N2 - Ribosomes decode mRNA to synthesize proteins. Ribosomes, once considered static, executing machines, are now viewed as dynamic modulators of translation. Increasingly detailed analyses of structural ribosome heterogeneity led to a paradigm shift toward ribosome specialization for selective translation. As sessile organisms, plants cannot escape harmful environments and evolved strategies to withstand. Plant cytosolic ribosomes are in some respects more diverse than those of other metazoans. This diversity may contribute to plant stress acclimation. The goal of this thesis was to determine whether plants use ribosome heterogeneity to regulate protein synthesis through specialized translation. I focused on temperature acclimation, specifically on shifts to low temperatures. During cold acclimation, Arabidopsis ceases growth for seven days while establishing the responses required to resume growth. Earlier results indicate that ribosome biogenesis is essential for cold acclimation. REIL mutants (reil-dkos) lacking a 60S maturation factor do not acclimate successfully and do not resume growth. Using these genotypes, I ascribed cold-induced defects of ribosome biogenesis to the assembly of the polypeptide exit tunnel (PET) by performing spatial statistics of rProtein changes mapped onto the plant 80S structure. I discovered that growth cessation and PET remodeling also occurs in barley, suggesting a general cold response in plants. Cold triggered PET remodeling is consistent with the function of Rei-1, a REIL homolog of yeast, which performs PET quality control. Using seminal data of ribosome specialization, I show that yeast remodels the tRNA entry site of ribosomes upon change of carbon sources and demonstrate that spatially constrained remodeling of ribosomes in metazoans may modulate protein synthesis. I argue that regional remodeling may be a form of ribosome specialization and show that heterogeneous cytosolic polysomes accumulate after cold acclimation, leading to shifts in the translational output that differs between wild-type and reil-dkos. I found that heterogeneous complexes consist of newly synthesized and reused proteins. I propose that tailored ribosome complexes enable free 60S subunits to select specific 48S initiation complexes for translation. Cold acclimated ribosomes through ribosome remodeling synthesize a novel proteome consistent with known mechanisms of cold acclimation. The main hypothesis arising from my thesis is that heterogeneous/ specialized ribosomes alter translation preferences, adjust the proteome and thereby activate plant programs for successful cold acclimation. N2 - Ribosomen dekodieren mRNA, um Proteine zu synthetisieren. Ribosomen, früher als statische, ausführende Maschinen betrachtet, werden heute als dynamische Modulatoren der Translation angesehen. Zunehmend detailliertere Analysen der Strukturheterogenität von Ribosomen führte zu einem Paradigmenwechsel hin zu einer Spezialisierung von Ribosomen für eine selektive Translation. Als sessile Organismen können Pflanzen schädlichen Umwelteinflüssen nicht ausweichen und haben Strategien entwickelt, um diesen zu widerstehen. Zytosolische Ribosomen von Pflanzen sind in mancher Hinsicht vielfältiger, als die von anderen Metazoen. Diese Vielfalt könnte zur Stressakklimatisierung der Pflanzen beitragen. Ziel dieser Arbeit war es, festzustellen, ob Pflanzen die Heterogenität der Ribosomen nutzen, um die Proteinsynthese durch spezialisierte Translation zu regulieren. Ich habe mich auf die Temperaturakklimatisierung konzentriert, insbesondere auf den Wechsel zu niedrigen Temperaturen. Im Verlauf der Kälteakklimatisierung stellt Arabidopsis das Wachstum für sieben Tage ein. Währenddessen etabliert sie die für die Wiederaufnahme des Wachstums erforderlichen Anpassungen. Vorherige Ergebnisse deuten darauf hin, dass Ribosomenbiogenese für die Kälteakklimatisierung essentiell ist. REIL-Mutanten (reil-dkos), denen ein 60S-Reifungsfaktor fehlt, akklimatisieren sich nicht erfolgreich und nehmen das Wachstum nicht wieder auf. Anhand dieser Genotypen habe ich kältebedingte Defekte der Ribosomenbiogenese auf den Aufbau des Polypeptidaustritts-Tunnels (PET) zurückgeführt, indem ich räumliche statistische Analysen von rProtein-Veränderungen auf die pflanzliche 80S-Struktur abgebildet habe. Ich habe entdeckt, dass Wachstumsstillstand und PET-Umbau auch in Gerste auftreten, was auf eine allgemeine Kältereaktion in Pflanzen hindeutet. Der durch Kälte ausgelöste PET-Umbau stimmt über ein mit der Funktion von Rei-1, einem REIL-homologen Protein aus Hefe, in der Rei-1 die PET-Qualitätskontrolle durchführt. Anhand bahnbrechender Daten zur Ribosomenspezialisierung zeige ich, dass Hefe die tRNA-Eintrittsstelle von Ribosomen bei einem Wechsel von Kohlenstoffquellen umbaut, und demonstriere, dass ein räumlich begrenzter Umbau von Ribosomen in Metazoen die Proteinsynthese modulieren kann. Ich argumentiere, dass die regionale Umgestaltung eine Form der Ribosomenspezialisierung sein kann, und zeige, dass nach einer Kälteakklimatisierung heterogene zytosolische Polysomen akkumulieren, was zu Verschiebungen im Translationsoutput führt, der sich zwischen Wildtyp und reil-dkos unterscheidet. Ich habe festgestellt, dass die heterogenen Komplexe aus neu synthetisierten und wiederverwendeten Proteinen bestehen. Ich schlage vor, dass maßgeschneiderte Ribosomenkomplexe freie 60S-Untereinheiten in die Lage versetzen, spezifische 48S-Initiationskomplexe für die Translation auszuwählen. Kälte-akklimatisierte Ribosomen synthetisieren durch Ribosomenumbau ein neues Proteom, das mit bekannten Mechanismen der Kälteakklimatisierung übereinstimmt. Die Haupthypothese, die sich aus meiner Arbeit ergibt, ist, dass heterogene/spezialisierte Ribosomen ihre Translationspräferenzen verändern, das Proteom anpassen und dadurch Pflanzenprogramme für eine erfolgreiche Kälteakklimatisierung aktivieren. T2 - Ribosomenheterogenität und -spezialisierung während der Temperaturakklimatisierung in Pflanzen KW - Ribosome specialization KW - Ribosomal protein heterogeneity KW - Ribosomal protein substoichiometry KW - Protein synthesis KW - Translational regulation KW - Plant cytosolic translation KW - Cold acclimation KW - Ribosome biogenesis KW - 60S maturation KW - Hordeum vulgare KW - Arabidopsis thaliana KW - 60S-Reifung KW - Kälteakklimatisierung KW - Cytosolische Translation in Pflanzen KW - Proteinsynthese KW - Ribosomale Proteinheterogenität KW - Ribosomale Protein Substöchiometrie KW - Ribosomen-Biogenese KW - Ribosomen-Spezialisierung KW - Translationsregulation Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-580724 ER - TY - THES A1 - Derežanin, Lorena T1 - Contribution of structural variation to adaptive evolution of mammalian genomes T1 - Beteiligung der strukturellen Variation zur adaptiven Evolution von Säugetiergenomen N2 - Following the extinction of dinosaurs, the great adaptive radiation of mammals occurred, giving rise to an astonishing ecological and phenotypic diversity of mammalian species. Even closely related species often inhabit vastly different habitats, where they encounter diverse environmental challenges and are exposed to different evolutionary pressures. As a response, mammals evolved various adaptive phenotypes over time, such as morphological, physiological and behavioural ones. Mammalian genomes vary in their content and structure and this variation represents the molecular mechanism for the long-term evolution of phenotypic variation. However, understanding this molecular basis of adaptive phenotypic variation is usually not straightforward. The recent development of sequencing technologies and bioinformatics tools has enabled a better insight into mammalian genomes. Through these advances, it was acknowledged that mammalian genomes differ more, both within and between species, as a consequence of structural variation compared to single-nucleotide differences. Structural variant types investigated in this thesis - such as deletion, duplication, inversion and insertion, represent a change in the structure of the genome, impacting the size, copy number, orientation and content of DNA sequences. Unlike short variants, structural variants can span multiple genes. They can alter gene dosage, and cause notable gene expression differences and subsequently phenotypic differences. Thus, they can lead to a more dramatic effect on the fitness (reproductive success) of individuals, local adaptation of populations and speciation. In this thesis, I investigated and evaluated the potential functional effect of structural variations on the genomes of mustelid species. To detect the genomic regions associated with phenotypic variation I assembled the first reference genome of the tayra (Eira barbara) relying on linked-read sequencing technology to achieve a high level of genome completeness important for reliable structural variant discovery. I then set up a bioinformatics pipeline to conduct a comparative genomic analysis and explore variation between mustelid species living in different environments. I found numerous genes associated with species-specific phenotypes related to diet, body condition and reproduction among others, to be impacted by structural variants. Furthermore, I investigated the effects of artificial selection on structural variants in mice selected for high fertility, increased body mass and high endurance. Through selective breeding of each mouse line, the desired phenotypes have spread within these populations, while maintaining structural variants specific to each line. In comparison to the control line, the litter size has doubled in the fertility lines, individuals in the high body mass lines have become considerably larger, and mice selected for treadmill performance covered substantially more distance. Structural variants were found in higher numbers in these trait-selected lines than in the control line when compared to the mouse reference genome. Moreover, we have found twice as many structural variants spanning protein-coding genes (specific to each line) in trait-selected lines. Several of these variants affect genes associated with selected phenotypic traits. These results imply that structural variation does indeed contribute to the evolution of the selected phenotypes and is heritable. Finally, I suggest a set of critical metrics of genomic data that should be considered for a stringent structural variation analysis as comparative genomic studies strongly rely on the contiguity and completeness of genome assemblies. Because most of the available data used to represent reference genomes of mammalian species is generated using short-read sequencing technologies, we may have incomplete knowledge of genomic features. Therefore, a cautious structural variation analysis is required to minimize the effect of technical constraints. The impact of structural variants on the adaptive evolution of mammalian genomes is slowly gaining more focus but it is still incorporated in only a small number of population studies. In my thesis, I advocate the inclusion of structural variants in studies of genomic diversity for a more comprehensive insight into genomic variation within and between species, and its effect on adaptive evolution. N2 - Nach dem Aussterben der Dinosaurier kam es zu einer großen adaptiven Radiation der Säugetiere, die eine erstaunliche ökologische und phänotypische Vielfalt von Säugetierarten hervorbrachte. Selbst eng verwandte Arten bewohnen oft sehr unterschiedliche Lebensräume, in denen sie verschiedenen Umwelteinflüssen und evolutionärem Druck ausgesetzt sind. Als Reaktion darauf haben Säugetiere im Laufe der Zeit verschiedene adaptive Phänotypen entwickelt, z. B. morphologische, physiologische und verhaltensbezogene. Die Genome von Säugetieren variieren in ihrem Inhalt und ihrer Struktur, und diese Variation stellt den molekularen Mechanismus für die langfristige Evolution der phänotypischen Variation dar. Das Verständnis dieser molekularen Grundlage der adaptiven phänotypischen Variation ist jedoch meist nicht trivial. Die jüngste Entwicklung von Sequenzierungstechnologien und Bioinformatik-Tools hat einen besseren Einblick in die Genome von Säugetieren ermöglicht. Durch diese Fortschritte wurde erkannt, dass sich die Genome von Säugetieren sowohl innerhalb als auch zwischen den Arten stärker durch strukturelle Variationen als durch Unterschiede zwischen einzelnen Nukleotiden unterscheiden. Variantenarten, die in dieser Arbeit untersucht werden - wie Deletion, Duplikation, Inversion und Insertion - stellen eine Veränderung der Genomstruktur dar, die sich auf die Größe, die Kopienzahl, die richtung und den Inhalt der DNA-Sequenzen auswirken. Im Gegensatz zu kurzen Varianten können strukturelle Varianten mehrere Gene umfassen. Sie können die Genkopien verändern und bemerkenswerte Unterschiede in der Genexpression und in der Folge phänotypische Unterschiede hervorrufen. Dadurch können sie dramatischere Auswirkungen auf die Fitness (den Fortpflanzungserfolg) von Individuen, die lokale Anpassung von Populationen und die Artbildung haben. In dieser Arbeit untersuchte und bewertete ich die potenziellen funktionellen Auswirkungen von strukturellen Variationen auf die Genome von Mustelidenarten. Weil für die zuverlässige Entdeckung struktureller Varianten ein hohes Maß an Genomvollständigkeit wichtig ist, habe ich das erste Referenzgenom der Tayra (Eira barbara) mit Hilfe der Linked-Read-Sequenzierungstechnologie zusammengestellt, um die mit der phänotypischen Variation verbundenen Genomregionen zu ermitteln. Anschließend habe ich eine Bioinformatik-Pipeline aufgesetzt, um eine vergleichende Genomanalyse durchzuführen und die Variationen zwischen den in unterschiedlichen Umgebungen lebenden Mustelidenarten zu untersuchen. Ich fand heraus, dass zahlreiche Gene, die mit artspezifischen Phänotypen in Verbindung stehen, durch strukturelle Variationen beeinflusst werden. Diese Phänotypen stehen u.a. in Zusammenhang mit Ernährung, Körperzustand und Fortpflanzung. Darüber hinaus untersuchte ich die Auswirkungen der künstlichen Selektion auf strukturelle Variationen bei Mäusen, die auf hohe Fruchtbarkeit, erhöhte Körpermasse und hohe Ausdauer selektiert wurden. Durch selektive Züchtung jeder Mauslinie haben sich die gewünschten Phänotypen innerhalb dieser Populationen durchgesetzt, wobei die für jede Linie spezifischen strukturellen Variationen erhalten blieben. Im Vergleich zur Kontrolllinie hat sich die Wurfgröße in den Linien selektiert auf Fruchtbarkeit verdoppelt, die Individuen in den Linien mit hoher Körpermasse sind erheblich größer geworden, und die auf Laufbandleistung selektierten Mäuse haben wesentlich mehr Strecke zurückgelegt. Im Vergleich zum Referenzgenom der Maus wurden in diesen nach Merkmalen selektierten Linien mehr strukturelle Variationen gefunden als in der Kontrolllinie. Darüber hinaus fanden wir doppelt so viele strukturelle Variationen, die proteinkodierende Gene überspannen (spezifisch für jede Linie), in nach Merkmalen selektierten Linien. Mehrere dieser Varianten betreffen Gene, die mit ausgewählten phänotypischen Merkmalen in Verbindung stehen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass strukturelle Variationen tatsächlich zur Evolution der ausgewählten Phänotypen beiträgt und vererbbar ist. Abschließend schlage ich eine Sammlung von maßgeblichen Metriken für Genomdaten vor, die für eine strenge Analyse der strukturellen Variation berücksichtigt werden sollten, da vergleichende Genomstudien in hohem Maße von der Kontiguität und Vollständigkeit der Genomassemblies abhängen. Weil die meisten der verfügbaren Daten, die verwendet wurden, um Referenzgenome von Säugetierarten zu repräsentieren mit Short-Read-Sequenzierungstechnologien erzeugt wurden, verfügen wir möglicherweise nur über unvollständige Kenntnisse der genomischen Merkmale. Daher ist eine vorsichtige Analyse der strukturellen Variationen erforderlich, um die Auswirkungen technischer Beschränkungen zu minimieren. Der Einfluss struktureller Variationen auf die adaptive Evolution von Säugetiergenomen rückt langsam immer mehr in den Mittelpunkt, wird aber immer noch nur in wenigen Populationsstudien berücksichtigt. In meiner Dissertation befürworte ich die Einbeziehung struktureller Variationen in Studien zur genomischen Diversität, um einen umfassenderen Einblick in die genomische Variation innerhalb und zwischen den Arten und ihre Auswirkungen auf die adaptive Evolution zu erhalten. KW - doctoral thesis KW - evolutionary biology KW - adaptation KW - genomics KW - Adaptation KW - Dissertation KW - Evolutionsbiologie KW - Genomik Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-591443 ER - TY - THES A1 - Koikkarah Aji, Amit T1 - Quantitative sub cellular characterization of Hantavirus structural proteins T1 - Quantitativ Subzellulär Charakterisierung Von Hantavirus-Strukturproteine. N2 - Hantaviruses (HVs) are a group of zoonotic viruses that infect human beings primarily through aerosol transmission of rodent excreta and urine samplings. HVs are classified geographically into: Old World HVs (OWHVs) that are found in Europe and Asia, and New World HVs (NWHVs) that are observed in the Americas. These different strains can cause severe hantavirus diseases with pronounced renal syndrome or severe cardiopulmonary system distress. HVs can be extremely lethal, with NWHV infections reaching up to 40 % mortality rate. HVs are known to generate epidemic outbreaks in many parts of the world including Germany, which has seen periodic HV infections over the past decade. HV has a trisegmented genome. The small segment (S) encodes the nucleocapsid protein (NP), the middle segment (M) encodes the glycoproteins (GPs) Gn and Gc which forms up to tetramers and primarily monomers \& dimers upon independent expression respectively and large segment (L) encodes RNA dependent RNA polymerase (RdRp). Interactions between these viral proteins are crucial in providing mechanistic insights into HV virion development. Despite best efforts, there continues to be lack of quantification of these associations in living cells. This is required in developing the mechanistic models for HV viral assembly. This dissertation focuses on three key questions pertaining to the initial steps of virion formation that primarily involves the GPs and NP. The research investigations in this work were completed using Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS) approaches. FCS is frequently used in assessing the biophysical features of bio-molecules including protein concentration and diffusion dynamics and circumvents the requirement of protein overexpression. FCS was primarily applied in this thesis to evaluate protein multimerization, at single cell resolution. The first question addressed which GP spike formation model proposed by Hepojoki et al.(2010) appropriately describes the evidence in living cells. A novel in cellulo assay was developed to evaluate the amount of fluorescently labelled and unlabeled GPs upon co-expression. The results clearly showed that Gn and Gc initially formed a heterodimeric Gn:Gc subunit. This sub-unit then multimerizes with congruent Gn:Gc subunits to generate the final GP spike. Based on these interactions, models describing the formation of GP complex (with multiple GP spike subunits) were additionally developed. HV GP assembly primarily takes place in the Golgi apparatus (GA) of infected cells. Interestingly, NWHV GPs are hypothesized to assemble at the plasma membrane (PM). This led to the second research question in this thesis, in which a systematic comparison between OWHV and NWHV GPs was conducted to validate this hypothesis. Surprisingly, GP localization at the PM was congruently observed with OWHV and NWHV GPs. Similar results were also discerned with OWHV and NWHV GP localization in the absence of cytoskeletal factors that regulate HV trafficking in cells. The final question focused on quantifying the NP-GP interactions and understanding their influence of NP and GP multimerization. Gc mutlimers were detected in the presence of NP and complimented by the presence of localized regions of high NP-Gc interactions in the perinuclear region of living cells. Gc-CT domain was shown to influence NP-Gc associations. Gn, on the other hand, formed up to tetrameric complexes, independent from the presence of NP. The results in this dissertation sheds light on the initial steps of HV virion formation by quantifying homo and heterotypic interactions involving NP and GPs, which otherwise are very difficult to perform. Finally, the in cellulo methodologies implemented in this work can be potentially extended to understand other key interactions involved in HV virus assembly. N2 - Hantaviren (HVs) gehören zu einer Gruppe von Zoonosenviren, die den Menschen hauptsächlich über Aerosolübertragung von Nagetierausscheidungen und Urinproben infizieren. HVs werden geografisch unterteilt in: Alte Welt-HVs (OWHVs), die in Europa und Asien vorkommen, und Neue Welt-HVs (NWHVs), die auf dem amerikanischen Kontinent beobachtet werden. Diese verschiedenen Stämme können schwere Krankheiten verursachen, wie hämorrhagisches Fieber mit Nierensyndrom oder schwere Herz-Lungen-Störungen. HVs haben eine hohe Sterblichkeitsrate, wobei NWHV-Infektionen eine Sterblichkeitsrate von bis zu 40 % erreichen. Es ist bekannt, dass HVs in vielen Teilen der Welt epidemische Ausbrüche verursachen können, so auch in Deutschland, wo in den letzten zehn Jahren regelmäßig HV-Infektionen vorkamen. HV besitzt ein trisegmentiertes Genom. Das kleine Segment (S) kodiert das Nukleokapsidprotein (NP), das mittlere Segment (M) kodiert die Glykoproteine (GPs) Gn und Gc, die bei unabhängiger Expression Tetramere und Dimere bilden, und das große Segment (L) kodiert die RNA-abhängige RNA-Polymerase (RdRp). Die Wechselwirkungen zwischen diesen viralen Proteinen sind von entscheidender Bedeutung für die Aufklärung der Mechanismen der HV-entwicklung. Trotz aller Bemühungen fehlt es nach wie vor an der Quantifizierung dieser Verbindungen in lebenden Zellen. Dies ist für die Entwicklung komplexer Modelle für den Aufbau von HV erforderlich. Diese Arbeit konzentriert sich auf drei Schlüsselfragen im Zusammenhang mit den ersten Phasen der Virionenbildung, an denen hauptsächlich die GPs und NP beteiligt sind. Die Forschungsaufgaben in dieser Arbeit wurden mit Hilfe der Fluoreszenzkorrelationspektroskopie (FCS) untersucht. Die FCS wird häufig zur Bewertung der biophysikalischen Eigenschaften von Biomolekülen, einschließlich der Proteinkonzentration und Diffusionsdynamik, eingesetzt und macht eine Überexpression von Proteinen überflüssig. In dieser Arbeit wurde FFS in erster Linie eingesetzt, um die Multimerisierung von Proteinen bei Einzelzellauflösung zu untersuchen. Die erste Frage lautete, welches das von Hepojoki et al. (2010) vorgeschlagene Modell der GP-Spike-Bildung den Vorgang in lebenden Zellen adäquat beschreibt. Es wurde ein neuartiger in cellulo-Assay entwickelt, um die Konzentration von fluoreszenzmarkierten und unmarkierten GPs bei der Ko-expression zu bestimmen. Die Ergebnisse zeigten deutlich, dass Gn und Gc zunächst eine heterodimere Gn:Gc-Untereinheit bilden. Diese Untereinheit multimerisiert dann mit kongruenten Gn:Gc-Untereinheiten, um den finalen GP-Spike zu erzeugen. Auf der Grundlage dieser Interaktionen wurden zusätzlich Modelle entwickelt, die die Bildung des GP-Komplexes (mit mehreren GP-Spike-Untereinheiten) beschreiben. Die HV-GP-Assemblierung findet hauptsächlich im Golgi-Apparat (GA) von infizierten Zellen statt. Interessanterweise wird angenommen, dass NWHV GPs an der Plasmamembran (PM) assembliert werden. Dies führte zur zweiten Frage dieser Arbeit, bei der ein systematischer Vergleich zwischen OWHV- und NWHV-GP durchgeführt wurde, um diese Hypothese zu bestätigen. Überraschenderweise wurde die GP-Lokalisierung an der PM bei OWHV- und NWHV-GPs gleichermaßen beobachtet. Ähnliche Ergebnisse wurden auch bei der Lokalisierung von OWHV- und NWHV-GP in Abwesenheit von zytoskelettalen Faktoren festgestellt, die die HV-Infektion regulieren. Die letzte Frage dieser Arbeit konzentrierte sich auf die Quantifizierung der NP-GP-Wechselwirkungen und das Verständnis ihres Einflusses auf die Multimerisierung von NP und GPs. Gc-Multimere, die in Gegenwart von NP nachgewiesen wurden, wurden durch das Vorhandensein von perinukleär lokalisierten Regionen mit starken NP-Gc-Wechselwirkungen in lebenden Zellen komplettiert. Es wurde gezeigt, dass die Gc-CT-Domäne die NP-Gc-Assoziationen beeinflusst. Gn hingegen bildete unabhängig von der Anwesenheit von NP tetramerische Komplexe. Die Ergebnisse dieser Arbeit geben Aufschluss über die ersten Phasen der HV-Assemblierung, indem sie die Homo- und Hetero-Interaktionen zwischen NP und GPs quantifizieren, was sonst nur sehr schwer möglich ist. Schließlich können die in dieser Arbeit implementierten in cellulo-Methoden potenziell erweitert werden, um andere Schlüsselinteraktionen zu verstehen, die an der HV-Assemblierung beteiligt sind. KW - Hantavirus KW - fluorescence microscopy KW - fluorescence correlation spectroscopy KW - protein multimerization KW - virus assembly KW - single cell imaging KW - Hantaviren KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Fluoreszenzkorrelationspektroskopie KW - Virionenbildung KW - Proteinmultimerisierung Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-586612 ER - TY - THES A1 - Riedel, Soraya Lisanne T1 - Development of electrochemical antibody-based and enzymatic assays for mycotoxin analysis in food T1 - Entwicklung elektrochemischer Antikörper- und Enzym-basierter Assays für die Analyse von Mykotoxinen in Lebensmitteln N2 - Electrochemical methods are promising to meet the demand for easy-to-use devices monitoring key parameters in the food industry. Many companies run own lab procedures for mycotoxin analysis, but it is a major goal to simplify the analysis. The enzyme-linked immunosorbent assay using horseradish peroxidase as enzymatic label, together with 3,3',5,5' tetramethylbenzidine (TMB)/H2O2 as substrates allows sensitive mycotoxin detection with optical detection methods. For the miniaturization of the detection step, an electrochemical system for mycotoxin analysis was developed. To this end, the electrochemical detection of TMB was studied by cyclic voltammetry on different screen-printed electrodes (carbon and gold) and at different pH values (pH 1 and pH 4). A stable electrode reaction, which is the basis for the further construction of the electrochemical detection system, could be achieved at pH 1 on gold electrodes. An amperometric detection method for oxidized TMB, using a custom-made flow cell for screen-printed electrodes, was established and applied for a competitive magnetic bead-based immunoassay for the mycotoxin ochratoxin A. A limit of detection of 150 pM (60 ng/L) could be obtained and the results were verified with optical detection. The applicability of the magnetic bead-based immunoassay was tested in spiked beer using a handheld potentiostat connected via Bluetooth to a smartphone for amperometric detection allowing to quantify ochratoxin A down to 1.2 nM (0.5 µg/L). Based on the developed electrochemical detection system for TMB, the applicability of the approach was demonstrated with a magnetic bead-based immunoassay for the ergot alkaloid, ergometrine. Under optimized assay conditions a limit of detection of 3 nM (1 µg/L) was achieved and in spiked rye flour samples ergometrine levels in a range from 25 to 250 µg/kg could be quantified. All results were verified with optical detection. The developed electrochemical detection method for TMB gives great promise for the detection of TMB in many other HRP-based assays. A new sensing approach, based on an enzymatic electrochemical detection system for the mycotoxin fumonisin B1 was established using an Aspergillus niger fumonisin amine oxidase (AnFAO). AnFAO was produced recombinantly in E. coli as maltose-binding protein fusion protein and catalyzes the oxidative deamination of fumonisins, producing hydrogen peroxide. It was found that AnFAO has a high storage and temperature stability. The enzyme was coupled covalently to magnetic particles, and the enzymatically produced H2O2 in the reaction with fumonisin B1 was detected amperometrically in a flow injection system using Prussian blue/carbon electrodes and the custom-made wall-jet flow cell. Fumonisin B1 could be quantified down to 1.5 µM (≈ 1 mg/L). The developed system represents a new approach to detect mycotoxins using enzymes and electrochemical methods. N2 - Zur Entwicklung von einfach zu bedienenden Vor-Ort-Geräten, welche für die Analytik von wichtigen Parametern in der Lebensmittelindustrie eingesetzt werden können, sind elektrochemische Methoden besonders vielversprechend. Viele Unternehmen führen bereits Mykotoxinanalytik in eigenen Laboren am Produktionsstandort durch, dennoch gibt es große Bestrebungen Analysenmethoden weiter zu vereinfachen. Der Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), welcher häufig mit der Meerrettichperoxidase als enzymatischem Label und 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB)/H2O2 als Enzymsubstraten arbeitet, ermöglicht den sensitiven Mykotoxinnachweis mithilfe optischer Detektionsmethoden. Zur Miniaturisierung des Detektionsschrittes wurde in dieser Arbeit der Aufbau von elektrochemischen Detektionssystemen für die Mykotoxinanalytik untersucht. Dazu wurde zunächst die elektrochemische Reaktion von TMB an verschiedenen Materialien siebgedruckter Elektroden (Kohlenstoff und Gold) sowie bei verschiedenen pH-Werten (pH 1 und pH 4) untersucht. Eine stabile Elektrodenreaktion, welche die Grundlage für den weiteren Aufbau des elektrochemischen Detektionssystems darstellt, konnte bei pH 1 an Goldelektroden erzielt werden. Basierend darauf wurde eine amperometrische Detektionsmethode für oxidiertes TMB entwickelt, wofür eine maßgefertigte Durchflusszelle verwendet wurde. Die amperometrische TMB-Detektion wurde für einen kompetitiven Magnetpartikel-basierten Immunoassay für Ochratoxin A eingesetzt. Mit diesem Assay wurde eine Nachweisgrenze von 150 pM (60 ng L-1) erreicht und die Ergebnisse konnten durch optische Detektion verifiziert werden. Die Anwendbarkeit des Assays konnte in Ochratoxin A dotiertem Bier demonstriert werden, wobei für die Detektion ein tragbarer Potentiostat verwendet wurde, welcher über Bluetooth mit einem Smartphone verbunden war. Hiermit konnten niedrige Ochratoxin A Konzentration von bis zu 1.2 nM (0.5 µg L-1) bestimmt werden. Aufbauend auf dem entwickelten elektrochemischen Detektionssystem für TMB wurde die Anwendbarkeit des Ansatzes auf einen Magnetpartikel-basierten Immunoassay für das Ergotalkaloid Ergometrine, evaluiert. Unter optimierten Bedingungen konnte mit dem Assay eine Nachweisgrenze von 3 nM (1 µg L-1) erreicht werden. In mit Ergometrin versetztem Roggenmehl konnten Konzentrationen von 25 bis 250 µg kg-1 nachgewiesen werden. Die entwickelte elektrochemische Nachweismethode für TMB bietet einen vielversprechenden Ansatz für den Einsatz in vielen anderen Meerrettichperoxidase-basierten Assays. Für das Mykotoxin Fumonisin B1, wurde ein neues sensorisches System entwickelt, welches auf einem enzymatischen elektrochemischen Nachweis basiert. Hierfür wurde eine Aspergillus niger Fumonisin Aminoxidase (AnFAO) rekombinant als Fusionsprotein mit dem Maltose-bindenden Protein exprimiert. AnFAO katalysiert die oxidative Deaminierung von Fumonisinen, wobei H2O2 gebildet wird. Es konnte gezeigt werden, dass AnFAO eine hohe Lagerungs- und Temperaturstabilität hat. Für den Nachweis von Fumonisin B1 wurde das Enzym kovalent an Magnetpartikel gekoppelt. Das enzymatisch produzierte H2O2 konnte anschließend amperometrisch mithilfe von Preußisch Blau/Kohlenstoff-Elektroden in der maßgefertigten Durchflusszelle detektiert werden. Fumonisin B1 konnte bis zu einer Konzentration von 1,5 µM (≈ 1 mg L-1) quantifiziert werden. Das entwickelte System stellt einen neuen Ansatz dar, um Mykotoxine unter Nutzung von Enzymen und elektrochemischen Methoden zu detektieren. KW - mycotoxins KW - Mykotoxine KW - immunoassay KW - Immunoassay KW - food analysis KW - Lebensmittelanalytik KW - enzyme KW - Enzym KW - amperometry KW - Amperometrie Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-607477 ER - TY - THES A1 - Parry, Victor T1 - From individual to community level: Assessing swimming movement, dispersal and fitness of zooplankton T1 - Vom Individuum zur Gemeinschaft: Bewertung von Schwimmbewegungen, Ausbreitung und Fitness von Zooplankton N2 - Movement is a mechanism that shapes biodiversity patterns across spatialtemporal scales. Thereby, the movement process affects species interactions, population dynamics and community composition. In this thesis, I disentangled the effects of movement on the biodiversity of zooplankton ranging from the individual to the community level. On the individual movement level, I used video-based analysis to explore the implication of movement behavior on preypredator interactions. My results showed that swimming behavior was of great importance as it determined their survival in the face of predation. The findings also additionally highlighted the relevance of the defense status/morphology of prey, as it not only affected the prey-predator relationship by the defense itself but also by plastic movement behavior. On the community movement level, I used a field mesocosm experiment to explore the role of dispersal (time i.e., from the egg bank into the water body and space i.e., between water bodies) in shaping zooplankton metacommunities. My results revealed that priority effects and taxon-specific dispersal limitation influenced community composition. Additionally, different modes of dispersal also generated distinct community structures. The egg bank and biotic vectors (i.e. mobile links) played significant roles in the colonization of newly available habitat patches. One crucial aspect that influences zooplankton species after arrival in new habitats is the local environmental conditions. By using common garden experiments, I assessed the performance of zooplankton communities in their home vs away environments in a group of ponds embedded within an agricultural landscape. I identified environmental filtering as a driving factor as zooplankton communities from individual ponds developed differently in their home and away environments. On the individual species level, there was no consistent indication of local adaptation. For some species, I found a higher abundance/fitness in their home environment, but for others, the opposite was the case, and some cases were indifferent. Overall, the thesis highlights the links between movement and biodiversity patterns, ranging from the individual active movement to the community level. N2 - Fortbewegung ist ein Mechanismus, der die Biodiversitätsmuster sowohl über räumliche als auch zeitliche Skalen hinweg prägt. Dabei beeinflusst der Bewegungsprozess die Interaktionen zwischen den Arten, die Populationsdynamik und die Zusammensetzung der Gemeinschaften. Diese Arbeit dient dazu die Auswirkungen der Bewegung auf die Biodiversitätsmuster des Zooplanktons sowohl auf der individuellen als auch gemeinschaftlichen Ebene zu untersuchen. Um auf der individuellen Ebene die Auswirkungen des Bewegungsverhaltens auf die Interaktionen zwischen Räuber und Beute zu untersuchen, wurde eine videobasierte Analyse durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass das Schwimmverhalten von großer Bedeutung ist, da es über das Überleben der Tiere im Angesicht von Räubern entscheidet. Darüber hinaus verdeutlichen die Ergebnisse die Rolle des Verteidigungsstatus bzw. der Morphologie der Beutetiere, da diese nicht nur durch die Verteidigung selbst, sondern auch durch die Plastizität des Bewegungsverhaltens, die Beziehung zwischen Beute und Raubtier beeinflussen. Auf der Ebene der Bewegung von Gemeinschaften habe ich ein Mesokosmen-Feldexperiment durchgeführt, um die Rolle der Ausbreitung (zeitlich, d. h. von den Überdauerungsstadien, welche im Sediment gelagert sind, in Kleingewässer, und räumlich, d. h. zwischen Kleingewässer) bei der Strukturierung von Zooplankton-Metagemeinschaften zu untersuchen. Die Ergebnisse konnten zeigen, dass Prioritätseffekte und taxon-spezifische Ausbreitungslimitierungen die Zusammensetzung der Gemeinschaften beeinflussen. Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse, dass die unterschiedlichen Ausbreitungsarten (Windausbreitung und Tierverbreitung). Einfluss auf die Gemeinschaftsstrukturen haben. Zusätzlich spielt das Überdauerungsstadien-Reservoir in Sedimenten“, sowie biotische Ausbreitungsvektoren (d. h. Tiere, engl. mobile links), eine wichtige Rolle bei der Besiedlung neuer Habitate. Die lokalen Umweltbedingungen, die eine ankommende Art in einem Habitat vorfindet, sind ein entscheidender Aspekt, der die Struktur der Zooplanktongemeinschaft beeinflusst. Mit Hilfe eines Laborexperiments, für welches Wasserproben aus Kleingewässern/Söllen genutzt wurden, die von einer Agrarlandschaft umgeben sind, konnte ich die Fitness von Zooplanktongemeinschaften in ihrem Heimathabitat vs. in einem neuen Habitat untersuchen. Hierbei konnte ich zeigen, dass die Umweltfilterung ein entscheidender Faktor für die Gemeinschaftsstrukturierung ist, da sich die Zooplanktongemeinschaften der einzelnen Kleingewässer in ihrer Heimatumgebung anders entwickelten als in einer neuen Umgebung. Auf der Art-Ebene, konnte ich jedoch keine eindeutigen Hinweise auf eine lokale Anpassung finden. Bei einigen Arten konnten allerdings höhere Abundanz/Fitness in ihrer Heimatumgebung festgestellt werden, bei anderen war das Gegenteil der Fall, und in einigen F¨allen gab es keine eindeutigen Unterschiede. Zusammenfassend, unterstreicht diese Arbeit die Zusammenhänge zwischen Bewegungs- und Biodiversitätsmustern, die von der aktiven Bewegung des Einzelnen bis hin zur Gemeinschaftsebene reichen. KW - movement KW - zooplankton KW - dispersal KW - video analysis KW - environment filtering KW - Fortbewegung KW - Ausbreitung KW - Videoanalyse KW - Umweltfilterung KW - Zooplankton Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-597697 ER - TY - THES A1 - Pramanik, Shreya T1 - Protein reconstitution in giant vesicles N2 - Das Leben auf der Erde ist vielfältig und reicht von einzelligen Organismen bis hin zu mehrzelligen Lebewesen wie dem Menschen. Obwohl es Theorien darüber gibt, wie sich diese Organismen entwickelt haben könnten, verstehen wir nur wenig darüber, wie "Leben" aus Molekülen entstanden ist. Die synthetische Bottom-up-Biologie zielt darauf ab, minimale Zellen zu schaffen, indem sie verschiedene Module wie Kompartimentierung, Wachstum, Teilung und zelluläre Kommunikation kombiniert. Alle lebenden Zellen haben eine Membran, die sie von dem sie umgebenden wässrigen Medium trennt und sie schützt. Darüber hinaus haben alle eukaryotischen Zellen Organellen, die von intrazellulären Membranen umschlossen sind. Jede Zellmembran besteht hauptsächlich aus einer Lipiddoppelschicht mit Membranproteinen. Lipide sind amphiphile Moleküle, die molekulare Doppelschichten aus zwei Lipid-Monoschichten oder Blättchen bilden. Die hydrophoben Ketten der Lipide sind einander zugewandt, während ihre hydrophilen Kopfgruppen die Grenzflächen zur wässrigen Umgebung bilden. Riesenvesikel sind Modellmembransysteme, die Kompartimente mit einer Größe von mehreren Mikrometern bilden und von einer einzigen Lipiddoppelschicht umgeben sind. Die Größe der Riesenvesikel ist mit der Größe von Zellen vergleichbar und macht sie zu guten Membranmodellen, die mit einem Lichtmikroskop untersucht werden können. Allerdings fehlen den Riesenvesikelmembranen nach der ersten Präparation Membranproteine, die in weiteren Präparationsschritten in diese Membranen eingebaut werden müssen. Je nach Protein kann es entweder über Ankerlipide an eines der Membranblättchen gebunden oder über seine Transmembrandomänen in die Lipiddoppelschicht eingebaut werden. Diese Arbeit befasst sich mit der Herstellung von Riesenvesikeln und der Rekonstitution von Proteinen in diesen Vesikeln. Außerdem wird ein mikrofluidischer Chip entworfen, der in verschiedenen Experimenten verwendet werden kann. Die Ergebnisse dieser Arbeit werden anderen Forschern helfen, die Protokolle für die Herstellung von GUVs zu verstehen, Proteine in GUVs zu rekonstituieren und Experimente mit dem mikrofluidischen Chip durchzuführen. Auf diese Weise wird die vorliegende Arbeit für das langfristige Ziel von Nutzen sein, die verschiedenen Module der synthetischen Biologie zu kombinieren, um eine Minimalzelle zu schaffen. N2 - Life on Earth is diverse and ranges from unicellular organisms to multicellular creatures like humans. Although there are theories about how these organisms might have evolved, we understand little about how ‘life’ started from molecules. Bottom-up synthetic biology aims to create minimal cells by combining different modules, such as compartmentalization, growth, division, and cellular communication. All living cells have a membrane that separates them from the surrounding aqueous medium and helps to protect them. In addition, all eukaryotic cells have organelles that are enclosed by intracellular membranes. Each cellular membrane is primarily made of a lipid bilayer with membrane proteins. Lipids are amphiphilic molecules that assemble into molecular bilayers consisting of two leaflets. The hydrophobic chains of the lipids in the two leaflets face each other, and their hydrophilic headgroups face the aqueous surroundings. Giant unilamellar vesicles (GUVs) are model membrane systems that form large compartments with a size of many micrometers and enclosed by a single lipid bilayer. The size of GUVs is comparable to the size of cells, making them good membrane models which can be studied using an optical microscope. However, after the initial preparation, GUV membranes lack membrane proteins which have to be reconstituted into these membranes by subsequent preparation steps. Depending on the protein, it can be either attached via anchor lipids to one of the membrane leaflets or inserted into the lipid bilayer via its transmembrane domains. The first step is to prepare the GUVs and then expose them to an exterior solution with proteins. Various protocols have been developed for the initial preparation of GUVs. For the second step, the GUVs can be exposed to a bulk solution of protein or can be trapped in a microfluidic device and then supplied with the protein solution. To minimize the amount of solution and for more precise measurements, I have designed a microfluidic device that has a main channel, and several dead-end side channels that are perpendicular to the main channel. The GUVs are trapped in the dead-end channels. This design exchanges the solution around the GUVs via diffusion from the main channel, thus shielding the GUVs from the flow within the main channel. This device has a small volume of just 2.5 μL, can be used without a pump and can be combined with a confocal microscope, enabling uninterrupted imaging of the GUVs during the experiments. I used this device for most of the experiments on GUVs that are discussed in this thesis. In the first project of the thesis, a lipid mixture doped with an anchor lipid was used that can bind to a histidine chain (referred to as His-tag(ged) or 6H) via the metal cation Ni2+. This method is widely used for the biofunctionalization of GUVs by attaching proteins without a transmembrane domain. Fluorescently labeled His-tags which are bound to a membrane can be observed in a confocal microscope. Using the same lipid mixture, I prepared the GUVs with different protocols and investigated the membrane composition of the resulting GUVs by evaluating the amount of fluorescently labeled His-tagged molecules bound to their membranes. I used the microfluidic device described above to expose the outer leaflet of the vesicle to a constant concentration of the His-tagged molecules. Two fluorescent molecules with a His-tag were studied and compared: green fluorescent protein (6H-GFP) and fluorescein isothiocyanate (6H-FITC). Although the quantum yield in solution is similar for both molecules, the brightness of the membrane-bound 6H-GFP is higher than the brightness of the membrane-bound 6H-FITC. The observed difference in the brightness reveals that the fluorescence of the 6H-FITC is quenched by the anchor lipid via the Ni2+ ion. Furthermore, my measurements also showed that the fluorescence intensity of the membranebound His-tagged molecules depends on microenvironmental factors such as pH. For both 6H-GFP and 6H-FITC, the interaction with the membrane is quantified by evaluating the equilibrium dissociation constant. The membrane fluorescence is measured as a function of the fluorophores’ molar concentration. Theoretical analysis of these data leads to the equilibrium dissociation constants of (37.5 ± 7.5) nM for 6H-GFP and (18.5 ± 3.7) nM for 6H-FITC. The anchor lipid mentioned previously used the metal cation Ni2+ to mediate the bond between the anchor lipid and the His-tag. The Ni2+ ion can be replaced by other transition metal ions. Studies have shown that Co3+ forms the strongest bonds with the His-tags attached to proteins. In these studies, strong oxidizing agents were used to oxidize the Co2+ mediated complex with the His-tagged protein to a Co3+ mediated complex. This procedure puts the proteins at risk of being oxidized as well. In this thesis, the vesicles were first prepared with anchor lipids without any metal cation. The Co3+ was added to these anchor lipids and finally the His-tagged protein was added to the GUVs to form the Co3+ mediated bond. This system was also established using the microfluidic device. The different preparation procedures of GUVs usually lead to vesicles with a spherical morphology. On the other hand, many cell organelles have a more complex architecture with a non spherical topology. One fascinating example is provided by the endoplasmic reticulum (ER) which is made of a continuous membrane and extends throughout the cell in the form of tubes and sheets. The tubes are connected by three-way junctions and form a tubular network of irregular polygons. The formation and maintenance of these reticular networks requires membrane proteins that hydrolyize guanosine triphosphate (GTP). One of these membrane proteins is atlastin. In this thesis, I reconstituted the atlastin protein in GUV membranes using detergent-assisted reconstitution protocols to insert the proteins directly into lipid bilayers. This thesis focuses on protein reconstitution by binding His-tagged proteins to anchor lipids and by detergent-assisted insertion of proteins with transmembrane domains. It also provides the design of a microfluidic device that can be used in various experiments, one example is the evaluation of the equilibrium dissociation constant for membrane-protein interactions. The results of this thesis will help other researchers to understand the protocols for preparing GUVs, to reconstitute proteins in GUVs, and to perform experiments using the microfluidic device. This knowledge should be beneficial for the long-term goal of combining the different modules of synthetic biology to make a minimal cell. KW - protein reconstitution KW - giant vesicles KW - microfluidics KW - synthetic biology KW - Riesenvesikel KW - Mikrofluidik KW - Proteinrekonstitution KW - synthetische Biologie Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-612781 ER - TY - THES A1 - Mendes Ferreira, Clara T1 - Indirect, tri-trophic effects of fear on biodiversity N2 - Predator-forager interactions are a major factor in evolutionary adaptation of many species, as predators need to gain energy by consuming prey species, and foragers needs to avoid the worst fate of mortality while still consuming resources for energetic gains. In this evolutionary arms race, the foragers have constantly evolved anti-predator behaviours (e.g. foraging activity changes). To describe all these complex changes, researchers developed the framework of the landscape of fear, that is, the spatio-temporal variation of perceived predation risk. This concept simplifies all the involved ecological processes into one framework, by integrating animal biology and distribution with habitat characteristics. Researchers can then evaluate the perception of predation risk in prey species, what are the behavioural responses of the prey and, therefore, understand the cascading effects of landscapes of fear at the resource levels (tri-trophic effects). Although tri-trophic effects are well studied at the predator-prey interaction level, little is known on how the forager-resource interactions are part of the overall cascading effects of landscapes of fear, despite the changes of forager feeding behaviour - that occur with perceived predation risk - affecting directly the level of the resources. This thesis aimed to evaluate the cascading effects of the landscape of fear on biodiversity of resources, and how the feeding behaviour and movement of foragers shaped the final resource species composition (potential coexistence mechanisms). We studied the changes caused by landscapes of fear on wild and captive rodent communities and evaluated: the cascading effects of different landscapes of fear on a tri-trophic system (I), the effects of fear on a forager’s movement patterns and dietary preferences (II) and cascading effects of different types of predation risk (terrestrial versus avian, III). In Chapter I, we applied a novel measure to evaluate the cascading effects of fear at the level of resources, by quantifying the diversity of resources left after the foragers gave-up on foraging (diversity at the giving-up density). We tested the measure at different spatial levels (local and regional) and observed that with decreased perceived predation risk, the density and biodiversity of resources also decreased. Foragers left a very dissimilar community of resources based on perceived risk and resources functional traits, and therefore acted as an equalising mechanism. In Chapter II, we wanted to understand further the decision-making processes of rodents in different landscapes of fear, namely, in which resource species rodents decided to forage on (based on three functional traits: size, nutrients and shape) and how they moved depending on perceived predation risk. In safe landscapes, individuals increased their feeding activity and movements and despite the increased costs, they visited more often patches that were further away from their central-place. Despite a preference for the bigger resources regardless of risk, when perceived predation risk was low, individuals changed their preference to fat-rich resources. In Chapter III, we evaluated the cascading effects of two different types of predation risk in rodents: terrestrial (raccoon) versus avian predation risk. Raccoon presence or absence did not alter the rodents feeding behaviour in different landscapes of fear. Rodent’s showed risk avoidance behaviours towards avian predators (spatial risk avoidance), but not towards raccoons (lack of temporal risk avoidance). By analysing the effects of fear in tri-trophic systems, we were able to deepen the knowledge of how non-consumptive effects of predators affect the behaviour of foragers, and quantitatively measure the cascading effects at the level of resources with a novel measure. Foragers are at the core of the ecological processes and responses to the landscape of fear, acting as variable coexistence agents for resource species depending on perceived predation risk. This newly found measures and knowledge can be applied to more trophic chains, and inform researchers on biodiversity patterns originating from landscapes of fear. N2 - Die Wechselwirkungen zwischen Raubtier und Beute sind ein wichtiger Faktor in der Evolution der Tierwelt, da sich die Raubtiere anpassen müssen, um ihre Beute besser jagen zu können und die Beutetiere vermeiden müssen, gefressen zu werden, während sie immer noch genügend Ressourcen für ihre täglichen Bedürfnisse verbrauchen. In diesem ständigen Kampf müssen die Beutetiere ihr Verhalten ständig ändern, da sie die Anwesenheit von Raubtieren fürchten. Die Landschaft der Angst ist ein Rahmen, der alle ökologischen Prozesse beschreibt, die ablaufen, wenn die Tiere das Raubtierrisiko auf unterschiedliche Weise wahrnehmen. In Angstlandschaften reichen die indirekten Auswirkungen der Angst vor einem Raubtier aus, um eine Vielzahl von Reaktionen bei den Beutetieren hervorzurufen und folglich die Art und Weise zu beeinflussen, in der die Beutetiere Naturgutstype fressen (tritrophe Effekte). Während die Interaktionen zwischen Raubtieren und Beutetieren gut erforscht sind, fehlt es an Wissen darüber, wie die Landschaft der Angst die Interaktionen zwischen Beutetieren und Naturgutstype beeinflussen kann (z. B. Pflanzenfresser, die Pflanzen fressen). In dieser Arbeit untersuchten wir die Kaskadeneffekte (d.h. Domino Effekte), die Beutetiere auf Naturgutstype haben, wenn sie verschiedene Prädationsrisiken wahrnehmen. Insbesondere wollten wir untersuchen, wie die Beutetiere entscheiden, was sie fressen und wohin sie sich bewegen, wie sich diese Veränderungen auf die biologische Vielfalt der Ressourcen auswirken können und welche Folgen dies für die Evolution der Ressourcenarten hat. Für alle unsere Studien haben wir Nagetiere als Modellarten verwendet. Wir entwickelten ein neues Maß zur Quantifizierung der Auswirkungen von Angst auf die biologische Vielfalt von Ressourcen und testeten es erfolgreich an wilden Nagetierpopulationen. Wir konnten beobachten, dass die Nagetiere unterschiedliche Samenarten und -mengen fressen, je nachdem, wie sie das Raubtierrisiko einschätzen und abhängig von den Eigenschaften der Samen und der Art der vorhandenen Raubtiere (terrestrische oder aviäre Fleischfresser). Wir konnten diese Veränderungen quantifizieren und Vorhersagen darüber machen, wie sich der Wettbewerb zwischen den Samen um das Wachstum verändern würde (Koexistenzmechanismen). Mit diesem Wissen haben wir den Rahmen der Angstlandschaft um die komplexen Wechselwirkungen zwischen Beute und Ressourcen erweitert und können unsere Erkenntnisse auch dazu nutzen, um zu verstehen, wie weitere Tierarten die biologische Vielfalt anderer Arten verändern, indem wir einfach verstehen, wie ängstlich sie sind. KW - landscape of fear KW - functional traits KW - foraging behaviour KW - biodiversity KW - giving-up density KW - cascading effects KW - Biodiversität KW - Kaskadeneffekte KW - Futtersuchverhalten KW - funktionale Merkmale KW - Landschaft der Angst Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-611020 ER - TY - THES A1 - Bysani Kondagari, Viswanada Reddy T1 - Engineering and evolution of saccharomyces cerevisiae for synthetic formatotrophic growth via the reductive glycine pathway N2 - Increasing demand for food, healthcare, and transportation arising from the growing world population is accompanied by and driving global warming challenges due to the rise of the atmospheric CO2 concentration. Industrialization for human needs has been increasingly releasing CO2 into the atmosphere for the last century or more. In recent years, the possibility of recycling CO2 to stabilize the atmospheric CO2 concentration and combat rising temperatures has gained attention. Thus, using CO2 as the feedstock to address future world demands is the ultimate solution while controlling the rapid climate change. Valorizing CO2 to produce activated and stable one-carbon feedstocks like formate and methanol and further upgrading them to industrial microbial processes to replace unsustainable feedstocks would be crucial for a future biobased circular economy. However, not all microbes can grow on formate as a feedstock, and those microbes that can grow are not well established for industrial processes. S. cerevisiae is one of the industrially well-established microbes, and it is a significant contributor to bioprocess industries. However, it cannot grow on formate as a sole carbon and energy source. Thus, engineering S. cerevisiae to grow on formate could potentially pave the way to sustainable biomass and value-added chemicals production. The Reductive Glycine Pathway (RGP), designed as the aerobic twin of the anaerobic Reductive Acetyl-CoA pathway, is an efficient formate and CO2 assimilation pathway. The RGP comprises of the glycine synthesis module (Mis1p, Gcv1p, Gcv2p, Gcv3p, and Lpd1p), the glycine to serine conversion module (Shmtp), the pyruvate synthesis module (Cha1p), and the energy supply module (Fdh1p). The RGP requires formate and elevated CO2 levels to operate the glycine synthesis module. In this study, I established the RGP in the yeast system using growth-coupled selection strategies to achieve formate and CO2-dependent biomass formation in aerobic conditions. Firstly, I constructed serine biosensor strains by disrupting the native serine and glycine biosynthesis routes in the prototrophic S288c and FL100 yeast strains and insulated serine, glycine, and one-carbon metabolism from the central metabolic network. These strains cannot grow on glucose as the sole carbon source but require the supply of serine or glycine to complement the engineered auxotrophies. Using growth as a readout, I employed these strains as selection hosts to establish the RGP. Initially, to achieve this, I engineered different serine-hydroxymethyltransferases in the genome of serine biosensor strains for efficient glycine to serine conversion. Then, I implemented the glycine synthesis module of the RGP in these strains for the glycine and serine synthesis from formate and CO2. I successfully conducted Adaptive Laboratory Evolution (ALE) using these strains, which yielded a strain capable of glycine and serine biosynthesis from formate and CO2. Significant growth improvements from 0.0041 h-1 to 0.03695 h-1 were observed during ALE. To validate glycine and serine synthesis, I conducted carbon tracing experiments with 13C formate and 13CO2, confirming that more than 90% of glycine and serine biosynthesis in the evolved strains occurs via the RGP. Interestingly, labeling data also revealed that 10-15% of alanine was labelled, indicating pyruvate synthesis from the formate-derived serine using native serine deaminase (Cha1p) activity. Thus, RGP contributes to a small pyruvate pool which is converted to alanine without any selection pressure for pyruvate synthesis from formate. Hence, this data confirms the activity of all three modules of RGP even in the presence of glucose. Further, ALE in glucose limiting conditions did not improve pyruvate flux via the RGP. Growth characterization of these strains showed that the best growth rates were achieved in formate concentrations between 25 mM to 300 mM. Optimum growth required 5% CO2, and dropped when the CO2 concentration was reduced from 5% to 2.5%. Whole-genome sequencing of these evolved strains revealed mutations in genes that encode Gdh1p, Pet9p, and Idh1p. These enzymes might influence intracellular NADPH, ATP, and NADH levels, indicating adjustment to meet the energy demand of the RGP. I reverse-engineered the GDH1 truncation mutation on unevolved serine biosensor strains and reproduced formate dependent growth. To elucidate the effect of the GDH1 mutation on formate assimilation, I reintroduced this mutation in the S288c strain and conducted carbon-tracing experiments to compared formate assimilation between WT and ∆gdh1 mutant strains. Comparatively, enhanced formate assimilation was recorded in the ∆gdh1 mutant strain. Although the 13C carbon tracing experiments confirmed the activity of all three modules of the RGP, the overall pyruvate flux via the RGP might be limited by the supply of reducing power. Hence, in a different approach, I overexpressed the formate dehydrogenase (Fdh1p) for energy supply and serine deaminase (Cha1p) for active pyruvate synthesis in the S288c parental strain and established growth on formate and serine without glucose in the medium. Further reengineering and evolution of this strain with a consistent energy, and formate-derived serine supply for pyruvate synthesis, is essential to achieve complete formatotrophic growth in the yeast system. N2 - Die steigende Nachfrage nach Lebensmitteln, Gesundheitsfürsorge und Transportmitteln durch die stetig wachsende Weltbevölkerung, sorgen für eine dramatisch fortschreitende globale Erwärmung; verursacht durch den massiven weltweiten CO2 Ausstoß. Durch die Industrialisierung wurde im vergangenen Jahrhundert immer mehr CO2 in die Atmosphäre freigesetzt. Recycling von CO2 hat in den letzten Jahren an Aufmerksamkeit gewonnen, um die steigenden Temperaturen zu stabilisieren. CO2 ist somit der ultimative Rohstoff, um den künftigen weltweiten Bedarf zu decken und gleichzeitig den raschen Klimawandel zu kontrollieren. Die Verwendung von CO2 zur Herstellung von aktivierten Ein-Kohlenstoff-Verbindungen wie Formiat und Methanol und die weitere Aufwertung durch mikrobielle Prozesse, wäre für die biobasierte Kreislaufwirtschaft von entscheidender Bedeutung. Allerdings können die allermeisten Mikroorganismen auf den genannten Ein-Kohlenstoffverbindungen- als Ausgangsstoff nicht wachsen und diejenigen, dies es können sind für industrielle Prozesse nicht geeignet. S. cerevisiae gehört zu den industriell etablierten Mikroorganismen und leistet einen wichtigen Beitrag zur Bioprozessindustrie. Sie kann jedoch nicht auf Formiat als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle wachsen. Die biotechnologische Anpassung von S. cerevisiae für das Wachstum auf Formiat könnte daher nachhaltige Wege für die Produktion von Biomasse und wertschöpfenden Chemikalien ebnen. Der Reduktive Glycinweg (RGP), der als aerober Zwilling des anaeroben Reduktiven Acetyl-CoA-Wegs konzipiert wurde, ist ein effizienter Formiat- und CO2 Assimilationsweg. Der RGP besteht aus dem Glycin-Synthesemodul (Mis1p, Gcv1p, Gcv2p, Gcv3p und Lpd1p), dem Modul zur Umwandlung von Glycin in Serin (Shmtp), dem Pyruvat-Synthesemodul (Cha1p) und dem Energieversorgungsmodul (Fdh1p). Der RGP benötigt Formiat und erhöhte CO2 Verfügbarkeit, um das Glycin-Synthesemodul zu betreiben. In dieser Studie habe ich das RGP im Hefesystem mit wachstumsgekoppelten Selektionsstrategien etabliert, um ein von Formiat und CO2 abhängiges zelluläres Wachstum unter aeroben Bedingungen zu erreichen. Zunächst habe ich Serin-Biosensor-Stämme konstruiert, indem ich die nativen Serin- und Glycin-Biosynthesewege in den prototrophen Stämmen S288c und FL100 unterbrochen und den Serin-, Glycin- und Ein-Kohlenstoff-Stoffwechsel vom zentralen Stoffwechselnetz isoliert habe. Diese Stämme können nicht mit Glukose als alleinige Kohlenstoffquelle wachsen, sondern benötigen die Zufuhr von Serin oder Glycin, um die eingeführten Auxotrophien zu ergänzen. Unter Verwendung von zellulärem Wachstum als Indikator, habe ich diese Stämme als Selektionswirte verwendet, um den RGP zu etablieren. Zu diesem Zweck habe ich durch genomische Integration von Serin-Hydroxymethyltransferasen (SHMTs) in diese Biosensorstämme effiziente Module zur Umwandlung von Glycin in Serin geschaffen. Dann implementierte ich das Glycin-Modul des RGP in die Stämme für die Glycin- und Serinsynthese aus Formiat und CO2. Mit diesen Stämmen führte ich erfolgreich eine adaptive Laborevolution (ALE) durch, die einen Stamm hervorbrachte, der zur Glycin- und Serinbiosynthese aus Ameisensäure und CO2 fähig ist. Während der ALE wurden signifikante Wachstumsverbesserungen von 0,0041 h-1 auf 0,03695 h-1 beobachtet. Um die Glycin- und Serinsynthese zu bestätigen, führte ich Experimente zur Kohlenstoffverfolgung mit 13C-Formiat und 13CO2 durch, die bestätigten, dass mehr als 90% der Glycin- und Serinbiosynthese über den RGP erfolgt. Interessanterweise ergaben die Markierungsdaten auch 10-15% markiertes Alanin, was auf eine Pyruvatsynthese aus dem von Formiat abgeleiteten Serin durch die native Serindeaminase (Cha1p) hinweist. Somit trägt der RGP zu einem kleinen Pyruvat-Pool bei, ohne dass ein Selektionsdruck für die Pryuvat Synthese aus Formiat besteht. Diese Daten bestätigen somit die Aktivität aller drei Module von RGP auch in Gegenwart von Glukose. Weitere ALE unter glukoselimitierenden Bedingungen verbesserte den Pyruvatfluss aus dem RGP allerdings nicht. Die Wachstumscharakterisierung der beschriebnen Stämme zeigte, dass die besten Wachstumsraten bei Formiatkonzentrationen zwischen 25 mM und 300 mM erzielt wurden. Für optimales Wachstum wurde 5% CO2 benötigt und die Wachstumsrate verschlechterte sich bei einer CO2 Konzentration von 2.5 %. Die Sequenzierung des gesamten Genoms dieser weiterentwickelten Stämme ergab Mutationen in Genen, die für Gdh1p, Pet9p und Idh1p kodieren. Diese Enzyme beeinflussen den intrazellulären NADPH-, ATP- und NADH-Spiegel, was auf den Energiebedarf für die Aktivität des RGP hinweist. Ich habe die GDH1-Mutation in nicht evolvierte Serin-Biosensor-Stämme eingebracht und damit das von Formiat und CO2 abhängige Wachstum reproduziert. Um die Auswirkung der GDH1-Mutation auf die Formationsassimilation zu klären, habe ich diese Mutation in den WT-Stamm eingeführt und ein Experiment zur Kohlenstoffverfolgung mit 13C-Formiat und Glukose durchgeführt. Es wurde nachgewiesen, dass die gdh1-Mutante im Vergleich zum WT-Stamm eine verbesserte Assimilation aufweist. Obwohl die 13C-Isotopenmarkierung die Aktivität aller drei Module der RGP bestätigte, könnte der Gesamtpyruvatfluss über den RGP durch die Versorgung mit Redox-Äuquivalenten begrenzt sein. In einem anderen Ansatz wurden daher die Formiatdehydrogenase (Fdh1p) für die Energieversorgung und die Serindesaminase (Cha1p) für die aktive Pyruvatsynthese überexprimiert und ein Wachstum mit Formiat und Serin ohne Glukose in der WT-Hefe festgestellt. Die weitere Entwicklung des gesamten Stoffwechsels in Kombination mit Evolutionsstrategien,und einer aus Formiat gewonnenen Serin- und Energiezufuhr für die Pyruvatsynthese ist unerlässlich, um ein vollständiges formatotrophes Wachstum im Hefesystem zu erreichen. KW - synthetic formatotrphy KW - green house gases KW - CHO-THF, CH-THF, CH2-THF, and CH3-THF KW - reductive glycine pathway KW - reductive acetyl-CoA pathway KW - glycine decarboxylase complex (=GCV) KW - glycine cleavage system KW - glycine synthase complex (reversal of GCV) KW - One-carbon KW - 10-Formyltetrahydrofolate KW - 5,10-Methenyltetrahydrofolate KW - 5,10-Methylenetetrahydrofolate KW - 5-Methyltetrahydrofolate KW - serine hydroxymethyltransferase KW - serine biosensor KW - adaptive laboratory evolution KW - next generation sequencing KW - Treibhausgase KW - Rahmenübereinkommen der Vereinten Nationen über Klimaänderungen KW - reduktiver Glycinweg KW - reduktiver Acetyl-CoA-Weg KW - Glycin-Spaltsystem KW - Glycin-Decarboxylase-Komplex (=GCV) KW - Glycin-Synthase-Komplex (Umkehrung von GCV) KW - Ein Kohlenstoff KW - 10-Formyltetrahydrofolat KW - 5,10-Methenyltetrahydrofolat KW - 5-Methyltetrahydrofolat KW - CHO-THF, CH-THF, CH2-THF und CH3-THF KW - 3-Phosphoglycerinsäure KW - Serin-Hydroxymethyltransferase KW - Serin-Biosensor KW - Evolutionsrunde KW - adaptive Laborentwicklung KW - Sequenzierung der nächsten Generation KW - Codierungssequenz KW - autonom replizierende Sequenz Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-582222 ER - TY - THES A1 - Carrasco, Tomas T1 - Genome structure analysis and patterns of transposable elements evolution in the slow-evolving Testudines clade N2 - Transposable elements (TEs) are loci that can replicate and multiply within the genome of their host. Within the host, TEs through transposition are responsible for variation on genomic architecture and gene regulation across all vertebrates. Genome assemblies have increased in numbers in recent years. However, to explore in deep the variations within different genomes, such as SNPs (single nucleotide polymorphism), INDELs (Insertion-deletion), satellites and transposable elements, we need high-quality genomes. Studies of molecular markers in the past 10 years have limitations to correlate with biological differences because molecular markers rely on the accuracy of the genomic resources. This has generated that a substantial part of the studies of TE in recent years have been on high quality genomic resources such as Drosophila, zebrafinch and maize. As testudine have a slow mutation rate lower only to crocodilians, with more than 300 species, adapted to different environments all across the globe, the testudine clade can help us to study variation. Here we propose Testudines as a clade to study variation and the abundance of TE on different species that diverged a long time ago. We investigated the genomic diversity of sea turtles, identifying key genomic regions associated to gene family duplication, specific expansion of particular TE families for Dermochelyidae and that are important for phenotypic differentiation, the impact of environmental changes on their populations, and the dynamics of TEs within different lineages. In chapter 1, we identify that despite high levels of genome synteny within sea turtles, we identified that regions of reduced collinearity and microchromosomes showed higher concentrations of multicopy gene families, as well as genetic distances between species, indicating their potential importance as sources of variation underlying phenotypic differentiation. We found that differences in the ecological niches occupied by leatherback and green turtles have led to contrasting evolutionary paths for their olfactory receptor genes. We identified in leatherback turtles a long-term low population size. Nonetheless, we identify no correlation between the regions of reduced collinearity with abundance of TEs or an accumulation of a particular TE group. In chapter 2, we identified that sea turtle genomes contain a significant proportion of TEs, with differences in TE abundance between species, and the discovery of a recent expansion of Penelope-like elements (PLEs) in the highly conserved sea turtle genome provides new insights into the dynamics of TEs within Testudines. In chapter 3, we compared the proportion of TE across the Testudine clade, and we identified that the proportion of transposable elements within the clade is stable, regardless of the quality of the assemblies. However, we identified that the proportion of TEs orders has correlation with genome quality depending of their expanded abundancy. For retrotransposon, a highly abundant element for this clade, we identify no correlation. However, for DNA elements a rarer element on this clade, correlate with the quality of the assemblies. Here we confirm that high-quality genomes are fundamental for the study of transposable element evolution and the conservation within the clade. The detection and abundance of specific orders of TEs are influenced by the quality of the genomes. We identified that a reduction in the population size on D. coriacea had left signals of long-term low population sizes on their genomes. On the same note we identified an expansion of TE on D. coriacea, not present in any other member of the available genomes of Testudines, strongly suggesting that it is a response of deregulation of TE on their genomes as consequences of the low population sizes. Here we have identified important genomic regions and gene families for phenotypic differentiation and highlighted the impact of environmental changes on the populations of sea turtles. We stated that accurate classification and analysis of TE families are important and require high-quality genome assemblies. Using TE analysis we manage to identify differences in highly syntenic species. These findings have significant implications for conservation and provide a foundation for further research into genome evolution and gene function in turtles and other vertebrates. Overall, this study contributes to our understanding of evolutionary change and adaptation mechanisms. N2 - Transponierbare Elemente (TEs) sind Loci, die sich im Genom ihres Wirts replizieren und vermehren können. Innerhalb des Wirts sind TEs durch Transposition für die Variation der genomischen Architektur und der Genregulation bei allen Wirbeltieren verantwortlich. In den letzten Jahren hat die Zahl der Genomassemblies zugenommen. Um jedoch die Variationen innerhalb verschiedener Genome, wie SNPs, INDELs, Satelliten und transponierbare Elemente, eingehend zu untersuchen, benötigen wir qualitativ hochwertige Genome. Studien über molekulare Marker in den letzten 10 Jahren haben nur begrenzt mit biologischen Unterschieden korreliert, da molekulare Marker von der Genauigkeit der genomischen Ressourcen abhängen. Dies hat dazu geführt, dass ein großer Teil der TE-Studien der letzten Jahre an qualitativ hochwertigen genomischen Ressourcen wie Drosophila, Zebrafinken und Mais durchgeführt wurde. Da die Testudinen eine langsame Mutationsrate haben, die nur bei Krokodilen niedriger ist, aber mehr als 300 Arten umfassen, die an verschiedene Umgebungen auf der ganzen Welt angepasst sind, kann uns diese Gruppe bei der Untersuchung der Variation helfen. Hier schlagen wir Testudinen als Klade vor, um die Variation und die Häufigkeit von TE bei verschiedenen Arten zu untersuchen, die sich vor langer Zeit auseinanderentwickelt haben. Wir untersuchten die genomische Vielfalt der Meeresschildkröten und identifizierten genomische Schlüsselregionen, die mit der Duplikation von Genfamilien, der spezifischen Ausbreitung bestimmter TE-Familien bei den Dermochelyidae verbunden und für die phänotypische Differenzierung wichtig sind, sowie die Auswirkungen von Umweltveränderungen auf ihre Populationen und die Dynamik transponierbarer Elemente (TEs) innerhalb verschiedener Linien. In Kapitel 1 stellen wir fest, dass trotz des hohen Maßes an Genomsyntenie innerhalb der Meeresschildkröten Regionen mit geringerer Kollinearität und Mikrochromosomen eine höhere Konzentration von Genfamilien mit mehreren Kopien sowie genetische Abstände zwischen den Arten aufweisen, was auf ihre potenzielle Bedeutung als Variationsquellen für die phänotypische Differenzierung hinweist. Wir fanden heraus, dass die Unterschiede in den ökologischen Nischen, die Lederschildkröten und Suppenschildkröten besetzen, zu gegensätzlichen evolutionären Pfaden für ihre Geruchsrezeptorgene geführt haben. Bei Lederschildkröten haben wir Anzeichen für langfristig niedrige Populationsgrößen festgestellt. Dennoch konnten wir keine Korrelation zwischen den Regionen mit reduzierter Kollinearität und der Häufigkeit von TEs oder einer Akkumulation einer bestimmten TE-Gruppe feststellen. In Kapitel 2 haben wir festgestellt, dass die Genome von Meeresschildkröten einen beträchtlichen Anteil an TEs enthalten, mit Unterschieden in der TE-Häufigkeit zwischen den Arten, und die Entdeckung einer kürzlichen Ausbreitung von Penelope-ähnlichen Elementen (PLEs) im hochkonservierten Genom von Meeresschildkröten bietet neue Einblicke in die Dynamik von TEs innerhalb der Testudinen. In Kapitel 3 haben wir den Anteil der TE innerhalb der Testudinenklade verglichen und festgestellt, dass der Anteil der transponierbaren Elemente innerhalb der Klade stabil ist, unabhängig von der Qualität der Assemblies. Allerdings haben wir festgestellt, dass der Anteil der TEs Bestellungen hat Korrelation mit Genom Qualität in Abhängigkeit von ihrer erweiterten Häufigkeit, wie auf Retrotransposon, ein sehr häufig Element für diese Klade, wir identifizieren keine Korrelation, aber, DNA-Elemente ein seltener Element auf dieser Klade, korrelieren mit der Qualität der Baugruppen. Hier bestätigen wir, dass qualitativ hochwertige Genome für die Untersuchung der Entwicklung transponierbarer Elemente und der Erhaltung innerhalb der Gruppe von grundlegender Bedeutung sind. Der Nachweis und die Häufigkeit bestimmter Ordnungen von TEs werden durch die Qualität der Genome beeinflusst. Wir haben festgestellt, dass eine Verringerung der Populationsgröße bei D. coriacea Signale für langfristig niedrige Populationsgrößen in ihren Genomen hinterlassen hat. Gleichzeitig haben wir bei D. coriacea eine Ausdehnung der TE festgestellt, die in keinem anderen Mitglied der verfügbaren Genome der Testudinen vorkommt, was stark darauf hindeutet, dass es sich um eine Reaktion auf die Deregulierung der TE auf ihren Genomen als Folge der geringen Populationsgrößen handelt. Hier haben wir wichtige genomische Regionen und Genfamilien für die phänotypische Differenzierung identifiziert und die Auswirkungen von Umweltveränderungen auf die Populationen von Meeresschildkröten aufgezeigt. Wir haben festgestellt, dass eine genaue Klassifizierung und Analyse von TE-Familien wichtig ist und qualitativ hochwertige Genomassemblies erfordert. Mit Hilfe der TE-Analyse gelingt es uns, Unterschiede in hochsynthetischen Arten zu identifizieren. Diese Ergebnisse sind von großer Bedeutung für den Artenschutz und bilden eine Grundlage für die weitere Erforschung der Genomevolution und der Genfunktionen bei Schildkröten und anderen Wirbeltieren. Insgesamt trägt diese Studie zu unserem Verständnis des evolutionären Wandels und der Anpassungsmechanismen bei. KW - transposable elements KW - Chelonia mydas KW - Dermochelys coriacea KW - evolutionary biology KW - Transponierbare Elemente KW - Chelonia mydas KW - Dermochelys coriacea KW - Evolutionsbiologie Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-606577 ER - TY - THES A1 - Göthel, Markus T1 - Entwicklung eines Verfahrens zur Generierung von spezifischen monoklonalen Antikörpern gegen Mikroorganismen basierend auf in silico Epitopanalysen T1 - A new workflow to generate monoclonal antibodies against microorganisms based on in silico epitope predictions N2 - Monoklonale Antikörper (mAK) sind eines der wichtigsten Biomoleküle für die Umweltanalytik und die medizinische Diagnostik. Für die Detektion von Mikroorganismen bilden sie die Grundlage für ein schnelles und präzises Testverfahren. Bis heute gibt es, aufgrund des hohen zeitlichen und materiellen Aufwandes und der unspezifischen Immunisierungsstrategien, nur wenige mAK, die spezifisch Mikroorganismen erkennen. Zu diesem Zweck sollte ein anwendbares Verfahren für die Generierung von mAK gegen Mikroorganismen entwickelt werden, welches anhand von Escherichia coli O157:H7 und Legionella pneumophila validiert wurde. In dieser Dissertation konnten neue Oberflächenstrukturen auf den Mikroorganismen mittels vergleichender Genomanalysen und in silico Epitopanalysen identifiziert werden. Diese wurden in das Virushüllprotein VP1 integriert und für eine gezielte Immunisierungsstrategie verwendet. Für die Bestimmung antigenspezifischer antikörperproduzierender Hybridome wurde ein Immunfärbeprotokoll entwickelt und etabliert, um die Hybridome im Durchflusszytometer zu sortieren. In der vorliegenden Studie konnten für E. coli O157:H7 insgesamt 53 potenzielle Proteinkandidaten und für L. pneumophila 38 Proteine mithilfe der bioinformatischen Analyse identifiziert werden. Fünf verschiedene potenzielle Epitope wurden für E. coli O157:H7 und drei verschiedenen für L. pneumophila ausgewählt und für die Immunisierung mit chimären VP1 verwendet. Alle Immunseren zeigten eine antigenspezifische Immunantwort. Aus den nachfolgend generierten Hybridomzellen konnten mehrere Antikörperkandidaten gewonnen werden, welche in Charakterisierungsstudien eine starke Bindung zu E. coli O157:H7 bzw. L. pneumophila vorwiesen. Kreuzreaktivitäten zu anderen relevanten Mikroorganismen konnten keine bzw. nur in geringem Maße festgestellt werden. Folglich konnte der hier beschriebene interdisziplinäre Ansatz zur Generierung spezifischer mAK gegen Mikroorganismen nachweislich spezifische mAK hervorbringen und ist als hocheffizienter Arbeitsablauf für die Herstellung von Antikörpern gegen Mikroorganismen einsetzbar. N2 - Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most important biomolecules for environmental analysis and medical diagnostics. For the detection of microorganisms, they form the basis for a rapid and precise test procedure. Until today, due to the substantial time and material effort and the non-specific immunization strategies, there are only a few mAbs that specifically detect microorganisms. Therefore, an easy-to-use methodology for the generation of mAbs against microorganisms was developed and validated using Legionella pneumophila and Escherichia coli O157:H7. In this dissertation, several new surface structures on the microorganisms were identified using comparative genomic analyses and in silico epitope modeling. These were integrated into the VP1 viral envelope protein and used for a specific immunization strategy. For the identification of antigen-specific antibody-producing hybridomas, an immunostaining protocol was developed and established to sort the hybridomas. In the present study, 53 potential protein candidates were identified for E. coli O157:H7 and 38 proteins for L. pneumophila using bioinformatic analysis methods. Five different peptide epitopes were selected for E. coli O157:H7 and three different peptide epitopes for L. pneumophila for immunization using chimeric VP1. All immune sera showed an antigen-specific immune response. Several antibody candidates were obtained from the generated hybridoma cells, which showed strong binding to E. coli O157:H7 and L. pneumophila. Cross-reactivity to other relevant microorganisms could not be detected or could only be observed to a minor extent. Consequently, the interdisciplinary approach to generate specific mAbs against microorganisms has been shown to generate specific mAbs and is applicable as a highly efficient workflow for the generation of antibodies against microorganisms. KW - Antikörper KW - antibody KW - Epitopvorhersage KW - epitop prediction KW - Escherichia coli KW - legionella pneumophila Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-588017 ER - TY - THES A1 - Prüfer, Mareike T1 - Charakterisierung und wechselfeldgestützte Herstellung von Enzym-Nanoarrays T1 - Characterization and AC-electrokinetical production of enzyme nanoarrays N2 - Dielektrophorese ist die Manipulation polarisierbarer Partikel durch inhomogene elektrische Wechselfelder. In dieser Arbeit wurden drei verschiedene Enzyme durch Dielektrophorese immobilisiert und anschließend hinsichtlich ihrer katalytischen Aktivität untersucht: Meerrettichperoxidase, Cholinoxidase aus Alcaligenes sp. und Glucoseoxidase aus Aspergillus niger. Die Immobilisierung erfolgte durch Dielektrophorese auf nano-Elektrodenarrays aus Wolfram-Zylindern mit 500 nm Durchmesser oder aus Titannitrid-Ringen mit 20 nm Breite. Die Immobilisierung der Enzyme konnte fluoreszenzmikroskopisch entweder anhand der intrinsischen Fluoreszenz oder aufgrund einer Fluoreszenzmarkierung vor oder nach der Immobilisierung für alle getesteten Enzyme nachgewiesen werden. Die Messung der Enzymaktivität erfolgte quantitativ durch den direkten oder indirekten Nachweis des gebildeten Produktes oder, im Falle der Cholinoxidase, durch Beobachtung der intrinsischen Fluoreszenz des Cofaktors FAD, die vom Oxidationszustand dieses Enzyms abhängt. Für die Meerrettichperoxidase konnte so eine hohe erhaltene Enzymaktivität nach der Immobilisierung nachgewiesen werden. Die Aktivität der permanent immobilisierten Fraktion der Meerrettichperoxidase entsprach bis zu 47 % der höchstmöglichen Aktivität einer Monolage dieses Enzyms auf den Elektroden des Chips. Diese Aktivität kann als aktive, aber zufällig gegenüber der Oberfläche ausgerichtete Enzymschicht interpretiert werden. Für die permanent immobilisierte Glucoseoxidase wurde nur eine Aktivität entsprechend <1,3 % der Aktivität einer solchen Enzymschicht detektiert, während für die immobilisierte Cholinoxidase gar keine Aktivität nachgewiesen werden konnte. Die Aktivität der durch DEP immobilisierten Enzyme konnte somit quantitativ bestimmt werden. Der Anteil an erhaltener Aktivität hängt dabei stark vom verwendeten Enzym ab. N2 - Dielectrophoresis is the manipulation of polarizable particles by alternating inhomogeneous electric fields. In this work, three enzymes were immobilized by dielectrophoresis and were analyzed regarding their catalytic activity afterwards: Horseradish peroxidase, choline oxidase from Alcaligenes sp. and glucose oxidase from Aspergillus niger. Immobilization by dielectrophoresis took place on nanoelectrode arrays consisting of tungsten cylinders with a diameter of 500 nm or of titanium nitride rings with a width of 20 nm. Immobilization was verified by fluorescence microscopy using either the intrinsic fluorescence of the enzymes or fluorescent labeling of the enzymes before or after immobilization. Enzyme activity measurements were performed quantitatively by direct or indirect detection of the enzyme’s product or, in the case of choline oxidase, by observing the intrinsic fluorescence of the enzyme’s cofactor FAD which is a function of its oxidation state. For horesradish peroxidase, a rather high retained activity of the enzyme after immobilization was observed. The activity of the permanently immobilized fraction of horseradish peroxidase equaled up to 47 % of the activity which can be maximally expected for a fully active monolayer of the enzyme molecules on all electrodes of the chip. This activity can be interpreted as the result of a fully active, but randomly oriented monolayer of immobilized horseradish peroxidase. The activity of permanently immobilized glucose oxidase equaled only <1,3 % of a fully active monolayer, whereas no activity was evident for immobilized choline oxidase. Accordingly, the activity of enzymes immobilized by DEP was measured quantitatively. The percentage of retained activity thereby strongly depends on the enzyme under investigation. KW - Enzyme KW - Dielektrophorese KW - enzymes KW - dielectrophoresis Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-612329 ER - TY - THES A1 - Petrich, Annett T1 - Quantitative fluorescence microscopy methods to investigate molecular interactions and dynamics in living cells T1 - Quantitative Fluoreszenzmikroskopiemethoden zur Untersuchung molekularer Interaktionen und Dynamik in lebenden Zellen N2 - Biomolecules such as proteins and lipids have vital roles in numerous cellular functions, including biomolecule transport, protein functions, cellular homeostasis and biomembrane integrity. Traditional biochemistry methods do not provide precise information about cellular biomolecule distribution and behavior under native environmental conditions since they are not transferable to live cell samples. Consequently, this can lead to inaccuracies in quantifying biomolecule interactions due to potential complexities arising from the heterogeneity of native biomembranes. To overcome these limitations, minimal invasive microscopic techniques, such as fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) in combination with fluorescence proteins (FPs) and fluorescence lipid analogs, have been developed. FFS techniques and membrane property sensors enable the quantification of various parameters, including concentration, dynamics, oligomerization, and interaction of biomolecules in live cell samples. In this work, several FFS approaches and membrane property sensors were implemented and employed to examine biological processes of diverse context. Multi-color scanning fluorescence fluctuation spectroscopy (sFCS) was used the examine protein oligomerization, protein-protein interactions (PPIs) and protein dynamics at the cellular plasma membrane (PM). Additionally, two-color number and brightness (N&B) analysis was extended with the cross-correlation analysis in order to quantify hetero-interactions of proteins in the PM with very slow motion, which would not accessible with sFCS due strong initial photobleaching. Furthermore, two semi-automatic analysis pipelines were designed: spectral Förster resonance energy transfer (FRET) analysis to study changes in membrane charge at the inner leaflet of the PM, and spectral generalized polarization (GP) imaging and spectral phasor analysis to monitor changes in membrane fluidity and order. An important parameter for studying PPIs is molecular brightness, which directly determines oligomerization and can be extracted from FFS data. However, FPs often display complex photophysical transitions, including dark states. Therefore, it is crucial to characterize FPs for their dark-states to ensure reliable oligomerization measurements. In this study, N&B and sFCS analysis were applied to determine photophysical properties of novel green FPs under different conditions (i.e., excitation power and pH) in living cells. The results showed that the new FPs, mGreenLantern (mGL) and Gamillus, exhibited the highest molecular brightness at the cost of lower photostability. The well-established monomeric enhanced green fluorescent protein (mEGFP) remained the best option to investigate PPIs at lower pH, while mGL was best suited for neutral pH, and Gamillus for high pH. These findings provide guidance for selecting an appropriate FP to quantify PPIs via FFS under different environmental conditions. Next, several biophysical fluorescence microscopy approaches (i.e., sFCS, GP imaging, membrane charge FRET) were employed to monitor changes in lipid-lipid-packing in biomembranes in different biological context. Lipid metabolism in cancer cells is known to support rapid proliferation and metastasis. Therefore, targeting lipid synthesis or membrane integrity holds immense promise as an anticancer strategy. However, the mechanism of action of the novel agent erufosine (EPC3) on membrane stability is not fully under stood. The present work revealed that EPC3 reduces lipid packing and composition as well as increased membrane fluidity and dynamic, hence, modifies lipid-lipid-interaction. These effects on membrane integrity were likely triggered by modulations in lipid metabolism and membrane organization. In the case of influenza A virus (IAV) infection, regulation of lipid metabolism is crucial for multiple steps in IAV replication and is related to the pathogenicity of IAV. Here, it is shown for the first time that IAV infection triggers a local enrichment of negatively charged lipids at the inner leaflet of the PM, which decreases membrane fluidity and dynamic, as well as increases lipid packing at the assembly site in living cells. This suggests that IAV alters lipid-lipid interactions and organization at the PM. Overall, this work highlights the potential of biophysical techniques as a screening platform for studying membrane properties in living cells at the single-cell level. Finally, this study addressed remaining questions about the early stage of IAV assembly. The recruitment of matrix protein 1 (M1) and its interaction with other viral surface proteins, hemagglutinin (HA), neuraminidase (NA), and matrix protein 2 (M2), has been a subject of debate due to conflicting results. In this study, different FFS approaches were performed in transfected cells to investigate interactions between IAV proteins themselves and host factors at the PM. FFS measurements revealed that M2 interacts strongly with M1, leading to the translocation of M1 to the PM. This interaction likely took place along the non-canonical pathway, as evidenced by the detection of an interaction between M2 and the host factor LC3-II, leading to the recruitment of LC3-II to the PM. Moreover, weaker interaction was observed between HA and membrane-bound M1, and no interaction between NA and M1. Interestingly, higher oligomeric states of M1 were only detectable in infected cells. These results indicate that M2 initiates virion assembly by recruiting M1 to the PM, which may serve as a platform for further interactions with viral proteins and host factors. N2 - Biomoleküle wie Proteine und Lipide spielen eine wichtige Rolle bei zahlreichen Zellfunktionen, darunter Biomolekültransport, Proteinfunktionen, zelluläre Homöostase und Biomembranintegrität. Traditionelle biochemische Methoden liefern keine Informationen über die Verteilung und das Verhalten zellulärer Biomolekülen unter natürlichen Bedingungen, da sie nicht auf lebende Zellproben übertragbar sind. Folglich kann dies zu Ungenauigkeiten bei der Quantifizierung von Biomolekülinteraktionen führen und potenzielle Komplexitäten der Heterogenität nativer Biomembranen übersehen. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden minimalinvasive mikroskopische Techniken wie die Fluoreszenzfluktuationsspektroskopie (FFS) in Kombination mit Fluoreszenzproteinen (FPs) und Fluoreszenzlipidanaloga entwickelt. FFS-Techniken und Membraneigenschaftssensoren ermöglichen die Quantifizierung verschiedener Parameter, einschließlich Konzentration, Dynamik, Oligomerisierung und Wechselwirkung von Biomolekülen in lebenden Zellproben. In dieser Arbeit wurden mehrere FFS-Ansätze und Sensoren für Membraneigenschaften implementiert und eingesetzt, um biologische Prozesse in verschiedenen Zusammenhängen zu untersuchen. Die Mehrfarben-Scanning-Fluoreszenzfluktuationsspektroskopie (sFCS) wurde zur Untersuchung von Protein-Oligomerisierung, Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPIs) und Proteindynamik an der zellulären Plasmamembran (PM) eingesetzt. Zusätzlich wurde die Zweifarben-Analyse von Anzahl und Helligkeit (N&B) mit der Kreuzkorrelationsanalyse erweitert, um Hetero-Interaktionen von Proteinen in der PM mit sehr langsamer Dynamik zu quantifizieren, die mit sFCS aufgrund starker anfänglicher Bleiche der Fluorophore nicht zugänglich wären. Darüber hinaus wurden zwei halbautomatische Analysepipelines entwickelt: die spektrale Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET)-Analyse zur Untersuchung von Änderungen der Membranladung auf der Innenseite der PM und die spektrale generalisierte Polarisation (GP)-Bildgebung sowie die spektrale Phasor-Analyse zur Überwachung von Änderungen der Membranfluidität und -ordnung. Ein wichtiger Parameter zur Untersuchung von PPIs ist die molekulare Helligkeit, die die Oligomerisierung direkt bestimmt und aus FFS daten extrahiert werden kann. Allerdings weisen FPs häufig komplexe photophysikalische Übergänge auf, einschließlich nichtfluoreszierender Zustände. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, FPs hinsichtlich ihrer dunklen Zustände zu charakterisieren, um zuverlässige Oligomerisierungsmessungen sicherzustellen. In dieser Studie wurden N&B- und sFCS-Analysen angewendet, um die photophysikalischen Eigenschaften neuartiger grüner FPs unter verschiedenen Bedingungen (d. h. Anregungsleistung und pH-Wert) in lebenden Zellen zu bestimmen. Die Ergebnisse zeigten, dass die neuen FPs mGreenLantern (mGL) und Gamillus die höchste molekulare Helligkeit aufwiesen, allerdings auf Kosten einer geringeren Photostabilität. Das etablierte mEGFP blieb die beste Option, um PPIs bei niedrigerem pH-Wert zu untersuchen, während mGL am besten für neutralen pH-Wert und Gamillus für hohen pH-Wert geeignet war. Diese Ergebnisse bieten Orientierung für die Auswahl eines geeigneten FP zur Quantifizierung von PPIs über FFS unter verschiedenen Umgebungsbedingungen. Als nächstes wurden mehrere biophysikalische Fluoreszenzmikroskopie-Ansätze (z. B. sFCS, GP-Bildgebung, Membranladung-FRET) eingesetzt, um Veränderungen in der Lipid-Lipid-Packung in Biomembranen in verschiedenen biologischen Kontexten zu überwachen. Es ist bekannt, dass der Lipidstoffwechsel in Krebszellen die schnelle Vermehrung und Metastasierung fördert. Daher ist die gezielte Beeinflussung der Lipidsynthese oder der Membranintegrität eine vielversprechende Strategie zur Krebsbekämpfung. Der Wirkungsmechanismus des neuartigen Wirkstoffs Erufosin (EPC3) auf die Membranstabilität ist nicht vollständig geklärt. Die vorliegende Arbeit ergab, dass EPC3 die Lipidpackung und -zusammensetzung reduziert sowie die Fluidität und Dynamik der Membran erhöht und somit die Lipid-Lipid-Wechselwirkung verändert. Diese Auswirkungen auf die Membranintegrität wurden wahrscheinlich durch Modulationen des Lipidstoffwechsels und der Membranorganisation ausgelöst. Im Falle einer Infektion mit dem Influenza-A-Virus (IAV) ist die Regulierung des Lipidstoffwechsels für mehrere Schritte der IAV-Replikation von entscheidender Bedeutung und hängt mit der Pathogenität von IAV zusammen. Hier wird zum ersten Mal gezeigt, dass eine IAV-Infektion eine lokale Anreicherung negativ geladener Lipide an der Innenseite der PM auslöst, die Fluidität und Dynamik der Membran verringert und die Lipidpackung an der Assemblierungsstelle in lebenden Zellen erhöht. Dies legt nahe, dass IAV die Lipid-Lipid-Wechselwirkungen und die Organisation am PM verändert. Insgesamt unterstreicht diese Arbeit das Potenzial biophysikalischer Techniken als Screening-Plattform zur Untersuchung von Membraneigenschaften in lebenden Zellen auf Einzelzellebene. Abschließend ging diese Studie auf verbleibende Fragen zur frühen Phase der IAV-Assemblierung ein. Die Rekrutierung von Matrixprotein 1 (M1) und seine Wechselwirkung mit anderen viralen Oberflächenproteinen, Hämagglutinin (HA), Neuraminidase (NA) und Matrixprotein 2 (M2), war aufgrund widersprüchlicher Ergebnisse Gegenstand von Debatten. In dieser Studie wurden verschiedene FFS-Ansätze in transfizierten Zellen durchgeführt, um Wechselwirkungen zwischen IAV-Proteinen untereinander und Wirtsfaktoren an der PM zu untersuchen. FFS-Messungen ergaben, dass M2 stark mit M1 interagiert, was zur Translokation von M1 zur PM führt. Diese Interaktion fand wahrscheinlich entlang des nichtkanonischen Weges statt, was durch den Nachweis einer Interaktion zwischen M2 und dem Wirtsfaktor LC3-II belegt wurde, die zur Rekrutierung von LC3-II zur PM führte. Darüber hinaus wurde eine schwächere Wechselwirkung zwischen HA und membrangebundenem M1 beobachtet und keine Wechselwirkung zwischen NA und M1. Interessanterweise waren höhere oligomere Zustände von M1 nur in infizierten Zellen nachweisbar. