TY - THES A1 - Schorling, Markus T1 - Ökologische und phytomedizinische Untersuchungen zum Anbau von Bt-Mais im Maiszünsler-Befallsgebiet Oderbruch T1 - Ecological and phytomedical investigations on Bt maize grown in the European corn borer (Ostrinia nubilalis) infested area in the Oderbruch region (Germany) N2 - In den letzten 20 Jahren hat sich der Maiszünsler (Ostrinia nubilalis HÜBNER), aus der Schmetterlingsfamilie der Pyralidae oder Zünsler, zum bedeutendsten tierischen Schädling des Maises (Zea mays) entwickelt. Eine Möglichkeit den Befall des Maiszünslers abzuwenden, bietet der Anbau von Bacillus thuringiensis-Mais (Bt-Mais). Mit Hilfe der Gentechnik wurden Gene des Bakteriums Bacillus thuringiensis übertragen, die einen für Fraßinsekten giftigen Wirkstoff bilden, wodurch die Pflanzen während der kompletten Vegetation vor den Larven des Maiszünslers geschützt sind. Ziel des vorliegenden Projektes war es, in einer 3-jährigen Studie die Auswirkungen des großflächigen Anbaus von Bt-Mais auf die ökologische Situation und den Handlungsrahmen des integrierten Pflanzenschutzes komplex zu untersuchen. Dazu wurden in Betrieben im Oderbruch, das als permanentes Befallsgebiet des Maiszünslers gilt, in den Jahren 2002 bis 2004 jährlich zwei Felder mit jeweils einer Bt-Sorte und einer konventionellen Sorte angelegt. Zusätzlich wurden biologische und chemische Maiszünsler-Bekämpfungsvarianten geprüft. Durch verschiedene Methoden wie Bonituren, Ganzpflanzenernten, Bodenfallenfänge und Beobachtungen des Wahlverhaltens von (Flug-)insekten konnten Aussagen zum Vorkommen von Insekten und Spinnentieren getroffen werden, wobei hierfür Daten aus Untersuchungen der Jahre 2000 und 2001 im Oderbruch ergänzend herangezogen werden konnten. Durch Ertragsmessungen, Energie- und Qualitätsermittlungen, sowie Fusarium- und Mykotoxinanalysen konnte der Anbau von Bt-Mais als neue Alternative zur Bekämpfung des Maiszünslers bewertet werden. Bezüglich des Auftretens von Insekten und Spinnentieren wurden im Mittel der fünfjährigen Datenerhebung beim Vergleich der Bt-Sorte zur konventionellen Sorte, mit Ausnahme der fast 100 %igen Bekämpfung des Maiszünslers, keine signifikanten Unterschiede festgestellt. Hierfür wurde ein besonderes Augenmerk auf Thripse, Wanzen, Blattläuse und deren Fraßfeinde, sowie mittels Bodenfallenfängen auf Laufkäfer und Spinnen gerichtet. Die erwarteten ökonomischen Vorteile wie etwa Ertragsplus oder bessere Nährstoff- und Energiegehalte durch geringeren Schaden beim Anbau von Bt-Mais als Silomais blieben in den Untersuchungsjahren aus. Allerdings zeigten Fusarium- und Mykotoxinanalysen eine geringere Belastung des Bt-Maises, was möglicherweise auf den geringeren Schaden zurückzuführen ist, da beschädigte Pflanzen für Fusarium und Mykotoxine anfälliger sind. Desweiteren konnten erste methodische Ansätze für ein auf EU-Ebene gefordertes, den Anbau von Bt-Mais begleitendes Monitoring, erarbeitet werden. So konnten Vorschläge für geeignete Methoden, deren Umfang sowie des Zeitpunktes der Durchführungen gemacht werden. N2 - In the last 20 years the European corn borer (Ostrinia nubilalis, Pyralidae) has become the most important pest in maize (Zea mays). One of a couple of possibilities to reduce the infestation by the European corn borer is the cultivation of Bacillus thuringiensis maize (Bt maize). Genetic engineering transmitted genes from Bacillus thuringiensis, which produce a substance that is toxic to feeding insects and thus protect plants against the larvae of the European corn borer during the whole vegetation. The present project is a 3-year study to identify the effects of Bt maize growing on the ecological situation and the possibilities of integrated plant protection. From 2002 to 2004, two fields in the Oderbruch region, where Ostrinia nubilalis occurs, were each planted with Bt maize and a conventional maize variety every year. Furthermore, a biological and a chemical strategy against the European corn borer were verified. Different methods like counts, harvest of whole plants, pitfall traps and observation the landing behaviour of flying insects were used to determine the abundance of insects and spiders. Furthermore, we could use additional data from studies obtained in the Oderbruch region in 2000 and 2001. The determination of yield, quality and energy content of the crops as well as of the degree of Fusarium infection and contamination by mycotoxins led to the conclusion that the cultivation of Bt maize is a new alternative strategy to control the European corn borer. The average occurrence of insects and spiders did not differ significantly between Bt maize and the conventional variety in the 5 years of data recording. The only exception is the almost total control of the European corn borer. Attention was especially paid to thrips, bugs, aphids and their feeding enemies and using ground traps to ground beetles and spiders. The expected economic benefits like increased yield or nutrient and energy content of the crop as a result of a minimized damage to silage Bt maize were not achieved in the years under investigation. However, the analysis of Fusarium and mycotoxins indicated a lower exposure of Bt maize, which may result from a lower damage caused by Ostrinia nubilalis, and damaged plants are more susceptible to Fusarium and mycotoxins. Furthermore, we developed a first methodological approach for the monitoring procedure of Bt maize growing required by the EU. We have made proposals on appropriate methods, their extent as well as the optimum time of their application. KW - Maiszünsler KW - Oderbruch KW - Monitoring KW - Gentechnologie KW - Biodiversität KW - Bt-Mais KW - Bt maize KW - European corn borer KW - Ostrinia nubilalis KW - genetic engineering KW - monitoring Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-6260 ER - TY - THES A1 - Lengefeld, Jan T1 - Zirkulardichroismus-Messungen mit Synchrotronstrahlung am BESSY : Möglichkeiten und Grenzen bei der Untersuchung biologischer Proben T1 - Synchrotron radiation circular dichroism measurements at BESSY : potentials and limitations investigating biological samples N2 - In dieser Arbeit wurden die Möglichkeiten und Grenzen für Zirkulardichroismus-Messungen mit Synchrotronstrahlung untersucht. Dazu wurde ein Messaufbau für Zirkulardichroismus-Messungen an zwei Strahlrohren am Berliner Elektronenspeicherring für Synchrotronstrahlung eingesetzt, die für Messungen im Bereich des ultravioletten Lichts geeignet sind. Eigenschaften der Strahlrohre und des Messaufbau wurden in einigen wichtigen Punkten mit kommerziellen Zirkulardichroismus-Spektrometern verglichen. Der Schwerpunkt lag auf der Ausdehnung des zugänglichen Wellenlängenbereichs unterhalb von 180 nm zur Untersuchung des Zirkulardichroismus von Proteinen in diesem Bereich. In diesem Bereich ist es nicht nur die Lichtquelle sondern vor allem die Absorption des Lichts durch Wasser, die den Messbereich bei der Messung biologischer Proben in wässriger Lösung einschränkt. Es wurden Bedingungen gefunden, unter denen der Messbereich auf etwa 160 nm, in einigen Fällen bis auf 130 nm ausgedehnt werden konnte. Dazu musste die Pfadlänge deutlich reduziert werden und verschieden Probenküvetten wurden getestet. Der Einfluss der dabei auftretenden Spannungsdoppelbrechung in den Probenküvetten auf das Messsignal konnte mit einem alternativen Messaufbau deutlich reduziert werden. Systematische Fehler im Messsignal und auftretende Strahlenschäden begrenzen jedoch die Zuverlässigkeit der gemessenen Spektren. Bei Proteinfilmen schränkt die Absorption von Wasser den Messbereich kaum ein. Es wurden jedoch meist deutliche Unterschiede zwischen den Spektren von Proteinfilmen und den Spektren von Proteinen in wässriger Lösung festgestellt. Solange diese Unterschiede nicht minimiert werden können, stellen Proteinfilme keine praktikable Alternative zu Messungen in wässriger Lösung dar. N2 - The possibilities and limitations for synchrotron radiation circular dichroism measurements were investigated in this thesis. Therefore an experimental setup to measure circular dichroism was used at two beamlines at the “Berliner Elektronenspeicherring für Synchrotronstrahlung”(BESSY), which were suitable in the ultraviolet range of light. Properties of the beamlines and the experimental setup were compared to those of commercial circular dichroism spectrometer in some important points. The focus was on the extension of the accessible wavelength range below 180 nm, with the aim to investigate the circular dichroism of proteins in that range. It is not only the light source that limits measurements with aqueous solutions in that range, but mainly the absorption of the light by water. Conditions were found under which the wavelength range was extended to about 160 nm, in some cases even to 130 nm. To achieve this, a significant reduction of the pathlength was necessary. Several sample cells were tested for their usability. The effect of birefringence within the sample cells on the circular dichroism signal could be reduced strongly with an alternative experimental setup. However systematic errors in the circular dichroism signal and appearing radiation damage of the proteins limits the reliability of the measured spectra. By using protein films, the light absorption by water is not a problem anymore. However, significant differences between the circular dichroism spectra of protein films and proteins in aqueous solution occurred in most of the cases. Unless these differences can be eliminated, measuring protein films is not an alternative to measurements in aqueous solution. KW - Synchrotronstrahlung KW - Zirkulardichroismus KW - BESSY KW - Wasserabsorption KW - Protein KW - synchrotron radiation KW - circular dichroism KW - BESSY KW - water absorbance KW - protein Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-44263 ER - TY - THES A1 - Brandt, Stephan Peter T1 - Zelltyp-spezifische Mikroanalyse von Arabidopsis thaliana-Blättern N2 - Im ersten Teil der Arbeit wurden Strategien zur Analyse von Transkripten erarbeitet. Die ersten Versuche zielten darauf ab, in mit Glaskapillaren genommenen Einzelzellproben verschiedener Gewebeschichten RT-PCR durchzuführen, um spezifische Transkripte nachweisen zu können. Dies gelang für eine Reihe von Genen aus verschiedenen Pflanzenspezies. Dabei konnten sowohl Transkripte stark wie auch schwach exprimierter Gene nachgewiesen werden. Für die Erstellung von Gewebe-spezifischen Expressionsprofilen war es notwendig, die in vereinigten Zellproben enthaltene mRNA zunächst zu amplifizieren, um eine ausreichende Menge für Arrayhybridisierungen zu erhalten. Vor der Vermehrung wurde die mRNA revers transkribiert. Es wurden daran anschließend verschiedene Amplifikationsstrategien getestet: Die neben Tailing, Adapterligation und anderen PCR-basierenden Protokollen getestete Arbitrary-PCR hat sich in dieser Arbeit als einfache und einzige Methode herausgestellt, die mit so geringen cDNA-Mengen reproduzierbar arbeitet. Durch Gewebe-spezifische Array-hybridisierungen mit der so amplifizierten RNA konnten schon bekannte Expressionsmuster verschiedener Gene, vornehmlich solcher, die an der Photosynthese beteiligt sind, beobachtet werden. Es wurden aber auch eine ganze Reihe neuer offensichtlich Gewebe-spezifisch exprimierter Gene gefunden. Exemplarisch für die differentiell exprimierten Gene konnte das durch Arrayhybridisierungen gefundene Expressionsmuster der kleinen Untereinheit von Rubisco verifiziert werden. Hierzu wurden Methoden zum Gewebe-spezifischen Northernblot sowie semiquantitativer und Echtzeit-Einzelzell-RT-PCR entwickelt. Im zweiten Teil der Arbeit wurden Methoden zur Analyse von Metaboliten einschließlich anorganischer Ionen verwendet. Es stellte sich heraus, daß die multiparallele Methode der Gaschromatographie-Massenspektrometrie keine geeignete Methode für die Analyse selbst vieler vereinigter Zellinhalte ist. Daher wurde auf Kapillarelektrophorese zurückgegriffen. Eine Methode, die mit sehr kleinen Probenvolumina auskommt, eine hohe Trennung erzielt und zudem extrem geringe Detektionslimits besitzt. Die Analyse von Kohlenhydraten und Anionen erfordert eine weitere Optimierung. Über UV-Detektion konnte die K+-Konzentration in verschiedenen Geweben von A. thaliana bestimmt werden. Sie lag in Epidermis und Mesophyll mit ca. 25 mM unterhalb der für andere Pflanzenspezies (Solanum tuberosum und Hordeum vulgare) publizierten Konzentration. Weiter konnte gezeigt werden, daß zwölf freie Aminosäuren mittels einer auf Kapillarelektrophorese basierenden Methode in vereinigten Zellproben von Cucurbita maxima identifiziert werden konnten. Die Übertragung der Methode auf A. thaliana-Proben muß jedoch weiter optimiert werden, da die Sensitivität selbst bei Laser induzierter Fluoreszenz-Detektion nicht ausreichte. Im dritten und letzten Teil der Arbeit wurde eine Methode entwickelt, die die Analyse bekannter wie unbekannter Proteine in Gewebe-spezifischen Proben ermöglicht. Hierzu wurde zur Probennahme mittels mechanischer Mikrodissektion eine alternative Methode zur Laser Capture Microdissection verwendet, um aus eingebetteten Gewebeschnitten distinkte Bereiche herauszuschneiden und somit homogenes Gewebe anzureichern. Aus diesem konnten die Proteine extrahiert und über Polyacrylamidgelelektrophorese separariert werden. Banden konnten ausgeschnitten, tryptisch verdaut und massenspektrometrisch die Primärsequenz der Peptidfragmente bestimmt werden. So konnten als Hauptproteine im Mesophyll die große Untereinheit von Rubisco sowie ein Chlorophyll bindendes Protein gefunden werden. Die in dieser Arbeit entwickelten und auf die Modellpflanze Arabidopsis thaliana angewandten Einzelzellanalysetechniken erlauben es in Zukunft, physiologische Prozesse besser sowohl räumlich als auch zeitlich aufzulösen. Dies wird zu einem detaillierteren Verständnis mannigfaltiger Vorgänge wie Zell-Zell-Kommunikation, Signalweiterleitung oder Pflanzen-Pathogen-Interaktionen führen. N2 - The subject of this thesis was the analysis of single plant cells in respect to their contents of i) transcripts, ii) inorganic cations and anions, iii) metabolites like amino acids and carbohydrates as well as iv) proteins. One task was the transfer of existing methods to single cell analysis on leaf tissues of the model plant Arabisopsis thaliana L., the second one was the