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass M2 den Zusammenbau von Virionen initiiert, indem es M1 zur PM rekrutiert, welches als Plattform für weitere Interaktionen mit viralen Proteinen und Wirtsfaktoren dienen könnte. KW - influenza A virus KW - virus-host interaction KW - cancer KW - biomolecule interactions KW - membrane fluidity KW - fluorescence fluctuation spectroscopy KW - fluorescent proteins KW - biosensors KW - Biomolekülinteraktionen KW - Biosensoren KW - Krebs KW - Fluoreszenzfluktuationsspektroskopie KW - fluoreszierende Proteine KW - Influenza A Virus KW - Membranfluidität KW - Virus-Wirt-Interaktion Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-611800 ER - TY - THES A1 - Stanke, Sandra T1 - AC electrokinetic immobilization of influenza viruses and antibodies on nanoelectrode arrays for on-chip immunoassays T1 - AC elektrokinetische Immobilisierung von Influenzaviren und Antikörpern auf Nanoelektrodenarrays für on-Chip Immunoassays N2 - In the present thesis, AC electrokinetic forces, like dielectrophoresis and AC electroosmosis, were demonstrated as a simple and fast method to functionalize the surface of nanoelectrodes with submicrometer sized biological objects. These nanoelectrodes have a cylindrical shape with a diameter of 500 nm arranged in an array of 6256 electrodes. Due to its medical relevance influenza virus as well as anti-influenza antibodies were chosen as a model organism. Common methods to bring antibodies or proteins to biosensor surfaces are complex and time-consuming. In the present work, it was demonstrated that by applying AC electric fields influenza viruses and antibodies can be immobilized onto the nanoelectrodes within seconds without any prior chemical modification of neither the surface nor the immobilized biological object. The distribution of these immobilized objects is not uniform over the entire array, it exhibits a decreasing gradient from the outer row to the inner ones. Different causes for this gradient have been discussed, such as the vortex-shaped fluid motion above the nanoelectrodes generated by, among others, electrothermal fluid flow. It was demonstrated that parts of the accumulated material are permanently immobilized to the electrodes. This is a unique characteristic of the presented system since in the literature the AC electrokinetic immobilization is almost entirely presented as a method just for temporary immobilization. The spatial distribution of the immobilized viral material or the anti-influenza antibodies at the electrodes was observed by either the combination of fluorescence microscopy and deconvolution or by super-resolution microscopy (STED). On-chip immunoassays were performed to examine the suitability of the functionalized electrodes as a potential affinity-based biosensor. Two approaches were pursued: A) the influenza virus as the bio-receptor or B) the influenza virus as the analyte. Different sources of error were eliminated by ELISA and passivation experiments. Hence, the activity of the immobilized object was inspected by incubation with the analyte. This resulted in the successful detection of anti-influenza antibodies by the immobilized viral material. On the other hand, a detection of influenza virus particles by the immobilized anti-influenza antibodies was not possible. The latter might be due to lost activity or wrong orientation of the antibodies. Thus, further examinations on the activity of by AC electric fields immobilized antibodies should follow. When combined with microfluidics and an electrical read-out system, the functionalized chips possess the potential to serve as a rapid, portable, and cost-effective point-of-care (POC) device. This device can be utilized as a basis for diverse applications in diagnosing and treating influenza, as well as various other pathogens. N2 - In der vorliegenden Arbeit wurden AC elektrokinetische Kräfte, wie die Dielektrophorese und die AC Elektroosmose, als einfache und schnelle Methode zur Funktionalisierung der Oberfläche von Nanoelektroden mit biologischen Objekten in Submikrometergröße demonstriert. Diese Nanoelektroden haben eine zylindrische Form mit einem Durchmesser von 500 nm und sind in einem Array aus 6256 Elektroden angeordnet. Aufgrund ihrer medizinischen Relevanz wurden Influenzaviren sowie anti-Influenza Antikörper als Modellorganismus ausgewählt. Gängige Methoden, um Antikörper oder Proteine auf Biosensoroberflächen zu bringen, sind komplex und zeitaufwändig. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass durch die Anwendung elektrischer Wechselfelder Influenzaviren und Antikörper innerhalb von Sekunden auf den Nanoelektroden immobilisiert werden können, ohne dass zuvor eine chemische Modifikation der Oberfläche noch des immobilisierten biologischen Objekts erforderlich ist. Die Verteilung dieser immobilisierten Objekte ist über das gesamte Array ungleichmäßig. Es kommt zur Ausbildung eines Gradienten, welcher von der äußeren zur den inneren Reihen hin abnimmt. Verschiedene Ursachen für diesen Gradienten wurden diskutiert, beispielsweise der Vortex-förmige Flüssigkeitsstrom über den Nanoelektroden, der unter anderem durch elektrothermische Flüssigkeitsbewegung erzeugt wird. Es wurde gezeigt, dass Teile des akkumulierten Materials dauerhaft an den Elektroden immobilisiert sind. Dies ist ein Alleinstellungsmerkmal des vorgestellten Systems, da in der Literatur die AC elektrokinetische Immobilisierung fast ausschließlich als Methode nur zur temporären Immobilisierung dargestellt wird. Die räumliche Verteilung des immobilisierten Virusmaterials bzw. der anti-Influenza Antikörper an den Elektroden wurde entweder durch die Kombination aus Fluoreszenzmikroskopie und Dekonvolution oder durch super-resolution Mikroskopie (STED) betrachtet. Es wurden On-Chip-Immunoassays durchgeführt, um die Eignung der funktionalisierten Elektroden für einen potenziellen affinitätsbasierten Biosensor zu untersuchen. Dabei wurden zwei Ansätze verfolgt: A) Influenzaviren als Biorezeptor oder B) Influenzavirus als Analyt. Verschiedene Fehlerquellen wurden mittels ELISA und Passivierungsexperimente eliminiert. Infolgedessen wurde die Aktivität der immobilisierten Objekte durch Inkubation mit dem Analyten überprüft. Dies führte zum erfolgreichen Nachweis von anti-Influenza Antikörpern mittels immobilisiertem Virusmaterial. Andererseits war ein Nachweis von Influenzaviruspartikeln durch die immobilisierten anti-Influenza Antikörper nicht möglich. Letzteres könnte auf einen Aktivitätsverlust oder eine falsche Ausrichtung der Antikörper zurückzuführen sein. Daher sollten weitere Untersuchungen zur Aktivität von durch elektrische Wechselfelder immobilisierte Antikörper folgen. In Kombination mit Mikrofluidik und einem elektrischen Auslesesystem besitzen die funktionalisierten Chips das Potenzial, als schnelle, tragbare und kostengünstige Point-of-Care-Einheit (POC) zu dienen. Dieses Einheit kann als Grundlage für vielfältige Anwendungen bei der Diagnose und Behandlung von Influenza und verschiedenen anderen Krankheitserregern genutzt werden. KW - AC electrokinetics KW - AC Elektrokinetik KW - AC electroosmosis KW - AC Elektroosmosis KW - dielectrophoresis KW - Dielektrophorese KW - virus KW - Virus KW - influenza KW - Influenza KW - antibody KW - Antikörper KW - nanoelectrodes KW - Nanoelektroden KW - lab-on-chip KW - lab-on-chip KW - LOC KW - LOC KW - point-of-care KW - point-of-care KW - POC KW - POC KW - immunoassay KW - Immunoassay Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-617165 ER - TY - THES A1 - Leins, Johannes A. T1 - Combining model detail with large scales T1 - Die Verbindung von Modelldetails und großen Skalen BT - a simulation framework for population viability analyses in changing and disturbed environments BT - ein Simulationswerkzeug zur Analyse der Überlebensfähigkeit von Populationen in einer sich verändernden und gestörten Umwelt N2 - The global climate crisis is significantly contributing to changing ecosystems, loss of biodiversity and is putting numerous species on the verge of extinction. In principle, many species are able to adapt to changing conditions or shift their habitats to more suitable regions. However, change is progressing faster than some species can adjust, or potential adaptation is blocked and disrupted by direct and indirect human action. Unsustainable anthropogenic land use in particular is one of the driving factors, besides global heating, for these ecologically critical developments. Precisely because land use is anthropogenic, it is also a factor that could be quickly and immediately corrected by human action. In this thesis, I therefore assess the impact of three climate change scenarios of increasing intensity in combination with differently scheduled mowing regimes on the long-term development and dispersal success of insects in Northwest German grasslands. The large marsh grasshopper (LMG, Stethophyma grossum, Linné 1758) is used as a species of reference for the analyses. It inhabits wet meadows and marshes and has a limited, yet fairly good ability to disperse. Mowing and climate conditions affect the development and mortality of the LMG differently depending on its life stage. The specifically developed simulation model HiLEG (High-resolution Large Environmental Gradient) serves as a tool for investigating and projecting viability and dispersal success under different climate conditions and land use scenarios. It is a spatially explicit, stage- and cohort-based model that can be individually configured to represent the life cycle and characteristics of terrestrial insect species, as well as high-resolution environmental data and the occurrence of external disturbances. HiLEG is a freely available and adjustable software that can be used to support conservation planning in cultivated grasslands. In the three case studies of this thesis, I explore various aspects related to the structure of simulation models per se, their importance in conservation planning in general, and insights regarding the LMG in particular. It became apparent that the detailed resolution of model processes and components is crucial to project the long-term effect of spatially and temporally confined events. Taking into account conservation measures at the regional level has further proven relevant, especially in light of the climate crisis. I found that the LMG is benefiting from global warming in principle, but continues to be constrained by harmful mowing regimes. Land use measures could, however, be adapted in such a way that they allow the expansion and establishment of the LMG without overly affecting agricultural yields. Overall, simulation models like HiLEG can make an important contribution and add value to conservation planning and policy-making. Properly used, simulation results shed light on aspects that might be overlooked by subjective judgment and the experience of individual stakeholders. Even though it is in the nature of models that they are subject to limitations and only represent fragments of reality, this should not keep stakeholders from using them, as long as these limitations are clearly communicated. Similar to HiLEG, models could further be designed in such a way that not only the parameterization can be adjusted as required, but also the implementation itself can be improved and changed as desired. This openness and flexibility should become more widespread in the development of simulation models. N2 - Die globale Klimakrise trägt maßgeblich dazu bei, dass sich Ökosysteme verändern, die Artenvielfalt sinkt und zahlreiche Spezies vom Aussterben bedroht sind. Viele Arten sind prinzipiell in der Lage, sich wandelnden Bedingungen anzugleichen oder ihre Habitate in geeignetere Regionen zu verlagern. Allerdings schreitet der Wandel schneller voran als sich einige Spezies anpassen können oder die mögliche Anpassung wird durch direkte und indirekte menschliche Eingriffe blockiert und gestört. Gerade die nicht-nachhaltige Landnutzung durch den Menschen ist neben der Klimaerhitzung einer der treibenden Faktoren für diese ökologisch kritischen Entwicklungen. Gleichzeitig ist sie durch ihre unmittelbare menschliche Ursache ein Faktor, der sich kurzfristig und schnell korrigieren ließe. Zu diesem Zweck untersuche ich in dieser Dissertation, wie sich drei Klimawandelszenarien ansteigender Intensität im Zusammenspiel mit unterschiedlich terminierten Mahdregimen im Nordwestdeutschen Grünland auf die langfristige Entwicklung und Ausbreitung von Insekten auswirken. In der Untersuchung fungiert die Sumpfschrecke (Stethophyma grossum, Linné 1758) als Bezugsspezies. Sie ist in Feucht- und Nasswiesen zu Hause und zu räumlicher Ausbreitung fähig, auch wenn sie nur eingeschränkt mobil ist. Mahd und Klimabedingungen wirken sich je nach Lebensstadium unterschiedlich stark auf die Entwicklung und Mortalität der Sumpfschrecke aus. Das eigens entwickelte Simulationsmodell HiLEG (High-resolution Large Environmental Gradient) dient als Werkzeug zur Untersuchung und Projektion der Überlebens- und Ausbreitungswahrscheinlichkeit unter verschiedenen Klima- und Landnutzungsszenarien. Es ist ein räumlich explizites, stadien- und kohortenbasiertes Modell, das individuell konfiguriert werden kann, um den Lebenszyklus und die Charakteristiken terrestrischer Insektenarten sowie hochaufgelöste Umweltdaten und das zeitlich variierende Auftreten externer Störfaktoren abzubilden. HiLEG ist eine frei verfügbare Software und kann zur Unterstützung bei der Planung von Umweltschutzmaßnahmen in kultiviertem Grünland verwendet werden. In den drei Fallstudien dieser Arbeit habe ich verschiedene Aspekte in Bezug auf die Struktur von Simulationsmodellen an sich, deren Bedeutung im Naturschutz im Allgemeinen und Erkenntnisse für die Sumpfschrecke im Speziellen untersucht. Es zeigte sich, dass die detaillierte Auflösung der Modellprozesse und -komponenten entscheidend ist, um den langfristigen Effekt räumlich und zeitlich begrenzter Ereignisse projizieren zu können. Insbesondere in Anbetracht der Klimakrise hat sich die gesteigerte Relevanz von Naturschutzmaßnahmen auf regionaler Ebene herausgestellt. Ich konnte außerdem bestätigen, dass die Sumpfschrecke zwar im Prinzip von der Klimaerwärmung profitiert, aber weiterhin durch ungeeignete Mahdregime beschränkt wird. Bewirtschaftungspläne könnten allerdings in dem Sinne angepasst werden, dass sie die Ausbreitung und Etablierung der Sumpfschrecke erlauben, ohne sich über die Maßen auf den Ertrag der Landwirtschaft auszuwirken. Insgesamt können Simulationsmodelle wie HiLEG einen wichtigen Beitrag und Mehrwert für die Planung von Naturschutzmaßnahmen und Politikinstrument leisten. Richtig eingesetzt beleuchten die Simulationsergebnisse Aspekte, die durch subjektive Bewertung und Erfahrung einzelner Akteure möglicherweise übersehen würden. Auch wenn es in der Natur von Modellen liegt, dass sie Einschränkungen unterworfen sind und nur Ausschnitte der Realität abbilden, sollte dies kein Hindernis für ihren Einsatz sein, solange diese Limitierungen klar kommuniziert werden. Analog zu HiLEG könnten Modelle so konzipiert werden, dass nicht nur ihre Parametrisierung nach Bedarf angepasst, sondern auch die Implementierung selbst beliebig verbessert und verändert werden kann. Diese Offenheit und Flexibilität sollte sich bei der Entwicklung von Simulationsmodelle stärker durchsetzen. KW - spatially explicit model KW - large marsh grasshopper KW - simulation framework KW - climate change KW - land use KW - Open Source KW - Open Access KW - dispersal KW - PVA (population viability analysis) KW - high resolution KW - scaling KW - grassland KW - disturbance timing KW - Klimawandel KW - Ausbreitung KW - Zeitpunkt von Störungen KW - Grünland KW - hohe Auflösung KW - Landnutzung KW - Sumpfschrecke KW - Open Access KW - Open Source KW - Populationsgefährdungsanalyse KW - Skalierung KW - Simulationsframework KW - räumlich explizites Modell KW - Stethophyma grossum Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-582837 ER - TY - THES A1 - Stübler, Sabine T1 - Mathematical model of the mucosal immune response to study inflammatory bowel diseases and their treatments T1 - Mathematisches Modell der mukosalen Immunantwort zur Analyse von chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen und deren Behandlung N2 - Inflammatory bowel diseases (IBD), characterised by a chronic inflammation of the gut wall, develop as consequence of an overreacting immune response to commensal bacteria, caused by a combination of genetic and environmental conditions. Large inter-individual differences in the outcome of currently available therapies complicate the decision for the best option for an individual patient. Predicting the prospects of therapeutic success for an individual patient is currently only possible to a limited extent; for this, a better understanding of possible differences between responders and non-responders is needed. In this thesis, we have developed a mathematical model describing the most important processes of the gut mucosal immune system on the cellular level. The model is based on literature data, which were on the one hand used (qualitatively) to choose which cell types and processes to incorporate and to derive the model structure, and on the other hand (quantitatively) to derive the parameter values. Using ordinary differential equations, it describes the concentration-time course of neutrophils, macrophages, dendritic cells, T cells and bacteria, each subdivided into different cell types and activation states, in the lamina propria and mesenteric lymph nodes. We evaluate the model by means of simulations of the healthy immune response to salmonella infection and mucosal injury. A virtual population includes IBD patients, which we define through their initially asymptomatic, but after a trigger chronically inflamed gut wall. We demonstrate the model's usefulness in different analyses: (i) The comparison of virtual IBD patients with virtual healthy individuals shows that the disease is elicited by many small or fewer large changes, and allows to make hypotheses about dispositions relevant for development of the disease. (ii) We simulate the effects of different therapeutic targets and make predictions about the therapeutic outcome based on the pre-treatment state. (iii) From the analysis of differences between virtual responders and non-responders, we derive hypotheses about reasons for the inter-individual variability in treatment outcome. (iv) For the example of anti-TNF-alpha therapy, we analyse, which alternative therapies are most promising in case of therapeutic failure, and which therapies are most suited for combination therapies: For drugs also directly targeting the cytokine levels or inhibiting the recruitment of innate immune cells, we predict a low probability of success when used as alternative treatment, but a large gain when used in a combination treatment. For drugs with direct effects on T cells, via modulation of the sphingosine-1-phosphate receptor or inhibition of T cell proliferation, we predict a considerably larger probability of success when used as alternative treatment, but only a small additional gain when used in a combination therapy. N2 - Chronisch-entzündliche Darmerkrankungen (CED), charakterisiert durch chronische Entzündung der Darmwand, entstehen durch eine Überreaktion der Immunantwort auf kommensale Bakterien, ausgelöst durch eine Kombination an genetischen und Umwelteinflüssen. Große inter-individuelle Unterschiede im Behandlungserfolg mit den verfügbaren Medikamenten erschweren die Wahl der für den jeweiligen Patienten besten Therapieoption. Eine Vorhersage der Erfolgsaussichten einer Behandlung für einen Patienten ist zum jetzigen Zeitpunkt nur sehr bedingt möglich; dafür wird ein besseres Verständnis möglicher Unterschiede zwischen sogenannten Respondern und Non-Respondern (Patienten, die gut bzw. schlecht auf ein Medikament ansprechen) benötigt. In der Dissertation haben wir ein mathematisches Modell entwickelt, das die wichtigsten Prozesse des mukosalen Immunsystems des Darms auf zellulärer Ebene beschreibt. Das Modell basiert auf Literaturdaten, die einerseits (qualitativ) zur Auswahl der zu betrachtenden Zelltypen und Prozesse und zur Herleitung der Modellstruktur und andererseits (quantitativ) zur Herleitung der Parameterwerte verwendet wurden. Mithilfe gewöhnlicher Differentialgleichungen wird der Konzentrations-Zeit-Verlauf von Neutrophilen, Makrophagen, dendritischen Zellen, T-Zellen und Bakterien, jeweils unterteilt in unterschiedliche Zelltypen und Aktivierungszustände, in der Lamina propria und den mesenterischen Lymphknoten, beschrieben. Wir evaluieren das Modells anhand von Simulationen der gesunden Immunantwort auf Salmonelleninfektion und Verletzung der Darmbarriere. Eine virtuelle Population beinhaltet CED-Patienten, die wir durch ein zunächst asymptomatisches, aber nach einem Auslöser chronisch entzündetes Darmgewebe definieren. Wir zeigen den Nutzen des Modells anhand verschiedener Analysen: (i) Der Vergleich von virtuellen CED-Patienten und virtuellen gesunden Individuen zeigt, dass die Krankheit durch viele kleine oder wenige große Veränderungen ausgelöst werden kann, und erlaubt, Hypothesen über krankheitsauslösende Veränderungen aufzustellen. (ii) Wir simulieren verschiedene Therapiemechanismen und treffen, basierend auf dem Zustand vor Behandlungsstart, Vorhersagen über den Therapieerfolg. (iii) Durch Analyse der Unterschiede zwischen virtuellen Respondern und Non-Respondern leiten wir Hypothesen über Ursachen für die inter-individuelle Variabilität im Therapieerfolg her. (iv) Am Beispiel von TNF-alpha-Antikörpern untersuchen wir, welche alternativen Therapien bei Therapieversagen am vielversprechendsten sind und welche Therapien sich besonders für Kombinationstherapien eignen: Für Medikamente, die auch direkt die Zytokinlevel beeinflussen oder die Rekrutierung von Zellen der natürlichen Immunantwort inhibieren, sagen wir eine geringe Erfolgswahrscheinlichkeit bei Nutzung als Alternativtherapie, aber einen großen Gewinn durch Nutzung in einer Kombinationstherapie vorher. Für Medikamente mit direkten Effekten auf T-Zellen, durch Modulation des Sphingosin-1-Phosphat-Rezeptors oder Inhibierung der T-Zellproliferation, sagen wir eine deutlich größere Erfolgswahrscheinlichkeit bei Nutzung als Alternativtherapie, aber nur einen geringen zusätzlichen Effekt bei Nutzung in einer Kombinationstherapie vorher. KW - systems biology KW - IBD KW - QSP KW - Systembiologie KW - CED KW - QSP Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-612301 ER - TY - THES A1 - Calderón Quiñónez, Ana Patricia T1 - Ecology and conservation of the jaguar (Panthera onca) in Central America T1 - Ökologie und Schutz des Jaguars (Panthera onca) in Mittelamerika N2 - Conservation of the jaguar relies on holistic and transdisciplinary conservation strategies that integratively safeguard essential, connected habitats, sustain viable populations and their genetic exchange, and foster peaceful human-jaguar coexistence. These strategies define four research priorities to advance jaguar conservation throughout the species’ range. In this thesis I provide several relevant ecological and sociological insights into these research priorities, each addressed in a separate chapter. I focus on the effects of anthropogenic landscapes on jaguar habitat use and population gene flow, spatial patterns of jaguar habitat suitability and functional population connectivity, and on innovative governance approaches which can work synergistically to help achieve human-wildlife conviviality. Furthermore, I translate these insights into recommendations for conservation practice by providing tools and suggestions that conservation managers and stakeholders can use to implement local actions but also make broad scale conservation decisions in Central America. In Chapter 2, I model regional habitat use of jaguars, producing spatially-explicit maps for management of key areas of habitat suitability. Using an occupancy model of 13-year-camera-trap occurrence data, I show that human influence has the strongest impact on jaguar habitat use, and that Jaguar Conservation Units are the most important reservoirs of high quality habitat in this region. I build upon these results by zooming in to an area of high habitat suitability loss in Chapter 3, northern Central America. Here I study the drivers of jaguar gene flow and I produce spatially-explicit maps for management of key areas of functional population connectivity in this region. I use microsatellite data and pseudo-optimized multiscale, multivariate resistance surfaces of gene flow to show that jaguar gene flow is influenced by environmental, and even more strongly, by human influence variables; and that the areas of lowest gene flow resistance largely coincide with the location of the Jaguar Conservation Units. Given that human activities significantly impact jaguar habitat use and gene flow, securing viable jaguar populations in anthropogenic landscapes also requires fostering peaceful human-wildlife coexistence. This is a complex challenge that cannot be met without transdisciplinary academic research and cross-sectoral, collaborative governance structures that effectively respond to the multiple challenges of such coexistence. With this in mind, I focus in Chapter 4 on carnivore conservation initiatives that apply transformative governance approaches to enact transformative change towards human-carnivore coexistence. Using the frameworks of transformative biodiversity governance and convivial conservation, I highlight in this chapter concrete pathways, supported by more inclusive, democratic forms of conservation decision-making and participation that promote truly transformative changes towards human-jaguar conviviality. N2 - Die Erhaltung des Jaguars beruht auf ganzheitlichen und transdisziplinären Erhaltungsstrategien, die wesentliche, zusammenhängende Lebensräume schützen, lebensfähige Populationen und deren genetischen Austausch erhalten und die friedliche Koexistenz von Mensch und Jaguar fördern. Diese Strategien werden durch die vier Forschungsprioritäten veranschaulicht, die den Schutz des Jaguars im gesamten Verbreitungsgebiet der Art vorantreiben sollen. In dieser Arbeit möchte ich die Forschung zum Schutz des Jaguars vorantreiben, indem ich mehrere relevante ökologische und soziologische Einblicke in diese Forschungsschwerpunkte gebe, die jeweils in einem eigenen Kapitel behandelt werden. Ich konzentriere mich auf die Auswirkungen anthropogener Landschaften auf die Lebensraumnutzung von Jaguaren und den Genfluss in der Population, auf räumliche Muster der Lebensraumeignung von Jaguaren und die funktionale Konnektivität von Populationen sowie auf innovative Governance-Ansätze, die synergetisch wirken können, um die Konvivenz zwischen Mensch und Wildtier zu fördern. Darüber hinaus setze ich diese Erkenntnisse in Empfehlungen für die Naturschutzpraxis um, indem ich konkrete Instrumente und Vorschläge für Maßnahmen anbiete, die Naturschutzmanager und Interessenvertreter nutzen können, um lokale Maßnahmen umzusetzen, aber auch um weitreichende Naturschutzentscheidungen in Zentralamerika zu treffen. In Kapitel 2 modelliere ich die regionale Lebensraumnutzung von Jaguaren und erstelle räumlich explizite Karten für das Management von Schlüsselgebieten mit geeigneter Lebensraumnutzung. Mithilfe eines Habitatmodells basierend auf 13-Jahres-Kamerfangdaten-Studien zeige ich, dass der menschliche Einfluss die stärkste Auswirkung auf die Lebensraumnutzung von Jaguaren hat und dass die Jaguar-Schutzgebiete die wichtigsten Reservoirs für hochwertige Lebensräume in dieser Region sind. Auf diesen Ergebnissen baue ich auf, indem ich in Kapitel 3 ein Gebiet mit einem hohen Verlust an Lebensraumeignung, das nördliche Mittelamerika, näher betrachte. Hier untersuche ich die Triebkräfte des Genflusses bei Jaguaren und erstelle räumlich explizite Karten für das Management von Schlüsselgebieten mit funktionaler Populationskonnektivität in dieser Region. Ich verwende Mikrosatellitendaten und pseudo-optimierte multiskalige, multivariate Widerstandsflächen des Genflusses, um zu zeigen, dass der Genfluss von Jaguaren durch Umweltvariablen und noch stärker durch menschliche Einflussfaktoren beeinflusst wird und dass die Gebiete mit dem geringsten Genflusswiderstand weitgehend mit den Standorten der Jaguar-Schutzgebiete übereinstimmen. Da sich menschliche Aktivitäten erheblich auf die Lebensraumnutzung der Jaguare und den Genfluss auswirken, ist für die Sicherung lebensfähiger Jaguarpopulationen in anthropogenen Landschaften auch die Förderung einer friedlichen Koexistenz von Mensch und Wildtieren erforderlich. Dies ist eine komplexe Herausforderung, die ohne transdisziplinäre akademische Forschung und sektorübergreifende, kooperative Governance-Strukturen, die wirksam auf die vielfältigen Herausforderungen einer solchen Koexistenz reagieren, nicht zu bewältigen ist. Vor diesem Hintergrund konzentriere ich mich in Kapitel 4 auf Initiativen zum Schutz von Raubtieren, die transformative Governance-Ansätze anwenden, um einen Wandel hin zu einer Konvivenz zwischen Mensch und Raubtier zu bewirken. Unter Verwendung des Rahmens der transformativen Biodiversitäts-Governance und des konvivialen Naturschutzes zeige ich in diesem Kapitel konkrete Wege auf, die durch integrativere, demokratische Formen der Entscheidungsfindung im Naturschutz unterstützt werden und wirklich transformative Veränderungen in Richtung Konvivialität zwischen Mensch und Jaguar fördern. KW - jaguar KW - ecology KW - felid conservation KW - Central America KW - habitat use KW - coexistence KW - population connectivity KW - Mittelamerika KW - Koexistenz KW - Ökologie KW - Schutz von Raubtieren KW - Lebensraumnutzung KW - Jaguar KW - Populationskonnektivität Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-613671 ER - TY - THES A1 - Sureshkumar, Priyavathi T1 - Erweiterung der zellbasierten Calcium-Imaging-Methode im eukaryotischen zellfreien Proteinsynthese-System für die transient-receptor-potential (TRP) - Ionenkanäle N2 - Die Fluoreszenz-Calcium-Imaging-Methode wird auch heute noch als gängige Methode verwendet, vor allem wegen der geringeren Kosten für das Wirkstoffscreening in der pharmazeutischen Forschung, wobei Ionenkanäle sowie einige der G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) die Mehrzahl der Wirkstoffziele ansprechen. Die zellfreie Synthese eukaryotischer Proteine hat nicht die Nachteile, die bei der Überexpression dieser ionenpermeablen Proteine in Zellen auftreten können, wie z. B. Zelltoxizität, geringere Proteinexpression und die Beseitigung der exprimierten Proteine aufgrund veränderter Domänen sowie die zeitaufwändige Pflege von Zelllinien. Die Synthese von Ionenkanälen in zellfreien Proteinsyntheseplattformen für das künftige Wirkstoffscreening ist noch in der Grundlagenforschung. Obwohl die Fluoreszenz-Calcium-Imaging-Methode in zellbasierten Assays weit verbreitet ist, wurde diese Methode bisher noch nicht in zellfreien Proteinexpressionssystemen verwendet. Insgesamt ist die neue Anwendung der Calcium-Imaging-Methode in eukaryontischen zellfreien Systemen eine Voraussetzung für die schnelle pharmakologische Analyse von Wirkstoffen. Das erste Ziel dieser wissenschaftlichen Arbeit bestand darin, die grundlegenden Prinzipien der Calcium-Imaging-Methode zur Untersuchung von Ionenkanälen in zellbasierten Systemen zu untersuchen. Hierfür wurden zwei Tumorzelllinien des Auges verwendet, und zwar benigne Pterygiumzellen und maligne Aderhautmelanom 92.1 Zellen. In diesen Studien wurde die Interaktion zwischen den nativ überexprimierten transient-receptor-potential-Ionenkanälen (TRPs) wie TRP Vanilliod 1 (TRPV1) (Capsaicinrezeptor) und TRP Melastatin 8 (TRPM8) (Mentholrezeptor) in diesen Tumorzellen nach Zugabe von verschiedenen Medikamenten und Hormonen untersucht. Das zweite Ziel dieser Arbeit war es, den Calcium-Mechanismus von GPCRs in den Zellen zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurde Mas, ein GPCR und Angiotensin (1-7) -Hormonrezeptor, aus dem renin-angiotensin-aldosteron-system (RAAS) in der Human Embryonic Kidney-293 (HEK293) Zelllinie überexprimiert. In dieser Studie wurden insbesondere die Aktivierung klassischer GPCR-Signalwege wie Phospholipase C und Proteinkinase C durch Angiotensin-(1-7) über Mas und die Beteiligung von TRP-Kanälen nachgewiesen. Die zellbasierte-Calcium-Imaging-Methode für chemische Calcium-Indikatoren ließ sich aufgrund der Anwesenheit einer großen Menge cytosolischer Carboxylesterasen gut anwenden. Carboxylesterase ist das wichtigste Enzym in der Calcium Imaging Methode, das die Verarbeitung chemischen Calcium-Farbstoffe behandelt. Dieses Enzym fehlt jedoch in Mikrosomen, die als Basismembran für die Integration synthetisierter Ionenkanäle in eukaryontischen zellfreien Systemen verwendet werden. Das dritte Ziel dieser Forschungsarbeit war die Umsetzung der zellbasierten Calcium-Imaging Methode und der Calcium-Signalwege in zellfreie Systeme. Hier wurde die zellfrei synthetisierte Carboxylesterase in Mikrosomen von Spodoptera frugiperda (Sf21) als praktikables Calcium-Imaging-Werkzeug etabliert, um sowohl native ionenpermeable Proteine als auch zellfrei-synthetisierte Ionenkanäle zu untersuchen. Die Enzymaktivität der zellfrei-synthetisierten Carboxylesterase in Mikrosomen wurde durch Esterase-Assays und den Calcium-Fluoreszenzfarbstoff Fluo-5N Acetoxymethylester (Fluo-5N AM) Belastungstests nachgewiesen. Das Calcium-Imaging der nativ vorhandenen Ca2+-ATPase des sarkoplasmatischen/endoplasmatischen Retikulums (SERCA) und der Ryanodin-Rezeptoren (RyR) in den Mikrosomen sowie der zell-frei exprimierten TRP-Ionenkanäle wurden mit dem Fura-5N-AM- Fluoreszenzfarbstoff in mit Carboxylesterase vorsynthetisierten Mikrosomen nachgewiesen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Prinzip der zellbasierten Calcium-Imaging -Methode vielversprechend an das eukaryotische zellfreie Sf21-System angepasst werden konnte, um Ionenkanäle zu analysieren. Nach entsprechender Forschung könnte die etablierte Methode in Zukunft auch auf andere Membranproteine ausgeweitet werden. Dies umfasst die Untersuchung anderer zell-frei exprimierte GPCRs oder anderer Ionenkanäle wie Kalium-, Natrium- und Chlorid-Ionenkanäle. N2 - Fluorescence calcium imaging is still used today used as the common method, mainly due to its cheaper costs for drug screening in pharmaceutical research encompassing both ion channels, and part of G- Protein Coupled Receptors (GPCRs) in the major share of drug targets. Eukaryotic cell-free protein translation overcomes several drawbacks that might occur for overexpression of these ion-permeable proteins in the cells such as cell toxicity, poor protein expression, and deletion due to modified protein domain and time-consuming cell line maintenance. Expressing ion channels in the cell-free protein synthesis platform for future drug screening processes is still ongoing basic research and so far, no calcium imaging technique for cell-free expressed ion channels is available. Taken together, the novel application of the fluorescence calcium imaging method in eukaryotic cell-free systems is a prerequisite for rapid pharmacological drug investigations, which are not feasible using conventional call-based approaches. The aim of this thesis is to investigate the common calcium signaling pathways relevant to drug research via ion channels and GPCRs in cell-based systems. Thereby, the basic mechanism of the cell-based calcium imaging for chemical calcium indicators is studied and then translate its principle to the cell-free protein synthesis platforms. In order to study the cell-based calcium imaging and calcium pathways, two types of eye tumor cell-based models, namely benign pterygial tumor cells and malign uveal melanoma 92.1 cells were used. Specifically, the interplay between the natively expressed Transient Receptor Potential Channels (TRPs) like TRP-Vanilloid 1 (TRPV1) (Capsaicin receptor) and TRP-Melastatin 8 (TRPM8) (Menthol receptor) in these tumor cells was investigated by application of various drugs and hormones. The second aim of this thesis was to investigate the cell-based calcium mechanism of GPCRs. For this, overexpressed Mas, a GPCR and Angiotensin-(1-7) hormone receptor, from the Renin Angiotensin Aldosterone System (RAAS) in the Human Embryonic Kidney (HEK293) cells was used. Particularly, the activation of classical GPCR pathways like Phospholipase C and Proteinkinase C via Ang-(1-7) through Mas and the involvement of TRPs was proven in this study. The third aim of this thesis is to translate the cell-based calcium imaging principle to cell-free systems. Cell-based calcium imaging for chemical calcium indicators could be performed with all ease due to the presence of a large amount of cytosolic carboxylesterase, the crucial enzyme which handles the chemical calcium dyes. But this enzyme is absent in microsomes. Microsomes are used as a backbone membrane to integrate the synthesized ion channels in a eukaryotic cell-free system. Cell-free synthesized carboxylesterase in Spodoptera frugiperda (Sf21) microsomes is established as a viable calcium imaging tool to study both natively present ion permeable proteins and cell-free synthesized ion channels. The enzyme activity of the carboxylesterase in microsomes was confirmed by esterase assays and fluorescent calcium dye Fluo-5N Acetoxymethylester (Fluo-5N AM) loading assays. Fluorescent calcium imaging of natively present SERCA (Sarco Endoplasmic Reticulum Calcium ATPase) and ryanodine channels in the microsomes and cell-free expressed TRPV1 channel was demonstrated using Fluo-5N AM fluorescent dye in carboxylesterase pre-synthesized microsomes. With adequate research in future, the established method could be promisingly extended to study other cell-free expressed GPCRs or other ion channels like potassium, sodium, and chloride ion channels. KW - zellfreie Proteinsynthese KW - Calcium-Imaging KW - transient-receptor-potential-Ionenkanäle KW - calcium imaging KW - transient receptor potential ion channels KW - cell-free protein synthesis Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-619872 ER - TY - THES A1 - Malchow, Anne-Kathleen T1 - Developing an integrated platform for predicting niche and range dynamics BT - inverse calibration of spatially-explicit eco-evolutionary models N2 - Species are adapted to the environment they live in. Today, most environments are subjected to rapid global changes induced by human activity, most prominently land cover and climate changes. Such transformations can cause adjustments or disruptions in various eco-evolutionary processes. The repercussions of this can appear at the population level as shifted ranges and altered abundance patterns. This is where global change effects on species are usually detected first. To understand how eco-evolutionary processes act and interact to generate patterns of range and abundance and how these processes themselves are influenced by environmental conditions, spatially-explicit models provide effective tools. They estimate a species’ niche as the set of environmental conditions in which it can persist. However, the currently most commonly used models rely on static correlative associations that are established between a set of spatial predictors and observed species distributions. For this, they assume stationary conditions and are therefore unsuitable in contexts of global change. Better equipped are process-based models that explicitly implement algorithmic representations of eco-evolutionary mechanisms and evaluate their joint dynamics. These models have long been regarded as difficult to parameterise, but an increased data availability and improved methods for data integration lessen this challenge. Hence, the goal of this thesis is to further develop process-based models, integrate them into a complete modelling workflow, and provide the tools and guidance for their successful application. With my thesis, I presented an integrated platform for spatially-explicit eco-evolutionary modelling and provided a workflow for their inverse calibration to observational data. In the first chapter, I introduced RangeShiftR, a software tool that implements an individual-based modelling platform for the statistical programming language R. Its open-source licensing, extensive help pages and available tutorials make it accessible to a wide audience. In the second chapter, I demonstrated a comprehensive workflow for the specification, calibration and validation of RangeShiftR by the example of the red kite in Switzerland. The integration of heterogeneous data sources, such as literature and monitoring data, allowed to successfully calibrate the model. It was then used to make validated, spatio-temporal predictions of future red kite abundance. The presented workflow can be adopted to any study species if data is available. In the third chapter, I extended RangeShiftR to directly link demographic processes to climatic predictors. This allowed me to explore the climate-change responses of eight Swiss breeding birds in more detail. Specifically, the model could identify the most influential climatic predictors, delineate areas of projected demographic suitability, and attribute current population trends to contemporary climate change. My work shows that the application of complex, process-based models in conservation-relevant contexts is feasible, utilising available tools and data. Such models can be successfully calibrated and outperform other currently used modelling approaches in terms of predictive accuracy. Their projections can be used to predict future abundances or to assess alternative conservation scenarios. They further improve our mechanistic understanding of niche and range dynamics under climate change. However, only fully mechanistic models, that include all relevant processes, allow to precisely disentangle the effects of single processes on observed abundances. In this respect, the RangeShiftR model still has potential for further extensions that implement missing influential processes, such as species interactions. Dynamic, process-based models are needed to adequately model a dynamic reality. My work contributes towards the advancement, integration and dissemination of such models. This will facilitate numeric, model-based approaches for species assessments, generate ecological insights and strengthen the reliability of predictions on large spatial scales under changing conditions. N2 - Arten sind an ihren jeweiligen Lebensraum angepasst, doch viele Lebensräume sind heute einem globalen Wandel unterworfen. Dieser äußert sich vor allem in Veränderungen von Landnutzung und Klima, welche durch menschliche Aktivitäten verursacht werden und ganze Ökosysteme in ihrem Gefüge stören können. Störungen der grundlegenden öko-evolutionären Prozesse können auf der Populationsebene in Form von veränderten Verbreitungsgebieten und Häufigkeitsmustern sichtbar werden. Hier werden die Auswirkungen des globalen Wandels auf eine Art oftmals zuerst beobachtet. Um zu untersuchen, wie die Wirkung und Wechselwirkung der verschiedenen öko-evolutionären Prozesse die beobachteten Verbreitungs- und Häufigkeitsmuster erzeugen, und wie diese Prozesse wiederum von Umweltbedingungen beeinflusst werden, stellen räumlich explizite Modelle wirksame Instrumente dar. Sie beschreiben die ökologische Nische einer Art, also die Gesamtheit aller Umweltbedingungen, unter denen die Art fortbestehen kann. Die derzeit am häufigsten verwendeten Modelle stützen sich auf statische, korrelative Zusammenhänge, die zwischen bestimmten räumlichen Prädiktoren und den beobachteten Artverteilungen hergestellt werden. Allerdings werden dabei stationäre Bedingungen angenommen, was sie im Kontext des globalen Wandels ungeeignet macht. Deutlich besser geeignet sind prozessbasierte Modelle, welche explizite, algorithmische Repräsentationen von ökologischen Prozessen beinhalten und deren gemeinsame Dynamik berechnen. Solche Modelle galten lange Zeit als schwierig zu parametrisieren, doch die zunehmende Verfügbarkeit von Beobachtungsdaten sowie die verbesserten Methoden zur Datenintegration machen ihre Verwendung zunehmend praktikabel. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, diese prozessbasierten Modelle weiterzuentwickeln, sie in umfassende Modellierungsabläufe einzubinden, sowie Software und Anleitungen für ihre erfolgreiche Anwendung verfügbar zu machen. In meiner Dissertation präsentiere ich eine integrierte Plattform für räumlich-explizite, öko-evolutionäre Modellierung und entwickle einen Arbeitsablauf für dessen inverse Kalibrierung an Beobachtungsdaten. Im ersten Kapitel stelle ich RangeShiftR vor: eine Software, die eine individuenbasierte Modellierungsplattform für die statistische Programmiersprache R implementiert. Durch die Open-Source-Lizenzierung, umfangreichen Hilfeseiten und online verfügbaren Tutorials ist RangeShiftR einem breiten Publikum zugänglich. Im zweiten Kapitel demonstriere ich einen vollständigen Modellierungsablauf am Beispiel des Rotmilans in der Schweiz, der die Spezifikation, Kalibrierung und Validierung von RangeShiftR umfasst.Durch die Integration heterogener Datenquellen, wie Literatur- und Monitoringdaten, konnte das Modell erfolgreich kalibriert werden. Damit konnten anschließend validierte, raum-zeitliche Vorhersagen über das Vorkommen des Rotmilans erstellt und die dafür relevanten Prozesse identifiziert werden. Der vorgestellte Arbeitsablauf kann auf andere Arten übertragen werden, sofern geeignete Daten verfügbar sind. Im dritten Kapitel habe ich RangeShiftR erweitert, sodass demografische Prozessraten direkt mit Klimavariablen verknüpft werden können. Dies ermöglichte es, die Reaktionen von acht Schweizer Brutvogelarten auf den Klimawandel genauer zu untersuchen. Insbesondere konnte das Modell die einflussreichsten klimatischen Faktoren identifizieren, demografisch geeignete Gebiete abgrenzen und aktuelle Populationstrends auf den bisherigen Klimawandel zurückführen. Meine Arbeit zeigt, dass die Anwendung komplexer, prozessbasierter Modelle in naturschutzrelevanten Kontexten mit verfügbaren Daten möglich ist. Solche Modelle können erfolgreich kalibriert werden und andere, derzeit verwendete Modellierungsansätze in Bezug auf ihre Vorhersagegenauigkeit übertreffen. Ihre Projektionen können zur Vorhersage zukünftiger Artvorkommen und zur Einschätzung alternativer Naturschutzmaßnahmen verwendet werden. Sie verbessern außerdem unser mechanistisches Verständnis von Nischen- und Verbreitungsdynamiken unter dem Einfluss des Klimawandels. Jedoch ermöglichen nur vollständig prozessbasierte Modelle, die alle relevanten Prozesse vereinen, eine korrekte Aufschlüsselung der Auswirkungen einzelner Prozesse auf die beobachteten Abundanzen. In dieser Hinsicht hat das RangeShiftR-Modell noch Potenzial für Weiterentwicklungen, um fehlende, einflussreiche Prozesse hinzuzufügen, wie zum Beispiel die Interaktionen zwischen Arten. Um eine dynamische Realität adäquat abbilden zu können, werden dynamische, prozessbasierte Modelle benötigt. Meine Arbeit leistet einen Beitrag zur Weiterentwicklung, Integration und Verbreitung solcher Modelle und stärkt somit die Anwendung numerischer, modellbasierter Methoden für die Bewertung des Zustands von Arten, die Untersuchung ökologischer Zusammenhänge und die Steigerung der Zuverlässigkeit von Vorhersagen auf großen räumlichen Skalen unter Umweltveränderungen. T2 - Entwicklung einer integrierten Modellierungs-Plattform zur Vorhersage von Nischen- und Verbreitungs-dynamiken: Inverse Kalibrierung räumlich-expliziter öko-evolutionärer Modelle KW - species distribution modelling KW - Bayesian inference KW - individual-based modelling KW - range shifts KW - ecological modelling KW - population dynamics KW - Bayes'sche Inferenz KW - ökologische Modellierung KW - individuen-basierte Modellierung KW - Populationsdynamik KW - Arealverschiebungen KW - Artverbreitungsmodelle Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-602737 ER - TY - THES A1 - Yildiz, Tugba T1 - Dissecting the role of the TusA protein for cell functionality and FtsZ ring assembly in Escherichia coli T1 - Entschlüsselung der Rolle des TusA-Proteins für die Zellfunktionalität und FtsZ-Ringbildung in Escherichia coli N2 - In this work, the role of the TusA protein was investigated for the cell functionality and FtsZ ring assembly in Escherichia coli. TusA is the tRNA-2-thiouridine synthase that acts as a sulfur transferase in tRNA thiolation for the formation of 2-thiouridine at the position 34 (wobble base) of tRNALys, tRNAGlu and tRNAGln. It binds the persulfide form of sulfur and transfers it to further proteins during mnm5s2U tRNA modification at wobble position and for Moco biosynthesis. With this thiomodification of tRNA, the ribosome binding is more efficient and frameshifting is averted during the protein translation. Previous studies have revealed an essential role of TusA in bacterial cell physiology since deletion of the tusA gene resulted in retarded growth and filamentous cells during the exponential growth phase in a rich medium which suddenly disappeared during the stationary phase. This indicates a problem in the cell division process. Therefore the focus of this work was to investigate the role of TusA for cell functionality and FtsZ ring formation and thus the cell separation. The reason behind the filamentous growth of the tusA mutant strain was investigated by growth and morphological analyses. ΔtusA cells showed a retarded growth during the exponential phase compared to the WT strain. Also, morphological analysis of ΔtusA cells confirmed the filamentous cell shape. The growth and cell division defects in ΔtusA indicated a defect in FtsZ protein as a key player of cell division. The microscopic investigation revealed that filamentous ΔtusA cells possessed multiple DNA parts arranged next to each other. This suggested that although the DNA replication occurred correctly, there was a defect in the step where FtsZ should act; probably FtsZ is unable to assemble to the ring structure or the assembled ring is not able to constrict. All tested mutant strains (ΔtusD, ΔtusE and ΔmnmA) involved in the mnm5s2U34 tRNA modification pathway shared the similar retarded growth and filamentous cell shape like ΔtusA strain. Thus, the cell division defect arises from a defect in mnm5s2U34 tRNA thiolation. Since the FtsZ ring formation was supposed to be defective in filaments, a possible intracellular interaction of TusA and FtsZ was examined by fluorescent (EGFP and mCherry) fusion proteins expression and FRET. FtsZ expressing tusA mutant (DE3) cells showed a red mCherry signal at the cell poles, indicating that FtsZ is still in the assembling phase. Interestingly, the cellular region of EGFP-TusA fusion protein expressed in ΔtusA (DE3) was conspicuous; the EGFP signal was spread throughout the whole cell and, in addition, a slight accumulation of the EGFP-TusA fluorescence was detectable at the cell poles, the same part of the cell as for mCherry-FtsZ. Thus, this strongly suggested an interaction of TusA and FtsZ. Furthermore, the cellular FtsZ and Fis concentrations, and their change during different growth phases were determined via immunoblotting. All tested deletion strains of mnm5s2U34 tRNA modification show high cellular FtsZ and Fis levels in the exponential phase, shifting to the later growth phases. This shift reflects the retarded growth, whereby the deletion strains reach later the exponential phase. Conclusively, the growth and cell division defect, and thus the formation of filaments, is most likely caused by changes in the cellular FtsZ and Fis concentrations. Finally, the translation efficiencies of certain proteins (RpoS, Fur, Fis and mFis) in tusA mutant and in additional gene deletion strains were studied whether they were affected by using unmodified U34 tRNAs of Lys, Glu and Gln. The translation efficiency is decreased in mnm5s2U34 tRNA modification-impaired strains in addition to their existing growth and cell division defect due to the elimination of these three amino acids. Finally, these results confirm and reinforce the importance of Lys, Glu and Gln and the mnm5s2U34 tRNA thiolation for efficient protein translation. Thus, these findings verify that the translation of fur, fis and rpoS is regulated by mnm5s2U34 tRNA modifications, which is growth phase-dependent. In total, this work showed the importance of the role of TusA for bacterial cell functionality and physiology. The deletion of the tusA gene disrupted a complex regulatory network within the cell, that most influenced by the decreased translation of Fis and RpoS, caused by the absence of mnm5s2U34 tRNA modifications. The disruption of RpoS and Fis cellular network influences in turn the cellular FtsZ level in the early exponential phase. Finally, the reduced FtsZ concentration leads to elongated, filamentous E. coli cells, which are unable to divide. N2 - In dieser Arbeit wurde die Rolle des TusA-Proteins für die Zellfunktionalität und FtsZ-Ringbildung in Escherichia coli untersucht. Bei TusA handelt es sich um die tRNA-2-Thiouridine-Synthase, die als Schwefeltransferase bei der tRNA-Thiolierung zur Bildung von 2-Thiouridin an der Position 34 (Wobble-Base) von tRNALys, tRNAGlu und tRNAGln dient. Dieses Protein bindet das Schwefelatom als Persulfid und überträgt dieses bei der mnm5s2U tRNA-Modifikation an der Wobble-Position und der Molybdän-Cofaktor (Moco)-Biosynthese auf weitere Proteine. Durch diese Thiomodifikation der tRNA wird eine effizientere Bindung des Ribosoms erreicht und zudem eine Verschiebung des Leserasters während der Proteintranslation verhindert. Frühere Studien haben eine essenzielle Rolle für TusA in der bakteriellen Zellphysiologie gezeigt: die Deletion des tusA-Gens führte zu einem verlangsamten Wachstum und filamentösen (fadenförmigen) Zellen als WT-Zellen während der exponentiellen Wachstumsphase in einem reichhaltigen Medium. In der stationären Phase waren diese Filamente hingegen nicht mehr zu beobachten, was auf einen Defekt während der Zellteilung hindeutete. Ziel dieser Arbeit war es daher die Rolle des TusA-Proteins für die Zellfunktionalität und FtsZ-Ringbildung zu analysieren. Im Rahmen der vorliegenden Doktorarbeit wurde die Ursache für das filamentöse Wachstum der tusA-Mutante untersucht. Dafür wurden Wachstums- und Morphologieanalysen durchgeführt. Die ΔtusA-Zellen zeigten im Vergleich zum WT-Stamm ein verzögertes Wachstum in der exponentiellen Phase. Die filamentöse Zellform der ΔtusA-Zellen wurde ebenfalls durch die Analyse der Zellmorphologie bestätigt. Demnach deutete das Wachstums- und Zellteilungsproblem von ΔtusA auf einen Defekt des FtsZ-Proteins hin, das eine Schlüsselrolle bei der Zellteilung besitzt. Anhand von mikroskopischen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die filamentöse ΔtusA-Zellen mehrere nebeneinander angeordnete DNA-Abschnitte besaßen. Dies ließ die Vermutung zu, dass trotz korrekt verlaufender DNA-Replikation, ein Defekt in dem Schritt, in dem FtsZ einsetzen sollte, vorliegt. Folglich scheint FtsZ sich nicht zur Ringstruktur anordnen zu können. Denkbar wäre auch, dass der zusammengesetzte Ring nicht in der Lage ist zu kontrahieren. Alle getesteten Mutantenstämme (ΔtusD, ΔtusE und ΔmnmA), die an der mnm5s2U34-Modifikation beteiligt sind, zeigten ein ähnlich verzögertes Wachstum und eine ähnliche filamentöse Zellform wie der ΔtusA-Stamm. Somit ist der Zellteilungsdefekt auf einen Defekt in der mnm5s2U34-tRNA-Thiolierung zurückzuführen. Des Weiteren wurde eine mögliche intrazelluläre Interaktion von TusA und FtsZ anhand der Expression von fluoreszierender (EGFP und mCherry) Fusionsproteine und FRET-Analysen überprüft, da die Bildung des FtsZ-Rings in den Filamenten defekt zu sein scheint. Für FtsZ-exprimierende tusA (DE3)-Zellen wurden rote mCherry-Signale an den Zellpolen detektiert, was auf das sich noch assemblierende FtsZ hindeutete. Interessanterweise war die zelluläre Region des EGFP-TusA Signals, das in ΔtusA (DE3) exprimiert wurde, überlappend mit dem von mCherry-FtsZ. Das EGFP-Signal zeigte eine Verteilung über die gesamte Zelle, wobei noch zusätzlich eine leichte Akkumulation der EGFP-TusA-Fluoreszenz an den Zellpolen (wie bei mCherry-FtsZ) festgestellt wurde. Somit deutet dies auf eine Interaktion zwischen TusA und FtsZ hin. Zusätzlich wurden die FtsZ- und Fis-Konzentrationen und deren Änderung während der unterschiedlichen Wachstumsphasen anhand von Immunoblot-Analysen ermittelt. Alle getesteten Deletionsstämme der mnm5s2U34-tRNA-Modifikation zeigten hohe zelluläre FtsZ- und Fis-Mengen in der exponentiellen Phase, die in die späteren Wachstumsphasen verschoben sind. Diese Verschiebung spiegelt das verlangsamte Wachstum wider, wodurch die Deletionsstämme später die exponentielle Phase erreichen. Demzufolge ist anzunehmen, dass der Wachstums- und Zellteilungsdefekt und daraus die Bildung von Filamenten durch Veränderungen der zellulären FtsZ- und Fis-Konzentrationen verursacht werden. Abschließend wurde in dieser Arbeit mittels Durchflusszytometrie die Translationseffizienz bestimmter Proteine (RpoS, Fur, Fis und mFis) in ΔtusA und zusätzlichen Gendeletionsstämmen untersucht. Insbesondere sollte gezeigt werden, ob die Translation der Proteine durch die Verwendung von unmodifizierten U34-tRNAs für Lys, Glu und Gln beeinträchtigt wird. Somit ist die Translationseffizienz in den Stämmen mit beeinträchtigter mnm5s2U34-tRNA-Modifikation verringert, was zusätzlich zu ihren bereits bestehenden Wachstums- und Zellteilungsdefekten aufgrund der Eliminierung dieser drei Aminosäuren hinzukommt. Damit bestätigen und verstärken diese Ergebnisse die Bedeutung von Lys, Glu und Gln und der mnm5s2U34 tRNA-Thiolierung für eine effiziente Proteintranslation. Sie belegen auch, dass die Translation von fur, fis und rpoS durch die mnm5s2U34-tRNA-Modifikation reguliert wird, welche wachstumsphasenabhängig ist. Im Résumé zeigen die Ergebnisse dieser Forschungsarbeit neue Funktionen des TusA-Proteins für die Funktionalität und Physiologie von Bakterienzellen. Durch die Deletion des tusA-Gens wurde ein komplexes regulatorisches Netzwerk innerhalb der Zelle gestört, das vor allem durch die verringerte Translation von Fis und RpoS beeinflusst wird (die durch das Fehlen der mnm5s2U34-tRNA-Modifikation verursacht wird). Die Unterbrechung des zellulären RpoS- und Fis-Netzwerks beeinflusst wiederum die zelluläre FtsZ-Menge in der frühen exponentiellen Phase. Schließlich führt diese Verringerung der FtsZ-Konzentration zu filamentösen E. coli-Zellen, die sich nicht mehr teilen können. KW - tRNA thiomodifications KW - 5-methylaminomethyl-2-thiouridine KW - TusA KW - growth defect KW - cell division KW - FtsZ KW - FtsZ ring assemby KW - RpoS KW - Fis KW - translation efficiency KW - tRNA Thiomodifikation KW - 5-Methylaminomethyl-2-Thiouridin KW - TusA KW - Zellteilungsdefekt KW - Zellteilung KW - FtsZ-Ringbildung KW - Translationseffizienz KW - filaments KW - Filamente Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-617135 ER - TY - THES A1 - Soltani, Ouad T1 - BLF1-Mode of Action in Barley Leaf Size Control N2 - Establishment of final leaf size in plants represents a complex mechanism that relies on the precise regulation of two interconnected cellular processes, cell division and cell expansion. In previous work, the barley protein BROAD LEAF1 (BLF1) was identified as a novel negative regulator of cell proliferation, that mainly limits leaf growth in the width direction. Here I identified a novel RING/U-box protein that interacts with BLF1 through a yeast two hybrid screen. Using BiFC, Co-IP and FRET I confirmed the interaction of the two proteins in planta. Enrichment of the BLF1-mEGFP fusion protein and the increase of the FRET signal upon MG132 treatment of tobacco plants, together with an in vivo ubiquitylation assay in bacteria, confirmed that the RING/U-box E3 interacts with BLF1 to mediate its ubiquitylation and degradation by the 26S proteasome system. Consistent with regulation of endogenous BLF1 in barley by proteasomal degradation, inhibition of the proteasome by bortezomib treatment on BLF1-vYFP transgenic barley plants also resulted in an enrichment of the BLF1 protein. I thus demonstrated that RING/U-box E3 is colocalized with BLF1 in nuclei and negatively regulates BLF1 protein levels. Analysis of ring-e3_1 knock-out mutants suggested the involvement of the RING/U-box E3 gene in leaf growth control, although the effect was mainly on leaf length. Together, my results suggest that proteasomal degradation, possibly mediated by RING/U-box E3, contributes to fine-tuning BLF1 protein-level in barley. N2 - Die Festlegung der endgültigen Blattgröße bei Pflanzen ist ein komplexer Mechanismus, der auf der präzisen Regulierung zweier miteinander verbundener zellulärer Prozesse beruht, der Zellteilung und der Zellexpansion. In einer früheren Arbeit wurde das Gerstenprotein BROAD LEAF1 (BLF1), als ein neuartiger negativer Regulator der Zellproliferation identifiziert, der das Blattwachstum hauptsächlich in Richtung der Breite begrenzt. Hier habe ich durch einen Hefe-Zwei-Hybrid-Screen ein neuartiges RING/U-Box-Protein identifiziert, das mit BLF1 interagiert. Mittels BiFC, Co-IP und FRET konnte ich die Interaktion der beiden Proteine in der Pflanze bestätigen. Die Anreicherung des BLF1-mEGFP-Fusionsproteins und der Anstieg des FRET-Signals bei der Behandlung von Tabakpflanzen mit MG132 sowie ein in vivo Ubiquitylierungsassay in Bakterien bestätigten, dass das RING/U-Box-E3 mit BLF1 interagiert und dessen Ubiquitylierung und Abbau durch das 26S-Proteasom-System vermittelt. Darüber hinaus habe ich festgestellt, dass die Behandlung mit Bortezomib, einem Inhibitor des Proteasoms, bei BLF1-vYFP-transgenen Pflanzen ebenfalls zu einer Anreicherung des BLF1-Proteins führt. Ich zeige dass RING/U-Box E3 mit BLF1 in den Zellkernen kolokalisiert ist und den BLF1-Proteinspiegel negativ reguliert. Die Analyse der Knock-out-Mutante ring-e3_1 legte eine Beteiligung das RING/U-Box-E3 Gen an der Kontrolle des Blattlänge nahe, was es zu einem guten Kandidaten macht, der die Funktion des BLF1-Gens regulieren könnte. KW - Barley KW - Gerste KW - leaf width KW - Blattbreite KW - cell proliferation KW - Zellproliferation KW - INDETERMINATE DOMAIN protein KW - INDETERMINATE DOMAIN-Protein KW - BROAD LEAF1 KW - RING/U-box E3 KW - ubiquitination KW - Ubiquitinierung KW - proteasomal degradation KW - 26S-Proteasom-System-Abbau KW - protein-level regulation KW - Proteinspiegel regulieren Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-607054 ER - TY - THES A1 - Stiegler, Jonas T1 - Mobile link functions in unpredictable agricultural landscapes N2 - Animal movement is a crucial aspect of life, influencing ecological and evolutionary processes. It plays an important role in shaping biodiversity patterns, connecting habitats and ecosystems. Anthropogenic landscape changes, such as in agricultural environments, can impede the movement of animals by affecting their ability to locate resources during recurring movements within home ranges and, on a larger scale, disrupt migration or dispersal. Inevitably, these changes in movement behavior have far-reaching consequences on the mobile link functions provided by species inhabiting such extensively altered matrix areas. In this thesis, I investigate the movement characteristics and activity patterns of the European hare (Lepus europaeus), aiming to understand their significance as a pivotal species in fragmented agricultural landscapes. I reveal intriguing results that shed light on the importance of hares for seed dispersal, the influence of personality traits on behavior and space use, the sensitivity of hares to extreme weather conditions, and the impacts of GPS collaring on mammals' activity patterns and movement behavior. In Chapter I, I conducted a controlled feeding experiment to investigate the potential impact of hares on seed dispersal. By additionally utilizing GPS data of hares in two contrasting landscapes, I demonstrated that hares play a vital role, acting as effective mobile linkers for many plant species in small and isolated habitat patches. The analysis of seed intake and germination success revealed that distinct seed traits, such as density, surface area, and shape, profoundly affect hares' ability to disperse seeds through endozoochory. These findings highlight the interplay between hares and plant communities and thus provide valuable insights into seed dispersal mechanisms in fragmented landscapes. By employing standardized behavioral tests in Chapter II, I revealed consistent behavioral responses among captive hares while simultaneously examining the intricate connection between personality traits and spatial patterns within wild hare populations. This analysis provides insights into the ecological interactions and dynamics within hare populations in agricultural habitats. Examining the concept of animal personality, I established a link between personality traits and hare behavior. I showed that boldness, measured through standardized tests, influences individual exploration styles, with shy and bold hares exhibiting distinct space use patterns. In addition to providing valuable insights into the role of animal personality in heterogeneous environments, my research introduced a novel approach demonstrating the feasibility of remotely assessing personality types using animal-borne sensors without additional disturbance of the focal individual. While climate conditions severely impact the activity and, consequently, the fitness of wildlife species across the globe, in Chapter III, I uncovered the sensitivity of hares to temperature, humidity, and wind speed during their peak reproduction period. I found a strong response in activity to high temperatures above 25°C, with a particularly pronounced effect during temperature extremes of over 35°C. The non-linear relationship between temperature and activity was characterized by contrasting responses observed for day and night. These findings emphasize the vulnerability of hares to climate change and the potential consequences for their fitness and population dynamics with the ongoing rise of temperature. Since such insights can only be obtained through capturing and tagging free-ranging animals, I assessed potential impacts and the recovery process post-collar attachment in Chapter IV. For this purpose, I examined the daily distances moved and the temporal-associated activity of 1451 terrestrial mammals out of 42 species during their initial tracking period. The disturbance intensity and the speed of recovery varied across species, with herbivores, females, and individuals captured and collared in relatively secluded study areas experiencing more pronounced disturbances due to limited anthropogenic influences. Mobile linkers are essential for maintaining biodiversity as they influence the dynamics and resilience of ecosystems. Furthermore, their ability to move through fragmented landscapes makes them a key component for restoring disturbed sites. Individual movement decisions determine the scale of mobile links, and understanding variations in space use among individuals is crucial for interpreting their functions. Climate change poses further challenges, with wildlife species expected to adjust their behavior, especially in response to high-temperature extremes, and comprehending the anthropogenic influence on animal movements will remain paramount to effective land use planning and the development of successful conservation strategies. This thesis provides a comprehensive ecological understanding of hares in agricultural landscapes. My research findings underscore the importance of hares as mobile linkers, the influence of personality traits on behavior and spatial patterns, the vulnerability of hares to extreme weather conditions, and the immediate consequences of collar attachment on mammalian movements. Thus, I contribute valuable insights to wildlife conservation and management efforts, aiding in developing strategies to mitigate the impact of environmental changes on hare populations. Moreover, these findings enable the development of methodologies aimed at minimizing the impacts of collaring while also identifying potential biases in the data, thereby benefiting both animal welfare and the scientific integrity of localization studies. N2 - Die Bewegung von Tieren ist ein entscheidender Aspekt des Lebens, der ökologische und evolutionäre Prozesse beeinflusst. Sie spielt eine wichtige Rolle bei der Gestaltung der biologischen Vielfalt und verbindet Lebensräume und Ökosysteme miteinander. Anthropogene Landschaftsveränderungen, z.B. in der Landwirtschaft, können die Bewegung von Tieren behindern, indem sie ihre Fähigkeiten beeinträchtigen, Ressourcen innerhalb ihres täglichen Bewegungsradius zu lokalisieren und im größeren Maßstab, ihre Wanderung oder Ausbreitung limitieren. In dieser Thesis untersuche ich die Bewegungsmerkmale und Aktivitätsmuster des Feldhasen (Lepus europaeus), um seine Bedeutung als Schlüsselart in fragmentierten Agrarlandschaften zu verstehen. Ich lege faszinierende Ergebnisse vor, die die Bedeutung des Hasen für die Verbreitung von Saatgut, den Einfluss von Persönlichkeitsmerkmalen auf das Verhalten und die Raumnutzung, die Sensibilität des Hasen gegenüber extremen Witterungsbedingungen und die Auswirkungen von GPS-Empfängern auf die Aktivitätsmuster und das Bewegungsverhalten der Säugetiere beleuchten. In Kapitel I führte ich ein kontrolliertes Fütterungsexperiment durch, um den potenziellen Einfluss von Hasen auf die Samenausbreitung zu analysieren. Durch die zusätzliche Verwendung von GPS-Daten von Hasen in zwei kontrastierenden Landschaften konnte ich nachweisen, dass Hasen eine wichtige Rolle spielen, da sie in kleinen und isolierten Habitatfeldern als effektive mobile Verbindungsglieder für viele Pflanzenarten fungieren. Die Analyse der Samenaufnahme und des Keimungserfolgs zeigte, dass verschiedene Eigenschaften der Samen, wie Dichte, Oberfläche und Form, die Fähigkeit der Hasen, Samen durch Endozoochorie zu verbreiten, stark beeinflussen. Diese Ergebnisse verdeutlichen die Wechselwirkung zwischen Hasen und Pflanzengemeinschaften und liefern somit wertvolle Erkenntnisse über die Mechanismen der Samenverbreitung in fragmentierten Landschaften. Durch den Einsatz standardisierter Verhaltenstests in Kapitel II konnte ich konsistente Verhaltensreaktionen bei in Gefangenschaft lebenden Hasen aufdecken und zeitgleich den komplexen Zusammenhang zwischen Persönlichkeitsmerkmalen und räumlichen Mustern in Wildhasenpopulationen untersuchen. Diese Analyse bietet Einblicke in die ökologischen Interaktionen und die Dynamik von Hasenpopulationen in landwirtschaftlichen Lebensräumen. Indem ich das Konzept der Tierpersönlichkeit untersuchte, stellte ich eine Verbindung zwischen Persönlichkeitsmerkmalen und dem Verhalten von Hasen her. Ich habe gezeigt, dass die durch standardisierte Tests gemessene Kühnheit den individuellen Erkundungsstil beeinflusst, wobei schüchterne und kühne Hasen unterschiedliche Raumnutzungsmuster aufweisen. Meine Forschung liefert nicht nur wertvolle Einblicke in die Rolle der Tierpersönlichkeit in heterogenen Umgebungen, sondern stellt auch einen neuartigen Ansatz vor, der die Durchführbarkeit einer Fernbeurteilung von Persönlichkeitstypen mithilfe von am Tier angebrachten Sensoren ohne zusätzliche Störung des Zielindividuums demonstrierte. Da die Klimabedingungen die Aktivität und folglich die Fitness von Wildtierarten auf der ganzen Welt stark beeinflussen, habe ich in Kapitel III die Sensibilität von Hasen gegenüber Temperatur, Luftfeuchtigkeit und Windgeschwindigkeit während ihrer Hauptfortpflanzungszeit ermittelt. Ich stellte fest, dass die Aktivität stark auf hohe Temperaturen über 25 °C reagiert, wobei die Auswirkungen bei extremen Temperaturen von über 35 °C besonders ausgeprägt sind. Die nicht lineare Beziehung zwischen Temperatur und Aktivität war durch gegensätzliche Reaktionen bei Tag und Nacht gekennzeichnet. Diese Ergebnisse unterstreichen die Anfälligkeit der Hasen für den Klimawandel und die möglichen Folgen für ihre Fitness und Populationsdynamik bei einem anhaltenden Temperaturanstieg. Da solche Erkenntnisse nur durch Fangen und Besendern von Wildtieren ermöglicht werden können, habe ich in Kapitel IV die potenziellen negativen Auswirkungen auf das Individuuum, sowie den Erholungsprozess nach dem Anlegen des Halsbandes untersucht. Hierfür analysierte ich die zurückgelegten täglichen Entfernungen in Verbindung mit der Aktivität von 1451 terrestrischen Säugetieren aus 42 verschiedenen Arten während ihrer anfänglichen Verfolgung. Die Intensität der Störung sowie die Geschwindigkeit der Erholung variieren je nach Art, wobei Pflanzenfresser, Weibchen und Individuen, die in relativ abgelegenen Untersuchungsgebieten gefangen und mit Halsbändern versehen wurden, aufgrund bisher begrenzter anthropogener Einflüsse stärkere Störungen erfahren. Mobile Verbindungsglieder sind essentiell für die Erhaltung der Biodiversität, indem sie eine wichtige Rolle in der Dynamik und Resilienz von Ökosystemen spielen. Weiterhin macht ihre Fähigkeit, sich durch zerstückelte Landschaften zu bewegen sie zu wichtigen Schlüsselkomponenten bei der Wiederherstellung von zerstörten Landschaften. Individuelle Bewegungsentscheidungen bestimmen den Maßstab der mobilen Verbindungen und die Schwankungen der Raumnutzung unter Individuen zu verstehen ist unerlässlich, um deren Funktion zu interpretieren. Der Klimawandel stellt eine weitere Herausforderung dar, indem Wildtiere dazu gezwungen werden, sich zu adaptieren, insbesondere an Hochtemperatur-Extreme. Den anthropogenen Einfluss auf Tierbewegungen aufzudecken bleibt von größter Bedeutung in der Landnutzungsplanung und die Entwicklung von erfolgreichen Strategien zum Schutz der Natur. Diese Thesis liefert ein umfassendes ökologisches Verständnis von Feldhasen in Agrarlandschaften. Die Ergebnisse meiner Forschung unterstreichen die Bedeutung von Hasen als mobile Bindeglieder, den Einfluss von Persönlichkeitsmerkmalen auf Verhalten und räumliche Muster, die Anfälligkeit von Hasen gegenüber extremen Wetterbedingungen und die unmittelbaren Folgen der Halsbandanbringung auf Tierbewegungen. Damit leiste ich einen wertvollen Beitrag zum Schutz und zur Bewirtschaftung von Wildtieren, indem ich die Entwicklung von Strategien zur Abschwächung der Auswirkungen von Umweltveränderungen auf Hasenpopulationen unterstütze. Darüber hinaus ermöglichen diese Erkenntnisse die Entwicklung von Methoden, die darauf abzielen, die Folgen der Halsbandanbringung zu minimieren und gleichzeitig potenzielle Verzerrungen in den Daten zu identifizieren, was sowohl dem Tierschutz als auch der wissenschaftlichen Integrität von Lokalisierungsstudien zugutekommt. KW - European hare KW - mammals KW - ecology KW - animal personality KW - seed dispersal KW - movement ecology KW - tracking impacts KW - energy budget KW - climate change KW - accelerometry KW - GPS KW - tracking KW - Feldhase KW - GPS KW - Beschleunigungsmessungen KW - Tierpersönlichkeit KW - Klimawandel KW - Tierökologie KW - Energiebudget KW - Säugetiere KW - Bewegungsökologie KW - Samenausbreitung KW - Tierortung KW - Konsequenzen von Fang und Besenderung Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-622023 ER - TY - THES A1 - Ogunkola, Moses T1 - Role of the tRNA thiouridine modification protein (TUM1) as a sulfurtransferase in humans T1 - Die Rolle des tRNA-Thiouridin-Modifikationsproteins (TUM1) als Sulfurtransferase beim Menschen N2 - Sulfur is essential for the functionality of some important biomolecules in humans. Biomolecules like the Iron-sulfur clusters, tRNAs, Molybdenum cofactor, and some vitamins. The trafficking of sulfur involves proteins collectively called sulfurtransferase. Among these are TUM1, MOCS3, and NFS1. This research investigated the role of TUM1 for molybdenum cofactor biosynthesis and cytosolic tRNA thiolation in humans. The rhodanese-like protein MOCS3 and the L-cysteine desulfurase (NFS1) have been previously demonstrated to interact with TUM1. These interactions suggested a dual function of TUM1 in sulfur transfer for Moco biosynthesis and cytosolic tRNA thiolation. TUM1 deficiency has been implicated to be responsible for a rare inheritable disorder known as mercaptolactate cysteine disulfiduria (MCDU), which is associated with a mental disorder. This mental disorder is similar to the symptoms of sulfite oxidase deficiency which is characterised by neurological disorders. Therefore, the role of TUM1 as a sulfurtransferase in humans was investigated, in CRISPR/Cas9 generated TUM1 knockout HEK 293T cell lines. For the first time, TUM1 was implicated in Moco biosynthesis in humans by quantifying the intermediate product cPMP and Moco using HPLC. Comparing the TUM1 knockout cell lines to the wild-type, accumulation and reduction of cPMP and Moco were observed respectively. The effect of TUM1 knockout on the activity of a Moco-dependent enzyme, Sulfite oxidase, was also investigated. Sulfite oxidase is essential for the detoxification of sulfite to sulfate. Sulfite oxidase activity and protein abundance were reduced due to less availability of Moco. This shows that TUM1 is essential for efficient sulfur transfer for Moco biosynthesis. Reduction in cystathionin -lyase in TUM1 knockout cells was quantified, a possible coping mechanism of the cell against sulfite production through cysteine catabolism. Secondly, the involvement of TUM1 in tRNA thio-modification at the wobble Uridine-34 was reported by quantifying the amount of mcm5s2U and mcm5U via HPLC. The reduction and accumulation of mcm5s2U and mcm5U in TUM1 knockout cells were observed in the nucleoside analysis. Herein, exogenous treatment with NaHS, a hydrogen sulfide donor, rescued the Moco biosynthesis, cytosolic tRNA thiolation, and cell proliferation deficits in TUM1 knockout cells. Further, TUM1 was shown to impact mitochondria bioenergetics through the measurement of the oxygen consumption rate and extracellular acidification rate (ECAR) via the seahorse cell Mito stress analyzer. Reduction in total ATP production was also measured. This reveals how important TUM1 is for H2S biosynthesis in the mitochondria of HEK 293T. Finally, the inhibition of NFS1 in HEK 293T and purified NFS1 protein by 2-methylene 3-quinuclidinone was demonstrated via spectrophotometric and radioactivity quantification. Inhibition of NFS1 by MQ further affected the iron-sulfur cluster-dependent enzyme aconitase activity. N2 - Schwefel ist für die Funktionalität einiger wichtiger Biomoleküle beim Menschen wie die Eisen-Schwefel-Cluster, tRNA, Molybdän-Cofaktoren und einige Vitamine unerlässlich. Am Schwefelverkehr ist eine weit verbreitete Gruppe von Proteinen beteiligt, die als Rhodanese (Sulfurtransferase) bezeichnet wird. Zu dieser Klasse von Enzymen gehören die humanen (Proteine) TUM1, MOCS3 und NFS1. Es hat sich gezeigt, dass TUM1 mit der L-Cystein-Desulfurase (NFS1) und dem rhodaneseähnlichen Protein MOCS3 interagiert. Diese Wechselwirkungen deuten auf eine Doppelfunktion von TUM1 beim Schwefeltransfer für die Moco-Biosynthese und die zytosolische tRNA-Thiolierung hin. Ein TUM1-Mangel wird für eine seltene vererbbare Störung verantwortlich gemacht, die als Mercaptolactat-Cystein-Disulfidurie (MCDU) bekannt ist und mit geistigen Störungen einhergeht. Diese psychische Störung könnte auf die Symptome des Sulfit-Oxidase-Mangels zurückzuführen sein, der auch durch neurologische Störungen gekennzeichnet ist. In dieser Studie wurde zum ersten Mal die Rolle von TUM1 bei der Biosynthese von Molybdän-Cofaktoren und der zytosolischen tRNA-Thiolierung beim Menschen untersucht. Dies wurde durch die Verwendung von einer zuvor generierten TUM1-Deletion in HEK 293T-Zelllinien unter Verwendung von CRISPR/Cas9 erreicht. Hier wurde zum ersten Mal die Funktion von TUM1 in der Moco-Biosynthese im Menschen untersucht, wobei das Zwischenprodukt cPMP und Moco mittels HPLC quantifiziert wurde. Beim Vergleich der TUM1-deletierten-Zelllinien mit dem Wildtyp wurde eine Akkumulation bzw. Reduktion von cPMP und Moco beobachtet. Die Auswirkungen der TUM1-Deletion auf die Aktivität eines Moco-abhängigen Enzyms, der Sulfit-Oxidase, wurden ebenfalls untersucht. Sulfit ist wichtig für die Entgiftung von Sulfit zu Sulfat. Die Aktivität der Sulfit-Oxidase und die Proteinquantität waren aufgrund der geringeren Verfügbarkeit von Moco reduziert. Dies zeigt, dass TUM1 für einen effizienten Schwefeltransfer für die Moco-Biosynthese wichtig ist. Wir berichteten auch über die Verringerung der Cystathionin -Lyase in TUM1-deletierten-Zellen, ein möglicher Bewältigungsmechanismus der Zelle gegen die Sulfitproduktion. Zweitens wurde die Beteiligung von TUM1 an der tRNA-ThioModifikation am Wobble Uridin-34 durch Quantifizierung der Menge an mcm5s2U und mcm5U mittels HPLC untersucht. Es wurde eine Reduktion bzw. Akkumulation von mcm5s2U und mcm5U in TUM1-Knockout-Zellen beobachtet. Die exogene Behandlung mit NaHS, einem Schwefelwasserstoff-Donor, rettete die Moco-Biosynthese, die zytosolische tRNA-Thiolation und das Defizit der Zellproliferation in TUM1-deletion-Zellen. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass TUM1 die Bioenergetik der Mitochondrien beeinflusst, indem die Sauerstoffverbrauchsrate und die extrazelluläre Versauerungsrate (ECAR) über den Seahorse XF Analyzer gemessen wurden. Eine Verringerung der gesamten ATP-Produktion war ebenfalls erkennbar. Dies zeigt, wie wichtig TUM1 für die H2S-Biosynthese in den Mitochondrien von HEK 293T ist. Schließlich wurde die Hemmung von NFS1 in HEK 293T und gereinigtem NFS1-Protein durch 2-Methylen-3-chinuclidinon mittels spektrophotometrischer und radioaktiver Quantifizierung nachgewiesen. Die Hemmung von NFS1 durch 2-Methylen-3-chinuclidinon verringerte die Aktivität des von Eisen-Schwefel-Clustern abhängigen Enzyms Aconitase in HEK 293T. KW - Moco biosynthesis KW - sulfite oxidase KW - cytosolic tRNA thiolation KW - 5-methoxycarbonylmethyl-2-thiouridine KW - H2S biosynthesis KW - cellular bioenergetics KW - Moco-Biosynthese KW - Sulfit-Oxidase KW - zytosolische tRNA-Thiolierung KW - 5-Methoxycarbonylmethyl-2-Thiouridin KW - H2S-Biosynthese KW - zelluläre Bioenergetik Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-611357 ER - TY - THES A1 - Schlossarek, Dennis T1 - Identification of dynamic protein-metabolite complexes in saccharomyces cerevisiae using co-fractionation mass spectrometry T1 - Identifikation von dynamischen Protein-Metabolit Komplexes in Saccharomyces cerevisiae unter Nutzung der Co-Fraktionierungs Massenspektrometrie N2 - Cells are built from a variety of macromolecules and metabolites. Both, the proteome and the metabolome are highly dynamic and responsive to environmental cues and developmental processes. But it is not their bare numbers, but their interactions that enable life. The protein-protein (PPI) and protein-metabolite interactions (PMI) facilitate and regulate all aspects of cell biology, from metabolism to mitosis. Therefore, the study of PPIs and PMIs and their dynamics in a cell-wide context is of great scientific interest. In this dissertation, I aim to chart a map of the dynamic PPIs and PMIs across metabolic and cellular transitions. As a model system, I study the shift from the fermentative to the respiratory growth, known as the diauxic shift, in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. To do so, I am applying a co-fractionation mass spectrometry (CF-MS) based method, dubbed protein metabolite interactions using size separation (PROMIS). PROMIS, as well as comparable methods, will be discussed in detail in chapter 1. Since PROMIS was developed originally for Arabidopsis thaliana, in chapter 2, I will describe the adaptation of PROMIS to S. cerevisiae. Here, the obtained results demonstrated a wealth of protein-metabolite interactions, and experimentally validated 225 previously predicted PMIs. Applying orthogonal, targeted approaches to validate the interactions of a proteogenic dipeptide, Ser-Leu, five novel protein-interactors were found. One of those proteins, phosphoglycerate kinase, is inhibited by Ser-Leu, placing the dipeptide at the regulation of glycolysis. In chapter 3, I am presenting PROMISed, a novel web-tool designed for the analysis of PROMIS- and other CF-MS-datasets. Starting with raw fractionation profiles, PROMISed enables data pre-processing, profile deconvolution, scores differences in fractionation profiles between experimental conditions, and ultimately charts interaction networks. PROMISed comes with a user-friendly graphic interface, and thus enables the routine analysis of CF-MS data by non-computational biologists. Finally, in chapter 4, I applied PROMIS in combination with the isothermal shift assay to the diauxic shift in S. cerevisiae to study changes in the PPI and PMI landscape across this metabolic transition. I found a major rewiring of protein-protein-metabolite complexes, exemplified by the disassembly of the proteasome in the respiratory phase, the loss of interaction of an enzyme involved in amino acid biosynthesis and its cofactor, as well as phase and structure specific interactions between dipeptides and enzymes of central carbon metabolism. In chapter 5, I am summarizing the presented results, and discuss a strategy to unravel the potential patterns of dipeptide accumulation and binding specificities. Lastly, I recapitulate recently postulated guidelines for CF-MS experiments, and give an outlook of protein interaction studies in the near future. N2 - Die Zelle besteht aus einer Vielzahl von großen und kleinen Molekülen, und sowohl das Proteom als auch das Metabolom passen sich dynamisch den vorherrschenden Umweltbedingungen oder zellulären Anforderungen an. Allerdings ist es nicht die bloße Menge an biologischen Molekülen, sondern deren Interaktionen miteinander, die das Leben erst ermöglichen. Protein-Protein (PPI) und Protein-Metabolit Interaktionen (PMI) vollbringen und regulieren alle Aspekte der Zelle, vom Stoffwechsel bis zur Mitose. Die Studie dieser Interaktionen ist daher von fundamentalem wissenschaftlichem Interesse. In dieser Dissertation strebe ich an, eine Karte der Protein-Protein und Protein-Metabolit Interaktionen zu zeichnen, die den Übergang vom fermentativen zum respiratioschen Stoffwechsel in der Hefe Saccharomyces cerevisiae umfasst. Zu diesem Zweck nutze ich PROMIS (egl. protein metabolite interactions using size separation), eine auf der co-Fraktionierungs Massensprektrometrie (CF-MS) aufbauende Methode. PROMIS, und ähnliche Methoden zur Untersuchung von Protein-Interkationen, werden ausgiebig in Kapitel 1 vorgestellt. Da PROMIS ursprünglich für die Modellpflanze Arabadopsis thaliana entwickelt wurde, beschreibe ich in Kapitel 2 zunächst die erste Anwendung der Methode in S. cerevisiae. Die Ergebnisse stellen eine Fülle an Protein-Metabolit Interaktionen dar, und 225 zuvor prognostizierte Interaktionen wurden das erste Mal experimentell beschrieben. Mit Hilfe orthogonaler Methoden wurde außerdem eine inhibitorische Interaktion zwischen dem proteinogenen Dipeptid Ser-Leu und einem Enzym der Glykolyse gefunden. In Kapitel 3 präsentiere ich PROMISed, eine neue Web-Anwendung zur Auswertung von Daten von PROMIS oder anderen CF-MS Experimente. PROMISed kann genutzt werden um in rohen Fraktionierungs-Profile lokale Maxima zu finden, aus denen ein Interaktions-Netzwerk basierend auf Korrelationen erstellt wird. Außerdem kann die Anwendung Unterschiede in den Profilen zwischen verschiedenen experimentellen Bedingungen bewerten. PROMISed umfasst eine benutzerfreundliche grafische Oberfläche und bedarf daher keiner Programmierkenntnisse zur Nutzung. In Kapitel 4 benutze ich schließlich PROMIS und ItSA (engl. isothermal shift assay) um PPI und PMI während des Übergangs vom fermentativen zum respiratorischen Stoffwechsel in Hefe zu untersuchen. Hier beschreibe ich eine zellweite Umbildung der Protein-Metabolit-Komplexe, bespielhaft beschrieben anhand des Auseinanderfallens des Proteasoms im respiratorischen Stoffwechsel, des Verlustes der Interaktion zwischen einem Enzym des Aminosäure Stoffwechsels mit seinem Cofaktor und spezifischen Interaktionen zwischen Dipeptiden und Enzymen des zentralen Stoffwechsels. In Kapitel 5 fasse ich die gefundenen Ergebnisse zusammen und stelle eine Strategie zur Untersuchung der Spezifität sowohl der Bildung als auch der Protein-Interaktionen von Dipeptiden vor. Zu aller letzt rekapituliere ich Richtlinien für CF-MS Experimente und gebe einen Ausblick auf die nahe Zukunft der Studien der Protein-Interkationen. KW - Protein KW - Metabolit KW - Interaktion KW - Interaktions Netzwerk KW - Stoffwechsel KW - Saccharomyces cerevisiae KW - protein KW - metabolite KW - interaction KW - interaction network KW - metabolism KW - saccharomyces cerevisiae KW - interactomics KW - proteomics KW - metabolomics Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-582826 ER - TY - THES A1 - Flores Castellanos, Junio T1 - Potato tuber (Solanum tuberosum L. cv Desiree) — characterization of starch interacting proteins and maltodextrin metabolism T1 - Kartoffelknolle (Solanum tuberosum L. cv Desiree) - Charakterisierung von Stärke-interagierenden Proteinen und Maltodextrin-Stoffwechsel N2 - Starch is a biopolymer for which, despite its simple composition, understanding the precise mechanism behind its formation and regulation has been challenging. Several approaches and bioanalytical tools can be used to expand the knowledge on the different parts involved in the starch metabolism. In this sense, a comprehensive analysis targeting two of the main groups of molecules involved in this process: proteins, as effectors/regulators of the starch metabolism, and maltodextrins as starch components and degradation products, was conducted in this research work using potato plants (Solanum tuberosum L. cv. Desiree) as model of study. On one side, proteins physically interacting to potato starch were isolated and analyzed through mass spectrometry and western blot for their identification. Alternatively, starch interacting proteins were explored in potato tubers from transgenic plants having antisense inhibition of starch-related enzymes and on tubers stored under variable environmental conditions. Most of the proteins recovered from the starch granules corresponded to previously described proteins having a specific role in the starch metabolic pathway. Another set of proteins could be grouped as protease inhibitors, which were found weakly interacting to starch. Variations in the protein profile obtained after electrophoresis separation became clear when tubers were stored under different temperatures, indicating a differential expression of proteins in response to changing environmental conditions. On the other side, since maltodextrin metabolism is thought to be involved in both starch initiation and degradation, soluble maltooligosaccharide content in potato tubers was analyzed in this work under diverse experimental variables. For this, tuber disc samples from wild type and transgenic lines strongly repressing either the plastidial or cytosolic form of the -glucan phosphorylase and phosphoglucomutase were incubated with glucose, glucose-6-phosphate, and glucose-1-phosphate solutions to evaluate the influence of such enzymes on the conversion of the carbon sources into soluble maltodextrins, in comparison to wild-type samples. Relative maltodextrin amounts analyzed through capillary electrophoresis equipped with laser-induced fluorescence (CE-LIF) revealed that tuber discs could immediately uptake glucose-1-phosphate and use it to produce maltooligosaccharides with a degree of polymerization of up to 30 (DP30), in contrast to transgenic tubers with strong repression of the plastidial glucan phosphorylase. The results obtained from the maltodextrin analysis support previous indications that a specific transporter for glucose-1-phosphate may exist in both the plant cells and the plastidial membranes, thereby allowing a glucose-6-phosphate independent transport. Furthermore, it confirms that the plastidial glucan phosphorylase is responsible for producing longer maltooligosaccharides in the plastids by catalyzing a glucan polymerization reaction when glucose-1-phosphate is available. All these findings contribute to a better understanding of the role of the plastidial glucan phosphorylase as a key enzyme directly involved in the synthesis and degradation of glucans and their implication on starch metabolism. N2 - Stärke ist ein Biopolymer, bei dem es trotz seiner einfachen Zusammensetzung schwierig ist, den genauen Mechanismus seiner Bildung und Regulierung zu verstehen. Verschiedene Ansätze und bioanalytische Instrumente können genutzt werden, um das Wissen über die verschiedenen am Stärkemetabolismus beteiligten Komponenten zu erweitern. In diesem Sinne wurde in dieser Forschungsarbeit eine umfassende Analyse durchgeführt, die auf zwei der wichtigsten Molekülgruppen abzielt, die an diesem Prozess beteiligt sind: Proteine als Effektoren/Regulatoren des Stärkestoffwechsels und Maltodextrine als Stärkebestandteile und Abbauprodukte, wobei Kartoffelpflanzen (Solanum tuberosum L. cv. Desiree) als Untersuchungsmodell dienten. Einerseits wurden Proteine, die physisch mit Kartoffelstärke interagieren, isoliert und mittels Massenspektrometrie und Western Blot analysiert, um sie zu identifizieren. Andererseits wurden die mit Stärke interagierenden Proteine in Kartoffelknollen von transgenen Pflanzen mit Antisense-Hemmung von stärkeverwandten Enzymen und in Knollen, die unter variablen Umweltbedingungen gelagert wurden, untersucht. Die meisten der aus den Stärkekörnchen gewonnenen Proteine entsprachen zuvor beschriebenen Proteinen, die eine spezifische Rolle im Stärkestoffwechselweg spielen. Eine andere Gruppe von Proteinen konnte als Proteaseinhibitoren gruppiert werden, die nur schwach mit der Stärke interagieren. Variationen im Proteinprofil nach der Elektrophorese-Trennung wurden deutlich, wenn die Knollen bei unterschiedlichen Temperaturen gelagert wurden, was auf eine unterschiedliche Expression von Proteinen als Reaktion auf wechselnde Umweltbedingungen hindeutet. Da man davon ausgeht, dass der Maltodextrin-Stoffwechsel sowohl an der Entstehung als auch am Abbau von Stärke beteiligt ist, wurde in dieser Arbeit der Gehalt an löslichen Maltooligosacchariden in Kartoffelknollen unter verschiedenen experimentellen Variablen analysiert. Zu diesem Zweck wurden Knollenscheibenproben von Wildtypen und transgenen Linien, die entweder die plastidiale oder die cytosolische Form der α-Glucanphosphorylase und Phosphoglucomutase stark unterdrücken, mit Glucose-, Glucose-6-Phosphat- und Glucose-1-Phosphat-Lösungen inkubiert, um den Einfluss dieser Enzyme auf die Umwandlung der Kohlenstoffquellen in lösliche Maltodextrine im Vergleich zu Wildtyp-Proben zu bewerten. Relative Maltodextrinmengen, die durch Kapillarelektrophorese mit laserinduzierter Fluoreszenz (CE-LIF) analysiert wurden, zeigten, dass die Knollenscheiben Glukose-1-Phosphat sofort aufnehmen und zur Herstellung von Maltooligosacchariden mit einem Polymerisationsgrad von bis zu 30 (DP30) verwenden konnten, im Gegensatz zu transgenen Knollen mit starker Unterdrückung der plastidialen Glukanphosphorylase. Die Ergebnisse der Maltodextrin-Analyse stützen frühere Hinweise darauf, dass ein spezifischer Transporter für Glucose-1-Phosphat sowohl in den Pflanzenzellen als auch in den plastidialen Membranen vorhanden sein könnte, was einen von Glucose-6-Phosphat unabhängigen Transport ermöglicht. Außerdem wird bestätigt, dass die plastidiale Glucanphosphorylase für die Herstellung längerer Maltooligosaccharide in den Plastiden verantwortlich ist, indem sie eine Glucanpolymerisationsreaktion katalysiert, wenn Glucose-1-Phosphat verfügbar ist. All diese Erkenntnisse tragen zu einem besseren Verständnis der Rolle der plastidialen Glucanphosphorylase als Schlüsselenzym bei, das direkt an der Synthese und dem Abbau von Glucanen und deren Auswirkungen auf den Stärkemetabolismus beteiligt ist. KW - Solanum tuberosum KW - potato KW - maltodextrin KW - starch KW - Stärke KW - Solanum tuberosum KW - Maltodextrin KW - Kartoffel Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-615055 ER - TY - THES A1 - Dreymann, Nico T1 - Identification and functional