refinement and the development, respectively, of new protocols for the analysis of such picoliter samples. For cell type specific sampling two different complimentary methods were applied: Using micro glass capillaries specific single cell contents could be harvested from intact plants, whereas typical sample volumes were in the picoliter range. Even the sampling of inner cell types such as companion cells could be demonstrated. Using mechanical micro dissection of embedded tissue a larger amount of homogenous tissue could be collected. Because single cell samples contain only femtogram amounts of mRNA, direct detection of transcripts is impossible. Therefore, two amplification protocols were applied to the cell samples: The first procedure makes use of specifically primed RT-PCR for amplification. Several genes derived from different plants and tissues could be detected after successful RT-PCR, including high as well as low expressed genes. The second method was developed to monitor the activity of many genes in parallel using array hybridisation with filters containing the cDNA of as many as 16.000 ESTs. For this purpose, unspecific RT-PCR as it is applied in the differential display was used to amplify different transcripts in just one reaction. However, in these tissue specific array hybridisations the expression patterns of several hundreds genes could be monitored. These included known tissue specific expression patterns (of mainly photosynthesis related genes) as well as a couple of unknown expression patterns. To verify the tissue specificity of gene activity some results were reconsidered using tissue specific northern blot hybridisations and real time RT-PCR, respectively. Secondly, metabolites (including inorganic ions) were investigated: Because gas chromatography-mass spectrometry does not reveal the sensitivity which in necessary for the analysis of even multiple pooled single cell samples capillary electrophoresis was applied for these studies. This method has a high potential as it needs only small amounts of starting material, has uncomparable low detection limits and exhibits a high number of theoretical plates. The analysis of inorganic anions and carbohydrates needs further optimisations. Using UV absorption-detection potassium could be detected in different cell types whereas the concentrations in mesophyll and epidermis were found around 25 mM each. These concentrations are lower than in other species as Solanum tuberosum or Hordeum vulgare. For investigations of amino acids the cell samples were derivatized to make the use of laser induced fluorescence-detection capable. In samples derived from pumpkin (Cucurbita maxima) mesophyll twelve amino acids could be detected and identified. The transfer of this method to A. thaliana derived samples exhibited no results which may be due to the low concentration of free amino acids in these plants. Finally, a method was developed with which the existence of known and unknown proteins in tissue specific samples could be monitored. For this, mechanical micro dissection was used to: After embedding and sectioning the tissue of interest was cut out by an vibrating steel chisel to get homogenous samples. The proteins contained in these tissue pieces were extracted and separated by one dimensional SDS polyacrylamid gel electrophoresis. Several protein bands could be detected after staining with either silver or coomassie blue stain. These bands were cut out and sequenced by mass spectrometry. The large subunit of rubisco as well as one chlorophyll binding protein could be identified as the major proteins within the mesophyll. The single cell analysis methods which were developed and applied to the model plant A. thaliana in this thesis allow a better spatial as well as temporal resolution of analysis. This will lead to a more detailed understanding of physiological processes like cell to cell communication, signalling or plant-pathogen interactions. KW - Einzelzellanalytik KW - minimal invasive Probennahme KW - Array Hybridisierung KW - RT-PCR KW - Kapillarelektrophorese KW - Fluoreszeinisothiocyanat KW - mechanische Mikrodis KW - single cell analysis KW - minimal invasive sampling KW - single cell sammpling and analysis (SCSA) KW - array hybridisation KW - RT-PCR KW - capillary electrophoresis KW - fl Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0000410 ER - TY - THES A1 - Pacholsky, Dirk T1 - Zell-Zell- und Zell-Matrix-Kontakte während der Muskelentwicklung N2 - Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei humane Varianten des von Wang et al., 1999, erstmals beschriebenen muskelspezifischen Proteins Xin (Huhn und Maus) über Sequenzanalyse, Immunofluoreszenzmikroskopie, Transfektionsstudien und biochemischer Analyse näher charakterisiert. Die Proteine wurden mit human Xin related proteins 1 und 2 – hXirp1 und 2 –bezeichnet. Die Xin-Proteine enthielten bisher unbekannte, sowie spezifische, repetitive Motive, die aus jeweils mindestens 16 Aminosäuren bestanden. Ihre Aminosäuresequenz, mit einer Vielzahl weiterer putativer Motivsequenzen, verwies auf eine potentielle Funktion von hXirp als Adapterprotein in Muskelzellen. Das hier näher untersuchte hXirp1 lokalisierte an den Zell-Matrix-Verbindungen der Muskel-Sehnen-Übergangszone im Skelettmuskel, sowie an den Zell-Zell-Verbindungen der Glanzstreifen im Herzmuskel. Während der Muskelentwicklung zeigte hXirp1 eine sehr frühe Expression, zusammen mit einer prägnanten Lokalisation an den Prämyofibrillen und deren Verankerungsstrukturen, die auf eine Funktion des Proteins in der Myofibrillogenese deuten. Ektopische Expressionen von hXirp1 in einer Vielzahl von Nichtmuskel-Kulturzellen zeigten wiederum eine Lokalisation des Proteins an den Zell-Matrix-Kontakten dieser Zellen. Am Beispiel von hXirp1 und 2 wurde stellvertretend für die Familie der Xin-Proteine gezeigt, daß es sich bei den repetitiven Motiven um neuartige, F-Aktin bindende Sequenzmotive handelte. Die Xin-Proteine können somit als muskelspezifische, aktinbindende, potentielle Adapterproteine bezeichnet werden, denen eine strukturelle und funktionelle Beteiligung an der Verankerung der Myofibrillen im adulten Muskel, wie auch während der Myofibrillogenese zukommt. N2 - The scope of this work was a further characterization of two human variants of the protein Xin which was reported for chicken and mouse in 1999 by Wang et al. Therefor sequence analysis, immunofluorescence microscopy, transfection studies and biochemical approaches were utilized. The proteins were named human Xin related proteins 1 und 2 – hXirp1 und 2. Xin-proteins possess specific repetitive motives consisting of a minimum of 16 amino acids each. Concerning further putative motive sequences hXirp is a potential adapter protein in the muscle cell. hXirp1 localized within the cell-matrix-contacts of the myotendinous junction in skeletal muscle as well as within the cell-cell-contacts of the intercalated disc in the cardiac muscle. During the development of muscle cells hXirp1 showed early expression as well as concise localization to premyofibrils and their anchorage structures indicating a potential role for this protein in myofibrillogenesis. Ectopic expression of hXirp1 in several non-muscle cells again revealed localization of this protein to cell-matrix contacts. Considering hXirp1 and 2 as an example for all Xin-proteins it was shown that the repetitive motives are new actin binding motives. The data indicated the Xin-proteins as muscle specific, actin binding and potential adapter proteins with implications in structure and function of anchorage of myofibrils in adult muscle and myofibrillogenesis. KW - Muskel KW - Muskel-Sehnen-Verbindung KW - Glanzstreifen KW - Xin KW - muscle KW - myotendinous junction KW - intercalated disc KW - Xin Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0001161 ER - TY - THES A1 - Rietdorf, Katja T1 - Wirkungen biogener Amine auf die Erregungs-Sekretions-Kopplung in der Speicheldrüse von Periplaneta americana (L.) N2 - In der vorliegenden Arbeit habe ich wichtige Teilmechanismen der Erregungs-Sekretionskopplung in der Speicheldrüse der Schabe Periplaneta americana (L.) untersucht. Die Speicheldrüse ist von dopaminergen und serotonergen Fasern innerviert (Baumann et al., 2002). Beide Transmitter stimulieren eine unterschiedliche Reaktion der Drüse: Dopamin (DA) stimuliert die P-Zellen der Acini und die Ausführgangzellen, während Serotonin (5-HT) die P- und C-Zellen der Acini stimuliert, nicht jedoch die Ausführgangzellen. Der Endspeichel ist nach einer DA-Stimulierung proteinfrei. Dagegen enthält er nach einer 5-HT-Stimulierung Proteine, die von den C-Zellen sezerniert werden (Just & Walz, 1996). Im ersten Teil meiner Arbeit habe ich mittels Kapillarelektrophoretischer Analyse (CE-Analyse) die Elektrolytkonzentrationen im Endspeichel untersucht sowie die Raten der Flüssigkeitssekretion gemessen. Damit wollte ich klären, welche Transporter an der Sekretion des Primärspeichels und an dessen Modifikation beteiligt sind. Ausserdem wollte ich die Rolle der transportaktiven Epithelzellen der Ausführgänge für die Modifikation des Primärspeichels untersuchen. Dafür habe ich einen Vergleich der Elektrolytkonzentrationen im DA- und 5-HT-stimulierten Endspeichel durchgeführt. Der Elektrolytgehalt des DA- und 5-HT-stimulierten Endspeichels unterscheidet sich nicht signifikant voneinander. Er ist nach beiden Stimulierungen hypoosmotisch zum verwendeten Ringer. Die Ausführgangzellen werden durch DA stimuliert und modifizieren den Primärspeichel durch eine netto-Ionenreabsorption. Meine Versuche zeigen jedoch, dass auch die während einer 5-HT-Stimulierung der Drüse unstimulierten Ausführgangzellen den Primärspeichel modifizieren. In einer nachfolgenden Versuchsreihe habe ich den Einfluss von Ouabain, einem Hemmstoff der Na+-K+-ATPase, und Bumetanid, einem Hemmstoff des NKCC, auf die Raten der Flüssigkeitssekretion sowie den Elektrolytgehalt des Endspeichels untersucht. Ich habe gefunden, dass die Aktivität der Na+-K+-ATPase wichtig für die Modifikation des DA-stimulierten Primärspeichels ist. Im Gegensatz dazu ist sie für die Modifikation des 5-HT-stimulierten Primärspeichels nicht von Bedeutung. Bezüglich der Flüssigkeitssekretion habe ich keinen Einfluss der Na+-K+-ATPase-Aktivität auf die DA-stimulierten Sekretionsraten gefunden, dagegen ist die 5-HT-stimulierte Sekretionsrate in Anwesenheit von Ouabain gesteigert. Die Aktivität des NKCC ist für beide sekretorische Prozesse, die Ionen- und die Flüssigkeitssekretion, wichtig. Eine Hemmung des NKCC bewirkt eine signifikante Verringerung der Raten der Flüssigkeitssekretion nach DA- und 5-HT-Stimulierung sowie in beiden Fällen einen signifikanten Abfall der Ionenkonzentrationen im Endspeichel. Im zweiten Teil meiner Arbeit habe ich versucht, Änderungen der intrazellulären Ionenkonzentrationen in den Acinuszellen während einer DA- oder 5-HT-Stimulierung zu messen. Diese Experimente sollten mit der Methode des "ratiometric imaging" durchgeführt werden. Messungen mit dem Ca2+-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff Fura-2 zeigten keinen globalen Anstieg in der intrazellulären Ca2+-Konzentration der P-Zellen. Aufgrund von Problemen mit einer schlechten Beladung der Zellen, einer starken und sich während der Stimulierung ändernden Autofluoreszenz der Zellen sowie Änderungen im Zellvolumen wurden keine Messungen mit Na+- und K+-sensitiven Fluoreszenzfarbstoffen durchgeführt. Im dritten Teil dieser Arbeit habe ich die intrazellulären Signalwege untersucht, die zwischen einer 5-HT-Stimulierung der Drüse und der Proteinsekretion vermitteln. Dazu wurde der Proteingehalt im Endspeichel biochemisch mittels eines modifizierten Bradford Assay gemessen. Eine erstellte Dosis-Wirkungskurve zeigt, dass die Rate der Proteinsekretion von der zur Stimulierung verwendeten 5-HT-Konzentration abhängt. In einer Serie von Experimenten habe ich die intrazellulären Konzentrationen von Ca2+, cAMP und / oder cGMP erhöht und anschließend den Proteingehalt im Endspeichel gemessen. Ein Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration aktiviert nur eine geringe Rate der Proteinsekretion. Dagegen kann die Steigerung der intrazellulären cAMP-Konzentration eine stärkere Proteinsekretion aktivieren, die sich nicht signifikant von der nach 5-HT-Stimulierung unterscheidet. Die cAMP-stimulierte Proteinsekretion kann durch gleichzeitige Erhöhung der intrazellulären Ca2+-Konzentration weiter gesteigert werden. Dagegen aktivierte eine Erhöhung der intrazellulären cGMP-Konzentration die Proteinsekretion nicht. Aufgrund dieser Ergebnisse postuliere ich die Existenz eines die Adenylatcyclase aktivierenden 5-HT-Rezeptors in der Basolateralmembran der C-Zellen. N2 - The aim of this PhD-work was to investigate major mechanisms of excitation-secretion coupling in the salivary gland of the cockroach Periplaneta americana (L.). This salivary gland is innervated by dopaminergic and serotonergic fibres (Baumann et al., 2002). The two transmitters stimulate different processes in the gland: Dopamine (DA) stimulates the p-cells of the acini and the salivary duct cells, whereas 5-HT (serotonin) activates the p- and the c-cells of the acini, but not the salivary duct cells. Final saliva is completely protein-free after dopamine stimulation. It contains proteins, which are secreted by the c-cells of the acini, after a 5-HT-stimulation (Just & Walz, 1996). In the first part of my work I measured the electrolytic composition of the final saliva by capillary electrophoretic analysis and measured the rates of fluid secretion, in order to answer the following questions: 1.) Which transporters affect the production of primary saliva and its modification? 