characterization of aptamers targeting human urokinase and NDM-1 for therapeutic and diagnostic applications T1 - Identifizierung und funktionelle Charakterisierung von Aptameren gegen humane Urokinase und NDM-1 für therapeutische und diagnostische Anwendungen N2 - Aptamers are single-stranded DNA (ssDNA) or RNA molecules that can bind specifically and with high affinity to target molecules due to their unique three-dimensional structure. For this reason, they are often compared to antibodies and sometimes even referred to as “chemical antibodies”. They are simple and inexpensive to synthesize, easy to modify, and smaller than conventional antibodies. Enzymes, especially hydrolases, are interesting targets in this context. This class of enzymes is capable of hydrolytically cleaving various macromolecules such as proteins, as well as smaller molecules such as antibiotics. Hence, they play an important role in many biological processes including diseases and their treatment. Hydrolase detection as well as the understanding of their function is therefore of great importance for diagnostics and therapy. Due to their various desirable features compared to antibodies, aptamers are being discussed as alternative agents for analytical and diagnostic use in various applications. The use of aptamers in therapy is also frequently investigated, as the binding of aptamers can have effects on the catalytic activity, protein-protein interactions, or proteolytic cascades. Aptamers are generated by an in vitro selection process. Potential aptamer candidates are selected from a pool of enriched nucleic acid sequences with affinity to the target, and their binding affinity and specificity is investigated. This is one of the most important steps in aptamer generation to obtain specific aptamers with high affinity for use in analytical and diagnostic applications. The binding properties or binding domains and their effects on enzyme functions form the basis for therapeutic applications. In this work, the binding properties of DNA aptamers against two different hydrolases were investigated. In view of their potential utility for analytical methods, aptamers against human urokinase (uPA) and New Delhi metallo-β-lactamase-1 (NDM-1) were evaluated for their binding affinity and specificity using different methods. Using the uPA aptamers, a protocol for measuring the binding kinetics of an aptamer-protein-interaction by surface plasmon resonance spectroscopy (SPR) was developed. Based on the increased expression of uPA in different types of cancer, uPA is discussed as a prognostic and diagnostic tumor marker. As uPA aptamers showed different binding sites on the protein, microtiter plate-based aptamer sandwich assay systems for the detection of uPA were developed. Because of the function of urokinase in cancer cell proliferation and metastasis, uPA is also discussed as a therapeutic target. In this regard, the different binding sites of aptamers showed different effects on uPA function. In vitro experiments demonstrated both inhibition of uPA binding to its receptor as well as the inhibition of uPA catalytic activity for different aptamers. Thus, in addition to their specificity and affinity for their targets, the utility of the aptamers for potential diagnostic and therapeutic applications was demonstrated. First, as an alternative inhibitor of human urokinase for therapeutic purposes, and second, as valuable recognition molecules for the detection of urokinase, as a prognostic and diagnostic marker for cancer, and for NDM-1 to detect resistance to carbapenem antibiotics. N2 - Aptamere sind einzelsträngige DNA- oder RNA-Moleküle, die aufgrund ihrer charakteristischen dreidimensionalen Struktur spezifisch und mit hoher Affinität an Zielmoleküle binden. Häufig werden sie mit Antikörpern verglichen und als „chemische Antikörper“ bezeichnet. Sie sind einfach und kostengünstig zu synthetisieren, leicht zu modifizieren und kleiner als herkömmliche Antikörper. Enzyme, insbesondere Hydrolasen, sind hierbei unter anderem interessante Zielmoleküle. Diese Klasse von Enzymen ist in der Lage verschiedene Makromoleküle wie z.B. Proteine, aber auch kleinere Moleküle, wie z.B. Antibiotika, hydrolytisch zu spalten. Sie spielen in vielen biologischen Prozessen und somit auch in Erkrankungen und deren Behandlung eine wichtige Rolle. Daher ist ihre Detektion, sowie das Verständnis ihrer Funktion für die Diagnostik und Therapie von hoher Bedeutung. Durch ihre Vorteile gegenüber Antikörpern werden Aptamere als Alternativen für den analytischen und diagnostischen Einsatz in verschiedenen Applikationen diskutiert. Der Einsatz von Aptameren in der Therapie wird ebenfalls häufig untersucht, da die Bindung der Aptamere Auswirkungen auf die katalytische Aktivität, Protein-Protein-Interaktionen oder proteolytische Kaskaden haben kann. Aptamere werden mittels in vitro Selektion generiert. Aus einem Pool angereicherter Nukleinsäuren mit Affinität zum Zielmolekül werden anschließend potentielle Aptamerkandidaten identifiziert und ihre Bindung zum Zielmolekül untersucht. Dies ist einer der wichtigsten Schritte in der Aptamergenerierung, um spezifische Aptamere mit hoher Affinität für den späteren Einsatz in analytischen und diagnostischen Applikationen zu erhalten. Die Bindungseigenschaften einschließlich der Bindedomänen und deren Auswirkungen auf die Funktion des Zielmoleküls stellen die Grundlage für spätere therapeutische Anwendungen dar. In dieser Arbeit wurden die Bindungseigenschaften von DNA Aptameren gegen zwei verschiedene Hydrolasen untersucht. Für den potentiellen Nutzen in analytischen Methoden wurden Aptamere gegen die humane Urokinase (uPA), sowie gegen die New-Delhi metallo β-lactamase-1 (NDM-1) mittels molekularbiologischer Methoden auf deren Bindungsaffinität und Spezifität untersucht. Anhand der uPA-Aptamere wurde ein Protokoll für die Messung der Bindungskinetik einer Aptamer-Protein-Bindung mittels Oberflächenplasmonenresonanz Spektroskopie (SPR) entwickelt. Durch die erhöhte Expression von uPA in vielen Krebserkrankungen, wird dieser als prognostischer und diagnostischer Tumormarker diskutiert. Die in dieser Arbeit untersuchten Aptamere gegen die Urokinase zeigten unterschiedliche Bindestellen, wodurch Aptamer-basierte Sandwich Assay Systeme auf Mikrotiterplattenbasis für die Detektion von uPA etabliert werden konnten. Durch die Funktion der Urokinase in der Zellproliferation und Metastasierung in Krebserkrankungen wird uPA ebenfalls als therapeutisches Zielprotein diskutiert. Hierbei zeigten die unterschiedlichen Bindestellen der Aptamere verschiedene Auswirkungen auf die Funktion von uPA. Mittels in vitro Experimenten konnte die Inhibierung der Bindung von uPA zu ihrem Rezeptor, sowie die Inhibierung der katalytischen Aktivität von uPA mit Hilfe verschiedener Aptamere nachgewiesen werden. Somit wurde für die Aptamere, neben ihrer Spezifität und Affinität zu ihren Zielmolekülen, der Nutzen für potentielle diagnostische und therapeutische Anwendungen gezeigt. Zum einen als alternativer Inhibitor der Urokinase für therapeutische Zwecke, als auch als wertvolle Erkennungsmoleküle für den Nachweis von Urokinase, als prognostischer und diagnostischer Marker für Krebserkrankungen, sowie für NDM-1, zum Nachweis der Resistenz gegen Carbapenem-Antibiotika. KW - DNA-Aptamer KW - protein-aptamer interaction KW - Surface Plasmon Resonance (SPR) KW - Microscale Thermophoresis (MST) KW - aptamer-based sandwich assay KW - cancer biomarker KW - cancer therapy KW - cancer detection KW - Urokinase-type Plasminogen Activator (uPA) KW - antibiotic resistance KW - New Delhi metallo-β-lactamase 1 (NDM-1) KW - DNA-Aptamer KW - Microscale Thermophoresis (MST) KW - Neu-Delhi Metallo-Beta-Laktamase 1 (NDM-1) KW - Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie (SPR-Spektroskopie) KW - Urokinase-Typ Plasminogen Aktivator (uPA) KW - Antibiotikaresistenz KW - Sandwich-Assay auf Basis von Aptameren KW - Krebsbiomarker KW - Krebserkennung KW - Krebstherapie KW - Protein-Aptamer Interaktion Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-612919 ER - TY - THES A1 - Courtin, Jérémy T1 - Biodiversity changes in Siberia between quaternary glacial and interglacial stages T1 - Veränderungen der Biodiversität in Sibirien zwischen Quartären Glazial- und Interglazialphasen BT - exploring the potential of sedaDNA BT - das Potenzial von sedaDNA erforschen N2 - Der vom Menschen verursachte Klimawandel wirkt sich auf die biologische Vielfalt der Erde und damit auf die Ökosysteme und ihre Leistungen aus. Die Ökosysteme in den hohen Breitengraden sind aufgrund der verstärkten Erwärmung an den Polen noch stärker betroffen als der Rest der nördlichen Hemisphäre. Dennoch ist es schwierig, die Dynamik von Ökosystemen in den hohen Breitengraden vorherzusagen, da die Wechselwirkungen zwischen abiotischen und biotischen Komponenten sehr komplex sind. Da die Vergangenheit der Schlüssel zur Zukunft ist, ist die Interpretation vergangener ökologischer Veränderungen möglich, um laufende Prozesse besser zu verstehen. Im Quartär durchlief das Pleistozän mehrere glaziale und interglaziale Phasen, welche die Ökosysteme der Vergangenheit beeinflussten. Während des letzten Glazials bedeckte die pleistozäne Steppentundra den größten Teil der unvergletscherten nördlichen Hemisphäre und verschwand parallel zum Aussterben der Megafauna am Übergang zum Holozän (vor etwa 11 700 Jahren). Der Ursprung des Rückgangs der Steppentundra ist nicht gut erforscht, und die Kenntnis über die Mechanismen, die zu den Veränderungen in den vergangenen Lebensgemeinschaften und Ökosystemen geführt haben, ist von hoher Priorität, da sie wahrscheinlich mit denen vergleichbar sind, die sich auf moderne Ökosysteme auswirken. Durch die Entnahme von See- oder Permafrostkernsedimenten kann die vergangene Artenvielfalt an den Übergängen zwischen Eis- und Zwischeneiszeiten untersucht werden. Sibirien und Beringia waren der Ursprung der Ausbreitung der Steppentundra, weshalb die Untersuchung dieses Gebiets hohe Priorität hat. Bis vor kurzem waren Makrofossilien und Pollen die gängigsten Methoden. Sie dienen der Rekonstruktion vergangener Veränderungen in der Zusammensetzung der Bevölkerung, haben aber ihre Grenzen und Schwächen. Seit Ende des 20. Jahrhunderts kann auch sedimentäre alte DNA (sedaDNA) untersucht werden. Mein Hauptziel war es, durch den Einsatz von sedaDNA-Ansätzen wissenschaftliche Beweise für Veränderungen in der Zusammensetzung und Vielfalt der Ökosysteme der nördlichen Hemisphäre am Übergang zwischen den quartären Eiszeiten und Zwischeneiszeiten zu liefern. In dieser Arbeit liefere ich Momentaufnahmen ganzer alter Ökosysteme und beschreibe die Veränderungen in der Zusammensetzung zwischen Quartärglazialen und Interglazialen und bestätige die Vegetationszusammensetzung sowie die räumlichen und zeitlichen Grenzen der pleistozänen Steppentundra. Ich stelle einen allgemeinen Verlust der Pflanzenvielfalt fest, wobei das Aussterben der Pflanzen parallel zum Aussterben der Megafauna verlief. Ich zeige auf, wie der Verlust der biotischen Widerstandsfähigkeit zum Zusammenbruch eines zuvor gut etablierten Systems führte, und diskutiere meine Ergebnisse im Hinblick auf den laufenden Klimawandel. Mit weiteren Arbeiten zur Eingrenzung von Verzerrungen und Grenzen kann sedaDNA parallel zu den etablierteren Makrofossilien- und Pollenansätzen verwendet werden oder diese sogar ersetzen, da meine Ergebnisse die Robustheit und das Potenzial von sedaDNA zur Beantwortung neuer paläoökologischer Fragen wie Veränderungen der Pflanzenvielfalt und -verluste belegen und Momentaufnahmen ganzer alter Biota liefern. N2 - Climate change of anthropogenic origin is affecting Earth’s biodiversity and therefore ecosystems and their services. High latitude ecosystems are even more impacted than the rest of Northern Hemisphere because of the amplified polar warming. Still, it is challenging to predict the dynamics of high latitude ecosystems because of complex interaction between abiotic and biotic components. As the past is the key to the future, the interpretation of past ecological changes to better understand ongoing processes is possible. In the Quaternary, the Pleistocene experienced several glacial and interglacial stages that affected past ecosystems. During the last Glacial, the Pleistocene steppe-tundra was covering most of unglaciated northern hemisphere and disappeared in parallel to the megafauna’s extinction at the transition to the Holocene (~11,700 years ago). The origin of the steppe-tundra decline is not well understood and knowledge on the mechanisms, which caused shifts in past communities and ecosystems, is of high priority as they are likely comparable to those affecting modern ecosystems. Lake or permafrost core sediments can be retrieved to investigate past biodiversity at transitions between glacial and interglacial stages. Siberia and Beringia were the origin of dispersal of the steppe-tundra, which make investigation this area of high priority. Until recently, macrofossils and pollen were the most common approaches. They are designed to reconstruct past composition changes but have limit and biases. Since the end of the 20th century, sedimentary ancient DNA (sedaDNA) can also be investigated. My main objectives were, by using sedaDNA approaches to provide scientific evidence of compositional and diversity changes in the Northern Hemisphere ecosystems at the transition between Quaternary glacial and interglacial stages. In this thesis, I provide snapshots of entire ancient ecosystems and describe compositional changes between Quaternary glacial and interglacial stages, and confirm the vegetation composition and the spatial and temporal boundaries of the Pleistocene steppe-tundra. I identify a general loss of plant diversity with extinction events happening in parallel of megafauna’ extinction. I demonstrate how loss of biotic resilience led to the collapse of a previously well-established system and discuss my results in regards to the ongoing climate change. With further work to constrain biases and limits, sedaDNA can be used in parallel or even replace the more established macrofossils and pollen approaches as my results support the robustness and potential of sedaDNA to answer new palaeoecological questions such as plant diversity changes, loss and provide snapshots of entire ancient biota. KW - sedaDNA KW - pleistocene KW - paleoecology KW - climate change KW - holocene KW - Siberia KW - sedaDNA KW - Pleistozän KW - Paläoökologie KW - Holozän KW - Klimawandel KW - Sibirien Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-595847 ER - TY - THES A1 - Steppert, Isabel T1 - Entwicklung einer nichtinvasiven Diagnostikmethode zum Nachweis von Infektionserregern T1 - Development of a non-invasive diagnostic method for the identification of infectious pathogens N2 - Die aktuelle COVID-19-Pandemie zeigt deutlich, wie sich Infektionskrankheiten weltweit verbreiten können. Neben Viruserkrankungen breiten sich auch multiresistente bakterielle Erreger weltweit aus. Dementsprechend besteht ein hoher Bedarf, durch frühzeitige Erkennung Erkrankte zu finden und Infektionswege zu unterbrechen. Herkömmliche kulturelle Verfahren benötigen minimalinvasive bzw. invasive Proben und dauern für Screeningmaßnahmen zu lange. Deshalb werden schnelle, nichtinvasive Verfahren benötigt. Im klassischen Griechenland verließen sich die Ärzte unter anderem auf ihren Geruchssinn, um Infektionen und andere Krankheiten zu differenzieren. Diese charakteristischen Gerüche sind flüchtige organische Substanzen (VOC), die im Rahmen des Metabolismus eines Organismus entstehen. Tiere, die einen besseren Geruchssinn haben, werden trainiert, bestimmte Krankheitserreger am Geruch zu unterscheiden. Allerdings ist der Einsatz von Tieren im klinischen Alltag nicht praktikabel. Es bietet sich an, auf technischem Weg diese VOCs zu analysieren. Ein technisches Verfahren, diese VOCs zu unterscheiden, ist die Ionenmobilitätsspektrometrie gekoppelt mit einer multikapillaren Gaschromatographiesäule (MCC-IMS). Hier zeigte sich, dass es sich bei dem Verfahren um eine schnelle, sensitive und verlässliche Methode handelt. Es ist bekannt, dass verschiedene Bakterien aufgrund des Metabolismus unterschiedliche VOCs und damit eigene spezifische Gerüche produzieren. Im ersten Schritt dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die verschiedenen Bakterien in-vitro nach einer kurzen Inkubationszeitzeit von 90 Minuten anhand der VOCs differenziert werden können. Hier konnte analog zur Diagnose in biochemischen Testreihen eine hierarchische Klassifikation der Bakterien erfolgen. Im Gegensatz zu Bakterien haben Viren keinen eigenen Stoffwechsel. Ob virusinfizierte Zellen andere VOCs als nicht-infizierte Zellen freisetzen, wurde an Zellkulturen überprüft. Hier konnte gezeigt werden, dass sich die Fingerprints der VOCs in Zellkulturen infizierter Zellen mit Respiratorischen Synzytial-Viren (RSV) von nicht-infizierten Zellen unterscheiden. Virusinfektionen im intakten Organismus unterscheiden sich von den Zellkulturen dadurch, dass hier neben Veränderungen im Zellstoffwechsel auch durch Abwehrmechanismen VOCs freigesetzt werden können. Zur Überprüfung, inwiefern sich Infektionen im intakten Organismus ebenfalls anhand VOCs unterscheiden lassen, wurde bei Patienten mit und ohne Nachweis einer Influenza A Infektion als auch bei Patienten mit Verdacht auf SARS-CoV-2 (Schweres-akutes-Atemwegssyndrom-Coronavirus Typ 2) Infektion die Atemluft untersucht. Sowohl Influenza-infizierte als auch SARS-CoV-2 infizierte Patienten konnten untereinander und von nicht-infizierten Patienten mittels MCC-IMS Analyse der Atemluft unterschieden werden. Zusammenfassend erbringt die MCC-IMS ermutigende Resultate in der schnellen nichtinvasiven Erkennung von Infektionen sowohl in vitro als auch in vivo. N2 - The current COVID-19 pandemic demonstrates the worldwide spread of infectious diseases. Besides virus infections there is also a worldwide dissemination of multiresistant bacterial strains. Therefore, there is an urgent need for rapid non-invasive screening methods. There is an unmet need to cut infection chains by early detection of infected subjects. Conventional cultural methods require minimally invasive or invasive samples and are not feasible for mass screening due to a long analysis time. In classical Greece, physicians also used their olfactory senses to differentiate infections from other diseases. These characteristic odors are volatile organic compounds (VOC) produced by the metabolism of an organism. Animals with a much better olfactory sense have been trained to detect different germs by their odors. However, the use of sniffing animals is not practicable in clinical settings. A technical detection of VOCs is therefore desirable. One technical approach for the differentiation of VOCs is ion mobility spectrometry coupled with a multicapillary gas chromatography (MCC-IMS). It could be shown that this method is a rapid, sensitive, and reliable method. It is known that various bacteria produce VOCs by their metabolism and therefore different specific smells. By the MCC-IMS method, different bacterial species could be distinguished based on the VOCs after an incubation time as short as 90 minutes in vitro. Comparable to biochemical series of tests a decision tree for the classification of bacteria could be implemented. In contrast to bacteria viruses have no own metabolism and thus are dependent on the host metabolism. Cell cultures were used to determine whether virus-infected cells release other VOCs than non-infected cells. It could be shown here that cell cultures infected with respiratory syncytial virus (RSV) differ from non-infected cell cultures in VOC profiles. Unlike in cell cultures, in the intact organism changes in VOC profiles are not only dependent on cell metabolism alterations but also in defense mechanisms. To investigate infection induced VOC changes in intact organisms, nasal breath of patients with and without influenza A infection as well as of patients with suspected SARS-CoV-2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus type 2) infection were analyzed. It was proven that a breath analysis using a MCC-IMS is able to distinguish infected patients from non-infected as well as SARS-CoV-2 from influenza A infections. In summary, MCC-IMS delivers encouraging results in the rapid, non-invasive detection of infections in vitro as well as in vivo. KW - volatile organische Substanzen (VOCs) KW - Ionenmobilitätsspektrometrie (IMS) KW - nichtinvasive Diagnostik KW - bakterielle Infektionen KW - virale Infektionen KW - volatile organic compounds (VOCs) KW - ion mobility spectrometry (IMS) KW - non-invasive Diagnostics KW - bacterial infections KW - viral infections Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-575441 ER - TY - THES A1 - Eckert, Silvia T1 - Trait variation in changing environments: Assessing the role of DNA methylation in non-native plant species T1 - Merkmalsvariation in sich verändernden Umgebungen: Bewertung der Rolle der DNA-Methylierung bei nicht einheimischen Pflanzenarten N2 - The increasing introduction of non-native plant species may pose a threat to local biodiversity. However, the basis of successful plant invasion is not conclusively understood, especially since these plant species can adapt to the new range within a short period of time despite impoverished genetic diversity of the starting populations. In this context, DNA methylation is considered promising to explain successful adaptation mechanisms in the new habitat. DNA methylation is a heritable variation in gene expression without changing the underlying genetic information. Thus, DNA methylation is considered a so-called epigenetic mechanism, but has been studied in mainly clonally reproducing plant species or genetic model plants. An understanding of this epigenetic mechanism in the context of non-native, predominantly sexually reproducing plant species might help to expand knowledge in biodiversity research on the interaction between plants and their habitats and, based on this, may enable more precise measures in conservation biology. For my studies, I combined chemical DNA demethylation of field-collected seed material from predominantly sexually reproducing species and rearing offsping under common climatic conditions to examine DNA methylation in an ecological-evolutionary context. The contrast of chemically treated (demethylated) plants, whose variation in DNA methylation was artificially reduced, and untreated control plants of the same species allowed me to study the impact of this mechanism on adaptive trait differentiation and local adaptation. With this experimental background, I conducted three studies examining the effect of DNA methylation in non-native species along a climatic gradient and also between climatically divergent regions. The first study focused on adaptive trait differentiation in two invasive perennial goldenrod species, Solidago canadensis sensu latu and S. gigantea AITON, along a climate gradient of more than 1000 km in length in Central Europe. I found population differences in flowering timing, plant height, and biomass in the temporally longer-established S. canadensis, but only in the number of regrowing shoots for S. gigantea. While S. canadensis did not show any population structure, I was able to identify three genetic groups along this climatic gradient in S. gigantea. Surprisingly, demethylated plants of both species showed no change in the majority of traits studied. In the subsequent second study, I focused on the longer-established goldenrod species S. canadensis and used molecular analyses to infer spatial epigenetic and genetic population differences in the same specimens from the previous study. I found weak genetic but no epigenetic spatial variation between populations. Additionally, I was able to identify one genetic marker and one epigenetic marker putatively susceptible to selection. However, the results of this study reconfirmed that the epigenetic mechanism of DNA methylation appears to be hardly involved in adaptive processes within the new range in S. canadensis. Finally, I conducted a third study in which I reciprocally transplanted short-lived plant species between two climatically divergent regions in Germany to investigate local adaptation at the plant family level. For this purpose, I used four plant families (Amaranthaceae, Asteraceae, Plantaginaceae, Solanaceae) and here I additionally compared between non-native and native plant species. Seeds were transplanted to regions with a distance of more than 600 kilometers and had either a temperate-oceanic or a temperate-continental climate. In this study, some species were found to be maladapted to their own local conditions, both in non-native and native plant species alike. In demethylated individuals of the plant species studied, DNA methylation had inconsistent but species-specific effects on survival and biomass production. The results of this study highlight that DNA methylation did not make a substantial contribution to local adaptation in the non-native as well as native species studied. In summary, my work showed that DNA methylation plays a negligible role in both adaptive trait variation along climatic gradients and local adaptation in non-native plant species that either exhibit a high degree of genetic variation or rely mainly on sexual reproduction with low clonal propagation. I was able to show that the adaptive success of these non-native plant species can hardly be explained by DNA methylation, but could be a possible consequence of multiple introductions, dispersal corridors and meta-population dynamics. Similarly, my results illustrate that the use of plant species that do not predominantly reproduce clonally and are not model plants is essential to characterize the effect size of epigenetic mechanisms in an ecological-evolutionary context. N2 - Die zunehmende Eintragung nicht-heimischer Pflanzenarten kann eine Gefahr für die lokale Artenvielfalt darstellen. Die Grundlagen einer erfolgreichen pflanzlichen Ausbreitung sind jedoch nicht abschließend geklärt, zumal sich diese Arten innerhalb kurzer Zeit an das neue Verbreitungsgebiet anpassen können trotz anfänglich reduzierter genetischer Vielfalt der Startpopulationen. In diesem Kontext gilt DNA-Methylierung als vielversprechend, um erfolgreiche Anpassungsmechanismen im neuen Lebensraum zu erklären. Bei der DNA-Methylierung handelt es sich um eine vererbbare Variation der Genaktivität, ohne dass die zugrundeliegende genetische Erbinformation verändert wird. Damit gehört DNA-Methylierung zu den sogenannten epigenetischen Mechanismen, wurde jedoch vorwiegend bei sich klonal vermehrenden Pflanzenarten oder genetischen Modellpflanzen untersucht. Ein Verständnis dieses epigenetischen Mechanismus im Zusammenhang mit nicht-einheimischen, sich vorwiegend sexuell reproduzierenden Pflanzenarten erweitert das Wissen in der Biodiversitätsforschung zur Interaktion zwischen Pflanzen und ihrem Lebensraum und kann, darauf aufbauend, präzisere Maßnahmen in der Naturschutzbiologie ermöglichen. Für meine Studien kombinierte ich die chemische DNA-Demethylierung von im Freiland gesammeltem Samenmaterial sich vorwiegend sexuell fortpflanzender Arten und die Aufzucht unter gemeinsamen klimatischen Bedingungen, um DNA-Methylierung im ökologisch-evolutionären Kontext zu untersuchen. Der Kontrast von chemisch behandelten (demethylierten) Pflanzen, deren Methylierungsvariation nun künstlich verringert war, und unbehandelten Kontrollpflanzen derselben Art ermöglichte mir die Auswirkung dieses Mechanismus auf adaptive Merkmalsvariationen und lokale Anpassung zu studieren. Vor diesem experimentellen Hintergrund führte ich drei Studien durch, um die Auswirkung von DNA-Methylierung bei nicht-einheimischen Pflanzenarten entlang eines klimatischen Gradienten und zwischen zwei klimatisch unterschiedlichen Regionen zu untersuchen. Die erste Studie konzentrierte sich auf adaptive Merkmalsveränderungen bei Nachkommen von zwei invasiven, mehrjährigen Goldrutenarten, Solidago canadensis sensu latu und S. gigantea AITON, entlang eines Klimagradienten von mehr als 1000 km Länge in Zentraleuropa. Ich fand graduelle Unterschiede im Blühzeitpunkt, in der Pflanzenhöhe und der Biomasse bei der zeitlich länger etablierten S. canadensis, bei S. gigantea jedoch nur in der Anzahl der nachwachsenden Triebe. Während S. canadensis keinerlei Populationsstruktur aufwies, konnte ich bei S. gigantea drei genetische Gruppen entlang dieses Klimagradienten identifizieren. Überraschenderweise zeigten demethylierte Pflanzen beider Arten keine Veränderung in der überwiegenden Anzahl der untersuchten Merkmale. In der darauffolgenden zweiten Studie konzentrierte ich mich auf die länger etablierte Goldrutenart S. canadensis und verwendete molekulare Analysen, um räumliche epigenetische und genetische Populationunterschiede aus den Exemplaren der vorhergehenden Studie abzuleiten. Ich fand schwache genetische aber keine epigenetische räumliche Variation zwischen den Populationen. Zusätzlich konnte ich einen genetischen und einen epigenetischen Marker identifizieren, welcher potentiell unter Selektion stehen könnte. Allerdings bestätigten die Ergebnisse dieser Studie erneut, dass DNA-Methylierung bei S. canadensis kaum in die Anpassung an das neue Verbreitungsgebiet involviert zu sein scheint. Schließlich führte ich eine dritte Studie durch, in welcher ich Samen kurzlebiger Pflanzenarten reziprok zwischen zwei klimatisch unterschiedlichen Regionen in Deutschland transplantierte, um lokale Anpassung auf Ebene der Pflanzenfamilien zu untersuchen. Zu diesem Zweck nutze ich vier Pflanzenfamilien (Amaranthaceae, Asteraceae, Plantaginaceae, Solanaceae), wobei ich hier auch zwischen nicht-heimischen und heimischen Pflanzenarten verglich. Beide Regionen lagen mehr als 600 Kilometer voneinander entfernt und wiesen entweder ein gemäßigt-ozeanisches oder gemäßigt-kontinentales Klima auf. In dieser Studie zeigte sich für einige—sowohl nicht-einheimische als auch einhimische—Arten eine Fehlanpassung an die eigenen lokalen Bedingungen. In demethylierten Individuen der untersuchten Pflanzenarten wirkte sich die DNA-Methylierung widersprüchlich, aber artspezifisch auf das Überleben und die Biomasseproduktion aus. Die Ergebnisse dieser Studie unterstreichen, dass DNA-Methylierung einen vernachlässigbaren Beitrag zur lokalen Anpassung bei den untersuchten nicht-heimischen, aber auch einheimischen Arten leistete. Zusammenfassend konnte ich mit dieser Arbeit festellen, dass DNA-Methylierung bei nicht-einheimischen Pflanzenarten eine untergeordnete Rolle sowohl bei der adaptiven Merkmalsvariation entlang von Klimagradienten als auch der lokalen Anpassung an klimatisch unterschiedliche Regionen spielt, wenn diese Pflanzenarten eine hohe genetische Vielfalt aufweisen und sich hauptsächlich sexuell vermehren. Ich konnte zeigen, dass der Anpassungserfolg dieser nicht-einheimischen Pflanzenarten kaum durch DNA-Methylierung erklärbar ist, sondern vielmehr eine mögliche Folge mehrfacher Eintragungen, von Ausbreitungskorridoren und Meta-Populationsdynamiken sein könnte. Die Ergebnisse dieser Studien verdeutlichen ebenso, dass die Verwendung von Pflanzenarten, die sich nicht überwiegend klonal vermehren und keine genetischen Modellpflanzen sind, unerlässlich ist, um die Effektstärke epigenetischer Mechanismen im ökologisch-evolutionären Kontext zu charakterisieren. KW - common-garden experiment KW - reciprocal transplant experiment KW - epigenetics KW - cytosine methylation KW - zebularine KW - adaptive differentiation KW - local adaptation KW - microsatellites KW - Solidago canadensis KW - Solidago gigantea KW - Amaranthus retroflexus KW - Chenopodium album KW - Erigeron canadensis KW - Erigeron annuus KW - Lactuca serriola KW - Senecio vulgaris KW - Sonchus oleraceus KW - Tripleurospermum inodorum KW - Veronica persica KW - Plantago major KW - Datura stramonium KW - Solanum nigrum KW - latitudinal clines KW - population structure KW - invasive KW - ruderal KW - non-native KW - Central Europe KW - Germany KW - AFLP KW - MSAP KW - spatial autocorrelation KW - genome scan KW - Gemeinschaftsgarten-Experiment KW - reziprokes Transplantationsexperiment KW - Epigenetik KW - Cytosin-Methylierung KW - Zebularin KW - adaptive Differenzierung KW - lokale Anpassung KW - Mikrosatelliten KW - Breitengrad KW - Ökokline KW - Populationsstruktur KW - invasiv KW - ruderal KW - nicht-einheimisch KW - Mitteleuropa KW - Deutschland KW - AFLP KW - MSAP KW - räumliche Autokorrelation KW - Genom-Scan Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-568844 ER - TY - THES A1 - Ziege, Ricardo T1 - Growth dynamics and mechanical properties of E. coli biofilms T1 - Wachstumsdynamik und mechanische Eigenschaften von E. coli Biofilmen N2 - Biofilms are complex living materials that form as bacteria get embedded in a matrix of self-produced protein and polysaccharide fibres. The formation of a network of extracellular biopolymer fibres contributes to the cohesion of the biofilm by promoting cell-cell attachment and by mediating biofilm-substrate interactions. This sessile mode of bacteria growth has been well studied by microbiologists to prevent the detrimental effects of biofilms in medical and industrial settings. Indeed, biofilms are associated with increased antibiotic resistance in bacterial infections, and they can also cause clogging of pipelines or promote bio-corrosion. However, biofilms also gained interest from biophysics due to their ability to form complex morphological patterns during growth. Recently, the emerging field of engineered living materials investigates biofilm mechanical properties at multiple length scales and leverages the tools of synthetic biology to tune the functions of their constitutive biopolymers. This doctoral thesis aims at clarifying how the morphogenesis of Escherichia coli (E. coli) biofilms is influenced by their growth dynamics and mechanical properties. To address this question, I used methods from cell mechanics and materials science. I first studied how biological activity in biofilms gives rise to non-uniform growth patterns. In a second study, I investigated how E. coli biofilm morphogenesis and its mechanical properties adapt to an environmental stimulus, namely the water content of their substrate. Finally, I estimated how the mechanical properties of E. coli biofilms are altered when the bacteria express different extracellular biopolymers. On nutritive hydrogels, micron-sized E. coli cells can build centimetre-large biofilms. During this process, bacterial proliferation and matrix production introduce mechanical stresses in the biofilm, which release through the formation of macroscopic wrinkles and delaminated buckles. To relate these biological and mechanical phenomena, I used time-lapse fluorescence imaging to track cell and matrix surface densities through the early and late stages of E. coli biofilm growth. Colocalization of high cell and matrix densities at the periphery precede the onset of mechanical instabilities at this annular region. Early growth is detected at this outer annulus, which was analysed by adding fluorescent microspheres to the bacterial inoculum. But only when high rates of matrix production are present in the biofilm centre, does overall biofilm spreading initiate along the solid-air interface. By tracking larger fluorescent particles for a long time, I could distinguish several kinematic stages of E. coli biofilm expansion and observed a transition from non-linear to linear velocity profiles, which precedes the emergence of wrinkles at the biofilm periphery. Decomposing particle velocities to their radial and circumferential components revealed a last kinematic stage, where biofilm movement is mostly directed towards the radial delaminated buckles, which verticalize. The resulting compressive strains computed in these regions were observed to substantially deform the underlying agar substrates. The co-localization of higher cell and matrix densities towards an annular region and the succession of several kinematic stages are thus expected to promote the emergence of mechanical instabilities at the biofilm periphery. These experimental findings are predicted to advance future modelling approaches of biofilm morphogenesis. E. coli biofilm morphogenesis is further anticipated to depend on external stimuli from the environment. To clarify how the water could be used to tune biofilm material properties, we quantified E. coli biofilm growth, wrinkling dynamics and rigidity as a function of the water content of the nutritive substrates. Time-lapse microscopy and computational image analysis revealed that substrates with high water content promote biofilm spreading kinetics, while substrates with low water content promote biofilm wrinkling. The wrinkles observed on biofilm cross-sections appeared more bent on substrates with high water content, while they tended to be more vertical on substrates with low water content. Both wet and dry biomass, accumulated over 4 days of culture, were larger in biofilms cultured on substrates with high water content, despite extra porosity within the matrix layer. Finally, the micro-indentation analysis revealed that substrates with low water content supported the formation of stiffer biofilms. This study shows that E. coli biofilms respond to the water content of their substrate, which might be used for tuning their material properties in view of further applications. Biofilm material properties further depend on the composition and structure of the matrix of extracellular proteins and polysaccharides. In particular, E. coli biofilms were suggested to present tissue-like elasticity due to a dense fibre network consisting of amyloid curli and phosphoethanolamine-modified cellulose. To understand the contribution of these components to the emergent mechanical properties of E. coli biofilms, we performed micro-indentation on biofilms grown from bacteria of several strains. Besides showing higher dry masses, larger spreading diameters and slightly reduced water contents, biofilms expressing both main matrix components also presented high rigidities in the range of several hundred kPa, similar to biofilms containing only curli fibres. In contrast, a lack of amyloid curli fibres provides much higher adhesive energies and more viscoelastic fluid-like material behaviour. Therefore, the combination of amyloid curli and phosphoethanolamine-modified cellulose fibres implies the formation of a composite material whereby the amyloid curli fibres provide rigidity to E. coli biofilms, whereas the phosphoethanolamine-modified cellulose rather acts as a glue. These findings motivate further studies involving purified versions of these protein and polysaccharide components to better understand how their interactions benefit biofilm functions. All three studies depict different aspects of biofilm morphogenesis, which are interrelated. The first work reveals the correlation between non-uniform biological activities and the emergence of mechanical instabilities in the biofilm. The second work acknowledges the adaptive nature of E. coli biofilm morphogenesis and its mechanical properties to an environmental stimulus, namely water. Finally, the last study reveals the complementary role of the individual matrix components in the formation of a stable biofilm material, which not only forms complex morphologies but also functions as a protective shield for the bacteria it contains. Our experimental findings on E. coli biofilm morphogenesis and their mechanical properties can have further implications for fundamental and applied biofilm research fields. N2 - Biofilme sind komplexe lebende Materialien, die sich bilden, wenn Bakterien in eine Matrix aus selbstproduzierten Protein- und Polysaccharidfasern eingebettet werden. Die Bildung eines Netzwerks aus extrazellulären Biopolymerfasern trägt zum Zusammenhalt des Biofilms bei, indem sie die Zell-Zell-Anhaftung fördert und die Wechselwirkungen zwischen Biofilm und Substrat vermittelt. Diese sessile Form des Bakterienwachstums wurde von Mikrobiologen eingehend untersucht, um die schädlichen Auswirkungen von Biofilmen in der Medizin und Industrie zu verhindern. Biofilme werden nämlich mit einer erhöhten Antibiotikaresistenz bei bakteriellen Infektionen in Verbindung gebracht, und sie können auch zur Verstopfung von Rohrleitungen führen oder Biokorrosion fördern. Biofilme sind jedoch auch für die Biophysik von Interesse, da sie während ihres Wachstums komplexe morphologische Muster bilden können. In jüngster Zeit werden auf dem aufstrebenden Gebiet der künstlich hergestellten lebenden Materialien die mechanischen Eigenschaften von Biofilmen auf verschiedenen Längenskalen untersucht und die Werkzeuge der synthetischen Biologie genutzt, um die Funktionen ihrer konstitutiven Biopolymere zu beeinflussen. In dieser Doktorarbeit soll geklärt werden, wie die Morphogenese von Escherichia coli (E. coli)-Biofilmen durch deren Wachstumsdynamik und mechanische Eigenschaften beeinflusst wird. Um dieser Frage nachzugehen, habe ich Methoden aus der Zellmechanik und der Materialwissenschaft verwendet. Zunächst habe ich untersucht, wie die biologische Aktivität in Biofilmen zu ungleichmäßigen Wachstumsmustern führt. In einer zweiten Studie untersuchte ich, wie sich die Morphogenese von E. coli-Biofilmen und ihre mechanischen Eigenschaften an einen Umweltstimulus, nämlich den Wassergehalt des Substrats, anpassen. Schließlich habe ich abgeschätzt, wie sich die mechanischen Eigenschaften von E. coli-Biofilmen verändern, wenn die Bakterien verschiedene extrazelluläre Biopolymere exprimieren. Auf nährstoffhaltigen Hydrogelen können mikrometergroße E. coli-Zellen zentimetergroße Biofilme bilden. Während dieses Prozesses führen die bakterielle Vermehrung und die Matrixproduktion zu mechanischen Spannungen im Biofilm, die sich durch die Bildung von makroskopischen Falten und delaminierten Knicken entladen. Um diese biologischen und mechanischen Phänomene miteinander in Beziehung zu setzen, habe ich mit Hilfe von Zeitraffer-Fluoreszenzaufnahmen die Zell- und Matrixoberflächendichte in den frühen und späten Phasen des E. coli-Biofilmwachstums verfolgt. Die Kolokalisierung hoher Zell- und Matrixdichten an der Peripherie geht dem Auftreten mechanischer Instabilitäten in diesem ringförmigen Bereich voraus. An diesem äußeren Ring wird ein frühes Wachstum festgestellt, das durch Zugabe von fluoreszierenden Mikrokugeln zum bakteriellen Inokulum analysiert wurde. Aber nur wenn im Zentrum des Biofilms hohe Raten der Matrixproduktion vorhanden sind, beginnt die Ausbreitung des gesamten Biofilms entlang der Feststoff-Luft-Grenzfläche. Indem ich größere fluoreszierende Partikel über einen längeren Zeitraum verfolgte, konnte ich mehrere kinematische Stadien der E. coli-Biofilmexpansion unterscheiden und einen Übergang von nichtlinearen zu linearen Geschwindigkeitsprofilen beobachten, der dem Auftreten von Falten an der Biofilmperipherie vorausgeht. Die Zerlegung der Partikelgeschwindigkeiten in ihre radialen und umlaufenden Komponenten ergab ein letztes kinematisches Stadium, in dem die Bewegung des Biofilms hauptsächlich auf die radialen delaminierten Knicke gerichtet ist, die sich vertikalisieren. Die in diesen Regionen berechneten Druckspannungen verformen die darunter liegenden Agarsubstrate erheblich. Die gleichzeitige Ansammlung höherer Zell- und Matrixdichten in einer ringförmigen Region und die Abfolge mehrerer kinematischer Stadien dürften somit das Entstehen mechanischer Instabilitäten an der Biofilm-Peripherie fördern. Diese experimentellen Ergebnisse werden voraussichtlich zukünftige Modellierungsansätze der Biofilmmorphogenese voranbringen. Die Morphogenese des E. coli-Biofilms wird voraussichtlich auch von externen Stimuli aus der Umwelt abhängen. Um zu klären, wie das Wasser zur Einstellung der Materialeigenschaften von Biofilmen genutzt werden könnte, haben wir das Wachstum, die Faltenbildung und die Steifigkeit von E. coli-Biofilmen in Abhängigkeit vom Wassergehalt der Nährsubstrate quantifiziert. Zeitraffermikroskopie und computergestützte Bildanalyse zeigten, dass Substrate mit hohem Wassergehalt die Ausbreitungskinetik des Biofilms fördern, während Substrate mit niedrigem Wassergehalt die Faltenbildung des Biofilms begünstigen. Die auf Biofilm-Querschnitten beobachteten Falten erschienen auf Substraten mit hohem Wassergehalt stärker gebogen, während sie auf Substraten mit niedrigem Wassergehalt eher vertikal verliefen. Sowohl die feuchte als auch die trockene Biomasse, die während der 4-tägigen Kultur akkumuliert wurde, war in Biofilmen, die auf Substraten mit hohem Wassergehalt gezüchtet wurden, größer, trotz der zusätzlichen Porosität innerhalb der Matrixschicht. Schließlich ergab die Mikroindentationsanalyse, dass Substrate mit niedrigem Wassergehalt die Bildung von steiferen Biofilmen begünstigten. Diese Studie zeigt, dass E. coli-Biofilme auf den Wassergehalt ihres Substrats reagieren, was für die Abstimmung ihrer Materialeigenschaften im Hinblick auf weitere Anwendungen genutzt werden könnte. Die Materialeigenschaften von Biofilmen hängen außerdem von der Zusammensetzung und Struktur der Matrix aus extrazellulären Proteinen und Polysacchariden ab. Insbesondere wurde vermutet, dass E. coli-Biofilme aufgrund eines dichten Fasernetzwerks aus Amyloid-Curli und Phosphoethanolamin-modifizierter Cellulose eine gewebeähnliche Elastizität aufweisen. Um den Beitrag dieser Komponenten zu den entstehenden mechanischen Eigenschaften von E. coli-Biofilmen zu verstehen, führten wir an Biofilmen, die aus Bakterien verschiedener Stämme gewachsen waren, Mikroeindrücke durch. Biofilme, die beide Hauptmatrixkomponenten enthalten, wiesen nicht nur eine höhere Trockenmasse, einen größeren Ausbreitungsdurchmesser und einen leicht verringerten Wassergehalt auf, sondern auch eine hohe Steifigkeit im Bereich von mehreren hundert kPa, ähnlich wie Biofilme, die nur Curli-Fasern enthalten. Das Fehlen von Amyloid-Curli-Fasern führt dagegen zu deutlich höheren Adhäsionsenergien und einem viskoelastischeren, flüssigkeitsähnlichen Materialverhalten. Die Kombination von Amyloid-Curli-Fasern und Phosphoethanolamin-modifizierten Cellulosefasern impliziert daher die Bildung eines Verbundmaterials, bei dem die Amyloid-Curli-Fasern den E. coli-Biofilmen Steifigkeit verleihen, während die Phosphoethanolamin-modifizierte Cellulose eher als Klebstoff wirkt. Diese Ergebnisse motivieren zu weiteren Studien mit gereinigten Versionen dieser Protein- und Polysaccharidkomponenten, um besser zu verstehen, wie ihre Interaktionen die Funktionen des Biofilms unterstützen. Alle drei Studien zeigen verschiedene Aspekte der Biofilm-Morphogenese, die miteinander verbunden sind. Die erste Arbeit zeigt den Zusammenhang zwischen ungleichmäßigen biologischen Aktivitäten und dem Auftreten mechanischer Instabilitäten im Biofilm auf. Die zweite Arbeit bestätigt die Anpassungsfähigkeit der Morphogenese des E. coli-Biofilms und seiner mechanischen Eigenschaften an einen Umweltreiz, nämlich Wasser. Die letzte Studie schließlich zeigt die komplementäre Rolle der einzelnen Matrixkomponenten bei der Bildung eines stabilen Biofilmmaterials, das nicht nur komplexe Morphologien bildet, sondern auch als Schutzschild für die darin enthaltenen Bakterien fungiert. Unsere experimentellen Erkenntnisse über die Morphogenese von E. coli-Biofilmen und ihre mechanischen Eigenschaften können weitere Auswirkungen auf grundlegende und angewandte Biofilm-Forschungsbereiche haben. KW - biofilm KW - E. coli KW - living materials KW - mechanobiology KW - E. coli KW - Biofilm KW - lebende Materialien KW - Mechanobiologie Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-559869 ER - TY - THES A1 - Oberkofler, Vicky T1 - Molecular basis of HS memory in Arabidopsis thaliana T1 - Die molekulare Basis des Hitzestress-Gedächtnisses in Arabidopsis thaliana N2 - Plants can be primed to survive the exposure to a severe heat stress (HS) by prior exposure to a mild HS. The information about the priming stimulus is maintained by the plant for several days. This maintenance of acquired thermotolerance, or HS memory, is genetically separable from the acquisition of thermotolerance itself and several specific regulatory factors have been identified in recent years. On the molecular level, HS memory correlates with two types of transcriptional memory, type I and type II, that characterize a partially overlapping subset of HS-inducible genes. Type I transcriptional memory or sustained induction refers to the sustained transcriptional induction above non-stressed expression levels of a gene for a prolonged time period after the end of the stress exposure. Type II transcriptional memory refers to an altered transcriptional response of a gene after repeated exposure to a stress of similar duration and intensity. In particular, enhanced re-induction refers to a transcriptional pattern in which a gene is induced to a significantly higher degree after the second stress exposure than after the first. This thesis describes the functional characterization of a novel positive transcriptional regulator of type I transcriptional memory, the heat shock transcription factor HSFA3, and compares it to HSFA2, a known positive regulator of type I and type II transcriptional memory. It investigates type I transcriptional memory and its dependence on HSFA2 and HSFA3 for the first time on a genome-wide level, and gives insight on the formation of heteromeric HSF complexes in response to HS. This thesis confirms the tight correlation between transcriptional memory and H3K4 hyper-methylation, reported here in a case study that aimed to reduce H3K4 hyper-methylation of the type II transcriptional memory gene APX2 by CRISPR/dCas9-mediated epigenome editing. Finally, this thesis gives insight into the requirements for a heat shock transcription factor to function as a positive regulator of transcriptional memory, both in terms of its expression profile and protein abundance after HS and the contribution of individual functional domains. In summary, this thesis contributes to a more detailed understanding of the molecular processes underlying transcriptional memory and therefore HS memory, in Arabidopsis thaliana. N2 - Pflanzen können darauf vorbereitet werden, einen schweren Hitzestress (HS) zu überleben, indem sie zuvor einem leichten HS ausgesetzt werden. Die Information über den Priming-Stimulus wird von der Pflanze mehrere Tage lang aufrechterhalten. Diese Aufrechterhaltung der erworbenen Thermotoleranz, das so genannte HS-Gedächtnis, ist genetisch vom Erwerb der Thermotoleranz selbst trennbar, und in den letzten Jahren wurden mehrere spezifische Regulierungsfaktoren identifiziert. Auf molekularer Ebene korreliert das HS-Gedächtnis mit zwei Arten von Transkriptionsgedächtnis, Typ I und Typ II, die eine sich teilweise überschneidende Untergruppe von HS-induzierbaren Genen charakterisieren. Das Transkriptionsgedächtnis vom Typ I oder die anhaltende Induktion bezieht sich auf die anhaltende Transkriptionsinduktion eines Gens über das Niveau der Expression im ungestressten Zustand hinaus über einen längeren Zeitraum nach dem Ende der Stressbelastung. Das Transkriptionsgedächtnis des Typs II bezieht sich auf eine veränderte Transkriptionsreaktion eines Gens nach wiederholter Exposition gegenüber einem Hitzestress von ähnlicher Dauer und Intensität. Insbesondere bezieht sich dabei die verstärkte Re-Induktion auf ein Transkriptionsmuster, bei dem ein Gen nach der zweiten Stressexposition in deutlich höherem Maße induziert wird als nach der ersten. Diese Arbeit beschreibt die funktionelle Charakterisierung eines neuartigen positiven Transkriptionsregulators des Typ-I-Transkriptionsgedächtnisses, des Hitzeschock-Transkriptionsfaktors HSFA3, und vergleicht ihn mit HSFA2, einem bekannten positiven Regulator des Typ-I- und Typ-II-Transkriptionsgedächtnisses. Die Arbeit untersucht das Typ-I-Transkriptionsgedächtnis und seine Abhängigkeit von HSFA2 und HSFA3 zum ersten Mal auf genomweiter Ebene und gibt Einblick in die Bildung heteromerer HSF-Komplexe als Reaktion auf HS. Diese Arbeit bestätigt den engen Zusammenhang zwischen transkriptionellem Gedächtnis und H3K4-Hypermethylierung, über den hier in einer Fallstudie berichtet wird, die darauf abzielt, die H3K4-Hypermethylierung des Typ-II-Transkriptionsgedächtnisgens APX2 durch CRISPR/dCas9-vermitteltes Epigenom-Editing zu reduzieren. Schließlich gibt diese Arbeit einen Einblick in die Anforderungen, die ein Hitzeschock-Transkriptionsfaktor erfüllen muss, damit er als positiver Regulator des Transkriptionsgedächtnisses fungieren kann, und zwar sowohl in Bezug auf sein Expressionsprofil und seine Proteinabundanz nach HS als auch in Bezug auf den Beitrag seiner einzelnen funktionellen Domänen. Zusammenfassend trägt diese Arbeit zu einem genaueren Verständnis der molekularen Prozesse bei, die dem Transkriptionsgedächtnis und damit dem HS-Gedächtnis in Arabidopsis thaliana zugrunde liegen. KW - Arabidopsis thaliana KW - abiotic stress KW - heat stress memory KW - transcription factors KW - HSF KW - epigenome editing KW - histone methylation KW - H3K4me KW - Arabidopsis thaliana KW - H3K4me KW - Hitzeschock-Transkriptionsfaktor KW - abiotischer Stress KW - Epigenom Editierung KW - Hitzestress-Gedächtnis KW - Histon Methylierung KW - Transkriptionsfaktoren Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-569544 ER - TY - THES A1 - Demin, Paul T1 - Blaulicht-aktivierbares Proteinexpressionssystem in Saccharomyces cerevisiae T1 - Blue light-inducible protein expression system in Saccharomyces cerevisiae N2 - Synthetische Transkriptionsfaktoren bestehen wie natürliche Transkriptionsfaktoren aus einer DNA-Bindedomäne, die sich spezifisch an die Bindestellensequenz vor dem Ziel-Gen anlagert, und einer Aktivierungsdomäne, die die Transkriptionsmaschinerie rekrutiert, sodass das Zielgen exprimiert wird. Der Unterschied zu den natürlichen Transkriptionsfaktoren ist, sowohl dass die DNA-Bindedomäne als auch die Aktivierungsdomäne wirtsfremd sein können und dadurch künstliche Stoffwechselwege im Wirt, größtenteils chemisch, induziert werden können. Optogenetische synthetische Transkriptionsfaktoren, die hier entwickelt wurden, gehen einen Schritt weiter. Dabei ist die DNA-Bindedomäne nicht mehr an die Aktivierungsdomäne, sondern mit dem Blaulicht-Photorezeptor CRY2 gekoppelt. Die Aktivierungsdomäne wurde mit dem Interaktionspartner CIB1 fusioniert. Unter Blaulichtbestrahlung dimerisieren CRY2 und CIB1 und damit einhergehend die beiden Domänen, sodass ein funktionsfähiger Transkriptionsfaktor entsteht. Dieses System wurde in die Saccharomyces cerevisiae genomisch integriert. Verifiziert wurde das konstruierte System mit Hilfe des Reporters yEGFP, welcher durchflusszytometrisch detektiert werden konnte. Es konnte gezeigt werden, dass die yEGFP Expression variabel gestaltet werden kann, indem unterschiedlich lange Blaulichtimpulse ausgesendet wurden, die DNA-Bindedomäne, die Aktivierungsdomäne oder die Anzahl der Bindestellen, an dem sich die DNA-Bindedomäne anlagert, verändert wurden. Um das System für industrielle Anwendungen attraktiv zu gestalten, wurde das System vom Deepwell-Maßstab auf Photobioreaktor-Maßstab hochskaliert. Außerdem erwies sich das Blaulichtsystem sowohl im Laborstamm YPH500 als auch im industriell oft verwendeten Hefestamm CEN.PK als funktional. Des Weiteren konnte ein industrierelevante Protein ebenso mit Hilfe des verifizierten Systems exprimiert werden. Schlussendlich konnte in dieser Arbeit das etablierte Blaulicht-System erfolgreich mit einem Rotlichtsystem kombiniert werden, was zuvor noch nicht beschrieben wurde. N2 - Like natural transcription factors, synthetic transcription factors consist of a DNA-binding domain that attaches specifically to the binding site sequence in front of the target gene, and an activation domain that recruits the transcription machinery so that the target gene is expressed. The difference to natural transcription factors is that both the DNA binding domain and the activation domain can be host foreign and artificial metabolic pathways, mostly chemically, can be induced in the host. In this work, new optogenetic synthetic transcription factors were developed so that chemical induction becomes obsolete. The DNA binding domain is no longer linked to the activation domain but to the blue light photoreceptor CRY2. The activation domain was fused to the interaction partner CIB1. Upon blue light irradiation, CRY2 and CIB1 dimerize and thus the two domains, resulting in a functional transcription factor. Six different prokaryotic DNA-binding domains and a total of two different activation domains, viral and fungal, were recombined with CRY2 and CIB1, respectively, and genomically integrated into the eukaryotic cell factory Saccharomyces cerevisiae. Since the blue light dimerization is based on the chromophore FAD, which the yeast can synthesize itself, only the blue light had to be switched on for the induction. The constructed system was verified with the help of the reporter yEGFP, which could be detected by flow cytometry. It could be shown that the yEGFP expression could be made variable by emitting blue light pulses of different lengths, changing the DNA binding domain, the activation domain or the copy number of binding sites at which the DNA binding domain attaches. To make the system attractive for industrial applications, the system was scaled up from deepwell scale to photobioreactor scale. In addition, the blue light system proved to be functional both in the laboratory strain YPH500 and in the yeast strain CEN.PK, which is often used industrially. Furthermore, the industrially relevant protein VP1 could also be expressed using the verified system. Due to its great flexibility, the blue light system established here was christened/named FLIRT (Flexible Blue Light Induced Transcription). Finally, in this work, the established flirt system could be successfully combined with a red light system, which has not been described before. KW - Synthetische Biologie KW - Hefe KW - Saccharomyces cerevisiae KW - Blaulicht KW - Transkriptionsfaktoren KW - Bioreaktor KW - bioreactor KW - blue light KW - budding yeast KW - Saccharomyces cerevisiae KW - synthetic biology KW - transcription factors Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-559696 ER - TY - THES A1 - Schulte, Luise T1 - Dynamics of Larix (Mill.) species in Siberia during the last 50,000 years inferred from sedimentary ancient DNA T1 - Die Dynamik sibirischer Lärchenarten (Larix Mill.) während der der letzten 50.000 Jahre, untersucht mittels sedimentärer alter DNA N2 - The deciduous needle tree larch (Larix Mill.) covers more than 80% of the Asian boreal forests. Only a few Larix species constitute the vast forests and these species differ markedly in their ecological traits, most importantly in their ability to grow on and stabilize underlying permafrost. The pronounced dominance of the summergreen larches makes the Asian boreal forests unique, as the rest of the northern hemisphere boreal forests is almost exclusively dominated by evergreen needle-leaf forests. Global warming is impacting the whole world but is especially pronounced in the arctic and boreal regions. Although adapted to extreme climatic conditions, larch forests are sensitive to varying climatic conditions. By their sheer size, changes in Asian larch forests as range shifts or changes in species composition and the resulting vegetation-climate feedbacks are of global relevance. It is however still uncertain if larch forests will persist under the ongoing warming climate or if they will be replaced by evergreen forests. It is therefore of great importance to understand how these ecosystems will react to future climate warmings and if they will maintain their dominance. One step in the better understanding of larch dynamics is to study how the vast dominant forests developed and why they only established in northern Asia. A second step is to study how the species reacted to past changes in the climate. The first objective of this thesis was to review and identify factors promoting Asian larch dominance. I achieved this by synthesizing and comparing reported larch occurrences and influencing components on the northern hemisphere continents in the present and in the past. The second objective was to find a possibility to directly study past Larix populations in Siberia and specifically their genetic variation, enabling the study of geographic movements. For this, I established chloroplast enrichment by hybridization capture from sedimentary ancient DNA (sedaDNA) isolated from lake sediment records. The third objective was to use the established method to track past larch populations, their glacial refugia during the Last Glacial Maximum (LGM) around 21,000 years before present (ka BP), and their post-glacial migration patterns. To study larch promoting factors, I compared the present state of larch species ranges, areas of dominance, their bioclimatic niches, and the distribution on different extents and thaw depths of permafrost. The species comparison showed that the bioclimatic niches greatly overlap between the American and Asian species and that it is only in the extremely continental climates in which only the Asian larch species can persist. I revealed that the area of dominance is strongly connected to permafrost extent but less linked to permafrost seasonal thaw depths. Comparisons of the paleorecord of larch between the continents suggest differences in the recolonization history. Outside of northern Asia and Alaska, glacial refugial populations of larch were confined to the southern regions and thus recolonization could only occur as migration from south to north. Alaskan larch populations could not establish wide-range dominant forest which could be related to their own genetically depletion as separated refugial population. In Asia, it is still unclear whether or not the northern refugial populations contributed and enhanced the postglacial colonization or whether they were replaced by populations invading from the south in the course of climate warming. Asian larch dominance is thus promoted partly by adaptions to extremely continental climates and by adaptations to grow on continuous permafrost but could be also connected to differences in glacial survival and recolonization history of Larix species. Except for extremely rare macrofossil findings of fossilized cones, traditional methods to study past vegetation are not able to distinguish between larch species or populations. Within the scope of this thesis, I therefore established a method to retrieve genetic information of past larch populations to distinguish between species. Using the Larix chloroplast genome as target, I successfully applied the method of DNA target enrichment by hybridization capture on sedaDNA samples from lake records and showed that it is able to distinguish between larch species. I then used the method on samples from lake records from across Siberia dating back up to 50 ka BP. The results allowed me to address the question of glacial survival and post-glacial recolonization mode in Siberian larch species. The analyzed pattern showed that LGM refugia were almost exclusively constituted by L. gmelinii, even in sites of current L. sibirica distribution. For included study sites, L. sibirica migrated into its extant northern distribution area only in the Holocene. Consequently, the post-glacial recolonization of L. sibirica was not enhanced by northern glacial refugia. In case of sites in extant distribution area of L. gmelinii, the absence of a genetic turn-over point to a continuous population rather than an invasion of southern refugia. The results suggest that climate has a strong influence on the distribution of Larix species and that species may also respond differently to future climate warming. Because species differ in their ecological characteristics, species distribution is also relevant with respect to further feedbacks between vegetation and climate. With this thesis, I give an overview of present and past larch occurrences and evaluate which factors promote their dominance. Furthermore, I provide the tools to study past Larix species and give first important insights into the glacial history of Larix populations. N2 - Der sommergrüne Nadelbaum Lärche (Larix Mill.) bedeckt mehr als 80 % der Fläche der borealen Wälder Asiens. Nur wenige Lärchenarten bilden ausgedehnte Wälder und diese Arten unterscheiden sich deutlich in ihren ökologischen Eigenschaften, vor allem in ihrer Fähigkeit, auf Permafrost zu wachsen und diesen zu stabilisieren. Die ausgeprägte Dominanz der sommergrünen Lärchen macht die asiatischen borealen Wälder einzigartig, da der Rest der borealen Wälder der Nordhalbkugel fast ausschließlich von immergrünen Nadelwäldern dominiert wird. Die Klimaerwärmung wirkt sich auf die ganze Welt aus, ist aber in den arktischen und borealen Regionen besonders ausgeprägt. Obwohl die Lärchenwälder an extreme klimatische Bedingungen angepasst sind, reagieren sie empfindlich auf klimatische Schwankungen. Aufgrund ihrer schieren Größe sind Veränderungen in asiatischen Lärchenwäldern, wie z. B. Verschiebungen des Verbreitungsgebiets oder Veränderungen in der Artenzusammensetzung und die daraus resultierenden Rückkopplungen zwischen Vegetation und Klima, von globaler Bedeutung. Es ist jedoch noch ungewiss, ob die Lärchenwälder unter der fortschreitenden Klimaerwärmung bestehen bleiben oder durch immergrüne Wälder ersetzt werden. Es ist daher von großer Bedeutung zu verstehen, wie diese Ökosysteme auf die künftige Klimaerwärmung reagieren werden und ob sie ihre Dominanz behalten werden. Ein Schritt zum besseren Verständnis der Lärchendynamik besteht darin, zu untersuchen, wie die riesigen dominanten Wälder von heute entstanden sind und warum sie sich nur in Nordasien etabliert haben. In einem zweiten Schritt soll untersucht werden, wie die Art auf vergangene Klimaveränderungen reagiert hat. Das erste Ziel dieser Arbeit bestand darin, die Faktoren zu ermitteln, die die Dominanz der asiatischen Lärche begünstigen. Dies erreichte ich, indem ich die dokumentierten Lärchenvorkommen und die sie beeinflussenden Komponenten auf den Kontinenten der nördlichen Hemisphäre in der Gegenwart und in der Vergangenheit gesammelt und verglichen habe. Das zweite Ziel bestand darin, eine Möglichkeit zu finden, frühere Lärchenpopulationen in Sibirien und insbesondere ihre genetische Variation direkt zu studieren, um geografische Bewegungen untersuchen zu können. Dafür etablierte ich die Methode der Anreicherung von Chloroplasten durch Hybridisierung von alter sedimentärer DNA (sedaDNA) isoliert aus Seesedimenten. Das dritte Ziel bestand darin, die etablierte Methode zu nutzen, um vergangene Lärchenpopulationen, ihre eiszeitlichen Refugien während des letzten glazialen Maximums (LGM) um ca. 21.000 Jahre vor der Gegenwart (ka BP) und ihre nacheiszeitlichen Migrationsmuster zu verfolgen. Um die Faktoren zu untersuchen, die die Ausbreitung der Lärche begünstigen, verglich ich den gegenwärtigen Stand der Verbreitungsgebiete der Lärchenarten, die Gebiete, in denen sie vorherrschen, ihre bioklimatischen Nischen und die Verteilung auf verschiedene Ausdehnungen und Auftautiefen des Permafrosts. Der Artenvergleich zeigte, dass sich die bioklimatischen Nischen der amerikanischen und asiatischen Arten stark überschneiden und dass nur in den extrem kontinentalen Klimazonen ausschließlich die asiatischen Lärchenarten überleben können. Es zeigte sich, dass das Verbreitungsgebiet stark mit der Permafrostausdehnung zusammenhängt, aber weniger mit der saisonalen Auftautiefe des Permafrosts. Der Vergleich vergangener Lärchenvorkommen zwischen den Kontinenten deutet auf Unterschiede in der Rekolonisationsgeschichte hin. Außerhalb Nordasiens und Alaskas waren die eiszeitlichen Lärchenpopulationen auf die südlichen Regionen beschränkt, so dass die Wiederbesiedlung nur als Wanderung von Süden nach Norden erfolgen konnte. Die Lärchenpopulationen in Alaska konnten keinen weiträumig dominanten Wald etablieren, was mit ihrer eigenen genetischen Verarmung als abgeschiedene Refugialpopulation zusammenhängen könnte. In Asien ist noch unklar, ob die nördlichen Refugialpopulationen zur nacheiszeitlichen Besiedlung beigetragen und diese verstärkt haben oder ob sie im Zuge der Klimaerwärmung durch von Süden eindringende Populationen ersetzt wurden. Die Dominanz der asiatischen Lärche wird also zum Teil durch Anpassungen an das extrem kontinentale Klima und durch Anpassungen an das Wachstum auf kontinuierlichem Permafrost begünstigt, könnte aber auch mit Unterschieden in der glazialen Überlebens- und Rekolonisationsgeschichte der Larix-Arten zusammenhängen. Abgesehen von den äußerst seltenen Makrofossilienfunden versteinerter Zapfen sind die herkömmlichen Methoden zur Untersuchung der vergangenen Vegetation nicht in der Lage, zwischen Lärchenarten oder -populationen zu unterscheiden. Im Rahmen dieser Arbeit habe ich daher eine Methode zur Gewinnung genetischer Informationen früherer Lärchenpopulationen entwickelt, um zwischen den Arten zu unterscheiden. Unter Verwendung des Larix-Chloroplastengenoms habe ich die Methode der DNA-Anreicherung durch Hybridisierung erfolgreich auf sedaDNA-Proben aus See-sedimentbohrkernen angewandt und gezeigt, dass die Methode erlaubt zwischen Lärchenarten zu unterscheiden. Anschließend wendete ich die Methode auf Proben aus Seen in ganz Sibirien an, die bis zu 50 ka BP zurückreichen. Anhand der Ergebnisse konnte ich zur Beantwortung der Frage beitragen, welche sibirische Lärchenarten während des LGM überlebten und wie die postglaziale Wiederbesiedlung stattfand. Das analysierte Muster zeigte, dass die LGM-Refugien fast ausschließlich von L. gmelinii gebildet wurden, selbst an Orten, an denen heute L. sibirica verbreitet ist. In den untersuchten Gebieten ist L. sibirica erst im Holozän in ihr heutiges nördliches Verbreitungsgebiet eingewandert. Folglich wurde die nacheiszeitliche Wiederbesiedlung von L. sibirica nicht durch nördliche eiszeitliche Refugien gefördert. Im Falle der Standorte im heutigen Verbreitungsgebiet von L. gmelinii deutet das Fehlen eines Wechsels genetischer Variation eher auf eine kontinuierliche Population als auf eine Invasion aus südlichen Refugien hin. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass das Klima einen starken Einfluss auf die Verbreitung von Larix-Arten hat und die Arten auch auf zukünftige Klimaerwärmung unterschiedlich reagieren könnten. Da die Arten sich in ihren ökologischen Eigenschaften unterscheiden, ist eine Änderung in der Verbreitung der Arten auch im Hinblick auf weitere Rückkopplungen zwischen Vegetation und Klima relevant. In dieser Arbeit gebe ich einen Überblick über die heutigen und früheren Lärchenvorkommen und bewerte, welche Faktoren ihre Dominanz begünstigen. Darüber hinaus stelle ich eine Methode zur Untersuchung vergangener Lärchenarten bereit und gebe erste wichtige Einblicke in ihre glaziale Geschichte. KW - ancient DNA KW - ancient sedimentary DNA KW - Larix KW - larch KW - glacial refugia KW - postglacial recolonization KW - phylogeography KW - hybridization capture KW - target enrichment KW - shotgun sequencing KW - chloroplast KW - Siberia KW - Larix KW - Sibirien KW - alte DNA KW - alte sedimentäre DNA KW - Chloroplast KW - glaziale Refugien KW - Lärche KW - Phylogeographie KW - nacheiszeitliche Wiederbesiedlung KW - Shotgun Sequenzierung Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-558782 ER - TY - THES A1 - Tegtmeier, Laura T1 - Functional analysis of ENTH domain proteins T1 - Funktionelle Analyse der ENTH Proteinen N2 - In plant cells, subcellular transport of cargo proteins relies to a large extent on post-Golgi transport pathways, many of which are mediated by clathrin-coated vesicles (CCVs). Vesicle formation is facilitated by different factors like accessory proteins and adaptor protein complexes (APs), the latter serving as a bridge between cargo proteins and the coat protein clathrin. One type of accessory proteins is defined by a conserved EPSIN N-TERMINAL HOMOLOGY (ENTH) domain and interacts with APs and clathrin via motifs in the C-terminal part. In Arabidopsis thaliana, there are three closely related ENTH domain proteins (EPSIN1, 2 and 3) and one highly conserved but phylogenetically distant outlier, termed MODIFIED TRANSPORT TO THE VACUOLE1 (MTV1). In case of the trans-Golgi network (TGN) located MTV1, clathrin association and a role in vacuolar transport have been shown previously (Sauer et al. 2013). In contrast, for EPSIN1 and EPSIN2 limited functional and localization data were available; and EPSIN3 remained completely uncharacterized prior to this study (Song et al. 2006; Lee et al. 2007). The molecular details of ENTH domain proteins in plants are still unknown. In order to systematically characterize all four ENTH proteins in planta, we first investigated expression and subcellular localization by analysis of stable reporter lines under their endogenous promotors. Although all four genes are ubiquitously expressed, their subcellular distribution differs markedly. EPSIN1 and MTV1 are located at the TGN, whereas EPSIN2 and EPSIN3 are associated with the plasma membrane (PM) and the cell plate. To examine potential functional redundancy, we isolated knockout T-DNA mutant lines and created all higher order mutant combinations. The clearest evidence for functional redundancy was observed in the epsin1 mtv1 double mutant, which is a dwarf displaying overall growth reduction. These findings are in line with the TGN localization of both MTV1 and EPS1. In contrast, loss of EPSIN2 and EPSIN3 does not result in a growth phenotype compared to wild type, however, a triple knockout of EPSIN1, EPSIN2 and EPSIN3 shows partially sterile plants. We focused mainly on the epsin1 mtv1 double mutant and addressed the functional role of these two genes in clathrin-mediated vesicle transport by comprehensive molecular, biochemical, and genetic analyses. Our results demonstrate that EPSIN1 and MTV1 promote vacuolar transport and secretion of a subset of cargo. However, they do not seem to be involved in endocytosis and recycling. Importantly, employing high-resolution imaging, genetic and biochemical experiments probing the relationship of the AP complexes, we found that EPSIN1/AP1 and MTV1/AP4 define two spatially and molecularly distinct subdomains of the TGN. The AP4 complex is essential for MTV1 recruitment to the TGN, whereas EPSIN1 is independent of AP4 but presumably acts in an AP1-dependent framework. Our findings suggest that this ENTH/AP pairing preference is conserved between animals and plants. N2 - In pflanzlichen Zellen hängt der Transport von Proteinen von vielen dem Golgi-Apparat nachfolgenden Transportwegen ab, welche zum Großteil durch Clathrin-bedeckte Vesikel (CCV) vermittelt werden. Die Vesikelbildung wird durch verschiedene Helferproteine und Adapterproteinkomplexe (AP) ermöglicht. Letztere dienen als Brücke zwischen den Transportproteinen und dem Hüllprotein Clathrin. Eine Gruppe von Hilfsproteinen interagiert mit APs und Clathrin mittels des C-Terminus und ist durch eine konservierte EPSIN N-TERMINAL HOMOLOGY (ENTH)-Domäne definiert. In Arabidopsis thaliana wurden drei eng verwandte ENTH-Domänenproteine (EPSIN1, 2 und 3) sowie ein stark konservierter phylogenetischer Außenseiter MODIFIED TRANSPORT TO THE VACUOLE1 (MTV1), gefunden. Im Falle des im trans-Golgi Netzwerk (TGN) lokalisierten MTV1 wurde die Assoziation mit Clathrin und eine Rolle im vakuolären Transport nachgewiesen (Sauer et al. 2013). Im Vergleich dazu gab es für EPSIN1 und EPSIN2 nur limitierte Daten und EPSIN3 war bisher unerforscht (Song et al. 2006; Lee et al. 2007). Die Funktionen der ENTH-Domänenproteine in Pflanzen blieben unklar. Um die vier ENTH-Proteine in planta zu charakterisieren, untersuchten wir zunächst deren Expression sowie subzelluläre Lokalisation anhand stabiler Reporterlinien, welche Fusionsproteine vom jeweils endogenen Promotor exprimierten. Obwohl unsere Ergebnisse zeigten, dass alle ENTH-Domänenproteine ubiquitär exprimiert wurden, war die subzelluläre Verteilung deutlich unterschiedlich. EPSIN1 und MTV1 lokalisierten am TGN, während EPSIN2 und EPSIN3 in der Nähe der Plasmamembran (PM) und der Zellplatte zu finden waren. Um eine mögliche funktionelle Redundanz zu untersuchen, nutzten wir komplette Funktionsverlust-Mutanten und erzeugten daraus Mutanten höherer Ordnung. Deutliche Hinweise auf funktionelle Redundanz ergab die epsin1 mtv1-Doppelmutante, die eine starke Wachstumsreduktion aufwies, was zur Lokalisierung beider Proteine am TGN passte. Im Gegensatz dazu verursachte der Verlust von EPSIN2 und EPSIN3 keinen vom Wildtyp abweichenden Phänotyp, jedoch zeigte die epsin1 epsin2 epsin3-Dreifachmutante partielle Sterilität. Wir fokussierten uns daher hauptsächlich auf epsin1 mtv1 und untersuchten die funktionelle Rolle im Clathrin-vermittelten Vesikeltransport durch vergleichende molekulare, biochemische und genetische Analysen. EPSIN1 und MTV1 unterstützten den vakuolären und sekretorischen Transport, waren aber nicht an Endozytose oder Recycling beteiligt. Durch hochauflösende Mikroskopie, genetische und biochemische Analysen der Beziehung zwischen verschiedenen AP-Komplexen und EPSIN1/MTV1 konnten wir zeigen, dass EPSIN1/AP1 und MTV1/AP4 zwei räumlich und molekular distinkte Subdomänen des TGNs definierten. AP4 war essenziell für die MTV1- jedoch nicht die EPSIN1-Rekrutierung zum TGN und EPSIN1 assoziierte bevorzugt mit AP1. Ähnliche Beobachtungen an EPSIN1- und MTV1-Homologen in tierischen Zellen legen eine evolutionär konservierte Paarung von AP-Komplexen und ENTH-Proteinen nahe. KW - vesicle transport KW - trans-Golgi network KW - trans-Golgi Netzwerk KW - clathrin-coated vesicles KW - Clathrin-bedeckte Vesikel KW - ENTH domain proteins KW - ENTH-Domänenproteine Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-570049 ER - TY - THES A1 - Kath, Nadja Jeanette T1 - Functional traits determine biomass dynamics, coexistence and energetics in plankton food webs N2 - Plankton food webs are the basis of marine and limnetic ecosystems. Especially aquatic ecosystems of high biodiversity provide important ecosystem services for humankind as providers of food, coastal protection, climate regulation, and tourism. Understanding the dynamics of biomass and coexistence in these food webs is a first step to understanding the ecosystems. It also lays the foundation for the development of management strategies for the maintenance of the marine and freshwater biodiversity despite anthropogenic influences. Natural food webs are highly complex, and thus often equally complex methods are needed to analyse and understand them well. Models can help to do so as they depict simplified parts of reality. In the attempt to get a broader understanding of the complex food webs, diverse methods are used to investigate different questions. In my first project, we compared the energetics of a food chain in two versions of an allometric trophic network model. In particular, we solved the problem of unrealistically high trophic transfer efficiencies (up to 70%) by accounting for both basal respiration and activity respiration, which decreased the trophic transfer efficiency to realistic values of ≤30%. Next in my second project I turned to plankton food webs and especially phytoplankton traits. Investigating a long-term data set from Lake Constance we found evidence for a trade-off between defence and growth rate in this natural phytoplankton community. I continued working with this data set in my third project focusing on ciliates, the main grazer of phytoplankton in spring. Boosted regression trees revealed that temperature and predators have the highest influence on net growth rates of ciliates. We finally investigated in my fourth project a food web model inspired by ciliates to explore the coexistence of plastic competitors and to study the new concept of maladaptive switching, which revealed some drawbacks of plasticity: faster adaptation led to higher maladaptive switching towards undefended phenotypes which reduced autotroph biomass and coexistence and increased consumer biomass. It became obvious that even well-established models should be critically questioned as it is important not to forget reality on the way to a simplistic model. The results showed furthermore that long-term data sets are necessary as they can help to disentangle complex natural processes. Last, one should keep in mind that the interplay between models and experiments/ field data can deliver fruitful insights about our complex world. N2 - Plankton-Nahrungsnetze sind die Grundlage mariner und limnischer Ökosysteme. Besonders die aquatischen Ökosysteme mit hoher Biodiversität erbringen wichtige Ökosystemdienstleistungen für uns Menschen wie beispielsweise die Bereitstellung von Nahrung, Küstenschutz, Klimaregulation sowie Tourismus. Die Dynamiken und die Koexistenz der Arten in diesen Ökosystemen zu verstehen, ist ein erster Schritt für die Entwicklung von Möglichkeiten zum Schutz ihrer Biodiversität. Aufgrund der hohen Komplexität natürlicher Nahrungsnetze braucht es oft ebenso komplexe Methoden um sie zu analysieren und zu verstehen. Modelle können dabei unterstützen, da sie Teile der Realität vereinfacht abbilden. In meiner Dissertation arbeitete ich mit verschiedenen Nahrungsnetzmodellen, um die Dynamiken in Nahrungsnetzen zu verstehen. In meinem ersten Projekt haben wir die Energieflüsse einer Nahrungskette in zwei Versionen eines allometrisch skalierten Nahrungsnetzmodells untersucht. Wenn nur die klassische basale Respiration einbezogen wird, steigt die trophische Transfereffizienz auf bis zu unrealistische 70 %. Durch die Einbeziehung der aktivitätsbezogenen Respiration sank die trophische Transfereffizienz auf realistische Werte von maximal 30 %. Danach wandte ich mich in meinem zweiten Projekt Plankton-Nahrungsnetzen und den Eigenschaften des Phytoplanktons zu. Bei der Untersuchung eines Langzeitdatensatzes von 21 Jahren aus dem Bodensee fanden wir einen Beweis für einen Trade-off zwischen Verteidigung und Wachstumsrate in einer natürlichen Phytoplankton-gemeinschaft. In diesem Datensatz konzentrierte ich mich anschließend in meinem dritten Projket auf Ciliaten, welche die wichtigsten Fraßfeinde von Phytoplankton im Frühjahr darstellen. Die Methode der boosted regression trees zeigte, dass Temperatur und Räuber den größten Einfluss auf die Nettowachstumsraten der Ciliaten haben. Schließlich nutzten wir in meinem vierten Projekt ein von Ciliaten inspiriertes Nahrungsnetzmodell, um die Koexistenz von Konkurrenten mit veränderlichen Eigenschaften und das neue Konzept des maladaptive switching zu untersuchen, welches Nachteile der Plastizität zeigt: höhere Wechselraten zwischen den Phänotypen führten zu höherem maladaptive switching in Richtung der unverteidigten Phänotypen, was die Biomasse und Koexistenz der Autotrophen reduziert und die Biomasse des Konsumenten erhöht. Es wurde offensichtlich, dass auch etablierte Modelle kritisch hinterfragt werden müssen, da es wichtig ist, die Realität auf dem Weg zu einem einfachen Modell nicht zu vergessen. Meine Ergebnisse zeigten des Weiteren, wie wichtig Langzeitdatensätze sind, da sie helfen können, komplexe natürliche Prozesse zu beleuchten. Dieses Wechselspiel zwischen Modellen und Daten aus Experimenten oder Felduntersuchungen kann fruchtbare Ergebnisse liefern und zu einem größeren Verständnis unserer komplexen Welt beitragen. KW - functional traits KW - plankton food web KW - coexistence KW - modelling KW - Modellierung KW - Planktonnahrungsnetz KW - Koexistenz Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-551239 ER - TY - THES A1 - Pitzen, Valentin T1 - Weitergeführte funktionelle Charakterisierung des centrosomalen Proteins Cep192 und Untersuchung der Topologie des Centrosoms in Dictyostelium Amöben T1 - Functional Characterization of the Centrosomal Protein Cep192 and Investigation of the Topology of the Centrosome in Dictyostelium amoeba N2 - Das Centrosom von Dictyostelium ist acentriolär aufgebaut, misst ca. 500 nm und besteht aus einer dreischichten Core-Struktur mit umgebender Corona, an der Mikrotubuli nukleieren. In dieser Arbeit wurden das centrosomale Protein Cep192 und mögliche Interaktionspartner am Centrosom eingehend untersucht. Die einleitende Lokalisationsuntersuchung von Cep192 ergab, dass es während der gesamten Mitose an den Spindelpolen lokalisiert und im Vergleich zu den anderen Strukturproteinen der Core-Struktur am stärksten exprimiert ist. Die dauerhafte Lokalisation an den Spindelpolen während der Mitose wird für Proteine angenommen, die in den beiden identisch aufgebauten äußeren Core-Schichten lokalisieren, die das mitotische Centrosom formen. Ein Knockdown von Cep192 führte zur Ausbildung von überzähligen Mikrotubuli-organisierenden Zentren (MTOC) sowie zu einer leicht erhöhten Ploidie. Deshalb wird eine Destabilisierung des Centrosoms durch die verminderte Cep192-Expression angenommen. An Cep192 wurden zwei kleine Tags, der SpotH6- und BioH6-Tag, etabliert, die mit kleinen fluoreszierenden Nachweiskonjugaten markiert werden konnten. Mit den so getagten Proteinen konnte die hochauflösende Expansion Microscopy für das Centrosom optimiert werden und die Core-Struktur erstmals proteinspezifisch in der Fluoreszenzmikroskopie dargestellt werden. Cep192 lokalisiert dabei in den äußeren Core-Schichten. Die kombinierte Markierung von Cep192 und den centrosomalen Proteinen CP39 und CP91 in der Expansion Microscopy erlaubte die Darstellung des dreischichtigen Aufbaus der centrosomalen Core-Struktur, wobei CP39 und CP91 zwischen Cep192 in der inneren Core-Schicht lokalisieren. Auch die Corona wurde in der Expansion Microscopy untersucht: Das Corona-Protein CDK5RAP2 lokalisiert in räumlicher Nähe zu Cep192 in der inneren Corona. Ein Vergleich der Corona-Proteine CDK5RAP2, CP148 und CP224 in der Expansion Microscopy ergab unterscheidbare Sublokalisationen der Proteine innerhalb der Corona und relativ zur Core-Struktur. In Biotinylierungsassays mit den centrosomalen Core-Proteinen CP39 und CP91 sowie des Corona-Proteins CDK5RAP2 konnte Cep192 als möglicher Interaktionspartner identifiziert werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen die wichtige Funktion des Proteins Cep192 im Dictyostelium-Centrosom und ermöglichen durch die Kombination aus Biotinylierungsassays und Expansion Microscopy der untersuchten Proteine ein verbessertes Verständnis der Topologie des Centrosoms. N2 - The Dictyostelium centrosome contains no centrioles and has a diameter of approx. 500 nm. It consists of a three layered core structure and a surrounding corona, which nucleates microtubules. This work focusses on the centrosomal protein Cep192 and potential interactors at the centrosome. Localization studies showed, that Cep192 is a permanent resident at the spindle poles during mitosis and that, compared to other centrosomal core proteins, Cep192 is expressed at the highest level. The permanent residence at the spindle poles throughout mitosis is assumed for proteins which localize to the outer core layers, which form the mitotic centrosome. A knockdown of Cep192 resulted in supernumerary microtubule organizing centers (MTOC) and a slightly higher ploidy. Due to the phenotype, a destabilization of the centrosome caused by the reduced Cep192 expression is assumed. Cep192 was fused to the newly established short tags BioH6 and SpotH6, which are recognized by small fluorescently labelled probes. The tagged proteins were used for superresolution expansion microscopy. Superresolution expansion microscopy was optimized for the centrosome and allowed the protein specific resolving of the core structure for the first time. Cep192 localizes to the outer core layers. Combination of tagged proteins nicely mirrored all three core layers. CP39 and CP91 localize inbetween Cep192 in the inner core layer. Corona proteins were included in the expansion microscopy: the corona protein CDK5RAP2 comes into close proximity of Cep192 and localizes to the inner corona. A comparison with CP148 and CP224, two other corona proteins, revealed a distinct localization of the proteins within the corona and relatively to the core structure. Applied biotinylase assays with the core proteins CP39 and CP91, as well with the corona protein CDK5RAP2 revealed Cep192 as a possible interaction partner of all three proteins. The results of this work show the important function of Cep192 at the Dictyostelium centrosome and through the biotinylase assay and expansion microscopy data shed a light on the refined Dictyostelium centrosome topology. KW - Centrosom KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - expansion microscopy KW - Cep192 KW - CDK5RAP2 KW - fluorescence microscopy KW - Cep192 KW - CDK5RAP2 Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-548891 ER - TY - THES A1 - Fischer, Axel T1 - Investigating the impact of genomic compartments contributing to non-Mendelian inheritance based on high throughput sequencing data T1 - Untersuchungen zum Einfluss genomischer Kompartimente auf Nicht-Mendelsche Vererbung unter Nutzung von Hochdurchsatz-Sequenzierungsdaten N2 - More than a century ago the phenomenon of non-Mendelian inheritance (NMI), defined as any type of inheritance pattern in which traits do not segregate in accordance with Mendel’s laws, was first reported. In the plant kingdom three genomic compartments, the nucleus, chloroplast, and mitochondrion, can participate in such a phenomenon. High-throughput sequencing (HTS) proved to be a key technology to investigate NMI phenomena by assembling and/or resequencing entire genomes. However, generation, analysis and interpretation of such datasets remain challenging by the multi-layered biological complexity. To advance our knowledge in the field of NMI, I conducted three studies involving different HTS technologies and implemented two new algorithms to analyze them. In the first study I implemented a novel post-assembly pipeline, called Semi-Automated Graph-Based Assembly Curator (SAGBAC), which visualizes non-graph-based assemblies as graphs, identifies recombinogenic repeat pairs (RRPs), and reconstructs plant mitochondrial genomes (PMG) in a semiautomated workflow. We applied this pipeline to assemblies of three Oenothera species resulting in a spatially folded and circularized model. This model was confirmed by PCR and Southern blot analyses and was used to predict a defined set of 70 PMG isoforms. With Illumina Mate Pair and PacBio RSII data, the stoichiometry of the RRPs was determined quantitatively differing up to three-fold. In the second study I developed a post-multiple sequence alignment algorithm, called correlation mapping (CM), which correlates segment-wise numbers of nucleotide changes to a numeric ascertainable phenotype. We applied this algorithm to 14 wild type and 18 mutagenized plastome assemblies within the Oenothera genus and identified two genes, accD and ycf2 that may cause the competitive behavior of plastid genotypes as plastids can be biparental inherited in Oenothera. Moreover, lipid composition of the plastid envelope membrane is affected by polymorphisms within these two genes. For the third study, I programmed a pipeline to investigate a NMI phenomenon, known as paramutation, in tomato by analyzing DNA and bisulfite sequencing data as well as microarray data. We identified the responsible gene (Solyc02g0005200) and were able to fully repress its caused phenotype by heterologous complementation with a paramutation insensitive transgene of the Arabidopsis thaliana orthologue. Additionally, a suppressor mutant shows a globally altered DNA methylation pattern and carries a large deletion leading to a gene fusion involving a histone deacetylase. In conclusion, my developed and implemented algorithms and data analysis pipelines are suitable to investigate NMI and led to novel insights about such phenomena by reconstructing PMGs (SAGBAC) as a requirement to study mitochondria-associated phenotypes, by identifying genes (CM) causing interplastidial competition as well by applying a DNA/Bisulfite-seq analysis pipeline to shed light in a transgenerational epigenetic inheritance phenomenon. N2 - Vor mehr als einem Jahrhundert wurde über das Phänomen der Nicht-Mendelschen Vererbung (NMI), welche als jede Art von Vererbungsmuster definiert wird, in denen Eigenschaften nicht nach dem Mendelschen Gesetzen segregieren, zum ersten Mal berichtet. Im Pflanzenkönigreich können drei Zellkompartimente mit ihrem eigenen Erbgut, Nukleus, Chloroplast, und Mitochondrium, an einem solchen Phänomen beteiligt sein. Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologien (HTS) stellen nachweislich eine Schlüsseltechnologie dar, um NMI Phänomene durch die Assemblierung und/oder Resequenzierung von ganzen Genomen zu untersuchen. Jedoch bleibt die Generierung, Analyse sowie die Interpretation solcher Datensätze durch die vielschichtige biologische Komplexität weiterhin eine Herausforderung. Um unser Wissen über NMI zu erweitern habe ich drei Studien durchgeführt in denen unterschiedliche HTS Technologien involviert waren und zwei neue Algorithmen implementiert um sie zu analysieren. In der ersten Studie habe ich eine neue Postassemblierungspipeline mit dem Namen Semi-Automated Graph-Based Assembly Curator (SAGBAC) entwickelt, welche nicht Graphen-basierte Genomassemblierungen als Graphen visualisiert, rekombinierende Repeatpaare (RRP) identifiziert, und pflanzliche mitochondrielle Genome (PMG) in einem halb-automatisierten Prozess rekonstruiert. Wir haben diese Pipeline auf Assemblierungen von drei Oenothera Spezies angewandt, was in gefalteten zirkularisierten Modellen resultierte. Dieses Modell wurde durch PCR und Southern Blot Analysen bestätigt, sowie verwendet, um einen definierten Satz von 70 PMG Isoformen vorherzusagen. Mit Illumina Mate Pair und PacBio RSII Daten wurde die Stöchiometrie der RRPs quantitativ bestimmt, die sich bis zu dreifach unterscheiden. In der zweiten Studie habe ich einen post-Multiples Sequenzalignment Algorithmus mit dem Namen Correlation Mapping (CM) entwickelt, der eine segmentweise Anzahl von Nukleotidaustauschen mit numerisch erfassbaren Phänotypen korreliert. Wir haben diesen Algorithmus auf 14 Wildtypen und 18 mutagenisierte Plastomassemblierungen aus der Gattung Oenothera angewandt und konnten zwei Gene, accD und ycf2 identifizieren, welche für das kompetitive Verhalten von Plastid Genotypen verantwortlich ist. Weiterhin wird die Lipidkomposition der Plastid-Hüllmembranen durch Polymorphismen in den beiden Genen beeinflusst. Für die dritte Studie habe ich eine Pipeline programmiert, um ein NMI Phänomen, bekannt als Paramutation, in der Tomate mit Hilfe von DNA- und Bisulfitsequenzierungsdaten sowie Microarray Daten zu analysieren. Wir haben das verantwortliche Gen (Solyc02g005200) identifiziert und waren in der Lage den verursachenden Phänotyp durch eine heterologe Komplementation eines paramutationsinsensitiven Transgens des Orthologs aus Arabidopsis thaliana vollständig zu unterdrücken. Weiterhin konnten wir zeigen, dass eine Suppressormutante ein global verändertes DNA-Methylierungsmuster aufweist und es durch eine große Deletion zu einer Genfusion gekommen ist, an der eine Histon-Deacetylase beteiligt ist. Zusammenfassend sind meine entwickelten und implementierten Algorithmen und Datenanalysen geeignet, um NMI zu untersuchen und haben wie folgt zu neuen Einsichten über solche Phänomene verholfen: (a) durch die Rekonstruktion von PMGs (SAGBAC) als Voraussetzung um Mitochondrien-assoziierte Phänotypen zu studieren, (b) durch die Identifizierung von Genen (CM), welche interplastidäre Kompetition auslösen sowie (c) durch Anwendung einer DNA-/Bisulfit-seq Analysepipeline zur Beantwortung der Ursache eines transgenerational epigenetischen Vererbungsphänomens. KW - non-Mendelian inheritance KW - de novo assembly KW - mitochondria KW - chloroplasts KW - paramutation KW - next generation sequencing KW - bisulfite sequencing KW - plant research KW - Bisulfit Sequenzierung KW - Chloroplasten KW - De novo Assemblierung KW - Mitochondrien KW - Sequenzierungstechnologien der nächsten Generation KW - nicht-Mendelsche Vererbung KW - Paramutation KW - Pflanzenforschung Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-549001 ER - TY - THES A1 - Esmaeeli Moghaddam Tabalvandani, Mariam T1 - ROS Generation in Human Aldehyde Oxidase And the Effects of ROS and Reactive Sulfhydryl on the Activity of the Enzyme T1 - ROS-Erzeugung in Humane Aldehydoxidase und die Auswirkungen von ROS und reaktivem Sulfhydryl auf die Aktivität des Enzyms N2 - Aldehyde oxidases (AOXs) (E.C. 1.2.3.1) are molybdoflavo-enzymes belonging to the xanthine oxidase (XO) family. AOXs in mammals contain one molybdenum cofactor (Moco), one flavin adenine dinucleotide (FAD) and two [2Fe-2S] clusters, the presence of which is essential for the activity of the enzyme. Human aldehyde oxidase (hAOX1) is a cytosolic enzyme mainly expressed in the liver. hAOX1is involved in the metabolism of xenobiotics. It oxidizes aldehydes to their corresponding carboxylic acids and hydroxylates N-heterocyclic compounds. Since these functional groups are widely present in therapeutics, understanding the behaviour of hAOX1 has important implications in medicine. During the catalytic cycle of hAOX1, the substrate is oxidized at Moco and electrons are internally transferred to FAD via the FeS clusters. An electron acceptor juxtaposed to the FAD receives the electrons and re-oxidizes the enzyme for the next catalytic cycle. Molecular oxygen is the endogenous electron acceptor of hAOX1 and in doing so it is reduced and produces reactive oxygen species (ROS) including hydrogen peroxide (H2O2) and superoxide (O2.