2.) What is the function of the transport-active salivary duct cells for the modification of the primary saliva? Electrolytic composition of the DA- and 5-HT-stimulated final saliva is not significantly different from each other, and is hypoosmotic to the Ringer used. Salivary duct cells are stimulated by DA and modify the primary saliva by a netto ion-reabsorption. My experiments also show that the duct cells, which are unstimulated during a 5-HT-stimulation of the gland, modify the primary saliva. In the next series of experiments I investigated the effects of ouabain, an inhibitor of the Na+-K+-ATPase, and bumetanide, an inhibitor of the NKCC on the rates of fluid secretion and the electrolytic composition of the final saliva. I found, that the activity of the Na+-K+-ATPase is important for the modification of DA-stimulated primary saliva during its flow through the stimulated duct system. In contrast, it is not important for modification of the 5-HT-stimulated primary saliva. Inhibition of the Na+-K+-ATPase does not affect rates of DA-stimulated fluid secretion, but it increases the rates of 5-HT-stimulated fluid secretion. Activity of the NKCC is important for both secretory processes: the ion and the fluid secretion. Inhibition of the NKCC results in a significant drop in the rates of fluid secretion after DA- and 5-HT-stimulation, as well as a drop in electrolytic concentrations in the saliva. In the second part of my work, I tried to measure changes in the intracellular ionic concentrations (Ca2+, Na+, and K+) within the acinar cells during a DA- or 5-HT-stimulation. The experiments should be performed by ratiometric imaging. Measurements with the Ca2+-sensitive dye Fura-2 did not show any global increase in the intracellular Ca2+-concentration in the p-cells of the acini. Problems concerning a bad loading of the cells, a strong autofluorescence which changed during the time course of the stimulation, as well as changes in the cell volume were the reason, that no measurements using Na+- or K+-sensitive dyes were performed. In the third part of my work I investigated the intracellular signalling pathways, which activate protein secretion after 5-HT-stimulation of the gland. A modified Bradford Assay was used for measuring the protein content in the final saliva. In a dose-response curve I showed that rates of protein secretion are dependent on the 5-HT-concentrations used to stimulate the glands. In another set of experiments I increased the intracellular concentrations of Ca2+, cAMP and / or cGMP, and measured the protein content in the final saliva. An increase in the intracellular Ca2+-concentration activates only a low rate of protein secretion. After an increase in the intracellular cAMP-concentration a much higher rate of protein secretion can be activated, which is not significantly different from the 5-HT stimulated rate of protein secretion. The cAMP-stimulated protein secretion can be further increased by a simultaneous rise in the intracellular Ca2+-concentration. In contrast, cGMP does not activate protein secretion. Therefore I propose the expression of an adenylyl cyclase activating 5-HT-receptor in the basolateral membrane of the protein secreting c-cells. KW - Periplaneta KW - Speicheldrüse KW - Speichel KW - ionale Zusammensetzung KW - Ionentransport KW - Proteinsekretion KW - second messenger KW - Periplaneta KW - salivary gland KW - saliva KW - ionic composition KW - ion transport KW - protein secretion KW - second messenger Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0000878 ER - TY - THES A1 - Itonaga, Naomi T1 - White storks (Ciconia ciconia) of Eastern Germany: age-dependent breeding ability, and age- and density-dependent effects on dispersal behavior T1 - Der Weißstorch (Ciconia ciconia) aus dem östlichen Deutschland: altersabhängiges Reproduktionsvermögen und alters- und bestandsdichteabhängiges Ausbreitungsverhalten N2 - Dispersal behavior plays an important role for the geographical distribution and population structure of any given species. Individual’s fitness, reproductive and competitive ability, and dispersal behavior can be determined by the age of the individual. Age-dependent as well as density-dependent dispersal patterns are common in many bird species. In this thesis, I first present age-dependent breeding ability and natal site fidelity in white storks (Ciconia ciconia); migratory birds breeding in large parts of Europe. I predicted that both the proportion of breeding birds and natal site fidelity increase with the age. After the seventies of the last century, following a steep population decline, a recovery of the white stork population has been observed in many regions in Europe. Increasing population density in the white stork population in Eastern Germany especially after 1983 allowed examining density- as well as age-dependent breeding dispersal patterns. Therefore second, I present whether: young birds show more often and longer breeding dispersal than old birds, and frequency of dispersal events increase with the population density increase, especially in the young storks. Third, I present age- and density-dependent dispersal direction preferences in the give population. I asked whether and how the major spring migration direction interacts with dispersal directions of white storks: in different age, and under different population densities. The proportion of breeding individuals increased in the first 22 years of life and then decreased suggesting, the senescent decay in aging storks. Young storks were more faithful to their natal sites than old storks probably due to their innate migratory direction and distance. Young storks dispersed more frequently than old storks in general, but not for longer distance. Proportion of dispersing individuals increased significantly with increasing population densities indicating, density- dependent dispersal behavior in white storks. Moreover, the finding of a significant interaction effects between the age of dispersing birds and year (1980–2006) suggesting, older birds dispersed more from their previous nest sites over time due to increased competition. Both young and old storks dispersed along their spring migration direction; however, directional preferences were different in young storks and old storks. Young storks tended to settle down before reaching their previous nest sites (leading to the south-eastward dispersal) while old birds tended to keep migrating along the migration direction after reaching their previous nest sites (leading to the north-westward dispersal). Cues triggering dispersal events may be age-dependent. Changes in the dispersal direction over time were observed. Dispersal direction became obscured during the second half of the observation period (1993–2006). Increase in competition may affect dispersal behavior in storks. I discuss the potential role of: age for the observed age-dependent dispersal behavior, and competition for the density dependent dispersal behavior. This Ph.D. thesis contributes significantly to the understanding of population structure and geographical distribution of white storks. Moreover, presented age- and density (competition)-dependent dispersal behavior helps understanding underpinning mechanisms of dispersal behavior in bird species. N2 - Das Verständnis der Mechanismen, die dem Ausbreitungsverhalten und der Wahl des Neststandorts zugrunde liegen, gibt wichtige Einsichten in Strukturen und Dynamiken von Tierpopulationen. Der Gesundheitszustand, die Produktivität und Konkurrenzfähigkeit sowie das Ausbreitungsverhalten eines Individuums können über das Alter ermittelt werden. Alters- und dichteabhängige Veränderungen in Verbreitungsmustern kommen bei vielen Vogelarten vor. In der vorliegenden Studie untersuchten wir zunächst den Effekt des