-). The production of ROS has patho-physiological importance, as ROS can have a wide range of effects on cell components including the enzyme itself. In this thesis, we have shown that hAOX1 loses its activity over multiple cycles of catalysis due to endogenous ROS production and have identified a cysteine rich motif that protects hAOX1 from the ROS damaging effects. We have also shown that a sulfido ligand, which is bound at Moco and is essential for the catalytic activity of the enzyme, is vulnerable during turnover. The ROS produced during the course of the reaction are also able to remove this sulfido ligand from Moco. ROS, in addition, oxidize particular cysteine residues. The combined effects of ROS on the sulfido ligand and on specific cysteine residues in the enzyme result in its inactivation. Furthermore, we report that small reducing agents containing reactive sulfhydryl groups, in a selective manner, inactivate some of the mammalian AOXs by modifying the sulfido ligand at Moco. The mechanism of ROS production by hAOX1 is another scope that has been investigated as part of the work in this thesis. We have shown that the ratio of type of ROS, i.e. hydrogen peroxide (H2O2) and superoxide (O2.-), produced by hAOX1 is determined by a particular position on a flexible loop that locates in close proximity of FAD. The size of the cavity at the ROS producing site, i.e. the N5 position of the FAD isoalloxazine ring, kinetically affects the amount of each type of ROS generated by hAOX1. Taken together, hAOX1 is an enzyme with emerging importance in pharmacological and medical studies, not only due to its involvement in drug metabolism, but also due to ROS production which has physiological and pathological implications. N2 - Aldehyd-Oxidasen (AOXs) (E.C. 1.2.3.1) sind Molybdo-Flavo-Enzyme aus der Familie der Xanthin-Oxidasen (XO). AOXs in Säugetieren enthalten einen Molybdän-Cofaktor (Moco), ein Flavin-Adenosin-Dinukleotid (FAD) und zwei [2Fe-2S]-Cluster, deren Anwesenheit für die Aktivität des Enzyms essentiell ist. Die Humane Aldehyd-Oxidase (hAOX1) ist ein zytosolisches Enzym, das hauptsächlich in der Leber exprimiert wird und am Stoffwechsel von Xenobiotika beteiligt ist. hAOX1 oxidiert Aldehyde zu ihren entsprechenden Carbonsäuren und hydroxyliert N-heterocyclische Verbindungen. Da diese funktionellen Gruppen in Therapeutika weit verbreitet sind, hat das Verständnis des Verhaltens von hAOX1 wichtige Auswirkungen auf medizinische Studien. Während des Katalysezyklus von hAOX1 wird das Substrat an Moco oxidiert und die Elektronen werden über die FeS-Cluster intern auf FAD übertragen. Ein Elektronenakzeptor am FAD nimmt die Elektronen auf und re-oxidiert das Enzym für den nächsten Katalysezyklus. Molekularer Sauerstoff ist der endogene Elektronenakzeptor von hAOX1, der reduziert wird und reaktive Sauerstoffspezies (ROS) einschließlich Wasserstoffperoxid (H2O2) und Superoxid (O2.-) produziert. Die Produktion von ROS hat pathophysiologische Bedeutung mit weitreichenden Auswirkungen auf die Zellbestandteile und das Enzym selbst. In der vorliegenden Arbeit haben wir gezeigt, dass hAOX1 aufgrund der endogenen ROS-Produktion seine Aktivität über mehrere Katalysezyklen verliert und haben ein Cystein-reiches Motiv identifiziert, das hAOX1 vor den ROS-schädigenden Wirkungen schützt. Wir haben auch gezeigt, dass ein an Moco gebundener und für die katalytische Aktivität des Enzyms essentieller Sulfidoligand unter reduzierenden Bedingungen anfällig ist. Die im Verlauf der Reaktion entstehenden ROS sind in der Lage, diesen Sulfidoliganden aus dem Moco zu entfernen. ROS oxidieren auch bestimmte Cysteinreste. Die kombinierten Effekte von ROS auf den Sulfidoliganden und Cysteine führen zu einer Inaktivierung des Enzyms. Darüber hinaus berichten wir, dass Reduktionsmittel, die eine reaktive Sulfhydrylgruppe enthalten, selektiv einige der Säuger-AOX inaktivieren, indem sie den Sulfidoliganden beim Moco modifizieren. Der Mechanismus der ROS-Produktion durch hAOX1 ist ein weiterer Bereich, der im Rahmen dieser Arbeit untersucht wurde. Wir haben gezeigt, dass die Art von ROS, d. h. Wasserstoffperoxid (H2O2) und Superoxid (O2.-), die von hAOX1 produziert wird, durch eine bestimmte Position auf einem flexiblen Loop bestimmt wird, die sich in der Nähe von FAD befindet. Es scheint, dass die Größe der Kavität an der ROS-produzierenden Stelle, d. h. die N5-Position des FAD-Isoalloxazin-Rings, die Menge jedes ROS-Typs, der von hAOX1 erzeugt wird, kinetisch beeinflusst. Zusammenfassend ist hAOX1 ein Enzym mit zunehmender Bedeutung in pharmakologischen und medizinischen Studien, nicht nur aufgrund seiner Beteiligung am Arzneimittelstoffwechsel, sondern auch aufgrund der ROS-Produktion, die physiologische und pathologische Auswirkungen hat. KW - human aldehyde oxidase KW - reactive oxygen species (ROS) KW - Aldehydoxidase KW - reaktive Sauerstoffspezies (ROS) Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-534600 ER - TY - THES A1 - Gerling, Marten Tobias T1 - A microfluidic system for high-precision image-based live cell sorting using dielectrophoretic forces T1 - Ein mikrofluidisches System zur hochpräzisen und bildgestützten Sortierung lebender Zellen mittels dielektrophoretischer Kräfte N2 - An important goal in biotechnology and (bio-) medical research is the isolation of single cells from a heterogeneous cell population. These specialised cells are of great interest for bioproduction, diagnostics, drug development, (cancer) therapy and research. To tackle emerging questions, an ever finer differentiation between target cells and non-target cells is required. This precise differentiation is a challenge for a growing number of available methods. Since the physiological properties of the cells are closely linked to their morphology, it is beneficial to include their appearance in the sorting decision. For established methods, this represents a non addressable parameter, requiring new methods for the identification and isolation of target cells. Consequently, a variety of new flow-based methods have been developed and presented in recent years utilising 2D imaging data to identify target cells within a sample. As these methods aim for high throughput, the devices developed typically require highly complex fluid handling techniques, making them expensive while offering limited image quality. In this work, a new continuous flow system for image-based cell sorting was developed that uses dielectrophoresis to precisely handle cells in a microchannel. Dielectrophoretic forces are exerted by inhomogeneous alternating electric fields on polarisable particles (here: cells). In the present system, the electric fields can be switched on and off precisely and quickly by a signal generator. In addition to the resulting simple and effective cell handling, the system is characterised by the outstanding quality of the image data generated and its compatibility with standard microscopes. These aspects result in low complexity, making it both affordable and user-friendly. With the developed cell sorting system, cells could be sorted reliably and efficiently according to their cytosolic staining as well as morphological properties at different optical magnifications. The achieved purity of the target cell population was up to 95% and about 85% of the sorted cells could be recovered from the system. Good agreement was achieved between the results obtained and theoretical considerations. The achieved throughput of the system was up to 12,000 cells per hour. Cell viability studies indicated a high biocompatibility of the system. The results presented demonstrate the potential of image-based cell sorting using dielectrophoresis. The outstanding image quality and highly precise yet gentle handling of the cells set the system apart from other technologies. This results in enormous potential for processing valuable and sensitive cell samples. N2 - Ein wichtiges Ziel in der Biotechnologie und (bio-) medizinischen Forschung ist die Isolation von Einzelzellen aus einer heterogenen Zellpopulation. Aufgrund ihrer besonderen Eigenschaften sind diese Zellen für die Bioproduktion, Diagnostik, Arzneimittelentwicklung, (Krebs-) Therapie und Forschung von großem Interesse. Um neue Fragestellungen angehen zu können, ist eine immer feinere Differenzierung zwischen Zielzellen und Nicht-Zielzellen erforderlich. Diese präzise Differenzierung stellt eine Herausforderung für eine wachsende Zahl verfügbarer Methoden dar. Da die physiologischen Eigenschaften der Zellen eng mit ihrer Morphologie verknüpft sind, ist es sinnvoll ihr Erscheinungsbild mit in die Sortierentscheidung einzubeziehen. Für etablierte Methoden stellt dies jedoch einen nicht adressierbaren Parameter dar, weshalb neue Methoden zur Identifikation und Isolation der Zielzellen benötigt werden. Folglich wurde in den letzten Jahren eine Vielzahl neuer durchflussbasierter Methoden entwickelt und vorgestellt, die 2D-Bilddaten zur Identifikation der Zielzellen innerhalb einer Probe heranziehen. Da diese Methoden auf hohe Durchsätze abzielen, erfordern die entwickelten Geräte in der Regel hochkomplexe Techniken zur Handhabung der Flüssigkeiten, was sie teuer macht und gleichzeitig zu einer begrenzten Bildqualität führt. In dieser Arbeit wurde ein neues durchflussbasiertes System zur bildbasierten Zellsortierung entwickelt, das Dielektrophorese zur präzisen Handhabung der Zellen in einem Mikrokanal verwendet. Dielektrophoretische Kräfte werden von inhomogenen elektrischen Wechselfeldern auf polarisierbare Partikel (hier: Zellen) ausgeübt. Bei dem vorliegenden System können die elektrischen Felder durch einen Signalgenerator präzise und schnell ein- und ausgeschaltet werden. Neben der daraus resultierenden einfachen und effektiven Handhabung der Zellen zeichnet sich das System durch die hervorragende Qualität der erzeugten Bilddaten und die Kompatibilität mit Standardmikroskopen aus. Diese Aspekte führen zu einer geringen Komplexität, die es sowohl erschwinglich als auch benutzerfreundlich macht. Mit dem entwickelten System zur Zellsortierung konnten Zellen sowohl auf Basis einer zytosolischen Färbung als auch auf Basis morphologischer Eigenschaften bei verschiedenen optischen Vergrößerungen zuverlässig und effizient sortiert werden. Die erreichte Reinheit der Zielzellpopulation betrug bis zu 95% wobei etwa 85% der sortierten Zellen aus dem System zurückgewonnen werden konnten. Dabei wurde eine gute Übereinstimmung der ermittelten Ergebnisse mit theoretischen Überlegungen erreicht. Der erreichte Durchsatz des Systems betrug bis zu 12.000 Zellen pro Stunde. Untersuchungen der Zellvitalität deuteten darauf hin, dass das System eine hohe Biokompatibilität aufweist. Die vorgestellten Ergebnisse demonstrieren das Potenzial der bildbasierten Zellsortierung mittels Dielektrophorese. Die herausragende Bildqualität und hochpräzise aber dennoch zellschonende Handhabung der Zellen grenzen das System von anderen Technologien ab. Daraus ergibt sich ein enormes Potenzial für die Verarbeitung wertvoller und sensibler Zellproben. KW - microfluidics KW - cell sorting KW - dielectrophoresis KW - Zellsortierung KW - Dielektrophorese KW - Mikrofluidik Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-587421 ER - TY - THES A1 - Heinsohn, Natascha T1 - Development of a fiber-based sensor for the molecular detection of pathogens using Legionella as an example T1 - Entwicklung eines Faser-basierten Sensors zur molekularen Detektion von Pathogenen am Beispiel von Legionellen N2 - Fiber-based microfluidics has undergone many innovative developments in recent years, with exciting examples of portable, cost-effective and easy-to-use detection systems already being used in diagnostic and analytical applications. In water samples, Legionella are a serious risk as human pathogens. Infection occurs through inhalation of aerosols containing Legionella cells and can cause severe pneumonia and may even be fatal. In case of Legionella contamination of water-bearing systems or Legionella infection, it is essential to find the source of the contamination as quickly as possible to prevent further infections. In drinking, industrial and wastewater monitoring, the culture-based method is still the most commonly used technique to detect Legionella contamination. In order to improve the laboratory-dependent determination, the long analysis times of 10-14 days as well as the inaccuracy of the measured values in colony forming units (CFU), new innovative ideas are needed. In all areas of application, for example in public, commercial or private facilities, rapid and precise analysis is required, ideally on site. In this PhD thesis, all necessary single steps for a rapid DNA-based detection of Legionella were developed and characterized on a fiber-based miniaturized platform. In the first step, a fast, simple and device-independent chemical lysis of the bacteria and extraction of genomic DNA was established. Subsequently, different materials were investigated with respect to their non-specific DNA retention. Glass fiber filters proved to be particularly suitable, as they allow recovery of the DNA sample from the fiber material in combination with dedicated buffers and exhibit low autofluorescence, which was important for fluorescence-based readout. A fiber-based electrophoresis unit was developed to migrate different oligonucleotides within a fiber matrix by application of an electric field. A particular advantage over lateral flow assays is the targeted movement, even after the fiber is saturated with liquid. For this purpose, the entire process of fiber selection, fiber chip patterning, combination with printed electrodes, and testing of retention and migration of different DNA samples (single-stranded, double-stranded and genomic DNA) was performed. DNA could be pulled across the fiber chip in an electric field of 24 V/cm within 5 minutes, remained intact and could be used for subsequent detection assays e.g., polymerase chain reaction (PCR) or fluorescence in situ hybridization (FISH). Fiber electrophoresis could also be used to separate DNA from other components e.g., proteins or cell lysates or to pull DNA through multiple layers of the glass microfiber. In this way, different fragments experienced a moderate, size-dependent separation. Furthermore, this arrangement offers the possibility that different detection reactions could take place in different layers at a later time. Electric current and potential measurements were collected to investigate the local distribution of the sample during migration. While an increase in current signal at high concentrations indicated the presence of DNA samples, initial experiments with methylene blue stained DNA showed a temporal sequence of signals, indicating sample migration along the chip. For the specific detection of a Legionella DNA, a FISH-based detection with a molecular beacon probe was tested on the glass microfiber. A specific region within the 16S rRNA gene of Legionella spp. served as a target. For this detection, suitable reaction conditions and a readout unit had to be set up first. Subsequently, the sensitivity of the probe was tested with the reverse complementary target sequence and the specificity with several DNA fragments that differed from the target sequence. Compared to other DNA sequences of similar length also found in Legionella pneumophila, only the target DNA was specifically detected on the glass microfiber. If a single base exchange is present or if two bases are changed, the probe can no longer distinguish between the DNA targets and non-targets. An analysis with this specificity can be achieved with other methods such as melting point determination, as was also briefly indicated here. The molecular beacon probe could be dried on the glass microfiber and stored at room temperature for more than three months, after which it was still capable of detecting the target sequence. Finally, the feasibility of fiber-based FISH detection for genomic Legionella DNA was tested. Without further processing, the probe was unable to detect its target sequence in the complex genomic DNA. However, after selecting and application of appropriate restriction enzymes, specific detection of Legionella DNA against other aquatic pathogens with similar fragment patterns as Acinetobacter haemolyticus was possible. N2 - Die faserbasierte Mikrofluidik hat in den letzten Jahren viele innovative Entwicklungen erfahren, mit spannenden Beispielen für portable, kostengünstige und einfach zu bedienende Nachweissysteme die bereits in diagnostischen und analytischen Fragestellungen Anwendung finden. In Wasserproben sind Legionellen als Humanpathogene ein ernstzunehmendes Risiko. Eine Infektion erfolgt über das Einatmen legionellenhaltiger Aerosole und kann schwerwiegende Pneumonien hervorrufen oder sogar tödlich verlaufen. Im Falle einer Legionellenkontamination von Wasserführenden Systemen beziehungsweise einer Legionellen-assoziierten Infektion ist es maßbeglich die Quelle der Kontamination möglichst schnell zu finden, um weitere Infektionen zu vermeiden. In der Überwachung von Trink- Prozess- und Abwasser ist die kulturbasierte Methode immer noch die am häufigsten verwendete Technik, um einen Legionellenbefall nachzuweisen. Um Alternativen zu einer laborabhängigen Bestimmung mit ihren langen Analysezeiten von 10-14 Tagen und der ungenauen Messwertausgabe in koloniebildenden Einheiten (KBE) zu finden, bedarf es neuer innovativer Ideen. In allen Anwendungsbereichen, zum Beispiel in öffentlichen, gewerblichen oder privaten Einrichtungen, ist eine schnelle und präzise Analyse erforderlich, idealerweise vor Ort. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden alle notwendigen Einzelschritte für einen schnellen DNA-basierten Nachweis von Legionellen auf einer faserbasierten, miniaturisierten Plattform entwickelt und charakterisiert. Im ersten Schritt wurde eine schnelle, einfache und geräteunabhängige chemische Lyse der Bakterien und Extraktion der genomischen DNA etabliert. Daraufhin wurden verschiedene Materialien hinsichtlich Ihres unspezifischen DNA-Rückhalts untersucht. Glasfaserfilter erwiesen sich als besonders geeignet, da sie in Kombination mit den geeigneten Puffern eine Rückgewinnung der DNA-Probe aus dem Fasermaterial ermöglichen und für eine fluoreszenzbasierte Auslese eine geringe Autofluoreszenz aufweisen. Eine faserbasierte Elektrophoreseeinheit wurde entwickelt, um durch Anlegen eines elektrischen Feldes verschiedene Oligonukleotide innerhalb einer Fasermatrix zu bewegen. Ein besonderer Vorteil gegenüber Lateral-Flow-Tests ist die Möglichkeit der gezielten Bewegung, auch nachdem die Faser mit Flüssigkeit gesättigt ist. Hierfür wurde der gesamte Prozess der Faserauswahl, der Strukturierung der Faserchips, der Kombination mit gedruckten Elektroden und der Prüfung der Retention und Migration verschiedener DNA-Proben (einzelsträngige, doppelsträngige und genomische DNA) bearbeitet. Die DNA konnte in einem elektrischen Feld von 24 V/cm innerhalb von 5 Minuten über den Faserchip gezogen werden, blieb dabei intakt und konnte für nachfolgende Detektionsnachweise z.B. Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) oder Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) genutzt werden. Die Faserelektrophorese konnte außerdem zur Separation der DNA von anderen Komponenten z.B. Proteinen oder Zelllysaten verwendet werden oder um DNA durch mehrere Lagen der Glasfaser zu steuern. Dabei erfuhren verschiedene Fragmente einen moderaten, größenabhängigen Trenneffekt. Außerdem bietet diese Anordnung die Möglichkeit, dass unterschiedliche Nachweisreaktionen zu einem späteren Zeitpunkt in verschiedenen Schichten stattfinden könnten. Strom- und Potentialmessungen wurden erhoben, um die lokale Verteilung der Probe während der Migration zu untersuchen. Während ein Anstieg des Stromsignals bei hohen Konzentrationen die Anwesenheit von DNA-Proben anzeigte, konnten nach ersten Experimenten mit Methylenblau-gefärbter DNA zeitlich aufeinanderfolgende Signale detektiert werden und somit prinzipiell eine Probenmigration nachgewiesen werden. Für den spezifischen Nachweis der Legionellen-DNA wurde ein FISH-basierter Nachweis mit einer molekularen Sonde auf der Glasmikrofaser getestet. Als Ziel für die Sonde diente eine bestimmte Region innerhalb des 16S rRNA-Gens von Legionellen. Für diesen Nachweis mussten zunächst geeignete Reaktionsbedingungen und eine Ausleseeinheit bestimmt werden. Anschließend wurde die Sensitivität der Sonde mit der umgekehrt komplementären Zielsequenz und die Spezifität mit verschiedenen DNA-Fragmenten, die sich von der Zielsequenz unterschieden, getestet. Im Vergleich zu abweichenden DNA-Sequenzen ähnlicher Länge, die auch in Legionella pneumophila vorkommen, wurde nur die Ziel-DNA spezifisch auf der Glasmikrofaser erkannt. Liegt ein einzelner Basenaustausch vor oder werden zwei Basen geändert, so kann die Sonde nicht mehr zwischen der Ziel-DNA und den abweichenden DNA-Fragmenten unterscheiden. Eine Detektion mit dieser Genauigkeit ist mit anderen Methoden wie z.B. der Schmelzpunktbestimmung möglich, wie hier prinzipiell demonstriert wurde. Es wurde ferner gezeigt, dass die Sonde auf der Glasmikrofaser eingetrocknet und über drei Monate bei Raumtemperatur gelagert werden kann und danach immer noch in der Lage ist, die Zielsequenz nachzuweisen. Schließlich wurde die Anwendbarkeit des faserbasierten FISH-Nachweises auch für genomische Legionellen-DNA getestet. Ohne weitere Prozessierung war die Sonde nicht in der Lage ihre Zielsequenz in der komplexen genomischen DNA zu erkennen. Nach der Auswahl und Anwendung geeigneter Restriktionsenzyme war eine spezifische Detektion der Legionellen-DNA gegenüber anderen Wasserkeimen mit ähnlichem Fragmentmuster wie Acinetobacter haemolyticus möglich. KW - Sensor KW - paper-based KW - Legionellen KW - Legionella KW - papier-basiert KW - sensor KW - Detektionssystem KW - detection system KW - Glasfaser KW - glass fiber Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-566833 ER - TY - THES A1 - Drago, Claudia T1 - Microplastics in the environment: Assessing the ingestion and effect of microplastics on freshwater rotifers in an environmental scenario T1 - Mikroplastik in der Umwelt: Bewertung der Aufnahme und Effekte von Mikroplastik auf Süßwasser-Rotatorien N2 - Microplastics in the environments are estimated to increase in the near future due to increasing consumption of plastic product and also due to further fragmentation in small pieces. The fate and effects of MP once released into the freshwater environment are still scarcely studied, compared to the marine environment. In order to understand possible effect and interaction of MPs in freshwater environment, planktonic zooplankton organisms are very useful for their crucial trophic role. In particular freshwater rotifers are one of the most abundant organisms and they are the interface between primary producers and secondary consumers. The aim of my thesis was to investigate the ingestion and the effect of MPs in rotifers from a more natural scenario and to individuate processes such as the aggregation of MPs, the food dilution effect and the increasing concentrations of MPs that could influence the final outcome of MPs in the environment. In fact, in a near natural scenario MPs interaction with bacteria and algae, aggregations together with the size and concentration are considered drivers of ingestion and effect. The aggregation of MPs makes smaller MPs more available for rotifers and larger MPs less ingested. The negative effect caused by the ingestion of MPs was modulated by their size but also by the quantity and the quality of food that cause variable responses. In fact, rotifers in the environment are subjected to food limitation and the presence of MPs could exacerbate this condition and decrease the population and the reproduction input. Finally, in a scenario incorporating an entire zooplanktonic community, MPs were ingested by most individuals taking into account their feeding mode but also the concentration of MPs, which was found to be essential for the availability of MPs. This study highlights the importance to investigate MPs from a more environmental perspective, this in fact could provide an alternative and realistic view of effect of MPs in the ecosystem. N2 - Das allgegenwärtige Vorhandensein in der Umwelt, der rasche Anstieg und die Langlebigkeit haben Plastik zu einem großen Umweltproblem gemacht. Die zunehmende Konzentration von Plastik durch weitere Fragmentierung in Süßgewässern und die daraus resultierenden Konsequenzen auf Ökosystemebenen werden noch immer unterschätzt. Die Auswirkungen von MP auf planktonische Organismen wie den Rotatorien sind noch nicht hinreichend untersucht worden. Ein negativer Effekt könnte Folgen auf höhere trophische Ebenen haben. In dieser Studie wird untersucht, wie natürliche Faktoren die Aufnahme und Wirkung von Mikroplastik (MP) auf Rotatorien verändern können. Natürliche Faktoren, wie zum Beispiel durch Bakterien aggregierte MP, unterschiedliche Algennahrung, sowie verschiedene aquatische Tierarten, wurden genutzt, um Umweltbedingungen im Labor zu imitieren. Die Aufnahmerate von MP, von MP in Verbindung mit Algennahrung und von aggregiertem MP wurde untersucht (Kapitel 2). Durch die Aggregation von MP sind kleinere MP für Rotatorien besser verfügbar und größere MP werden weniger aufgenommen. Die Auswirkungen des MPs wurden in meiner Studie in Abhängigkeit von der Nahrungszufuhr, z. B. von der Algenkonzentration, aber auch von der Art der Algen untersucht. Darüber hinaus wurden Polyamidfragmente und Siliziumdioxidkügelchen verwendet, um mögliche Partikeleffekte oder negative Reaktionen im Zusammenhang mit der Art und Form des Plastiks zu verstehen. Zwei verwandte Brachyonidenarten wurden dabei untersucht. Die Wirkung von MP auf B. calyciflorus und B. fernandoi wurde in Kombination mit verschiedenen Konzentrationen und Arten von Futter getestet. Ziel dieser Studie (Kapitel 3) war es, eine Beziehung zwischen den MP-Konzentrationen und der Qualität der Nahrung herzustellen. Darüber hinaus wurden die beiden Arten miteinander verglichen, um mögliche Unterschiede in der Reaktion auf MP festzustellen. Es wurden subletale Reaktionen, wie die Fortpflanzung, die Populationswachstumsrate und das Überleben untersucht, wobei eine schädliche Auswirkung in Form einer Verringerung der Populationsgröße durch geringere Fortpflanzung festgestellt wurde. In einem komplexeren und naturnahen Szenario, wurde ein Mikrokosmos-Experiment durchgeführt, bei dem vier verschiedene Zooplanktongruppen, bestehend aus Rotatorien, Cladoceren, Copepoden und Ostracoden, drei verschiedenen MP-Größen ausgesetzt wurden (Kapitel 4). Die wichtigsten Einflussfaktoren, wie die MP-Konzentration, die Größe und die Art der Nahrungsaufnahme, wurden berücksichtigt, um festzustellen, welche Gruppe anfälliger für die MP-Aufnahme ist. Die MP-Konzentration und die Art der Futteraufnahme beeinflussten die Aufnahme von MP stärker als die Größe. Bei hoher Konzentration nahmen trotz der Größenpräferenz und der Art der Futteraufnahme mehr Individuen das MP auf. Im Gegensatz dazu konnte die Aufnahme von MP bei niedriger Konzentration vermieden werden. Diese Studie verdeutlicht, dass Umweltfaktoren sowie die MP-Konzentration und die Art der Futteraufnahme eine wichtige Rolle bei der Untersuchung von MP spielen. KW - microplastics KW - rotifer KW - ingestion KW - effect KW - Effekt KW - Aufnahme KW - Mikroplastik KW - Rotatorien Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-573356 ER - TY - THES A1 - Shevtsova, Iuliia T1 - Recent and future vegetation change in the treeline region of Chukotka (NE Russia) inferred from field data, satellite data and modelling N2 - Vegetation change at high latitudes is one of the central issues nowadays with respect to ongoing climate changes and triggered potential feedback. At high latitude ecosystems, the expected changes include boreal treeline advance, compositional, phenological, physiological (plants), biomass (phytomass) and productivity changes. However, the rate and the extent of the changes under climate change are yet poorly understood and projections are necessary for effective adaptive strategies and forehanded minimisation of the possible negative feedbacks. The vegetation itself and environmental conditions, which are playing a great role in its development and distribution are diverse throughout the Subarctic to the Arctic. Among the least investigated areas is central Chukotka in North-Eastern Siberia, Russia. Chukotka has mountainous terrain and a wide variety of vegetation types on the gradient from treeless tundra to northern taiga forests. The treeline there in contrast to subarctic North America and north-western and central Siberia is represented by a deciduous conifer, Larix cajanderi Mayr. The vegetation varies from prostrate lichen Dryas octopetala L. tundra to open graminoid (hummock and non-hummock) tundra to tall Pinus pumila (Pall.) Regel shrublands to sparse and dense larch forests. Hence, this thesis presents investigations on recent compositional and above-ground biomass (AGB) changes, as well as potential future changes in AGB in central Chukotka. The aim is to assess how tundra-taiga vegetation develops under changing climate conditions particularly in Fareast Russia, central Chukotka. Therefore, three main research questions were considered: 1) What changes in vegetation composition have recently occurred in central Chukotka? 2) How have the above-ground biomass AGB rates and distribution changed in central Chukotka? 3) What are the spatial dynamics and rates of tree AGB change in the upcoming millennia in the northern tundra-taiga of central Chukotka? Remote sensing provides information on the spatial and temporal variability of vegetation. I used Landsat satellite data together with field data (foliage projective cover and AGB) from two expeditions in 2016 and 2018 to Chukotka to upscale vegetation types and AGB for the study area. More specifically, I used Landsat spectral indices (Normalised Difference Vegetation Index (NDVI), Normalised Difference Water Index (NDWI) and Normalised Difference Snow Index (NDSI)) and constrained ordination (Redundancy analysis, RDA) for further k-means-based land-cover classification and general additive model (GAM)-based AGB maps for 2000/2001/2002 and 2016/2017. I also used Tandem-X DEM data for a topographical correction of the Landsat satellite data and to derive slope, aspect, and Topographical Wetness Index (TWI) data for forecasting AGB. Firstly, in 2016, taxa-specific projective cover data were collected during a Russian-German expedition. I processed the field data and coupled them with Landsat spectral Indices in the RDA model that was used for k-means classification. I could establish four meaningful land-cover classes: (1) larch closed-canopy forest, (2) forest tundra and shrub tundra, (3) graminoid tundra and (4) prostrate herb tundra and barren areas, and accordingly, I produced the land cover maps for 2000/2001/2002 and 2016/20017. Changes in land-cover classes between the beginning of the century (2000/2001/2002) and the present time (2016/2017) were estimated and interpreted as recent compositional changes in central Chukotka. The transition from graminoid tundra to forest tundra and shrub tundra was interpreted as shrubification and amounts to a 20% area increase in the tundra-taiga zone and 40% area increase in the northern taiga. Major contributors of shrubification are alder, dwarf birch and some species of the heather family. Land-cover change from the forest tundra and shrub tundra class to the larch closed-canopy forest class is interpreted as tree infilling and is notable in the northern taiga. We find almost no land-cover changes in the present treeless tundra. Secondly, total AGB state and change were investigated for the same areas. In addition to the total vegetation AGB, I provided estimations for the different taxa present at the field sites. As an outcome, AGB in the study region of central Chukotka ranged from 0 kg m-2 at barren areas to 16 kg m-2 in closed-canopy forests with the larch trees contributing the highest. A comparison of changes in AGB within the investigated period from 2000 to 2016 shows that the greatest changes (up to 1.25 kg m 2 yr 1) occurred in the northern taiga and in areas where land cover changed to larch closed-canopy forest. Our estimations indicate a general increase in total AGB throughout the investigated tundra-taiga and northern taiga, whereas the tundra showed no evidence of change in AGB within the 15 years from 2002 to 2017. In the third manuscript, potential future AGB changes were estimated based on the results of simulations of the individual-based spatially explicit vegetation model LAVESI using different climate scenarios, depending on Representative Concentration Pathways (RCPs) RCP 2.6, RCP 4.5 and RCP 8.5 with or without cooling after 2300 CE. LAVESI-based AGB was simulated for the current state until 3000 CE for the northern tundra-taiga study area for larch species because we expect the most notable changes to occur will be associated with forest expansion in the treeline ecotone. The spatial distribution and current state of tree AGB was validated against AGB field data, AGB extracted from Landsat satellite data and a high spatial resolution image with distinctive trees visible. The simulation results are indicating differences in tree AGB dynamics plot wise, depending on the distance to the current treeline. The simulated tree AGB dynamics are in concordance with fundamental ecological (emigrational and successional) processes: tree stand formation in simulated results starts with seed dispersion, tree stand establishment, tree stand densification and episodic thinning. Our results suggest mostly densification of existing tree stands in the study region within the current century in the study region and a lagged forest expansion (up to 39% of total area in the RCP 8.5) under all considered climate scenarios without cooling in different local areas depending on the closeness to the current treeline. In scenarios with cooling air temperature after 2300 CE, forests stopped expanding at 2300 CE (up to 10%, RCP 8.5) and then gradually retreated to their pre-21st century position. The average tree AGB rates of increase are the strongest in the first 300 years of the 21st century. The rates depend on the RCP scenario, where the highest are as expected under RCP 8.5. Overall, this interdisciplinary thesis shows a successful integration of field data, satellite data and modelling for tracking recent and predicting future vegetation changes in mountainous subarctic regions. The obtained results are unique for the focus area in central Chukotka and overall, for mountainous high latitude ecosystems. N2 - Die Veränderung der Vegetation in den hohen Breiten ist heutzutage eines der zentralen Themen im Hinblick auf den anhaltenden Klimawandel und hat potenziell auslösende Rückkopplungen. In den Ökosystemen der hohen Breiten umfassen die erwarteten Veränderungen das Fortschreiten der borealen Baumgrenze, sowie kompositorische, phänologische, physiologische, Biomassen- (Phytomasse) und Produktivitätsveränderungen. Die Geschwindigkeit und das Ausmaß der Veränderungen im Rahmen des Klimawandels sind jedoch noch wenig verstanden, und Projektionen sind für wirksame Anpassungsstrategien und eine vorausschauende Minimierung möglicher negativer Rückkopplungen erforderlich. Die Vegetation selbst und die Umweltbedingungen, die bei ihrer Entwicklung und Verbreitung eine große Rolle spielen, sind in der gesamten Subarktis bis zur Arktis unterschiedlich. Zu den am wenigsten untersuchten Gebieten gehört Zentral-Tschukotka, in Nordost-Sibirien, Russland. Tschukotka hat gebirgiges Terrain und eine weite Bandbreite von Vegetationstypen entlang des Gradienten von der baumlosen Tundra bis zu den nördlichen Taiga-Wäldern. Die Baumgrenze dort wird im Gegensatz zum subarktischen Nordamerika sowie Nordwest- und Mittelsibirien durch eine laubabwerfende Nadelbaumart, Larix cajanderi Mayr, aufgebaut. Die Vegetation variiert von Tundra mit Flechten und Dryas octopetala L. über offene graminoide (Horstgras und nicht Horstgras) Tundra und hohe Pinus pumila (Pall.) Regel Strauchlandschaften zu lockeren Lärchenbeständen bis zu dichten Lärchenwäldern. Somit werden in meiner Dissertation Untersuchungen zu den jüngsten Veränderungen der Vegetationszusammensetzung und der oberirdischen Biomasse (aus dem Englischen above-ground biomass, bzw. AGB), sowie zu potenziellen zukünftigen Veränderungen der AGB vorgestellt. Das Ziel meiner Arbeit ist es abzuschätzen, wie sich die Tundra-Taiga-Vegetation unter Klimawandel entwickelt, insbesondere in Fernost Russland, Zentral-Tschukotka. Daher wurden drei Hauptforschungsfragen berücksichtigt: 1) Welche Veränderungen in der Vegetationszusammensetzung sind in den letzten Jahrzehnten in Zentral-Tschukotka aufgetreten? 2) Wie haben sich die AGB-Raten und die Verteilung der oberirdischen Biomasse in Zentral-Tschukotka verändert? 3) Wie sind die räumlichen Dynamiken und Änderungsraten der Baum-AGB in dem kommenden Jahrtausend in der nördlichen Tundra-Taiga in Zentral-Tschukotka? Fernerkundung liefert Informationen über die räumliche und zeitliche Vegetationsvariabilität. Ich habe Landsat-Satellitendaten zusammen mit Felddaten (Projektive Vegetationsbedeckung und AGB) von zwei Expeditionen in den Jahren 2016 und 2018 nach Tschukotka verwendet, um Vegetationstypen und AGB für das Untersuchungsgebiet räumlich abzubilden. Insbesondere habe ich die Landsat-Spektralindizes (Normalized Difference Vegetation Index (NDVI), Normalized Difference Water Index (NDWI) und Normalized Difference Snow Index (NDSI)) und eine Ordination mit Randbedingungen (Redundanzanalyse, RDA) verwendet, um eine Land-Klassifizierung mittels der k-means Methode zu entwickeln, und AGB-Karten mittels des General Additive Model (GAM) für 2000/2001/2002 und 2016/2017 zu erstellen. Außerdem verwendete ich Tandem-X-DEM-Daten, um die Landsat-Satellitendaten topografisch zu korrigieren und um die Hangneigung-, Hangaspekt- und TWI- (Topographical Wetness Index) Daten für die Vorhersage von AGB abzuleiten. Auf einer russisch-deutschen Expedition im Jahr 2016 wurden Vegetationsdaten erhoben. Ich prozessierte die Felddaten zu taxaspezifischen-projektiven Vegetationsbedeckungsdaten. Ich habe die taxaspezifisch-projektive Vegetationsbedeckung mit Landsat-Spektralindizes im RDA-Modell gekoppelt, das für die k-means-Klassifizierung verwendet wurde. Ich konnte vier repräsentative Landbedeckungsklassen einrichten: (1) Lärchen-Wald mit geschlossenem Blätterdach, (2) Waldtundra und Strauch-Tundra, (3) graminoide Tundra und (4) Kräutertundra und vegetationsarme Gebiete. Dementsprechend prozessierte ich dann die Landbedeckungskarten für 2000/2001/2002 und 2016/20017. Ich ermittelte die Änderungen der Landbedeckungsklassen zwischen dem Beginn des Jahrhunderts (2000/2001/2002) und der Gegenwart (2016/2017) und konnte sie als aktuelle Kompositionsänderungen in der Vegetation von Zentral-Tschukotka interpretieren. Die Transformation von der graminoiden Tundra zur Waldtundra oder zur Strauch-Tundra habe ich als Prozess der Strauchbildung interpretiert, die einer Flächenvergrößerung von 20% in der Tundra-Taiga Zone und einer Flächenvergrößerung von 40% in der nördlichen Taiga entspricht. Hauptakteure der Strauchung sind Erle, Zwergbirke und einige Arten der Heidekrautfamilie. Der Landbedeckungswechsel von der Waldtundra- und Strauch-Tundra-Klasse zur Klasse des Lärchen-Waldes mit geschlossenen Blätterdach wird als eine Verdichtung des Baumbestandes interpretiert und ist in der nördlichen Taiga bemerkenswert. In der heutigen baumlosen Tundra finden wir fast keine Landbedeckungsänderungen. Im zweiten Projekt bestimmte ich den Gesamt-AGB-Zustand und die gesamte AGB-Veränderung für dieselben Regionen in Zentral-Chukotka. Zusätzlich zur gesamten AGB lieferte ich Schätzungen für die verschiedenen Taxa, die an den Feldstandorten vorhanden sind. Als Ergebnis lag die AGB in der Untersuchungsregion von Zentral-Tschukotka zwischen 0 kg m-2 in vegetationsarmen Gebieten und 16 kg m-2 in den Wäldern mit geschlossenem Blätterdach mit dem größten Anteil von Lärchen. Ein Vergleich der Veränderungen der AGB im Untersuchungszeitraum von 2000 bis 2016 zeigt, dass die größten Veränderungen (bis zu 1,25 kg m-2 Jahr-1) in der nördlichen Taiga und in den Gebieten auftraten, in denen sich die Landbedeckung hin zu einen Lärchenwald mit geschlossenen Blätterdach änderte. Unsere Schätzungen deuten auf einen allgemeinen Anstieg der gesamten AGB in der untersuchten Tundra-Taiga und der nördlichen Taiga hin. Im Gegensatz zeigte die Tundra innerhalb der 15 Jahre von 2002 bis 2017 keine Hinweise auf eine Veränderung der AGB. Im dritten Projekt wurden potenzielle zukünftige Änderungen der oberirdischen Biomasse (AGB) basierend auf den Ergebnissen von Simulationen des individuell basierten räumlich expliziten Vegetationsmodells LAVESI unter Verwendung verschiedener Klimaszenarien, abhängig von RCP (Representative Concentration Pathways) 2.6, RCP 4.5 und RCP 8.5 (mit und ohne die Temperaturminderung nach den 2300 CE), geschätzt. Die LAVESI-basierte AGB wurde für den aktuellen Zustand bis 3000 CE für Lärchen-AGB simuliert, da wir davon ausgehen, dass die bemerkenswertesten Veränderungen im Baumgrenze-Ökoton mit einer Waldausdehnung zusammenhängen. Die räumliche Verteilung und der aktuelle Zustand der Baum-AGB wurden anhand von AGB-Felddaten, aus Landsat-Satellitendaten extrahierten AGB und einem Satellitenbild mit hoher räumlicher Auflösung und dadurch sichtbaren Einzelbäumen validiert. Die Simulationsergebnisse deuten auf Unterschiede in der Baum-AGB-Dynamik in Abhängigkeit von der Entfernung zur aktuellen Baumgrenze hin. Die simulierte Baum-AGB-Dynamik stimmt mit grundlegenden ökologischen (Auswanderungs- und Sukzessions-) Prozessen überein: die simulierte Baumbestandsentwicklung fängt mit Samenverbreitung an, Schaffung des Baumbestands, Baumbestand Verdichtung und episodische Verdünnung. Unsere Ergebnisse weisen auf eine Verdichtung des bestehenden Baumbestandes im Laufe dieses Jahrhunderts hin in der Untersuchungsregion, und auf eine zeitlich verzögerte Waldverbreitung (bis zu 39% der Fläche im RCP 8.5) unter allen betrachteten Klima-Szenarien ohne Abkühlung in verschiedenen lokalen Bereichen, abhängig von der Nähe zur heutigen Baumgrenze. In Szenarien mit Abkühlung nach 2300 CE beenden die Wälder ihre Ausbreitung um 2300 CE; bis zu 10%, RCP 8.5) um dann graduell zu ihrer vor 21. Jhd. Position zurückzuweichen. Die gemittelten Änderungsraten der Baum AGB sind am höchsten in den ersten 300 Jahren des 21. Jahrhunderts. Die Änderungsraten hängen ab von dem RCP Szenarium, mit den höchsten Änderungsraten unter RCP 8.5, wie zu erwarten war. Insgesamt zeigt diese interdisziplinäre Arbeit eine erfolgreiche Integration von Felddaten, Satellitendaten und Modellen zur Verfolgung der aktuellen und vorhergesagten zukünftigen Vegetationsänderungen in subarktischen Gebirgsregionen. Die erzielten Ergebnisse sind einzigartig für den Schwerpunktbereich in Zentral-Tschukotka und insgesamt für Gebirgsregionen in den hohen Breiten. T2 - Aktuelle und zukünftige Vegetationsveränderung in der Baumgrenzenregion von Chukotka (Nordost-Russland), abgeleitet aus Felddaten, Satellitendaten und Modellierung KW - plant ecology KW - vegetation change KW - Chukotka vegetation KW - above-ground biomass KW - land-cover classification KW - LAVESI KW - tree infilling KW - shrubification KW - subarctic vegetation change KW - treeline KW - tundra-taiga KW - Larix cajanderi KW - Vegetation von Tschukotka KW - oberirdische Biomasse KW - Klassifikation der Landbedeckung KW - Pflanzenökologie KW - Vegetationsveränderungen in der Subarktis KW - Waldausdehnung KW - Vegetationsveränderungen KW - Baumgrenze KW - Tundra-Taiga Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-548452 ER - TY - THES A1 - Sun, Xianlei T1 - Elasticity of fiber meshes derived from multiblock copolymers influences cell behaviors T1 - Elastizität von Fasergeweben abgeleitet Multiblockcopolymere beeinflussen das Zellverhalten. N2 - Objective: The behaviors of endothelial cells or mesenchymal stem cells are remarkably influenced by the mechanical properties of their surrounding microenvironments. Here, electrospun fiber meshes containing various mechanical characteristics were developed from polyetheresterurethane (PEEU) copolymers. The goal of this study was to explore how fiber mesh stiffness affected endothelial cell shape, growth, migration, and angiogenic potential of endothelial cells. Furthermore, the effects of the E-modulus of fiber meshes on human adipose-derived stem cells (hADSCs) osteogenic potential was investigated. Methods: Polyesteretherurethane (PEEU) polymers with various poly(p-dioxanone) (PPDO) to poly (ε-caprolactone) (PCL) weight percentages (40 wt.%, 50 wt.%, 60 wt.%, and 70 wt.%) were synthesized, termed PEEU40, PEEU50, PEEU60, and PEEU70, accordingly. The electrospinning method was used for the preparation of PEEU fiber meshes. The effects of PEEU fiber meshes with varying elasticities on the human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) shape, growth, migration and angiogenic potential were characterized. To determine how the E-modulus of fiber meshes affects the osteogenic potential of hADSCs, the cellular and nuclear morphologies and osteogenic differentiation abilities were evaluated. Results: With the increasing stiffness of PEEU fiber meshes, the aspect ratios of HUVECs cultivated on PEEU materials increased. HUVECs cultivated on high stiffness fiber meshes (4.5 ± 0.8 MPa) displayed a considerably greater proliferation rate and migratory velocity, in addition demonstrating increased tube formation capability, compared with those of the cells cultivated on lower stiffness fiber meshes (2.6 ± 0.8 MPa). Furthermore, in comparison to those cultivated on lower stiffness fiber meshes, hADSCs adhered to the highest stiffness fiber meshes PEEU70 had an elongated shape. The hADSCs grown on the softer PEEU40 fiber meshes showed a reduced nuclear aspect ratio (width to height) than those cultivated on the stiffer fiber meshes. Culturing hADSCs on stiffer fibers improved their osteogenic differentiation potential. Compared with cells cultured on PEEU40, osteocalcin expression and alkaline phosphatase (ALP) activity increased by 73 ± 10% and 43 ± 16%, respectively, in cells cultured on PEEU70. Conclusion: The mechanical characteristics of the substrate are crucial in the modulation of cell behaviors. These findings indicate that adjusting the elasticity of fiber meshes might be a useful method for controlling the blood vessels development and regeneration. Furthermore, the mechanical characteristics of PEEU fiber meshes might be modified to control the osteogenic potential of hADSCs. N2 - Ziel: Das Verhalten von Endothelzellen oder mesenchymalen Stammzellen wird erheblich von den mechanischen Eigenschaften der Mikroumgebung beeinflusst. Hier wurden elektrogesponnene Fasernetze mit unterschiedlicher Elastizität aus Polyetheresterurethan (PEEU) hergestellt. Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss der Elastizität von Fasernetzen auf die Zellmorphologie, Proliferation, Migration und Angiogenese von Endothelzellen zu untersuchen. Außerdem war der Einfluss des E-Moduls von Fasersubstraten auf die Bindung an die Abstammungslinie von humanen Fettstammzellen (hADSCs) untersucht. Methoden: Polyesteretherurethane (PEEU) mit unterschiedlichen Poly(p-dioxanon) (PPDO) to Poly (ε-Caprolacton) （PCL）-Gewichtsverhältnissen (40:60, 50:50, 60:40, 70:30) wurden synthetisiert und als PEEU40, PEEU50, PEEU60 bzw. PEEU70 bezeichnet. Die Fasernetze wurden durch Elektrospinnen von PEEU hergestellt. Dann wurden humane Endothelzellen der Nabelschnurvene (HUVECs) auf diesen elektrogesponnenen Fasernetzen aus Polyetheresterurethan (PEEU) kultiviert, die sich in ihrer Elastizität unterscheiden. Zellmorphologie, Proliferation, Migration und Angiogenese von Endothelzellen auf den abbaubaren Substraten wurden charakterisiert. Für den Einfluss des E-Moduls von Fasersubstraten auf die Bindung an die Abstammungslinie von hADSCs-Zellen und die Kernmorphologie wurde die Fähigkeit zur osteogenen Differenzierung bewertet. Ergebnisse: Das Aspektverhältnis von HUVECs, die auf den Fasernetzen aus PEEU-Materialien kultiviert wurden, nahm mit zunehmender Steifheit der Materialien zu. HUVECs, die auf Fasernetzen mit hoher Steifheit (Young-Modul E = 4,5 ± 0,8 MPa) kultiviert wurden, zeigten eine höhere Proliferationsrate und eine signifikant schnellere Migrationsgeschwindigkeit sowie ein höheres Röhrenbildungsvermögen als die Zellen, die auf Fasernetzen mit niedriger Steifheit kultiviert wurden (E = 2,6 ± 0,8 MPa). Des Weiteren zeigten an steiferen PEEU70-Fasernetzen (PPDO: PCL = 70:30) gebundene hADSCs eine verlängerte Morphologie im Vergleich zu jenen, die auf weicheren Fasern kultiviert wurden. Das Kernaspektverhältnis (Breite gegen Länge eines Kerns) von hADSCs, die auf weicheren PEEU40-Fasern (PPDO: PCL = 40:60) kultiviert wurden, war niedriger als auf steiferen Fasern. Die osteogene Differenzierung von hADSCs wurde durch Kultivierung auf steiferen Fasern verstärkt. Im Vergleich zu PEEU40 wurde in Zellen auf PEEU70 eine 73 ± 10% ige Steigerung der Osteocalcin-Expression und eine 34 ± 16% ige Steigerung der Aktivität der alkalischen Phosphatase (ALP) beobachtet. Schlussfolgerung: Die mechanischen Eigenschaften des Substrats spielen eine Schlüsselrolle bei der Modulation des Zellverhaltens. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das Einstellen der Elastizität der Fasernetze eine potenzielle Strategie zur Modulation der Bildung oder Regeneration von Blutgefäßen sein könnte. Darüber hinaus könnte die Differenzierung von hADSCs durch die Anpassung der mechanischen Eigenschaften von elektrogesponnenen Fasern gestaltet werden. KW - PEEU KW - fiber mesh scaffolds KW - osteogenesis KW - angiogenesis KW - stiffness KW - hADSC KW - HUVEC KW - HUVEC KW - PEEU KW - Angiogenese KW - Gerüste aus Fasergeflecht KW - hADSC KW - Osteogenese KW - Steifheit Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-535285 ER - TY - THES A1 - Moradian, Hanieh T1 - Modulation of human macrophage activity by mRNA-mediated genetic engineering N2 - Macrophages play an integral role for the innate immune system. It is critically important for basic research and therapeutic applications to find approaches to potentially modulate their function as the first line of defense. Transient genetic engineering via delivery of synthetic mRNA can serve for such purposes as a robust, reliable and safe technology to modulate macrophage functions. However, a major drawback particularly in the transfection of sensitive immune cells such as macrophages is the immunogenicity of exogenous IVT-mRNAs. Consequently, the direct modulation of human macrophage activity by mRNA-mediated genetic engineering was the aim of this work. The synthetic mRNA can instruct macrophages to synthesize specific target proteins, which can steer macrophage activity in a tailored fashion. Thus, the focus of this dissertation was to identify parameters triggering unwanted immune activation of macrophages, and to find approaches to minimize such effects. When comparing different carrier types as well as mRNA chemistries, the latter had unequivocally a more pronounced impact on activation of human macrophages and monocytes. Exploratory investigations revealed that the choice of nucleoside chemistry, particularly of modified uridine, plays a crucial role for IVT-mRNA-induced immune activation, in a dose-dependent fashion. Additionally, the contribution of the various 5’ cap structures tested was only minor. Moreover, to address the technical aspects of the delivery of multiple genes as often mandatory for advanced gene delivery studies, two different strategies of payload design were investigated, namely “bicistronic” delivery and “monocistronic” co-delivery. The side-by-side comparison of mRNA co-delivery via a bicistronic design (two genes, one mRNA) with a monocistronic design (two gene, two mRNAs) unexpectedly revealed that, despite the intrinsic equimolar nature of the bicistronic approach, it was outperformed by the monocistronic approach in terms of reliable co-expression when quantified on the single cell level. Overall, the incorporation of chemical modifications into IVT-mRNA by using respective building blocks, primarily with the aim to minimize immune activation as exemplified in this thesis, has the potential to facilitate the selection of the proper mRNA chemistry to address specific biological and clinical challenges. The technological aspects of gene delivery evaluated and validated by the quantitative methods allowed us to shed light on crucial process parameters and mRNA design criteria, required for reliable co-expression schemes of IVT-mRNA delivery. N2 - Makrophagen spielen eine wesentliche Rolle für das angeborene (innate) Immunsystem. Sowohl für die Grundlagenforschung sowie als auch für therapeutische Anwendungen ist es von größter Wichtigkeit, Möglichkeiten zu finden, die Funktion von Makrophagen als erstem Abwehrmechanismus des Immunsystems zu modulieren. Transientes Genetic Engineering mittels synthetischer mRNA kann hierbei als robuste, zuverlässige und sichere Technologie zur Modulation des Zellverhaltens zu dienen. Eine besondere Herausforderung ist jedoch die Immunogenität exogener IVT-mRNAs, insbesondere für sensitive Immunzellen wie Makrophagen. Die direkte Modulation der Zellaktivität von humanen Makrophagen durch mRNA-vermitteltes Genetic Engineering ist das Ziel dieser Arbeit. Mit synthetischer mRNA lassen sich Makrophagen so instruieren, dass sie spezifische Zielproteine produzieren, um die Zellaktivität bedarfsgerecht zu steuern. Der Hauptfokus dieser Dissertation war die Identifikation der Parameter, die eine aus dem IVT-mRNA Transfer resultierende, unerwünschten Zellaktivierung bei Makrophagen auslösen und Ansätze zu finden, um diese zu minimieren. Beim Vergleich verschiedener Transfektionsagenzien und Nukleinsäurekompositionen der mRNA zeigte sich, dass letztere einen weitaus eindeutigeren Effekt auf die Zellaktivierung von humanen Makrophagen und Monozyten haben. Explorative Untersuchungen ergaben, dass die Wahl der Nukleosidchemie, insbesondere des modifizierten Uridins, eine entscheidende Rolle für diese dosisabhängige Immunaktivierung durch IVT-mRNA spielt. Im Vergleich dazu war der Einfluss der verschiedenen getesteten 5'-Cap-Strukturen nur geringfügig. Der Transfer mehrerer Gene in Zellen ist für komplexe Studien und Anwendungen oft zwingend erforderlich. Hierzu wurden die technischen Aspekte von zwei verschiedenen Strategien untersucht, nämlich die "bicistronische" Transfektion und die "monocistronische" Co-Transfektion. Der direkte Vergleich von mRNA-Co-Transfer über ein bicistronisches Design (zwei Gene, eine mRNA) mit einem monocistronischen Design (zwei Gene, zwei mRNAs) ergab überraschenderweise, dass trotz der intrinsischen äquimolaren Natur des bicistronischen Ansatzes dieser dem monocistronische Ansatz in Bezug auf eine zuverlässige Koexpression bei der Quantifizierung auf Einzelzellebene unterlegen war. Wie in dieser Arbeit gezeigt kann die Einbeziehung geeigneter chemischer Modifikationen in IVT-mRNA durch die Verwendung der entsprechenden Bausteine bei der Synthese zur Bewältigung spezifischer biologischer und klinischer Herausforderungen beitragen, in erster Linie durch die Minimierung der Immunaktivierung. Die Evaluation und Validierung technologischer Aspekte des Gentransfers durch quantitative Methoden ermöglichten uns auch entscheidende Prozessparameter und Kriterien für das mRNA-Design zu identifizieren, die für eine zuverlässige Co-Expression von Genen nach IVT-mRNA Transfektion erforderlich sind. T2 - Modulation der Aktivität humaner Makrophagen durch mRNA-vermittelte gentechnische Eingriffe KW - In vitro transcription technology KW - Messenger RNA (mRNA) KW - mRNA chemistry KW - primary human macrophages KW - macrophage activation KW - genetic engineering KW - innate immune response KW - co-delivery of multiple genes KW - co-transfection KW - In-vitro-Transkriptionstechnologie KW - Boten-RNA (mRNA) KW - simultane Einbringung multipler Gene KW - Co-Transfektion KW - Gentechnik KW - angeborene Immunantwort KW - mRNA-Chemie KW - Makrophagen-Aktivierung KW - primäre humane Makrophagen Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-548579 ER - TY - THES A1 - Ramm, Timo T1 - Entwicklung von Multiplex-Methoden zur Antikörper-Charakterisierung und Validierung N2 - Antikörper werden in verschiedensten Bereichen, sowohl zu therapeutischen als auch zu diagnostischen und forschungsorientierten Zwecken verwendet. Vor der Verwendung des Antikörpers bedarf es der Charakterisierung seiner Eigenschaften, in Bezug auf sein Epitop und sein Bindeverhalten gegenüber dem Paratop. Gleichzeitig muss, in Abhängigkeit des Einsatzes, der Antikörper, für den gewünschten Gebrauch, validiert werden. Zu diesem Zweck wurden in der vorliegenden Arbeit Bead-basierte, multiplexe Testsysteme entworfen, ausgetestet und etabliert mit dem Ziel, eine einfache Screeningmethode zu entwickeln, um eine hohe Anzahl an Proben beziehungsweise Analyten gleichzeitig bestimmen zu können. Dafür wurden drei verschiedene Herangehensweisen etabliert. So wurden ein phospho-PKA-Substrat Antikörper, welcher phosphorylierte Bindemotive der PKA der Form RRxpS erkennt, gleichzeitig mit einer Reihe an Peptide getestet, welche Punktmutationen im Vergleich zur Konsensussequenz enthielten, um den Einfluss einzelner Aminosäuren auf die Bindung des Antikörpers zu untersuchen. Es konnte im Multiplex gezeigt werden, dass die Unterschiede im Antikörperbindungsverhalten in Abhängigkeit der Aminosäure an verschiedenen P-Positionen detektierbar waren. Mit dem Bead-basierten Multiplexansatz konnten, durch Messungen von Konzentrationsreihen des Antikörpers, Bindungskinetiken aufgenommen und diese mit bereits etablierten Methoden verglichen werden. Des Weiteren wurden verschiedene Antikörper, welche essenzielle Bestandteile von Bead-basierten Testsystemen darstellten, validiert. Es wurden dabei verschiedene Antikörper, welche spezifisch THC und CBD erkennen ausgetestet und anschließend ein kompetitiver Assay zur Detektion von THC und CBD in humanem Serum etabliert, und die Nachweisgrenzen bestimmt. Ferner sollten Pferdeseren von Tieren, welche am Sommerekzem leiden, auf ihren IgE-Gehalt hin bestimmt werden. Dafür wurden relevante Proteine rekombinant hergestellt und durch Immobilisierung an Beads im Multiplex mit Serum inkubiert. Die spezifische Bindung des IgE an die Allergen sollte damit messbar gemacht werden können. Für die Gesamtvalidierung des Testsystems wurden zuvor sämtliche Einzelschritte einzeln validiert, um im Anschluss im multiplexen Screening zu vermessen. Die Nutzung von Bead-basierten Multiplexmessungen als eine Plattformtechnologie erleichtert die Charakterisierung von Antikörpern sowie ihre Validierung für verschiedene Testsysteme. N2 - Antibodies are widely used in different fields, which include therapeutic as well as diagnostic and research applications Before the antibody can be used, its properties must be characterized with regard to its epitope and its binding behavior to the paratope. At the same time, depending on the application, the antibody must be validated for its desired use. For this purpose, bead-based multiplex assay systems were designed, tested, and established with the aim of developing a simple screening method to simultaneously measure a high number of samples or analytes. Thus, a phospho-PKA-substrate antibody, which recognizes phosphorylated binding motifs of PKA with the RRxpS motif, was tested. A series of peptides containing point mutations as compared to consensus sequences were used to investigate the influence of individual amino acids on the binding of the antibody. In a multiplex approach it was shown that the differences in the antibody binding behavior were detectable at different P-positions depending on the amino acid. Furthermore, it was possible to measure binding kinetics by the bead-based multiplex approach using dilution series of the antibody, and to compare these with already established methods. In addition to that, different antibodies, which were applied as essential components of bead-based biosensor systems, were validated. On the one hand, different antibodies specifically recognizing THC and CBD were tested and subsequently a competitive assay for the detection of THC and CBD in human serum was established. The detection limits could be determined. On the other hand, the IgG level in horse sera from animals suffering from sweet itch were determined. For this purpose, relevant proteins were recombinantly expressed, immobilized on beads and incubated with serum in a multiplex approach. The specific binding of IgE to the allergen was measurable. For the overall validation of the test system, all individual steps were partially validated beforehand to allow for a measurement in the multiplex screening system. Thus, using the advantages of bead-based multiplex measurements, a platform for the characterization of antibodies as well as their validation in different test systems was demonstrated. KW - Antikörper KW - Multiplex KW - THC KW - Proteinkinase A KW - Sommerekzem KW - CBD KW - Bead KW - Antikörpercharakterisierung KW - Antikörpervalidierung KW - antibody KW - antibody characterization KW - antibody validation KW - THC KW - CBD KW - Proteinkinase A KW - summer eczema Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-561531 ER - TY - THES A1 - Welsch, Maryna T1 - Investigation of the stress tolerance regulatory network integration of the NAC transcription factor JUNGBRUNNEN1 (JUB1) T1 - Untersuchung des Stresstoleranz-Regulationsnetzwerks des NAC-Transkriptionsfaktors JUNGBRUNNEN1 (JUB1) N2 - The NAC transcription factor (TF) JUNGBRUNNEN1 (JUB1) is an important negative regulator of plant senescence, as well as of gibberellic acid (GA) and brassinosteroid (BR) biosynthesis in Arabidopsis thaliana. Overexpression of JUB1 promotes longevity and enhances tolerance to drought and other abiotic stresses. A similar role of JUB1 has been observed in other plant species, including tomato and banana. Our data show that JUB1 overexpressors (JUB1-OXs) accumulate higher levels of proline than WT plants under control conditions, during the onset of drought stress, and thereafter. We identified that overexpression of JUB1 induces key proline biosynthesis and suppresses key proline degradation genes. Furthermore, bZIP63, the transcription factor involved in proline metabolism, was identified as a novel downstream target of JUB1 by Yeast One-Hybrid (Y1H) analysis and Chromatin immunoprecipitation (ChIP). However, based on Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA), direct binding of JUB1 to bZIP63 could not be confirmed. Our data indicate that JUB1-OX plants exhibit reduced stomatal conductance under control conditions. However, selective overexpression of JUB1 in guard cells did not improve drought stress tolerance in Arabidopsis. Moreover, the drought-tolerant phenotype of JUB1 overexpressors does not solely depend on the transcriptional control of the DREB2A gene. Thus, our data suggest that JUB1 confers tolerance to drought stress by regulating multiple components. Until today, none of the previous studies on JUB1´s regulatory network focused on identifying protein-protein interactions. We, therefore, performed a yeast two-hybrid screen (Y2H) which identified several protein interactors of JUB1, two of which are the calcium-binding proteins CaM1 and CaM4. Both proteins interact with JUB1 in the nucleus of Arabidopsis protoplasts. Moreover, JUB1 is expressed with CaM1 and CaM4 under the same conditions. Since CaM1.1 and CaM4.1 encode proteins with identical amino acid sequences, all further experiments were performed with constructs involving the CaM4 coding sequence. Our data show that JUB1 harbors multiple CaM-binding sites, which are localized in both the N-terminal and C-terminal regions of the protein. One of the CaM-binding sites, localized in the DNA-binding domain of JUB1, was identified as a functional CaM-binding site since its mutation strongly reduced the binding of CaM4 to JUB1. Furthermore, JUB1 transactivates expression of the stress-related gene DREB2A in mesophyll cells; this effect is significantly reduced when the calcium-binding protein CaM4 is expressed as well. Overexpression of both genes in Arabidopsis results in early senescence observed through lower chlorophyll content and an enhanced expression of senescence-associated genes (SAGs) when compared with single JUB1 overexpressors. Our data also show that JUB1 and CaM4 proteins interact in senescent leaves, which have increased Ca2+ levels when compared to young leaves. Collectively, our data indicate that JUB1 activity towards its downstream targets is fine-tuned by calcium-binding proteins during leaf senescence. N2 - Der NAC Transkriptionsfaktor (TF) JUNGBRUNNEN1 (JUB1) ist ein wichtiger negativer Regulator der Pflanzenseneszenz, Gibberellinsäure- (GA) und Brassinosteroid- (BR) Biosynthese in Arabidopsis thaliana. Die Überexpression von JUB1 fördert die Langlebigkeit und erhöht die Toleranz gegenüber Trockenheit und anderen abiotischen Belastungen. Bei anderen Pflanzenarten, einschließlich Tomaten und Bananen, wurde eine ähnliche Rolle von JUB1 beobachtet. Unsere Daten zeigen, dass JUB1 Überexpressionslinien im Vergleich zu WT-Pflanzen sowohl unter Kontrollbedingungen, als auch zu Beginn und während späterer Stadien von Trockenstress größere Mengen an Prolin akkumulieren. Wir haben festgestellt, dass die Überexpression von JUB1 die Schlüsselbiosynthese von Prolin induziert und Schlüsselgene für den Abbau von Prolin unterdrückt. Darüber hinaus wurde bZIP63, ein am Prolinstoffwechsel beteiligter Transkriptionsfaktor, mittels Yeast One-Hybrid-System (Y1H) und Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) als neues nachgeschaltetes Ziel von JUB1 identifiziert. Basierend auf dem Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) konnte die direkte Bindung von JUB1 an bZIP63 jedoch nicht bestätigt werden. Unsere Daten zeigen, dass JUB1-OXs unter Kontrollbedingungen eine niedrigere stomatale Leitfähigkeit aufweisen. Allerdings verbessert eine selektive Überexpression von JUB1 in den Schließzellen die Trockenstresstoleranz bei Arabidopsis nicht. Darüber hinaus hängt der trockenheitstolerante Phänotyp von JUB1 nicht allein von der transkriptionellen Kontrolle des DREB2A-Gens ab. Unsere Daten legen daher nahe, dass JUB1 durch die Regulierung mehrerer Komponenten Toleranz gegenüber Trockenstress verleiht. Bis heute konzentrierte sich keine der bisherigen Studien zum regulatorischen Netzwerk von JUB1 auf die Identifizierung von Protein-Protein-Interaktionen. Wir führten deshalb einen Hefe-Zwei-Hybrid-Screen (Y2H) durch, der mehrere Protein-Interaktoren von JUB1 identifizierte, von denen zwei Calcium-bindende Proteine sind (CaM1 und CaM4). Beide Proteine interagieren mit JUB1 im Kern von Arabidopsis-Protoplasten. Darüber hinaus wird JUB1 mit den CaM1- und CaM4-Genen unter den gleichen Bedingungen exprimiert und kolokalisiert mit den Proteinen im Zellkern von Arabidopsis thaliana-Protoplasten. Unsere Daten zeigen, dass JUB1 mehrere CaM-Bindungsstellen aufweist, die sowohl in der N-terminalen, als auch in der C-terminalen Region des Proteins lokalisiert sind. Eine der CaM-Bindungsstellen, die in der DNA-Bindungsdomäne von JUB1 lokalisiert ist, wurde als funktionelle und aktive CaM-Bindungsstelle identifiziert, da ihre Mutation die Bindung von CaM4 an JUB1 stark reduzierte. Darüber hinaus transaktiviert JUB1 die Expression des stressbezogenen Gens DREB2A in Mesophyllzellen. Dieser Effekt wird deutlich reduziert, wenn auch das Calcium-bindende Protein CaM4 exprimiert wird. Die Überexpression beider Gene in Arabidopsis führt zum frühen Seneszenz-Phänotyp, der durch einen verminderten Chlorophyllgehalt und eine veränderte SAGs-Expression im Vergleich zu einzelnen JUB1-Überexpressoren beobachtet wird. Unsere Daten zeigen auch, dass JUB1- und CaM4-Proteine in den seneszenten Blättern, die im Vergleich zu jungen Blättern erhöhte Ca2+-spiegel aufweisen, interagieren. Zusammenfassend weisen unsere Daten darauf hin, dass während der Blattseneszenz die Aktivität von JUB1 gegenüber seinen nachgeschalteten Zielen durch die Calcium-bindenden Proteine fein abgestimmt wird. KW - transcription factor KW - senescence KW - calmodulin KW - JUB1 KW - CaM4 KW - drought stress KW - CaM4 KW - JUB1 KW - calmodulin KW - Trockenstress KW - Seneszenz KW - Transkriptionsfaktor Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-547310 ER - TY - THES A1 - Milles, Alexander T1 - Sources and consequences of intraspecific trait variation in movement behaviour T1 - Ursachen und Konsequenzen intraspezifischer Merkmalsvariation im Bewegungsverhalten N2 - Variation in traits permeates and affects all levels of biological organisation, from within individuals to between species. Yet, intraspecific trait variation (ITV) is not sufficiently represented in many ecological theories. Instead, species averages are often assumed. Especially ITV in behaviour has only recently attracted more attention as its pervasiveness and magnitude became evident. The surge in interest in ITV in behaviour was accompanied by a methodological and technological leap in the field of movement ecology. Many aspects of behaviour become visible via movement, allowing us to observe inter-individual differences in fundamental processes such as foraging, mate searching, predation or migration. ITV in movement behaviour may result from within-individual variability and consistent, repeatable among-individual differences. Yet, questions on why such among-individual differences occur in the first place and how they are integrated with life-history have remained open. Furthermore, consequences of ITV, especially of among-individual differences in movement behaviour, on populations and species communities are not sufficiently understood. In my thesis, I approach timely questions on the sources and consequences of ITV, particularly, in movement behaviour. After outlining fundamental concepts and the current state of knowledge, I approach these questions by using agent-based models to integrate concepts from behavioural and movement ecology and to develop novel perspectives. Modern coexistence theory is a central pillar of community ecology, yet, insufficiently considers ITV in behaviour. In chapter 2, I model a competitive two-species system of ground-dwelling, central-place foragers to investigate the consequences of among-individual differences in movement behaviour on species coexistence. I show that the simulated among-individual differences, which matched with empirical data, reduce fitness differences betweem species, i.e. provide an equalising coexistence mechanism. Furthermore, I explain this result mechanistically and, thus, resolve an apparent ambiguity of the consequences of ITV on species coexistence described in previous studies. In chapter 3, I turn the focus to sources of among-individual differences in movement behaviour and their potential integration with life-history. The pace-of-life syndrome (POLS) theory predicts that the covariation between among-individual differences in behaviour and life-history is mediated by a trade-off between early and late reproduction. This theory has generated attention but is also currently scrutinised. In chapter 3, I present a model which supports a recent conceptual development that suggests fluctuating density-dependent selection as a cause of the POLS. Yet, I also identified processes that may alter the association between movement behaviour and life-history across levels of biological organization. ITV can buffer populations, i.e. reduce their extinction risk. For instance, among-individual differences can mediate portfolio effects or increase evolvability and, thereby, facilitate rapid evolution which can alleviate extinction risk. In chapter 4, I review ITV, environmental heterogeneity, and density-dependent processes which constitute local buffer mechanisms. In the light of habitat isolation, which reduces connectivity between populations, local buffer mechanisms may become more relevant compared to dispersal-related regional buffer mechanisms. In this chapter, I argue that capacities, latencies, and interactions of local buffer mechanisms should motivate more process-based and holistic integration of local buffer mechanisms in theoretical and empirical studies. Recent perspectives propose to apply principles from movement and community ecology to study filamentous fungi. It is an open question whether and how the arrangement and geometry of microstructures select for certain movement traits, and, thus, facilitate coexistence-stabilising niche partitioning. As a coauthor of chapter 5, I developed an agent-based model of hyphal tips navigating in soil-like microstructures along a gradient of soil porosity. By measuring network properties, we identified changes in the optimal movement behaviours along the gradient. Our findings suggest that the soil architecture facilitates niche partitioning. The core chapters are framed by a general introduction and discussion. In the general introduction, I outline fundamental concepts of movement ecology and describe theory and open questions on sources and consequences of ITV in movement behaviour. In the general discussion, I consolidate the findings of the core chapters and critically discuss their respective value and, if applicable, their impact. Furthermore, I emphasise promising avenues for further research. N2 - Die Variation von Merkmalen durchdringt und beeinflusst alle Ebenen der biologischen Organisation, von Individuen bis hin zu Artgemeinschaften. Dennoch wird die intraspezifische Merkmalsvariation (ITV) in vielen ökologischen Theorien nicht ausreichend berücksichtigt. Stattdessen wird oft von Durchschnittswerten der Arten ausgegangen. Insbesondere ITV im Verhalten hat erst in jüngster Zeit mehr Aufmerksamkeit erfahren, als dessen Verbreitung und Ausmaß deutlich wurden. Der Anstieg des Interesses an ITV im Verhalten ging mit einem methodischen und technologischen Sprung auf dem Gebiet der Bewegungsökologie einher. Viele Aspekte des Verhaltens werden durch die Bewegung sichtbar und ermöglichen es uns, interindividuelle Unterschiede bei grundlegenden Prozessen wie Nahrungssuche, Partnersuche, Räuber-Beute-Beziehungen oder Migration zu beobachten. ITV im Bewegungsverhalten kann aus intraindividueller Variabilität und konsistenten, wiederholbaren Unterschieden zwischen einzelnen Individuen resultieren. Die Fragen, weshalb solche Unterschiede interindividuellen Unterschiede überhaupt auftreten und wie sie mit der Lebensgeschichte ("life-history") zusammenhängen, sind jedoch bislang ungeklärt. Darüber hinaus sind die Folgen von ITV, insbesondere von individuellen Unterschieden im Bewegungsverhalten, für Populationen und Artengemeinschaften nicht ausreichend bekannt. In meiner Dissertation gehe ich aktuellen Fragen zu den Quellen und Folgen von ITV, insbesondere im Bewegungsverhalten, nach. Nach einer Darstellung grundlegender Konzepte und des aktuellen Wissensstandes nähere ich mich diesen Fragen mit Hilfe agentenbasierter Modelle, um Konzepte aus der Verhaltens- und Bewegungsökologie zu integrieren und neue Perspektiven zu entwickeln. Die moderne Koexistenztheorie ist ein zentraler Pfeiler der Gemeinschaftsökologie, berücksichtigt aber ITV im Verhalten nur unzureichend. In Kapitel 2 modelliere ich ein System zweiter konkurrierender, bodenbewohnender Arten mit zentralisierten Streifgebieten, um die Folgen von Unterschieden im Bewegungsverhalten zwischen Individuen auf die Koexistenz der Arten zu untersuchen. Ich zeige, dass die simulierten interindividuellen Unterschiede, die mit empirischen Daten übereinstimmen, die Fitnessunterschiede zwischen den Arten verringern, d. h. einen ausgleichenden Koexistenzmechanismus darstellen. Darüber hinaus erkläre ich dieses Ergebnis mechanistisch und löse damit eine scheinbare Zweideutigkeit der in früheren Studien beschriebenen Folgen von ITV auf die Koexistenz von Arten auf. In Kapitel 3 richte ich den Fokus auf die Quellen individueller Unterschiede im Bewegungsverhalten und deren mögliche Integration in die Lebensgeschichte. Die Theorie des "pace-of-life" Syndroms (POLS) sagt voraus, dass die Kovariation zwischen individuellen Unterschieden im Verhalten und der Lebensgeschichte durch einen Zielkonflikt zwischen früher und später Reproduktion vermittelt wird. Diese Theorie hat viel Aufmerksamkeit erregt, wird aber derzeit auch kritisch betrachtet. In Kapitel 3 stelle ich ein Modell vor, das Hypothesen einer neuere konzeptionelle Entwicklung stützt, die eine fluktuierende, dichteabhängige Selektion als Ursache des POLS nahelegt. Ich habe jedoch auch Prozesse identifiziert, die den Zusammenhang zwischen Bewegungsverhalten und Lebensgeschichte auf verschiedenen Ebenen der biologischen Organisation verändern können. ITV kann Populationen puffern, d. h. ihr Aussterberisiko verringern. So können beispielsweise Unterschiede zwischen Individuen Portfolioeffekte vermitteln oder die Fähigkeit zur Anpassung erhöhen und damit etwa eine schnelle Evolution erleichtern, die das Aussterberisiko verringern kann. In Kapitel 4 gebe ich einen Überblick über ITV, Umweltheterogenität und dichteabhängige Prozesse, die lokale Puffermechanismen darstellen. Angesichts der Isolierung von Lebensräumen, die die Konnektivität zwischen Populationen verringert, können lokale Puffermechanismen im Vergleich zu ausbreitungsbedingten regionalen Puffermechanismen an Bedeutung gewinnen. In diesem Kapitel argumentiere ich, dass Kapazitäten, Latenzen und Interaktionen lokaler Puffermechanismen zu einer prozessbasierten und ganzheitlichen Integration lokaler Puffermechanismen in theoretischen und empirischen Studien motivieren sollten. Neuere konzeptionelle Einsichten legen nahe, dass Prinzipien aus der Bewegungs- und Gemeinschaftsökologie auf die Untersuchung filamentöser Pilze angewendet können. In diesem Zusammenhang ist es eine offene Frage, ob und wie die Anordnung und Geometrie von Mikrostrukturen für bestimmte Bewegungseigenschaften selektieren und damit eine koexistenzstabilisierende Nischenaufteilung erleichtern. Als Koautor von Kapitel 5 habe ich ein agentenbasiertes Modell der Hyphenspitzen entwickelt. In diesem Modell navigieren die Hyphenspitzen in bodenähnlichen Mikrostrukturen entlang eines Gradienten der Bodenporosität. Durch die Messung von Netzwerkeigenschaften konnten wir Veränderungen des optimalen Bewegungsverhaltens entlang des Gradienten feststellen. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Bodenarchitektur eine ökologische Nische mit verschiedenen Bewegungsoptima darstellt. Die Hauptkapitel werden von einer allgemeinen Einführung und einer Diskussion eingerahmt. In der allgemeinen Einführung umreiße ich die grundlegenden Konzepte der Bewegungsökologie und beschreibe die Theorie und die offenen Fragen zu den Ursachen und Folgen von ITV im Bewegungsverhalten. In der allgemeinen Diskussion fasse ich die Ergebnisse der Kernkapitel zusammen und diskutiere kritisch ihren jeweiligen Wert und gegebenenfalls ihre Auswirkungen. Darüber hinaus zeige ich vielversprechende Wege für künftige Forschungsarbeiten auf. KW - ecology KW - movement ecology KW - agent-based model KW - intraspecific variation KW - species coexistence KW - pace-of-life syndrome KW - population persistence KW - Ökologie KW - Bewegungsökologie KW - Agentenbasierte Modelle KW - Intraspezifische Variation KW - Koexistenz KW - Pace-of-Life Syndrom KW - Populationspersistenz Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-565011 ER - TY - THES A1 - Kürschner, Tobias T1 - Disease transmission and persistence in dynamic landscapes T1 - Krankheitsübertragung und Persistenz in dynamischen Landschaft N2 - Infectious diseases are an increasing threat to biodiversity and human health. Therefore, developing a general understanding of the drivers shaping host-pathogen dynamics is of key importance in both ecological and epidemiological research. Disease dynamics are driven by a variety of interacting processes such as individual host behaviour, spatiotemporal resource availability or pathogen traits like virulence and transmission. External drivers such as global change may modify the system conditions and, thus, the disease dynamics. Despite their importance, many of these drivers are often simplified and aggregated in epidemiological models and the interactions among multiple drivers are neglected. In my thesis, I investigate disease dynamics using a mechanistic approach that includes both bottom-up effects - from landscape dynamics to individual movement behaviour - as well as top-down effects - from pathogen virulence on host density and contact rates. To this end, I extended an established spatially explicit individual-based model that simulates epidemiological and ecological processes stochastically, to incorporate a dynamic resource landscape that can be shifted away from the timing of host population-dynamics (chapter 2). I also added the evolution of pathogen virulence along a theoretical virulence-transmission trade-off (chapter 3). In chapter 2, I focus on bottom-up effects, specifically how a temporal shift of resource availability away from the timing of biological events of host-species - as expected under global change - scales up to host-pathogen interactions and disease dynamics. My results show that the formation of temporary disease hotspots in combination with directed individual movement acted as key drivers for pathogen persistence even under highly unfavourable conditions for the host. Even with drivers like global change further increasing the likelihood of unfavourable interactions between host species and their environment, pathogens can continue to persist with heir hosts. In chapter 3, I demonstrate that the top-down effect caused by pathogen-associated mortality on its host population can be mitigated by selection for lower virulent pathogen strains when host densities are reduced through mismatches between seasonal resource availability and host life-history events. I chapter 4, I combined parts of both theoretical models into a new model that includes individual host movement decisions and the evolution of pathogenic virulence to simulate pathogen outbreaks in realistic landscapes. I was able to match simulated patterns of pathogen spread to observed patterns from long-term outbreak data of classical swine fever in wild boar in Northern Germany. The observed disease course was best explained by a simulated high virulent strain, whereas sampling schemes and vaccination campaigns could explain differences in the age-distribution of infected hosts. My model helps to understand and disentangle how the combination of individual decision making and evolution of virulence can act as important drivers of pathogen spread and persistence. As I show across the chapters of this thesis, the interplay of both bottom-up and top-down processes is a key driver of disease dynamics in spatially structured host populations, as they ultimately shape host densities and contact rates among moving individuals. My findings are an important step towards a paradigm shift in disease ecology away from simplified assumptions towards the inclusion of mechanisms, such as complex multi-trophic interactions, and their feedbacks on pathogen spread and disease persistence. The mechanisms presented here should be at the core of realistic predictive and preventive epidemiological models. N2 - Infektionskrankheiten stellen eine zunehmende Bedrohung für die biologische Vielfalt und die menschliche Gesundheit dar. Daher ist es sowohl für die epidemiologische als auch für die ökologische Forschung von zentraler Bedeutung, ein allgemeines Verständnis der Mechanismen, die die Wirts-Pathogen-Dynamik beeinflussen, zu entwickeln. Die Krankheitsausbrüche werden durch eine Vielzahl von interagierenden Prozessen angetrieben, wie unter anderem individuellem Wirtsverhalten, Ressourcenverfügbarkeit oder Erregermerkmale wie Virulenz. Externe Faktoren wie der globale Wandel können grundlegende Veränderungen dieser Prozesse verursachen und sich damit auch auf Krankheitsdynamiken auswirken. Trotz ihrer Bedeutung für Krankheitsausbrüche werden viele dieser Faktoren in epidemiologischen Modellen oft vereinfacht und die Wechselwirkungen zwischen den Faktoren vernachlässigt. In Anbetracht dessen, ist es sowohl für die ökologische als auch für die epidemiologische Forschung von zentraler Bedeutung, ein allgemeines Verständnis dafür zu entwickeln, wie mehrere interagierende Prozesse Wirts-Pathogen-Interaktionen beeinflussen können. In meiner Dissertation untersuche ich die Krankheitsdynamik mittels eines mechanistischen Ansatzes, der sowohl Bottom-up-Effekte - von der Landschaftsdynamik bis zum individuellen Bewegungsverhalten - als auch Top-down-Effekte - von der Virulenz des Erregers auf die Wirtsdichte und die Kontaktraten - berücksichtigt. Zu diesem Zweck habe ich ein etabliertes, räumlich explizites, Individuen basiertes Modell, das epidemiologische und ökologische Prozesse stochastisch simuliert, um eine dynamische Ressourcenlandschaft erweitert, die zeitlich mit der Populationsdynamik der Wirte verschoben werden kann (Kapitel 2). Zusätzlich habe ich die Evolution der Virulenz von Krankheitserregern entlang eines theoretischen Verhältnisses zwischen Virulenz und Übertragung hinzugefügt (Kapitel 3). In Kapitel 2 konzentriere ich mich auf Bottom-up-Effekte, insbesondere auf die Frage, wie sich eine zeitliche Verschiebung der Ressourcenverfügbarkeit weg vom Zeitpunkt biologischer Ereignisse der Wirtsarten - wie sie im Rahmen des globalen Wandels erwartet wird - auf die Wirt-Pathogen-Interaktionen und Krankheitsdynamiken auswirkt. Meine Ergebnisse zeigen, dass die Bildung vorübergehender Krankheitsherde in Kombination mit gezielter individueller Wirtsbewegung als Schlüsselfaktoren für die Persistenz von Krankheitserregern selbst unter äußerst ungünstigen Bedingungen für den Wirt fungieren. Selbst wenn Faktoren wie der globale Wandel die Wahrscheinlichkeit ungünstiger Wechselwirkungen zwischen Wirtsarten und ihrer Umwelt weiter erhöhen, können Krankheitserreger weiterhin in ihren Wirten persistieren. In Kapitel 3 zeige ich, dass der Top-Down-Effekt, der durch die pathogen-assoziierte Mortalität verursacht wird, durch eine evolutionäre Selektion auf weniger virulente Erregerstämme abgeschwächt werden kann, wenn die Wirtsdichte durch eine zeitliche Verschiebung von saisonaler Ressourcenverfügbarkeit und dem Zeitpunkt von biologischen Ereignissen der Wirtsarten reduziert wird. In Kapitel 4 habe ich Teile der beiden theoretischen Modelle zu einem neuen Modell kombiniert, das individuelle Wirtsbewegungen und die Entwicklung der Virulenz von Krankheitserregern einbezieht, um Ausbrüche von Krankheitserregern in realistischen Landschaften zu simulieren. Es gelang mir, die simulierten Muster der Krankheitsausbreitung mit beobachteten Mustern von Langzeitausbrüchen der klassischen Schweinepest in Wildschweinen in Norddeutschland abzugleichen. Der beobachtete Krankheitsverlauf ließ sich am besten durch einen simulierten hochvirulenten Stamm erklären, während das Design der Probenentnahmen und Impfkampagnen Unterschiede in der Altersverteilung der infizierten Wirte erklären könnten. Mein Modell trägt dazu bei, zu verstehen, wie die Kombination aus individueller Bewegung und der Evolution von Virulenz als wichtige Treiber für die Ausbreitung und Persistenz des Erregers wirken können. Wie ich in den Kapiteln dieser Arbeit zeige, ist das Zusammenspiel von Bottom-up- und Top-down-Prozessen ein entscheidender Faktor für die Krankheitsdynamik in Wirtspopulationen, da sie letztlich die Wirtsdichte und den Kontakt zwischen sich bewegenden Individuen bestimmen. Meine Ergebnisse sind ein wichtiger Schritt auf dem Weg zu einem Paradigmenwechsel in der Krankheitsökologie, weg von vereinfachten Annahmen hin zur Einbeziehung von komplexen Interaktionen und deren Rückkopplungen auf die Ausbreitung und Persistenz von Krankheitserregern. Die hier vorgestellten Mechanismen sollten den Kern realistischer Vorhersage- und Präventivmodelle für die Epidemiologie bilden. KW - disease ecology KW - movement ecology KW - Krankheitsökologie KW - Bewegungsökologie Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-564689 ER - TY - THES A1 - Folikumah, Makafui Yao T1 - Stimuli-promoted in situ formation of hydrogels with thiol/thioester containing peptide precursors T1 - Stimuli-induzierte In-Situ-Bildung von Hydrogelen durch Peptid-Prekursor mit Thiol/Thioestergruppen N2 - Hydrogels are potential synthetic ECM-like substitutes since they provide functional and structural similarities compared to soft tissues. They can be prepared by crosslinking of macromolecules or by polymerizing suitable precursors. The crosslinks are not necessarily covalent bonds, but could also be formed by physical interactions such as π-π interactions, hydrophobic interactions, or H-bonding. On demand in situ forming hydrogels have garnered increased interest especially for biomedical applications over preformed gels due to the relative ease of in vivo delivery and filling of cavities. The thiol-Michael addition reaction provides a straightforward and robust strategy for in situ gel formation with its fast reaction kinetics and ability to proceed under physiological conditions. The incorporation of a trigger function into a crosslinking system becomes even more interesting since gelling can be controlled with stimulus of choice. The use of small molar mass crosslinker precursors with active groups orthogonal to thiol-Michael reaction type electrophile provides the opportunity to implement an on-demand in situ crosslinking without compromising the fast reaction kinetics. It was postulated that short peptide sequences due to the broad range structural-function relations available with the different constituent amino acids, can be exploited for the realisation of stimuli-promoted in situ covalent crosslinking and gelation applications. The advantages of this system over conventional polymer-polymer hydrogel systems are the ability tune and predict material property at the molecular level. The main aim of this work was to develop a simplified and biologically-friendly stimuli-promoted in situ crosslinking and hydrogelation system using peptide mimetics as latent crosslinkers. The approach aims at using a single thiodepsipeptide sequence to achieve separate pH- and enzyme-promoted gelation systems with little modification to the thiodepsipeptide sequence. The realization of this aim required the completion of three milestones. In the first place, after deciding on the thiol-Michael reaction as an effective in situ crosslinking strategy, a thiodepsipeptide, Ac-Pro-Leu-Gly-SLeu-Leu-Gly-NEtSH (TDP) with expected propensity towards pH-dependent thiol-thioester exchange (TTE) activation, was proposed as a suitable crosslinker precursor for pH-promoted gelation system. Prior to the synthesis of the proposed peptide-mimetic, knowledge of the thiol-Michael reactivity of the would-be activated thiol moiety SH-Leu, which is internally embedded in the thiodepsipeptide was required. In line with pKa requirements for a successful TTE, the reactivity of a more acidic thiol, SH-Phe was also investigated to aid the selection of the best thiol to be incorporated in the thioester bearing peptide based crosslinker precursor. Using ‘pseudo’ 2D-NMR investigations, it was found that only reactions involving SH-Leu yielded the expected thiol-Michael product, an observation that was attributed to the steric hindrance of the bulkier nature of SH-Phe. The fast reaction rates and complete acrylate/maleimide conversion obtained with SH-Leu at pH 7.2 and higher aided the direct elimination of SH-Phe as a potential thiol for the synthesis of the peptide mimetic. Based on the initial studies, for the pH-promoted gelation system, the proposed Ac-Pro-Leu-Gly-SLeu-Leu-Gly-NEtSH was kept unmodified. The subtle difference in pKa values between SH-Leu (thioester thiol) and the terminal cysteamine thiol from theoretical conditions should be enough to effect a ‘pseudo’ intramolecular TTE. In polar protic solvents and under basic aqueous conditions, TDP successfully undergoes a ‘pseudo’ intramolecular TTE reaction to yield an α,ω-dithiol tripeptide, HSLeu-Leu-Gly-NEtSH. The pH dependence of thiolate ion generation by the cysteamine thiol aided the incorporation of the needed stimulus (pH) for the overall success of TTE (activation step) – thiol-Michael addition (crosslinking) strategy. Secondly, with potential biomedical applications in focus, the susceptibility of TDP, like other thioesters, to intermolecular TTE reaction was probed with a group of thiols of varying thiol pKa values, since biological milieu characteristically contain peptide/protein thiols. L-cysteine, which is a biologically relevant thiol, and a small molecular weight thiol, methylthioglycolate both with relatively similar thiol pKa, values, led to an increase concentration of the dithiol crosslinker when reacted with TDP. In the presence of acidic thiols (p-NTP and 4MBA), a decrease in the dithiol concentration was observed, an observation that can be attributed to the inability of the TTE tetrahedral intermediate to dissociate into exchange products and is in line with pKa requirements for successful TTE reaction. These results additionally makes TDP more attractive and the potentially the first crosslinker precursor for applications in biologically relevant media. Finally, the ability of TDP to promote pH-sensitive in situ gel formation was probed with maleimide functionalized 4-arm polyethylene glycol polymers in tris-buffered media of varying pHs. When a 1:1 thiol: maleimide molar ratio was used, TDP-PEG4MAL hydrogels formed within 3, 12 and 24 hours at pH values of 8.5, 8.0 and 7.5 respectively. However, gelation times of 3, 5 and 30 mins were observed for the same pH trend when the thiol: maleimide molar was increased to 2:1. A direct correlation of thiol content with G’ of the gels at each pH could also be drawn by comparing gels with thiol: maleimide ratios of 1:1 to those with 2:1 thiol: maleimide mole ratios. This is supported by the fact that the storage modulus (G') is linearly dependent on the crosslinking density of the polymer. The values of initial G′ for all gels ranged between (200 – 5000 Pa), which falls in the range of elasticities of certain tissue microenvironments for example brain tissue 200 – 1000 Pa and adipose tissue (2500 – 3500 Pa). Knowledge so far gained from the study on the ability to design and tune the exchange reaction of thioester containing peptide mimetic will give those working in the field further insight into the development of new sequences tailored towards specific applications. TTE substrate design using peptide mimetic as presented in this work has revealed interesting new insights considering the state-of-the-art. Using the results obtained as reference, the strategy provides a possibility to extend the concept to the controlled delivery of active molecules needed for other robust and high yielding crosslinking reactions for biomedical applications. Application for this sequentially coupled functional system could be seen e.g. in the treatment of inflamed tissues associated with urinary tract like bladder infections for which pH levels above 7 were reported. By the inclusion of cell adhesion peptide motifs, the hydrogel network formed at this pH could act as a new support layer for the healing of damage epithelium as shown in interfacial gel formation experiments using TDP and PEG4MAL droplets. The versatility of the thiodepsipeptide sequence, Ac-Pro-Leu-Gly-SLeu-Leu-Gly-(TDPo) was extended for the design and synthesis of a MMP-sensitive 4-arm PEG-TDPo conjugate. The purported cleavage of TDPo at the Gly-SLeu bond yields active thiol units for subsequent reaction of orthogonal Michael acceptor moieties. One of the advantages of stimuli-promoted in situ crosslinking systems using short peptides should be the ease of design of required peptide molecules due to the predictability of peptide functions their sequence structure. Consequently the functionalisation of a 4-arm PEG core with the collagenase active TDPo sequence yielded an MMP-sensitive 4-arm thiodepsipeptide-PEG conjugate (PEG4TDPo) substrate. Cleavage studies using thiol flourometric assay in the presence of MMPs -2 and -9 confirmed the susceptibility of PEG4TDPo towards these enzymes. The resulting time-dependent increase in fluorescence intensity in the presence of thiol assay signifies the successful cleavage of TDPo at the Gly-SLeu bond as expected. It was observed that the cleavage studies with thiol flourometric assay introduces a sigmoid non-Michaelis-Menten type kinetic profile, hence making it difficult to accurately determine the enzyme cycling parameters, kcat and KM . Gelation studies with PEG4MAL at 10 % wt. concentrations revealed faster gelation with MMP-2 than MMP-9 with 28 and 40 min gelation times respectively. Possible contributions by hydrolytic cleavage of PEG4TDPo has resulted in the gelation of PEG4MAL blank samples but only after 60 minutes of reaction. From theoretical considerations, the simultaneous gelation reaction would be expected to more negatively impact the enzymatic than hydrolytic cleavage. The exact contributions from hydrolytic cleavage of PEG4TDPo would however require additional studies. In summary this new and simplified in situ crosslinking system using peptide-based crosslinker precursors with tuneable properties exhibited in situ crosslinking gelation kinetics on similar levels with already active dithiols reported. The advantageous on-demand functionality associated with its pH-sensitivity and physiological compatibility makes it a strong candidate worth further research as biomedical applications in general and on-demand material synthesis is concerned. Results from MMP-promoted gelation system unveils a simple but unexplored approach for in situ synthesis of covalently crosslinked soft materials, that could lead to the development of an alternative pathway in addressing cancer metastasis by making use of MMP overexpression as a trigger. This goal has so far not being reach with MMP inhibitors despite the extensive work this regard. N2 - Hydrogele sind synthetische, potenziell ECM-ähnliche Substituenten, die funktionelle und strukturelle Ähnlichkeiten mit Weichteilgeweben aufweisen. Sie können durch Vernetzung von Makromolekülen oder durch Polymerisation geeigneter Precursoren hergestellt werden. Die Vernetzungen müssen nicht unbedingt aus kovalenten Bindungen bestehen, sondern können auch durch physikalische Wechselwirkungen wie π-π-Wechselwirkungen, hydrophoben Wechselwirkungen oder Wasserstoff-Brückenbindungen entstehen. In-situ-Hydrogele, die on-demand gebildet werden, haben vor allem für biomedizinische Anwendungen gegenüber vorgefertigten Gelen zunehmend an Interesse gewonnen, da sie relativ einfach in-vivo eingebracht und somit Fehlstellen gefüllt werden können. Die Thiol-Michael-Additionsreaktion bietet mit ihrer schnellen Reaktionskinetik und ihrer Fähigkeit, unter physiologischen Bedingungen abzulaufen, eine unkomplizierte und robuste Strategie für die in-situ-Gelbildung. Der Einbau einer Triggerfunktion in ein Vernetzungssystem ist besonders interessant, da die Gelierung durch einen gewählten Stimulus gesteuert werden kann. Die Verwendung eines Precursors mit geringer Molmasse und aktiven Gruppen, die orthogonal zu den Elektrophilen des Thiol-Michael-Reaktionstyps sind, bietet die Möglichkeit, eine bedarfsgesteuerte in-situ-Vernetzung zu realisieren, ohne die schnelle Reaktionskinetik zu beeinträchtigen. Es wurde postuliert, dass kurze Peptidsequenzen aufgrund der weitreichenden Struktur-Funktions-Beziehungen, die mit den verschiedenen konstituierenden Aminosäuren zur Verfügung stehen, für die Realisierung von Stimulus-ausgelösten, in-situ kovalenten Vernetzungs- und Gelierungsanwendungen genutzt werden können. Die Vorteile dieses Systems gegenüber herkömmlichen Polymer-Polymer-Hydrogelsystemen liegen in der Möglichkeit, die Materialeigenschaften auf molekularer Ebene zu justieren und vorherzusagen. Das Hauptziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines vereinfachten und biologisch-geeigneten, stimulierungsgeförderten in-situ-Vernetzungs- und Hydrogelierungssystems unter Verwendung von Peptidmimetika als latente Vernetzer. Der Ansatz zielt darauf ab, eine einzige Thiodepsipeptidsequenz zu verwenden, um getrennte pH- und enzymausgelöste Gelierungssysteme mit geringen Modifikationen der Thiodepsipeptidsequenz zu erreichen. Zur Verwirklichung dieses Ziels, mussten drei Meilensteine erreicht werden. Nach der Wahl der Thiol-Michael-Reaktion als in-situ-Vernetzungsstrategie, musste ein Thiodepsipeptid, Ac-Pro-Leu-Gly-SLeu-Leu-Gly-NEtSH (TDP) mit einer zu erwartenden Neigung zu einer pH-abhängigen Thiol-Thioester-Austausch-Aktivierung (TTE), als geeignetem Vernetzer-Precursor für das pH-unterstützte Gelierungssystem designt werden. Vor der Synthese dieses Peptid-Mimetikums war die Untersuchung der Thiol-Michael-Reaktivität der potenziell aktivierten Thiolkomponente SH-Leu erforderlich, die intern in das Thiodepsipeptid eingebettet ist. In Übereinstimmung mit den pKa-Anforderungen für eine erfolgreiche TTE wurde auch die Reaktivität eines saureren Thiols, SH-Phe, untersucht, um die Auswahl des besten Thiols zu ermöglichen, das in den Thioester-tragenden Peptid-basierten Vernetzer-Precursor eingebaut werden sollte. Pseudo-2D-NMR-Untersuchungen zeigten, dass nur Reaktionen mit SH-Leu das erwartete Thiol-Michael-Produkt ergaben, eine Beobachtung, die auf die sterische Hinderung durch die sperrige Natur von SH-Phe zurückzuführen ist. Wegen der schnellen Reaktionsgeschwindigkeiten und der vollständigen Acrylat/Maleimid-Umwandlung, die mit SH-Leu bei einem pH-Wert von 7,2 und höher erzielt wurde, kam SH-Phe als potenzielles Thiol für die Synthese des Peptidmimetikums nicht mehr infrage. Auf der Grundlage der ersten Studien wurde für das pH-basierte Gelierungssystem das vorgeschlagene Ac-Pro-Leu-Gly-SLeu-Leu-Gly-NEtSH unverändert beibehalten. Der geringe Unterschied in den pKa-Werten zwischen SH-Leu (Thioesterthiol) und dem terminalen Cysteaminthiol sollte ausreichen, um eine "pseudo"-intramolekulare TTE zu bewirken. In polaren protischen Lösungsmitteln und unter basischen wässrigen Bedingungen verläuft die "pseudo"-intramolekulare TTE-Reaktion bei TDP erfolgreich, bei der ein α,ω-Dithiol-Tripeptid, HSLeu-Leu-Gly-NEtSH, entsteht. Die pH-Abhängigkeit der Thiolat-Ionen-Generierung durch das Cysteamin-Thiol trug dazu bei, den notwendigen Stimulus (pH) für den Gesamterfolg der TTE (Aktivierungsschritt) - Thiol-Michael-Addition (Vernetzung) Strategie einzubauen. Zweitens wurde mit Blick auf potenzielle biomedizinische Anwendungen die Empfindlichkeit von TDP, wie auch anderer Thioester, für die intermolekulare TTE-Reaktion mit einer Gruppe von Thiolen mit unterschiedlichen Thiol-pKa-Werten untersucht, da biologische Milieus typischerweise Peptid-/Proteinthiole enthalten. L-Cystein, ein biologisch relevantes Thiol, und ein Thiol mit geringem Molekulargewicht, Methylthioglykolat, die beide relativ ähnliche Thiol-pKa-Werte besitzen, führten bei der Reaktion mit TDP zu einer erhöhten Konzentration des Dithiol-Vernetzers. In Gegenwart von sauren Thiolen (p-NTP und 4MBA) wurde eine Abnahme der Dithiolkonzentration beobachtet, eine Beobachtung, die auf die Unfähigkeit des tetraedrischen TTE-Zwischenprodukts in Austauschprodukte zu dissoziieren zurückgeführt werden kann und mit den pKa-Anforderungen für eine erfolgreiche TTE-Reaktion in Einklang steht. Diese Ergebnisse machen TDP noch attraktiver und zum potenziell ersten Vernetzer-Precursor für Anwendungen in biologisch relevanten Medien. Schließlich wurde die Fähigkeit von TDP, die pH-empfindliche in-situ-Gelbildung zu fördern, mit Maleimid-funktionalisierten 4-armigen Polyethylenglykolpolymeren in tris-gepufferten Medien mit unterschiedlichen pH-Werten untersucht. Bei einem Molverhältnis von 1:1 Thiol zu Maleimid bildeten sich TDP-PEG4MAL-Hydrogele innerhalb von 3, 12 und 24 Stunden bei pH-Werten von 8,5, 8,0 bzw. 7,5. Bei einer Erhöhung des Molverhältnisses von Thiol zu Maleimid auf 2:1 wurden jedoch Gelierzeiten von 3, 5 und 30 Minuten für denselben pH-Trend beobachtet. Ein direkter Zusammenhang zwischen dem Thiolgehalt und G' der Gele bei jedem pH-Wert konnte auch durch den Vergleich von Gelen mit einem Thiol/Maleimid-Molverhältnis von 1:1 mit solchen mit einem Thiol/Maleimid-Molverhältnis von 2:1 hergestellt werden. Dies wird durch die Tatsache unterstützt, dass der Speichermodulus (G') linear von der Vernetzungsdichte des Polymers abhängig ist. Die Werte des anfänglichen G′ für alle Gele lagen bei 200 - 5000 Pa, was in den Bereich der Elastizitäten bestimmter Gewebe-Mikroumgebungen fällt, z. B. Gehirngewebe (200 - 1000 Pa) und Fettgewebe (2500 - 3500 Pa). Die bisher aus der Studie gewonnenen Erkenntnisse über die Möglichkeit, die Austauschreaktion von Thioester-haltigen Peptidmimetika zu entwerfen und abzustimmen, geben weitere Einblicke in die Entwicklung neuer, auf spezifische Anwendungen zugeschnittener Sequenzen. Das Design von TTE-Substraten unter Verwendung von Peptidmimetika, wie es in dieser Arbeit vorgestellt wurde, hat interessante neue Erkenntnisse im Hinblick auf den Stand der Technik gebracht. Mit den erzielten Ergebnissen als Basis bietet die Strategie die Möglichkeit, das Konzept auf die kontrollierte Freisetzung aktiver Moleküle zu erweitern, die für andere robuste Vernetzungsreaktionen mit hohem Umsatz für biomedizinische Anwendungen benötigt werden. Dieses sequentiell gekoppelte funktionelle System könnte z. B. bei der Behandlung von entzündetem Gewebe im Zusammenhang mit Harnwegsinfektionen wie Blasenentzündungen eingesetzt werden, für die pH-Werte über 7 berichtet wurden. Durch die Einbeziehung von Zelladhäsionspeptidmotiven könnte das bei diesem pH-Wert gebildete Hydrogelnetz als neue Stützschicht für die Heilung von geschädigtem Epithel fungieren, wie in Experimenten zur Bildung von Grenzflächengelen mit TDP- und PEG4MAL-Tropfen gezeigt wurde. Die Vielseitigkeit der Thiodepsipeptidsequenz Ac-Pro-Leu-Gly-SLeu-Leu-Gly-(TDPo) wurde um Design und die Synthese eines MMP-empfindlichen 4-armigen PEG-TDPo-Konjugats erweitert. Die beabsichtigte Spaltung von TDPo an der Gly-SLeu-Bindung liefert aktive Thiol-Einheiten für die anschließende Reaktion orthogonaler Michael-Akzeptor-Einheiten. Einer der Vorteile stimulierungsgestützter in-situ-Vernetzungssysteme unter Verwendung kurzer Peptide dürfte darin liegen, dass sich die erforderlichen Peptidmoleküle aufgrund der Vorhersagbarkeit der Peptidfunktionen und ihrer Sequenzstruktur leicht entwerfen lassen. Die Funktionalisierung eines vierarmigen PEG-Kerns mit der kollagenaseaktiven TDPo-Sequenz führte zu einem MMP-empfindlichen vierarmigen Thiodepsipeptid-PEG-Konjugat (PEG4TDPo). Spaltungs-Studien unter Verwendung eines thiolfluorimetrischen Assays in Gegenwart der MMPs -2 und -9 bestätigten die Spaltbarkeit von PEG4TDPo durch diese Enzyme. Der daraus resultierende zeitabhängige Anstieg der Fluoreszenzintensität in Anwesenheit des Thiol-Assays deutet auf die erfolgreiche Spaltung von TDPo an der Gly-SLeu-Bindung hin. Es wurde festgestellt, dass die Spaltungsstudien mit dem thiol-fluorimetrischen Assay ein sigmoides, nicht-Michaelis-Menten-artiges kinetisches Profil ergeben, was eine genaue Bestimmung der Enzymzyklusparameter, kcat und KM, erschwert. Gelierungsstudien mit PEG4MAL in einer Konzentration von 10 Gew.