Alters auf die Reproduktivität, auf die Wahl des Neststandorts sowie auf die Geburtsorttreue des Weißstorchs (Ciconia ciconia). Wir fragten, ob sowohl der Anteil der brütenden Individuen als auch die Geburtsorttreue mit dem Alter zunimmt. Weißstörche sind Zugvögel, die während der Migration zumeist segelnd die Thermik nutzen und in weiten Teilen Europas brüten. Nach einem starken Bestandsrückgang konnte in vielen Regionen Europas ab den 1970er Jahren wieder ein positiver Trend in der Populationsentwicklung beobachtet werden. Die zunehmende Populationsdichte, besonders nach 1983 in der ostziehenden Subpopulation in den fünf Bundesländern der ehemaligen DDR, erlaubte die Analyse von dichte- und altersabhängigen Präferenzen in der Richtung der Brutstandorte sowie in der Verbreitungsfrequenz und -distanz. Wir untersuchten zudem die Alters- und Dichteabhängigkeit der Ausbreitungsrichtung einer Teilpopulation. Wir fragten, ob und wie die Hauptzugrichtung im Frühjahr mit der Verbreitungsrichtung interagiert: Beeinflussen Alter und Populationsdichte die Ausbreitungsrichtung? Der Anteil der brütenden Individuen, die älter als 22 Jahre sind, nahm innerhalb der beobachteten Teilpopulation ab, vermutlich aufgrund einer altersbedingten Abnahme des Gesundheitszustands. Junge Vögel zeigten eine starke Geburtsorttreue, was auf eine genetische Komponente in den Zugmustern junger Störche hinweist. Generell trat bei jungen Störchen häufiger Ausbreitungsverhalten auf als bei älteren Störchen. Eine signifikante Zunahme der Ausbreitungsdistanz von Individuen über die Zeit lässt auf eine dichteabhängige Komponente im Ausbreitungsverhalten der Weißstörche schließen. Weiterhin wurde eine signifikante Interaktion zwischen dem Alter sich ausbreitender Individuen und dem betrachteten Jahr gefunden. Demzufolge breiteten sich alte Vögel über die Zeit über größere Distanzen aus, vermutlich um der ansteigenden Konkurrenz, bedingt durch den wachsenden Bestandsdruck, zu entgehen. KW - Weißstorch KW - Altersabhängigkeit KW - Dichteabhängigkeit KW - Ausbreitungsverhalten KW - Reproduktivität KW - White stork KW - age-dependent KW - density-dependent KW - dispersal behavior KW - breeding ability Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-39052 ER - TY - THES A1 - Pitzen, Valentin T1 - Weitergeführte funktionelle Charakterisierung des centrosomalen Proteins Cep192 und Untersuchung der Topologie des Centrosoms in Dictyostelium Amöben T1 - Functional Characterization of the Centrosomal Protein Cep192 and Investigation of the Topology of the Centrosome in Dictyostelium amoeba N2 - Das Centrosom von Dictyostelium ist acentriolär aufgebaut, misst ca. 500 nm und besteht aus einer dreischichten Core-Struktur mit umgebender Corona, an der Mikrotubuli nukleieren. In dieser Arbeit wurden das centrosomale Protein Cep192 und mögliche Interaktionspartner am Centrosom eingehend untersucht. Die einleitende Lokalisationsuntersuchung von Cep192 ergab, dass es während der gesamten Mitose an den Spindelpolen lokalisiert und im Vergleich zu den anderen Strukturproteinen der Core-Struktur am stärksten exprimiert ist. Die dauerhafte Lokalisation an den Spindelpolen während der Mitose wird für Proteine angenommen, die in den beiden identisch aufgebauten äußeren Core-Schichten lokalisieren, die das mitotische Centrosom formen. Ein Knockdown von Cep192 führte zur Ausbildung von überzähligen Mikrotubuli-organisierenden Zentren (MTOC) sowie zu einer leicht erhöhten Ploidie. Deshalb wird eine Destabilisierung des Centrosoms durch die verminderte Cep192-Expression angenommen. An Cep192 wurden zwei kleine Tags, der SpotH6- und BioH6-Tag, etabliert, die mit kleinen fluoreszierenden Nachweiskonjugaten markiert werden konnten. Mit den so getagten Proteinen konnte die hochauflösende Expansion Microscopy für das Centrosom optimiert werden und die Core-Struktur erstmals proteinspezifisch in der Fluoreszenzmikroskopie dargestellt werden. Cep192 lokalisiert dabei in den äußeren Core-Schichten. Die kombinierte Markierung von Cep192 und den centrosomalen Proteinen CP39 und CP91 in der Expansion Microscopy erlaubte die Darstellung des dreischichtigen Aufbaus der centrosomalen Core-Struktur, wobei CP39 und CP91 zwischen Cep192 in der inneren Core-Schicht lokalisieren. Auch die Corona wurde in der Expansion Microscopy untersucht: Das Corona-Protein CDK5RAP2 lokalisiert in räumlicher Nähe zu Cep192 in der inneren Corona. Ein Vergleich der Corona-Proteine CDK5RAP2, CP148 und CP224 in der Expansion Microscopy ergab unterscheidbare Sublokalisationen der Proteine innerhalb der Corona und relativ zur Core-Struktur. In Biotinylierungsassays mit den centrosomalen Core-Proteinen CP39 und CP91 sowie des Corona-Proteins CDK5RAP2 konnte Cep192 als möglicher Interaktionspartner identifiziert werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen die wichtige Funktion des Proteins Cep192 im Dictyostelium-Centrosom und ermöglichen durch die Kombination aus Biotinylierungsassays und Expansion Microscopy der untersuchten Proteine ein verbessertes Verständnis der Topologie des Centrosoms. N2 - The Dictyostelium centrosome contains no centrioles and has a diameter of approx. 500 nm. It consists of a three layered core structure and a surrounding corona, which nucleates microtubules. This work focusses on the centrosomal protein Cep192 and potential interactors at the centrosome. Localization studies showed, that Cep192 is a permanent resident at the spindle poles during mitosis and that, compared to other centrosomal core proteins, Cep192 is expressed at the highest level. The permanent residence at the spindle poles throughout mitosis is assumed for proteins which localize to the outer core layers, which form the mitotic centrosome. A knockdown of Cep192 resulted in supernumerary microtubule organizing centers (MTOC) and a slightly higher ploidy. Due to the phenotype, a destabilization of the centrosome caused by the reduced Cep192 expression is assumed. Cep192 was fused to the newly established short tags BioH6 and SpotH6, which are recognized by small fluorescently labelled probes. The tagged proteins were used for superresolution expansion microscopy. Superresolution expansion microscopy was optimized for the centrosome and allowed the protein specific resolving of the core structure for the first time. Cep192 localizes to the outer core layers. Combination of tagged proteins nicely mirrored all three core layers. CP39 and CP91 localize inbetween Cep192 in the inner core layer. Corona proteins were included in the expansion microscopy: the corona protein CDK5RAP2 comes into close proximity of Cep192 and localizes to the inner corona. A comparison with CP148 and CP224, two other corona proteins, revealed a distinct localization of the proteins within the corona and relatively to the core structure. Applied biotinylase assays with the core proteins CP39 and CP91, as well with the corona protein CDK5RAP2 revealed Cep192 as a possible interaction partner of all three proteins. The results of this work show the important function of Cep192 at the Dictyostelium centrosome and through the biotinylase assay and expansion microscopy data shed a light on the refined Dictyostelium centrosome topology. KW - Centrosom KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - expansion microscopy KW - Cep192 KW - CDK5RAP2 KW - fluorescence microscopy KW - Cep192 KW - CDK5RAP2 Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-548891 ER - TY - THES A1 - Heilmann, Katja T1 - Wechselwirkungen von Immunzellen mit synthetischen und biomimetischen Oberflächen T1 - Interactions of immune cells with synthetic and biomimetic surfaces N2 - Die vorliegende Arbeit wurde im Zeitraum von Oktober 2002 bis November 2005 an dem Institut für Biochemie und Biologie der Universität Potsdam in Kooperation mit dem Institut für Chemie des GKSS Forschungszentrums in Teltow unter der Leitung von Herrn Prof. Dr. B. Micheel und Herrn Prof. Dr. Th. Groth angefertigt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Wechselwirkungen von Immunzellen mit verschiedenen Kultursubstraten untersucht. Dafür wurden drei verschiedene Hybridomzelllinien eingesetzt. Eine Hybridomzelllinie (K2) ist im Laufe dieser Arbeit hergestellt und etabliert worden. Der Einsatz von synthetischen und proteinbeschichteten Kulturoberflächen führte bei Hybridomzellen zu einer deutlich gesteigerten Antikörpersynthese im Vergleich zu herkömmlichen Zellkulturmaterialien. Obwohl diese Zellen in der Regel als Suspensionszellen kultiviert werden, führten die eingesetzten Polymermembranen (PAN, NVP) zu einer verbesserten Antikörpersynthese (um 30%) gegenüber Polystyrol als Referenz. Es konnte gezeigt werden, dass es einen Zusammenhang zwischen der Produktivität und dem Adh asionsverhalten der Hybridomzellen gibt. Um den Einfluss von Proteinen der extrazellulären Matrix auf Zellwachstum und Antikörpersynthese von Hybridomzellen zu untersuchen, wurden proteinbeschichtete Polystyrol-Oberflächen eingesetzt. Für die Modifikationen wurden Fibronektin, Kollagen I, Laminin und BSA ausgewählt. Die Modifikation der Polystyrol-Oberfläche mit geringen Mengen Fibronektin (0,2-0,4 µg/ml) führte zu einer beträchtlichen Steigerung der Antikörpersynthese um 70-120%. Für Kollagen I- und BSA-Beschichtungen konnten Steigerungen von 40% beobachtet werden. Modifikationen der Polystyrol-Oberfläche mit Laminin zeigten nur marginale Effekte. Durch weitere Versuche wurde bestätigt, dass die Adhäsion der Zellen an Kollagen I- und Laminin-beschichteten Oberflächen verringert ist. Die alpha2-Kette des alpha2beta1-Integrins konnte auf der Zelloberfläche nicht nachgewiesen werden. Durch ihr Fehlen wird wahrscheinlich die Bindungsfähigkeit der Zellen an Kollagen I und Laminin beeinflusst. Durch die Ergebnisse konnte gezeigt werden, dass Hybridomzellen nicht nur Suspensionszellen sind und das Kultursubstrate das Zellwachstum und die Produktivität dieser Zellen stark beeinflussen können. Der Einsatz von synthetischen und proteinbeschichteten Kultursubstraten zur Steigerung der Antikörpersynthese kann damit für die industrielle Anwendung von großer Relevanz sein. Für die Modellierung einer Lymphknotenmatrix wurden Fibronektin, Kollagen I, Heparansulfat und N-Acetylglucosamin-mannose in verschiedenen Kombinationen an Glasoberflächen adsorbiert und für Versuche zur In-vitro-Immunisierung eingesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass die Modifikation der Oberflächen die Aktivierung und Interaktion von dendritischen Zellen, T- und B-Lymphozyten begünstigt, was durch den Nachweis spezifischer Interleukine (IL12, IL6) und durch die Synthese spezifischer Antikörper bestätigt wurde. Eine spezifische Immunreaktion gegen das Antigen Ovalbumin konnte mit den eingesetzten Zellpopulationen aus Ovalbumin-T-Zell-Rezeptor-transgenen Mäusen nachgewiesen werden. Die In-vitro-Immunantwort wurde dabei am stärksten durch eine Kombination von Kollagen I, Heparansulfat und N-Acetylglucosamin-mannose auf einer Glasoberfläche gefördert. Die Etablierung einer künstlichen Immunreaktion kann eine gesteuerte Aktivierung bzw. Inaktivierung von körpereigenen dendritischen Zellen gegen bestehende Krankheitsmerkmale in vitro ermöglichen. Durch die Versuche wurden Grundlagen für spezifische Immunantworten erarbeitet, die u.a. für die Herstellung von humanen Antikörpern eingesetzt werden können. N2 - In this scientific work the interactions of immune cells with different culture substrata were investigated. Therefore, three hybridoma cell lines were tested, one cell line (K2) was established during this work. The application of synthetic and protein-coated culture surfaces lead to a significantly increased synthesis of monoclonal antibodies in comparison to usual tissue polystyrene. Although hybridoma cells were normally cultured in suspension applied polymer membranes like PAN and NVP induced an increase by 30%. Furthermore, an influence of cell adhesion and antibody synthesis could be shown. To investigate the influence of extracellular matrix proteins on growth and antibody synthesis of hybridoma cells tissue culture polystyrene was coated with fibronectin, collagen I, laminin and bovine serum albumine in different concentrations. Modifications with fibronectin (concentrations between 0.2 and 0.4 µg/ml) improved the yield of monoclonal antibodies considerably by 70-120%. Coating cell culture plates with collagen I and bovine serum albumine induced an increase by 40%. The coating with laminin showed only marginal effects. Further experiments approved a decreased adhesion of hybridoma cells on collagen I and laminin coated surfaces. FACS analysis showed a reduced presence of the alpha2-chain of the alpha2/beta1-integrin responsible for mediating the binding to collagen I and laminin. Probably, the binding affinity to collagen I and laminin coated surfaces was influenced by this. The results showed a high impact of modified culture substrata on antibody synthesis even if hybridoma cells were cultured in suspension normally and this could be an approach for industrial application. The second part of this work comprised the creation of a lymph node paracortex related surface. Different matrix proteins like fibronectin, collagen I, heparane sulfate and a sugar named N-acetylglucosamine-mannose were coated in different combinations on glass surfaces to create a matrix. Dendritic cells were cultivated on these surfaces and get activated with ovalbumin. After that naïve T- and B-cell populations were added and it could be shown nicely that the modifications of the culture surface were essential for activation and interaction of dendritic cells, T- and B-cells which resulted in the secretion of specific interleukins (IL12, IL6) and specific antibodies (anti-ovalbumin-antibodies). In these experiments a specific immune respone to ovalbumin in vitro could be detected if the cells were isolated from ovalbumin-receptor-transgenic-mice (TgNDO11.10). This In-vitro-immunization was triggered at most if cells were cultured on a surface coated with a combination of collagen I, heparane sulfate and N-acetylglucosamine-mannose. These experiments could be basics for controlled specific immune reactions in vitro which could be used for the production of human antibodies or for the controlled activation or inactivation of immune cells. KW - Hybridomtechnik KW - Antikörper