-% ergaben eine schnellere Gelierung mit MMP-2 als mit MMP-9 mit Gelierungszeiten von 28 bzw. 40 Minuten. Eventuelle Beiträge durch hydrolytische Spaltung von PEG4TDPo an der Gelierung wurden an PEG4MAL-Blindproben untersucht und führten erst nach 60 Minuten Reaktionszeit zu einer Gelierung. Aus theoretischen Überlegungen heraus wäre zu erwarten, dass sich die gleichzeitige Gelierungsreaktion negativer auf die enzymatische als auf die hydrolytische Spaltung auswirkt. Genaues zum Beitrag der hydrolytischen Spaltung von PEG4TDPo bedürfte jedoch weiterer Untersuchungen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses neue in-situ-Vernetzungssystem, bei dem Peptid-basierte Vernetzungs-Precursor mit einstellbaren Eigenschaften verwendet werden, eine in-situ-Vernetzungs-Gelierungskinetik auf ähnlichem Niveau wie bei bereits berichteten aktiven Dithiole aufweist. Die vorteilhafte On-Demand-Funktionalität in Verbindung mit ihrer pH-Sensitivität und physiologischen Verträglichkeit macht sie zu einem interessanten Kandidaten für weitere Forschungen im Bereich biomedizinischer Anwendungen im Allgemeinen und der On-Demand-Materialsynthese. Die Ergebnisse des MMP-geförderten Gelierungssystems weisen einen einfachen, aber unerforschten Ansatz für die in-situ-Synthese kovalent vernetzter weicher Materialien, der zur Entwicklung eines alternativen Weges zur Bekämpfung der Krebsmetastasierung führen könnte, indem er die MMP-Überexpression als Auslöser nutzt. Mit MMP-Inhibitoren wurde dieses Ziel trotz umfangreicher Arbeiten in dieser Hinsicht bisher nicht erreicht. KW - hydrogels KW - stimuli KW - peptide KW - thioester KW - crosslinker KW - Hydrogele KW - Vernetzer KW - Peptid KW - Thioester KW - Stimuli Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-569713 ER - TY - THES A1 - Kahl, Sandra T1 - Evolutionary adaptive responses to rapid climate change in plants T1 - Evolutionäre Anpassungsstrategien von Pflanzen an den Klimawandel BT - a case study of the widely distributed species Silene vulgaris BT - ein Fallbeispiel der weit verbreiteten Art Silene vulgaris N2 - The ongoing climate change is altering the living conditions for many organisms on this planet at an unprecedented pace. Hence, it is crucial for the survival of species to adapt to these changing conditions. In this dissertation Silene vulgaris is used as a model organism to understand the adaption strategies of widely distributed plant species to the current climate change. Especially plant species that possess a wide geographic range are expected to have a high phenotypic plasticity or to show genetic differentiation in response to the different climate conditions they grow in. However, they are often underrepresented in research. In the greenhouse experiment presented in this thesis, I examined the phenotypic responses and plasticity in S. vulgaris to estimate its’ adaptation potential. Seeds from 25 wild European populations were collected along a latitudinal gradient and grown in a greenhouse under three different precipitation (65 mm, 75 mm, 90 mm) and two different temperature regimes (18°C, 21°C) that resembled a possible climate change scenario for central Europe. Afterwards different biomass and fecundity-related plant traits were measured. The treatments significantly influenced the plants but did not reveal a latitudinal difference in response to climate treatments for most plant traits. The number of flowers per individual however, showed a stronger plasticity in northern European populations (e.g., Swedish populations) where numbers decreased more drastically with increased temperature and decreased precipitation. To gain an even deeper understanding of the adaptation of S. vulgaris to climate change it is also important to reveal the underlying phylogeny of the sampled populations. Therefore, I analysed their population genetic structure through whole genome sequencing via ddRAD. The sequencing revealed three major genetic clusters in the S. vulgaris populations sampled in Europe: one cluster comprised Southern European populations, one cluster Western European populations and another cluster contained central European populations. A following analysis of experimental trait responses among the clusters to the climate-change scenario showed that the genetic clusters significantly differed in biomass-related traits and in the days to flowering. However, half of the traits showed parallel response patterns to the experimental climate-change scenario. In addition to the potential geographic and genetic adaptation differences to climate change this dissertation also deals with the response differences between the sexes in S. vulgaris. As a gynodioecious species populations of S. vulgaris consist of female and hermaphrodite individuals and the sexes can differ in their morphological traits which is known as sexual dimorphism. As climate change is becoming an important factor influencing plant morphology it remains unclear if and how different sexes may respond in sexually dimorphic species. To examine this question the sex of each individual plant was determined during the greenhouse experiment and the measured plant traits were analysed accordingly. In general, hermaphrodites had a higher number of flowers but a lower number of leaves than females. With regards to the climate change treatment, I found that hermaphrodites showed a milder negative response to higher temperatures in the number of flowers produced and in specific leaf area (SLA) compared to females. Synthesis – The significant treatment response in Silene vulgaris, independent of population origin in most traits suggests a high degree of universal phenotypic plasticity. Also, the three European intraspecific genetic lineages detected showed comparable parallel response patterns in half of the traits suggesting considerable phenotypic plasticity. Hence, plasticity might represent a possible adaptation strategy of this widely distributed species during ongoing and future climatic changes. The results on sexual dimorphism show that females and hermaphrodites are differing mainly in their number of flowers and females are affected more strongly by the experimental climate-change scenario. These results provide a solid knowledge basis on the sexual dimorphism in S. vulgaris under climate change, but further research is needed to determine the long-term impact on the breeding system for the species. In summary this dissertation provides a comprehensive insight into the adaptation mechanisms and consequences of a widely distributed and gynodioecious plant species and leverages our understanding of the impact of anthropogenic climate change on plants. N2 - Der derzeitige Klimawandel verändert die Lebensbedingungen für viele Tiere und Pflanzen auf unserem Planeten in nie da gewesenem Maße. Damit Arten überleben, ist es von besonderer Wichtigkeit, dass sich diese an die sich ändernden Klimabedingungen anpassen können. Die vorliegende Dissertation befasst sich mit der Modellpflanze Silene vulgaris und versucht zu ergründen, wie sich solch weit verbreitete Pflanzenarten an den Klimawandel anpassen. Dabei ist zu erwarten, dass sie eine hohe phänotypische Plastizität besitzen, durch die sie sich gut anpassen können oder, dass sie sich durch eine genetische Differenzierung als Antwort auf die vorherrschenden Umweltbedingungen auszeichnen. Im experimentellen Ansatz dieser Dissertation untersuchte ich daher die phänotypischen Anpassungen und die phänotypische Plastizität von S. vulgaris an ein mögliches Klimawandelszenario für Zentraleuropa. Dabei wurden die Samen von 25 europäischen Populationen gesammelt und in einem Gewächshausexperiment unter drei verschiedenen Niederschlagsbedingungen (65 mm, 75 mm, 90 mm) und zwei verschiedenen Temperaturbedingungen (18°C, 21°C) herangezogen. Im Anschluss wurden verschiedene Biomasse- und Fertilitätsmerkmale gemessen. Für ein tiefergehendes Verständnis der Anpassungsmöglichkeiten von S. vulgaris an den Klimawandel ist es zudem wichtig, auch die zugrundeliegende Phylogenie der Populationen zu verstehen. In diesem Zusammenhang nutzte ich eine genomweite Sequenziermethode mittels ddRAD. Die Bedingungen im Gewächshausexperiment beeinflussten die Pflanzen signifikant in ihren phänotypischen Merkmalen, jedoch ließ sich kein Unterschied zwischen Population unterschiedlicher Herkunft erkennen. Lediglich die Anzahl der Blüten zeigte eine größere Plastizität in nördlichen europäischen Populationen, wo sich die Blütenzahl stärker dezimierte unter höheren Temperaturen und stärkerer Trockenheit. Die populationsgenetische Analyse ergab drei distinkte phylogenetische Gruppen für die untersuchten europäischen Populationen von S. vulgaris: eine Gruppe beinhaltete südeuropäische Populationen aus Spanien und Südfrankreich, eine weitere Gruppe bestand aus den gesammelten Individuen der westfranzösischen Populationen, während die dritte Gruppe, die Populationen aus Mittel- und Nordeuropa enthielt. Diese genetischen Gruppen wurden anschließend ebenfalls der Merkmalsanalyse unter den Gewächshausbedingungen unterzogen. Dabei stellte sich heraus, dass sich die genetischen Gruppen in ihren phänotypischen Merkmalen unterschieden, jedoch eine ähnliche Anpassung ihrer Merkmale an die experimentellen Klimawandelbedingungen zeigten. Der dritte Aspekt dieser Dissertation befasste sich mit möglichen Anpassungsunterschieden zwischen den Geschlechtern in S. vulgaris. Als gynodiözische Art bestehen ihre Populationen sowohl aus weiblichen, also auch aus zwittrigen Individuen. Die phänotypischen Merkmale beider Geschlechter können sich dabei unterscheiden, was man als Sexualdimorphismus bezeichnet. Es ist bereits bekannt, dass sich Pflanzenmerkmale durch den anhaltenden Klimawandel bereits verändern, jedoch ist es nicht gut erforscht, ob und wie sich die unterschiedlichen Geschlechter bei einer sexuell dimorphen Art unter diesem Selektionsdruck verhalten. Während des Gewächshausexperiments wurden daher die Geschlechter der Individuen bestimmt und die phänotypischen Unterschiede zwischen weiblichen und zwittrigen Pflanzen analysiert. Allgemein lässt sich sagen, dass zwittrige Individuen mehr Blüten aber weniger Blätter hatten als weibliche. Im Hinblick auf die experimentellen Klimawandelbedingungen konnte ich zudem feststellen, dass Hermaphroditen in ihrer spezifischen Blattfläche und der Blütenanzahl weniger stark negativ auf höhere Temperaturen reagierten. Synthese – Die signifikanten Merkmalsanpassungen an die Gewächshausbedingungen waren unabhängig von der geographischen Herkunft oder genetischen Gruppe der Individuen. Dies lässt ein hohes Maß an universeller, phänotypischer Plastizität vermuten. Dementsprechend kann davon ausgegangen werden, dass phänotypische Plastizität ein möglicher Anpassungsmechanismus für diese weit verbreitete Art an den Klimawandel sein könnte. Im Hinblick auf den Sexualdimorphismus in S. vulgaris lässt sich sagen, dass sich beide Geschlechter vornehmlich in der Anzahl der Blüten unterscheiden und dass weibliche Pflanzen stärker von den Bedingungen des Gewächshausexperiments beeinflusst wurden. Diese Dissertation konnte damit erstmals darüber Aufschluss geben, wie sich S. vulgaris im Hinblick auf ihren Sexualdimorphismus unter Klimawandelbedingungen verhält. Weitere Forschung wird nun benötigt, um auch den Langzeiteffekt des Klimawandels auf das Fortpflanzungssystem dieser Art abschätzen zu können. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die vorliegende Arbeit einen umfassenden Einblick in die Anpassungsmechanismen einer weit verbreiteten Pflanzenart an den anthropogenen Klimawandel gibt. Zudem bestärkt sie unser Verständnis der Auswirkungen, die sich daraus für eine gynodiözische Art, wie S. vulgaris ergeben. KW - Silene vulgaris KW - climate change KW - plant adaptation KW - Silene vulgaris KW - Klimawandel KW - Pflanzenanpassung Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-556483 ER - TY - THES A1 - Wijesingha Ahchige, Micha T1 - Canalization of plant metabolism and yield T1 - Kanalisierung des Pflanzenmetabolismus und -ertrags N2 - Plant metabolism is the main process of converting assimilated carbon to different crucial compounds for plant growth and therefore crop yield, which makes it an important research topic. Although major advances in understanding genetic principles contributing to metabolism and yield have been made, little is known about the genetics responsible for trait variation or canalization although the concepts have been known for a long time. In light of a growing global population and progressing climate change, understanding canalization of metabolism and yield seems ever-more important to ensure food security. Our group has recently found canalization metabolite quantitative trait loci (cmQTL) for tomato fruit metabolism, showing that the concept of canalization applies on metabolism. In this work two approaches to investigate plant metabolic canalization and one approach to investigate yield canalization are presented. In the first project, primary and secondary metabolic data from Arabidopsis thaliana and Phaseolus vulgaris leaf material, obtained from plants grown under different conditions was used to calculate cross-environment coefficient of variations or fold-changes of metabolite levels per genotype and used as input for genome wide association studies. While primary metabolites have lower CV across conditions and show few and mostly weak associations to genomic regions, secondary metabolites have higher CV and show more, strong metabolite to genome associations. As candidate genes, both potential regulatory genes as well as metabolic genes, can be found, albeit most metabolic genes are rarely directly related to the target metabolites, suggesting a role for both potential regulatory mechanisms as well as metabolic network structure for canalization of metabolism. In the second project, candidate genes of the Solanum lycopersicum cmQTL mapping are selected and CRISPR/Cas9-mediated gene-edited tomato lines are created, to validate the genes role in canalization of metabolism. Obtained mutants appeared to either have strong aberrant developmental phenotypes or appear wild type-like. One phenotypically inconspicuous mutant of a pantothenate kinase, selected as candidate for malic acid canalization shows a significant increase of CV across different watering conditions. Another such mutant of a protein putatively involved in amino acid transport, selected as candidate for phenylalanine canalization shows a similar tendency to increased CV without statistical significance. This potential role of two genes involved in metabolism supports the hypothesis of structural relevance of metabolism for its own stability. In the third project, a mutant for a putative disulfide isomerase, important for thylakoid biogenesis, is characterized by a multi-omics approach. The mutant was characterized previously in a yield stability screening and showed a variegated leaf phenotype, ranging from green leaves with wild type levels of chlorophyll over differently patterned variegated to completely white leaves almost completely devoid of photosynthetic pigments. White mutant leaves show wild type transcript levels of photosystem assembly factors, with the exception of ELIP and DEG orthologs indicating a stagnation at an etioplast to chloroplast transition state. Green mutant leaves show an upregulation of these assembly factors, possibly acting as overcompensation for partially defective disulfide isomerase, which seems sufficient for proper chloroplast development as confirmed by a wild type-like proteome. Likely as a result of this phenotype, a general stress response, a shift to a sink-like tissue and abnormal thylakoid membranes, strongly alter the metabolic profile of white mutant leaves. As the severity and pattern of variegation varies from plant to plant and may be effected by external factors, the effect on yield instability, may be a cause of a decanalized ability to fully exploit the whole leaf surface area for photosynthetic activity. N2 - Der pflanzliche Stoffwechsel ist der Hauptprozess, der assimilierten Kohlenstoff in unterschiedliche Stoffe umwandelt, die wichtig für das Pflanzenwachstum und somit den Ertrag sind, weswegen es ein wichtiges Forschungsthema ist. Obwohl große Fortschritte beim Verständnis der genetischen Prinzipien, die zum Stoffwechsel und Ertrag beitragen, gemacht wurden, ist noch relativ wenig über die genetischen Prinzipien bekannt, die für die Variation oder Kanalisierung von Eigenschaften verantwortlich sind, obwohl diese Konzepte schon lange bekannt sind. In Anbetracht einer wachsenden Weltbevölkerung und des fortschreitenden Klimawandels, scheint es immer wichtiger zu sein, Kanalisierung von Metabolismus und Ertrag zu verstehen, um Ernährungssicherheit zu garantieren. Unsere Gruppe hat kürzlich metabolisch kanalisierte quantitative Merkmalsregionen für den Stoffwechsel von Tomatenfrüchten gefunden und damit gezeigt, dass sich das Konzept der Kanalisierung sich auf den Stoffwechsel anwenden lässt. In dieser Arbeit werden zwei Ansätze zu Untersuchung von Kanalisierung des pflanzlichen Stoffwechsels und ein Ansatz zur Untersuchung von Ertragskanalisierung präsentiert. Im ersten Projekt, wurden Daten von Primär- und Sekundärmetaboliten von Arabidopsis thaliana und Phaseolus vulgaris, gewonnen von Pflanzen, die unter unterschiedlichen Bedingungen wuchsen, verwendet, um den Variationskoeffizient (VarK) oder die relative Änderung von Stoffgehalten umweltübergreifend für jeden Genotyp zu berechnen und als Eingabe für genomweite Assoziationsstudien verwendet. Während Primärmetabolite über unterschiedliche Umweltbedingungen einen geringeren VarK haben und nur wenige eher schwache Assoziationen zu genomischen Regionen zeigen, haben Sekundärstoffe einen höheren VarK und zeigen mehr und stärkere Assoziationen zwischen Metabolit und Genom. Als Kandidatengene können sowohl potenziell regulatorische, als auch metabolische Gene gefunden werden, jedoch sind metabolische Gene selten direkt zu den Zielmetaboliten verbunden, was für eine Rolle von sowohl regulatorischen Mechanismen als auch metabolischer Netzwerkstruktur für die Kanalisierung des Stoffwechsels spricht. Im zweiten Projekt wurden Kandidatengene aus der Solanum lycopersicum cmQTL-Kartierung, ausgewählt und CRISPR/Cas9-vermittelte, genomeditierte Tomatenlinien erschaffen, um die Rolle dieser Gene in der Kanalisierung des Metabolismus zu validieren. Erhaltene Mutanten zeigten entweder starke Fehlentwicklungsphänotypen oder erschienen wildtypähnlich. Eine phänotypisch unauffällige Mutante einer Pantothensäurekinase, die als Kandidat für die Kanalisierung von Apfelsäure gewählt wurde, zeigte einen signifikanten Anstieg des VarK über unterschiedliche Bewässerungsbedingungen. Eine andere solche Mutante eines Proteins, welches mutmaßlich im Aminosäuretransport involviert ist, welches als Kandidat für die Kanalisierung von Phenylalanin gewählt wurde, zeigt eine ähnliche Tendenz zu einem erhöhten VarK ohne statistische Signifikanz. Diese potenzielle Rolle von zwei Genen, die im Stoffwechsel involviert sind, unterstützt die Hypothese einer strukturellen Relevanz des Metabolismus für seine eigene Stabilität. Im dritten Projekt wurde eine Mutante einer mutmaßlichen Disulfid-Isomerase, welche wichtig für die Thylakoidbiogenese ist, durch einen Multiomik Ansatz charakterisiert. Die Mutante wurde vorher in einer Ertragsstabilitäts-Selektierung charakterisiert und zeigte einen panaschierten Blattphänotyp, welcher von grünen Blättern mit Wildtyp Chlorophyllgehalt über unterschiedlich gemustert panaschierte Blätter bis zu komplett weißen Blätter reichte, die fast gar keine photosynthetischen Pigmente enthielten. Weiße Blätter der Mutante zeigen Wildtyp Transkriptlevel von Photosystem-Aufbaufaktoren, mit der Ausnahme von ELIP und DEG Orthologen, was indikativ für eine Stagnation in einer Etioplast-zu-Chloroplast-Übergangsphase ist. Grüne Blätter der Mutante zeigen eine Hochregulierung dieser Aufbaufaktoren, was möglicherweise als Überkompensation für eine partiell defekte Disulfid-Isomerase wirkt und letztlich ausreichend für Chloroplastenentwicklung zu sein scheint, was wiederum durch ein wildtyp-ähnliches Proteom bestätigt wird. Wahrscheinlich als Effekt dieses Phänotyps ändern, eine generelle Stressantwort, eine Umschaltung zu einem Senke-ähnlichen Gewebe und abnormale Thylakoidmembranen, stark das metabolische Profil von weißen Blättern der Mutante. Da der Schweregrad und das Muster der Panaschierung von Pflanze zu Pflanze unterschiedlich ist und durch äußere Faktoren beeinflusst sein könnte, könnte der Effekt auf die Ertragsstabilität eine Folge einer dekanalisierten Fähigkeit sein die ganze Blattoberfläche für photosynthetische Aktivität zu nutzen. KW - canalization KW - phenotypic variation KW - metabolism KW - CRISPR/Cas9 KW - GWAS KW - CRISPR/Cas9 KW - GWAS KW - Kanalisierung KW - Metabolismus KW - phänotypische Variation Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-548844 ER - TY - THES A1 - Korovila, Ioanna T1 - Role of proteolytic systems in lipotoxicity-induced hepatocellular damage T1 - Lipotoxizität und Leberzellschädigung - Die Rolle der proteolytischen Systeme N2 - Scope: Several studies show that excessive lipid intake can cause hepatic steatosis. To investigate lipotoxicity on cellular level, palmitate (PA) is often used to highly increase lipid droplets (LDs). One way to remove LDs is autophagy, while it is controversially discussed if autophagy is also affected by PA. It is aimed to investigate whether PA-induced LD accumulation can impair autophagy and punicalagin, a natural autophagy inducer from pomegranate, can improve it. Methods and results: To verify the role of autophagy in LD degradation, HepG2 cells are treated with PA and analyzed for LD and perilipin 2 content in presence of autophagy inducer Torin 1 and inhibitor 3-Methyladenine. PA alone seems to initially induce autophagy-related proteins but impairs autophagic-flux in a time-dependent manner, considering 6 and 24 h PA. To examine whether punicalagin can prevent autophagy impairment, cells are cotreated for 24 h with PA and punicalagin. Results show that punicalagin preserves expression of autophagy-related proteins and autophagic flux, while simultaneously decreasing LDs and perilipin 2. Conclusion: Data provide new insights into the role of PA-induced excessive LD content on autophagy and suggest autophagy-inducing properties of punicalagin, indicating that punicalagin can be a health-beneficial compound for future research on lipotoxicity in liver. N2 - Lebersteatose entsteht durch eine übermäßige Zufuhr von Nahrungslipiden und ist durch eine chronische Ansammlung von Lipidtröpfchen (LD) in der Leber gekennzeichnet, die wiederum zu einer hepatozellulären Dysfunktion führen. Dieser pathogene Zustand ist ein grundlegendes Merkmal der nichtalkoholischen Fettleber (NAFLD) und ein Risikofaktor für viele weit verbreitete Stoffwechselerkrankungen, einschließlich Fettleibigkeit und Typ-2-Diabetes. Abgesehen von der Menge der aufgenommenen Nahrungsfette wird die Entwicklung der Lebersteatose auch stark von der Art der Fettsäure beeinflusst. Palmitat (PA) ist die am häufigsten vorkommende gesättigte Fettsäure und spielt eine bedeutende Rolle bei der Pathogenese der Lebersteatose. Sie wird häufig verwendet, um Lipotoxizität zu induzieren und die Entwicklung von LDs auf zellulärer Ebene zu untersuchen. Die beiden wichtigsten intrazellulären proteolytischen Systeme, das Ubiquitin-Proteasom-System und das Autophagie-Lysosom-System, sind am LD-Abbau beteiligt und kontrollieren das Gleichgewicht der Lipidhomöostase. Der Einfluss der Lipotoxizität auf ihre Funktion ist jedoch noch umstritten. Das Ziel der vorliegenden Dissertation ist es zu untersuchen, ob eine erhöhte LD-Akkumulation die Funktion der proteolytischen Systeme beeinträchtigt und ob die Effekte durch Kontrolle ihrer Aktivität umgekehrt werden können. In-vivo Untersuchungen an New Zealand Obese (NZO) Mäusen, einem polygenen Modell für Fettleibigkeit, zeigten, dass eine fettreiche Ernährung eine Akkumulation von LDs und hepatozelluläre Schäden verursacht. Diese Effekte wurden von einem Verlust der Autophagieeffizienz und einer verminderten Expression der Proteasomaler Untereinheiten begleitet. Ähnliche Effekte wurden in vitro in PA-beladenen HepG2-Zellen beobachtet. PA induziert LD-Akkumulation und verändert den Redoxstatus in Mitochondrien und im Endoplasmatische Retikulum (ER). Zusätzlich beeinflusst PA die Funktion beider proteolytischer Systeme (proteasomal und lysosomal) zeitabhängig nach 6- und 24-stündiger Behandlung. Um die Rolle des Proteasome und der Autophagie beim LD-Abbau unter PAinduzierten lipotoxischen Bedingungen zu untersuchen, wurden beide Systeme inhibiert oder induziert und die Veränderungen des LD-Gehalts analysiert. Dazu wurden die HepG2 Zellen wurden mit PA in Gegenwart des Autophagie-Aktivators Torin 1, des Autophagie-Inhibitors 3-Methyladenin, des Proteasom-Aktivators Ursolsäure und des Proteasom-Inhibitors Lactacystin behandelt. Die erhaltenen Daten aus unseren Modellen belegen, dass vorrangig Autophagie am Abbau der LDs beteiligt ist. Die PA-vermittelte Lipidakkumulation könnte auf ein Versagen der Autophagie hinweisen und zu einer Störung der Proteostase sowie einer weiteren LD-Stabilisierung und Anreicherung beitragen. Experimente mit dem natürlichen Autophagie-Aktivator Punicalagin weisen darauf hin, dass die PA-vermittelten lipotoxischen Wirkungen reduziert werden können. Insbesondere zeigen die Ergebnisse, dass Punicalagin die Expression von Autophagie-Proteinen erhält und durch PA-beeinträchtigten autophagischen Fluss wiederherstellt. Parallel dazu wird der durch PA-induzierte Gehalt an LD durch Punicalagin verringert. Zusammenfassend, liefern die Daten dieser Dissertation neue Einblicke in die Rolle des Proteasoms und des Autophagie-Lysosomalen Systems bei der PA-induzierten Lipotoxizität. Zudem werden die Autophagie-induzierenden Eigenschaften von Punicalagin aufgezeigt, die einen vielversprechenden Ansatz für die zukünftige Forschung zur hepatischen Lipotoxizität bieten. KW - HepG2 hepatocytes KW - autophagy KW - lipophagy KW - lysosome KW - palmitate KW - punicalagin KW - HepG2-Zellen KW - Autophagie KW - Lipophagie KW - Lysosom KW - Palmitat KW - Punicalagin Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-552385 ER - TY - THES A1 - Pellegrino, Antonio T1 - miRNA profiling for diagnosis of chronic pain in polyneuropathy T1 - miRNA profiling zur Diagnose von chronischem Schmerz in Polyneuropathie N2 - This dissertation aimed to determine differential expressed miRNAs in the context of chronic pain in polyneuropathy. For this purpose, patients with chronic painful polyneuropathy were compared with age matched healthy patients. Taken together, all miRNA pre library preparation quality controls were successful and none of the samples was identified as an outlier or excluded for library preparation. Pre sequencing quality control showed that library preparation worked for all samples as well as that all samples were free of adapter dimers after BluePippin size selection and reached the minimum molarity for further processing. Thus, all samples were subjected to sequencing. The sequencing control parameters were in their optimal range and resulted in valid sequencing results with strong sample to sample correlation for all samples. The resulting FASTQ file of each miRNA library was analyzed and used to perform a differential expression analysis. The differentially expressed and filtered miRNAs were subjected to miRDB to perform a target prediction. Three of those four miRNAs were downregulated: hsa-miR-3135b, hsa-miR-584-5p and hsa-miR-12136, while one was upregulated: hsa-miR-550a-3p. miRNA target prediction showed that chronic pain in polyneuropathy might be the result of a combination of miRNA mediated high blood flow/pressure and neural activity dysregulations/disbalances. Thus, leading to the promising conclusion that these four miRNAs could serve as potential biomarkers for the diagnosis of chronic pain in polyneuropathy. Since TRPV1 seems to be one of the major contributors of nociception and is associated with neuropathic pain, the influence of PKA phosphorylated ARMS on the sensitivity of TRPV1 as well as the part of AKAP79 during PKA phosphorylation of ARMS was characterized. Therefore, possible PKA-sites in the sequence of ARMS were identified. This revealed five canonical PKA-sites: S882, T903, S1251/52, S1439/40 and S1526/27. The single PKA-site mutants of ARMS revealed that PKA-mediated ARMS phosphorylation seems not to influence the interaction rate of TRPV1/ARMS. While phosphorylation of ARMST903 does not increase the interaction rate with TRPV1, ARMSS1526/27 is probably not phosphorylated and leads to an increased interaction rate. The calcium flux measurements indicated that the higher the interaction rate of TRPV1/ARMS, the lower the EC50 for capsaicin of TRPV1, independent of the PKA phosphorylation status of ARMS. In addition, the western blot analysis confirmed the previously observed TRPV1/ARMS interaction. More importantly, AKAP79 seems to be involved in the TRPV1/ARMS/PKA signaling complex. To overcome the problem of ARMS-mediated TRPV1 sensitization by interaction, ARMS was silenced by shRNA. ARMS silencing resulted in a restored TRPV1 desensitization without affecting the TRPV1 expression and therefore could be used as new topical therapeutic analgesic alternative to stop ARMS mediated TRPV1 sensitization. N2 - Ziel dieser Dissertation war es, differentiell exprimierte miRNAs im Kontext von chronischen Schmerzen bei Polyneuropathie zu bestimmen. Zu diesem Zweck wurden Patienten mit chronisch schmerzhafter Polyneuropathie und altersgleiche gesunde Patienten verglichen. Insgesamt waren alle Qualitätskontrollen zur Erstellung der miRNA-Bibliothek erfolgreich und keine der Proben wurde als Ausreißer identifiziert oder ausgeschlossen. Die Qualitätskontrolle vor der Sequenzierung zeigte, dass die Bibliothekserstellung für alle Proben funktionierte, sowie dass alle Proben frei von Adapterdimeren waren und die Mindestmolalität erreichten, woraufhin alle Proben sequenziert wurden. Die Kontrollparameter für die Sequenzierung lagen im optimalen Bereich und führten bei allen Proben zu gültigen Sequenzierungsergebnissen mit einer starken Korrelation zwischen den Proben. Die resultierende FASTQ-Datei jeder miRNA-Bibliothek wurde analysiert und für eine differenzielle Expressionsanalyse verwendet. Die differenziell exprimierten und gefilterten miRNAs wurden mittels miRDB analysiert, um eine Zielvorhersage zu erhalten. Drei dieser vier miRNAs wurden herunterreguliert: hsa-miR-3135b, hsa-miR-584-5p und hsa-miR-12136, während eine hochreguliert wurde: hsa-miR-550a-3p. Die miRNA-Zielvorhersage zeigte, dass chronische Schmerzen bei Polyneuropathie das Ergebnis von miRNA induziertem hohen Blutdruck und neuralen Aktivitätsdysregulationen sein könnten. Daraus ergibt sich die Schlussfolgerung, dass diese vier miRNAs als potenzielle Biomarker für die Diagnose von chronischen Schmerzen bei Polyneuropathie dienen könnten. Da TRPV1 mit Nozizeption und neuropathischen Schmerzen in Verbindung gebracht wird, wurde der Einfluss von PKA-phosphoryliertem ARMS auf die Sensitivität von TRPV1 sowie die Rolle von AKAP79 während der PKA-Phosphorylierung von ARMS untersucht. Dazu wurden mögliche PKA-Stellen in der Sequenz von ARMS identifiziert. Dies ergab fünf kanonische PKA-Stellen: S882, T903, S1251/52, S1439/40 und S1526/27. Die einzelnen ARMS-Mutanten zeigten, dass die PKA-vermittelte ARMS-Phosphorylierung die Interaktion von TRPV1/ARMS nicht zu beeinflussen scheint. Während die Phosphorylierung von ARMST903 die Interaktionsrate mit TRPV1 nicht erhöht, wird ARMSS1526/27 vermutlich nicht phosphoryliert und führt zu einer erhöhten Interaktionsrate. Zusätzlich zeigten Kalziumflussmessungen, dass der EC50 für Capsaicin von TRPV1 umso niedriger ist, je höher die Interaktionsrate von TRPV1/ARMS ist, unabhängig vom PKA-Phosphorylierungsstatus von ARMS. Darüber hinaus bestätigte die Western-Blot-Analyse, dass AKAP79 an dem TRPV1/ARMS/PKA-Signalkomplex beteiligt zu sein scheint. Letztlich sorgte die Stilllegung von ARMS mittels shRNA zu einer wiederhergestellten TRPV1-Desensibilisierung, ohne die TRPV1-Expression zu beeinträchtigen, und könnte als neue topische therapeutische Analgetika-Alternative verwendet werden. KW - miRNA KW - miRNA KW - chronic pain KW - chronischer Schmerz KW - polyneuropathy KW - Polyneuropathie KW - TRPV1 KW - TRPV1 KW - ARMS KW - ARMS Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-583858 ER - TY - THES A1 - Nwosu, Ebuka Canisius T1 - Sedimentary DNA-based reconstruction of cyanobacterial communities from Lake Tiefer See, NE Germany, for the last 11,000 years N2 - Climate change and human-driven eutrophication promote the spread of harmful cyanobacteria blooms in lakes worldwide, which affects water quality and impairs the aquatic food chain. In recent times, sedimentary ancient DNA-based (sedaDNA) studies were used to probe how centuries of climate and environmental changes have affected cyanobacterial assemblages in temperate lakes. However, there is a lack of information on the consistency between sediment-deposited cyanobacteria communities versus those of the water column, and on the individual role of natural climatic changes versus human pressure on cyanobacteria community dynamics over multi-millennia time scales. Therefore, this thesis uses sedimentary ancient DNA of Lake Tiefer See in northeastern Germany to trace the deposition of cyanobacteria along the water column into the sediment, and to reconstruct cyanobacteria communities spanning the last 11,000 years using a set of molecular techniques including quantitative PCR, biomarkers, metabarcoding, and metagenome sequence analyses. The results of this thesis proved that cyanobacterial composition and species richness did not significantly differ among different water depths, sediment traps, and surface sediments. This means that the cyanobacterial community composition from the sediments reflects the water column communities. However, there is a skewed sediment deposition of different cyanobacteria groups because of DNA alteration and/or deterioration during transport along the water column to the sediment. Specifically, single filament taxa, such as Planktothrix, are poorly represented in sediments despite being abundant in the water column as shown by an additional study of the thesis on cyanobacteria seasonality. In contrast, aggregate-forming taxa, like Aphanizomenon, are relatively overrepresented in sediment although they are not abundant in the water column. These different deposition patterns of cyanobacteria taxa should be considered in future DNA-based paleolimnological investigations. The thesis also reveals a substantial increase in total cyanobacteria abundance during the Bronze Age which is not apparent in prior phases of the early to middle Holocene and is suggested to be caused by human farming, deforestation, and excessive nutrient addition to the lake. Not only cyanobacterial abundance was influenced by human activity but also cyanobacteria community composition differed significantly between phases of no, moderate, and intense human impact. The data presented in this thesis are the first on sedimentary cyanobacteria DNA since the early Holocene in a temperate lake. The results bring together archaeological, historical climatic, and limnological data with deep DNA-sequencing and paleoecology to reveal a legacy impact of human pressure on lake cyanobacteria populations dating back to approximately 4000 years. N2 - Der Klimawandel und die vom Menschen verursachte Eutrophierung fördern die Ausbreitung schädlicher Cyanobakterienblüten in Seen weltweit, was die Wasserqualität und die aquatische Nahrungskette beeinträchtigt. In jüngster Zeit wurden sedimentäre DNA (sedaDNA)-Studien verwendet, um zu untersuchen, wie sich klimatische- und menschliche Umweltveränderungen von Jahrhunderten auf Cyanobakteriengemeinschaften in Seen ausgewirkt haben. Jedoch fehlen bislang Informationen, wie repräsentativ die im Sediment abgelagerten Cyanobakterien und deren DNA für die Gemeinschaften der Wassersäule sind, sowie zur individuellen Rolle natürlicher klimatischer Veränderungen gegenüber dem menschlichen Einflusses auf die Dynamik von Cyanobakterien über Zeitskalen von Jahrtausenden. Daher wurde in dieser Arbeit sedimentäre alte DNA (sedaDNA) des Tiefen Sees in Nordostdeutschland verwendet, um die Ablagerung von Cyanobakterien entlang der Wassersäule in das Sediment zu verfolgen. Ein Hauptteil dieser Arbeit bildete jedoch die Rekonstruktion von Cyanobakteriengemeinschaften der letzten 11.000 Jahre, unter Verwendung einer Reihe von molekularen Techniken, darunter quantitative PCR, Biomarker, Metabarcoding und Metagenom-Sequenzanalysen. Die Ergebnisse dieser Arbeit beweisen, dass die Cyanobakterien-Zusammensetzung und der Artenreichtum zwischen verschiedenen Wassertiefen, Sedimentfallen und Oberflächensedimenten nicht signifikant unterschiedlich ist. Das bedeutet, dass die Zusammensetzung der Cyanobakteriengemeinschaften aus den Sedimenten die Gemeinschaften der Wassersäule widerspiegelt. Aufgrund von DNA-Veränderungen und/oder -Abbau während des Transports entlang der Wassersäule zum Sediment kommt es jedoch zu einer verzerrten Sedimentablagerung verschiedener Cyanobakterien Arten. Insbesondere sind filamentose Arten wie Planktothrix in Sedimenten schlecht vertreten, obwohl sie, laut Ergebnissen einer zusätzlichen Studie dieser Arbeit zur Saisonalität von Cyanobakterien, in der Wassersäule reichlich vorhanden sind. Im Gegensatz dazu sind aggregatbildende Arten wie Aphanizomenon in Sedimenten relativ gesehen überrepräsentiert, obwohl sie in der Wassersäule relativ selten vorkommen. Diese unterschiedlichen Muster zur Sedimentablagerung verschiedener Cyanobakterien Arten sollten in zukünftigen DNA-basierten paläolimnologischen Untersuchungen berücksichtigt werden. Die Dissertation zeigt auch eine deutliche Zunahme der Cyanobakterien Abundanz während der Bronzezeit, die in vorhergehenden Phasen des frühen und mittleren Holozäns nicht erkennbar war. Dies ist wahrscheinlich durch menschliche Landwirtschaft, Entwaldung und übermäßige Nährstoffzufuhr in den See verursacht worden. Nicht nur die Abundanz von Cyanobakterien wurde durch menschliche Aktivitäten beeinflusst, sondern auch die Zusammensetzung von deren Gemeinschaften, die sich signifikant zwischen Phasen unterscheidet, die durch keinen, moderaten, und intensiven menschlichen Einfluss gekennzeichnet sind. Die in dieser Dissertation präsentierten Daten sind die ersten zu sedimentärer Cyanobakterien-DNA seit dem frühen Holozän eines Sees der gemäßigte Klimazone. Die Ergebnisse vereinen archäologische, historische, klimatische und limnologische Daten mit hochaufgelöster und Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierung und belegen, dass der menschliche Einfluss auf Cyanobakteriengemeinschaften in Seen etwa 4000 Jahre zurückreicht. KW - anthropogenic impact KW - paleoecology KW - high throughput sequencing KW - cyanobacteria biomarker KW - microbial diversity KW - microbial ecology KW - 7-methylheptadecane KW - 7-Methylheptadecan KW - anthropogene Einwirkung KW - Cyanobakterien-Biomarker KW - hoher Durchsatz Sequenzierung KW - mikrobielle Vielfalt KW - mikrobielle Ökologie KW - Paläoökologie Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-563590 ER - TY - THES A1 - Gibert, Arthur T1 - Influence of Amyloid Aggregates on the Trafficking and Signaling of GPCRs T1 - Einfluss von Amyloidaggregaten auf den Transport und die Signalübertragung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren N2 - The prevalence of diseases associated with misfolded proteins increases with age. When cellular defense mechanisms become limited, misfolded proteins form aggregates and may also develop more stable cross-β structures ultimately forming amyloid aggregates. Amyloid aggregates are associated with neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s disease and Huntington’s disease. The formation of amyloid deposits, their toxicity and cellular defense mechanisms have been intensively studied. However, surprisingly little is known about the effects of protein aggregates on cellular signal transduction. It is also not understood whether the presence of aggregation-prone, but still soluble proteins affect signal transduction. In this study, the still soluble aggregation-prone HttExon1Q74 and its amyloid aggregates were used to analyze the effect of amyloid aggregates on internalization and receptor activation of G protein-coupled receptors (GPCRs), the largest protein family of mammalian cell surface receptors involved in signal transduction. The aggregated HttExon1Q74, but not its soluble form, could inhibit ligand-induced clathrin-mediated endocytosis (CME) of various GPCRs. Most likely this inhibitory effect is based on a terminal sequestration of the HSC70 chaperone to the aggregates which is necessary for CME. Using the vasopressinV1a receptor (V1aR) and the corticotropin-releasing factor receptor 1 (CRF1R) as a model, it could be shown that the presence of HttExon1Q74 aggregates and the inhibition of ligand-induced CME leads to an accumulation of desensitized receptors at the plasma membrane. In turn, this disrupts Gq-mediated Ca2+ signaling and Gs-mediated cAMP signaling of the V1aR and the CRF1R respectively. In contrast to HttExon1Q74 amyloid aggregates, soluble HttExon1Q74 as well as amorphous aggregates did not inhibit GPCR internalization and signaling demonstrating that cellular signal transduction mechanisms are specifically impaired in response to the formation of amyloid aggregates. In addition, preliminary experiments could show that HttExon1Q74 aggregates provoke an increase in membrane expression of a protein from a structurally and functionally unrelated membrane protein family, namely the serotonin transporter SERT. As SERT is the main pharmacological target to treat depression this could shed light on this commonly occurring comorbidity in neurodegenerative diseases, in particular in early disease states. N2 - Die Prävalenz von Krankheiten, die mit fehlgefalteten Proteinen assoziiert sind, nimmt mit dem Alter zu. Wenn die zellulären Abwehrmechanismen weniger effizient werden, können fehlgefaltete Proteine nicht nur einfache Aggregate bilden, sondern auch stabilere Cross-β-Strukturen, die am Ende zu sogenannten Amyloidaggregaten führen können. Amyloidaggregate sind mit neurodegenerativen Erkrankungen wie z. B. der Alzheimer Erkrankung und dem Huntington-Syndrom assoziiert. Die Bildung von Amyloidablagerungen, ihre Toxizität und die zellulären Abwehrmechanismen wurden in den letzten Jahren intensiv untersucht. Über die Auswirkungen von Proteinaggregaten auf die zelluläre Signaltransduktion ist jedoch überraschend wenig bekannt. Es ist auch nicht bekannt, ob bereits das Vorhandensein von löslichen Vorstadien dieser zur Aggregation neigenden Protein, die Signaltransduktion von Zellen beeinflusst. In dieser Studie wurden Amyloidaggregate des auf dem Huntingtin-Protein basierenden Konstrukts HttExon1Q74 und seine noch löslichen Formen verwendet, um deren Wirkung auf die Internalisierung und Rezeptoraktivierung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) zu analysieren. GPCR bilden die größte Proteinfamilie von Oberflächenrezeptoren in Säugerzellen und spielen eine entscheidende Rolle in der zellulären Signaltransduktion. Es konnte gezeigt werden, dass aggregiertes HttExon1Q74, aber nicht seine noch lösliche Form, die ligandeninduzierte Clathrin-vermittelte Endozytose (CME) verschiedener GPCRs hemmt. Höchstwahrscheinlich beruht dieser inhibitorische Effekt auf einer Sequestrierung des HSC70-Chaperons zu den HttExon1Q74-Aggregaten. In früheren Studien konnte bereits gezeigt werden, dass HSC70 die für CME notwendig ist. Unter Verwendung des VasopressinV1a-Rezeptors (V1aR) und des Corticotropin-Releasing-Faktor-Rezeptors 1 (CRF1R) als Modellproteine, konnte in dieser Arbeit ferner gezeigt werden, dass das Vorhandensein von HttExon1Q74-Aggregaten und die Hemmung der ligandeninduzierten CME zu einer Akkumulation desensibilisierter Rezeptoren in der Plasmamembran führt. Dies stört wiederum die Gq-vermittelte Ca2+-Signalisierung und die Gs-vermittelte cAMP-Signalisierung des V1aR bzw. des CRF1R. Im Gegensatz zu HttExon1Q74-Amyloidaggregaten hemmten lösliches HttExon1Q74 sowie amorphe Proteinaggregate die GPCR-Internalisierung und –Signalisierung nicht. Dies zeigt, dass Amyloidaggregate zelluläre Signaltransduktionsmechanismen spezifisch beeinträchtigen können. Darüber hinaus konnten vorläufige Experimente zeigen, dass HttExon1Q74-Aggregate eine Erhöhung der Membranexpression des Serotonintranporters SERT verursachen, eines Membranproteins das strukturell und funktionell nicht mit GPCR verwandt ist. Da SERT das wichtigste pharmakologische Zielmolekül bei der Behandlung von depressiven Syndromen ist, könnten diese Daten dazu beitragen, besser zu verstehen, warum Depressionen in sehr frühen Stadien von neurodegenerativen Erkrankungen gehäuft auftreten. KW - GPCR KW - neurodegenerative KW - disease KW - protein trafficking KW - cell signaling KW - Huntington KW - GPCR KW - Huntington KW - Zellsignalisierung KW - neurodegenerative Erkrankung KW - Proteinhandel Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-506659 ER - TY - THES A1 - Schaarschmidt, Stephanie T1 - Evaluation and application of omics approaches to characterize molecular responses to abiotic stresses in plants T1 - Evaluierung und Anwendung von Omics-Methoden zur Charakterisierung von abiotischem Stress in Pflanzen auf molekularer Ebene N2 - Aufgrund des globalen Klimawandels ist die Gewährleistung der Ernährungssicherheit für eine wachsende Weltbevölkerung eine große Herausforderung. Insbesondere abiotische Stressoren wirken sich negativ auf Ernteerträge aus. Um klimaangepasste Nutzpflanzen zu entwickeln, ist ein umfassendes Verständnis molekularer Veränderungen in der Reaktion auf unterschiedlich starke Umweltbelastungen erforderlich. Hochdurchsatz- oder "Omics"-Technologien können dazu beitragen, Schlüsselregulatoren und Wege abiotischer Stressreaktionen zu identifizieren. Zusätzlich zur Gewinnung von Omics-Daten müssen auch Programme und statistische Analysen entwickelt und evaluiert werden, um zuverlässige biologische Ergebnisse zu erhalten. Ich habe diese Problemstellung in drei verschiedenen Studien behandelt und dafür zwei Omics-Technologien benutzt. In der ersten Studie wurden Transkript-Daten von den beiden polymorphen Arabidopsis thaliana Akzessionen Col-0 und N14 verwendet, um sieben Programme hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Positionierung und Quantifizierung von Illumina RNA Sequenz-Fragmenten („Reads“) zu evaluieren. Zwischen 92% und 99% der Reads konnten an die Referenzsequenz positioniert werden und die ermittelten Verteilungen waren hoch korreliert für alle Programme. Bei der Durchführung einer differentiellen Genexpressionsanalyse zwischen Pflanzen, die bei 20 °C oder 4 °C (Kälteakklimatisierung) exponiert wurden, ergab sich eine große paarweise Überlappung zwischen den Programmen. In der zweiten Studie habe ich die Transkriptome von zehn verschiedenen Oryza sativa (Reis) Kultivaren sequenziert. Dafür wurde die PacBio Isoform Sequenzierungstechnologie benutzt. Die de novo Referenztranskriptome hatten zwischen 38.900 bis 54.500 hoch qualitative Isoformen pro Sorte. Die Isoformen wurden kollabiert, um die Sequenzredundanz zu verringern und danach evaluiert z.B. hinsichtlich des Vollständigkeitsgrades (BUSCO), der Transkriptlänge und der Anzahl einzigartiger Transkripte pro Genloci. Für die hitze- und trockenheitstolerante Sorte N22 wurden ca. 650 einzigartige und neue Transkripte identifiziert, von denen 56 signifikant unterschiedlich in sich entwickelnden Samen unter kombiniertem Trocken- und Hitzestress exprimiert wurden. In der letzten Studie habe ich die Veränderungen in Metabolitprofilen von acht Reissorten gemessen und analysiert, die dem Stress hoher Nachttemperaturen (HNT) ausgesetzt waren und während der Trocken- und Regenzeit im Feld auf den Philippinen angebaut wurden. Es wurden jahreszeitlich bedingte Veränderungen im Metabolitspiegel sowie für agronomische Parameter identifiziert und mögliche Stoffwechselwege, die einen Ertragsrückgang unter HNT-Bedingungen verursachen, vorgeschlagen. Zusammenfassend konnte ich zeigen, dass der Vergleich der RNA-seq Programme den Pflanzenwissenschaftler*innen helfen kann, sich für das richtige Werkzeug für ihre Daten zu entscheiden. Die de novo Transkriptom-Rekonstruktion von Reissorten ohne Genomsequenz bietet einen gezielten, kosteneffizienten Ansatz zur Identifizierung neuer Gene, die durch verschiedene Stressbedingungen reguliert werden unabhängig vom Organismus. Mit dem Metabolomik-Ansatz für HNT-Stress in Reis habe ich stress- und jahreszeitenspezifische Metabolite identifiziert, die in Zukunft als molekulare Marker für die Verbesserung von Nutzpflanzen verwendet werden könnten. N2 - Due to global climate change providing food security for an increasing world population is a big challenge. Especially abiotic stressors have a strong negative effect on crop yield. To develop climate-adapted crops a comprehensive understanding of molecular alterations in the response of varying levels of environmental stresses is required. High throughput or ‘omics’ technologies can help to identify key-regulators and pathways of abiotic stress responses. In addition to obtain omics data also tools and statistical analyses need to be designed and evaluated to get reliable biological results. To address these issues, I have conducted three different studies covering two omics technologies. In the first study, I used transcriptomic data from the two polymorphic Arabidopsis thaliana accessions, namely Col-0 and N14, to evaluate seven computational tools for their ability to map and quantify Illumina single-end reads. Between 92% and 99% of the reads were mapped against the reference sequence. The raw count distributions obtained from the different tools were highly correlated. Performing a differential gene expression analysis between plants exposed to 20 °C or 4°C (cold acclimation), a large pairwise overlap between the mappers was obtained. In the second study, I obtained transcript data from ten different Oryza sativa (rice) cultivars by PacBio Isoform sequencing that can capture full-length transcripts. De novo reference transcriptomes were reconstructed resulting in 38,900 to 54,500 high-quality isoforms per cultivar. Isoforms were collapsed to reduce sequence redundancy and evaluated, e.g. for protein completeness level (BUSCO), transcript length, and number of unique transcripts per gene loci. For the heat and drought tolerant aus cultivar N22, I identified around 650 unique and novel transcripts of which 56 were significantly differentially expressed in developing seeds during combined drought and heat stress. In the last study, I measured and analyzed the changes in metabolite profiles of eight rice cultivars exposed to high night temperature (HNT) stress and grown during the dry and wet season on the field in the Philippines. Season-specific changes in metabolite levels, as well as for agronomic parameters, were identified and metabolic pathways causing a yield decline at HNT conditions suggested. In conclusion, the comparison of mapper performances can help plant scientists to decide on the right tool for their data. The de novo reconstruction of rice cultivars without a genome sequence provides a targeted, cost-efficient approach to identify novel genes responding to stress conditions for any organism. With the metabolomics approach for HNT stress in rice, I identified stress and season-specific metabolites which might be used as molecular markers for crop improvement in the future. KW - Arabidopsis thaliana KW - Oryza sativa KW - RNA-seq KW - PacBio IsoSeq KW - metabolomics KW - high night temperature KW - combined heat and drought stress KW - natural genetic variation KW - differential gene expression KW - Arabidopsis thaliana KW - Oryza sativa KW - PacBio IsoSeq KW - RNA-seq KW - kombinierter Hitze- und Trockenstress KW - erhöhte Nachttemperaturen KW - Differenzielle Genexpression KW - Metabolomik KW - natürliche genetische Variation Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-509630 ER - TY - THES A1 - Moga, Akanksha T1 - Reconstitution of molybdenum cofactor biosynthesis in giant vesicles N2 - Bottom-up synthetic biology is used for the understanding of how a cell works. It is achieved through developing techniques to produce lipid-based vesicular structures as cellular mimics. The most common techniques used to produce cellular mimics or synthetic cells is through electroformation and swelling method. However, the abovementioned techniques cannot efficiently encapsulate macromolecules such as proteins, enzymes, DNA and even liposomes as synthetic organelles. This urges the need to develop new techniques that can circumvent this issue and make the artificial cell a reality where it is possible to imitate a eukaryotic cell through encapsulating macromolecules. In this thesis, the aim to construct a cell system using giant unilamellar vesicles (GUVs) to reconstitute the mitochondrial molybdenum cofactor biosynthetic pathway. This pathway is highly conserved among all life forms, and therefore is known for its biological significance in disorders induced through its malfunctioning. Furthermore, the pathway itself is a multi-step enzymatic reaction that takes place in different compartments. Initially, GTP in the mitochondrial matrix is converted to cPMP in the presence of cPMP synthase. Further, produced cPMP is transported across the membrane to the cytosol, to be converted by MPT synthase into MPT. This pathway provides a possibility to address the general challenges faced in the development of a synthetic cell, to encapsulate large biomolecules with good efficiency and greater control and to evaluate the enzymatic reactions involved in the process. For this purpose, the emulsion-based technique was developed and optimised to allow rapid production of GUVs (~18 min) with high encapsulation efficiency (80%). This was made possible by optimizing various parameters such as density, type of oil, the impact of centrifugation speed/time, lipid concentration, pH, temperature, and emulsion droplet volume. Furthermore, the method was optimised in microtiter plates for direct experimentation and visualization after the GUV formation. Using this technique, the two steps - formation of cPMP from GTP and the formation of MPT from cPMP were encapsulated in different sets of GUVs to mimic the two compartments. Two independent fluorescence-based detection systems were established to confirm the successful encapsulation and conversion of the reactants. Alternatively, the enzymes produced using bacterial expression and measured. Following the successful encapsulation and evaluation of enzymatic reactions, cPMP transport across mitochondrial membrane has been mimicked using GUVs using a complex mitochondrial lipid composition. It was found that the cPMP interaction with the lipid bilayer results in transient pore-formation and leakage of internal contents. Overall, it can be concluded that in this thesis a novel technique has been optimised for fast production of functional synthetic cells. The individual enzymatic steps of the Moco biosynthetic pathway have successfully implemented and quantified within these cellular mimics. N2 - Die synthetische Biologie wird in der von unten-nach-oben-Methode eingesetzt, um zu verstehen, wie eine Zelle funktioniert. Dafür werden Techniken zur Herstellung lipidbasierter vesikul rer Strukturen als zellul re Nachahmungen entwickelt. Die gebräuchlichste Technik zur Herstellung von Zellnachahmungen oder synthetischen Zellen ist die Elektroformations- und Schwellmethode. Diese Techniken können jedoch Makromoleküle wie Proteine, Enzyme, DNA und sogar Liposomen nicht effizient als synthetische Organellen einkapseln. Daher ist es dringend erforderlich, neue Techniken zu entwickeln, die dieses Problem umgehen und die künstliche Zelle zu einer Realität machen, in der es möglich ist, eine eukaryotische Zelle durch Einkapselung von Makromolekülen zu imitieren. Das Ziel dieser Arbeit war es, ein komplexes Zellensystemmodel zu konstruieren, bei dem riesige unilamellare Vesikel (GUVs) zur Rekonstruktion des mitochondrialen Molybd n-Kofaktor-Biosynthesewegs verwendet werden. Dieser Stoffwechselweg ist bei allen Lebensformen hoch konserviert und daher aufgrund von St rungen, die durch Fehlfunktionen hervorgerufen werden, für seine biologische Bedeutung relevant. Darüber hinaus ist die Biosynthese selbst eine mehrstufige enzymatische Reaktion, die in verschiedenen Kompartimenten abläuft. Zunächst wird GTP in der mitochondrialen Matrix in Gegenwart von cPMP-Synthase zu cPMP umgewandelt. Anschlie end wird das produzierte cPMP über die Membran zum Zytosol transportiert, wo es von der MPT-Synthase in MPT umgewandelt wird. Dieser Biosyntheseweg bietet eine M glichkeit, den allgemeinen Herausforderungen bei der Entwicklung einer synthetischen Zelle zu begegnen, um große Biomoleküle mit guter Effizienz und Kontrolle zu verkapseln und die am Prozess beteiligten enzymatischen Reaktionen zu bewerten. Zu diesem Zweck wurde die emulsionsbasierte Technik entwickelt und optimiert, die eine schnelle Produktion von GUVs (~18 min) mit hoher Verkapselungseffizienz (80%) ermöglicht. M glich wurde dies durch die Optimierung verschiedener Parameter wie Dichte,  ltyp, Einfluss von Zentrifugationsgeschwindigkeit/-zeit, Lipidkonzentration, pH-Wert, Temperatur und Emulsionstropfenvolumen. Darüber hinaus wurde die Methode in Mikrotiterplatten für das direkte Experimentieren und die Visualisierung nach der GUV-Bildung optimiert. Mit dieser Technik wurden die beiden Schritte, die Bildung von cPMP aus GTP und die Bildung von MPT aus cPMP, in verschiedenen GUVs eingekapselt, um die beiden Kompartimente nachzuahmen. Zwei unabhängige fluoreszenzbasierte Detektionssysteme wurden eingerichtet, um die erfolgreiche Einkapselung und Umwandlung der Reaktanten zu best tigen. Alternativ wurden die Enzyme mittels bakterieller Expression produziert und gemessen. Nach der erfolgreichen Einkapselung und Auswertung der enzymatischen Reaktionen wurde der cPMP-Transport durch die mitochondriale Membran mit Hilfe von GUVs unter Verwendung einer komplexen mitochondrialen Lipidzusammensetzung nachgeahmt. Es wurde festgestellt, dass die cPMP-Wechselwirkung mit der Lipiddoppelschicht zu einer transienten Porenbildung und zum Auslaufen des inneren Inhalts führt. Insgesamt kann der Schluss gezogen werden, dass in dieser Arbeit eine neuartige Technik für die schnelle Herstellung funktioneller synthetischer Zellen optimiert wurde. Einzelne enzymatische Schritte des Moco-Biosynthesewegs wurden in diesen zellul ren Mimiken erfolgreich implementiert und quantifiziert. KW - GUVs KW - Molybdenum cofactor biosynthetic KW - Microscopy KW - Inverted emulsion-based method KW - Mikroskop KW - Biochemie Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-510167 ER - TY - THES A1 - Ceulemans, Ruben T1 - Diversity effects on ecosystem functions of tritrophic food webs T1 - Diversität beeinflusst Ökosystemfunktionen tritrophischer Nahrungsnetze N2 - There is a general consensus that diverse ecological communities are better equipped to adapt to changes in their environment, but our understanding of the mechanisms by which they do so remains incomplete. Accurately predicting how the global biodiversity crisis affects the functioning of ecosystems, and the services they provide, requires extensive knowledge about these mechanisms. Mathematical models of food webs have been successful in uncovering many aspects of the link between diversity and ecosystem functioning in small food web modules, containing at most two adaptive trophic levels. Meaningful extrapolation of this understanding to the functioning of natural food webs remains difficult, due to the presence of complex interactions that are not always accurately captured by bitrophic descriptions of food webs. In this dissertation, we expand this approach to tritrophic food web models by including the third trophic level. Using a functional trait approach, coexistence of all species is ensured using fitness-balancing trade-offs. For example, the defense-growth trade-off implies that species may be defended against predation, but this defense comes at the cost of a lower maximal growth rate. In these food webs, the functional diversity on a given trophic level can be varied by modifying the trait differences between the species on that level. In the first project, we find that functional diversity promotes high biomass on the top level, which, in turn, leads to a reduction in the temporal variability due to compensatory dynamical patterns governed by the top level. Next, these results are generalized by investigating the average behavior of tritrophic food webs, for wide intervals of all parameters describing species interactions in the food web. We find that the diversity on the top level is most important for determining the biomass and temporal variability of all other trophic levels, and show how biomass is only transferred efficiently to the top level when diversity is high everywhere in the food web. In the third project, we compare the response of a simple food chain against a nutrient pulse perturbation, to that of a food web with diversity on every trophic level. By joint consideration of the resistance, resilience, and elasticity, we uncover that the response is efficiently buffered when biomass on the top level is high, which is facilitated by functional diversity on every trophic level in the food web. Finally, in the fourth project, we show that even in a simple consumer-resource model without any diversity, top-down control on the intermediate level frequently causes the phase difference between the intermediate and basal level to deviate from the quarter-cycle lag rule. By adding a top predator, we show that these deviations become even more likely, and anti-phase cycles are often observed. The combined results of these projects show how the properties of the top trophic level, including its functional diversity, have a decisive influence on the functioning of tritrophic food webs from a mechanistic perspective. Because top species are often among the most vulnerable to extinction, our results emphasize the importance of their conservation in ecosystem management and restoration strategies. N2 - Wissenschaftliche Erkenntnisse über die in natürlichen Ökoystemen beobachtete Artenvielfalt hat gezeigt, dass die Artenvielfalt fast überall auf der Erde rapide abnimmt. Dieser Rückgang ist hauptsächlich auf den zunehmenden menschlichen Einfluss auf die Umwelt zurückzuführen. Insbesondere die zunehmende Landnutzung z. B. für die Landwirtschaft, die Verschmutzung und die überfischung wirken sich negativ auf die Biodiversität aus. Den Einfluss von Biodiversität auf die Funktion von natürlichen Ökosystemen ist ein sehr aktives Forschungsgebiet der Ökologie. Insbesondere hat sich herausgestellt, dass die Biodiversität einen entscheidenden Einfluss auf wichtige Eigenschaften von Ökosystemen hat, wie z.B. die Menge an Biomasse, die sich etablieren kann, wie groß die Schwankungen der Biomasse im Laufe der Zeit sind, wie effizient Energie durch das gesamte Ökosystem übertragen wird und wie es auf Umweltstörungen reagiert. In dieser Dissertation wird der Zusammenhang zwischen Biodiversität und Ökosystemfunktionen mit Hilfe mathematischer Modelle von Nahrungsnetzen untersucht um mit Hilfe dieses Ansatz wichtige Eigenschaften und deren Relevanz zu ermitteln. Ein Nahrungsnetz beschreibt einen zentralen Teil dessen, wie Arten in einem Ökosystem miteinander interagieren, nämlich wer wen frisst. Unsere Modelle enthalten drei trophische Ebenen: eine basale Ebene (z.B. Pflanzen), die einer mittleren Ebene (Pflanzenfresser) als Nahrungsquelle dient, die wiederum von einer oberen Ebene (Fleischfresser) gefressen werden. Die Koexistenz mehrerer Arten auf einer trophischen Ebene ist über Trade-offs zwischen wichtigen Merkmalen der Arten sichergestellt. Ein Trade-off zwischen Fraßschutz und Wachstum bedeutet zum Beispiel, dass jeder Mechanismus, mit dem sich eine Art vor Fressfeinden schützen kann (z. B. die Bildung von Stacheln), mit einer geringeren Wachstumsrate erkauft wird (die Pflanze muss Energie für die Bildung der Stacheln aufgewendet werden). Auf diese Weise ist die Koexistenz mehrerer Arten möglich: kein Fraßschutz und eine hohe Wachstumsrate, gegenüber hohem Fraßschutz und einer niedrigen Wachstumsrate. Wir zeigen, dass die Eigenschaften der obersten trophischen Ebene, wie z. B. ihr Biomasseanteil und ihre Diversität, einen sehr großen Einfluss auf die Eigenschaften aller anderen trophischen Ebenen im Nahrungsnetz ausüben. Insbesondere beobachten wir, dass eine hohe Biomasse und Diversität auf der obersten trophischen Ebene zu einem Nahrungsnetz führt, das zeitlich stabiler ist, die verfügbaren anorganischen Nährstoffe besser ausnutzt und die erhöhte Produktivität der basalen trophischen Ebene effizienter an die Spitze des Nahrungsnetzes weitergibt. Darüber hinaus stellen wir fest, dass die oberste trophische Ebene eine Schlüsselrolle bei der Abschwächung von Auswirkungen auf ein Nahrungsnetz durch externe Störungen spielt. Zudem verstärkt sich dieser Effekt der obersten trophischen Ebene, wenn die anderen trophischen Ebenen ebenfalls eine hohe Diversität aufzeigen. Unsere Ergebnisse unterstreichen somit die Bedeutung von Diversität in allen Nahrungsnetzen, um einen Fortbestand von Ökosystemdienstleistungen zu gewährleisten, auf die wir angewiesen sind. KW - food webs KW - trait variation KW - trait diversity KW - Nahrungsnetze KW - Merkmalsvielfalt KW - Merkmalsvariation Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-503259 ER - TY - THES A1 - Borghi, Gian Luca T1 - Evolution and diversity of photosynthetic metabolism in C3, C3-C4 intermediate and C4 plants T1 - Evolution und Diversität des photosynthetischen Stoffwechsels in C3-, C3-C4-Intermediär- und C4-Pflanzen N2 - In C3 plants, CO2 diffuses into the leaf and is assimilated by the Calvin-Benson cycle in the mesophyll cells. It leaves Rubisco open to its side reaction with O2, resulting in a wasteful cycle known as photorespiration. A sharp fall in atmospheric CO2 levels about 30 million years ago have further increased the side reaction with O2. The pressure to reduce photorespiration led, in over 60 plant genera, to the evolution of a CO2-concentrating mechanism called C4 photosynthesis; in this mode, CO2 is initially incorporated into 4-carbon organic acids, which diffuse to the bundle sheath and are decarboxylated to provide CO2 to Rubisco. Some genera, like Flaveria, contain several species that represent different steps in this complex evolutionary process. However, the majority of terrestrial plant species did not evolve a CO2-concentrating mechanism and perform C3 photosynthesis. This thesis compares photosynthetic metabolism in several species with C3, C4 and intermediate modes of photosynthesis. Metabolite profiling and stable isotope labelling were performed to detect inter-specific differences changes in metabolite profile and, hence, how a pathway operates. The results obtained were subjected to integrative data analyses like hierarchical clustering and principal component analysis, and were deepened by correlation analyses to uncover specific metabolic features and reaction steps that were conserved or differed between species. The main findings are that Calvin-Benson cycle metabolite profiles differ between C3 and C4 species and between different C3 species, including a very different response to rising irradiance in Arabidopsis and rice. These findings confirm Calvin-Benson cycle operation diverged between C3 and C4 species and, most unexpectedly, even between different C3 species. Moreover, primary metabolic profiles supported the current C4 evolutionary model in the genus Flaveria and also provided new insights and opened up new questions. Metabolite profiles also point toward a progressive adjustment of the Calvin-Benson cycle during the evolution of C4 photosynthesis. Overall, this thesis point out the importance of a metabolite-centric approach to uncover underlying differences in species apparently sharing the same photosynthetic routes and as a valid method to investigate evolutionary transition between C3 and C4 photosynthesis. N2 - Bei C3-Pflanzen diffundiert CO2 in das Blatt und wird durch den Calvin-Benson-Zyklus in den Mesophyllzellen assimiliert. Dies lässt Rubisco für seine Nebenreaktion mit O2 offen, was zu einem verschwenderischen Kreislauf führt, der als Photorespiration bekannt ist. Ein starker Rückgang der atmosphärischen CO2-Konzentration vor etwa 30 Millionen Jahren hat die Nebenreaktion mit O2 weiter verstärkt. Der Druck, die Photorespiration zu reduzieren, hat in über 60 Pflanzengattungen zur Entwicklung eines CO2-Konzentrationsmechanismus namens C4-Photosynthese geführt. In diesem Mechanismus wird CO2 zunächst in organische C4-Kohlenstoffsäuren eingebaut, die zur Bündelscheide diffundieren und dort decarboxyliert werden, um CO2 für Rubisco bereitzustellen. Einige Gattungen, wie z.B. Flaveria, enthalten mehrere Arten, die verschiedene Schritte dieses komplexen Evolutionsprozesses darstellen. Die Mehrheit der terrestrischen Pflanzenarten hat jedoch keinen CO2-Konzentrationsmechanismus entwickelt und betreibt C3-Photosynthese. Diese Arbeit vergleicht den Photosynthese-Metabolismus in mehreren Spezies mit C3-, C4- und intermediären Arten der Photosynthese. Metaboliten-Profiling und stabile Isotopenmarkierung wurden durchgeführt, um interspezifische Unterschiede im Metabolitenprofil und damit die Funktionsweise der Stoffwechselwege zu erkennen. Die Ergebnisse wurden integrativen Datenanalysen wie hierarchischem Clustering und Hauptkomponentenanalyse unterzogen und durch Korrelationsanalysen vertieft, um spezifische metabolische Merkmale und Reaktionsschritte aufzudecken, die konserviert oder zwischen Spezies verschieden sind. Die wichtigsten Ergebnisse sind, dass sich die Metabolitenprofile des Calvin-Benson-Zyklus zwischen C3- und C4-Spezies und zwischen verschiedenen C3-Spezies unterscheiden, einschließlich einer sehr unterschiedlichen Reaktion auf steigende Strahlungsintensität bei Arabidopsis und Reis. Diese Ergebnisse bestätigen, dass der Calvin-Benson-Zyklus zwischen C3- und C4-Spezies und, höchst unerwartet, sogar zwischen verschiedenen C3-Spezies divergiert. Darüber hinaus unterstützen die primären Stoffwechselprofile das aktuelle C4-Evolutionsmodell in der Gattung Flaveria, liefern auch neue Erkenntnisse und eröffnen neue Fragen. Die Metabolitenprofile weisen auch auf eine fortschreitende Anpassung des Calvin-Benson-Zyklus während der Evolution der C4-Photosynthese hin. Insgesamt unterstreicht diese Dissertation die Bedeutung eines metabolitenzentrierten Ansatzes, um Unterschiede in Arten aufzudecken, die anscheinend dieselben Photosynthesewege teilen, und als valide Methode zur Untersuchung des evolutionären Übergangs zwischen C3- und C4-Photosynthese. KW - Photosynthesis KW - C4 KW - Evolution KW - Photosynthese KW - C4 KW - Evolution Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-522200 ER - TY - THES A1 - Krumbholz, Julia T1 - Identification of chemical mediators that regulate the specialized metabolism in Nostoc punctiforme T1 - Identifizierung chemischer Mediatoren, die den spezialisierten Metabolismus in Nostoc punctiforme regulieren N2 - Specialized metabolites, so-called natural products, are produced by a variety of different organisms, including bacteria and fungi. Due to their wide range of different biological activities, including pharmaceutical relevant properties, microbial natural products are an important source for drug development. They are encoded by biosynthetic gene clusters (BGCs), which are a group of locally clustered genes. By screening genomic data for genes encoding typical core biosynthetic enzymes, modern bioinformatical approaches are able to predict a wide range of BGCs. To date, only a small fraction of the predicted BGCs have their associated products identified. The phylum of the cyanobacteria has been shown to be a prolific, but largely untapped source for natural products. Especially multicellular cyanobacterial genera, like Nostoc, harbor a high amount of BGCs in their genomes. A main goal of this study was to develop new concepts for the discovery of natural products in cyanobacteria. Due to its diverse setup of orphan BGCs and its amenability to genetic manipulation, Nostoc punctiforme PCC 73102 (N. punctiforme) appeared to be a promising candidate to be established as a model organism for natural product discovery in cyanobacteria. By utilizing a combination of genome-mining, bioactivity-screening, variations of culture conditions, as well as metabolic engineering, not only two new polyketides were discovered, but also first-time insights into the regulation of the specialized metabolism in N. punctiforme were gained during this study. The cultivation of N. punctiforme to very high densities by utilizing increasing light intensities and CO2 levels, led to an enhanced metabolite production, causing rather complex metabolite extracts. By utilizing a library of CFP reporter mutant strains, each strain reporting for one of the predicted BGCs, it was shown that eight out of 15 BGCs were upregulated under high density (HD) cultivation conditions. Furthermore, it could be demonstrated that the supernatant of an HD culture can increase the expression of four of the influenced BGCs, even under conventional cultivation conditions. This led to the hypothesis that a chemical mediator encoded by one of the affected BGCs is accumulating in the HD supernatant and is able to increase the expression of other BGCs as part of a cell-density dependent regulatory circuit. To identify which of the BGCs could be a main trigger of the presumed regulatory circuit, it was tried to activate four BGCs (pks1, pks2, ripp3, ripp4) selectively by overexpression of putative pathway-specific regulatory genes that were found inside the gene clusters. Transcriptional analysis of the mutants revealed that only the mutant strain targeting the pks1 BGC, called AraC_PKS1, was able to upregulate the expression of its associated BGC. From an RNA sequencing study of the AraC_PKS1 mutant strain, it was discovered that beside pks1, the orphan BGCs ripp3 and ripp4 were also upregulated in the mutant strain. Furthermore, it was observed that secondary metabolite production in the AraC_PKS1 mutant strain is further enhanced under high-light and high-CO2 cultivation conditions. The increased production of the pks1 regulator NvlA also had an impact on other regulatory factors, including sigma factors and the RNA chaperone Hfq. Analysis of the AraC_PKS1 cell and supernatant extracts led to the discovery of two novel polyketides, nostoclide and nostovalerolactone, both encoded by the pks1 BGC. Addition of the polyketides to N. punctiforme WT demonstrated that the pks1-derived compounds are able to partly reproduce the effects on secondary metabolite production found in the AraC_PKS1 mutant strain. This indicates that both compounds are acting as extracellular signaling factors as part of a regulatory network. Since not all transcriptional effects that were found in the AraC_PKS1 mutant strain could be reproduced by the pks1 products, it can be assumed that the regulator NvlA has a global effect and is not exclusively specific to the pks1 pathway. This study was the first to use a putative pathway specific regulator for the specific activation of BGC expression in cyanobacteria. This strategy did not only lead to the detection of two novel polyketides, it also gave first-time insights into the regulatory mechanism of the specialized metabolism in N. punctiforme. This study illustrates that understanding regulatory pathways can aid in the discovery of novel natural products. The findings of this study can guide the design of new screening strategies for bioactive compounds in cyanobacteria and help to develop high-titer production platforms for cyanobacterial natural products. N2 - Sekundärmetabolite, auch Naturstoffe genannt, werden von einer Vielzahl an Organismen, darunter Bakterien und Pilzen, hergestellt. Aufgrund ihrer Vielzahl an verschiedenen Bioaktivitäten, einschließlich pharmakologisch relevanter Wirkungen, sind mikrobielle Naturstoffe eine wichtige Grundlage für die Arzneimittelentwicklung. Naturstoffe werden durch eine Ansammlung lokal gruppierter Gene, sogenannten Biosynthese-Genclustern (BGC), im Genom kodiert. Moderne bioinformatische Methoden durchsuchen Genom-Daten nach Genen, die typische biosynthetische Enzyme kodieren. Auf Grundlage dessen können verschiedenste BGCs vorhergesagt werden. Bislang konnte allerdings nur für einen kleinen Teil der vorhergesagten BGCs das dazugehörige Produkt identifiziert und charakterisiert werden. Cyanobakterien sind nachweislich eine reichhaltige, aber weitestgehend unerschlossene Quelle für Naturstoffe. Insbesondere mehrzellige Gattungen, wie Nostoc, tragen eine Vielzahl an BGCs in ihren Genomen. Ein Hauptziel dieser Studie war es, neue Konzepte für die Entdeckungen von Naturstoffen in Cyanobakterien zu entwickeln. Nostoc punctiforme PCC 73102 (N. punctiforme) erwies sich als besonders geeigneter Stamm für diese Aufgabe, da er eine Vielzahl weitestgehend ununtersuchter Gencluster besitzt und zugänglich für genetische Modifikationen ist. Eine Kombination aus Genome Mining, Bioaktivitäts-Screening, verschiedenen Kultivierungsbedingungen und Metabolic Engineering führte zur Entdeckung zweier neuer Polyketide und gewährte im Verlauf der Studie erstmals Einblicke in den spezialisierten Metabolismus von N. punctiforme. Die Kultivierung von N. punctiforme in sehr hohen Zelldichten, ermöglicht durch sehr hohe Lichtintensitäten und erhöhte CO2-Verfügbarkeit, führte zu einer verstärkten Metabolitproduktion und komplexen Metabolitextrakten. Unter Verwendung einer Bibliothek von CFP-Reportermutanten, bei der jede Mutante eines der vorhergesagten BGCs repräsentiert, konnte gezeigt werden, dass 8 von 15 BGCs unter Hochzelldichte-Kultivierungsbedingungen hochreguliert wurden. Zudem zeigte sich, dass der Überstand einer dichten Kultur, auch unter konventionellen Kultivierungsbedingungen, vier der regulierten BGCs beeinflussen kann. Dies lässt vermuten, dass sich unter Hochzelldichte-Kultivierungsbedingungen ein chemischer Mediator, welcher von einem der beeinflussten BGCs produziert wird, im Überstand anhäuft und die Expression anderer BGCs als Teil eines zelldichte-abhängigen Regelkreises kontrollieren kann. Um herauszufinden, welches der BGCs ein Hauptauslöser des vermuteten Regelkreises sein könnte, wurde versucht die Expression von vier BGCs (pks1, pks2, ripp3, ripp4) mittels Überexpression von potentiell biosynthese-spezifischen regulatorischen Genen zu aktivieren. Eine transkriptionelle Analyse der Mutanten ergab, dass nur der Stamm, welcher das pks1 BGC aktivieren sollte (AraC_PKS1), einen positiven Effekt auf die Expression des zu erwartenden BGCs hatte. Eine RNA-Sequenzierungsstudie ergab, dass in der AraC_PKS1 Mutante neben dem pks1 BGC auch die kryptischen BGCs ripp3 und ripp4 eine erhöhte Transkription aufwiesen. Zudem wurde beobachtet, dass sich die Sekundärmetabolitproduktion in der Mutante durch Kultivierung unter erhöhten Licht-Intensitäten und CO2-Leveln erweitern lässt. Unabhängig von den Kultivierungsbedingungen, hat die erhöhte Produktion des pks1 Regulators NvlA in der Mutante einen Einfluss auf andere regulatorische Faktoren, wie Sigma-Faktoren und das RNA-Chaperon Hfq. Die Analyse des Zell- und Überstandsextrakts der AraC_PKS1 Mutante führte zur Entdeckung zweier neuer Polyketide, Nostoclid und Nostovalerolacton, welche beide vom pks1 BGC codiert werden. Die Zugabe dieser Polyketide zum N. punctiforme Wildtyp zeigte, dass diese in der Lage sind einen Teil der Sekundärmetabolit-Effekte der AraC_PKS1 Mutante zu reproduzieren. Dies lässt darauf schließen, dass beide Polyketide als Signalstoffe innerhalb eines regulatorischen Netzwerks agieren. Da nicht alle transkriptionellen Effekte der AraC_PKS1 Mutante durch die Zugabe der pks1 Produkte reproduziert werden konnten, ist anzunehmen, dass der Regulator NvlA einen globalen Effekt hat und nicht ausschließlich die pks1 Biosynthese reguliert. Diese Studie war die erste, welche einen potentiell biosynthese-spezifischen Regulator für die gezielte Aktivierung von BGC-Expression in Cyanobakterien verwendet hat. Diese Strategie führte neben der Entdeckung zweier neuer Polyketide, zu ersten Einblicken in den regulatorischen Mechanismus, der den spezialisierten Metabolismus in N. punctiforme kontrolliert. Diese Studie veranschaulicht, dass das Verstehen regulatorischer Mechanismen für die Entdeckung neuer Naturstoffe hilfreich sein kann. Die Studien-Ergebnisse können die Entwicklung neuer Screening-Strategien für bioaktive Metabolite in Cyanobakterien anregen und können dabei helfen Hochtiter-Produktionsplattformen für cyanobakterielle Naturstoffe zu entwickeln. KW - cyanobacteria KW - natural products KW - specialized metabolites KW - gene cluster activation KW - Nostoc punctiforme KW - Cyanobakterien KW - Sekundärmetabolite KW - Naturstoffe KW - Gencluster-Aktivierung Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-540240 ER - TY - THES A1 - Hasnat, Muhammad Abrar T1 - A-Type Carrier Proteins are involved in [4Fe-4S] Cluster insertion into the Radical S-adenosylmethionine (SAM) Protein MoaA and other molybdoenzymes N2 - Iron-sulfur clusters are essential enzyme cofactors. The most common and stable clusters are [2Fe-2S] and [4Fe-4S] that are found in nature. They are involved in crucial biological processes like respiration, gene regulation, protein translation, replication and DNA repair in prokaryotes and eukaryotes. In Escherichia coli, Fe-S clusters are essential for molybdenum cofactor (Moco) biosynthesis, which is a ubiquitous and highly conserved pathway. The first step of Moco biosynthesis is catalyzed by the MoaA protein to produce cyclic pyranopterin monophosphate (cPMP) from 5’GTP. MoaA is a [4Fe-4S] cluster containing radical S-adenosyl-L-methionine (SAM) enzyme. The focus of this study was to investigate Fe-S cluster insertion into MoaA under nitrate and TMAO respiratory conditions using E. coli as a model organism. Nitrate and TMAO respiration usually occur under anaerobic conditions, where oxygen is depleted. Under these conditions, E. coli uses nitrate and TMAO as terminal electron. Previous studies revealed that Fe-S cluster insertion is performed by Fe-S cluster carrier proteins. In E. coli, these proteins are known as A-type carrier proteins (ATC) by phylogenomic and genetic studies. So far, three of them have been characterized in detail in E. coli, namely IscA, SufA, and ErpA. This study shows that ErpA and IscA are involved in Fe-S cluster insertion into MoaA under nitrate and TMAO respiratory conditions. ErpA and IscA can partially replace each other in their role to provide [4Fe-4S] clusters for MoaA. SufA is not able to replace the functions of IscA or ErpA under nitrate respiratory conditions. Nitrate reductase is a molybdoenzyme that coordinates Moco and Fe-S clusters. Under nitrate respiratory conditions, the expression of nitrate reductase is significantly increased in E. coli. Nitrate reductase is encoded in narGHJI genes, the expression of which is regulated by the transcriptional regulator, fumarate and nitrate reduction (FNR). The activation of FNR under conditions of nitrate respiration requires one [4Fe-4S] cluster. In this part of the study, we analyzed the insertion of Fe-S cluster into FNR for the expression of narGHJI genes in E. coli. The results indicate that ErpA is essential for the FNR-dependent expression of the narGHJI genes, a role that can be replaced partially by IscA and SufA when they are produced sufficiently under the conditions tested. This observation suggests that ErpA is indirectly regulating nitrate reductase expression via inserting Fe-S clusters into FNR. Most molybdoenzymes are complex multi-subunit and multi-cofactor-containing enzymes that coordinate Fe-S clusters, which are functioning as electron transfer chains for catalysis. In E. coli, periplasmic aldehyde oxidoreductase (PaoAC) is a heterotrimeric molybdoenzyme that consists of flavin, two [2Fe-2S], one [4Fe-4S] cluster and Moco. In the last part of this study, we investigated the insertion of Fe-S clusters into E. coli periplasmic aldehyde oxidoreductase (PaoAC). The results show that SufA and ErpA are involved in inserting [4Fe-4S] and [2Fe-2S] clusters into PaoABC, respectively under aerobic respiratory conditions. KW - enzyme KW - gene KW - iron sulfur clusters KW - Enzyme KW - Gen KW - Eisen-Schwefel-Cluster Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-530791 ER - TY - THES A1 - Dahmani, Ismail T1 - Influenza A virus matrix protein M1 T1 - Influenza-A-Virus-Matrixprotein M1 BT - structural determinants of membrane binding and protein- induced deformation BT - strukturelle Determinanten der Membranbindung und protein-induzierte Deformation N2 - Influenza A virus (IAV) is a pathogen responsible for severe seasonal epidemics threatening human and animal populations every year. During the viral assembly process in the infected cells, the plasma membrane (PM) has to bend in localized regions into a vesicle towards the extracellular side. Studies in cellular models have proposed that different viral proteins might be responsible for inducing membrane curvature in this context (including M1), but a clear consensus has not been reached. M1 is the most abundant protein in IAV particles. It plays an important role in virus assembly and budding at the PM. M1 is recruited to the host cell membrane where it associates with lipids and other viral proteins. However, the details of M1 interactions with the cellular PM, as well as M1-mediated membrane bending at the budozone, have not been clarified. In this work, we used several experimental approaches to analyze M1-lipids and M1-M1 interactions. By performing SPR analysis, we quantified membrane association for full-length M1 and different genetically engineered M1 constructs (i.e., N- and C-terminally truncated constructs and a mutant of the polybasic region). This allowed us to obtain novel information on the protein regions mediating M1 binding to membranes. By using fluorescence microscopy, cryogenic transmission electron microscopy (cryo-TEM), and three-dimensional (3D) tomography (cryo-ET), we showed that M1 is indeed able to cause membrane deformation on vesicles containing negatively-charged lipids, in the absence of other viral components. Further, sFCS analysis proved that simple protein binding is not sufficient to induce membrane restructuring. Rather, it appears that stable M1-M1 interactions and multimer formation are required to alter the bilayer three-dimensional structure through the formation of a protein scaffold. Finally, to mimic the budding mechanism in cells that arise by the lateral organization of the virus membrane components on lipid raft domains, we created vesicles with lipid domains. Our results showed that local binding of M1 to spatial confined acidic lipids within membrane domains of vesicles led to local M1 inward curvature. N2 - Das Influenza-A-Virus (IAV) ist ein Erreger, der für schwere saisonale Epidemien verantwortlich ist, die jedes Jahr Menschen und Tiere bedrohen. Während des viralen Assemblierungsprozesses in den infizierten Zellen muss sich die Plasmamembran (PM) an bestimmten Stellen zu einem Vesikel zur extrazellulären Seite biegen. Studien an zellulären Modellen haben ergeben, dass verschiedene virale Proteine (einschließlich M1) für die Induktion der Membrankrümmung in diesem Zusammenhang verantwortlich sein könnten, ein eindeutiger Konsens wurde jedoch nicht erreicht. M1 ist das am häufigsten vorkommende Protein in IAV-Partikeln. Es spielt eine wichtige Rolle bei der Virusassemblierung und Knospung. M1 wird zur Wirtszellmembran rekrutiert, wo es sich mit Lipiden und anderen viralen Proteinen assoziiert. Die Einzelheiten der Interaktionen von M1 mit der zellulären PM sowie die M1-vermittelte Membranverbiegung am Ort der Virusfreisetzung sind jedoch noch nicht geklärt. In dieser Arbeit wurden mehrere experimentelle Ansätze zur Analyse von M1-Lipiden und M1-M1 Wechselwirkungen untersucht. Mittels SPR-Analyse wurde die Membranassoziation für M1 in voller Länge und verschiedene gentechnisch veränderte M1-Konstrukte (d. h. N- und C-terminal verkürzte Konstrukte und eine Mutante der polybasischen Region) quantifiziert; so konnten neue Erkenntnisse über die Proteinregionen, die die Bindung von M1 an Membranen steuern, gewonnen werden. Mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie, kryogener Transmissionselektronenmikroskopie (cryo-TEM) und dreidimensionaler (3D) Tomographie (cryo-ET) konnten wir zeigen, dass M1 tatsächlich in der Lage ist, die Membran von Vesikeln, die negativ geladene Lipide enthalten, zu deformieren (und zwar ohne andere virale Komponenten). Außerdem bewies die sFCS-Analyse, dass eine einfache Proteinbindung nicht ausreicht, um eine Umstrukturierung der Membran zu bewirken. Vielmehr scheint es, dass stabile M1-M1-Wechselwirkungen und die Bildung von Multimeren erforderlich sind, um die dreidimensionale Struktur der Doppelschicht Struktur durch die Bildung eines Proteingerüsts zu verändern. Um schließlich den Knospungsmechanismus zu imitieren, der durch die laterale Organisation der Virusmembrankomponenten auf Lipid-Raft-Domänen entsteht, haben wir Vesikel mit Lipiddomänen erzeugt. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die lokale Bindung von M1 an räumlich begrenzte saure Lipide innerhalb der Membrandomänen der Vesikel zu einer lokalen Krümmung von M1 nach innen führt. KW - Influenza A virus KW - Influenza KW - Pathogen KW - Lipids KW - Epidemic KW - Epidemics KW - Plasma membrane KW - Viral assembly KW - Virus KW - Vesicle KW - Giant Vesicles KW - Budozone KW - M1-M1 interaction KW - Virion KW - Membrane deformation KW - IAV particles KW - membrane binding KW - M1-lipids KW - protein binding KW - GUV KW - Giant unilamellar vesicles KW - Budozone KW - Epidemie KW - Epidemien KW - GUV KW - Riesenvesikel KW - riesige unilamellare Vesikel KW - IAV-Partikel KW - Influenza KW - Influenza-A-Virus KW - Lipide KW - M1-M1-Interaktion KW - M1-Lipide KW - Membrandeformation KW - Pathogen KW - Plasmamembran KW - Vesikel KW - Virusassemblierung, Virion KW - Virus KW - Membranbindung KW - Proteinbindung Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-527409 ER - TY - THES A1 - Woehlecke, Sandra T1 - Das erweiterte Fachwissen für den schulischen Kontext als Leitlinie für eine additive fachliche Lehrveranstaltung im Lehramtsstudium Biologie T1 - School-related content knowledge as a guideline for an additive subject-based course for preservice biology teachers N2 - Das Fachwissen von Lehrkräften weist für die Ausprägung fachdidaktischer Expertise eine hohe Bedeutung auf. Welche Merkmale universitäre Lehrveranstaltungen aufweisen sollten, um Lehramtsstudierenden ein berufsspezifisches Fachwissen zu vermitteln, ist jedoch überwiegend noch unklar. Innerhalb des Projekts PSI-Potsdam wurde auf theoretischer Grundlage das fachübergreifende Modell des erweiterten Fachwissens für den schulischen Kontext entwickelt. Als Ansatz zur Verbesserung des Biologie-Lehramtsstudiums diente dieses Modell als Konzeptionsgrundlage für eine additive Lehrveranstaltung. Hierbei werden Lerngelegenheiten geboten, um das universitär erworbene Fachwissen über zellbiologische Inhalte auf schulische Kontexte anzuwenden, z.B. durch die Dekonstruktion und anschließende Rekonstruktion von schulischen Lerntexten. Die Wirkung des Seminars wurde in mehreren Zyklen im Forschungsformat der Fachdidaktischen Entwicklungsforschung beforscht. Eine der zentralen Forschungsfragen lautet dabei: Wie kann eine Lerngelegenheit für Lehramtsstudierende der Biologie gestaltet sein, um ein erweitertes Fachwissen für den schulischen Kontext für den zellbiologischen Themenbereich „Struktur und Funktion der Biomembran“ zu fördern? Anhand fallübergreifender Analysen (n = 29) wird im empirischen Teil aufgezeigt, welche Einstellungen zum Lehramtsstudium in der Stichprobe bestehen. Als ein wichtiges Ergebnis kann hierbei herausgestellt werden, dass sich das Fachinteresse hinsichtlich schulisch und universitär vermittelter Inhalte bei den untersuchten Studierenden auffallend unterscheidet, wobei dem Schulwissen ein deutlich höheres Interesse entgegengebracht wird. Die Berufsrelevanz fachlicher Inhalte wird seitens der Studierenden häufig am Schulwissen festgemacht. Innerhalb konkreter Einzelfallanalysen (n = 6) wird anhand von Lernpfaden dargestellt, wie sich über mehrere Design-Experimente hinweg fachliche Konzepte entwickelt haben. Bei der Beschreibung wird vor allem auf Schlüsselstellen und Hürden im Lernprozess fokussiert. Aus diesen Ergebnissen folgend werden vorgenommene Iterationen für die einzelnen Zyklen beschrieben, die ebenfalls anhand der iterativen Entwicklung der Design-Prinzipien dargelegt werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Schlüsselstellen sehr individuell aufgrund der subjektiv fokussierten Inhalte zu Tage treten. Meist treten sie jedoch im Zusammenhang mit der Verknüpfung verschiedener fachlicher Konzepte oder durch kooperative Aufschlüsselungen von Konzepten auf. Fachliche Hürden konnten hingegen in Form von fachlich unangemessenen Vorstellungen fallübergreifend identifiziert werden. Dies betrifft unter anderem die Vorstellung der Biomembran als Wand, die mit den Vorstellungen einer Schutzfunktion und einer formgebenden Funktion der Biomembran einhergeht. Weiterhin wird beleuchtet, wie das erweiterte Fachwissen für den schulischen Kontext zur Bearbeitung der Lernaufgaben angewendet wurde. Es hat sich gezeigt, dass sich bestimmte Lerngelegenheiten eigenen, um bestimmte Facetten des erweiterten Fachwissens zu fördern. Insgesamt scheint das Modell des erweiterten Fachwissens für den schulischen Kontext äußerst geeignet zu sein, um anhand der Facetten und deren Beschreibungen Lerngelegenheiten oder Gestaltungsprinzipien für diese zu konzipieren. Für das untersuchte Lehr-Lernarrangement haben sich kleinere Adaptationen des Modells als sinnvoll erwiesen. Hinsichtlich der Methodologie konnten Ableitungen für die Anwendung der fachdidaktischen Entwicklungsforschung für additive fachliche Lehrveranstaltungen dieser Art herausgestellt werden. Um den Professionsbezug der fachwissenschaftlichen Anteile im Lehramtsstudium zu verbessern, ist der weitere Einbezug des erweiterten Fachwissens für den schulischen Kontext in die fachwissenschaftlichen Studienanteile überaus wünschenswert. N2 - The content knowledge of teachers is of great importance for the development of pedagogical content knowledge and its application in teaching. However, the characteristics of university courses in order to provide pre-service biology teachers with job-specific content knowledge are still unclear. Within the project PSI-Potsdam a theory-based interdisciplinary model of school-related content knowledge (SRCK) was developed. This model served as a conceptual basis for an additive course within the biology teacher training curriculum. Learning opportunities are offered to apply the university-acquired subject matter knowledge to school contexts (e.g. through the deconstruction and subsequent reconstruction of texts for school purposes). The effects of the seminar, especially the learning processes, were observed in several cycles in the format of design research. One of the central research questions is: How can a learning opportunity for perspective Biology teachers be designed, to promote SRCK with regard to the topic “structure and function of the biomembrane"? Cross-case analyses (n = 29) show existing attitudes towards teacher training. As an important result, it can be emphasized, that the subject interest in school- and university-taught content differs strikingly among the students. School knowledge is shown a significantly higher interest. The professional relevance of subject-related content is often determined by a perceived proximity to school knowledge. Within concrete individual case analyses (n = 6), learning paths are used to show how subject-specific concepts have developed over several design experiments. The description focuses primarily on key points and obstacles in the learning process. Within this framework, iterations made for the individual cycles are described. It could be shown that the key points come to light very individually due to the focused content. In most cases, however, they occur in connection with the linking of different concepts or through cooperative explanations of concepts. Obstacles in the learning processes, on the other hand, could be identified across cases in the form of inappropriate ideas. This concerns, among other things, the idea of the biomembrane as a wall, which goes hand in hand with the ideas of a protective function and a shaping function of the biomembrane. Furthermore, a number of possibilities could be shown, how the SRCK was applied in the learning tasks. It was established that certain learning opportunities are appropriate to promote certain facets of SRCK. Overall, the model of SRCK seems to be extremely suitable in order to design learning opportunities. For the investigated teaching-learning arrangement, smaller adaptations of the model have proven as useful. In order to improve the professional relevance of the teacher training programme, the further inclusion of the SRCK in the subject-specific study components is highly desirable. KW - Professionswissen KW - Fachwissen KW - Studierendenvorstellungen KW - Biomembran KW - Erweitertes Fachwissen für den schulischen Kontext KW - professional competence KW - Design Research KW - Design Research KW - content knowledge KW - biomembrane KW - school-related content knowledge Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-521209 ER - TY - THES A1 - Möser, Christin T1 - Modular DNA constructs for oligovalent bio-enhancement and functional screening T1 - Modulare DNA-Konstrukte für oligovalente Bio-Verstärkung und funktionelles Screening N2 - Deoxyribonucleic acid (DNA) nanostructures enable the attachment of functional molecules to nearly any unique location on their underlying structure. Due to their single-base-pair structural resolution, several ligands can be spatially arranged and closely controlled according to the geometry of their desired target, resulting in optimized binding and/or signaling interactions. This dissertation covers three main projects. All of them use variations of functionalized DNA nanostructures that act as platform for oligovalent presentation of ligands. The purpose of this work was to evaluate the ability of DNA nanostructures to precisely display different types of functional molecules and to consequently enhance their efficacy according to the concept of multivalency. Moreover, functionalized DNA structures were examined for their suitability in functional screening assays. The developed DNA-based compound ligands were used to target structures in different biological systems. One part of this dissertation attempted to bind pathogens with small modified DNA nanostructures. Pathogens like viruses and bacteria are known for their multivalent attachment to host cells membranes. By blocking their receptors for recognition and/or fusion with their targeted host in an oligovalent manner, the objective was to impede their ability to adhere to and invade cells. For influenza A, only enhanced binding of oligovalent peptide-DNA constructs compared to the monovalent peptide could be observed, whereas in the case of respiratory syncytial virus (RSV), binding as well as blocking of the target receptors led to an increased inhibition of infection in vitro. In the final part, the ability of chimeric DNA-peptide constructs to bind to and activate signaling receptors on the surface of cells was investigated. Specific binding of DNA trimers, conjugated with up to three peptides, to EphA2 receptor expressing cells was evaluated in flow cytometry experiments. Subsequently, their ability to activate these receptors via phosphorylation was assessed. EphA2 phosphorylation was significantly increased by DNA trimers carrying three peptides compared to monovalent peptide. As a result of activation, cells underwent characteristic morphological changes, where they "round up" and retract their periphery. The results obtained in this work comprehensively prove the capability of DNA nanostructures to serve as stable, biocompatible, controllable platforms for the oligovalent presentation of functional ligands. Functionalized DNA nanostructures were used to enhance biological effects and as tool for functional screening of bio-activity. This work demonstrates that modified DNA structures have the potential to improve drug development and to unravel the activation of signaling pathways. N2 - Desoxyribonukleinsäure (DNS, engl. DNA) - Nanostrukturen ermöglichen die Anbringung funktioneller Moleküle an nahezu jede einzigartige Stelle der zugrunde liegenden Struktur. Aufgrund der Basenpaar-Strukturauflösung von DNA können mehrere Moleküle (z.B. Liganden) entsprechend der Geometrie ihres gewünschten Ziels räumlich angeordnet und genau kontrolliert werden, was zu optimierten Bindungs- und/oder Signalwechselwirkungen führt. Diese Dissertation umfasst drei Hauptprojekte. Alle Projekte verwenden Varianten von funktionalisierten DNA-Nanostrukturen, die als Plattform für die oligovalente Präsentation von Liganden dienen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Fähigkeit von DNA-Nanostrukturen zur präzisen Positionierung verschiedener Arten von funktionellen Molekülen zu evaluieren und folglich die Wirksamkeit der Moleküle gemäß dem Konzept der Multivalenz zu erhöhen. Außerdem wurde untersucht, wie funktionalisierte DNA-Strukturen in verschiedenen Verfahren zur Erforschung von biologischen Interaktionen eingesetzt werden können. Die entwickelten DNA-basierten Liganden wurden verwendet, um Strukturen auf verschiedenen biologischen Systemen gezielt zu binden. In einem Teil dieser Dissertation wurde versucht, Krankheitserreger mit kleinen modifizierten DNA-Nanostrukturen zu binden. Pathogene, wie Viren und Bakterien, sind für ihre multivalente Anheftung an Wirtszellmembranen bekannt. Durch die oligovalente Blockierung ihrer Rezeptoren für die Erkennung und/oder Fusion mit ihrem Wirt sollte ihre Fähigkeit, sich an Zielzellen anzuheften und in diese einzudringen, beeinträchtigt werden. Bei Influenza A Viren konnte nur eine verstärkte Bindung von oligovalenten Peptid-DNA-Konstrukten im Vergleich zu monovalenten Peptiden beobachtet werden, wohingegen bei Respiratorischen Synzytial-Viren (RSV) sowohl die Bindung als auch die Blockierung der Zielrezeptoren zu einer verstärkten Hemmung der Infektion in vitro führte. Im letzten Teil wurden chimäre DNA-Peptidkonstrukte auf ihre Fähigkeit, an Signalrezeptoren auf der Oberfläche von Zellen zu binden und diese zu aktivieren, getestet. Die spezifische Bindung von mit bis zu drei Peptiden konjugierten DNA-Trimeren an EphA2-Rezeptor-exprimierende Zellen wurde in Durchflusszytometrie-Experimenten untersucht. Anschließend wurde ihre Fähigkeit, diese Rezeptoren durch Phosphorylierung zu aktivieren, beurteilt. Die Phosphorylierung von EphA2 war durch DNA-Trimere, die drei Peptide trugen, im Vergleich zu monovalenten Peptiden signifikant erhöht. Infolge der Aktivierung kommt es zu charakteristischen morphologischen Veränderungen der Zellen, bei denen diese ihre Peripherie "abrunden" und zurückziehen. Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse beweisen umfassend die Fähigkeit von DNA-Nanostrukturen, als stabile, biokompatible, kontrollierbare Plattformen für die oligovalente Präsentation funktioneller Liganden zu fungieren. Funktionalisierte DNA-Nanostrukturen wurden zur Verstärkung biologischer Effekte und als Werkzeug für das funktionelle Screening von biologischen Interaktionen verwendet. Diese Arbeit zeigt, dass modifizierte DNA-Strukturen das Potenzial haben, die Medikamentenentwicklung zu verbessern und die Aktivierung von Signalwegen zu entschlüsseln. KW - DNA KW - multivalency KW - influenza KW - respiratory syncytial virus KW - nanostructure KW - ephrin KW - DNA KW - Ephrin KW - Influenza KW - Multivalenz KW - Nanostruktur KW - Respiratorisches Synzytial-Virus KW - DNS Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-507289 ER - TY - THES A1 - Michelchen, Sophia T1 - Etablierung einer Antigen-spezifischen Aktivierung von B-Lymphozyten in vitro N2 - Monoklonale Antikörper sind essenzielle Werkzeuge in der modernen Laboranalytik sowie in der medizinischen Therapie und Diagnostik. Die Herstellung monoklonaler Antikörper ist ein zeit- und arbeitsintensiver Prozess. Herkömmliche Methoden beruhen auf der Immunisierung von Labortieren, die mitunter mehrere Monate in Anspruch nimmt. Anschließend werden die Antikörper-produzierenden B-Lymphozyten bzw. deren Antikörpergene isoliert und in Screening-Verfahren untersucht, um geeignete Binder zu identifizieren. Der Transfer der humoralen Immunantwort in eine in vitro Umgebung erlaubt eine Verkürzung des Prozesses und umgeht die Notwendigkeit der in vivo Immunisierung. Das komplexe Zusammenspiel aller involvierten Immunzellen in vitro abzubilden, stellt sich allerdings als schwierig dar. Der Schwerpunkt dieser Arbeit war deshalb die Realisierung einer vereinfachten In vitro Immunisierung, die sich auf die Protagonisten der Antikörper-Produktion konzentriert: die B-Lymphozyten. Darüber hinaus sollte eine permanente Zelllinie etabliert werden, die zur Antikörper-Herstellung eingesetzt werden und die Verwendung von Primärzellen ersetzen würde. Im ersten Teil der Arbeit wurde ein Protokoll zur In vitro Immunisierung muriner BLymphozyten etabliert. In Vorversuchen wurden die optimalen Konditionen für die Antigenspezifische Aktivierung gereinigter Milz-B-Lymphozyten aus nicht-immunisierten Mäusen determiniert. Dazu wurde der Einfluss verschiedener Stimuli auf die Produktion unspezifischer und spezifischer Antikörper untersucht. Eine Kombination aus dem Modellantigen VP1 (Hamster Polyomavirus Hüllprotein 1), einem Anti-CD40-Antikörper, Interleukin 4 (IL 4) und Lipopolysaccharid (LPS) oder IL 7 induzierte nachweislich eine Antigen-spezifische Antikörper-Antwort in vitro. Als Indikatoren einer erfolgreichen Aktivierung der B-Lymphozyten infolge der in vitro Stimulation wurden die rapide Proliferation und die Expression charakteristischer Aktivierungsmarker auf der Zelloberfläche nachgewiesen. In einer Zeitreihe über zehn Tage wurde am zehnten Tag der In vitro Immunisierung die verhältnismäßig höchste Konzentration Antigen-spezifischer IgG-Antikörper im Kulturüberstand der stimulierten Zellen nachgewiesen. Als nächster Schritt sollte eine permanente Zelllinie hergestellt werden, die statt primärer BLymphozyten für die zuvor etablierte In vitro Immunisierung eingesetzt werden könnte. Zu diesem Zweck wurden retrovirale Vektoren hergestellt, die durch den Transfer verschiedener Onkogene in murine B-Lymphozyten bzw. deren Vorläuferzellen das Proliferationsverhalten der Zellen manipulieren sollen. Es wurden Retroviren mit Doxycyclin-induzierbaren Expressionskassetten mit den Onkogenen cmyc, Bcl2, BclxL und dem Fusionsgen NUP98HOXB4 generiert. Eine Testzelllinie wurde erfolgreich mit den hergestellten Retroviren transduziert und die Funktionalität der hergestellten Viren anhand verschiedener Assays belegt. Die transferierten Gene konnten in der Testzelllinie auf DNAEbene nachgewiesen oder die Überexpression der entsprechenden Proteine im Western Blot detektiert werden. Es wurden schließlich B-Lymphozyten bzw. unreife Vorläuferzellen derselben mit den generierten Retroviren transduziert und mit Knochenmark-ähnlichen Stromazellen co-kultiviert. Aus keinem der transduzierten Ansätze konnte bisher eine Zelllinie oder eine Langzeit-Kultur etabliert werden. Im letzten Teil der Arbeit wurde die Effektivität und Übertragbarkeit des zuvor etablierten Protokolls zur In vitro Immunisierung muriner B-Lymphozyten anhand verschiedener Antigene gezeigt. Es konnten in vitro spezifische IgG-Antworten gegen VP1, Legionella pneumophila und das Protein Mip, von dem ein Peptid in das zur Immunisierung eingesetzte VP1 integriert wurde, induziert werden. Die stimulierten B-Lymphozyten wurden durch Fusion mit Myelomzellen in permanente Antikörper-produzierende Zelllinien transformiert. Dabei konnten mehrere Hybridomzelllinien generiert werden, die spezifische IgGAntikörper gegen VP1 oder Mip produzieren. Die generierten Antikörper konnten sowohl im Western Blot als auch im ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) das entsprechende Antigen spezifisch binden. Die hier etablierte In vitro Immunisierung bietet eine effektive Alternative zu bisherigen Verfahren zur Herstellung spezifischer Antikörper. Sie ersetzt die Immunisierung von Versuchstieren und reduziert den Zeitaufwand erheblich. In Kombination mit der Hybridomtechnologie können die in vitro immunisierten Zellen, wie hier demonstriert, zur Generation von Hybridomzelllinien und zur Herstellung monoklonaler Antikörper genutzt werden. Um die Verwendung von Versuchstieren in dieser Methode durch eine adäquate permanente Zelllinie zu ersetzen, muss die genetische Veränderung von B-Lymphozyten und unreifen hämatopoetischen Zellen optimiert werden. Die Ergebnisse bieten eine Basis für eine universelle, Spezies-unabhängige Methodik zur Antikörperherstellung und für die Etablierung einer idealen, tierfreien In vitro Immunisierung. N2 - Monoclonal antibodies are essential tools in modern analytics as well as medical therapy and diagnostics. The production of such is a time consuming and labor intensive process. Common methods rely on the immunization of laboratory animals which comprises up to several months. Subsequently antibody producing B lymphocytes or their antibody coding genes are isolated and screened for suitable binders. The transfer of the humoral immune reaction into an in vitro setting allows to shorten this process and circumvents the necessity of in vivo immunization. The imitation of the complex interaction between all involved immune cells however is difficult to mimic in vitro. Consequently, the main focus of this thesis was the establishment of a simplified in vitro immunization focusing only on the protagonists of antibody production: B lymphocytes. Furthermore a permanent cell line should be generated for the implementation in antibody production and to replace the use of primary cells. In the first part of this work a protocol for the in vitro immunization of murine B lymphocytes was established. In preliminary experiments the optimal conditions for the antigen specific activation of spleen B lymphocytes isolated from non-immunized mice were determined. Therefore the influence of various stimuli on the production of unspecific and specific antibodies was investigated. A combination of the model antigen VP1 (Hamster Polyomavirus capsid protein 1), an anti-CD40 antibody, interleukin 4 (IL 4) and lipopolysaccharide (LPS) or IL 7 evidently induced an antigen specific antibody response in vitro. To proof successful B lymphocyte activation following the in vitro stimulation rapid cell proliferation and the expression of characteristic activation markers on cell surfaces were shown. Over the course of ten days of in vitro immunization the production of antigen specific IgG antibodies in the supernatant of stimulated B lymphocytes was monitored peaking on day ten. Next a permanent cell line was to be established for replacing primary B lymphocytes in the previously established in vitro immunization. For this purpose several retroviral vectors were generated to manipulate the proliferative behavior of B lymphocytes or their progenitor cells by transferring different oncogenes into those cells. Retroviruses with doxycycline inducible expression cassettes carrying the oncogenes cmyc, Bcl2, BclxL and the fusion gene NUP98HOXB4 were generated. A model cell line was successfully transduced with the generated retroviruses. The functionality of these viruses was shown in several assays. In the model cell line the transferred genes were shown to be part of their genome or the overexpression of the corresponding proteins was shown in Western Blots or fluorescent microscopy. Finally, B lymphocytes or respectively immature progenitor cells of such were transduced with the generated retroviruses and co-cultured with bone marrow-like stroma cells. Cells could be cultured for several weeks past their natural lifespan. However, none of the approaches led to the generation of a permanent cell line or the establishment of a long term culture system. In the final part of this thesis the effectivity and transferability of the previously established protocol for the in vitro immunization of murine B lymphocytes was shown by applying various antigens. Specific IgG responses were induced in vitro against VP1, Legionella pneumophila and the protein Mip, a peptide of which had been included in a VP1 carrier protein used for immunization. The stimulated B lymphocytes were fused with myeloma cells to produce permanent antibody secreting cell lines. Thereby several hybridoma cell lines were generated producing specific IgG antibodies against VP1 or Mip. The generated antibodies were purified and shown to specifically bind their antigen in ELISA and Western Blot. This protocol for in vitro immunization presented here poses an effective alternative to conventional methods for the production of specific antibodies. It replaces the immunization of laboratory animals and greatly reduces the time needed. As shown here, in combination with the hybridoma technology these in vitro immunized cells can be used for the generation of hybridoma cell lines and subsequently for the production of monoclonal antibodies. To replace the use of laboratory animals used in this method by a permanent cell line the genetic manipulation of B lymphocytes and immature hematopoietic cells needs to be optimized. The results provide a foundation for a universal, species-independent method for antibody production and for the establishment of an ideal, animal-free in vitro immunization. KW - B-Lymphozyten KW - Antikörper KW - Antibodies KW - B lymphocytes KW - in vitro immunization KW - In vitro-Immunisierung Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-530272 ER - TY - THES A1 - Egli, Lukas T1 - Stabilizing agricultural systems through diversity N2 - In the light of climate change, rising demands for agricultural products and the intensification and specialization of agricultural systems, ensuring an adequate and reliable supply of food is fundamental for food security. Maintaining diversity and redundancy has been postulated as one generic principle to increase the resilience of agricultural production and other ecosystem services. For example, if one crop fails due to climate instability and extreme events, others can compensate the losses. Crop diversity might be particularly important if different crops show asynchronous production trends. Furthermore, spatial heterogeneity has been suggested to increase stability at larger scales as production losses in some areas can be buffered by surpluses in undisturbed ones. Besides systematically investigating the mechanisms underlying stability, identifying transformative pathways that foster them is important. In my thesis, I aim at answering the following questions: (i) How does yield stability differ between nations, regions and farms, and what is the effect of crop diversity on yield stability in relation to agricultural inputs, climate heterogeneity, climate instability and time at the national, regional or farm level? (ii) Is asynchrony between crops a better predictor of production stability than crop diversity? (iii) What is the effect of asynchrony between and within crops on stability and how is it related to crop diversity and space, respectively? (iv) What is the state of the art and what are knowledge gaps in exploring resilience and its multidimensionality in ecological and social-ecological systems with agent-based models and what are potential ways forward? In the first chapter, I provide the theoretical background for the subsequent analyses. I stress the need to better understand the resilience of social-ecological systems and particularly the stability of agricultural production. Moreover, I introduce diversity and spatial heterogeneity as two prominently discussed resilience mechanisms and describe approaches to assess resilience. In the second chapter, I combined agriculture and climate data at three levels of organization and spatial extents to investigate yield stability patterns and their relation to crop diversity, fertilizer, irrigation, climate heterogeneity and instability and time of nations globally, regions in Europe and farms in Germany using statistical analyses. Yield stability decreased from the national to the farm level. Several nations and regions substantially contributed to larger-scale stability. Crop diversity was positively associated with yield stability across all three levels of organization. This effect was typically more profound at smaller scales and in variable climates. In addition to crop diversity, climate heterogeneity was an important stabilizing mechanism especially at larger scales. These results confirm the stabilizing effect of crop diversity and spatial heterogeneity, yet their importance depends on the scale and agricultural management. Building on the findings of the second chapter, I deepened in the third chapter my research on the effect of crop diversity at the national level. In particular, I tested if asynchrony between crops, i.e. between the temporal production patterns of different crops, better predicts agricultural production stability than crop diversity. The stabilizing effect of asynchrony was multiple times higher than the effect of crop diversity, i.e. asynchrony is one important property that can explain why a higher diversity supports the stability of national food production. Therefore, strategies to stabilize agricultural production through crop diversification also need to account for the asynchrony of the crops considered. The previous chapters suggest that both asynchrony between crops and spatial heterogeneity are important stabilizing mechanisms. In the fourth chapter, I therefore aimed at better understanding the relative importance of asynchrony between and within crops, i.e. between the temporal production patterns of different crops and between the temporal production patterns of different cultivation areas of the same crop. Better understanding their relative importance is important to inform agricultural management decisions, but so far this has been hardly assessed. To address this, I used crop production data to study the effect of asynchrony between and within crops on the stability of agricultural production in regions in Germany and nations in Europe. Both asynchrony between and within crops consistently stabilized agricultural production. Adding crops increased asynchrony between crops, yet this effect levelled off after eight crops in regions in Germany and after four crops in nations in Europe. Combining already ten farms within a region led to high asynchrony within crops, indicating distinct production patters, while this effect was weaker when combining multiple regions within a nation. The results suggest, that both mechanisms need to be considered in agricultural management strategies that strive for more resilient farming systems. The analyses in the foregoing chapters focused at different levels of organization, scales and factors potentially influencing agricultural stability. However, these statistical analyses are restricted by data availability and investigate correlative relationships, thus they cannot provide a mechanistic understanding of the actual processes underlying resilience. In this regard, agent-based models (ABM) are a promising tool. Besides their ability to measure different properties and to integrate multiple situations through extensive manipulation in a fully controlled system, they can capture the emergence of system resilience from individual interactions and feedbacks across different levels of organization. In the fifth chapter, I therefore reviewed the state of the art and potential knowledge gaps in exploring resilience and its multidimensionality in ecological and social-ecological systems with ABMs. Next, I derived recommendations for a more effective use of ABMs in resilience research. The review suggests that the potential of ABMs is not utilized in most models as they typically focus on a single dimension of resilience and are mostly limited to one reference state, disturbance type and scale. Moreover, only few studies explicitly test the ability of different mechanisms to support resilience. To solve real-world problems related to the resilience of complex systems, ABMs need to assess multiple stability properties for different situations and under consideration of the mechanisms that are hypothesized to render a system resilient. In the sixth chapter, I discuss the major conclusions that can be drawn from the previous chapters. Moreover, I showcase the use of simulation models to identify management strategies to enhance asynchrony and thus stability, and the potential of ABMs to identify pathways to implement such strategies. The results of my thesis confirm the stabilizing effect of crop diversity, yet its importance depends on the scale, agricultural management and climate. Moreover, strategies to stabilize agricultural production through crop diversification also need to account for the asynchrony of the crops considered. As spatial heterogeneity and particularly asynchrony within crops strongly enhances stability, integrated management approaches are needed that simultaneously address multiple resilience mechanisms at different levels of organization, scales and time horizons. For example, the simulation suggests that only increasing the number of crops at both the pixel and landscape level avoids trade-offs between asynchrony between and within crops. If their potential is better exploited, agent-based models have the capacity to systematically assess resilience and to identify comprehensive pathways towards resilient farming systems. N2 - In Anbetracht des Klimawandels, steigender Nachfrage nach landwirtschaftlichen Produkten und der weitgehenden Intensivierung und Spezialisierung landwirtschaftlicher Systeme ist eine ausreichende und zuverlässige Nahrungsmittelproduktion zentral für die Ernährungssicherheit. Eine hohe Nutzpflanzenvielfalt und räumliche Heterogenität können helfen, die Resilienz bzw. Widerstandsfähigkeit der landwirtschaftlichen Produktion zu stärken. Fällt zum Beispiel die Ernte einer Nutzpflanze aufgrund einer Dürre aus, können andere die Verluste ausgleichen. Außerdem können Produktionsverluste in einigen Gebieten durch Überschüsse in anderen Gebieten kompensiert werden. In meiner Arbeit habe ich mittels umfassender Landwirtschafts- und Klimadaten und statistischer Analysen untersucht, wie sich insbesondere Nutzpflanzenvielfalt und Klimaheterogenität auf zeitliche Ertragsstabilität auswirken. Zudem habe ich evaluiert, ob asynchrone Produktionstrends unterschiedlicher Nutzpflanzen den stabilisierenden Effekt einer hohen Nutpflanzenvielfalt erklären können. Außerdem habe ich den Effekt asynchroner Produktionstrends unterschiedlicher Nutzpflanzen und von unterschiedlichen Anbaugebieten derselben Nutzpflanze in Bezug auf Produktionsstabilität verglichen und mit einer Computersimulation eruiert, wie diese Mechanismen durch Diversifizierung verändert werden. Zum Schluss habe ich untersucht, wie umfassend die Resilienz ökologischer und sozioökologischer Systeme mittels agentenbasierter Modelle bislang erforscht wurde. Die Untersuchungen dieser Arbeit zeigen, dass Nutzpflanzenvielfalt die landwirtschaftliche Produktion auf sämtlichen untersuchten Organisationsebenen stabilisiert. Asynchrone Produktionstrends unterschiedlicher Nutzpflanzen können erklären, warum eine höhere Diversität die Produktion stabilisiert. Daneben sind asynchrone Produktionstrends unterschiedlicher Anbaugebiete besonders wichtig. Meine Simulation zeigt, dass nur eine Diversifizierung auf Feld- und Landschaftsebene asynchrone Produktionsmuster zwischen Nutpflanzen und Anbaugebieten gleichzeitig erhöht oder zumindest keine der beiden Mechanismen verringert. Agentenbasierte Modelle bieten die Möglichkeit, Resilienz systematisch zu untersuchen und Wege aufzuzeigen, die zu resilienteren Anbausystemen führen. Meine Ergebnisse unterstreichen die Notwendigkeit umfassenderer Ansätze um eine resiliente, produktive und nachhaltige landwirtschaftliche Produktion in Zeiten globaler Veränderungsprozesse zu erreichen. Dies beinhaltet insbesondere eine Diversifizierung der Nutzpflanzen auf unterschiedlichen Ebenen unter Berücksichtigung der zeitlichen Produktionstrends sowie eine nachhaltige Nutzung landwirtschaftlicher Betriebsmittel. T2 - Stabilisierung landwirtschaftlicher Systeme durch Diversität KW - Agent-based models KW - Agroecology KW - Resilience KW - Social-ecological systems KW - Sustainability KW - Agentenbasierte Modelle KW - Agrarökologie KW - Resilienz KW - Sozialökologische Systeme KW - Nachhaltigkeit Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-496848 ER - TY - THES A1 - Stark, Markus T1 - Implications of local and regional processes on the stability of metacommunities in diverse ecosystems T1 - Auswirkungen lokaler und regionaler Prozesse auf die Stabilität von Metagemeinschaften in diversen Ökosystemen N2 - Anthropogenic activities such as continuous landscape changes threaten biodiversity at both local and regional scales. Metacommunity models attempt to combine these two scales and continuously contribute to a better mechanistic understanding of how spatial processes and constraints, such as fragmentation, affect biodiversity. There is a strong consensus that such structural changes of the landscape tend to negatively effect the stability of metacommunities. However, in particular the interplay of complex trophic communities and landscape structure is not yet fully understood. In this present dissertation, a metacommunity approach is used based on a dynamic and spatially explicit model that integrates population dynamics at the local scale and dispersal dynamics at the regional scale. This approach allows the assessment of complex spatial landscape components such as habitat clustering on complex species communities, as well as the analysis of population dynamics of a single species. In addition to the impact of a fixed landscape structure, periodic environmental disturbances are also considered, where a periodical change of habitat availability, temporally alters landscape structure, such as the seasonal drying of a water body. On the local scale, the model results suggest that large-bodied animal species, such as predator species at high trophic positions, are more prone to extinction in a state of large patch isolation than smaller species at lower trophic levels. Increased metabolic losses for species with a lower body mass lead to increased energy limitation for species on higher trophic levels and serves as an explanation for a predominant loss of these species. This effect is particularly pronounced for food webs, where species are more sensitive to increased metabolic losses through dispersal and a change in landscape structure. In addition to the impact of species composition in a food web for diversity, the strength of local foraging interactions likewise affect the synchronization of population dynamics. A reduced predation pressure leads to more asynchronous population dynamics, beneficial for the stability of population dynamics as it reduces the risk of correlated extinction events among habitats. On the regional scale, two landscape aspects, which are the mean patch isolation and the formation of local clusters of two patches, promote an increase in $\beta$-diversity. Yet, the individual composition and robustness of the local species community equally explain a large proportion of the observed diversity patterns. A combination of periodic environmental disturbance and patch isolation has a particular impact on population dynamics of a species. While the periodic disturbance has a synchronizing effect, it can even superimpose emerging asynchronous dynamics in a state of large patch isolation and unifies trends in synchronization between different species communities. In summary, the findings underline a large local impact of species composition and interactions on local diversity patterns of a metacommunity. In comparison, landscape structures such as fragmentation have a negligible effect on local diversity patterns, but increase their impact for regional diversity patterns. In contrast, at the level of population dynamics, regional characteristics such as periodic environmental disturbance and patch isolation have a particularly strong impact and contribute substantially to the understanding of the stability of population dynamics in a metacommunity. These studies demonstrate once again the complexity of our ecosystems and the need for further analysis for a better understanding of our surrounding environment and more targeted conservation of biodiversity. N2 - Seit geraumer Zeit prägt der Mensch seine Umwelt und greift in die Struktur von Landschaften ein. In den letzten Jahrzehnten wurde die Landschaftsnutzung intensiviert und Ökosyteme weltweit anthropogen überprägt. Solche Veränderungen der Landschaft sind mit Verantwortlich für den derzeit rapiden Verlust an Biodiversität auf lokaler wie regionaler Ebene. Metagemeinschafts-Modelle versuchen diese beiden Ebenen zu kombinieren und kontinuierlich zu einem besseren mechanistischen Verständnis beizutragen, wie räumliche Prozesse, so z. B. Fragmentierung von Biotopen, die Biodiversität beeinflussen. Es besteht dabei ein großer Konsens, dass sich solche Änderungen der Landschaft tendenziell negativ auf die Stabilität von Metagemeinschaften auswirken. Jedoch ist insbesondere das Zusammenspiel von komplexen trophischen Gemeinschaften und räumlichen Prozessen längst nicht vollständig verstanden. In der vorliegenden Arbeit wird ein Metagemeinschafts-Modellansatz verwendet, der auf einem dynamischen und räumlich expliziten Modell basiert, das Populationsdynamiken auf der lokalen Ebene und Migrationsdynamiken auf der regionalen Ebene integriert. Dieser Ansatz erlaubt die Bewertung komplexer räumlicher Landschaftskomponenten wie z. B. die Auswirkung von Habitatsclustern auf Populationsdynamiken einzelner Arten bis hin zur Diversität komplexer Artengemeinschaften. Zusätzlich zum Einfluss von einzelner konstanter räumlicher Strukturen werden auch periodische Umweltstörungen berücksichtigt, bei der ein Wechsel der Habitatverfügbarkeit, die räumliche Struktur der Landschaft temporär verändert, wie z. B. die Austrocknung eines Gewässers. Auf der lokalen Ebene deuten die Modellergebnisse darauf hin, dass Tierarten mit einer großen Körpermasse, wie z. B. Raubtierarten in höheren trophischen Positionen, in einem Zustand großer Habitat-Isolation stärker vom Aussterben bedroht sind, als Arten mit geringer Körpermasse auf unteren trophischen Ebenen. Arten mit einer geringerer Körpermasse haben einen erhöhten metabolischen Verlust, der zu einer Energielimitierung auf den höheren trophischen Ebenen führt. Dies kann eine Erklärung dafür sein, dass Arten mit großer Körpermasse ein höheres Aussterberisiko in den Modellergebnissen aufweisen. Dieser Effekt ist vor allem in Nahrungsnetzen ausgeprägt, bei denen Arten empfindlicher auf metabolische Verluste durch Migration und eine Veränderung der Habitat Struktur reagieren. Neben der Bedeutung der Zusammensetzung der Arten eines Nahrungsnetzes für die Diversität, haben lokale Fraßinteraktionen ebenfalls Auswirkungen auf die Synchronisierung von Populationsdynamiken. Ein geringerer Fraßdruck führt zu mehr asynchronen Populationsdynamiken, die diese Dynamiken einer Metapopulation stabilisiert, sodass das Risiko von Aussterbeereignissen einzelner Arten sinkt. Auf der regionalen Ebene führen als landschaftliche Aspekte, neben der mittleren Habitat-Isolation, ebenso die Bildung von lokalen Clustern aus zwei Habitaten zu einer Zunahme der Beta-Diversität. Jedoch erklären die individuelle Zusammensetzung und Robustheit der lokalen Arten- gemeinschaft gleichermaßen einen großen Anteil der zu beobachteten Diversitätsmuster. Eine Kombination aus periodischen Umweltstörungen und Habitat-Isolation hat insbesondere einen Einfluss auf die Populationsdynamiken einzelner Arten. Populationsdynamiken können durch periodische Umweltstörungen synchronisiert werden, und dabei die sonst auftauchende asynchronen Populationsdynamiken bei einer größeren Habitat-Isolation überlagern. Die dadurch vereinheitlichen Trends in der Synchronisierung erhöhen das Risiko korrelierter Aussterbeereignisse einer Art. Zusammenfassend lassen sich zwei große Einflussfaktoren auf die lokalen Diversitätsmuster der Metagemeinschaften feststellen. Zum Einen die lokale Artenzusammensetzung und zum Anderen die Interaktionen der Arten. Im Vergleich dazu, haben räumliche Komponenten wie die Fragmentierung der Landschaft einen vernachlässigbaren Einfluss auf die lokalen Diversitätsmuster und gewinnen erst für regionale Diversitätsmuster an Gewicht. Im Gegensatz dazu spielen auf der Ebene der Populationsdynamik besonders regionale Eigenschaften, wie die periodische Umweltstörung und Habitat-Isolation, eine Rolle und tragen wesentlich zum Verständnis der Stabilität von Populationsdynamiken der Metagemeinschaft bei. Diese Untersuchungen zeigen einmal mehr die Komplexität unserer Ökosysteme und die Notwendigkeit weiterer Analysen für ein besseres Verständnis unserer umgebenen Umwelt und gezielteren Schutz der Biodiversität. KW - Fragmentation KW - Ecology KW - Food Web KW - Metacommunity KW - Disturbance KW - Störungen KW - Ökologie KW - Nahrungsnetze KW - Fragmentierung KW - Metagemeinschaften Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-526399 ER - TY - THES A1 - Moreno Curtidor, Catalina T1 - Elucidating the molecular basis of enhanced growth in the Arabidopsis thaliana accession Bur-0 N2 - The life cycle of flowering plants is a dynamic process that involves successful passing through several developmental phases and tremendous progress has been made to reveal cellular and molecular regulatory mechanisms underlying these phases, morphogenesis, and growth. Although several key regulators of plant growth or developmental phase transitions have been identified in Arabidopsis, little is known about factors that become active during embryogenesis, seed development and also during further postembryonic growth. Much less is known about accession-specific factors that determine plant architecture and organ size. Bur-0 has been reported as a natural Arabidopsis thaliana accession with exceptionally big seeds and a large rosette; its phenotype makes it an interesting candidate to study growth and developmental aspects in plants, however, the molecular basis underlying this big phenotype remains to be elucidated. Thus, the general aim of this PhD project was to investigate and unravel the molecular mechanisms underlying the big phenotype in Bur-0. Several natural Arabidopsis accessions and late flowering mutant lines were analysed in this study, including Bur-0. Phenotypes were characterized by determining rosette size, seed size, flowering time, SAM size and growth in different photoperiods, during embryonic and postembryonic development. Our results demonstrate that Bur-0 stands out as an interesting accession with simultaneously larger rosettes, larger SAM, later flowering phenotype and larger seeds, but also larger embryos. Interestingly, inter-accession crosses (F1) resulted in bigger seeds than the parental self-crossed accessions, particularly when Bur-0 was used as the female parental genotype, suggesting parental effects on seed size that might be maternally controlled. Furthermore, developmental stage-based comparisons revealed that the large embryo size of Bur-0 is achieved during late embryogenesis and the large rosette size is achieved during late postembryonic growth. Interestingly, developmental phase progression analyses revealed that from germination onwards, the length of developmental phases during postembryonic growth is delayed in Bur-0, suggesting that in general, the mechanisms that regulate developmental phase progression are shared across developmental phases. On the other hand, a detailed physiological characterization in different tissues at different developmental stages revealed accession-specific physiological and metabolic traits that underlie accession-specific phenotypes and in particular, more carbon resources during embryonic and postembryonic development were found in Bur-0, suggesting an important role of carbohydrates in determination of the bigger Bur-0 phenotype. Additionally, differences in the cellular organization, nuclei DNA content, as well as ploidy level were analyzed in different tissues/cell types and we found that the large organ size in Bur-0 can be mainly attributed to its larger cells and also to higher cell proliferation in the SAM, but not to a different ploidy level. Furthermore, RNA-seq analysis of embryos at torpedo and mature stage, as well as SAMs at vegetative and floral transition stage from Bur-0 and Col-0 was conducted to identify accession-specific genetic determinants of plant phenotypes, shared across tissues and developmental stages during embryonic and postembryonic growth. Potential candidate genes were identified and further validation of transcriptome data by expression analyses of candidate genes as well as known key regulators of organ size and growth during embryonic and postembryonic development confirmed that the high confidence transcriptome datasets generated in this study are reliable for elucidation of molecular mechanisms regulating plant growth and accession-specific phenotypes in Arabidopsis. Taken together, this PhD project contributes to the plant development research field providing a detailed analysis of mechanisms underlying plant growth and development at different levels of biological organization, focusing on Arabidopsis accessions with remarkable phenotypical differences. For this, the natural accession Bur-0 was an ideal outlier candidate and different mechanisms at organ and tissue level, cell level, metabolism, transcript and gene expression level were identified, providing a better understanding of different factors involved in plant growth regulation and mechanisms underlying different growth patterns in nature. N2 - Der Lebenszyklus blühender Pflanzen ist ein dynamischer Prozess, der das erfolgreiche Durchlaufen mehrerer Entwicklungsphasen impliziert. Es wurden enorme Fortschritte gemacht, um zelluläre und molekulare Regulationsmechanismen zu entschlüsseln, die diesen Phasen, der Morphogenese und dem Wachstum zu Grunde liegen. Obwohl mehrere Schlüsselregulatoren des Pflanzenwachstums oder der Entwicklungsphasenübergänge in Arabidopsis identifiziert wurden, ist nur wenig über Faktoren bekannt, die sowohl während der Embryogenese als auch während der Samenentwicklung und dem weiteren Wachstum aktiv werden. Noch viel weniger ist über akzessionspezifische Faktoren bekannt, die die Pflanzenarchitektur und Organgröße bestimmen. Bur-0 wurde als eine natürliche Arabidopsis-Akzession mit außergewöhnlich großen Samen und großer Blattrosette beschrieben. Ihr Phänotyp macht sie zu einem interessanten Kandidaten für die Untersuchung von Wachstums- und Entwicklungsaspekten in Pflanzen, jedoch muss die molekulare Basis, die diesem großen Phänotyp unterliegt, noch entschlüsselt werden. Daher war das allgemeine Ziel dieser Doktorarbeit, die molekularen Mechanismen, die dem großen Phänotyp in Bur-0 zu Grunde liegen, zu entschlüsseln und zu verstehen. Mehrere natürliche Arabidopsis-Akzessionen und spät blühende Mutantenlinien wurden in dieser Studie analysiert, so auch Bur-0. Die Phänotypen wurden durch eine detaillierte Analyse der Rosettengröße, der Samengröße, der Blütezeit, der Sprossapikalmeristemgröße und des Wachstums in verschiedenen Photoperioden, während der embryonalen und postembryonalen Entwicklung charakterisiert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Bur-0 als interessanter Akzession mit gleichzeitig größeren Blattrosetten, größerem Sprossapikalmeristem (SAM), späterem Blühphänotyp und größeren Samen, aber auch größeren Embryonen auffällt. Interessanterweise führten Kreuzungen zwischen den Akzessionen (F1) zu größeren Samen als die elterlichen selbstgekreuzten Akzessionen, insbesondere wenn Bur-0 als weiblicher elterlicher Genotyp verwendet wurde, was auf elterliche Effekte auf die Samengröße hindeutet, die möglicherweise mütterlicherseits kontrolliert werden. Darüber hinaus ergaben Vergleiche auf Basis von Entwicklungsstadien, dass die große Embryogröße von Bur-0 während der späten Embryogenese erreicht wird und die große Blattrosette während des späten postembryonalen Wachstums. Interessanterweise ergaben Analysen der Entwicklungsphasenprogression, dass ab der Keimung die Länge der Entwicklungsphasen während des postembryonalen Wachstums bei Bur-0 verzögert ist, was darauf hindeutet, dass im Allgemeinen die Mechanismen, die die Entwicklungsphasenprogression regulieren, über die Entwicklungsphasen hinweg geteilt werden. Andererseits ergab eine detaillierte physiologische Charakterisierung in verschiedenen Geweben in unterschiedlichen Entwicklungsstadien akzession-spezifische physiologische und metabolische Merkmale, die den akzession-spezifischen Phänotypen zu Grunde liegen. Insbesondere wurden mehr Kohlenstoff-Ressourcen, während der embryonalen und postembryonalen Entwicklung in Bur-0 gefunden, was auf eine wichtige Rolle von Kohlenhydraten bei der Bestimmung des größeren Bur-0-Phänotyps hindeutet. Zusätzlich wurden Unterschiede in der zellulären Organisation, dem DNA-Gehalt der Nuklei sowie dem Ploidiegrad in verschiedenen Geweben/Zelltypen analysiert und wir fanden heraus, dass die größere Organgröße in Bur-0 hauptsächlich auf die größeren Zellen und auch auf eine höhere Zellproliferation im SAM zurückzuführen ist, aber nicht auf einen anderen Ploidiegrad. Darüber hinaus wurden RNA-seq-Analysen von Embryonen im Torpedo- und Reifestadium sowie SAMs im vegetativen und Florenübergangsstadium von Bur-0 und Col-0 durchgeführt, um akzession-spezifische genetische Faktoren für Pflanzenphänotypen zu identifizieren, die in allen Geweben und Entwicklungsstadien während des embryonalen und postembryonalen Wachstums auftreten. Potenzielle Kandidatengene wurden identifiziert und eine weitere Validierung der Transkriptomdaten durch Expressionsanalysen neuartiger Kandidatengene sowie bekannter Schlüsselregulatoren für Organgröße und -wachstum während der embryonalen und postembryonalen Entwicklung bestätigte, dass die in dieser Studie generierten Transkriptomdatensätze mit hoher Zuverlässigkeit für die Aufklärung molekularer Mechanismen zur Regulierung des Pflanzenwachstums und akzessionspezifischer Phänotypen in Arabidopsis geeignet sind. Insgesamt trägt diese Doktorarbeit zur Forschung im Bereich der Pflanzenentwicklung bei, indem sie eine detaillierte Analyse der Mechanismen liefert, die dem Wachstum und der Entwicklung auf verschiedenen Ebenen der biologischen Organisation zu Grunde liegen, wobei der Schwerpunkt auf Arabidopsis-Akzessionen mit bemerkenswerten phänotypischen Unterschieden liegt. Dafür war die natürliche Akzession Bur-0 ein idealer Ausreißerkandidat und es wurden verschiedene Mechanismen auf Organ- und Gewebeebene, Zellebene, Stoffwechsel, Transkript- und Genexpressionsniveau identifiziert, was ein besseres Verständnis der verschiedenen Faktoren, die an der Regulierung des Pflanzenwachstums beteiligt sind, und der Mechanismen, die den verschiedenen Wachstumsmustern in der Natur zu Grunde liegen, ermöglicht. KW - Plant development KW - Plant growth KW - Arabidopsis thaliana KW - Phenotype KW - Transcriptome KW - Pflanzenentwicklung KW - Pflanzenwachstum KW - Arabidopsis thaliana KW - Phänotyp KW - Transkriptom Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-526814 ER - TY - THES A1 - Bartholomäus, Lisa T1 - Impact of growth-related genes on petal size in Arabidopsis thaliana and the formation of two distinct floral morphs in Amsinckia spectabilis T1 - Einfluss von wachstumsbedingten Genen auf die Petalengröße von Arabidopsis thaliana und die Bildung von zwei unterschiedlichen Blütenmorphologien von Amsinckia spectabilis N2 - Der Lebenszyklus von Pflanzen ist geprägt von sich wiederholenden Wachstums- und Entwicklungsphasen, die auf wiederkehrenden Abläufen, bestehend aus Zellteilung, Zellvergrößerung und Zelldifferenzierung, basieren. Diese Dissertation ist aus zwei Projekten aufgebaut, die sich beide mit unterschiedlichen Blickwinkeln des Zellwachstums beschäftigen. Im ersten steht die Charakterisierung einer Arabidopsis thaliana Mutante, die eine generelle Zellvergrößerung aufweist, im Vordergrund. Das zweite fokussiert sich auf zwei natürlich vorkommende Blütenmorphologien in Amsinckia spectabilis (Boraginaceae), die sich, aufgrund von Zelllängenunterschieden, in Griffellänge und Höhe der Staubblattposition unterscheiden. Es wurde gezeigt, dass die EMS-Mutante eop1 durch größere Zellen 26% größere Blütenblätter aufweist. Außerdem wurden weitere Phänotypen beschrieben, wie zum Beispiel, vergrößerte Kotyledonen, (ebenfalls aufgrund von Zellvergrößerung), Fruchtblätter, Kelchblätter, Rosettenblätter und Pollen. Die Gesamtwuchshöhe der Mutante zeigte sich ebenfalls erhöht und zusätzliche Trichomäste erklärten den haarigen Phänotyp. Feinkartierung enthüllte eine C zu T Transition des letzten Nukleotids des Introns 7 des INCURVATA 11 (ICU11) Gens, einer 2-oxoglutarat/Fe(II)-abhängigen Dioxygenase, als ursächlichen SNP, welcher missgespleißte mRNA verursacht. Zwei T-DNA Insertionslinien (icu11-2 & icu11-4), ebenfalls mit vergrößerten Blütenblättern, bestätigten ICU11 als kausales Gen, und erlaubten somit die Analyse von drei verschiedenen icu11 Allelen. Ein Vergleich der verursachten molekularen Veränderung durch die jeweiligen Mutationen ermittelte Unterschiede in den drei Mutanten, wie zum Beispiel Überexpression von ICU11, als auch die Modifikation von ICU11 mRNA. Zusammen bildete das die Grundlage für die Untersuchung des molekularen Mechanismus, der für den beobachteten Phänotyp verantwortlich ist. Verschiedene Ansätze ermittelten widersprüchliche Ergebnisse hinsichtlich der Proteinfunktion von ICU11 in den drei Mutanten. So zeigte eine Komplementierungsanalyse, dass alle drei Mutationen austauschbar sind, was, zusammen mit der Beobachtung, dass eine ICU11 Überexpression im Wildtyp zu einem icu11-ähnlichen Phänotyp zeigte, dazu führte, dass die icu11 Mutanten als gain-of-function Mutationen eingeordnet wurden. Im Widerspruch dazu stand die Entdeckung, dass sich icu11-4 durch ein genomisches ICU11 Transgen retten ließ. So wurde ein Model, basierend auf der Annahme, dass eine ICU11 Überexpression die Proteinfunktion ebenso hemmt wie ein nichtfunktionales Protein, vorgeschlagen. Außerdem wurde eine erhöhte Resistenz der icu11-3 (eop1) gegenüber Paclobutrazol, einem Gibberellin (GA)-Inhibitor, und die Aktivierung der Expression von AtGA20ox2, einem Haupt-GA-Biosynthese-Gen, festgestellt. Zusätzlich wurde eine zytoplasmatische Lokalisation von ICU11 detektiert, sodass ein Einfluss von ICU11 auf die GA- Biosynthese und somit auf das Gesamt-GA-Level angenommen wird, der den beobachteten (GA-überdosierten) Phänotyp erklären könnte. Das zweite Projekt strebte die Identifizierung der genetischen Grundlage des S-Locus in Amsinckia spectabilis an, da die Gattung Amsinckia einige untypische Charakteristiken für eine heterostyle Art, wie zum Beispiel das Fehlen einer offensichtlichen Selbstinkompatibilität (SI), sowie die mehrmalige Entwicklung zu Homostyly und 100% autonomem Selbsten, aufweist. Die Analyse basierte auf drei Amsinckia spectabilis Varianten: einer heterostylen Form, bestehend aus zwei Blütenmorphologien mit gegensätzlich positionierten Sexualorganen (S-Morph: hohe Staubblattposition und kurzer Griffel und L-Morph: niedrige Staubblattansätze und langer Griffel), und zwei homostylen Formen, einer großblütigen teilweise selbstenden und einer kleinblütigen voll selbstenden. Natürliche Populationen weisen ungefähr ein 1:1 S:L Morph-Verhältnis auf, welches sich durch vorherrschend disassortative Paarung beider Morphs erklären lasst. Dadurch kann das dominante S-Allel ausschließlich heterozygot auftreten (heterozygot (Ss) im S-morph und homozygot rezessiv (ss) im L-morph). Die Suche nach Morph-spezifischen Phänotypen offenbarte 56% längere L-Morph Griffel und 58% höhere S-Morph Staubblattansätze. Zusätzlich wurden 21% größere S-Morph Pollen, sowie das Fehlen einer offensichtlichen SI gefunden. Dies war die Grundlage für die Annahme, dass der Amsinckia spec. S-Locus mindestens aus G- (Griffel), A- (Staubblatt) und P- (Pollen) Locus besteht. Vergleichende Transkriptom-Analyse beider Morphs offenbarte 22 unterschiedlich exprimierte Marker, die in 2 Contigs der PacBio Genom-Assemblierung eines SS-Individuums lokalisiert werden konnten. Dies erlaubte die genetische Einengung des S-Locus auf einen Bereich von circa 23 Mb. Gegensätzlich zu bisher aufgeklärten S-Loci in anderen Pflanzenarten konnte kein Hinweis auf eine hemizygote Region gefunden werden, die die supprimierte Rekombination am S-Locus erklären könnte, sodass eine Inversion als Ursache dieser vermutet wurde. N2 - The life cycle of higher plants is based on recurring phases of growth and development based on repetitive sequences of cell division, cell expansion and cell differentiation. This dissertation deals with two projects, each of them investigating two different topics that are related to cell expansion. The first project is examining an Arabidopsis thaliana mutant exhibiting overall cell enlargement and the second project is analysing two naturally occurring floral morphs of Amsinckia spectabilis (Boraginaceae) differing (amongst others) in style length and anther heights due to differences in longitudinal cell elongation. The EMS-mutant eop1 was shown to exhibit a petal size increase of 26% caused by cell enlargement. Further phenotypes were detected, such as cotyledon size increase (based on larger cells) as well as increased carpel, sepal, leaf and pollen sizes. Plant height was shown to be increased and more highly branched trichomes explained the hairy eop1 phenotype. Fine mapping revealed the causal SNP to be a C to T transition at the last nucleotide of intron 7 of the INCURVATA11 (ICU11) gene, a 2-oxoglutarate /Fe(II)-dependant dioxygenase, and thus causing missplicing of the mRNA. Two T-DNA insertion lines (icu11-2 & icu11-4) confirmed ICU11 as causal gene by exhibiting increased petal size. A comparison of three icu11 alleles, which possessed different mutation-related changes, either overexpressing ICU11 or modified mRNAs, was the base for investigating the molecular mechanism that underlies the observed phenotype. Different approaches revealed contradictory results regarding ICU11 protein functionality in the icu11 mutants. A complementation assay proved the three mutants to be exchangeable and ICU11 overexpression in the wild-type led to an icu11-like phenotype, arguing for all three icu11 mutants to be GOF mutants. Contradicting this conclusion, the icu11-4 line could be rescued by a genomic ICU11 transgene. A model, based on the assumption that an overexpression of ICU11 is inhibiting the function of the protein, and thus causing the same effect as a LOF protein was proposed. Further, icu11-3 (eop1) mutants were shown to have an increased resistance towards paclobutrazol, a gibberellin (GA) inhibitor and an upregulation of AtGA20ox2, a main GA biosynthesis gene. Additionally, ICU11 subcellular localization was discovered to be cytoplasmic, supporting the assumption, that ICU11 affects GA biosynthesis and overall GA level, possibly explaining the observed (GA-overdose) phenotype. The second project aimed to identify the genetic base of the S-locus in Amsinckia spectabilis, as the Amsinckia genus represents untypical characteristics for a heterostylous species, such as no obvious self-incompatibility (SI) and the repeated transition towards homostylous and fully selfing variants. The work was based on three Amsinckia spectabilis forms: a heterostylous form, consisting of two floral morphs with reciprocal positioning of sexual organs (S-morph: high anthers and a short style and L-morph: low anthers and a long style), and two homostylous forms, one large-flowered and partially selfing and the other small-flowered and fully selfing. The maintenance of the two floral morphs is genetically based on the S-locus region, containing genes that encode for the morph-specific traits, which are marked by a tight linkage due to suppressed recombination. Natural populations are found to possess a 1:1 S:L morph ratio, that can be explained by predominant disassortative mating of the two morphs, causing the occurrence of the dominant S-allele only in the heterozygous state (heterozygous (Ss) for the S-morph and homozygous recessive (ss) for the L-morph). Investigation of morph-specific phenotypes detected 56% elongated L-morph styles and 58% higher positioned S-morph anthers. Approximately 50% of the observed size differences were explained by an increase in cell elongation. Moreover, additional phenotypes were found, such as 21% enlarged S-morph pollen and no obvious SI, confirmed by hand pollinated seed counts, in vivo pollen tube growth and the development of homozygous dominant SS individuals via selfing. The Amsinckia spec. S-locus was assumed to at least consist of the G- (style length), the A- (anther height) and the P- (pollen size) locus. Comparative Transcriptomics of the two morphs revealed 22 differentially expressed markers that were found to be located within two contigs of a SS individual PacBio genome assembly, allowing the localization of the S-locus to be delimited to a region of approximately 23 Mb. Contradictory to revealed S-loci within the plant kingdom, no strong argument for a present hemizygous region was found to be causal for the suppressed recombination of the S-locus, so that an inversion was assumed to be the causal mechanism. KW - INCURVATA11 KW - Amsinckia KW - Arabidopsis thaliana cell size S-morph KW - L-morph KW - style KW - anthers KW - 2-oxoglutarate /FeII-dependant dioxygenases KW - cell size KW - S-morph KW - Zellgröße KW - S-morph KW - L-morph KW - Fruchtknoten KW - Staubblätter KW - 2-oxoglutarat / FeII- abhängige Dioxygenases Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-519861 ER - TY - THES A1 - Raatz, Larissa T1 - Boon and bane T1 - Segen und Fluch BT - how semi-natural habitats shape biodiversity-driven ecosystem (dis)services in agricultural landscapes BT - wie naturnahe Habitate biodiversitätsbedingte Ökosystemdienstleistungen in Agrarlandschaften beeinflussen N2 - Semi-natural habitats (SNHs) in agricultural landscapes represent important refugia for biodiversity including organisms providing ecosystem services. Their spill-over into agricultural fields may lead to the provision of regulating ecosystem services such as biological pest control ultimately affecting agricultural yield. Still, it remains largely unexplored, how different habitat types and their distributions in the surrounding landscape shape this provision of ecosystem services within arable fields. Hence, in this thesis I investigated the effect of SNHs on biodiversity-driven ecosystem services and disservices affecting wheat production with an emphasis on the role and interplay of habitat type, distance to the habitat and landscape complexity. I established transects from the field border into the wheat field, starting either from a field-to-field border, a hedgerow, or a kettle hole, and assessed beneficial and detrimental organisms and their ecosystem functions as well as wheat yield at several in-field distances. Using this study design, I conducted three studies where I aimed to relate the impacts of SNHs at the field and at the landscape scale on ecosystem service providers to crop production. In the first study, I observed yield losses close to SNHs for all transect types. Woody habitats, such as hedgerows, reduced yields stronger than kettle holes, most likely due to shading from the tall vegetation structure. In order to find the biotic drivers of these yield losses close to SNHs, I measured pest infestation by selected wheat pests as potential ecosystem disservices to crop production in the second study. Besides relating their damage rates to wheat yield of experimental plots, I studied the effect of SNHs on these pest rates at the field and at the landscape scale. Only weed cover could be associated to yield losses, having their strongest impact on wheat yield close to the SNH. While fungal seed infection rates did not respond to SNHs, fungal leaf infection and herbivory rates of cereal leaf beetle larvae were positively influenced by kettle holes. The latter even increased at kettle holes with increasing landscape complexity suggesting a release of natural enemies at isolated habitats within the field interior. In the third study, I found that also ecosystem service providers benefit from the presence of kettle holes. The distance to a SNH decreased species richness of ecosystem service providers, whereby the spatial range depended on species mobility, i.e. arable weeds diminished rapidly while carabids were less affected by the distance to a SNH. Contrarily, weed seed predation increased with distance suggesting that a higher food availability at field borders might have diluted the predation on experimental seeds. Intriguingly, responses to landscape complexity were rather mixed: While weed species richness was generally elevated with increasing landscape complexity, carabids followed a hump-shaped curve with highest species numbers and activity-density in simple landscapes. The latter might give a hint that carabids profit from a minimum endowment of SNHs, while a further increase impedes their mobility. Weed seed predation was affected differently by landscape complexity depending on weed species displayed. However, in habitat-rich landscapes seed predation of the different weed species converged to similar rates, emphasising that landscape complexity can stabilize the provision of ecosystem services. Lastly, I could relate a higher weed seed predation to an increase in wheat yield even though seed predation did not diminish weed cover. The exact mechanisms of the provision of weed control to crop production remain to be investigated in future studies. In conclusion, I found habitat-specific responses of ecosystem (dis)service providers and their functions emphasizing the need to evaluate the effect of different habitat types on the provision of ecosystem services not only at the field scale, but also at the landscape scale. My findings confirm that besides identifying species richness of ecosystem (dis)service providers the assessment of their functions is indispensable to relate the actual delivery of ecosystem (dis)services to crop production. N2 - Naturnahe Habitate, wie zum Beispiel Hecken und Sölle, stellen wichtige Refugien für die Biodiversität in Agrarlandschaften dar, weil aus diesen Habitaten Organismen in die Agrarflächen einwandern und dort regulierende Ökosystemdienstleistungen, wie zum Beispiel biologische Schädlingsbekämpfung, erbringen können. Weitgehend unerforscht ist bisher, in welcher Art und Weise die verschiedenen Habitattypen und ihre Verteilung in der umgebenden Landschaft die Bereitstellung dieser Ökosystemdienstleistungen, die letztlich auch einen Einfluss auf die landwirtschaftlichen Erträge haben können, beeinflussen. Daher habe ich den Einfluss von naturnahen Habitattypen auf biodiversitätsbedingte Ökosystemdienstleistungen und ihre Auswirkung auf die Weizenproduktion untersucht. Der Schwerpunkt meiner Arbeit lag auf dem Einfluss und dem Zusammenspiel von Habitattyp, Entfernung zum naturnahen Habitat und der umgebenden Landschaftsvielfalt. Auf intensiv bewirtschafteten Weizenfeldern habe ich entlang von Transekten von der Feldgrenze in das Feld hinein Nützlinge und Schädlinge, Ökosystemfunktionen sowie den Weizenertrag ermittelt. In der ersten Studie habe ich am Feldrand für alle Habitattypen einen Ertragsverlust im Vergleich zur Feldmitte beobachtet, wobei Hecken die stärkste Ertragsreduktion aufwiesen. Dieses Resultat führe ich auf die Beschattung durch die hohe Vegetationsstruktur zurück. Um Ertragsverluste besser zu verstehen, habe ich in der zweiten Studie den Schädlingsbefall durch ausgewählte Weizenschädlinge sowie den direkten Einfluss der naturnahen Habitate auf die Schädlingsraten auf der Feld- und Landschaftsskala untersucht. Nur die Unkrautbedeckung konnte mit dem Ertragsverlust in Verbindung gebracht werden, wobei sie einen stärkeren Einfluss auf die Ernteerträge in der Nähe der naturnahen Habitate hatte. Darüber hinaus konnte ich zeigen, dass die Befallsraten von Blattpathogenen und die Fraßraten der Larven des Getreidehähnchens an Söllen erhöht waren. Letzteres stieg sogar an Söllen mit zunehmender Landschaftsvielfalt an, was auf den Wegfall natürlicher Feinde an isolierten Habitaten im Feldinneren, wie Söllen, schließen lässt. In meiner dritten Studie fand ich heraus, dass auch Ökosystemdienstleister, wie Laufkäfer sowie die Samenprädation von Unkräutern, von Söllen profitieren. Die Entfernung zu einem naturnahen Habitat verringerte den Artenreichtum der Ökosystemdienstleister, im Gegensatz zur Samenprädation, welche zur Feldmitte zunahm. Dies deutet darauf hin, dass eine höhere Nahrungsverfügbarkeit an Feldrändern die Prädation von Versuchssamen abgeschwächt haben könnte. Während mit zunehmender Landschaftsvielfalt die Artenanzahl an Unkräutern anstieg, war bei den Laufkäfern die höchste Artenzahl und Aktivitätsdichte in Landschaften mit geringer Vielfalt zu beobachten. Das lässt den Schluss zu, dass eine Minimalausstattung an naturnahen Habitaten für Laufkäfer vorteilhaft ist, während ein zu großer Anteil an naturnahen Habitaten ihre Mobilität behindern könnte. Die ausgelegten Samen wurden in habitatarmen Landschaften unterschiedlich stark gefressen, wohingegen sie sich in habitatreichen Landschaften anglichen. Dieses Resultat unterstreicht, dass Landschaftsvielfalt die Bereitstellung von Ökosystemdienstleistungen stabilisieren kann. Abschließend konnte ich zeigen, dass mit ansteigender Samenprädation von Unkräutern ein Anstieg des Weizenertrages einherging, wenn auch die Unkrautbedeckung nicht verringert wurde. Die genauen Mechanismen der Bereitstellung von natürlicher Unkrautbekämpfung für die Pflanzenproduktion sollten in zukünftigen Studien weiter untersucht werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die untersuchten Ökosystemdienstleister und ihre Schädlings- sowie Prädationsraten Habitatpräferenzen aufwiesen. Diese Tatsache unterstreicht die Notwendigkeit, die Auswirkungen verschiedener Habitattypen auf die Bereitstellung von Ökosystemdienstleistungen nicht nur auf der Feldskala, sondern auch auf der Landschaftsskala zu bewerten. Meine Ergebnisse bestätigen, dass neben der Aufnahme des Artenreichtums von Ökosystemdienstleistern die Bewertung ihrer Funktionen unerlässlich ist, um die tatsächliche Bereitstellung von Ökosystemdienstleistungen mit dem landwirtschaftlichen Ertrag in Beziehung zu setzen. KW - semi-natural habitat KW - agroecology KW - yield KW - pest KW - natural enemies KW - Agrarökologie KW - Nützlinge KW - Schädlinge KW - naturnahe Habitate KW - Ernte Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-519653 ER - TY - THES A1 - Spinti, Daniela T1 - Proteasomal protein turnover during defense priming in Arabidopsis T1 - Proteasomaler Proteinabbau während der erworbenen Immunantwort in Arabidopsis N2 - The ubiquitin-proteasome-system (UPS) is a cellular cascade involving three enzymatic steps for protein ubiquitination to target them to the 26S proteasome for proteolytic degradation. Several components of the UPS have been shown to be central for regulation of defense responses during infections with phytopathogenic bacteria. Upon recognition of the pathogen, local defense is induced which also primes the plant to acquire systemic resistance (SAR) for enhanced immune responses upon challenging infections. Here, ubiquitinated proteins were shown to accumulate locally and systemically during infections with Psm and after treatment with the SAR-inducing metabolites salicylic acid (SA) and pipecolic acid (Pip). The role of the 26S proteasome in local defense has been described in several studies, but the potential role during SAR remains elusive and was therefore investigated in this project by characterizing the Arabidopsis proteasome mutants rpt2a-2 and rpn12a-1 during priming and infections with Pseudomonas. Bacterial replication assays reveal decreased basal and systemic immunity in both mutants which was verified on molecular level showing impaired activation of defense- and SAR-genes. rpt2a-2 and rpn12a-1 accumulate wild type like levels of camalexin but less SA. Endogenous SA treatment restores local PR gene expression but does not rescue the SAR-phenotype. An RNAseq experiment of Col-0 and rpt2a-2 reveal weak or absent induction of defense genes in the proteasome mutant during priming. Thus, a functional 26S proteasome was found to be required for induction of SAR while compensatory mechanisms can still be initiated. E3-ubiquitin ligases conduct the last step of substrate ubiquitination and thereby convey specificity to proteasomal protein turnover. Using RNAseq, 11 E3-ligases were found to be differentially expressed during priming in Col-0 of which plant U-box 54 (PUB54) and ariadne 12 (ARI12) were further investigated to gain deeper understanding of their potential role during priming. PUB54 was shown to be expressed during priming and /or triggering with virulent Pseudomonas. pub54 I and pub54-II mutants display local and systemic defense comparable to Col-0. The heavy-metal associated protein 35 (HMP35) was identified as potential substrate of PUB54 in yeast which was verified in vitro and in vivo. PUB54 was shown to be an active E3-ligase exhibiting auto-ubiquitination activity and performing ubiquitination of HMP35. Proteasomal turnover of HMP35 was observed indicating that PUB54 targets HMP35 for ubiquitination and subsequent proteasomal degradation. Furthermore, hmp35-I benefits from increased resistance in bacterial replication assays. Thus, HMP35 is potentially a negative regulator of defense which is targeted and ubiquitinated by PUB54 to regulate downstream defense signaling. ARI12 is transcriptionally activated during priming or triggering and hyperinduced during priming and triggering. Gene expression is not inducible by the defense related hormone salicylic acid (SA) and is dampened in npr1 and fmo1 mutants consequently depending on functional SA- and Pip-pathways, respectively. ARI12 accumulates systemically after priming with SA, Pip or Pseudomonas. ari12 mutants are not altered in resistance but stable overexpression leads to increased resistance in local and systemic tissue. During priming and triggering, unbalanced ARI12 levels (i.e. knock out or overexpression) leads to enhanced FMO1 activation indicating a role of ARI12 in Pip-mediated SAR. ARI12 was shown to be an active E3-ligase with auto-ubiquitination activity likely required for activation with an identified ubiquitination site at K474. Mass spectrometrically identified potential substrates were not verified by additional experiments yet but suggest involvement of ARI12 in regulation of ROS in turn regulating Pip-dependent SAR pathways. Thus, data from this project provide strong indications about the involvement of the 26S proteasome in SAR and identified a central role of the two so far barely described E3-ubiquitin ligases PUB54 and ARI12 as novel components of plant defense. N2 - Das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) ist ein in drei Schritten enzymatisch ablaufender Prozess zur Ubiquitinierung von Proteinen, wodurch diese zum proteolytischen Abbau an das 26S Proteasom geschickt werden. Verschiedene Komponenten des UPS sind zentral an der Regulation von Immunantworten während der Infektion mit phytopathogenen Bakterien beteiligt. Beim Erkennen einer Infektion werden lokale Abwehrreaktionen initiiert, wobei auch mobile Signale in distalen Pflanzenteilen verteilt werden, welche die Pflanze primen (vorbereiten). Mit dem Erwerb der systemischen Resistenz (SAR) kann die Immunantwort bei einer zweiten Infektion verstärkt aktiviert werden. Es wurde hier gezeigt, dass ubiquitinierte Proteine in lokalem und systemischem Gewebe akkumulieren, wenn Arabidopsis mit Pseudomonas infiziert oder mit SAR-induzierender Salizylsäure (SA) oder Pipecolinsäure (Pip) behandelt wird. Die genaue Rolle des 26S Proteasoms in der systemischen Immunantwort ist bisher unklar und wurde daher in diesem Projekt mithilfe der Charakterisierung der Proteasommutanten rpt2a-2 und rpn12a-1 während des Primings genauer untersucht. In Bakterienwachstumsversuchen zeigte sich eine lokal und systemisch erhöhte Suszeptibilität der Proteasommutanten, welche auf molekularer Ebene durch ausbleibende Aktivierung von Abwehrgenen verifiziert wurde. Beide Mutanten akkumulieren ähnliche Mengen Camalexin während einer Infektion, sind aber in der Biosynthese von SA gestört. Die endogene Applikation von SA löst lokale PR-Gen Expression aus, kann aber nicht das SAR-Defizit ausgleichen. In einem RNAseq Experiment wurde das Transkriptom von Col-0 und rpt2a-2 während des Primings analysiert und zeigte, dass zentrale Abwehr- und SAR-Gene nicht oder nur schwach induziert werden. Es konnte somit gezeigt werden, dass ein funktionales 26S Proteasom zur vollen Induktion aller Teile der lokalen und systemischen Immunantwort benötigt wird, während ausgleichende Prozesse weiterhin aktiviert werden können. E3-Ubiquitin Ligasen führen den letzten Schritt der Substratubiquitinierung durch und vermitteln dadurch die Spezifität des proteasomalen Proteinabbaus. Mithilfe des RNAseq Experiments konnten 11 differentiell exprimierte Transkripte, annotiert als E3-Ligasen, identifiziert werden. Von diesen wurden PLANT U-BOX 54 (PUB54) und ARIADNE 12 (ARI12) weiter analysiert, um ein tiefergehendes Verständnis ihres Einflusses auf die systemische Immunantwort zu erhalten. PUB54 wird während des Primings und bei Infektionen mit virulenten Pseudomonas exprimiert. Die pub54 I und pub54-II Mutanten zeigen lokal und systemisch eine wildtyp-ähnliche Resistenz. Das „heavy-metal associated protein 35” (HMP35) wurde in Hefe als potentielles Substrat von PUB54 identifiziert und in vitro und in vivo verifiziert. PUB54 ist eine aktive E3-Ligase mit Autoubiquitinierungsaktivität, welche HMP35 ubiquitiniert. HMP35 wird außerdem in planta proteasomal abgebaut, wodurch eine Ubiquitinierung von HMP35 durch PUB54 zum proteasomalen Abbau nahegelegt wird. Des Weiteren wurde gezeigt, dass hmp35 Mutanten von erhöhter Resistenz profitieren. HMP35 agiert möglicherweise als negativer Regulator der Immunantwort und wird zur Aktivierung von Abwehrreaktionen durch PUB54 für den proteasomalen Abbau markiert. ARI12 wird nach Priming oder Infektion mit Pseudomonas transkriptionell aktiviert und nach sekundärer Infektion hyperinduziert, wobei die Behandlung mit SA keine Expression induziert. ARI12 ist jedoch reduziert in npr1 und fmo1 Mutanten, wodurch eine Abhängigkeit der Genexpression von funktionalen SA- und Pip-Signalwegen angedeutet wird. ARI12 akkumuliert in systemischem Gewebe nach lokaler Behandlung mit SA, Pip, oder Pseudomonas. Die ari12 Mutante zeigt wildtypähnliche Resistenz gegenüber bakteriellen Infektionen, wohingegen die Überexpression zu einer verstärkten Resistenz in lokalem und systemischem Gewebe führt. Unausgewogene Level von ARI12 (d.h. knockout oder Überexpression) führen zur erhöhten Expression von FMO1, sodass ARI12 potentiell eine regulatorische Rolle in der Pip-vermittelten systemischen Immunantwort übernimmt. Es konnte gezeigt werden, dass ARI12 eine aktive E3-Ligase mit Autoubiquitinierungsaktivität an Lys474 ist, welche vermutlich für die Aktivierung benötigt wird. Massenspektrometrisch identifizierte, mögliche Substrate von ARI12 konnten noch nicht experimentell bestätigt werden, deuten aber auf eine Rolle von ARI12 in der Regulation von reaktiven Oxygen Spezies (ROS) hin, welche wiederum Pip-anhängige Signalwege regulieren. Zusammengenommen deuten die Daten aus diesem Projekt darauf hin, dass das 26S Proteasom durch den regulierten Proteinabbau zentral ist für die systemische erworbene Resistenz und dass die bisher wenig untersuchten E3-Ligasen PUB54 und ARI12 neue regulatorische Komponenten der pflanzlichen Immunabwehr darstellen. KW - defense priming KW - Arabidopsis KW - Ubiquitin-proteasome-system KW - E3-ubiquitin ligases KW - Arabidopsis KW - E3-Ubiquitin Ligasen KW - Ubiquitin-Proteasom-System KW - erworbene Immunantwort Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-505909 ER - TY - THES A1 - Raffeiner, Margot T1 - Funktionelle Charakterisierung des Xanthomonas Typ-III Effektorproteins XopS T1 - Functional characterisation of the Xanthomonas type-III effector protein XopS N2 - Angepasste Pathogene besitzen eine Reihe von Virulenzmechanismen, um pflanzliche Immunantworten unterhalb eines Schwellenwerts der effektiven Resistenz zu unterdrücken. Dadurch sind sie in der Lage sich zu vermehren und Krankheiten auf einem bestimmten Wirt zu verursachen. Eine essentielle Virulenzstrategie Gram-negativer Bakterien ist die Translokation von sogenannten Typ-III Effektorproteinen (T3Es) direkt in die Wirtszelle. Dort stören diese die Immunantwort des Wirts oder fördern die Etablierung einer für das Pathogen günstigen Umgebung. Eine kritische Komponente der Pflanzenimmunität gegen eindringende Pathogene ist die schnelle transkriptionelle Umprogrammierung der angegriffenen Zelle. Viele adaptierte bakterielle Pflanzenpathogene verwenden T3Es, um die Induktion Abwehr-assoziierter Gene zu stören. Die Aufklärung von Effektor-Funktionen, sowie die Identifikation ihrer pflanzlichen Zielproteine sind für das Verständnis der bakteriellen Pathogenese essentiell. Im Rahmen dieser Arbeit sollte das Typ-III Effektorprotein XopS aus Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv) funktionell charakterisiert werden. Zudem lag hier ein besonderer Fokus auf der Untersuchung der Wechselwirkung zwischen XopS und seinem in Vorarbeiten identifizierten pflanzlichen Interaktionspartner WRKY40, einem transkriptionellen Regulator der Abwehr-assoziierten Genexpression. Es konnte gezeigt werden, dass XopS ein essentieller Virulenzfaktor des Phytopathogens Xcv während der präinvasiven Immunantwort ist. So zeigten xopS-defiziente Xcv Bakterien bei einer Inokulation der Blattoberfläche suszeptibler Paprika Pflanzen eine deutlich reduzierte Virulenz im Vergleich zum Xcv Wildtyp. Die Translokation von XopS durch Xcv, sowie die ektopische Expression von XopS in Arabidopsis oder N. benthamiana verhinderte das Schließen von Stomata als Reaktion auf Bakterien bzw. einem Pathogen-assoziierten Stimulus, wobei zudem gezeigt werden konnte, dass dies in einer WRKY40-abhängigen Weise geschieht. Weiter konnte gezeigt werden, dass XopS in der Lage ist, die Expression Abwehr-assoziierter Gene zu manipulieren. Dies deutet darauf hin, dass XopS sowohl in die prä-als auch in die postinvasive, apoplastische Abwehr eingreift. Phytohormon-Signalnetzwerke spielen während des Aufbaus einer effizienten pflanzlichen Immunantwort eine wichtige Rolle. Hier konnte gezeigt werden, dass XopS mit genau diesen Signalnetzwerken zu interferieren scheint. Eine ektopische Expression des Effektors in Arabidopsis führte beispielsweise zu einer signifikanten Induktion des Phytohormons Jasmonsäure (JA), während eine Infektion von suszeptiblen Paprika Pflanzen mit einem xopS-defizienten Xcv Stamm zu einer ebenfalls signifikanten Akkumulation des Salicylsäure (SA)-Gehalts führte. So kann zu diesem Zeitpunkt vermutet werden, dass XopS die Virulenz von Xcv fördert, indem JA-abhängige Signalwege induziert werden und es gleichzeitig zur Unterdrückung SA-abhängiger Signalwege kommt. Die Virus-induzierte Genstilllegung des XopS Interaktionspartners WRKY40a in Paprika erhöhte die Toleranz der Pflanze gegenüber einer Xcv Infektion, was darauf hindeutet, dass es sich bei diesem Protein um einen transkriptionellen Repressor pflanzlicher Immunantworten handelt. Die Hypothese, dass WRKY40 die Abwehr-assoziierte Genexpression reprimiert, konnte hier über verschiedene experimentelle Ansätze bekräftigt werden. So wurde beispielsweise gezeigt, dass die Expression von verschiedenen Abwehrgenen einschließlich des SA-abhängigen Gens PR1 und die des Negativregulators des JA-Signalwegs JAZ8 von WRKY40 gehemmt wird. Um bei einem Pathogenangriff die Abwehr-assoziierte Genexpression zu gewährleisten, muss WRKY40 als Negativregulator abgebaut werden. Vorarbeiten zeigten, dass WRKY40 über das 26S Proteasom abgebaut wird. In der hier vorliegenden Studie konnte weiter bestätigt, dass der T3E XopS zu einer Stabilisierung des WRKY40 Proteins führt, indem er auf bislang ungeklärte Weise dessen Abbau über das 26S Proteasom verhindert. Die Ergebnisse aus der hier vorliegenden Arbeit lassen die Vermutung zu, dass die Stabilisierung des Negativregulators der Immunantwort WRKY40 seitens XopS dazu führt, dass eine darüber vermittelte Manipulation der Abwehr-assoziierten Genexpression, sowie eine Umsteuerung phytohormoneller Wechselwirkungen die Ausbreitung von Xcv auf suszeptiblen Paprikapflanzen fördert. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, weitere potentielle in planta Interaktionspartner von XopS zu identifizieren die für seine Interaktion mit WRKY40 bzw. für die Aufschlüsselung seines Wirkmechanismus relevant sein könnten. So konnte die Deubiquitinase UBP12 als weiterer pflanzlicher Interaktionspartner sowohl von XopS als auch von WRKY40 gefunden werden. Dieses Enzym ist in der Lage, die Ubiquitinierung von Substratproteinen zu modifizieren und seine Funktion könnte somit ein Bindeglied zwischen XopS und dessen Interferenz mit dem proteasomalen Abbau von WRKY40 sein. Während einer kompatiblen Xcv-Wirtsinteraktion führte die Virus-induzierte Genstilllegung von UBP12 zu einer reduzierten Resistenz der Pflanze gegenüber des Pathogens Xcv, was auf dessen positiv-regulatorische Wirkung während der Immunantwort hindeutet. Zudem zeigten Western Blot Analysen, dass das Protein WRKY40 bei einer Herunterregulierung von UBP12 akkumuliert und dass diese Akkumulation von der Anwesenheit des T3Es XopS zusätzlich verstärkt wird. Weiterführende Analysen zur biochemischen Charakterisierung der XopS/WRKY40/UBP12 Interaktion sollten in Zukunft durchgeführt werden, um den genauen Wirkmechanismus des XopS T3Es weiter aufzuschlüsseln. N2 - Adapted pathogens have acquired a number of virulence mechanisms to suppress plant immune responses below a threshold of effective resistance and are thus able to replicate and cause disease on a given host. Virulence mechanisms include the translocation of so-called type-III effector proteins (T3Es) directly into the host cell, where they disrupt immune responses or assist the pathogen to establish a beneficial environment. A critical component of plant immunity against invading pathogens is rapid transcriptional reprogramming of the targeted cell to minimize virulence. Many adapted bacterial plant pathogens use T3Es to interfere with the induction of defense-associated genes. Due to the fact that for most of the T3Es studied to date their target proteins in the host are unknown, it is often unclear by which mechanisms these defense responses are disrupted. Thus, the elucidation of effector functions, as well as the identification of their plant target proteins, are necessary for the understanding of bacterial pathogenesis. In this work, the type-III effector protein XopS from Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv) was functionally characterized. In addition, a particular focus of this characterization was to investigate the interaction between XopS and its plant interaction partner WRKY40, a transcriptional regulator of defense-associated gene expression, identified in preliminary work. XopS was shown to be an essential virulence factor of the phytopathogen Xcv during the preinvasive immune response. Thus, xopS-deficient Xcv bacteria showed significantly reduced virulence when inoculated on the leaf surface of susceptible pepper plants compared to Xcv wild type. Translocation of XopS by Xcv, as well as ectopic expression of XopS in Arabidopsis or N. benthamiana, prevented stomatal closure in response to bacteria or a pathogen-associated stimulus, respectively, and it was further shown that this occurs in a WRKY40-dependent manner. Additionally, XopS was shown to be able to manipulate the expression of defense-associated genes. This suggests that XopS interferes with both preinvasive and postinvasive apoplastic defense mechanisms. Phytohormone signaling networks play an important role during the establishment of an efficient plant immune response. Here, it was shown that XopS appears to interfere with these signaling networks. For example, ectopic expression of the effector in Arabidopsis led to a significant induction of the phytohormone jasmonic acid (JA), while infection of susceptible pepper plants with a xopS-deficient Xcv strain resulted in an equally significant accumulation of the salicylic acid (SA) content. Thus, at this stage it can be speculated that XopS promotes the virulence of Xcv by inducing JA-dependent signaling pathways and simultaneously suppressing SA signaling pathways via it. In this work, it was confirmed that XopS interacts not only with WRKY40 from N. benthamiana but also with its orthologous proteins from Arabidopsis (AtWRKY40) and pepper (CaWRKY40a). Virus-induced gene silencing of WRKY40a in bell pepper increased plant tolerance to Xcv infection, suggesting that this protein is a transcriptional regulator that suppresses induction of plant immune responses. The hypothesis that WRKY40 is a transcriptional repressor of defense-associated gene expression was corroborated here via several experimental approaches. For example, the expression of several defense genes including the SA-dependent gene PR1 and that of the negative regulator of the JA pathway JAZ8 was shown to be inhibited by WRKY40. To ensure defense-associated gene expression during pathogen attack, WRKY40 as a negative regulator must be removed to allow expression of defense genes. Preliminary work showed that WRKY40 is degraded via the 26S proteasome. The present study further confirmed that the T3E XopS leads to stabilization of WRKY40 protein by preventing its proteasomal degradation in a yet unexplained manner. The results from the work presented here suggest that stabilization of the negative regulator of immune responses WRKY40 by XopS leads to the manipulation of defense-associated gene expression, as well as a redirection of phytohormonal interactions, which in turn promotes the spread of Xcv on susceptible pepper plants. Another goal of this work was to identify other potential in planta interaction partners of XopS that might be relevant for its interaction with WRKY40 or for the deciphering of its mechanism of action. This identified the deubiquitinase UBP12 as another plant interaction partner of both XopS and WRKY40. UBP12 is able to modify the ubiquitination of substrate proteins and its function could thus represent a link between XopS and its interference with the proteasomal degradation of WRKY40. During a compatible Xcv-host interaction, virus-induced gene silencing of UBP12 resulted in reduced plant resistance to the pathogen Xcv, suggesting its positive regulatory effect during the immune response. Moreover, Western blot analyses showed that the protein WRKY40 accumulates upon down-regulation of UBP12 and that this accumulation is further enhanced by the presence of the T3E XopS. Further analysis on the biochemical characterization of the XopS/WRKY40/UBP12 interaction should be performed in the future to further elucidate the exact mode of action of the XopS T3E. KW - Xanthomonas campestris pv. vesicatoria KW - XopS KW - WRKY40 KW - Stomatäre Immunität KW - Proteasomaler Abbau KW - Xanthomonas campestris pv. vesicatoria KW - XopS KW - WRKY40 KW - stomatal immunity KW - proteasomal degradation Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-525532 ER - TY - THES A1 - Leiser, Rico T1 - Biogeochemical processes governing microplastic transport in freshwater reservoirs N2 - The presented study investigated the influence of microbial and biogeochemical processes on the physical transport related properties and the fate of microplastics in freshwater reservoirs. The overarching goal was to elucidate the mechanisms leading to sedimentation and deposition of microplastics in such environments. This is of importance, as large amounts of initially buoyant microplastics are found in reservoir sediments worldwide. However, the transport processes which lead to microplastics accumulation in sediments, were up to now understudied. The impact of biofilm formation on the density and subsequent sedimentation of microplastics was investigated in the eutrophic Bautzen reservoirs (Chapter 2). Biofilms are complex microbial communities fixed to submerged surfaces through a slimy organic film. The mineral calcite was detected in the biofilms, which led to the sinking of the overgrown microplastic particles. The calcite was of biogenic origin, most likely precipitated by sessile cyanobacteria within the biofilms. Biofilm formation was also studied in the mesotrophic Malter reservoir. Unlike in Bautzen reservoir, biofilm formation did not govern the sedimentation of different microplastics in Malter reservoir (Chapter 3). Instead autumnal lake mixing led to the formation of sinking aggregates of microplastics and iron colloids. Such colloids form when anoxic, iron-rich water from the hypolimnion mixes with the oxygenated epilimnetic waters. The colloids bind organic material from the lake water, which leads to the formation of large and sinking iron-organo flocs. Hence, iron-organo floc formation and their influence on the buoyancy or burial of microplastics into sediments of Bautzen reservoir was studied in laboratory experiments (Chapter 4). Microplastics of different shapes (fiber, fragment, sphere) and sizes were readily incorporated into sinking iron-organo flocs. By this initially buoyant polyethylene microplastics were transported on top of sediments from Bautzen reservoir. Shortly after deposition, the microplastic bearing flocs started to subside and transported the pollutants into deeper sediment layers. The microplastics were not released from the sediments within two months of laboratory incubation. The stability of floc microplastic deposition was further investigated employing experiments with the iron reducing model organism Shewanella oneidensis (Chapter 5). It was shown, that reduction or re-mineralization of the iron minerals did not affect the integrity of the iron-organo flocs. The organic matrix was stable under iron reducing conditions. Hence, no incorporated microplastics were released from the flocs. As similar processes are likely to take place in natural sediments, this might explain the previous described low microplastic release from the sediments. This thesis introduced different mechanisms leading to the sedimentation of initially buoyant microplastics and to their subsequent deposition in freshwater reservoirs. Novel processes such as the aggregation with iron-organo flocs were identified and the understudied issue of biofilm densification through biogenic mineral formation was further investigated. The findings might have implications for the fate of microplastics within the river-reservoir system and outline the role of freshwater reservoirs as important accumulation zone for microplastics. Microplastics deposited in the sediments of reservoirs might not be transported further by through flowing river. Hence the study might contribute to better risk assessment and transport balances of these anthropogenic contaminants. N2 - Die vorliegende Arbeit befasst sich mit dem Einfluss mikrobiologischer und biogeochemischer Prozesse auf die physikalischen Transporteigenschaften und den Verbleib von Mikroplastik in Stauseen. Ein Schwerpunkt lag auf der Untersuchung von Mechanismen, welche die Sedimentation von Mikroplastik einleiten. Dies ist von hoher Relevanz, da große Mengen eigentlich schwimmfähigen Mikroplastiks in Stauseesedimenten gefunden werden, aber die Transportprozesse vom Wasser in das Sediment bislang unbekannt waren. In der eutrophen Talsperre Bautzen wurde der Einfluss der Biofilmbildung auf die Dichte und Sedimentation von Mikroplastik untersucht (Kapitel 2). Biofilme sind komplexe mikrobielle Lebensgemeinschaften, welche sich in Form schleimiger Filme auf im Wasser befindlichen Oberflächen bilden. Es konnte ein Zusammenhang zwischen der starken Dichtezunahme beziehungsweise dem Absinken der bewachsenen Partikel und dem Vorhandensein des Minerals Calcit innerhalb des aufwachsenden Biofilms festgestellt werden. Das Calcit war biogenen Ursprungs und wurde infolge der Photosynthese sessiler Cyanobakterien gebildet. In der mesotrophen Talsperre Malter wurde ebenfalls die Biofilmbildung auf Mikroplastik untersucht (Kapitel 3). Dort veränderte die Bildung von mikrobiellen Biofilmen das Sedimentationsverhalten von verschiedenen Mikroplastik-Polymeren nicht. Stattdessen wurde beobachtet, dass die Herbstzirkulation des Sees zur Bildung von Aggregaten aus Mikroplastik und mineralischen Eisenkolloiden führte. Diese Eisenkolloide bilden sich durch die Mischung von eisenreichen, sauerstofffreien Tiefenwasser mit sauerstoffhaltigem Oberflächenwasser. Die Kolloide verbinden sich mit organischem Material aus dem See und formen dadurch größere Flocken. Da die Bildung von eisenhaltigen Flocken ein für geschichtete Stauseen wichtiger Prozess ist, wurde ihr Einfluss auf die Schwimmfähigkeit von Mikroplastik und den darauffolgenden Einbau in die Sedimente untersucht (Kapitel 4). In Laborversuchen konnten verschiedene Formen (Fasern, Fragmente, Kugeln) und Größenklassen von Mikroplastik in die Flocken eingebaut werden. Da die Flocken im Wasser absinken, können sie zuvor schwimmfähiges Polyethylen-Mikroplastik zur Sedimentoberfläche transportieren. Dort angekommen, beginnen die Flocken zusammen mit dem Mikroplastik langsam in das Sediment einzusinken und transportieren es dadurch in tiefere Sedimentschichten. Im Labor konnte innerhalb von zwei Monaten keine signifikante Freisetzung des so transportierten Mikroplastiks aus den Sedimenten beobachtet werden. Die Transformation der Flocken und welchen Einfluss dies auf die Freisetzung von Mikroplastik hat, wurde in Versuchen mit dem eisenreduzierenden Modelorganismus Shewanella oneidensis untersucht (Kapitel 5). Hierbei zeigte sich, dass die Auflösung oder Umwandlung des Eisens beziehungsweise der Eisenminerale innerhalb der Flocken, nicht zur Zerstörung der Flocken führte. Die organische Matrix der Flocken blieb unverändert stabil und umschloss auch weiterhin das eingebaute Mikroplastik. Da im Sediment ähnliche Abbauprozesse ablaufen, gibt dies einen möglichen Hinweis darauf, warum abgelagertes Mikroplastik nicht mehr aus Sedimenten freigesetzt wird. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass in Talsperren unterschiedliche Prozesse zum Absinken und zur Deposition von Mikroplastik führen. Es wurden neuartige Prozesse wie die Aggregation mit eisenhaltigen Flocken identifiziert und ungewöhnliche Aspekte wie die biogene Mineralbildung näher beleuchtet. Dadurch können wichtige Implikationen hinsichtlich des Transports von Mikroplastik in Fluss- Stausee-Systemen abgeleitet werden. Aufgrund der beschriebenen Sedimentationsprozesse sind Stauseen wichtige Akkumulationszonen für Mikroplastik. Im Stausee sedimentierendes Mikroplastik wird potentiell nicht vom aufgestauten Fluss weitertransportiert. Daher könnten die hier beschriebenen Prozesse zu einer Verbesserung von Risikoabschätzungen und Transportbilanzen dieser anthropogenen Belastung führen. KW - microplastics KW - reservoirs KW - calcite KW - iron KW - biofouling KW - sedimentation KW - polyethylene KW - biofilms KW - Mikroplastik KW - Stauhaltungen KW - Kalzit KW - Eisen KW - Sedimentation KW - Polyethylen KW - Biofilme Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-520240 ER - TY - THES A1 - Barchewitz, Tino T1 - Impact of microcystin on the non-canonical localization of RubisCO in the toxic bloom-forming cyanobacterium Microcystis aeruginosa PCC7806 T1 - Einfluss von Microcystin auf die nicht-kanonische Lokalisierung von RubisCO im toxischen Blüten-bildenden Cyanobakterium Microcystis aeruginosa PCC7806 N2 - Cyanobacteria are an abundant bacterial group and are found in a variety of ecological niches all around the globe. They can serve as a real threat for fish or mammals and can restrict the use of lakes or rivers for recreational purposes or as a source of drinking water, when they form blooms. One of the most abundant bloom-forming cyanobacteria is Microcystis aeruginosa. In the first part of the study, the role and possible dynamics of RubisCO in M. aeruginosa during high-light irradiation were examined. Its response was analyzed on the protein and peptide level via immunoblotting, immunofluorescence microscopy and with high performance liquid chromatography (HPLC). It was revealed that large amounts of RubisCO were located outside of carboxysomes under the applied high light stress. RubisCO aggregated mainly underneath the cytoplasmic membrane. There it forms a putative Calvin-Benson-Bassham (CBB) super complex together with other enzymes of photosynthesis. This complex could be part of an alternative carbon-concentrating mechanism (CCM) in M. aeruginosa, which enables a faster, and energy saving adaptation to high light stress of the whole bloom. Furthermore, the re-localization of RubisCO was delayed in the microcystin-deficient mutant ΔmcyB and RubisCO was more evenly distributed over the cell in comparison to the wild type. Since ΔmcyB is not harmed in its growth, possibly other produced cyanopeptides as aeruginosin or cyanopeptolin also play a role in the stabilization of RubisCO and the putative CBB complex, especially in the microcystin-free mutant. In the second part of this work, the possible role of microcystin as an extracellular signaling peptide during the diurnal cycle was studied. HPLC analysis showed a strong increase of extracellular microcystin in the wild type when the population entered nighttime and it resumed into the next day as well. Together with the increase of extracellular microcystin, a strong decrease of protein-bound intracellular microcystin was observed via immunoblot analysis. Interestingly, the signal of the large subunit of RubisCO (RbcL) also diminished when high amounts of microcystin were present in the surrounding medium. Microcystin addition experiments to M. aeruginosa WT and ΔmcyB cultures support this observation, since the immunoblot signal of both subunits of RubisCO and CcmK, a shell protein of carboxysomes, diminished after the addition of microcystin. In addition, the fluctuation of cyanopeptolin during the diurnal cycle indicates a more prominent role of other cyanopeptides besides microcystin as a signaling peptide, intracellularly as well as extracellularly. N2 - Cyanobakterien können weltweit in einer Vielzahl von ökologischen Nischen gefunden werden. Sie stellen eine Gefahr für Eukaryoten wie Fische oder Säugetiere dar, und können auch die Nutzung von Seen oder Flüssen zu Erholungszwecken oder als Trinkwasserquelle beeinträchtigen, wenn sie an der Wasser-Luft Interphase Blüten bilden. Einer der häufigsten blütenbildenden Cyanobakterien ist der Stamm M. aeruginosa PCC7806, welcher in Cyanobakterienblüten auf der ganzen Welt gefunden werden kann. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Funktion und mögliche Dynamiken von RubisCO während der Bildung und Aufrechterhaltung von dicht gewachsenen Blüten untersucht. Dafür wurden Schwachlicht-adaptierte M. aeruginosa Zellkulturen Starklicht ausgesetzt und deren Reaktion auf dem Protein- und Peptidlevel analysiert. Verwendete Analysemethoden waren Western Blots, Immunofluoreszenz-mikroskopie und Hochleistungsflüssigkeitschromatografie (HPLC). Es konnte aufgezeigt werden, dass unter der angewendeten Starklichtbehandlung große Mengen RubisCO außerhalb der Carboxysomen lokalisiert waren. Dabei konnte RubisCO hauptsächlich direkt unterhalb der zytoplasmatischen Membran in Form von Aggregaten nachgewiesen werden. Diese Aggregate sind möglicherweise Teil eines hypothetischen Calvin-Benson-Bassham Zyklus (CBB) Superkomplexes zusammen mit anderen Enzymen aus der Photosynthese. Dieser Komplex könnte Teil eines alternativen Kohlenstoff-Konzentrationsmechanismus in M. aeruginosa sein, welcher eine schnellere und energiesparendere Anpassung der Cyanobakterienblüte an Starklichtstress ermöglicht. Weiterhin erfolgte die Relokalisation von RubisCO in der Microcystin-freien Mutante ΔmcyB verzögert und RubisCO war homogener in der Zelle verteilt im Vergleich zum Wildtyp. Die Ergebnisse dieser Arbeit sind im Einklang mit vorherigen Publikationen zu der Funktion von Microcystin als Schutz gegen Proteinabbau in Folge der Bindung von Microcystin an das jeweilige Protein. Da ΔmcyB im Wachstum nicht eingeschränkt war, scheint es möglich, dass andere Cyanopeptoline wie Aeruginosin oder Cyanopeptolin die stabilisierende Funktion von Microcystin gegenüber RubisCO und den hypothetischen CBB Komplex übernehmen, vor allem in der Microcystin-freien Mutante. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die mögliche extrazelluläre Funktion von Microcystin untersucht. HPLC-Analysen zeigen eine starke Zunahme an extrazellulärem Microcystin im Wildtyp als die Zellkultur in die Nachtphase übergegangen ist. Dieser Trend hat sich auch in den folgenden Tag hinein fortgesetzt. Zusammen mit der Zunahme an extrazellulärem Microcystin wurde eine starke Abnahme an proteingebundenem intrazellulärem Microcystin festgestellt, anhand von Western Blot-Untersuchungen. Interessanterweise verringerte sich die Signalstärke der großen Untereinheit von RubisCO (RbcL) im selben Zeitraum im Western Blot. Microcystin Zugabe-Experimente zu M. aeruginosa WT und ΔmcyB unterstützen diese Beobachtung, da das Western Blot-Signal für sowohl beide Untereinheiten von RubisCO als auch CcmK, ein Hüllenprotein der Carboxysomen, nach der Zugabe von Microcystin stark abnahm. Zusätzlich weist die Fluktuation des Cyanopeptolin-Signals während des Tag-Nacht Zyklus auf eine wichtigere Funktion von Cyanopeptiden abseits von Microcystin hin; als Signalpeptide, sowohl intrazellulär als auch extrazellulär. Diese Dissertation gibt neue Einsichten in Adaptionsprozesse von M. aeruginosa an Starklicht-Bedingungen. Der postulierte alternative Kohlenstoff-Konzentrations-mechanismus, welcher direkt unterhalb der zytoplasmatischen Membran stattfindet, gibt M. aeruginosa einen Vorteil gegenüber anderen Cyanobakterien, welche nur den in der Literatur anerkannten Carboxysomen-basierten Kohlenstoff-Konzentrations-mechanismus besitzen. Des Weiteren stärkt die vorliegende Arbeit die Hypothese, dass die eigentliche extrazelluläre Funktion von Microcystin die eines Signalstoffes ist, und nicht die eines antibiotischen Stoffes. KW - Cyanobacteria KW - Microcystis KW - Microcystin KW - RubisCO KW - Carbon concentrating mechanism KW - Cyanobakterien KW - Microcystin KW - Microcystis KW - Carboxysomen KW - Kohlenstoff-Konzentrationsmechanismus KW - RubisCO Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-508299 ER - TY - THES A1 - Tunn, Isabell T1 - From single molecules to bulk materials: tuning the viscoelastic properties of coiled coil cross-linked hydrogels N2 - The development of bioinspired self-assembling materials, such as hydrogels, with promising applications in cell culture, tissue engineering and drug delivery is a current focus in material science. Biogenic or bioinspired proteins and peptides are frequently used as versatile building blocks for extracellular matrix (ECM) mimicking hydrogels. However, precisely controlling and reversibly tuning the properties of these building blocks and the resulting hydrogels remains challenging. Precise control over the viscoelastic properties and self-healing abilities of hydrogels are key factors for developing intelligent materials to investigate cell matrix interactions. Thus, there is a need to develop building blocks that are self-healing, tunable and self-reporting. This thesis aims at the development of α-helical peptide building blocks, called coiled coils (CCs), which integrate these desired properties. Self-healing is a direct result of the fast self-assembly of these building blocks when used as material cross-links. Tunability is realized by means of reversible histidine (His)-metal coordination bonds. Lastly, implementing a fluorescent readout, which indicates the CC assembly state, self-reporting hydrogels are obtained. Coiled coils are abundant protein folding motifs in Nature, which often have mechanical function, such as in myosin or fibrin. Coiled coils are superhelices made up of two or more α-helices wound around each other. The assembly of CCs is based on their repetitive sequence of seven amino acids, so-called heptads (abcdefg). Hydrophobic amino acids in the a and d position of each heptad form the core of the CC, while charged amino acids in the e and g position form ionic interactions. The solvent-exposed positions b, c and f are excellent targets for modifications since they are more variable. His-metal coordination bonds are strong, yet reversible interactions formed between the amino acid histidine and transition metal ions (e.g. Ni2+, Cu2+ or Zn2+). His-metal coordination bonds essentially contribute to the mechanical stability of various high-performance proteinaceous materials, such as spider fangs, Nereis worm jaws and mussel byssal threads. Therefore, I bioengineered reversible His-metal coordination sites into a well-characterized heterodimeric CC that served as tunable material cross-link. Specifically, I took two distinct approaches facilitating either intramolecular (Chapter 4.2) and/or intermolecular (Chapter 4.3) His-metal coordination. Previous research suggested that force-induced CC unfolding in shear geometry starts from the points of force application. In order to tune the stability of a heterodimeric CC in shear geometry, I inserted His in the b and f position at the termini of force application (Chapter 4.2). The spacing of His is such that intra-CC His-metal coordination bonds can form to bridge one helical turn within the same helix, but also inter-CC coordination bonds are not generally excluded. Starting with Ni2+ ions, Raman spectroscopy showed that the CC maintained its helical structure and the His residues were able to coordinate Ni2+. Circular dichroism (CD) spectroscopy revealed that the melting temperature of the CC increased by 4 °C in the presence of Ni2+. Using atomic force microscope (AFM)-based single molecule force spectroscopy, the energy landscape parameters of the CC were characterized in the absence and the presence of Ni2+. His-Ni2+ coordination increased the rupture force by ~10 pN, accompanied by a decrease of the dissociation rate constant. To test if this stabilizing effect can be transferred from the single molecule level to the bulk viscoelastic material properties, the CC building block was used as a non-covalent cross-link for star-shaped poly(ethylene glycol) (star-PEG) hydrogels. Shear rheology revealed a 3-fold higher relaxation time in His-Ni2+ coordinating hydrogels compared to the hydrogel without metal ions. This stabilizing effect was fully reversible when using an excess of the metal chelator ethylenediaminetetraacetate (EDTA). The hydrogel properties were further investigated using different metal ions, i.e. Cu2+, Co2+ and Zn2+. Overall, these results suggest that Ni2+, Cu2+ and Co2+ primarily form intra-CC coordination bonds while Zn2+ also participates in inter-CC coordination bonds. This may be a direct result of its different coordination geometry. Intermolecular His-metal coordination bonds in the terminal regions of the protein building blocks of mussel byssal threads are primarily formed by Zn2+ and were found to be intimately linked to higher-order assembly and self-healing of the thread. In the above example, the contribution of intra-CC and inter-CC His-Zn2+ cannot be disentangled. In Chapter 4.3, I redesigned the CC to prohibit the formation of intra-CC His-Zn2+ coordination bonds, focusing only on inter-CC interactions. Specifically, I inserted His in the solvent-exposed f positions of the CC to focus on the effect of metal-induced higher-order assembly of CC cross-links. Raman and CD spectroscopy revealed that this CC building block forms α-helical Zn2+ cross-linked aggregates. Using this CC as a cross-link for star-PEG hydrogels, I showed that the material properties can be switched from viscoelastic in the absence of Zn2+ to elastic-like in the presence of Zn2+. Moreover, the relaxation time of the hydrogel was tunable over three orders of magnitude when using different Zn2+:His ratios. This tunability is attributed to a progressive transformation of single CC cross-links into His-Zn2+ cross-linked aggregates, with inter-CC His-Zn2+ coordination bonds serving as an additional, cross-linking mode. Rheological characterization of the hydrogels with inter-CC His-Zn2+ coordination raised the question whether the His-Zn2+ coordination bonds between CCs or also the CCs themselves rupture when shear strain is applied. In general, the amount of CC cross-links initially formed in the hydrogel as well as the amount of CC cross-links breaking under force remains to be elucidated. In order to more deeply probe these questions and monitor the state of the CC cross-links when force is applied, a fluorescent reporter system based on Förster resonance energy transfer (FRET) was introduced into the CC (Chapter 4.4). For this purpose, the donor-acceptor pair carboxyfluorescein and tetramethylrhodamine was used. The resulting self-reporting CC showed a FRET efficiency of 77 % in solution. Using this fluorescently labeled CC as a self-reporting, reversible cross-link in an otherwise covalently cross-linked star-PEG hydrogel enabled the detection of the FRET efficiency change under compression force. This proof-of-principle result sets the stage for implementing the fluorescently labeled CCs as molecular force sensors in non-covalently cross-linked hydrogels. In summary, this thesis highlights that rationally designed CCs are excellent reversibly tunable, self-healing and self-reporting hydrogel cross-links with high application potential in bioengineering and biomedicine. For the first time, I demonstrated that His-metal coordination-based stabilization can be transferred from the single CC level to the bulk material with clear viscoelastic consequences. Insertion of His in specific sequence positions was used to implement a second non-covalent cross-linking mode via intermolecular His-metal coordination. This His-metal binding induced aggregation of the CCs enabled for reversibly tuning the hydrogel properties from viscoelastic to elastic-like. As a proof-of-principle to establish self-reporting CCs as material cross-links, I labeled a CC with a FRET pair. The fluorescently labelled CC acts as a molecular force sensor and first preliminary results suggest that the CC enables the detection of hydrogel cross-link failure under compression force. In the future, fluorescently labeled CC force sensors will likely not only be used as intelligent cross-links to study the failure of hydrogels but also to investigate cell-matrix interactions in 3D down to the single molecule level. N2 - Die Entwicklung von biomimetischen Materialien, wie Hydrogelen, zur Anwendung in der Zellkultur und der regenerativen Medizin bildet einen aktuellen Schwerpunkt der Materialwissenschaften. Häufig werden natürlich vorkommende oder neu entwickelte Proteine als biomimetische Bausteine für Hydrogele genutzt, welche die extrazelluläre Umgebung von Zellen nachahmen. Gegenwärtig bleibt es jedoch eine Herausforderung, die Eigenschaften dieser Bausteine und der daraus entwickelten Materialien genau zu kontrollieren und gezielt maßzuschneidern. Jedoch stellen präzise kontrollierbare Materialeigenschaften einen Schlüsselfaktor für die Herstellung von intelligenten Materialen für die Zellkultur dar. Das Ziel dieser Arbeit ist die Entwicklung von α-helikalen Protein-Bausteinen, so genannter Coiled Coils (CCs), mit maßgeschneiderten, reversibel veränderbaren Eigenschaften. Dazu wurden reversible Histidin (His)-Metall-Koordinationsbindungen in ein CC Heterodimer eingefügt. Des Weiteren wurden Fluoreszenz-markierte CCs entwickelt, um das Verhalten der CC-Bausteine in Hydrogelen unter Krafteinwirkung zu untersuchen. In der Natur kommen CCs oft als Faltungsmotive in Proteinen vor, die eine mechanische Funktion haben, z.B. Myosin oder Fibrin. CCs bestehen aus zwei bis sieben α-Helices, die eine Superhelix bilden. Die Aminosäuresequenz von CCs ist hoch repetitiv und besteht aus sieben sich wiederholenden Aminosäurepositionen (abcdefg). In den Positionen a und d befinden sich aliphatische Aminosäuren, die den hydrophoben Kern des CCs bilden. Die Positionen e und g werden durch geladene Aminosäuren besetzt, die ionische Bindungen eingehen. In den Lösungsmittel-exponierten Positionen, können diverse Aminosäure platziert werden. Daher sind diese Positionen für Modifikationen gut geeignet. His-Metall-Koordinationsbindungen sind stabile Bindungen der Aminosäure His mit Übergangsmetallionen, wie Ni2+, Cu2+ oder Zn2+. His-Metall-Koordinationsbindungen tragen entscheidend zur mechanischen Stabilität von verschiedenen Protein-basierten Biomaterialien bei, z.B. in den Fangzähnen von Spinnen oder in Byssusfäden von Miesmuscheln. Daher wurden His-Metall-Koordinationsstellen in dieser Arbeit verwendet, um ein gut charakterisiertes CC Heterodimer zu stabilisieren. Zwei verschiedene Ansätze wurden zur Stabilisierung des CCs, und den daraus synthetisierten Materialien, genutzt. Zum einen wurden die His-Metall-Koordinationsbindungen so im CC platziert, dass primär Koordination innerhalb einer Helix stattfindet (intra-CC) (Kapitel 4.2). Zum anderen wurde His in Positionen eingefügt, die nur Metall-Koordinationsbindungen zwischen den CCs erlauben (inter-CC) (Kapitel 4.3). Bisherige Forschungsergebnisse zur mechanischen Entfaltung von CCs in der Schergeometrie lassen vermuten, dass die Entfaltung am Angriffspunkt der Kraft beginnt. Um die Stabilität einzelner CC Heterodimere in der Schergeometrie zu erhöhen, habe ich His-Metall Koordinationsbindungen in den Positionen b und f an den Enden der CC-Peptide einfügt (intra-CC), an denen die Scherkraft angreift (Kapitel 4.2). Mittels Raman Spektroskopie konnte ich zeigen, dass das His-modifizierte CC α-helikal bleibt und Ni2+ koordiniert. Zirkulardichroismus Spektroskopie wurde genutzt, um die thermodynamische Stabilität mit und ohne Ni2+ zu ermitteln. Unter Zugabe von Ni2+ erhöhte sich die Schmelztemperatur des CCs um 4 °C. Um die Energielandschaft der Entfaltung zu untersuchen, wurde Einzelmolekülkraftspektroskopie mit dem Rasterkraftmikroskop durchgeführt. His-Ni2+-Koordination führte zu einer Erhöhung der Abrisskraft um 10 pN und einer 10-fach verringerten Dissoziationskonstante. Die Koordination von Ni2+ führt demnach zu einer Stabilisierung des CCs. Um zu testen, ob der stabilisierende Effekt vom Einzelmolekül auf die viskoelastischen Eigenschaften von Hydrogelen übertragbar ist, wurde das CC als Vernetzungs-Baustein für sternförmiges Polyethylenglykol genutzt. Scherrheologie zeigte, dass die Relaxationszeit der CC-Hydrogele bei Zugabe von Ni2+ um das 3-fache erhöht ist. Dieser stabilisierende Effekt war vollkommen reversibel, wenn Metallchelatoren, wie Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) zugegeben wurden. Des Weiteren konnte ich zeigen, dass Cu2+ und Co2+ intra-CC Koordinationsbindungen eingehen und einen ähnlichen Effekt auf die Relaxationszeit haben wie Ni2+, wohingegen Zn2+ auch zwischen verschiedenen CCs (inter-CC) koordiniert wurde. Intermolekulare His-Zn2+-Koordination an den Enden der Protein-Bausteine von Byssusfäden ist essentiell für deren hierarchische Struktur und Selbstheilung nach mechanischer Belastung. Im oben beschriebenen CC kann der Effekt der intra- und inter-CC His-Zn2+-Koordination nicht klar voneinander getrennt werden. In Kapitel 4.3 wurden die His daher mit größerem Abstand in das CC eingefügt, so dass nur inter-CC Zn2+-Koordination möglich war. Raman und Zirkulardichroismus Spektroskopie zeigten, dass dieses CC unter Zugabe von Zn2+ aggregiert. Während sich die CC-Hydrogele ohne Zn2+ viskoelastisch verhielten, führte die Zugabe von Zn2+ zu annähernd elastischem Verhalten. Unter Verwendung von verschiedenen His:Zn2+ Verhältnissen, konnte die Relaxationszeit in einem großen Bereich gezielt verändert werden. Diese maßgeschneiderten Materialeigenschaften sind auf die schrittweise Umwandlung von einzelnen CC-Vernetzungen zu CC-Aggregaten mit inter-CC His-Zn2+-Koordination zurückzuführen. Die Rheologiemessungen mit den His-Zn2+-vernetzten CC-Aggregaten werfen die Frage auf, ob die inter-CC His-Zn2+-Koordinationsbindungen oder die CCs selbst brechen, wenn eine Kraft wirkt. Im Allgemeinen sind die Mechanismen der Dissoziation von Vernetzern im Hydrogel unter Krafteinwirkung größtenteils unerforscht. Um diese zu beleuchten, wurde das CC mit einem Fluoreszenz-Reportersystem ausgestattet (Kapitel 4.4). Genauer gesagt, wurde ein Förster Resonanzenergietransfer (FRET) Paar (Carboxyfluorescein-Tetramethylrhodamin) an das CC gekoppelt. Die Effizienz des Energietransfers gibt in diesem System Aufschluss darüber, ob das CC assoziiert oder dissoziiert ist. Das FRET-markierte CC wurde als nicht-kovalenter, reversibler molekularer Kraftsensor in einem ansonsten kovalent vernetzten Hydrogel eingesetzt. Unter Kompression verringerte sich die FRET-Effizienz, was einen ersten Hinweise auf die Dissoziation des CCs darstellt. Dieses Ergebnis verdeutlicht, dass CCs hervorragende molekulare Kraftsensoren für biomimetische Materialien darstellen. Diese Arbeit demonstriert, dass CCs mit maßgeschneiderten, reversibel manipulierbaren Eigenschaften exzellente Bausteine für Hydrogele sind, die in der Zellkultur und der regenerativen Medizin Verwendung finden können. Es konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass einzelne CCs durch His-Metall-Koordinationsbindungen reversibel stabilisiert werden können und dass diese molekulare Stabilisierung direkt auf die viskoelastischen Materialeigenschaften von Hydrogelen übertragbar ist. Durch gezieltes Einfügen von intermolekularen His-Metall-Koordinationsbindungen gelang es, CC-Hydrogele mit einem zweiten übergeordneten His-Zn2+ basierten Vernetzungsmodus herzustellen. So konnte die Relaxationszeit der Hydrogele über einen weiten Bereich maßgeschneidert kontrolliert werden. Um CCs als molekulare Kraftsensoren in Materialien zu etablieren, wurde das CC Heterodimer mit einem FRET-Reportersystem ausgestattet. Erste Experimente deuten darauf hin, dass die Dissoziation des CCs im Hydrogel unter Krafteinwirkung optisch verfolgt werden kann. Zukünftig können CCs mit maßgeschneiderter Stabilität nicht nur als molekulare Kraftsensoren für Materialien, sondern auch zur Erforschung von Zell-Matrix Wechselwirkungen eingesetzt werden. T2 - Von Molekülen zu Materialien: Coiled Coil-vernetzte Hydrogele mit maßgeschneiderten viskoelastischen Eigenschaften KW - biochemistry KW - coiled coil KW - histidine-metal coordination KW - Förster resonance energy transfer (FRET) KW - rheology KW - single-molecule force spectroscopy KW - Biochemie KW - Coiled Coil KW - Hydrogel KW - Histidin-Metall Koordination KW - Förster Resonanz Energie Transfer (FRET) KW - Rheologie KW - Einzelmolekülkraftspektroskopie Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-475955 ER - TY - THES A1 - Schuster, Maja T1 - High resolution decoding of the tobacco chloroplast translatome and its dynamics during light-intensity acclimation N2 - Chloroplasts are the photosynthetic organelles in plant and algae cells that enable photoautotrophic growth. Due to their prokaryotic origin, modern-day chloroplast genomes harbor 100 to 200 genes. These genes encode for core components of the photosynthetic complexes and the chloroplast gene expression machinery, making most of them essential for the viability of the organism. The regulation of those genes is predominated by translational adjustments. The powerful technique of ribosome profiling was successfully used to generate highly resolved pictures of the translational landscape of Arabidopsis thaliana cytosol, identifying translation of upstream open reading frames and long non-coding transcripts. In addition, differences in plastidial translation and ribosomal pausing sites were addressed with this method. However, a highly resolved picture of the chloroplast translatome is missing. Here, with the use of chloroplast isolation and targeted ribosome affinity purification, I generated highly enriched ribosome profiling datasets of the chloroplasts translatome for Nicotiana tabacum in the dark and light. Chloroplast isolation was found unsuitable for the unbiased analysis of translation in the chloroplast but adequate to identify potential co-translational import. Affinity purification was performed for the small and large ribosomal subunit independently. The enriched datasets mirrored the results obtained from whole-cell ribosome profiling. Enhanced translational activity was detected for psbA in the light. An alternative translation initiation mechanism was not identified by selective enrichment of small ribosomal subunit footprints. In sum, this is the first study that used enrichment strategies to obtain high-depth ribosome profiling datasets of chloroplasts to study ribosome subunit distribution and chloroplast associated translation. Ever-changing light intensities are challenging the photosynthetic capacity of photosynthetic organism. Increased light intensities may lead to over-excitation of photosynthetic reaction centers resulting in damage of the photosystem core subunits. Additional to an expensive repair mechanism for the photosystem II core protein D1, photosynthetic organisms developed various features to reduce or prevent photodamage. In the long-term, photosynthetic complex contents are adjusted for the efficient use of experienced irradiation. However, the contribution of chloroplastic gene expression in the acclimation process remained largely unknown. Here, comparative transcriptome and ribosome profiling was performed for the early time points of high-light acclimation in Nicotiana tabacum chloroplasts in a genome-wide scale. The time- course data revealed stable transcript level and only minor changes in translational activity of specific chloroplast genes during high-light acclimation. Yet, psbA translation was increased by two-fold in the high light from shortly after the shift until the end of the experiment. A stress-inducing shift from low- to high light exhibited increased translation only of psbA. This study indicate that acclimation fails to start in the observed time frame and only short-term responses to reduce photoinhibition were observed. N2 - Chloroplasten sind die photosynthetischen Organellen in Pflanzen- und Algenzellen, die photoautotrophes Wachstum ermöglichen. Aufgrund ihrer prokaryotischen Herkunft besitzen moderne Chloroplasten ein Genom mit 100 bis 200 Gene. Diese kodieren für zentrale Komponenten der Photosynthesekomplexe und des Genexpressionsapparates, was sie für die Lebensfähigkeit des gesamten Organismus essenziell macht. Die leistungsstarke Methode Ribosome Profiling wurde bereits erfolgreich eingesetzt, um hochaufgelöste Bilder der zytosolischen Translationslandschaft von Arabidopsis thaliana zu erstellen, wobei Translation von der Hauptsequenz vorgelagerten, kodierenden Sequenzen und langen, nicht-kodierenden Transkripten identifiziert wurde. Ferner wurden mit dieser Technik Regulationen der Plastidentranslation und spezifische Regionen mit unterschiedlicher Elongationsgeschwindigkeit aufgedeckt. Es fehlen jedoch hochaufgelöste Datensätze des Chloroplasten-Translatoms. Chloroplastenisolation und Affinitätsaufreinigung chloroplastidiärer Ribosomen wurde verwendet, um hochangereicherte Ribosome Profiling-Datensätze des Chloroplastentranslatoms für Nicotiana tabacum im Dunkeln und unter Licht zu erzeugen. Wenngleich sich die Chloroplastenisolation als ungeeignet für eine unverfälschte Analyse der Translation im Chloroplast erwies, ermöglichte sie die Identifizierung von potentiellem co-translationalen Proteinimport. Die entsprechenden Datensätze spiegelten die Ergebnisse des zellulären Ribosome Profilings wider. Für psbA wurde im Licht erhöhte Translationsaktivität festgestellt. Alternative Initiationsmechanismen konnten durch spezifische Anreicherung der kleinen ribosomalen Untereinheit nicht verifiziert werden. Zusammenfassend, dies ist die erste Studie, die mittels Anreicherungsstrategien hochaufgelöste Ribosome Profiling-Datensätze zur Analyse von Ribosomuntereinheitsverteilungen und Chloroplast-assoziierter Translation nutzte. Ständig wechselnde Lichtintensitäten stellen die Photosynthesekapazität von photosynthetischen Organismen auf die Probe. Erhöhte Lichtintensitäten können zu einer Überreizung der photosynthetischen Reaktionszentren führen, was Beschädigungen von zentralen Komplexeinheiten der Photosysteme verursacht. Neben einem aufwändigen Reparaturmechanismus für das Photosystem II-Protein D1 entwickelte der photosynthetische Organismus verschiedene Mechanismen um lichtinduzierte Schäden zu reduzieren oder zu verhindern. Langfristig kommt es zu einer Anreicherung spezifischer Photosynthesekomplexen um eine effiziente Ausnutzung der erhöhten Strahlung zu gewährleisten. Der Beitrag der chloroplastidiäeren Genexpressionsregulation zum Akklimatisierungsprozess ist jedoch weitgehend unbekannt. Hier wurde ein vergleichendes Transkript- und Ribosomen Profiling für die frühen Zeitpunkte der Akklimatisierung unter Starklicht in Tabakchloroplasten in einem genomweiten Maßstab durchgeführt. Die Zeitverlaufsdaten zeigten ein unverändertes Transkriptniveau und nur geringe Änderungen der translationalen Aktivität von chloroplastidiären Genen im Hochlicht im Vergleich zu Kontrollproben. Die psbA-Translation war jedoch unter Hochlicht schon kurz nach Beginn bis zum Ende des Experiments um etwa das Zweifache erhöht. Der stressinduzierende Wechsel von Schwach- zu Hochlicht bewirkte ebenfalls eine auf psbA-beschränkt, erhöhte Translation. Die Ergebnisse zeigen, dass die Akklimatisierung im beobachteten Zeitrahmen nicht begonnen hatte und nur kurzfristige Reaktionen zur Verringerung der Photoinhibition wirksam gewesen sein konnten. KW - translation KW - chloroplast KW - high light KW - ribosome profiling Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-512680 ER - TY - THES A1 - Fontana, Federica T1 - Antagonistic activities of Vegfr3/Flt4 and Notch1b fine-tune mechanosensitive signaling during zebrafish cardiac valvulogenesis N2 - Cardiac valves are essential for the continuous and unidirectional flow of blood throughout the body. During embryonic development, their formation is strictly connected to the mechanical forces exerted by blood flow. The endocardium that lines the interior of the heart is a specialized endothelial tissue and is highly sensitive to fluid shear stress. Endocardial cells harbor a signal transduction machinery required for the translation of these forces into biochemical signaling, which strongly impacts cardiac morphogenesis and physiology. To date, we lack a solid understanding on the mechanisms by which endocardial cells sense the dynamic mechanical stimuli and how they trigger different cellular responses. In the zebrafish embryo, endocardial cells at the atrioventricular canal respond to blood flow by rearranging from a monolayer to a double-layer, composed of a luminal cell population subjected to blood flow and an abluminal one that is not exposed to it. These early morphological changes lead to the formation of an immature valve leaflet. While previous studies mainly focused on genes that are positively regulated by shear stress, the mechanisms regulating cell behaviors and fates in cells that lack the stimulus of blood flow are largely unknown. One key discovery of my work is that the flow-sensitive Notch receptor and Krüppel-like factor (Klf) 2, one of the best characterized flow-regulated transcriptional factors, are activated by shear stress but that they function in two parallel signal transduction pathways. Each of these two pathways is essential for the rearrangement of atrioventricular cells into an immature double-layered valve leaflets. A second key discovery of my study is the finding that both Notch and Klf2 signaling negatively regulate the expression of the angiogenesis receptor Vegfr3/Flt4, which becomes restricted to abluminal endocardial cells of the valve leaflet. Within these cells, Flt4 downregulates the expressions of the cell adhesion proteins Alcam and VE-cadherin. A loss of Flt4 causes abluminal endocardial cells to ectopically express Notch, which is normally restricted to luminal cells, and impairs valve morphology. My study suggests that abluminal endocardial cells that do not experience mechanical stimuli loose Notch expression and this triggers expression of Flt4. In turn, Flt4 negatively regulates Notch on the abluminal side of the valve leaflet. These antagonistic signaling activities and fine-tuned gene regulatory mechanisms ultimately shape cardiac valve leaflets by inducing unique differences in the fates of endocardial cells. N2 - Herzklappen sind essentiell für den kontinuierlichen und gerichteten Blutfluss durch den Körper. Während der Embryonalentwicklung ist die Bildung der Herzklappen stark von vom Blutfluss generierten, mechanischen Kräften abhängig. Das Endokard, ein endotheliales Gewebe, das das Herz im Inneren auskleidet, reagiert sehr sensibel auf biomechanische Einwirkungen. Endokardzellen weisen eine Signaltransduktionsmaschinerie auf, welche die Umwandlung dieser Kräfte in biochemische und elektrische Signale ermöglicht und somit unverzichtbar für die Herzmorphogenese und -physiologie ist. Allerdings fehlt uns noch immer das Verständnis der Mechanismen, mit denen Endokardzellen dynamische, biomechanische Signale wahrnehmen und wie verschiedene zelluläre Antworten ausgelöst werden können. Im Zebrafischembryo reagieren Endokardzellen im atrioventrikulärem Kanal auf Blutfluss induzierte Schubspannung mit einer Umorganisation, wobei sich aus einer Einzelschicht an Zellen eine Doppelschicht bildet. Letztere besteht aus einer luminalen Zellpopulation, die dem Blutstrom ausgesetzt ist und einer abluminalen Population, der der Kontakt zum Blut fehlt. Diese initialen morphologischen Veränderungen führen zur Ausbildung des frühen Herzklappensegels. Bisherige Studien berichteten im Besonderen über Gene die positiv von einer veränderten Schubspannung in Endokardzellen reguliert werden. Allerdings sind die Mechanismen, die das Verhalten und die Spezifizierung von den Zellen regulieren, die nicht in Kontakt mit dem Blutfluss sind, weitgehend unbekannt. Eine meiner Schlüsselentdeckungen in dieser Arbeit ist, dass zwei der am besten charakterisierten, durch Blutfluss transkriptional regulierten Faktoren, der Notch Rezeptor und der Krüppel-like factor (Klf) 2, durch Schubspannung aktiviert werden. Dies funktioniert auf zwei parallelen mechanosensitiven Signaltransduktionswegen und beide Kaskaden sind essentiell für die Umorganisation der atrioventrikulären Zellen während der Bildung der frühen zweischichtigen Klappensegeln. Eine zweite wichtige Entdeckung meiner Studien ist, dass die Expression des angiogenen Faktors Vegfr3/Flt4, die auf abluminale Endokardzellen im frühen Klappensegel beschränk ist, von beiden Signalwegen, Notch und KLf2, negativ reguliert wird. Außerdem veringert Flt4 die Expression der Zelladhäsionsproteine Alcam und VE-cadherin in abluminalen Zellen und führt die Herzklappenmorphogenese herbei. Der Verlust von Flt4 wiederum führt zu einer ektopischen Expression von Notch in abluminalen Endokardzellen, welche sonst nur in luminalen Zellen auftritt. Daher zeigt meine Arbeit, dass abluminale Endokardzellen, die keinem mechanischem Reiz ausgesetzt sind, Notch herunterregulieren und damit die Expression von Flt4 auslösen. Flt4 wiederum blockiert dann zusätzlich den Notch Signalweg in dieser Zellpopulation. Diese antagonistischen Signalaktivitäten und fein abgestimmte Genregulationsmechanismen sorgen für Unterschiede in der Spezifizierung der Endokardzellen und formen so schließlich die Segelklappen im Herz. KW - heart development KW - cardiac valves KW - zebrafish KW - mechanosensation KW - Herzklappe KW - Herzentwicklung KW - Mechanosensation KW - Zebrafisch Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-487517 ER - TY - THES A1 - Ghandour, Rabea T1 - Identification of chloroplast translational feedback regulation and establishment of aptamer based mRNA purification to unravel involved regulatory factors N2 - After endosymbiosis, chloroplasts lost most of their genome. Many former endosymbiotic genes are now nucleus-encoded and the products are re-imported post-translationally. Consequently, photosynthetic complexes are built of nucleus- and plastid-encoded subunits in a well-defined stoichiometry. In Chlamydomonas, the translation of chloroplast-encoded photosynthetic core subunits is feedback-regulated by the assembly state of the complexes they reside in. This process is called Control by Epistasy of Synthesis (CES) and enables the efficient production of photosynthetic core subunits in stoichiometric amounts. In chloroplasts of embryophytes, only Rubisco subunits have been shown to be feedback-regulated. That opens the question if there is additional CES regulation in embryophytes. I analyzed chloroplast gene expression in tobacco and Arabidopsis mutants with assembly defects for each photosynthetic complex to broadly answer this question. My results (i) confirmed CES within Rubisco and hint to potential translational feedback regulation in the synthesis of (ii) cytochrome b6f (Cyt b6f) and (iii) photosystem II (PSII) subunits. This work suggests a CES network in PSII that links psbD, psbA, psbB, psbE, and potentially psbH expression by a feedback mechanism that at least partially differs from that described in Chlamydomonas. Intriguingly, in the Cyt b6f complex, a positive feedback regulation that coordinates the synthesis of PetA and PetB was observed, which was not previously reported in Chlamydomonas. No evidence for CES interactions was found in the expression of NDH and ATP synthase subunits of embryophytes. Altogether, this work provides solid evidence for novel assembly-dependent feedback regulation mechanisms controlling the expression of photosynthetic genes in chloroplasts of embryophytes. In order to obtain a comprehensive inventory of the rbcL and psbA RNA-binding proteomes (including factors that regulate their expression, especially factors involved in CES), an aptamer based affinity purification method was adapted and refined for the specific purification these transcripts from tobacco chloroplasts. To this end, three different aptamers (MS2, Sephadex ,and streptavidin binding) were stably introduced into the 3’ UTRs of psbA and rbcL by chloroplast transformation. RNA aptamer based purification and subsequent chip analysis (RAP Chip) demonstrated a strong enrichment of psbA and rbcL transcripts and currently, ongoing mass spectrometry analyses shall reveal potential regulatory factors. Furthermore, the suborganellar localization of MS2 tagged psbA and rbcL transcripts was analyzed by a combined affinity, immunology, and electron microscopy approach and demonstrated the potential of aptamer tags for the examination of the spatial distribution of chloroplast transcripts. N2 - Nach der Endosymbiose wurde der größte Teil des Chloroplastengenoms in das Kerngenom transferiert. Die entsprechenden Genprodukte werden posttranslational wieder in die Chloroplasten importiert. Dementsprechend sind photosynthetische Proteinkomplexe aus plastidär- und kernkodierten Untereinheiten in definierter Stöchiometrie zusammengesetzt. In der einzelligen Grünalge Chlamydomonas ist die Translation von chloroplastenkodierten photosynthetischen Untereinheiten durch einen Rückkopplungsmechanismus in Abhängigkeit vom Assemblierungsstatus der entsprechenden Komplexe reguliert. Dieser „Control by Epistasy of Synthesis“ (CES) genannte Mechanismus erlaubt die effiziente Synthese von photosynthetischen Untereinheiten in den stöchiometrischen Mengen, die für die Assemblierung der Komplexe benötigt werden. In den Chloroplasten der Embryophyten wurde bisher nur die Translation von Rubisco als CES reguliert beschrieben. Daher stellt sich die Frage, ob derartige CES-Regulationen in Embryophyten auch in anderen Photosynthesekomplexen stattfinden. Um diese Frage zu beantworten, habe ich die chloroplastidäre Genexpression in Tabak- und Arabidopsismutanten mit Defekten in der Assemblierung photosynthetischer Komplexe untersucht. Meine Ergebnisse bestätigen (i) die bekannte CES Regulation von Rubisco und zeigen mögliche weitere assemblierungsabhängige Rückkopplungsregulationen in der Synthese des (ii) Cytochrom b6f (Cyt b6f) Komplexes sowie des (iii) Photosystems II (PSII). Insbesondere weisen meine Ergebnisse auf ein CES-Netzwerk hin, welches die Expressionen von psbD, psbA, psbB, psbE und wahrscheinlich auch psbH steuert und teilweise von der beschriebenen linearen CES-Kaskade in Chlamydomonas abweicht. Für die Synthese des Cyt b6f Komplexes wurde zudem eine positive Feedback-Regulation der Untereinheiten PetA und PetB beobachtet, die in Chlamydomonas nicht gezeigt wurde. Dagegen wurden für die NDH- und ATP Synthase-Komplexe keine Hinweise auf CES-Regulation in Embryophyten gefunden. Zusammenfassend zeigen meine Ergebnisse klare Belege für bisher unbekannte CES-Regulationen, welche die Expression von photosynthetischen Genen in Embryophyten steuern. Um das mRNA-Protein-Interaktom von rbcL und psbA zu bestimmen (einschließlich Faktoren, welche CES regulieren), wurde eine aptamer-basierte Affinitätsreinigungsmethode für die Anreicherung dieser Transkripte aus Tabakchloroplasten adaptiert und optimiert. Dazu wurden mittels Chloroplasten¬transformation drei verschiedene Aptamere (MS2, Sephadex- und Streptavidin-bindende Aptamere) stabil in den 3’UTR der Transkripte integriert. Die aptamer-basierte RNA-Aufreinigung und anschließende Chip-Analyse (RAP-Chip) zeigte die spezifische Anreicherung der psbA- bzw. rbcL-Transkripte. Die aktuell ausgeführte Massenspektrometrie zur Analyse der transkriptgebundenen Proteine soll potenziell regulatorische Faktoren identifizieren. Des Weiteren wurde die Lokalisation der MS2-markierten psbA- und rbcL-Transkripte innerhalb des Chloroplasten mittels Affinitäts¬immunologie und Elektronenmikroskopie untersucht und dabei gezeigt, dass die Aptamer-Markierung geeignet ist, um die Transkriptverteilung innerhalb von Organellen zu untersuchen. T2 - Identifikation translationaler Rückkopplungsregulationen in Chloroplasten und Etablierung einer aptamer-basierten mRNA-Anreicherungsmethode zur Entschlüsselung der beteiligten regulatorischen Faktoren KW - Translation KW - Ribosome profiling KW - Chloroplast gene expression KW - Translation feedback regulation KW - Protein complex assembly KW - Aptamers KW - Chloroplasten-Genexpression KW - Ribosome profiling KW - Proteinkomplexassemblierung KW - Translation KW - Translationsfeedbackregulation KW - Aptamer Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-482896 ER - TY - THES A1 - AL-Rawi, Shadha T1 - Biochemical studies to determine the role of Early Starvation 1 (ESV1) protein and its homologue Like-Early Starvation 1 (LESV) during starch degradation N2 - Depending on the biochemical and biotechnical approach, the aim of this work was to understand the mechanism of protein-glucan interactions in regulation and control of starch degradation. Although starch degradation starts with the phosphorylation process, the mechanisms by which this process is controlling and adjusting starch degradation are not yet fully understood. Phosphorylation is a major process performed by the two dikinases enzymes α-glucan, water dikinase (GWD) and phosphoglucan water dikinase (PWD). GWD and PWD enzymes phosphorylate the starch granule surface; thereby stimulate starch degradation by hydrolytic enzymes. Despite these important roles for GWD and PWD, so far the biochemical processes by which these enzymes are able to regulate and adjust the rate of phosphate incorporation into starch during the degradation process haven‘t been understood. Recently, some proteins were found associated with the starch granule. Two of these proteins are named Early Starvation Protein 1 (ESV1) and its homologue Like-Early Starvation Protein 1 (LESV). It was supposed that both are involved in the control of starch degradation, but their function has not been clearly known until now. To understand how ESV1 and LESV-glucan interactions are regulated and affect the starch breakdown, it was analyzed the influence of ESV1 and LESV proteins on the phosphorylating enzyme GWD and PWD and hydrolysing enzymes ISA, BAM, and AMY. However, the analysis determined the location of LESV and ESV1 in the chloroplast stroma of Arabidopsis. Mass spectrometry data predicted ESV1and LESV proteins as a product of the At1g42430 and At3g55760 genes with a predicted mass of ~50 kDa and ~66 kDa, respectively. The ChloroP program predicted that ESV1 lacks the chloroplast transit peptide, but it predicted the first 56 amino acids N-terminal region as a chloroplast transit peptide for LESV. Usually, the transit peptide is processed during transport of the proteins into plastids. Given that this processing is critical, two forms of each ESV1 and LESV were generated and purified, a full-length form and a truncated form that lacks the transit peptide, namely, (ESV1and tESV1) and (LESV and tLESV), respectively. Both protein forms were included in the analysis assays, but only slight differences in glucan binding and protein action between ESV1 and tESV1 were observed, while no differences in the glucan binding and effect on the GWD and PWD action were observed between LESV and tLESV. The results revealed that the presence of the N-terminal is not massively altering the action of ESV1 or LESV. Therefore, it was only used the ESV1 and tLESV forms data to explain the function of both proteins. However, the analysis of the results revealed that LESV and ESV1 proteins bind strongly at the starch granule surface. Furthermore, not all of both proteins were released after their incubation with starches after washing the granules with 2% [w/v] SDS indicates to their binding to the deeper layers of the granule surface. Supporting of this finding comes after the binding of both proteins to starches after removing the free glucans chains from the surface by the action of ISA and BAM. Although both proteins are capable of binding to the starch structure, only LESV showed binding to amylose, while in ESV1, binding was not observed. The alteration of glucan structures at the starch granule surface is essential for the incorporation of phosphate into starch granule while the phosphorylation of starch by GWD and PWD increased after removing the free glucan chains by ISA. Furthermore, PWD showed the possibility of starch phosphorylation without prephosphorylation by GWD. Biochemical studies on protein-glucan interactions between LESV or ESV1 with different types of starch showed a potentially important mechanism of regulating and adjusting the phosphorylation process while the binding of LESV and ESV1 leads to altering the glucan structures of starches, hence, render the effect of the action of dikinases enzymes (GWD and PWD) more able to control the rate of starch degradation. Despite the presence of ESV1 which revealed an antagonistic effect on the PWD action as the PWD action was decreased without prephosphorylation by GWD and increased after prephosphorylation by GWD (Chapter 4), PWD showed a significant reduction in its action with or without prephosphorylation by GWD in the presence of ESV1 whether separately or together with LESV (Chapter 5). However, the presence of LESV and ESV1 together revealed the same effect compared to the effect of each one alone on the phosphorylation process, therefore it is difficult to distinguish the specific function between them. However, non-interactions were detected between LESV and ESV1 or between each of them with GWD and PWD or between GWD and PWD indicating the independent work for these proteins. It was also observed that the alteration of the starch structure by LESV and ESV1 plays a role in adjusting starch degradation rates not only by affecting the dikinases but also by affecting some of the hydrolysing enzymes since it was found that the presence of LESV and ESV1leads to the reduction of the action of BAM, but does not abolish it. N2 - Ziel dieser Arbeit war es, den Mechanismus der Protein-Glucan-Wechselwirkungen bei der Regulation und Kontrolle des Stärkeabbaus zu verstehen. Der Stärkeabbau beginnt mit dem Phosphorylierungsprozess, der von den beiden Dikinasen, der a-Glucan, Wasserdikinase (GWD) und der Phosphoglucanwasserdikinase (PWD) durchgeführt wird. Kürzlich wurden einige Proteine gefunden, die mit dem Stärkegranulum assoziiert sind. Zwei dieser Proteine heißen Early Starvation 1 (ESV1) und das Homolog Like-Early Starvation (LESV), Es wurde vorgeschlagen, dass beide an der Kontrolle des Stärkeabbaus beteiligt sind, aber ihre Funktion ist bisher nicht bekannt. Um zu verstehen, wie ESV1- und LESV-Glucan-Wechselwirkungen reguliert werden und den Stärkeabbau beeinflussen, wurde der Einfluss der beiden Proteine auf die Phosphorylierungsenzyme GWD und PWD, sowie die Hydrolasen isoamylase, betaamylase, und alpha-amylase ntersucht. Dabei ergab die Analyse, dass LESV und ESV1 nicht nur stark an der Oberfläche, sondern auch in den tieferen Schichten der Stärkegranula binden. Obwohl beide Proteine in der Lage sind, an die Stärkestruktur zu binden, zeigte nur LESV eine Bindung an Amylose, während für ESV1 keine Bindung beobachtet werden konnte. Die Veränderung der Glucanstrukturen an der Oberfläche der Stärkekörner ist für den Einbau von Phosphat wesentlich, so nahm beispielsweise die Phosphorylierung der Stärke durch GWD und PWD nach Entfernung der freien Glucanketten mittels ISA zu. Darüber hinaus konnte ebenso gezeigt werden, dass PWD auch ohne eine Präphosphorylierung durch GWD die Glucosyleinheiten innerhalb der Stärke phosphorylieren kann. Die Bindung von LESV und ESV1 führt zu einer Veränderung der Glucanstrukturen von Stärken, wodurch die Aktivität der Dikinasen (GWD und PWD) und somit die Geschwindigkeit des Stärkeabbaus wahrscheinlich besser gesteuert werden kann. Es wurden keine Wechselwirkungen zwischen LESV und ESV1 oder zwischen jedem von ihnen mit GWD und PWD oder zwischen GWD und PWD festgestellt, was auf die unabhängige Arbeit von diesen Proteinen hinweist. Es wurde auch beobachtet, dass die Modifikation der Stärkestruktur durch LESV und ESV1 eine Rolle bei der Anpassung der Stärkeabbauraten spielt, nicht nur durch Beeinflussung der Dikinasen, sondern auch durch die Beeinflussung einiger hydrolysierender Enzyme wie BAM. Den so zeigte die Amylase eine eindeutige Reduktion ihrer katalytischen Wirkung in Präsenz von LESV und ESV1. Daraus resumierend kann davon ausgegangen werden, dass die beiden Proteine ESV1 und LESV für die Feinregulation des Stärkeabbaus von höchster Relevanz sind. T2 - Biochemische Studien zur Bestimmung der Rolle des ESV1-Proteins (Early Starvation 1) und seines Homologen Like-Early Starvation 1 (LESV) während des Stärkeabbaus KW - Early starvation protein KW - Like-Early starvation protein KW - Glucan water dikinase KW - Phosphoglucan water dikinase KW - Phosphorylation process KW - Starch metabolism KW - Early Starvation 1 KW - Glucan-Wasser-Dikinase KW - Like-Early Starvation 1 KW - Phosphoglucan-Wasser-Dikinase KW - Phosphorylierungsprozess KW - Stärkestoffwechsel Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-483956 ER - TY - THES A1 - Irmscher, Tobias T1 - Enzymatic remodelling of the exopolysaccharide stewartan network BT - implications for the diffusion of nano-sized objects BT - Implikationen für die Diffusion von nanogroßen Objekte N2 - In nature, bacteria are found to reside in multicellular communities encased in self-produced extracellular matrices. Indeed, biofilms are the default lifestyle of the bacteria which cause persistent infections in humans. The biofilm assembly protects bacterial cells from desiccation and limits the effectiveness of antimicrobial treatments. A myriad of biomolecules in the extracellular matrix, including proteins, exopolysaccharides, lipids, extracellular DNA and other, form a dense and viscoelastic three dimensional network. Many studies emphasized that a destabilization of the mechanical integrity of biofilm architectures potentially eliminates the protective shield and renders bacteria more susceptible to the immune system and antibiotics. Pantoea stewartii is a plant pathogen which infects monocotyledons such as maize and sweet corn. These bacteria produce dense biofilms in the xylem of infected plants which cause wilting of plants and crops. Stewartan is an exopolysaccharide which is produced by Pantoea stewartii and secreted as the major component to the extracellular matrix. It consists of heptasaccharide repeating units with a high degree of polymerization (2-4 MDa). In this work, the physicochemical properties of stewartan were investigated to understand the contributions of this exopolysaccharide to the mechanical integrity and cohesiveness of Pantoea stewartii biofilms. Therefore, a coarse-grained model of stewartan was developed with computational techniques to obtain a model for its three dimensional structural features. Here, coarse-grained molecular dynamic simulations revealed that the exopolysaccharide forms a hydrogel in which the exopolysaccharide chains arrange into a three dimensional mesh-like network. Simulations at different concentrations were used to investigate the influence of the water content on the network formation. Stewartan was further purified from 72 h grown Pantoea stewartii biofilms and the diffusion of bacteriophage and differently-sized nanoparticles (which ranged from 1.1 to 193 nm diameter) was analyzed in reconstituted stewartan solutions. Fluorescence correlation spectroscopy and single-particle tracking revealed that the stewartan network impeded the mobility of a set of differently-sized fluorescent particles in a size-dependent manner. Diffusion of these particles became more anomalous, as characterized by fitting the diffusion data to an anomalous diffusion model, with increasing stewartan concentrations. Further bulk and microrheological experiments were used to analyze the transitions in stewartan fluid behavior and stewartan chain entanglements were described. Moreover, it was noticed, that a small fraction of bacteriophage particles was trapped in small-sized pores deviating from classical random walks which highlighted the structural heterogeneity of the stewartan network. Additionally, the mobility of fluorescent particles also depended on the charge of the stewartan exopolysaccharide and a model of a molecular sieve for the stewartan network was proposed. The here reported structural features of the stewartan polymers were used to provide a detailed description of the mechanical properties of typically glycan-based biofilms such as the one from Pantoea stewartii. In addition, the mechanical properties of the biofilm architecture are permanently sensed by the embedded bacteria and enzymatic modifications of the extracellular matrix take place to address environmental cues. Hence, in this work the influence of enzymatic degradation of the stewartan exopolysaccharides on the overall exopolysaccharide network structure was analyzed to describe relevant physiological processes in Pantoea stewartii biofilms. Here, the stewartan hydrolysis kinetics of the tailspike protein from the ΦEa1h bacteriophage, which is naturally found to infect Pantoea stewartii cells, was compared to WceF. The latter protein is expressed from the Pantoea stewartii stewartan biosynthesis gene cluster wce I-III. The degradation of stewartan by the ΦEa1h tailspike protein was shown to be much faster than the hydrolysis kinetics of WceF, although both enzymes cleaved the β D GalIII(1→3)-α-D-GalI glycosidic linkage from the stewartan backbone. Oligosaccharide fragments which were produced during the stewartan cleavage, were analyzed in size-exclusion chromatography and capillary electrophoresis. Bioinformatic studies and the analysis of a WceF crystal structure revealed a remarkably high structural similarity of both proteins thus unveiling WceF as a bacterial tailspike-like protein. As a consequence, WceF might play a role in stewartan chain length control in Pantoea stewartii biofilms. N2 - In der Natur lagern sich Bakterien zu großen und komplexen Gemeinschaften zusammen, die als Biofilme bezeichnet werden. Diese multizellulären Biofilme sind der Ursprung vieler langlebiger und gefährlicher Infektionskrankheiten. Die bakteriellen Zellen produzieren und umgeben sich mit einen biofilm-spezifischen Schleim, der aus einer Unzahl von Biomolekülen, wie z.B. Exopolysaccharide, Lipide und extrazelluläre DNA, besteht. Diese Biofilmarchitektur schützt Bakterien vor Austrocknung und begrenzen die Wirksamkeit von antimikrobiellen Wirkstoffen (z.B. Antibiotika). Viele Studien haben gezeigt, dass die Destabilisierung der mechanischen Festigkeit des Biofilmapparates eine neue Behandlungsstrategie darstellt, in der das bakterielle Schutzschild eliminiert wird, sodass die Zellen wieder anfälliger gegenüber dem menschlichen Immunsystem oder Antibiotika werden. Pantoea stewartii ist ein Pflanzenpathogen, welches Mais und Süßmais befällt. Diese Bakterien produzieren Biofilme im Inneren der Pflanze, sodass der freie Wassertransport gestört wird. Daraufhin verwelken die Blätter und Früchte. In dieser Arbeit wurde das Exopolysaccharid Stewartan untersucht, welches lange Ketten ausbildet und als häufigste Komponente in den Biofilmen von Pantoea stewartii vorkommt. Dabei wurden die mechanischen Eigenschaften von Stewartan untersucht, um zu verstehen, wie diese den Biofilm beeinflussen. Dafür wurde eine Lösung aus mehreren Stewartan Molekülen computergestützt simuliert. Hierbei konnte beobachtet werden, dass die Stewartan Ketten ein dreidimensionales Netzwerk ausbilden, welches Poren aufweist. Außerdem wurde Stewartan aus Pantoea stewartii Biofilmen isoliert und die Diffusion von verschieden großen Nanopartikeln in dem Exopolysaccharidnetzwerk untersucht. Je höher die Stewartankonzentration war, desto mehr wurde die Diffusion der Nanopartikeln abgebremst. Außerdem wurden große Partikel stärker von dem Netzwerk zurückgehalten. Diese Untersuchungen wurden auf die Diffusion von Bakteriophagen, das sind Viren, die spezifisch Bakterien infizieren, ausgeweitet. Infolgedessen wurde gezeigt, dass Bakteriophagen in kleine Stewartanporen feststecken können. Die Diffusion all dieser Partikeln war aber auch abhängig von der Oberflächenladung des Partikels. Folglich bildet Stewartan ein Netzwerk aus, welches ganz spezifisch den Transport von Molekülen mit bestimmten Eigenschaften unterbindet. Außerdem ist bekannt, dass die Bakterien in der Lage sind, die mechanischen Eigenschaften des Biofilms zu modulieren, um sie an Veränderungen in der Umgebung anzupassen. Dies geschieht über bakterielle Enzyme. Daher wurde in dieser Arbeit der enzymatische Abbau von Stewartan untersucht, der eine dramatische Änderung der Eigenschaften des Biofilms zufolge haben kann. Dabei wurde die Stewartan Spaltung durch das Enzym WceF untersucht, welches von Pantoea stewartii produziert wird. Dieses Enzym spaltete die Stewartanketten nur sehr langsamen, sodass das Stewartannetzwerk erhalten blieb. Die Ergebnisse wurden mit dem tailspike Protein verglichen, welches von dem ΦEa1h Bakteriophagen produziert wird, dem natürlichen Feind des Bakteriums. Im Gegensatz zu WceF, baute das tailspike Protein Stewartan deutlich schneller ab und die gesamte mechanische Festigkeit des Netzwerkes wurde beseitigt. Beide Enzyme, trotz der unterschiedlichen Aktivität, besitzen eine sehr ähnliche Struktur, was vermuten lässt, dass sie von einem gleichen Vorgängerprotein abstammen. In dieser Arbeit wird vorgeschlagen, dass WceF möglicherweise in der Kettenlängekontrolle von Stewartan involviert ist. T2 - Enzymatische Remodellierung des Exopolysaccharid-Stewartan-Netzwerkes KW - biofilm KW - Pantoea stewartii KW - stewartan KW - exopolysaccharide KW - coarse grained molecular dynamics KW - microviscosity KW - Mikroviskosität KW - coarse grained Molekulardynamiken Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-472486 ER - TY - THES A1 - Siemiatkowska, Beata T1 - Redox signalling in plants N2 - Once proteins are synthesized, they can additionally be modified by post-translational modifications (PTMs). Proteins containing reactive cysteine thiols, stabilized in their deprotonated form due to their local environment as thiolates (RS-), serve as redox sensors by undergoing a multitude of oxidative PTMs (Ox-PTMs). Ox-PTMs such as S-nitrosylation or formation of inter- or intra-disulfide bridges induce functional changes in these proteins. Proteins containing cysteines, whose thiol oxidation state regulates their functions, belong to the so-called redoxome. Such Ox-PTMs are controlled by site-specific cellular events that play a crucial role in protein regulation, affecting enzyme catalytic sites, ligand binding affinity, protein-protein interactions or protein stability. Reversible protein thiol oxidation is an essential regulatory mechanism of photosynthesis, metabolism, and gene expression in all photosynthetic organisms. Therefore, studying PTMs will remain crucial for understanding plant adaptation to external stimuli like fluctuating light conditions. Optimizing methods suitable for studying plants Ox-PTMs is of high importance for elucidation of the redoxome in plants. This study focusses on thiol modifications occurring in plant and provides novel insight into in vivo redoxome of Arabidopsis thaliana in response to light vs. dark. This was achieved by utilizing a resin-assisted thiol enrichment approach. Furthermore, confirmation of candidates on the single protein level was carried out by a differential labelling approach. The thiols and disulfides were differentially labelled, and the protein levels were detected using immunoblot analysis. Further analysis was focused on light-reduced proteins. By the enrichment approach many well studied redox-regulated proteins were identified. Amongst those were fructose 1,6-bisphosphatase (FBPase) and sedoheptulose-1,7-bisphosphatase (SBPase) which have previously been described as thioredoxin system targeted enzymes. The redox regulated proteins identified in the current study were compared to several published, independent results showing redox regulated proteins in Arabidopsis leaves, root, mitochondria and specifically S-nitrosylated proteins. These proteins were excluded as potential new candidates but remain as a proof-of-concept to the enrichment experiments to be effective. Additionally, CSP41A and CSP41B proteins, which emerged from this study as potential targets of redox-regulation, were analyzed by Ribo-Seq. The active translatome study of csp41a mutant vs. wild-type showed most of the significant changes at end of the night, similarly as csp41b. Yet, in both mutants only several chloroplast-encoded genes were altered. Further studies of CSP41A and CSP41B proteins are needed to reveal their functions and elucidate the role of redox regulation of these proteins. N2 - Wenn Proteine synthetisiert sind, können sie zusätzlich noch post-translationelle Modifikationen (PTM) aufweisen. Proteine, die wegen ihres lokalen Umfeldes reaktive Cysteinthiole in ihrer stabilen deprotonierten Thiolat-Form aufweisen, dienen als Redoxsensoren indem sie eine Vielzahl von oxidativen PTMs (Ox-PTMs) enthalten können. Ox-PTMs wie die S-Nitrosylierung oder die Bildung von Inter- oder Intradisulfidbrücken induzieren funktionelle Veränderungen in diesen Proteinen. Cystein-haltige Proteine, deren Funktion durch diese Thioloxidierung gesteuert werden, gehören zu dem so genannten Redoxom. Die Ox-PTMs werden durch ortsspezifische zelluläre Prozesse gesteuert, die eine essentielle Rolle bei der Proteinregulation spielen und welche das katalytische Zentrum, die Ligandenbindungsaffinität, Protein-Protein-Interaktionen oder die Proteinstabilität beeinflussen können. Die umkehrbare Proteinthioloxidierung ist ein essentieller regulatorischer Mechanismus in der Photosynthese, dem Metabolismus und der Genexpression photosynthetischer Organismen. Es ist demnach wichtig PTMs zu untersuchen, um zu verstehen wie sich Pflanzen an externe Stimuli wie das Licht anpassen können. Es ist von großer Bedeutung für das Redoxom-Forschungsgebiet Methoden zur Untersuchung von pflanzlichen Ox-PTMs zu verbessern. Die vorliegende Arbeit konzentriert sich auf Thiolveränderungen, die in Pflanzen auftreten, und gibt einen Einblick in das in vivo Redoxom von Arabidopsis thaliana als Reaktion auf Licht oder Dunkelheit. Dieses wurde ermöglicht durch eine auf Harz-basierende Thiol-Anreicherung. Darüber hinaus konnten Kandidaten auf dem Einzelproteinlevel durch eine Differentialmarkierungsmethode bestätigt werden. Thiole und Disulfide wurden unterschiedlich markiert und die Proteine durch spezifische Antikörper mittels Proteinblotanalyse erkannt. Weitere Analysen fokussierten sich auf im Licht reduzierte Proteine. Durch die Anreicherungsmethode konnten viele bereits untersuchte redox-regulierte Proteine identifiziert werden. Unter diesen waren unter anderem die Fruktose-1,6-Bisphosphatase (FBPase) sowie die Seduheptulose-1,7-Bisphosphatase (SBPase), welche als Thioredoxin-gesteuerte Enzyme beschrieben sind. Die redox-regulierten Proteine, die in dieser Studie identifiziert werden konnten, wurden mit veröffentlichten unabhängigen Ergebnissen verglichen und dieses führte zu einer Vielzahl an redox-regulierten Proteinen in Arabidopsisblättern, -Wurzeln und -Mitochondrien sowie S-nitrosylierten Proteinen. Diese Proteine wurden zwar als neue potentielle Kandidaten ausgeschlossen, zeigten allerdings die Effektivität der Anreicherungsmethode. Darüber hinaus wurden die Proteine CSP41 A and CSP41 B, welche in dieser Studie als potentielle Ziele der Redox-Regulation identifiziert wurden, durch Ribo-seq analysiert. T2 - Redoxsignalisierung in Pflanzen KW - redox KW - signalling KW - plants KW - enrichments methods KW - post-translational modifications KW - oxidative protein modifications KW - Redox KW - Signalübertragung KW - Pflanzen KW - Anreicherungsmethoden KW - posttranslationale Modifikationen KW - oxidative Proteinmodifikationen Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-489119 ER - TY - THES A1 - Dehm, Daniel T1 - Development of concepts for the genomic mining of novel secondary metabolites in symbiotic cyanobacteria N2 - Naturstoffe sind seit der goldenen Ära der Antibiotika von immer größerem Interesse, sowohl für die Grundlagenforschung als auch die Angewandten Wissenschaften, da sie die Hauptquelle für neuartige Pharmazeutika mit starken antibiotischen, anti-entzündlichen und Antitumor-Aktivitäten darstellen. Neben den technologischen Fortschritten im Bereich der Hochdurchsatz Genomsequenzierung und dem verbesserten Verständnis des modularen Aufbaus der Biosynthesewege von Sekundärmetaboliten, kam es auch zu einem Wechsel vom labor-gestützten Screening aktiver Zellextrakte hin zum Algorithmen-basierten in silico Screening nach neuen Naturstoff-Biosyntheseclustern. Obwohl die steigende Zahl verfügbarer Genomsequenzen zeigte, dass nicht-ribosomale Peptid-Synthetasen (NRPS), Polyketid-Synthasen (PKS), und ribosomal synthetisierte und posttranslational modifizierte Peptide (RiPPs) ubiquitär in allen Sparten des Lebens gefunden werden können, so zeigen einige Phyla wie Actinobakterien oder Cyanobakterien eine besonders hohe Dichte an Sekundärmetabolitclustern. Der fakultativ symbiotische, N2-fixierende Modellorganismus N. punctiforme PCC73102 ist ein terrestrisches typ-IV Cyanobakterium, welches nicht nur einen besonders hohen Anteil seines Genoms der Produktion von Sekundärmetaboliten widmet, sondern zusätzlich noch genetisch modifizierbar ist. Eine AntiSMASH Analyse des Genoms zeigte, dass N. punctiforme insgesamt sechzehn potentielle Sekundärmetabolitcluster besitzt, von denen aber bis heute nur zweien ein spezifisches Produkt zugewiesen werden konnte. Das macht N. punctiforme zu einem perfekten Testorganismus für die Entwicklung eines neuartigen kombinatorischen Genomic Mining Ansatzes zur Detektion von bislang unbeschriebenen Naturstoffen. Der neuartige Ansatz, der im Rahmen dieser Studie entwickelt wurde, stellt eine Kombination aus Genomic Mining, unabhängigen Monitoring-Techniken sowie modifizierten Kultivierungsbedingungen dar und führte nicht nur zu neuen Erkenntnissen im Bereich cyanobakterieller Naturstoffsynthese, sondern letztlich auch zur Entdeckung eines neuen, von N. punctiforme produzierten, Naturstoffs. Die Herstellung und Untersuchung einer Reporterstamm Bibliothek, bestehend aus je einem CFP-produzierenden Transkriptionsreporter für jedes der sechzehn Sekundärmetabolitcluster von N. punctiforme, zeigte, dass im Gegensatz zur Erwartung nicht alle Biosynthesecluster für die man kein Produkt nachweisen kann auch nicht exprimiert werden. Stattdessen konnten klar definierbare Expressionsmuster beschrieben werden, was deutlich machte, dass die Naturstoffproduktion einer engen Regulation unterliegt und nur ein kleiner Teil der Biosynthesecluster unter Standardbedingungen tatsächlich still sind. Darüber hinaus führte die Erhöhung der Lichtintensität sowie der Kohlenstoffdioxid-Verfügbarkeit zusammen mit der Kultivierung von N. punctiforme zu extrem hohen Zelldichten zu einer starken Erhöhung der gesamten metabolischen Aktivität des Organismus. Nähere Untersuchungen der Zellextrakte dieser hoch-dichte Kultivierungen führten letztlich zur Entdeckung einer neuartigen Gruppe von Microviridinen mit verlängerter Peptidsequenz, welche Microviridin N3-N9 genannt wurden. Sowohl die Kultivierung der Transkriptionsreporter als auch die RTqPCR-basierte Untersuchung der Transkriptionslevel der verschiedenen Biosynthesecluster zeigten, dass die hoch-Zelldichte Kultivierung von N. punctiforme zu einer Aktivierung von 50% der vorhandenen Sekundärmetabolitcluster führt. Im Gegensatz zu dieser sehr breit-gefächerten Aktivierung, führt die Co-Kultivierung von N. punctiforme in chemischen oder physischen Kontakt zu einer N-gehungerten Wirtspflanze (Blasia pusilla) zu einer sehr spezifischen Aktivierung der RIPP4 und RiPP3 Biosynthesecluster. Obwohl dieser Effekt mittels verschiedener unabhängiger Methoden bestätigt werden konnte und trotz intensiver Analysebemühungen, konnte jedoch keinem der beiden Cluster ein Produkt zugeordnet werden. Diese Studie stellt die erste weitreichende, systematische Analyse eines cyanobakteriellen Sekundärmetaboloms durch einen kombinatorischen Ansatz aus Genomic Mining und unabhängigen Monitoring-Techniken dar und kann als neue strategische Herangehensweise für die Untersuchung anderer Organismen hinsichtlich ihrer Sekundärmetabolit-Produktion dienen. Obwohl es bereits gut beschriebene einzelne Sekundärmetabolite gibt, wie beispielweise den Zelldifferenzierungsfaktor PatS in Anabaena sp. PCC7120, so ist der Grad an Regulation der in dieser Studie gezeigt werden konnte bislang beispiellos und die Entschlüsselung dieser Mechanismen könnte die Entdeckung neuer Naturstoffe stark beschleunigen. Daneben lassen die Ergebnisse aber auch darauf schließen, dass die Induktion der Biosynthesewege nicht das eigentliche Problem darstellt, sondern vielmehr die verlässliche Detektion deren Produkte. Die Erarbeitung neuer Analytik-Strategien könnte somit auch einen deutlichen Einfluss auf die Geschwindigkeit der Entdeckung neuer Naturstoffe haben. N2 - Since the golden era of antibiotics natural products are of ever growing interest to both basic research and applied sciences as they are the main source of new bioactive compounds delivering lead structures for new pharmaceuticals with potent antibiotic, anti-inflammatory or anti-cancer activities. Alongside the technological advances in high-throughput genome sequencing and the better understanding of the general organization of those modular biosynthetic assembly lines of secondary metabolites, there was also a shift from wet-lab screening of active cell extracts towards algorithm-based in silico screening for new natural product biosynthesis gene clusters (BGCs). Although the increasing availability of full genome sequences revealed that such non-ribosomal peptide synthetases (NRPS), polyketide synthases (PKS) and ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides (RiPPs) can be found in all three kingdoms of life, certain phyla like actinobacteria and cyanobacteria show a very high density of these secondary metabolite BGCs. The facultative symbiotic, N2-fixing model organism N. punctiforme PCC73102 is a terrestrial type IV cyanobacterium that not only dedicates are very large fraction of its genome to secondary metabolite production but is also amenable to genetic modification. AntiSMASH analysis of the genome showed that there are sixteen potential secondary metabolite BGCs encoded in N. punctiforme, but until now there were only two compounds assigned to their respective BGC leaving the remaining fourteen orphan. This makes the organism a perfect subject for the establishment of a novel combinatorial genomic mining approach for the detection of new natural products. In the course of this study a combinatorial approach of genomic mining, independent monitoring techniques and alteration of cultivation conditions lead to new insights in cyanobacterial natural product biosynthesis and ultimately to the description of a novel compound produced by N. punctiforme. With the generation and investigation of a reporter strain library consisting of CFP-producing transcriptional reporter mutants for every predicted secondary metabolite BGC of N. punctiforme, it could be shown that natural product expression is in fact not silent for all those BGCs where no compound can be detected. Instead several distinct expression patterns could be described highlighting that secondary metabolite production is under tight regulation and only a minor fraction of these BGCs is in fact silent under standard laboratory conditions. Furthermore, increasing light intensity and carbon dioxide availability and cultivating N. punctiforme to very high cell densities had a tremendous impact on the overall metabolic activity of the organism. Investigation of high density cultivated cell extracts ultimately lead to the detection of a so far undescribed set of microviridins with unusual extended peptide sequences named Microviridin N3 – N9. Both cultivation of the transcriptional reporter mutants as well as RTqPCR-based detection of secondary metabolite BGC transcription levels revealed that in fact 50% of N. punctiforme’s natural product BGCs are upregulated under high cell density conditions. In contrast to this very broad response, co-cultivation of N. punctiforme in chemical or physical contact with a N-deprived host plant (Blasia pusilla) lead to a very specific upregulation of two natural product BGCs, namely RIPP3 and RIPP4. Although this response could be confirmed by various independent monitoring techniques and heavy analytical efforts were spent, no compound could be assigned to either of these BGCs. This study is the first in-depth systematic investigation of a cyanobacterial secondary metabolome by a combinatorial approach of genome mining and independent monitoring techniques that can serve as a new strategic approach to gain further insight into natural product synthesis of various organisms. Although there are single well described examples of secondary metabolites like the cell differentiation factor PatS in Anabaena sp. strain PCC 7120, the level and extent of regulation observed in this study is unprecedented and understanding of these mechanisms might be the key to streamline natural product discovery. However, the results of this study also highlight that induction of secondary metabolite BGCs is not the real challenge. Instead the new insights point towards analytical issues being a severe hurdle and finding reliable strategies to overcome these problems might as well drive natural product discovery. T2 - Entwicklung von Konzepten für das Genomic Mining von neuartigen Sekundärmetaboliten in symbiotischen Cyanobakterien KW - Cyanobacteria KW - Cyanobakterien KW - Natural Products KW - Naturstoffe KW - Genomic Mining KW - Secondary Metabolites KW - Sekundärmetabolite KW - Nostoc punctiforme Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-478342 ER - TY - THES A1 - Šustr, David T1 - Molecular diffusion in polyelectrolyte multilayers N2 - Research on novel and advanced biomaterials is an indispensable step towards their applications in desirable fields such as tissue engineering, regenerative medicine, cell culture, or biotechnology. The work presented here focuses on such a promising material: polyelectrolyte multilayer (PEM) composed of hyaluronic acid (HA) and poly(L-lysine) (PLL). This gel-like polymer surface coating is able to accumulate (bio-)molecules such as proteins or drugs and release them in a controlled manner. It serves as a mimic of the extracellular matrix (ECM) in composition and intrinsic properties. These qualities make the HA/PLL multilayers a promising candidate for multiple bio-applications such as those mentioned above. The work presented aims at the development of a straightforward approach for assessment of multi-fractional diffusion in multilayers (first part) and at control of local molecular transport into or from the multilayers by laser light trigger (second part). The mechanism of the loading and release is governed by the interaction of bioactives with the multilayer constituents and by the diffusion phenomenon overall. The diffusion of a molecule in HA/PLL multilayers shows multiple fractions of different diffusion rate. Approaches, that are able to assess the mobility of molecules in such a complex system, are limited. This shortcoming motivated the design of a novel evaluation tool presented here. The tool employs a simulation-based approach for evaluation of the data acquired by fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) method. In this approach, possible fluorescence recovery scenarios are primarily simulated and afterwards compared with the data acquired while optimizing parameters of a model until a sufficient match is achieved. Fluorescent latex particles of different sizes and fluorescein in an aqueous medium are utilized as test samples validating the analysis results. The diffusion of protein cytochrome c in HA/PLL multilayers is evaluated as well. This tool significantly broadens the possibilities of analysis of spatiotemporal FRAP data, which originate from multi-fractional diffusion, while striving to be widely applicable. This tool has the potential to elucidate the mechanisms of molecular transport and empower rational engineering of the drug release systems. The second part of the work focuses on the fabrication of such a spatiotemporarily-controlled drug release system employing the HA/PLL multilayer. This release system comprises different layers of various functionalities that together form a sandwich structure. The bottom layer, which serves as a reservoir, is formed by HA/PLL PEM deposited on a planar glass substrate. On top of the PEM, a layer of so-called hybrids is deposited. The hybrids consist of thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) -based hydrogel microparticles with surface-attached gold nanorods. The layer of hybrids is intended to serve as a gate that controls the local molecular transport through the PEM–solution-interface. The possibility of stimulating the molecular transport by near-infrared (NIR) laser irradiation is being explored. From several tested approaches for the deposition of hybrids onto the PEM surface, the drying-based approach was identified as optimal. Experiments, that examine the functionality of the fabricated sandwich at elevated temperature, document the reversible volume phase transition of the PEM-attached hybrids while sustaining the sandwich stability. Further, the gold nanorods were shown to effectively absorb light radiation in the tissue- and cell-friendly NIR spectral region while transducing the energy of light into heat. The rapid and reversible shrinkage of the PEM-attached hybrids was thereby achieved. Finally, dextran was employed as a model transport molecule. It loads into the PEM reservoir in a few seconds with the partition constant of 2.4, while it spontaneously releases in a slower, sustained manner. The local laser irradiation of the sandwich, which contains the fluorescein isothiocyanate tagged dextran, leads to a gradual reduction of fluorescence intensity in the irradiated region. The release system fabricated employs renowned photoresponsivity of the hybrids in an innovative setting. The results of the research are a step towards a spatially-controlled on-demand drug release system that paves the way to spatiotemporally controlled drug release. The approaches developed in this work have the potential to elucidate the molecular dynamics in ECM and to foster engineering of multilayers with properties tuned to mimic the ECM. The work aims at spatiotemporal control over the diffusion of bioactives and their presentation to the cells. N2 - Die Forschung an neuartigen und komplexen Biomaterialien ist unabdingbar für deren Einsatz in begehrten Bereichen wie der Gewebezüchtung, regenerativen Medizin, Zellkultivierung und Biotechnologie. Die hier vorgelegte Arbeit beschäftigt sich eingehend mit einem dieser vielversprechenden Materialien: Polyelektrolytische Multilayers (PEM), die aus Hyaluronsäure (Hyaluronic Acid, HA) und Poly-L-Lysin (PLL) zusammengesetzt sind. Diese gelartige Polymerbeschichtung ermöglicht es, (Bio-) Moleküle wie z.B. Proteine oder Medikamente zu akkumulieren und diese kontrolliert wieder abzugeben. Durch ihre Zusammensetzung und intrinsischen Merkmale können die PEM der Imitation einer Extrazellulären Matrix (ECM) dienen. Diese Eigenschaften machen die HA/PLL-PEM zu einem Anwärter auf verschiedene Bio-Anwendungen, wie den oben genannten. Die vorliegende Arbeit zielt auf die Entwicklung eines Ansatzes zur Einschätzung der multi-fraktionellen Diffusion in Multilayers (1. Teil), und auf die Kontrolle des lokalen molekularen Transports in und aus den Multilayers durch Laser-Stimulation (2. Teil). Der Aufnahme- und Freisetzungsmechanismus wird bestimmt von der Wechselwirkung zwischen Bioaktiva und den Bestandteilen der Multilayers, sowie allgemein vom Diffusionsprozess. Der Diffusion eines Molekül in HA/PLL-PEM weist unterschiedliche Diffusionsraten einzelner Molekülbestandteile auf. Derzeit existieren nur wenige Ansätze zur Einschätzung der Mobilität von Molekülen in derart komplexen Systemen. Diesem Mangel will die vorliegende Arbeit durch das Design eines neuartigen Evaluations-Instruments abhelfen. Dieses Instrument bedient sich eines simulationsbasierten Ansatzes zur Evaluation von Daten, die durch die fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) -Methode erfasst wurden. Der Ansatz simuliert zunächst mögliche Szenarien der Fluoreszenz-Rückbildung, um diese anschließend mit Messdaten zu vergleichen; dazu werden Modell-Parameter angepasst, um suffiziente Vergleichswerte zu erzielen. Fluoreszierende Latex-Partikel verschiedener Größe und eine Fluoresceinlösung wurden als Kontroll- und Vergleichs-Proben verwendet, um die Ergebnisse zu überprüfen. Zusätzlich wurde die Diffusion des Proteins Cytochrom C in eine HA/PLL-PEM ausgewertet. Dieses Instrument weitet die Möglichkeiten der Analyse von spatiotemporären FRAP-Daten, die aus der multi-fraktionellen Diffusion stammen, erheblich und gleichzeitig ist es vielseitig einsetzbar. Das Instrument hat das Potential, die Mechanismen des Molekültransports weiter zu erhellen, und eine gezielte Steuerung der Freisetzung medikamentöser Wirkstoffe zu ermöglichen. Der zweite Teil der Arbeit widmet sich der Erstellung eines Systems zur spatiotemporären Wirkstofffreisetzung, das sich die HA/PLL-PEM zunutze macht. Dieses Freisetzungssystem umfasst verschiedene Lagen mit jeweils unterschiedlichen Funktionsweisen, die zusammen ein „Sandwich“ bilden. Die zugrundeliegende Schicht aus HA/PLL-PEM auf einem planaren Glassubstrat dient als Reservoir. Auf diese PEM ist eine Schicht sogenannter Hybride aufgebracht. Die Hybride bestehen aus thermoresponsiven Poly-N-Isopropylacrylamid (PNIPAM) -basierten Hydrogel-Mikropartikeln auf deren Gold-Nanostäbchen gebunden sind. Die Hybridschicht dient in der räumlichen Kontrolle des lokalen Molekültransports als „Schlupfloch“ an der Schnittstelle von PEM und Lösung. Die Möglichkeit der Stimulation des molekülaren Transports durch Bestrahlung mit einem Nah-Infrarot-Laser (NIR) wird hier untersucht. Von den mehreren getesteten Ansätzen zur Aufbringung von Hybriden auf die PEM-Oberfläche stellte sich die Trocknung als beste Möglichkeit heraus. Funktionalitätskontrollen des hergestellten Sandwiches bei erhöhter Temperatur ergaben eine reversible Volumenphasenübergang der PEM-gebundenen Hybride, wobei die Sandwich-Struktur erhalten blieb. Weiterhin wurde eine effektive Lichtabsorption durch die Gold-Nanostäbchen in den gewebe- und zellschonenden NIR-Spektrumsbereich gezeigt, wobei die aufgenommene Lichtenergie in Wärme umgewandelt wurde. Dadurch wurde eine schnelle und reversible Schrumpfung der PEM-gebundenen Hybride erreicht. Zuguterletzt wird Dextran als Modellmolekül für den Transport eingesetzt. Dieses wird in wenigen Sekunden – mit einem Verteilungskoeffizient von 2,4 – in das PEM-Reservoir aufgenommen, während es auf langsamere, anhaltende Weise freigesetzt wird. Die lokale Laser-Bestrahlung des Dextran-FITC-haltigen Sandwiches bewirkte eine schrittweise Reduktion der Fluoreszenz-Intensität in der bestrahlten Region. Das hier vorgestellte Molekül-Freisetzungssystem verwendet die vielzitierte Photoresponsivität von Hybriden auf neuartige Weise. Die Ergebnisse der Untersuchung bedeuten einen Fortschritt in Richtung eines räumlich kontrollierten, nach Bedarf steuerbaren Freisetzungs-Systems, das wiederum den Weg zu einer spatiotemporären Kontrollierbarkeit der Wirkstoff-Freisetzung bereiten könnte. Die in dieser Arbeit entwickelten Ansätze ermöglichen ein besseres Verständnis der Dynamik in der ECM, sowie die Entwicklung ECM-ähnlicher Multilayers. Die Arbeit hat die spatiotemporäre Kontrolle der Diffusion von bioaktiven Stoffen und deren Präsentation gegenüber Zellen zum Ziel. T2 - Molekulare Diffusion in Polyelektrolyt-Multischichten KW - polyelectrolyte multilayers KW - diffusion KW - simulation KW - FRAP KW - microgel KW - drug release KW - PNIPAM KW - IR laser KW - assessment of the diffusion KW - mulifractional diffusion KW - spatially and temporally controlled drug release KW - ordering of particles on the surface KW - close packing KW - dichteste Packung KW - Diffusion KW - Einschätzung der Diffusion KW - Wirkstoff-Freisetzun KW - Mikrogel KW - multi-fraktionelle Diffusion KW - Ordnung der Partikel auf der Oberfläche KW - Polyelektrolyt-Multischichten KW - Simulation KW - räumlich und zeitlich kontrollierte Wirkstoff-Freisetzung KW - FRAP KW - IR laser KW - PNIPAM Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-489038 ER - TY - THES A1 - Zhang, Jianrui T1 - Completely water-based emulsions as compartmentalized systems via pickering stabilization N2 - Completely water-based systems are of interest for the development of novel material for various reasons: On one hand, they provide benign environment for biological systems and on the other hand they facilitate effective molecular transport in a membrane-free environment. In order to investigate the general potential of aqueous two-phase systems (ATPSs) for biomaterials and compartmentalized systems, various solid particles were applied to stabilize all-aqueous emulsion droplets. The target ATPS to be investigated should be prepared via mixing of two aqueous solutions of water-soluble polymers, which turn biphasic when exceeding a critical polymer concentration. Hydrophilic polymers with a wide range of molar mass such as dextran/poly(ethylene glycol) (PEG) can therefore be applied. Solid particles adsorbed at the interfaces can be exceptionally efficient stabilizers forming so-called Pickering emulsions, and nanoparticles can bridge the correlation length of polymer solutions and are thereby the best option for water-in-water emulsions. The first approach towards the investigation of ATPS was conducted with all aqueous dextran-PEG emulsions in the presence of poly(dopamine) particles (PDP) in Chapter 4. The water-in-water emulsions were formed with a PEG/dextran system via utilizing PDP as stabilizers. Studies of the formed emulsions were performed via laser scanning confocal microscope (CLSM), optical microscope (OM), cryo-scanning electron microscope (SEM) and tensiometry. The stable emulsions (at least 16 weeks) were demulsified easily via dilution or surfactant addition. Furthermore, the solid PDP at the water-water interface were crosslinked in order to inhibit demulsification of the Pickering emulsion. Transmission electron microscope (TEM) and scanning electron microscope (SEM) were used to visualize the morphology of PDP before and after crosslinking. PDP stabilized water-in-water emulsions were utilized in the following Chapter 5 to form supramolecular compartmentalized hydrogels. Here, hydrogels were prepared in pre-formed water-in-water emulsions and gelled via α-cyclodextrin-PEG (α-CD-PEG) inclusion complex formation. Studies of the formed complexes were performed via X-ray powder diffraction (XRD) and the mechanical properties of the hydrogels were measured with oscillatory shear rheology. In order to verify the compartmentalized state and its triggered decomposition, hydrogels and emulsions were assessed via OM, SEM and CLSM. The last chapter broadens the investigations from the previous two systems by utilizing various carbon nitrides (CN) as different stabilizers in ATPS. CN introduces another way to trigger demulsification, namely irradiation with visible light. Therefore, emulsification and demulsification with various triggers were probed. The investigated all aqueous multi-phase systems will act as model for future fabrication of biocompatible materials, cell micropatterning as well as separation of compartmentalized systems. N2 - Komplett wässrige Systeme sind aus vielerlei Hinsicht interessant für die Entwicklung neuer Materialien: Zum Einen eignet sich die wässrige Umgebung für Anwendung in biologischen System und zum Anderen ermöglicht eine Membran-freie Umgebung erleichterten Stofftransport. In dieser Arbeit wurden verschiedene Partikeltypen zur Stabilisierung von Wasser-in-Wasser Emulsionströpfchen eingesetzt, um das Potenzial von ATPSs (Aqueous two-phase systems (DE: Wässrige Zweiphasensysteme)) für Biomaterialien und kompartmentalisierte Systeme zu untersuchen. Das zu untersuchende ATPS sollte durch Mischen von zwei wässrigen Lösungen wasserlöslicher Polymere hergestellt werden und bei Überschreiten einer kritischen Polymerkonzentration zweiphasig werden. Als hydrophile Polymer wurden Dextran und Poly(ethylenglycol) (PEG) für die Bildung des ATPS angewendet. Die Grenzfläche zwischen den beiden Phasen in ATPSs ist undefiniert und erstreckt sich über einen Bereich, deshalb müssen Partikel für die Stabilisierung des ATPS eingesetzt werden. Die an den Grenzflächen adsorbierten Partikel können effizient als Stabilisatoren fungieren und die sogenannten Pickering-Emulsionen bilden. Der erste Ansatz der Untersuchung von Wasser-in-Wasser Emulsionen wurde mit dem Dextran-PEG-System in Gegenwart von Poly(dopamin)-Partikeln (PDP) als Stabilisatoren durchgeführt. Die bis zu 16 Wochen stabilen Emulsionen konnten mittels Verdünnung oder Tensidzugabe gebrochen werden. Weiterhin wurde die stabilisierenden PDP vernetzt, um eine Deemulgierung der Pickering-Emulsion zu verhindern. Des Weiteren wurden PDP stabiliserte Emulsionen verwednet, um supramolekulare kompartmentalisierte Hydrogele herzustellen. Hier wurden Hydrogele in vorgeformten Wasser-in-Wasser-Emulsionen hergestellt und über die Bildung des α-Cyclodextrin-PEG Komplexes geliert. Die gebildeten Komplexe wurden mittels XRD erforscht und die mechanischen Eigenschaften der Hydrogele mit Rheologie gemessen. Zuletzt wurde die Forschung der zwei vorherigen erwähnten Systemen erweitert, indem verschiedene Kohlenstoffnitride (CN) als Stabilisatoren in ATPS verwendet wurden. Der Einsatz von CN ermöglichte dabei einen weiteren Stimulus zur Deemulgierung, nämlich sichtbares Licht. So wurden Emulgierung und Deemulgierung mit verschiedenen äußeren Reizen untersucht. Die verschiedenen Wasser-in-Wasser Emulsionen werden ein Modell für die zukünftige Herstellung biokompatibler Materialien, die örtlche Zellstrukturierung sowie die Trennung von Kompartimentsystemen liefern. T2 - Vollständig wasserbasierte Pickeringemulsionen als Kompartimentsysteme KW - emulsion KW - water-in-water KW - ATPS KW - Emulsionen KW - Wasser-in-Wasser Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-476542 ER - TY - THES A1 - Crawford, Michael Scott T1 - Using individual-based modeling to understand grassland diversity and resilience in the Anthropocene N2 - The world’s grassland systems are increasingly threatened by anthropogenic change. Susceptible to a variety of different stressors, from land-use intensification to climate change, understanding the mechanisms driving the maintenance of these systems’ biodiversity and stability, and how these mechanisms may shift under human-mediated disturbance, is thus critical for successfully navigating the next century. Within this dissertation, I use an individual-based and spatially-explicit model of grassland community assembly (IBC-grass) to examine several processes, thought key to understanding their biodiversity and stability and how it changes under stress. In the first chapter of my thesis, I examine the conditions under which intraspecific trait variation influences the diversity of simulated grassland communities. In the second and third chapters of my thesis, I shift focus towards understanding how belowground herbivores influence the stability of these grassland systems to either a disturbance that results in increased, stochastic, plant mortality, or eutrophication. Intraspecific trait variation (ITV), or variation in trait values between individuals of the same species, is fundamental to the structure of ecological communities. However, because it has historically been difficult to incorporate into theoretical and statistical models, it has remained largely overlooked in community-level analyses. This reality is quickly shifting, however, as a consensus of research suggests that it may compose a sizeable proportion of the total variation within an ecological community and that it may play a critical role in determining if species coexist. Despite this increasing awareness that ITV matters, there is little consensus of the magnitude and direction of its influence. Therefore, to better understand how ITV changes the assembly of grassland communities, in the first chapter of my thesis, I incorporate it into an established, individual-based grassland community model, simulating both pairwise invasion experiments as well as the assembly of communities with varying initial diversities. By varying the amount of ITV in these species’ functional traits, I examine the magnitude and direction of ITV’s influence on pairwise invasibility and community coexistence. During pairwise invasion, ITV enables the weakest species to more frequently invade the competitively superior species, however, this influence does not generally scale to the community level. Indeed, unless the community has low alpha- and beta- diversity, there will be little effect of ITV in bolstering diversity. In these situations, since the trait axis is sparsely filled, the competitively inferior may suffer less competition and therefore ITV may buffer the persistence and abundance of these species for some time. In the second and third chapters of my thesis, I model how one of the most ubiquitous trophic interactions within grasslands, herbivory belowground, influences their diversity and stability. Until recently, the fundamental difficulty in studying a process within the soil has left belowground herbivory “out of sight, out of mind.” This dilemma presents an opportunity for simulation models to explore how this understudied process may alter community dynamics. In the second chapter of my thesis, I implement belowground herbivory – represented by the weekly removal of plant biomass – into IBC-grass. Then, by introducing a pulse disturbance, modelled as the stochastic mortality of some percentage of the plant community, I observe how the presence of belowground herbivores influences the resistance and recovery of Shannon diversity in these communities. I find that high resource, low diversity, communities are significantly more destabilized by the presence of belowground herbivores after disturbance. Depending on the timing of the disturbance and whether the grassland’s seed bank persists for more than one season, the impact of the disturbance – and subsequently the influence of the herbivores – can be greatly reduced. However, because human-mediated eutrophication increases the amount of resources in the soil, thus pressuring grassland systems, our results suggest that the influence of these herbivores may become more important over time. In the third chapter of my thesis, I delve further into understanding the mechanistic underpinnings of belowground herbivores on the diversity of grasslands by replicating an empirical mesocosm experiment that crosses the presence of herbivores above- and below-ground with eutrophication. I show that while aboveground herbivory, as predicted by theory and frequently observed in experiments, mitigates the impact of eutrophication on species diversity, belowground herbivores counterintuitively reduce biodiversity. Indeed, this influence positively interacts with the eutrophication process, amplifying its negative impact on diversity. I discovered the mechanism underlying this surprising pattern to be that, as the herbivores consume roots, they increase the proportion of root resources to root biomass. Because root competition is often symmetric, herbivory fails to mitigate any asymmetries in the plants’ competitive dynamics. However, since the remaining roots have more abundant access to resources, the plants’ competition shifts aboveground, towards asymmetric competition for light. This leads the community towards a low-diversity state, composed of mostly high-performance, large plant species. We further argue that this pattern will emerge unless the plants’ root competition is asymmetric, in which case, like its counterpart aboveground, belowground herbivory may buffer diversity by reducing this asymmetry between the competitively superior and inferior plants. I conclude my dissertation by discussing the implications of my research on the state of the art in intraspecific trait variation and belowground herbivory, with emphasis on the necessity of more diverse theory development in the study of these fundamental interactions. My results suggest that the influence of these processes on the biodiversity and stability of grassland systems is underappreciated and multidimensional, and must be thoroughly explored if researchers wish to predict how the world’s grasslands will respond to anthropogenic change. Further, should researchers myopically focus on understanding central ecological interactions through only mathematically tractable analyses, they may miss entire suites of potential coexistence mechanisms that can increase the coviability of species, potentially leading to coexistence over ecologically-significant timespans. Individual-based modelling, therefore, with its focus on individual interactions, will prove a critical tool in the coming decades for understanding how local interactions scale to larger contexts, and how these interactions shape ecological communities and further predicting how these systems will change under human-mediated stress. N2 - Grasland ist durch anthropogene Veränderungen bedroht. Im Rahmen dieser Dissertation verwende ich ein individuelles und räumlich-explizites Modell der Grasland-Gemeinschaftsversammlung (IBC-Gras), um verschiedene Prozesse zu untersuchen, die als Schlüssel zum Verständnis ihrer Biodiversität und Stabilität und deren Veränderung unter Stress gelten. Im ersten Kapitel meiner Dissertation untersuche ich die Bedingungen, unter denen eine intraspezifische Merkmalsvariation die Vielfalt der simulierten Graslandgemeinschaften beeinflusst. Im zweiten und dritten Kapitel meiner Dissertation verlege ich den Schwerpunkt auf das Verständnis, wie unterirdische Pflanzenfresser die Stabilität dieser Grünlandsysteme beeinflussen, und zwar entweder durch eine Störung, die zu erhöhter, stochastischer Pflanzensterblichkeit oder Eutrophierung führt. Intraspezifische Merkmalsvariation (ITV) oder Variation der Merkmalswerte zwischen Individuen derselben Art ist für die Struktur ökologischer Gemeinschaften von grundlegender Bedeutung. Da sie sich jedoch historisch gesehen nur schwer in theoretische und statistische Modelle einbauen lässt, wurde sie bei Analysen auf Gemeindeebene weitgehend übersehen. Diese Realität ändert sich jedoch schnell, da ein Forschungskonsens darauf hindeutet, dass sie einen beträchtlichen Anteil der Gesamtvariation innerhalb einer ökologischen Gemeinschaft ausmachen kann und dass sie eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung der Koexistenz von Arten spielen kann. Trotz dieses zunehmenden Bewusstseins, dass das ITV von Bedeutung ist, gibt es kaum einen Konsens über das Ausmaß und die Richtung seines Einflusses. Um besser zu verstehen, wie ITV die Zusammensetzung von Grünlandgesellschaften verändert, beziehe ich daher im ersten Kapitel meiner Dissertation diese in ein etabliertes, auf dem Individuum basierendes Modell der Grünlandgesellschaften ein. Indem ich die Menge an ITV in den funktionellen Merkmalen dieser Arten variiere, untersuche ich das Ausmaß und die Richtung des Einflusses von ITV auf die paarweise Unsichtbarkeit und die Koexistenz von Gemeinschaften. Im zweiten und dritten Kapitel meiner Dissertation modelliere ich, wie eine der allgegenwärtigsten trophischen Interaktionen innerhalb von Grasland, die Pflanzenfresserei unter der Erde, deren Vielfalt und Stabilität beeinflusst. Bis vor kurzem hat die grundlegende Schwierigkeit, einen Prozess im Boden zu untersuchen, dazu geführt, dass Pflanzenfresser unter der Erde "aus den Augen, aus dem Sinn" geraten sind. Dieses Dilemma bietet eine Gelegenheit für Simulationsmodelle zu erforschen, wie dieser noch nicht untersuchte Prozess die Dynamik von Gemeinschaften verändern kann. Im zweiten Kapitel meiner Dissertation implementiere ich unterirdische Pflanzenfresserei - repräsentiert durch die wöchentliche Entfernung von pflanzlicher Biomasse - in IBC-Gras. Dann beobachte ich durch die Einführung einer Pulsstörung, die als stochastische Mortalität eines gewissen Prozentsatzes der Pflanzengemeinschaft modelliert wird, wie die Anwesenheit von unterirdischen Pflanzenfressern die Resistenz und Erholung der Shannon-Diversität in diesen Gemeinschaften beeinflusst. Ich stelle fest, dass Gemeinschaften mit hohen Ressourcen und geringer Diversität durch die Anwesenheit von unterirdischen Pflanzenfressern nach einer Störung wesentlich stärker destabilisiert werden. Abhängig vom Zeitpunkt der Störung und davon, ob die Saatgutbank des Graslandes länger als eine Saison besteht, können die Auswirkungen der Störung - und damit der Einfluss der Pflanzenfresser - stark reduziert werden. Im dritten Kapitel meiner Dissertation vertiefe ich das Verständnis der mechanistischen Grundlagen der unterirdischen Herbivoren für die Diversität von Grasland, indem ich ein empirisches Mesokosmos-Experiment repliziere, das die Anwesenheit von Herbivoren über- und unterirdisch mit Eutrophierung kreuzt. Ich zeige, dass, während oberirdische Pflanzenfresser, wie von der Theorie vorhergesagt und häufig in Experimenten beobachtet, die Auswirkungen der Eutrophierung auf die Artenvielfalt abschwächen, unterirdische Pflanzenfresser die Artenvielfalt kontraintuitiv reduzieren. Tatsächlich interagiert dieser Einfluss positiv mit dem Eutrophierungsprozess und verstärkt seine negativen Auswirkungen auf die Vielfalt. Ich schließe meine Dissertation mit einer Erörterung der Auswirkungen meiner Forschung auf den Stand der Technik bei der Variation intraspezifischer Merkmale und der unterirdischen Pflanzenfresserei, wobei der Schwerpunkt auf der Notwendigkeit einer vielfältigeren Theorieentwicklung bei der Untersuchung dieser grundlegenden Wechselwirkungen liegt. Meine Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Einfluss dieser Prozesse auf die biologische Vielfalt und Stabilität von Graslandsystemen unterschätzt wird und mehrdimensional ist und gründlich erforscht werden muss, wenn Forscher vorhersagen wollen, wie die Grasländer der Welt auf anthropogene Veränderungen reagieren werden. Sollten sich Forscherinnen und Forscher darüber hinaus myopisch darauf konzentrieren, zentrale ökologische Wechselwirkungen nur durch mathematisch nachvollziehbare Analysen zu verstehen, könnten sie ganze Suiten potenzieller Koexistenzmechanismen übersehen, die die Begehrlichkeit von Arten erhöhen können und möglicherweise zu einer Koexistenz über ökologisch signifikante Zeitspannen hinweg führen. Daher wird sich die individuenbasierte Modellierung mit ihrem Schwerpunkt auf individuellen Interaktionen in den kommenden Jahrzehnten als ein entscheidendes Instrument erweisen, um zu verstehen, wie lokale Interaktionen sich auf größere Zusammenhänge ausdehnen und wie diese Interaktionen ökologische Gemeinschaften formen, und um weiter vorherzusagen, wie sich diese Systeme unter vom Menschen verursachtem Stress verändern werden. T2 - Einsatz von individualbasierten Modellen zum Verständnis der Grasland-Diversität und -Resilienz im Anthropozän KW - intraspecific trait variation KW - eutrophication KW - belowground herbivory KW - grassland KW - ecological modelling KW - intraspezifische Merkmalsvariation KW - Eutrophierung KW - Grasland KW - ökologische Modellierung KW - unterirdische Pflanzenfresser Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-479414 ER - TY - THES A1 - Folkertsma, Remco T1 - Evolutionary adaptation to climate in microtine mammals N2 - Understanding how organisms adapt to their local environment is a major focus of evolutionary biology. Local adaptation occurs when the forces of divergent natural selection are strong enough compared to the action of other evolutionary forces. An improved understanding of the genetic basis of local adaptation can inform about the evolutionary processes in populations and is of major importance because of its relevance to altered selection pressures due to climate change. So far, most insights have been gained by studying model organisms, but our understanding about the genetic basis of local adaptation in wild populations of species with little genomic resources is still limited. With the work presented in this thesis I therefore set out to provide insights into the genetic basis of local adaptation in populations of two voles species: the common vole (Microtus arvalis) and the bank vole (Myodes glareolus). Both voles species are small mammals, they have a high evolutionary potential compared to their dispersal capabilities and are thus likely to show genetic responses to local conditions, moreover, they have a wide distribution in which they experience a broad range of different environmental conditions, this makes them an ideal species to study local adaptation. The first study focused on producing a novel mitochondrial genome to facilitate further research in M. arvalis. To this end, I generated the first mitochondrial genome of M. arvalis using shotgun sequencing and an iterative mapping approach. This was subsequently used in a phylogenetic analysis that produced novel insights into the phylogenetic relationships of the Arvicolinae. The following two studies then focused on the genetic basis of local adaptation using ddRAD-sequencing data and genome scan methods. The first of these involved sequencing the genomic DNA of individuals from three low-altitude and three high-altitude M. arvalis study sites in the Swiss Alps. High-altitude environments with their low temperatures and low levels of oxygen (hypoxia) pose considerable challenges for small mammals. With their small body size and proportional large body surface they have to sustain high rates of aerobic metabolism to support thermogenesis and locomotion, which can be restricted with only limited levels of oxygen available. To generate insights into high-altitude adaptation I identified a large number of single nucleotide polymorphisms (SNPs). These data were first used to identify high levels of differentiation between study sites and a clear pattern of population structure, in line with a signal of isolation by distance. Using genome scan methods, I then identified signals of selection associated with differences in altitude in genes with functions related to oxygen transport into tissue and genes related to aerobic metabolic pathways. This indicates that hypoxia is an important selection pressure driving local adaptation at high altitude in M. arvalis. A number of these genes were linked with high-altitude adaptation in other species before, which lead to the suggestion that high-altitude populations of several species have evolved in a similar manner as a response to the unique conditions at high altitude The next study also involved the genetic basis of local adaptation, here I provided insights into climate-related adaptation in M. glareolus across its European distribution. Climate is an important environmental factor affecting the physiology of all organisms. In this study I identified a large number of SNPs in individuals from twelve M. glareolus populations distributed across Europe. I used these, to first establish that populations are highly differentiated and found a strong pattern of population structure with signal of isolation by distance. I then employed genome scan methods to identify candidate loci showing signals of selection associated with climate, with a particular emphasis on polygenic loci. A multivariate analysis was used to determine that temperature was the most important climate variable responsible for adaptive genetic variation among all variables tested. By using novel methods and genome annotation of related species I identified the function of genes of candidate loci. This showed that genes under selection have functions related to energy homeostasis and immune processes. Suggesting that M. glareolus populations have evolved in response to local temperature and specific local pathogenic selection pressures. The studies presented in this thesis provide evidence for the genetic basis of local adaptation in two vole species across different environmental gradients, suggesting that the identified genes are involved in local adaptation. This demonstrates that with the help of novel methods the study of wild populations, which often have little genomic resources available, can provide unique insights into evolutionary processes. N2 - Ein Schwerpunkt der Evolutionsbiologie besteht darin, zu verstehen, wie sich Organismen an ihre lokale Umgebung anpassen. Lokale Anpassung tritt ein, wenn die Kräfte der divergierenden natürlichen Selektion im Vergleich zu anderen evolutionären Kräften stark genug sind. Ein verbessertes Verständnis der genetischen Grundlagen der lokalen Anpassung kann Informationen über die Evolutionsprozesse in Populationen liefern und ist durch seine Relevanz für durch den Klimawandel bedingte veränderte Selektionsdrücke von großer Bedeutung. Bisher wurden die meisten Erkenntnisse durch Untersuchungen an Modellorganismen gewonnen. Jedoch ist das Verständnis der genetischen Grundlagen der lokalen Anpassung in Wildpopulationen von Arten mit geringen genomischen Ressourcen noch immer begrenzt. Mit den in dieser Doktorarbeit vorgestellten Untersuchungen war es daher mein Ziel, Einblicke in die genetischen Grundlagen der lokalen Anpassung in Populationen von zwei Wühlmausarten zu geben: der Feldmaus (Microtus arvalis) und der Rötelmaus (Myodes glareolus). Bei beiden handelt es sich um kleine Säugetiere mit einem, im Vergleich zu ihrer Ausbreitungsfähigkeit, hohen Evolutionspotential. Daher ist anzunehmen, dass sie genetische Reaktionen auf lokale Bedingungen zeigen. Hinzu kommt, dass sie aufgrund ihrer großen Verbreitung ein großes Spektrum an verschiedenen Umweltbedingungen erfahren, was sie zu einer idealen Spezies, für die Untersuchung lokaler Anpassung macht. Die erste Studie dieser Arbeit konzentrierte sich auf die Erstellung eines bisher nicht verfügbaren mitochondriellen Genoms, um die weitere Forschung an M. arvalis zu erleichtern. Dies wurde mittels Shotgun-Sequenzierung und eines iterativen Kartierungsansatzes erreicht. Anschließend wurde es in einer phylogenetischen Analyse verwendet, die neue Erkenntnisse über die phylogenetischen Beziehungen der Arvicolinae lieferte. Die folgenden zwei Studien konzentrierten sich auf die genetische Basis der lokalen Anpassung unter Verwendung von ddRAD-Sequenzierungsdaten und Genom-Scan-Methoden. Die erste umfasste die Sequenzierung der genomischen DNA von Individuen aus drei M. arvalis-Untersuchungsgebieten in geringer Höhe und drei in großer Höhe in den Schweizer Alpen. Umgebungen in großer Höhe mit niedrigen Temperaturen und niedrigem Sauerstoffgehalt (Hypoxie) stellen kleine Säugetiere vor erhebliche Herausforderungen. Aufgrund ihrer geringen Körpergröße und proportional großen Körperoberfläche müssen sie hohe aerobe Stoffwechselraten aufrechterhalten, um die Thermogenese und Fortbewegung zu unterstützen, die mit begrenzter Sauerstoffverfügbarkeit eingeschränkt sein können. Um Einblicke in die Höhenanpassung zu erhalten, habe ich eine große Anzahl von Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs) identifiziert. Mit Hilfe dieser Daten wurden ein hohes Maß an Differenzierung zwischen den Untersuchungsorten und ein klares Muster der Populationsstruktur zusammen mit einem isolation-by-distance Signal identifiziert. Unter Verwendung von Genom-Scan-Methoden identifizierte ich Selektionssignale in Genen, die mit Höhenunterschieden verbunden werden. Diese besitzen Funktionen, die mit dem Sauerstofftransport in das Gewebe sowie mit aeroben Stoffwechselwegen zusammenhängen. Dies weist darauf hin, dass Hypoxie ein wichtiger Selektionsdruck für die lokale Anpassung in großer Höhe für M. arvalis ist. Einige dieser Gene sind bereits früher mit der Höhenanpassung bei anderen Arten in Verbindung gebracht worden. Dies führte zu der Annahme, dass sich Populationen in großer Höhe lebender verschiedener Arten in Anpassung an die einzigartigen Bedingungen in großer Höhe auf ähnliche Weise entwickelt haben. Die nächste Studie befasste sich ebenfalls mit den genetischen Grundlagen der lokalen Anpassung. Hier stellte ich Erkenntnisse über die klimabedingte Anpassung von M. glareolus in ihrem europäischen Verbreitungsgebiet vor. Das Klima ist ein wichtiger Umweltfaktor, der die Physiologie aller Organismen beeinflusst. In dieser Studie identifizierte ich zehntausende SNPs bei Individuen aus zwölf in ganz Europa verteilten M. glareolus-Populationen. Diese ergaben eine starke Differenzierung der Populationen mit deutlicher Populationsstruktur und einem Signal für isolation-by-distance. Anschließend verwendete ich Genom-Scan-Methoden, um mögliche Loci zu identifizieren, die mit dem Klima verbundene Selektionssignale aufweisen, wobei der Schwerpunkt dabei auf polygenen Loci lag. Eine Multivariaten Analysemethode ermittelte, dass die Temperatur die wichtigste Klimavariable unter allen getesteten Variablen ist, die für die adaptive genetische Variation verantwortlich ist. Mit Hilfe neuartiger Methoden und der Annotation von Genomen verwandter Spezies identifizierte ich die Funktion von Genen an Kandidatenloci. Diese zeigten, dass die unter Selektion stehenden Gene Funktionen im Zusammenhang mit der Energiehomöostase und den Immunprozessen ausüben. Dies wiederum deutet darauf hin, dass sich die Populationen von M. glareolus in Reaktion auf die lokale Temperatur und den spezifischen lokalen Selektionsdruck für Krankheitserreger entwickelt haben. Die in dieser Arbeit vorgestellten Studien liefern Belege für die genetische Basis der lokalen Anpassung auf verschiedene Umweltgradienten in zwei Wühlmausarten. Dies deutet darauf hin, dass die identifizierten Gene an der lokalen Anpassung beteiligt sind. Darüber hinaus zeigt dies, dass Untersuchungen wildlebender Populationen mit geringen genomischen Ressourcen durch den Einsatz neuartiger Methoden einzigartige Einblicke in evolutionäre Prozesse ermöglichen können. T2 - Evolutionäre Klimaanpassungen bei Wühlmausarten KW - Genomics KW - Local adaptation KW - Altitude KW - Climate KW - Microtus arvalis KW - Myodus glareolus KW - Höhe KW - Klima KW - Genomik KW - lokale Anpassung KW - Feldmaus KW - Rötelmaus Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-476807 ER - TY - THES A1 - Alirezaeizanjani, Zahra T1 - Movement strategies of a multi-mode bacterial swimmer N2 - Bacteria are one of the most widespread kinds of microorganisms that play essential roles in many biological and ecological processes. Bacteria live either as independent individuals or in organized communities. At the level of single cells, interactions between bacteria, their neighbors, and the surrounding physical and chemical environment are the foundations of microbial processes. Modern microscopy imaging techniques provide attractive and promising means to study the impact of these interactions on the dynamics of bacteria. The aim of this dissertation is to deepen our understanding four fundamental bacterial processes – single-cell motility, chemotaxis, bacterial interactions with environmental constraints, and their communication with neighbors – through a live cell imaging technique. By exploring these processes, we expanded our knowledge on so far unexplained mechanisms of bacterial interactions. Firstly, we studied the motility of the soil bacterium Pseudomonas putida (P. putida), which swims through flagella propulsion, and has a complex, multi-mode swimming tactic. It was recently reported that P. putida exhibits several distinct swimming modes – the flagella can push and pull the cell body or wrap around it. Using a new combined phase-contrast and fluorescence imaging set-up, the swimming mode (push, pull, or wrapped) of each run phase was automatically recorded, which provided the full swimming statistics of the multi-mode swimmer. Furthermore, the investigation of cell interactions with a solid boundary illustrated an asymmetry for the different swimming modes; in contrast to the push and pull modes, the curvature of runs in wrapped mode was not affected by the solid boundary. This finding suggested that having a multi-mode swimming strategy may provide further versatility to react to environmental constraints. Then we determined how P. putida navigates toward chemoattractants, i.e. its chemotaxis strategies. We found that individual run modes show distinct chemotactic responses in nutrition gradients. In particular, P. putida cells exhibited an asymmetry in their chemotactic responsiveness; the wrapped mode (slow swimming mode) was affected by the chemoattractant, whereas the push mode (fast swimming mode) was not. These results can be seen as a starting point to understand more complex chemotaxis strategies of multi-mode swimmers going beyond the well-known paradigm of Escherichia coli, that exhibits only one swimming mode. Finally we considered the cell dynamics in a dense population. Besides physical interactions with their neighbors, cells communicate their activities and orchestrate their population behaviors via quorum-sensing. Molecules that are secreted to the surrounding by the bacterial cells, act as signals and regulate the cell population behaviour. We studied P. putida’s motility in a dense population by exposing the cells to environments with different concentrations of chemical signals. We found that higher amounts of chemical signals in the surrounding influenced the single-cell behaviourr, suggesting that cell-cell communications may also affect the flagellar dynamics. In summary, this dissertation studies the dynamics of a bacterium with a multi-mode swimming tactic and how it is affected by the surrounding environment using microscopy imaging. The detailed description of the bacterial motility in fundamental bacterial processes can provide new insights into the ecology of microorganisms. N2 - Bakterien gehören zu den am weitesten verbreiteten Mikroorganismen mit einer essentiellen Bedeutung in vielen biologischen und okologischen Prozessen. Bakterien können entweder als unabhängige Individuen oder in organisierten Gemeinschaften leben. Auf dem Level einer einzelnen Zelle sind Interaktionen zwischen Bakterien, ihren Nachbarn und des umgebenden physikalischen und chemischen Umwelt die Grundlage von mikrobiellen Prozessen. Mikroskopische Bildgebungs techniken bieten attraktive und vielversprechende Möglichkeiten den Einfluß dieses Interaktionen auf die Dynamik von Bakterien zu untersuchen. Das ziel dieser Dissertation ist es, vier fundamentale bakterielle Prozesse mittels Lebendzell-Mikroskopie besser zu verstehen – die Einzelzellbewegung, die Chemotaxis, die Wechselwirkungen der Bakterien mit der Umgebung und ihre Kommunikation mit Nachbarzellen. Durch die Untersuchung dieser Prozesse konnten wir das Wissen über die bisher ungeklärten Mechanismen der bakteriellen Interaktionen erweitern. Als Erstes untersuchten wir die Fortbewegung des Bodenbakteriums Pseudomonas putida (P. putida), welches mit Hilfe eines Flagellenantriebs schwimmt und eine komplexe multi-mode Schwimmstrategie aufweist. Kürzlich wurde veröffentlich, dass P. putida mehrere unterschiedliche Schwimmmodi besitzt – die Flagellen können den Zellkörper nach vorne drücken (push) oder ziehen (pull) oder sich um ihn wickeln (wrap). Unter Verwendung einer neuen Methode, der kombinierten Phasenkontrast- und Fluoreszenzmikroskopie, konnten die Schwimmmodi (push, pull oder wrap) für jede Schwimmphase automatisch aufgenommen werden, was eine vollständige Schwimmstatistik des multi-mode Schwimmers lieferte. Weiterhin zeigte die Untersuchung von Interaktionen mit einer festen Grenzschicht eine Asymmetrie bezüglich der verschiedenen Schwimmmodi. Im Gegensatz zu push und pull, der wrapped Modus nicht durch die feste Grenzschicht beeinflusst. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass eine multi-mode Schwimmstrategie dem Bakterium weitere möglichkeiten bietet, sich an die Umgebungsbedingungen anzupassen. Als Nächstes haben wir bestimmt, wie P. putida in Richtung eines Lockstoffes navigiert (Chemotaxis). Wir haben herausgefunden, dass einzelne Schwimmmodi eine unterschiedliche chemotaktische Antwort in Nährstoff-gradienten zeigen. P. putida besitzt eine Asymmetrie in seiner chemotaktischen Ansprechbarkeit: der wrapped Modus (langsamer Schwimmmodus) wird vom Lockstoff beeinflusst, der push Modus (schneller Schwimmmodus) hingegen nicht. Diese Ergebnisse können als Ausgangspunkt gesehen werden, um komplexere Chemotaxisstrategien von mulit-mode Schwimmern zu verstehen, die über das bekannte Musterbeispiel Escherichia coli hinaus gehen, des nur einen schwimmmodus aufweist. schließend haben wir die Zelldynamik in dichten Kulturen untersucht. Neben den physikalischen Interaktionen mit den Nachbarzellen, kommunizieren zellen ihre Aktivitäten und organisieren ihr Populationsverhalten über quorum sensing. Moleküle, die von den Bakterienzellen in die Umgebung sekretiert werden, wirken als Signale und regulieren das Verhalten der Zellpopulation. Wir haben die Bewegung von P. putida in hoher Zelldichte untersucht, indem wir die Zellen unterschiedlichen Konzentrationen dieses Moleküle aussetzten. Wir haben festgestellt, dass größere Mengen dieser signalstoffe in der Umgebung die Einzelzelldynamik beeinflusst haben. Dies lässt uns vermuten, dass sich die Zell-Zell-Kommunikation auch auf die Flagellendynamik auswirkt. Zusammenfassend zeigt diese Dissertation mittels Mikroskopie die Dynamik von einem Bakterium mit multi-mode Schwimmstrategie und wie die umgebende Umwelt diese Dynamik beeinflußt. Die detaillierte Beschreibung der Bakterienmotilität in grundlegenden bakteriellen Prozessen kann neue Erkenntnisse für die ökologie der Mikroorganismen bringen. T2 - Bewegungsstrategien von bakteriellenmulti-mode Schwimmern KW - Single-cell motility KW - Einzelzellbewegung KW - Chemotaxis KW - Chemotaxis KW - Flagellen KW - Flagella KW - Bacteria KW - Bakterien Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-475806 ER - TY - THES A1 - Banerjee, Pallavi T1 - Glycosylphosphatidylinositols (GPIs) and GPI-anchored proteins tethered to lipid bilayers BT - modelling a complex interplay of carbohydrates, proteins and lipids BT - Modellierung eines komplexen Zusammenspiels von Kohlenhydraten, Proteinen und Lipiden N2 - Glycosylphosphatidylinositols (GPIs) are highly complex glycolipids that serve as membrane anchors to a large variety of eukaryotic proteins. These are covalently attached to a group of peripheral proteins called GPI-anchored proteins (GPI-APs) through a post-translational modification in the endoplasmic reticulum. The GPI anchor is a unique structure composed of a glycan, with phospholipid tail at one end and a phosphoethanolamine linker at the other where the protein attaches. The glycan part of the GPI comprises a conserved pseudopentasaccharide core that could branch out to carry additional glycosyl or phosphoethanolamine units. GPI-APs are involved in a diverse range of cellular processes, few of which are signal transduction, protein trafficking, pathogenesis by protozoan parasites like the malaria- causing parasite Plasmodium falciparum. GPIs can also exist freely on the membrane surface without an attached protein such as those found in parasites like Toxoplasma gondii, the causative agent of Toxoplasmosis. These molecules are both structurally and functionally diverse, however, their structure-function relationship is still poorly understood. This is mainly because no clear picture exists regarding how the protein and the glycan arrange with respect to the lipid layer. Direct experimental evidence is rather scarce, due to which inconclusive pictures have emerged, especially regarding the orientation of GPIs and GPI-APs on membrane surfaces and the role of GPIs in membrane organization. It appears that computational modelling through molecular dynamics simulations would be a useful method to make progress. In this thesis, we attempt to explore characteristics of GPI anchors and GPI-APs embedded in lipid bilayers by constructing molecular models at two different resolutions – all-atom and coarse-grained. First, we show how to construct a modular molecular model of GPIs and GPI-anchored proteins that can be readily extended to a broad variety of systems, addressing the micro-heterogeneity of GPIs. We do so by creating a hybrid link to which GPIs of diverse branching and lipid tails of varying saturation with their optimized force fields, GLYCAM06 and Lipid14 respectively, can be attached. Using microsecond simulations, we demonstrate that GPI prefers to “flop-down” on the membrane, thereby, strongly interacting with the lipid heads, over standing upright like a “lollipop”. Secondly, we extend the model of the GPI core to carry out a systematic study of the structural aspects of GPIs carrying different side chains (parasitic and human GPI variants) inserted in lipid bilayers. Our results demonstrate the importance of the side branch residues as these are the most accessible, and thereby, recognizable epitopes. This finding qualitatively agrees with experimental observations that highlight the role of the side branches in immunogenicity of GPIs and the specificity thereof. The overall flop-down orientation of the GPIs with respect to the bilayer surface presents the side chain residues to face the solvent. Upon attaching the green fluorescent protein (GFP) to the GPI, it is seen to lie in close proximity to the bilayer, interacting both with the lipid heads and glycan part of the GPI. However the orientation of GFP is sensitive to the type of GPI it is attached to. Finally, we construct a coarse-grained model of the GPI and GPI-anchored GFP using a modified version of the MARTINI force-field, using which the timescale is enhanced by at least an order of magnitude compared to the atomistic system. This study provides a theoretical perspective on the conformational behavior of the GPI core and some of its branched variations in presence of lipid bilayers, as well as draws comparisons with experimental observations. Our modular atomistic model of GPI can be further employed to study GPIs of variable branching, and thereby, aid in designing future experiments especially in the area of vaccines and drug therapies. Our coarse-grained model can be used to study dynamic aspects of GPIs and GPI-APs w.r.t plasma membrane organization. Furthermore, the backmapping technique of converting coarse-grained trajectory back to the atomistic model would enable in-depth structural analysis with ample conformational sampling. N2 - Glykosylphosphatidyl-Inositole (GPIs) sind komplex Glykolipide, die insbesondere auf der Oberfläche eukaryotischer Zellen als Verankerung einer Reihe unterschiedlicher Proteine dienen. GPIs werden den Proteinen als post-translationale Modifikationen im endoplasmotischen Reticulum hinzugefügt. Die Verankerung in der Membran wird durch einen Phospholipidrest hergestellt, das Protein ist dann über ein sich daran anschließendes Pseudo-Pentasaccharid und einen Phospoethanolaminrest kovalent an den GPI Anker gebunden. Das Pseudo-Pentasaccharid ist dabei proteinunabhängig eine invariante Struktur, kann aber an bestimmten Stellen durch weitere Carbohydratseitenketten und/oder Phosphoethanolaminreste wesentlich erweitert werden. GPI-verankerte Proteine (engl. GPI-anchored proteins, GPI-APs) sind an einer Reihe zellulärer Prozesse beteiligt; einige davon betreffen intra- und interzelluläre Signalübermittlung oder Proteintransport auf der Zelloberfläche; die Pathogenese vieler Parasiten, wie etwa Plasmodium falciparum (Malaria) wird entscheidend durch GPI-APs bestimmt; es können aber auch die bei vielen parasitischen Einzellern freien, ohne Protein auftretenden GPIs pathogene Wirkung entfalten wie etwa bei der Toxoplasmose (Toxoplasma gondii). Der allgemeine Zusammenhang von Struktur eines GPI-AP und seiner Funktion ist allerdings bis heute zum größten Teil unbekannt. Dies liegt zum einen daran, dass sich kein klares Bild zeichnen lässt, wie ein GPI-AP relativ zur Zellmembran exponiert wird. Die relevanten Zeit- und Längenskalen sind experimentell unzugänglich, und entsprechende in vivo oder in vitro Untersuchungen liefern lediglich indirekte Hinweise. Der Fall GPI-verankerter Proteine ist daher ein Beispiel, in dem computergestützte Modellierung einen wesentlichen Beitrag zur Aufklärung leisten kann. In der vorliegenden Arbeit wird zunächst ein atomistisches, molekulardynamisches Modell für GPIs und GPI-APs konstruiert und vorgestellt, mit dem sich GPI-APs auf der Längenskala einiger 10 Nanometer und einer Zeitskala von etwa 10 Mikrosekunden effizient untersuchen lassen. Modularität des Modells ist hierbei ein entscheidender Aspekt: mit den entwickelten Modellen lassen sich eine breite Palette von GPI Variationen darstellen. GPIs weisen, wie auch andere Proteinglykolysierungen eine sogenannte Mikroheterogenität auf; die Modifikation durch den Zucker kann sich zwischen den Kopien ein und desselben Proteins unterscheiden. Die technische Umsetzung erfolgt im Rahmen der sogenannten AMBER- Familie atomistischer Kraftfelder, die nach einem bestimmten Schema für biomolekulare Simulationen entwickelt wurden. Dabei werden existierende Modelle für Zucker (GLYCAM06) und Lipide (Lipid14) durch die Optimierung und Herleitung fehlender Parameter so angepasst, dass sich ein vollständiges GPI-AP in einer Lipid-Doppelschicht darstellen lässt. Dabei zeigt sich, dass das Protein vermittelt über den flexiblen Anker über einen beachtlichen Bewegungsspielraum verfügt. Im Falle des hier betrachteten Green Fluorescent Protein (GFP) kann man daher das Bild einer festen Orientierung des Proteins in Bezug auf die Lipidoberfläche verwerfen; wie in der Mehrzahl der Simulationen beobachtet, kann das GFP sogar vollständig auf der Lipidschicht zu liegen kommen. Weiterhin konnte nachgewiesen werden, dass eine Reihe möglicher Seitenketten des GPI Ankers, die zu Parasiten wie Toxoplasma gondii gehören und bei entsprechenden Immunreaktionen relevant sind, tatsächlich so exponiert werden, dass ihre Rolle als Rezeptoren unterstrichen wird. Das Pseudopentasaccharid selbst ist dabei teilweise in die Kopfgruppenregion der Lipidschicht eingebettet. Des Weiteren wurde hier das atomistische Modell auf eine vergröberte Darstellung im Rahmen des MARTINI Kraftfelds projiziert, um die zugänglichen Zeit- und Längenskalen noch einmal um einen Faktor 10 zu erweitern. Somit werden auch Studien GPI-APs möglich, bei denen sich ihre Dynamik in heterogenen Lipidschichten untersuchen lässt, etwa um Fragen zu beantworten, wie diese Proteine mit verschiedenen Membrandomänen assoziieren. Insgesamt werden mit dieser Arbeit eine Reihe von Ansätzen aufgezeigt, wie sich GPI verankerte Proteine möglicherweise effektiver in speziell angepassten Experimenten und in größerem Detail untersuchen lassen, als dies bisher möglich war. T2 - Glykosylphosphatidylinositole (GPIs) und GPI-verankerte Proteine, die an Lipid-Doppelschichten gebunden sind KW - GPI KW - carbohydrates KW - membrane KW - protein KW - molecular dynamics KW - coarse-graining KW - martini KW - GPI KW - Kohlenhydrate KW - grobkörnig KW - martini KW - Membran KW - Molekular-dynamik KW - Protein Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-489561 ER - TY - THES A1 - Liu, Qi T1 - Influence of CO2 degassing on microbial community distribution and activity in the Hartoušov degassing system, western Eger Rift (Czech Republic) N2 - The Cheb Basin (CZ) is a shallow Neogene intracontinental basin located in the western Eger Rift. The Cheb Basin is characterized by active seismicity and diffuse degassing of mantle-derived CO2 in mofette fields. Within the Cheb Basin, the Hartoušov mofette field shows a daily CO2 flux of 23–97 tons. More than 99% of CO2 released over an area of 0.35 km2. Seismic active periods have been observed in 2000 and 2014 in the Hartoušov mofette field. Due to the active geodynamic processes, the Cheb Basin is considered to be an ideal region for the continental deep biosphere research focussing on the interaction of biological processes with geological processes. To study the influence of CO2 degassing on microbial community in the surface and subsurface environments, two 3-m shallow drillings and a 108.5-m deep scientific drilling were conducted in 2015 and 2016 respectively. Additionally, the fluid retrieved from the deep drilling borehole was also recovered. The different ecosystems were compared regarding their geochemical properties, microbial abundances, and microbial community structures. The geochemistry of the mofette is characterized by low pH, high TOC, and sulfate contents while the subsurface environment shows a neutral pH, and various TOC and sulfate contents in different lithological settings. Striking differences in the microbial community highlight the substantial impact of elevated CO2 concentrations and high saline groundwater on microbial processes. In general, the microorganisms had low abundance in the deep subsurface sediment compared with the shallow mofette. However, within the mofette and the deep subsurface sediment, the abundance of microbes does not show a typical decrease with depth, indicating that the uprising CO2-rich groundwater has a strong influence on the microbial communities via providing sufficient substrate for anaerobic chemolithoautotrophic microorganisms. Illumina MiSeq sequencing of the 16S rRNA genes and multivariate statistics reveals that the pH strongly influences the microbial community composition in the mofette, while the subsurface microbial community is significantly influenced by the groundwater which motivated by the degassing CO2. Acidophilic microorganisms show a much higher relative abundance in the mofette. Meanwhile, the OTUs assigned to family Comamonadaceae are the dominant taxa which characterize the subsurface communities. Additionally, taxa involved in sulfur cycling characterizing the microbial communities in both mofette and CO2 dominated subsurface environments. Another investigated important geo–bio interaction is the influence of the seismic activity. During seismic events, released H2 may serve as the electron donor for microbial hydrogenotrophic processes, such as methanogenesis. To determine whether the seismic events can potentially trigger methanogenesis by the elevated geogenic H2 concentration, we performed laboratory simulation experiments with sediments retrieved from the drillings. The simulation results indicate that after the addition of hydrogen, substantial amounts of methane were produced in incubated mofette sediments and deep subsurface sediments. The methanogenic hydrogenotrophic genera Methanobacterium was highly enriched during the incubation. The modeling of the in-situ observation of the earthquake swarm period in 2000 at the Novy Kostel focal area/Czech Republic and our laboratory simulation experiments reveals a close relation between seismic activities and microbial methane production via earthquake-induced H2 release. We thus conclude that H2 – which is released during seismic activity – can potentially trigger methanogenic activity in the deep subsurface. Based on this conclusion, we further hypothesize that the hydrogenotrophic early life on Earth was boosted by the Late Heavy Bombardment induced seismic activity in approximately 4.2 to 3.8 Ga. N2 - Das Eger-Becken (CZ) ist ein flaches, intrakontinentales neogenes Becken im westlichen Eger-Graben. Das Eger-Becken zeichnet sich durch aktive Seismizität und die diffuse Entgasung von aus dem Mantel stammenden CO2 in Mofettenfeldern aus. Das Mofettenfeld von Hartoušov weist einen täglichen CO2-Fluss von 23-97 Tonnen auf. Mehr als 99% des CO2 werden auf einer Fläche von 0,35 km2 freigesetzt. Im Untersuchungsgebiet wurden in den Jahren 2000 und 2014 seismisch aktive Perioden beobachtet. Aufgrund der aktiven geodynamischen Prozesse gilt das Egerer Becken als ideale Region für die kontinentale Tiefenbiosphärenforschung, die sich auf die Wechselwirkung von biologischen Prozessen mit geologischen Prozessen konzentriert. Zur Untersuchung des Einflusses der CO2-Entgasung auf die mikrobielle Gemeinschaft in der ober- und unterirdischen Umwelt wurden 2015 und 2016 zwei 3 m tiefe Flachbohrungen und eine 108,5 m tiefe wissenschaftliche Bohrung durchgeführt. Zusätzlich wurde auch aus dem Tiefbohrloch Flüssigkeit gewonnen. Die verschiedenen Ökosysteme wurden hinsichtlich ihrer geochemischen Eigenschaften, der mikrobiellen Abundanzen und der mikrobiellen Gemeinschaftsstrukturen verglichen. Die Geochemie der Mofetten zeichnet sich durch einen niedrigen pH-Wert und hohe TOC- und Sulfatgehalte aus, während das unterirdische Milieu einen neutralen pH-Wert und verschiedene TOC- und Sulfatgehalte in unterschiedlichen lithologischen Umgebungen aufweist. Auffällige Unterschiede in der mikrobiellen Gemeinschaft unterstreichen den erheblichen Einfluss erhöhter CO2-Konzentrationen und stark salzhaltigen Grundwassers auf mikrobielle Prozesse. Generell waren die mikrobiellen Abundanzen in dem tiefen Untergrundsediment im Vergleich zur flachen Mofette gering. Innerhalb der Mofette und des tiefen unterirdischen Sediments zeigt die Häufigkeit der Mikroorganismen jedoch keine typische Abnahme mit der Tiefe, was darauf hinweist, dass das aufsteigende CO2-reiche Grundwasser einen starken Einfluss auf die mikrobiellen Gemeinschaften hat, indem es genügend Substrat für anaerobe chemolithoautotrophe Mikroorganismen bietet. Die Illumina-MiSeq-Sequenzierung der 16S rRNA-Gene und die multivariate Statistik zeigen, dass der pH-Wert die Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft in der Mofette signifikant bestimmt, während die unterirdische mikrobielle Gemeinschaft signifikant vom Grundwasser beeinflusst wird, das durch das ausgasende CO2 geprägt ist. Azidophile Mikroorganismen zeigen eine viel höhere relative Abundanz in der Mofette, wohingegen die der Familie Comamonadaceae zugeordneten OTUs die dominierenden Taxa der unterirdischen Gemeinschaften darstellen. Zusätzlich charakterisieren Taxa, die am Schwefelzyklus beteiligt sind, die mikrobiellen Gemeinschaften sowohl in der Mofette als auch in der CO2-dominierten unterirdischen Umwelt. Eine weitere wichtige Untersuchung der Geo-Bio-Interaktion ist der Einfluss der seismischen Aktivität. Während seismischer Ereignisse kann freigesetztes H2 als Elektronendonator für mikrobielle hydrogenotrophe Prozesse, wie z.B. die Methanogenese, dienen. Um zu bestimmen, ob die seismischen Ereignisse durch die erhöhten geogenen H2-Konzentrationen möglicherweise methanogene Prozesse auslösen können, führten wir Laborsimulationsexperimente mit Sedimenten durch, die aus den Bohrungen gewonnen wurden. Die Simulationsexperimente weisen darauf hin, dass nach der Zugabe von Wasserstoff beträchtliche Mengen an Methan in inkubierten Mofettensedimenten und tiefen unterirdischen Sedimenten produziert wurden. Die methanogene hydrogenotrophe Gattung Methanobacterium wurde während der Inkubation stark angereichert. Die Modellierung der in-situ-Beobachtung der Erdbeben-Schwarmzeit im Jahr 2000 im Schwerpunktgebiet Novy Kostel/Tschechische Republik und unsere Laborsimulationsexperimente zeigen einen engen Zusammenhang zwischen seismischen Aktivitäten und der biotischen Methanproduktion durch erdbebeninduzierte H2-Freisetzung. Wir kommen daher zu dem Schluss, dass H2 - dass bei seismischer Aktivität freigesetzt wird - möglicherweise methanogene Aktivität im tiefen Untergrund auslösen kann. Basierend auf dieser Schlussfolgerung gehen wir weiter davon aus, dass das frühe hydrogenotrophe Leben, durch die durch Late Heavy Bombardment induzierte seismische Aktivität in etwa 4,2 bis 3,8 Ga verstärkt wurde. T2 - Einfluss der CO2-Entgasung auf die Verteilung und Aktivität der mikrobiellen Gemeinschaft im Hartoušov-Entgasungssystem im westlichen Eger-Graben (Tschechische Republik) KW - CO2 degassing KW - western Eger Rift KW - microbial community KW - microbial activity KW - earthquake KW - seismic activity KW - deep biosphere KW - CO2-Entgasung KW - tiefe Biosphäre KW - Erdbeben KW - mikrobielle Aktivität KW - mikrobielle Gemeinschaft KW - seismische Aktivität KW - westlichen Eger-Graben Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-475341 ER - TY - THES A1 - Aneley, Gedif Mulugeta T1 - Drought tolerance prediction of potato by automatic phenotyping of morphological and physiological traits T1 - Vorhersage von Trockentoleranz in Kartoffel durch automatische Phänotypisierung morphologischer und physiologischer Eigenschaften N2 - Potato is the 4th most important food crop in the world. Especially in tropical and sub-tropical potato production, drought is a yield limiting factor. Potato is sensitive to water stress. Potato yield loss under water stress could be reduced by using tolerant varieties and adjusted agronomic practices. Direct selection for yield under water-stressed conditions requires long selection cycles. Thus, identification of markers for marker-assisted selection may speed up breeding. The objective of this thesis is to identify morphological markers for drought tolerance by continuously monitoring plant growth and canopy temperature with an automatic phenotyping system. The phenotyping was performed in drought-stress experiments that were conducted in population A with 64 genotypes and population B with 21 genotypes in the screenhouse in 2015 and 2016 (population A) and in 2017 and 2018 (population B). Drought tolerance was quantified as deviation of the relative tuber starch yield from the experimental median (DRYM) and parent median (DRYMp). Relative tuber starch yield is starch yield under drought stress relative to the average starch yield of the respective cultivar under control conditions in the same experiment. The specific DRYM value was calculated based on the yield data of the same experiment or the global DRYM that was calculated from yield data derived from data combined over yeas of respective population or across multiple experiments including VALDIS and TROST experiments (2011-2016). Analysis of variance found a significant effect of genotype on DRYM indicating that the tolerance variation required for marker identification was given in both populations. Canopy growth was monitored continuously six times a day over five to ten weeks by a laser scanner system and yielded information on leaf area, plant height and leaf angle for population A and additionally on leaf inclination and light penetration depth for population B. Canopy temperature was measured 48 times a day over six to seven weeks by infrared thermometry in population B. From the continuous IRT surface temperature data set, the canopy temperature for each plant was selected by matching the time stamp of the IRT data with laser scanner data. Mean, maximum, range and growth rate values were calculated from continuous laser scanner measurements of respective canopy parameters. Among the canopy parameters, the maximum and mean values in long-term stress conditions showed better correlation with DRYM values calculated in the same experiment than growth rate and diurnal range values. Therefore, drought tolerance index prediction was done from maximum and mean values of canopy parameters. The tolerance index in specific experiment condition was linearly predicted by simple regression model from different single canopy parameters under long-term stress condition in population A (2016) and population B (2017 and 2018). Among the canopy parameters maximum light penetration depth (2017), mean leaf angle (2017, 2018, and 2016), mean leaf inclination or mean canopy temperature depression (2017 and 2018), maximum plant height (2017) were selected as tolerance predictors. However, no single parameters were sufficient to predict DRYM. Therefore, several independent parameters were integrated in a multiple regression model. In multiple regression model, specific experiment DRYM values in population A was predicted from mean leaf angle (2016). In population B, specific tolerance could be predicted from maximum light penetration depth and mean leaf inclination (2017) and mean leaf inclination (2018) or mean canopy temperature depression and mean leaf angle (2018). In data combined over season of population A, the multiple linear regression model selected maximum plant height and mean leaf angle as tolerance predictor. In Population B, mean leaf inclination was selected as tolerance predictor. However, in population A, the variation explained by the final model was too low. Furthermore, the average tolerances respective to parent median (2011-2018) across FGH plants or all plants (FGH and field) were predicted from maximum plant height (population A) and maximum plant height and mean leaf inclination (population B). Altogether, canopy parameters could be used as markers for drought tolerance. Therefore, water stress breeding in potato could be speed up through using leaf inclination, light penetration depth, plant height and canopy temperature depression as markers for drought tolerance, especially in long-term stress conditions. N2 - Die Kartoffel ist die viertwichtigste Nahrungspflanze der Welt. Besonders in den Tropen und Subtropen ist Trockenheit ein ertragsbegrenzender Faktor für die Kartoffelproduktion. Kartoffeln sind empfindlich gegen Trockenstress. Der Ertragsverlust von Kartoffeln unter Wasserstress könnte durch die Verwendung von toleranten Sorten und angepasste Anbaupraxis verringert werden. Die direkte Selektion für Ertrag unter Trockenstressbedingungen erfordert lange Selektionszyklen. Daher kann die Identifizierung von Markern für marker-assisted Selektion die Züchtung beschleunigen. Das Ziel dieser Arbeit ist es, morphologische Marker für Trockentoleranz mit Hilfe von kontinuierlichen Messungen von Pflanzenwachstum und Bestandstemperatur mittels automatischer Phänotypisierung zu identifizieren. Die Phänotypisierung wurde in Trockenstressexperimenten durchgeführt, welche mit 64 Genotypen aus Population A und 21 Genotypen aus Population B in einem Foliengewächshaus in 2015 und 2016 (Population A) bzw. 2017 und 2018 (Population B) stattgefunden haben. Die Trockentoleranz wurde als Abweichung des relativen Stärkeertrags der Knollen vom experimentellen Median (DRYM) und dem Elternmedian (DRYMp) quantifiziert. Der relative Stärkeertrag ist der Stärkeertrag unter Trockenstress relativ zum mittleren Stärkeertrag der Sorte unter optimaler Bewässerung im gleichen Experiment. Der spezifische DRYM wurde auf der Basis der Ertragsdaten des gleichen Experiments berechnet oder der globale DRYM wurde auf der Basis der Ertragsdaten kombinierter Experimente aus mehreren Jahren für die gleiche Population oder für mehrere Experimente auch aus VALDIS und TROST (2011-2016) berechnet. Die Varianzanalyse zeigte einen signifikanten Effekt des Genotyps auf DRYM, so dass die für die Identifizierung von Markern erforderliche Toleranzvariation in beiden Populationen gegeben war. Die Bestandsentwicklung wurde mit einem Laserscanner-System kontinuierlich sechsmal täglich über fünf bis zehn Wochen gemessen und lieferte Informationen zu Blattfläche, Pflanzenhöhe und Blattwinkel für Population A sowie zusätzlich Blattneigung und Lichteinfalltiefe für Population B. Die Oberflächentemperatur wurde 48mal täglich für sechs bis sieben Wochen mittels Infrarot-Thermometrie in Population B gemessen. Aus dem kontinuierlichen IRT-Oberflächentemperatur-Datensatz wurde die Oberflächentemperatur jeder Pflanze bestimmt, indem die Zeitstempel der IRT-Daten mit denen der Laserscannerdaten abgeglichen wurden. Mittelwert, Maximum, Streubereich (range) und Wachstumsrate wurden für die Bestandsparameter der Laserscannermessungen bestimmt. Unter den Bestandsparametern zeigten die Maxima und Mittelwerte unter Langzeitstress die bessere Korrelation mit dem Toleranzindex DRYM, der aus dem gleichen Experiment berechnet wurde, als die Wachstumsrate und der Streubereich. Die Trockentoleranzprognose wurde daher aus den Maxima und Mittelwerte der Bestandsparameter gemacht. Der Toleranzindex spezifischer Versuche wurde linear mit einem einfachen Regressionsmodell aus verschiedenen einzelnen Bestandparameters unter Langzeitstressbedingungen in Population A (2016) und Population (B) (2017 und 2018) vorhergesagt. Toleranz-Prognoseparameter wurden unter den Bestandparametern maximale Lichteinfalltiefe (2017), mittlerer Blattwinkel (2017, 2018 und 2016), mittlere Blattneigung und mittlere Oberflächentemperatur-Abweichung (2017 und 2018), maximale Pflanzenhöhe (2017) ausgewählt. Kein einzelner Parameter war jedoch ausreichend um DRYM vorherzusagen. Daher wurden mehrere unabhängige Parameter in einem multiplen Regressionsmodell integriert. Im multiplen Regressionsmodel wurde der spezifische Experiment-DRYM in Population A aus dem mittleren Blattwinkel (2016) vorhergesagt. In Population B konnte die spezifische Toleranz aus der maximalen Lichteinfalltiefe, der maximalen Blattneigung (2017) und der mittleren Blattneigung (2018) oder der mittleren Oberflächentemperatur-Abweichung und dem mittleren Blattwinkel (2018) vorhergesagt werden. In Daten aus mehreren Anbauperioden von Population A wählte das multiple lineare Regressionsmodel maximale Pflanzenhöhe und mittleren Blattwinkel als Prognoseparameter für Toleranz aus. In Population B wurde mittlere Blattneigung als Prognoseparameter für Toleranz ausgewählt. In Population A war jedoch die Variation, die durch das Endmodell erklärt wurde, zu niedrig. Die mittlere Toleranz hinsichtlich des Medians der Eltern (2011 – 2018) über alle FGH Pflanzen oder alle Pflanzen (FGH und Feld) wurde ferner aus der maximalen Pflanzenhöhe (Population A) und der maximalen Pflanzenhöhe und mittleren Blattneigung (Population) vorhergesagt. Insgesamt konnten Bestandsparameter als Marker für Trockentoleranz genutzt werden. Dementsprechend könnte Trockenstresszucht in Kartoffeln beschleunigt werden, indem Blattneigung, Lichteinfalltiefe, Pflanzenhöhe und Oberflächentemperatur-Abweichung als Marker für Trockentoleranz, insbesondere unter Langzeitstressbedingungen, genutzt werden. (Übersetzung Karin Köhl, 4.6.2020). KW - Canopy parameters KW - Drought tolerance KW - DRYM KW - Bestandsparameter KW - Trockentoleranz KW - DRYM Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-486836 ER - TY - THES A1 - Mitzscherling, Julia T1 - Microbial communities in submarine permafrost and their response to permafrost degradation and warming N2 - The Arctic region is especially impacted by global warming as temperatures in high latitude regions have increased and are predicted to further rise at levels above the global average. This is crucial to Arctic soils and the shallow shelves of the Arctic Ocean as they are underlain by permafrost. Perennially frozen ground is a habitat for a large number and great diversity of viable microorganisms, which can remain active even under freezing conditions. Warming and thawing of permafrost makes trapped soil organic carbon more accessible to microorganisms. They can transform it to the greenhouse gases carbon dioxide, methane and nitrous oxide. On the other hand, it is assumed that thawing of the frozen ground stimulates microbial activity and carbon turnover. This can lead to a positive feedback loop of warming and greenhouse gas release. Submarine permafrost covers most areas of the Siberian Arctic Shelf and contains a large though unquantified carbon pool. However, submarine permafrost is not only affected by changes in the thermal regime but by drastic changes in the geochemical composition as it formed under terrestrial conditions and was inundated by Holocene sea level rise and coastal erosion. Seawater infiltration into permafrost sediments resulted in an increase of the pore water salinity and, thus, in thawing of permafrost in the upper sediment layers even at subzero temperatures. The permafrost below, which was not affected by seawater, remained ice-bonded, but warmed through seawater heat fluxes. The objective of this thesis was to study microbial communities in submarine permafrost with a focus on their response to seawater influence and long-term warming using a combined approach of molecular biological and physicochemical analyses. The microbial abundance, community composition and structure as well as the diversity were investigated in drill cores from two locations in the Laptev Sea, which were subjected to submarine conditions for centuries to millennia. The microbial abundance was measured through total cell counts and copy numbers of the 16S rRNA gene and of functional genes. The latter comprised genes which are indicative for methane production (mcrA) and sulfate reduction (dsrB). The microbial community was characterized by high-throughput-sequencing of the 16S rRNA gene. Physicochemical analyses included the determination of the pore water geochemical and stable isotopic composition, which were used to describe the degree of seawater influence. One major outcome of the thesis is that the submarine permafrost stratified into different so-called pore water units centuries as well as millennia after inundation: (i) sediments that were mixed with seafloor sediments, (ii) sediments that were infiltrated with seawater, and (iii) sediments that were unaffected by seawater. This stratification was reflected in the submarine permafrost microbial community composition only millennia after inundation but not on time-scales of centuries. Changes in the community composition as well as abundance were used as a measure for microbial activity and the microbial response to changing thermal and geochemical conditions. The results were discussed in the context of permafrost temperature, pore water composition, paleo-climatic proxies and sediment age. The combination of permafrost warming and increasing salinity as well as permafrost warming alone resulted in a disturbance of the microbial communities at least on time-scales of centuries. This was expressed by a loss of microbial abundance and bacterial diversity. At the same time, the bacterial community of seawater unaffected but warmed permafrost was mainly determined by environmental and climatic conditions at the time of sediment deposition. A stimulating effect of warming was observed only in seawater unaffected permafrost after millennia-scale inundation, visible through increased microbial abundance and reduced amounts of substrate. Despite submarine exposure for centuries to millennia, the community of bacteria in submarine permafrost still generally resembled the community of terrestrial permafrost. It was dominated by phyla like Actinobacteria, Chloroflexi, Firmicutes, Gemmatimonadetes and Proteobacteria, which can be active under freezing conditions. Moreover, the archaeal communities of both study sites were found to harbor high abundances of marine and terrestrial anaerobic methane oxidizing archaea (ANME). Results also suggested ANME populations to be active under in situ conditions at subzero temperatures. Modeling showed that potential anaerobic oxidation of methane (AOM) could mitigate the release of almost all stored or microbially produced methane from thawing submarine permafrost. Based on the findings presented in this thesis, permafrost warming and thawing under submarine conditions as well as permafrost warming without thaw are supposed to have marginal effects on the microbial abundance and community composition, and therefore likely also on carbon mobilization and the formation of methane. Thawing under submarine conditions even stimulates AOM and thus mitigates the release of methane. N2 - Die globale Erwärmung beeinträchtigt die Arktische Region besonders stark. Im Vergleich zum globalen Mittel sind die Temperaturen in den hohen Breitengraden am stärksten gestiegen und werden voraussichtlich auch weiterhin am stärksten ansteigen. Das ist äußerst kritisch, da arktische Böden und die flachen Schelfgebiete des Arktischen Ozeans von Permafrost geprägt sind. Dieser mehrjährig gefrorene Boden ist ein Habitat für eine große Anzahl und Diversität von Mikroorganismen, die lebensfähig sind und auch unter gefrorenen Bedingungen aktiv sein können. Einerseits machen eine Erwärmung und das Tauen des Permafrosts gespeicherten organischen Kohlenstoff zugänglicher für die Mikroorganismen. Diese können den Kohlenstoff in die Treibhausgase Kohlenstoffdioxid, Methan und Distickstoffoxid umwandeln. Andererseits stimuliert das Tauen des gefrorenen Bodens die mikrobielle Aktivität und den Kohlenstoffumsatz. Das kann zu einem sich verstärkenden Rückkopplungsprozess aus Erwärmung und Freisetzung von Treibhausgasen führen. Submariner Permafrost umfasst den größten Teil des Ostsibirischen Arktisschelfs und enthält ein großes, wenn auch nicht quantifiziertes Kohlenstoffreservoir. Der submarine Permafrost wird jedoch nicht nur durch Veränderungen des Wärmehaushalts beeinflusst, sondern auch durch drastische Veränderungen in der geochemischen Zusammensetzung. Durch den holozänen Meeresspiegelanstieg und durch Küstenerosion wurde der unter terrestrischen Bedingungen gebildete Permafrost überflutet. Ein Eindringen von Meerwasser führte in den Permafrostsedimenten zu einem Anstieg der Porenwasser-Salinität und dadurch zum Tauen des Permafrosts in den oberen Schichten, sogar bei Temperaturen unter 0 °C. Tiefer liegende Permafrostsedimente, die (noch) nicht vom Meerwasser beeinflusst wurden, blieben eis-gebunden, aber begannen sich durch den Wärmestrom des Meerwassers zu erwärmen. Das Ziel dieser Dissertation war es, die mikrobiellen Gemeinschaften in submarinem Permafrost zu untersuchen. Der Fokus lag dabei auf der Reaktion der Gemeinschaften auf den Einfluss des Meerwassers und die Langzeiterwärmung. Die Arbeit nutzt dafür einen kombinierten Ansatz aus molekularbiologischen und physikochemischen Analysen. Die mikrobielle Abundanz, Gemeinschaftszusammensetzung und -struktur sowie die Diversität wurden in Sedimentbohrkernen zweier Standorte in der Laptew See untersucht, welche seit Jahrhunderten bis Jahrtausenden submarinen Bedingungen ausgesetzt waren. Die mikrobielle Abundanz wurde mit Hilfe von Zellzahlen und Kopienzahlen des 16S rRNA Gens sowie funktioneller Gene bestimmt, die kennzeichnend für die Methanproduktion (mcrA) und Sulfatreduktion (dsrB) sind. Die mikrobielle Gemeinschaft wurde mit Hilfe der Hochdurchsatz-Sequenzierung des 16S rRNA Gens charakterisiert. Physikochemische Analysen beinhalteten die Untersuchung der geochemischen Zusammensetzung der Porenwassers und der stabilen Wasserisotopen. Beide Zusammensetzungen wurden genutzt, um den Grad des Meerwassereinflusses auf die Permafrostsedimente zu beschreiben. Ein Hauptergebnis der Arbeit ist, dass sich submariner Permafrost sowohl nach Jahrhunderten als auch nach Jahrtausenden der Überflutung in verschiedene Schichten, sogenannte Porenwassereinheiten, unterteilen lässt: (i) Sedimente, die sich mit dem Meeresboden vermischt haben, (ii) Sedimente, die vom Meerwasser infiltriert wurden und (iii) Sedimente, die vom Meerwasser unbeeinflusst sind. Diese Schichtenbildung spiegelt sich erst nach jahrtausendelanger Überflutung auch in der mikrobiellen Gemeinschaftszusammensetzung wider, nicht jedoch nach Jahrhunderten. Änderungen sowohl in der Gemeinschaftszusammensetzung als auch in der Abundanz wurden als Maß für mikrobielle Aktivität und die mikrobielle Reaktion auf die sich ändernden thermischen und geochemischen Bedingungen genutzt. Die Ergebnisse wurden im Kontext von Permafrosttemperatur, Porenwasserzusammensetzung, paleoklimatischen Proxys und dem Sedimentalter diskutiert. Die Kombination aus Permafrosterwärmung und steigender Salinität, sowie die Permafrosterwärmung allein, resultierten auf Zeitskalen von Jahrhunderten in einer Störung der mikrobiellen Gemeinschaft. Dies drückte sich durch einen Verlust der mikrobiellen Abundanz und der bakteriellen Diversität aus. Gleichzeitig wurde die bakterielle Gemeinschaft im vom Meerwasser unbeeinflussten, aber erwärmten Permafrost hauptsächlich durch die Umweltbedingungen und das Klima zur Zeit der Sedimentablagerung geprägt. Ein stimulierender Einfluss der Erwärmung konnte im vom Meerwasser unbeeinflussten Permafrost erst nach jahrtausendelanger Überflutung beobachtet werden. Dies wurde durch einen Anstieg in der mikrobiellen Abundanz und einer Abnahme der organischen Substrate sichtbar. Obwohl die bakteriellen Gemeinschaften des Permafrostes submarinen Bedingungen für Jahrhunderte bis Jahrtausende ausgesetzt waren, unterschieden sie sich kaum von den Gemeinschaften im terrestrischen Permafrost. Die Gemeinschaft des submarinen Permafrosts wurde von Phyla wie Actinobacteria, Chloroflexi, Firmicutes, Gemmatimonadetes und Proteobacteria dominiert, welche auch unter gefrorenen Bedingungen aktiv sein können. Darüber hinaus enthielten die archaellen Gemeinschaften an beiden Standorten eine hohe Anzahl von marinen und terrestrischen anaerob methan-oxidierenden Archaeen (ANME), bei denen eine Aktivität unter in situ Bedingungen bei Minusgraden angenommen wird. Eine Modellierung zeigte, dass die anaerobe Oxidation von Methan (AOM) potenziell fast die gesamte Menge des gespeicherten und mikrobiell produzierten Methans in tauendem submarinem Permafrost reduzieren könnte. Die Ergebnisse der Arbeit deuten darauf hin, dass das Tauen von Permafrost unter submarinen Bedingungen sowie eine Erwärmung ohne Tauen marginale Effekte auf die Abundanz und Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaften und somit wahrscheinlich auch auf die Mobilisierung von Kohlenstoff in Form von Methan hat. Das Tauen unter submarinen Bedingungen stimuliert sogar AOM und reduziert somit den Ausstoß von Methan. T2 - Mikrobielle Gemeinschaften in submarinem Permafrost and ihre Reaktion auf die Degradierung und Erwärmung des Permafrosts KW - Microbial communities KW - Subsea permafrost KW - Arctic KW - Mikrobielle Gemeinschaften KW - Submariner Permafrost KW - Arktis KW - Submarine permafrost KW - next generation sequencing KW - Hochdurchsatzsequenzierung KW - Permafrostdegradation KW - permafrost degradation Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-471240 ER - TY - THES A1 - Wen, Xi T1 - Distribution patterns and environmental drivers of methane-cycling microorganisms in natural environments and restored wetlands N2 - Methane is an important greenhouse gas contributing to global climate change. Natural environments and restored wetlands contribute a large proportion to the global methane budget. Methanogenic archaea (methanogens) and methane oxidizing bacteria (methanotrophs), the biogenic producers and consumers of methane, play key roles in the methane cycle in those environments. A large number of studies revealed the distribution, diversity and composition of these microorganisms in individual habitats. However, uncertainties exist in predicting the response and feedback of methane-cycling microorganisms to future climate changes and related environmental changes due to the limited spatial scales considered so far, and due to a poor recognition of the biogeography of these important microorganisms combining global and local scales. With the aim of improving our understanding about whether and how methane-cycling microbial communities will be affected by a series of dynamic environmental factors in response to climate change, this PhD thesis investigates the biogeographic patterns of methane-cycling communities, and the driving factors which define these patterns at different spatial scales. At the global scale, a meta-analysis was performed by implementing 94 globally distributed public datasets together with environmental data from various natural environments including soils, lake sediments, estuaries, marine sediments, hydrothermal sediments and mud volcanos. In combination with a global biogeographic map of methanogenic archaea from multiple natural environments, this thesis revealed that biogeographic patterns of methanogens exist. The terrestrial habitats showed higher alpha diversities than marine environments. Methanoculleus and Methanosaeta (Methanothrix) are the most frequently detected taxa in marine habitats, while Methanoregula prevails in terrestrial habitats. Estuary ecosystems, the transition zones between marine and terrestrial/limnic ecosystems, have the highest methanogenic richness but comparably low methane emission rates. At the local scale, this study compared two rewetted fens with known high methane emissions in northeastern Germany, a coastal brackish fen (Hütelmoor) and a freshwater riparian fen (Polder Zarnekow). Consistent with different geochemical conditions and land-use history, the two rewetted fens exhibit dissimilar methanogenic and, especially, methanotrophic community compositions. The methanotrophic community was generally under-represented among the prokaryotic communities and both fens show similarly low ratios of methanotrophic to methanogenic abundances. Since few studies have characterized methane-cycling microorganisms in rewetted fens, this study provides first evidence that the rapid and well re-established methanogenic community in combination with the low and incomplete re-establishment of the methanotrophic community after rewetting contributes to elevated sustained methane fluxes following rewetting. Finally, this thesis demonstrates that dispersal limitation only slightly regulates the biogeographic distribution patterns of methanogenic microorganisms in natural environments and restored wetlands. Instead, their existence, adaption and establishment are more associated with the selective pressures under different environmental conditions. Salinity, pH and temperature are identified as the most important factors in shaping microbial community structure at different spatial scales (global versus terrestrial environments). Predicted changes in climate, such as increasing temperature, changes in precipitation patterns and increasing frequency of flooding events, are likely to induce a series of environmental alterations, which will either directly or indirectly affect the driving environmental forces of methanogenic communities, leading to changes in their community composition and thus potentially also in methane emission patterns in the future. N2 - Methan ist ein wichtiges Treibhausgas, das zum globalen Klimawandel beiträgt. Bedeutend für das globale Methanbudget sind unter anderem natürliche und wiedervernäßte Moore. Methanogene Archaeen (Methanogene) und Methan-oxidierende Bakterien (Methanotrophe) sind die biogenen Produzenten und Konsumenten von Methan. Daher nehmen sie global, und speziell in Mooren, eine Schlüsselrolle für das Methanbudget ein. Eine Vielzahl von Studien hat die Verteilung, Vielfalt und Zusammensetzung dieser Mikroorganismen in einzelnen Lebensräumen untersucht. Es bestehen jedoch Unsicherheiten in der Vorhersage, wie sie auf den globalen Wandel und auf die damit verbundenen Umweltveränderungen reagieren werden. Diese Unsicherheiten basieren unter anderem auf bislang fehlenden biogeographischen Untersuchungen, die globale und lokale Skalen kombinieren, und auf einem unzureichenden Verständnis dazu, ob und welche Umweltfaktoren speziell methanogene Gemeinschaften beeinflussen. Zudem gibt es trotz der Bedeutung von Projekten zur Moorwiedervernässung für das regionale und globale Treibhausgasbudget nahezu keine Untersuchungen zur Zusammensetzung und Verbreitung von methanogenen und methanotrophen Gemeinschaften in degradierten wiedervernäßten, eutrophen Niedermooren. Das Ziel dieser Doktorarbeit ist es, unser Verständnis zur Reaktion der am Methanbudget beteiligten mikrobiellen Gemeinschaften auf den globalen Wandel und auf die damit einhergehenden Umweltänderungen zu verbessern. Die Arbeit untersucht daher zum einen die biogeographischen Muster methanogener Gemeinschaften und die ihnen zugrunde liegenden Umweltfaktoren auf verschiedenen räumlichen Skalen. Auf globaler Ebene wurde eine Meta-Analyse durchgeführt, die auf 94 global verteilten, öffentlichen Sequenzdatensätzen sowie den dazugehörigen Umweltdaten aus verschiedenen natürlichen Ökosystemen basiert. Hierzu gehören Böden, Seesedimente, Ästuare, marine Sedimente, hydrothermale Sedimente und Schlammvulkane. In Kombination mit einer globalen biogeographischen Karte zur Verbreitung methanogener Archaeen konnte diese Arbeit zeigen, dass biogeographische Muster von Methanogenen existieren. Terrestrische Ökosysteme zeigen zudem eine höhere Diversität als marine Ökosysteme. Ästuare, Übergangszonen zwischen marinen und terrestrischen/ limnischen Ökosystemen, weisen die größte methanogene Diversität bei jedoch vergleichsweise geringen Methanemissionen auf. Methanoculleus und Methanosaeta (Methanothrix) sind die am häufigsten nachgewiesenen Taxa in marinen Lebensräumen, während Methanoregula in terrestrischen Ökosystemen dominiert. Auf lokaler Ebene wurden in dieser Arbeit zwei wiedervernässte, eutrophe Niedermoore im Nordosten Deutschlands verglichen, das von der Ostsee beeinflusste „Hütelmoor“ und das Durchströmungsmoor „Polder Zarnekow“. Beide Moore sind durch hohe Methanemissionen infolge der Wiedervernässung charakterisiert. Einhergehend mit unterschiedlichen geochemischen Bedingungen und unterschiedlicher Nutzungshistorie weisen diese beiden wiedervernässten Standorte in ihrer Zusammensetzung unterschiedliche methanogene und methanotrophe Gemeinschaften auf lokaler Ebene auf. Zudem ist die Gruppe der Methanotrophen innerhalb der prokaryotischen Gemeinschaften jeweils unterrepräsentiert und beide Moore zeigen ein vergleichbar niedriges Verhältnis von Methanotrophen im Vergleich zu Methanogenen. Diese Arbeit liefert erste Hinweise darauf, dass die schnelle und erfolgreiche Wiederbesiedlung durch Methanogene in Kombination mit einer offenbar schlecht etablierten methanotrophen Gemeinschaft zu den erhöhten Methanflüssen in beiden Mooren nach Wiedervernässung beiträgt. Abschließend zeigt diese Arbeit, dass eine eingeschränkte Migration („dispersal limitation“) die biogeographischen Verteilungsmuster von Methanogenen in natürlichen Ökosystemen kaum beeinflusst. Stattdessen werden Vorkommen und Anpassung von methanogenen Gemeinschaften vor allem durch den selektiven Druck verschiedener Umweltbedingungen reguliert. Die Umweltparameter Salzgehalt, pH-Wert und Temperatur wurden dabei als wichtigste Faktoren identifiziert, die die Verbreitung methanogener Gemeinschaften global bzw. speziell in terrestrischen Standorten beeinflussen. Es ist daher wahrscheinlich, dass prognostizierte Klimaveränderungen wie steigende Temperatur, Änderungen der Niederschlagsmuster und zunehmende Häufigkeit von Überschwemmungsereignissen zu Änderungen in der Zusammensetzung methanogener Gemeinschaften führen, die möglicherweise auch die Methanemissionsmuster beeinflussen werden. T2 - Verteilungsmuster Methan produzierender und Methan oxidierender Mikroorganismen und deren Abhängigkeit von Umweltfaktoren in natürlichen Ökosystemen und wiedervernäßten Mooren KW - biogeography KW - Biogeographie KW - methanogens KW - methanotrophs KW - Methanogene KW - Methanotrophe KW - distribution pattern KW - Verteilungsmuster KW - methane KW - Methane Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-471770 ER - TY - THES A1 - Romero Mujalli, Daniel T1 - Ecological modeling of adaptive evolutionary responses to rapid climate change T1 - Ökologische Modellierung anpassungsfähiger evolutionärer Reaktionen auf schnellen Klimawandel N2 - A contemporary challenge in Ecology and Evolutionary Biology is to anticipate the fate of populations of organisms in the context of a changing world. Climate change and landscape changes due to anthropic activities have been of major concern in the contemporary history. Organisms facing these threats are expected to respond by local adaptation (i.e., genetic changes or phenotypic plasticity) or by shifting their distributional range (migration). However, there are limits to their responses. For example, isolated populations will have more difficulties in developing adaptive innovations by means of genetic changes than interconnected metapopulations. Similarly, the topography of the environment can limit dispersal opportunities for crawling organisms as compared to those that rely on wind. Thus, populations of species with different life history strategy may differ in their ability to cope with changing environmental conditions. However, depending on the taxon, empirical studies investigating organisms’ responses to environmental change may become too complex, long and expensive; plus, complications arising from dealing with endangered species. In consequence, eco-evolutionary modeling offers an opportunity to overcome these limitations and complement empirical studies, understand the action and limitations of underlying mechanisms, and project into possible future scenarios. In this work I take a modeling approach and investigate the effect and relative importance of evolutionary mechanisms (including phenotypic plasticity) on the ability for local adaptation of populations with different life strategy experiencing climate change scenarios. For this, I performed a review on the state of the art of eco-evolutionary Individual-Based Models (IBMs) and identify gaps for future research. Then, I used the results from the review to develop an eco-evolutionary individual-based modeling tool to study the role of genetic and plastic mechanisms in promoting local adaption of populations of organisms with different life strategies experiencing scenarios of climate change and environmental stochasticity. The environment was simulated through a climate variable (e.g., temperature) defining a phenotypic optimum moving at a given rate of change. The rate of change was changed to simulate different scenarios of climate change (no change, slow, medium, rapid climate change). Several scenarios of stochastic noise color resembling different climatic conditions were explored. Results show that populations of sexual species will rely mainly on standing genetic variation and phenotypic plasticity for local adaptation. Population of species with relatively slow growth rate (e.g., large mammals) – especially those of small size – are the most vulnerable, particularly if their plasticity is limited (i.e., specialist species). In addition, whenever organisms from these populations are capable of adaptive plasticity, they can buffer fitness losses in reddish climatic conditions. Likewise, whenever they can adjust their plastic response (e.g., bed-hedging strategy) they will cope with bluish environmental conditions as well. In contrast, life strategies of high fecundity can rely on non-adaptive plasticity for their local adaptation to novel environmental conditions, unless the rate of change is too rapid. A recommended management measure is to guarantee interconnection of isolated populations into metapopulations, such that the supply of useful genetic variation can be increased, and, at the same time, provide them with movement opportunities to follow their preferred niche, when local adaptation becomes problematic. This is particularly important for bluish and reddish climatic conditions, when the rate of change is slow, or for any climatic condition when the level of stress (rate of change) is relatively high. N2 - Eine aktuelle Herausforderung in der Ökologie und Evolutionsbiologie besteht darin, das Schicksal von Populationen verschiedener Lebewesen im Kontext einer sich verändernden Welt zu antizipieren. Der Klimawandel und die durch anthropologische Aktivitäten verursachten Landschaftsveränderungen sind im Laufe der Geschichte von großer Bedeutung geworden. Von den Organismen, die sich diesen Veränderungen stellen, wird erwartet, dass sie durch lokale Anpassung (d.h. genetische Veränderungen oder phänotypische Plastizität) oder durch Verschiebung ihres Verbreitungsgebietes (Migration) darauf reagieren. Allerdings sind diese Reaktionen begrenzt. So werden beispielsweise isolierte Populationen mehr Schwierigkeiten bei der Entwicklung adaptiver Neuheiten mittels genetischer Variation haben als vernetzte Metapopulationen. Ebenso kann die Topographie der Umgebung die Ausbreitungsmöglichkeiten für zum Beispiel kriechende Organismen im Vergleich zu denen, die auf Wind angewiesen sind, einschränken. So können Populationen von Arten mit unterschiedlichen Lebensstrategien verschiedene Fähigkeiten haben, mit den sich ändernden Umweltbedingungen umzugehen. Empirische Studien, die die Reaktionen von Organismen auf Umweltveränderungen untersuchen, können jedoch, je nach Taxon, zu komplex, langwierig und teuer werden. Ebenso sollten Komplikationen im Umgang mit gefährdeten Arten nicht außer Acht gelassen werden. Die ökoevolutionäre Modellierung bietet jedoch die Möglichkeit, diese Einschränkungen zu überwinden und empirische Studien zu ergänzen, die Wirkung und Grenzen der zugrunde liegenden Mechanismen zu verstehen und mögliche Zukunftsszenarien zu erstellen. In dieser Arbeit untersuche ich mittels einer Modellierungsmethode die Wirkung und relative Bedeutung evolutionärer Mechanismen (einschließlich phänotypischer Plastizität) auf die Fähigkeit zur lokalen Anpassung von Populationen mit unterschiedlichen Lebensstrategien, die Szenarien des Klimawandels durchleben. Dazu habe ich in einem Review den Stand der Technik ökoevolutionärer individuenbasierender Modelle (Individual-Based Models; IBMs) zusammengefasst und Ansätze für eine zukünftige Forschung identifiziert. Die Erkenntnisse des Reviews nutzte ich, um ein ökoevolutionäres, individuelles Modellierungsprogramm zu entwickeln. Dieses analysiert die Rolle genetischer und plastischer Mechanismen zur Förderung der lokalen Anpassung organismischer Populationen mit unterschiedlichen Lebensstrategien, welche Szenarien des Klimawandels und der ökologischen Stochastik erfahren. Die Umweltbedingungen wurden durch eine klimatische Variable (z.B. Temperatur) simuliert, die ein phänotypisches Optimum definiert, das sich mit einer bestimmten Änderungsrate bewegt. Verschiedene Änderungsraten wurden angewandt, um unterschiedliche Szenarien des Klimawandels darzustellen (keine Veränderung, langsamer, mittlerer, schneller Klimawandel). Es wurden mehrere Szenarien stochastischen Farbrauschens untersucht, die verschiedene klimatische Bedingungen widerspiegeln. Die Ergebnisse zeigen, dass Populationen sexueller Arten hauptsächlich auf genetische Variation und phänotypische Plastizität hinsichtlich lokalen Anpassung angewiesen sind. Populationen von Arten mit relativ langsamer Wachstumsrate (z.B. große Säugetiere), und insbesondere die mit kleiner Populationsgröße, sind am anfälligsten, vor allem wenn ihre Plastizität begrenzt ist (d.h. spezialisierte Arten). Wenn Individuen dieser Populationen zu adaptiver Plastizität fähig sind, können sie Fitnessverluste unter „rötlichen“ Klimabedingungen ausgleichen. Zugleich können diese Populationen durch Anpassung der Plastizität auch unter bläulichen Umweltbedingungen zurecht kommen (z.B. Bed-Hedging-Strategie). Im Gegensatz dazu können sich Lebensstrategen mit hoher Reproduktionszahl auf nicht-adaptive Plastizität zur lokalen Anpassung an neue Umweltbedingungen verlassen, es sei denn, die Änderungsrate ist zu schnell. Eine empfohlene Handlungsmaßnahme ist es, die Eingliederung von isolierten Populationen in Metapopulationen zu gewährleisten, so dass die genetische Variation erhöht werden kann. Wenn eine lokale Anpassung problematisch wird, sollte ihnen gleichzeitig Migrationsfreiraum gegeben werden, um ihrer bevorzugten Nische zu folgen. Dies ist besonders wichtig für „bläuliche“ und „rötliche“ Klimabedingungen, bei denen die Änderungsrate langsam ist, oder für jede klimatische Bedingung, wenn die Belastung (Änderungsrate) relativ hoch ist. KW - climate change KW - local adaptation KW - plasticity KW - evolution KW - individual-based model KW - Klimawandel KW - lokale Anpassung KW - Plastizität KW - Evolution KW - Individuen-basierende Modelle Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-430627 ER -