KW - Extrazelluläre Matrix KW - Antikörperproduktion KW - Adhäsion KW - Polymermembranen KW - adhesion KW - polymer membranes KW - hybridoma cells KW - antibody synthesis Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-8843 ER - TY - THES A1 - Gromelski, Sandra T1 - Wechselwirkung zwischen Lipiden und DNA : auf dem Weg zum künstlichen Virus T1 - Interaction between lipids and DNA : on the way to the artificial virus N2 - Weltweit versuchen Wissenschaftler, künstliche Viren für den Gentransfer zu konstruieren, die nicht reproduktionsfähig sind. Diese sollen die Vorteile der natürlichen Viren besitzen (effizienter Transport von genetischem Material), jedoch keine Antigene auf ihrer Oberfläche tragen, die Immunreaktionen auslösen. Ziel dieses Projektes ist es, einen künstlichen Viruspartikel herzustellen, dessen Basis eine Polyelektrolytenhohlkugel bildet, die mit einer Lipiddoppelschicht bedeckt ist. Um intakte Doppelschichten zu erzeugen, muss die Wechselwirkung zwischen Lipid und Polyelektrolyt (z.B. DNA) verstanden und optimiert werden. Dazu ist es notwendig, die strukturelle Grundlage der Interaktion aufzuklären. Positiv geladene Lipide gehen zwar starke Wechselwirkungen mit der negativ geladenen DNA ein, sie wirken jedoch toxisch auf biologische Zellen. In der vorliegenden Arbeit wurde daher die durch zweiwertige Kationen vermittelte Kopplung von genomischer oder Plasmid-DNA an zwitterionische oder negativ geladene Phospholipide an zwei Modellsystemen untersucht. 1. Modellsystem: Lipidmonoschicht an der Wasser/Luft-Grenzfläche Methoden: Filmwaagentechnik in Kombination mit IR-Spektroskopie (IRRAS), Röntgenreflexion (XR), Röntgendiffraktion (GIXD), Brewsterwinkel-Mikroskopie (BAM), Röntgenfluoreszenz (XRF) und Oberflächenpotentialmessungen Resultate: A) Die Anwesenheit der zweiwertigen Kationen Ba2+, Mg2+, Ca2+ oder Mn2+ in der Subphase hat keinen nachweisbaren Einfluss auf die Struktur der zwitterionischen DMPE- (1,2-Dimyristoyl-phosphatidyl-ethanolamin) Monoschicht. B) In der Subphase gelöste DNA adsorbiert nur in Gegenwart dieser Kationen an der DMPE-Monoschicht. C) Sowohl die Adsorption genomischer Kalbsthymus-DNA als auch der Plasmid-DNA pGL3 bewirkt eine Reduktion des Neigungswinkels der Alkylketten, die auf einen veränderten Platzbedarf der Kopfgruppe zurückzuführen ist. Durch die Umorientierung der Kopfgruppe wird die elektrostatische Wechselwirkung zwischen den positiv geladenen Stickstoffatomen der Lipidkopfgruppen und den negativ geladenen DNA-Phosphaten erhöht. D) Die adsorbierte DNA weist eine geordnete Struktur auf, wenn sie durch Barium-, Magnesium-, Calcium- oder Manganionen komplexiert ist. Der Abstand zwischen parallelen DNA-Strängen hängt dabei von der Größe der DNA-Fragmente sowie von der Art des Kations ab. Die größten Abstände ergeben sich mit Bariumionen, gefolgt von Magnesium- und Calciumionen. Die kleinsten DNA-Abstände werden durch Komplexierung mit Manganionen erhalten. Diese Ionenreihenfolge stellt sich sowohl für genomische DNA als auch für Plasmid-DNA ein. E) Die DNA-Abstände werden durch die Kompression des Lipidfilms nicht beeinflusst. Zwischen der Lipidmonoschicht und der adsorbierten DNA besteht demnach nur eine schwache Wechselwirkung. Offensichtlich befindet sich die durch zweiwertige Kationen komplexierte DNA als weitgehend eigenständige Schicht unter dem Lipidfilm. 2. Modellsystem: Lipiddoppelschicht an der fest/flüssig-Grenzfläche Methoden: Neutronenreflexion (NR) und Quarzmikrowaage (QCM-D) Resultate: A) Das zwitterionische Phospholipid DMPC (1,2-Dimyristoyl-phosphatidylcholin) bildet keine Lipiddoppelschicht auf planaren Polyelektrolytmultischichten aus, deren letzte Lage das positiv geladene PAH (Polyallylamin) ist. B) Hingegen bildet DMPC auf dem negativ geladenen PSS (Polystyrolsulfonat) eine Doppelschicht aus, die jedoch Defekte aufweist. C) Eine Adsorption von genomischer Kalbsthymus-DNA auf dieser Lipidschicht findet nur in Gegenwart von Calciumionen statt. Andere zweiwertige Kationen wurden nicht untersucht. D) Das negativ geladene Phospholipid DLPA (1,2-Dilauryl-phosphatidsäure) bildet auf dem positiv geladenen PAH eine Lipiddoppelschicht aus, die Defekte aufweist. E) DNA adsorbiert ebenfalls erst in Anwesenheit von Calciumionen in der Lösung an die DLPA-Schicht. F) Durch die Zugabe von EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) werden die Calciumionen dem DLPA/DNA-Komplex entzogen, wodurch dieser dissoziiert. Demnach ist die calciuminduzierte Bildung dieser Komplexe reversibel. N2 - All over the world scientists are trying to engineer artificial viruses, which do not replicate, for gene delivery. These artificial viruses should have the advantages of natural viruses such as efficient transport of genetic material, but they should not carry antigens, which cause immune reactions, on their top portion. The aim of this project is to develop an artificial virus particle that is based on a polyelectrolyte hollow capsule which is covered by a lipid bilayer. To create intact bilayers, it is crucial to understand and optimize the interaction between lipids and polyelectrolytes (e. g. DNA). Therefore the structural basis of that interaction must be elucidated. Positively charged lipids interact strongly with the negatively charged DNA but they cause toxic reactions in biological cells. Hence the present work used two model systems to study the coupling of genomic or plasmid DNA to zwitterionic or negatively charged phospholipids induced by divalent cations. 1. Model system: Lipid monolayer at the air/water-interface Methods: Langmuir filmbalance in combination with IR-spectroscopy (IRRAS), X-ray reflectometry (XR), X-ray diffraction (GIXD), Brewster angle microscopy (BAM), X-ray fluorescence (XRF), and surface potential measurements Results: A) The presence of the divalent cations Ba2+, Mg2+, Ca2+ or Mn2+ in the subphase has no traceable influence on the structure of a zwitterionic DMPE (1,2-dimyristoyl-phosphatidyl-ethanolamine) monolayer. B) DNA which is dissolved in the subphase adsorbs to the DMPE-monolayer only if divalent cations are present. C) The adsorption of genomic calf thymus DNA as well as of the plasmid DNA pGL3 causes a reduction of the tilt angle of the lipid alkyl chains. The tilt reduction can be ascribed to a change in the space required by the lipid head group. This change in head group orientation increases the electrostatic interaction between the positively charged nitrogen atoms in the lipid head and the negatively charged DNA phosphates. D) The adsorbed DNA exhibits an ordered structure if it is complexed by barium, magnesium, calcium or manganese ions. The spacing between parallel DNA strands depends on the size of the DNA fragments as well as on the kind of cation. The largest DNA-spacings are observed with barium ions, followed by magnesium and calcium ions. DNA-complexation with manganese ions causes the smallest spacings. This order of ions is observed for both genomic and plasmid DNA. E) Compression of the monolayer does not influence the DNA spacings. Thus the interaction between the lipid monolayer and adsorbed DNA is only weak. The DNA must exist as a more or less separate layer under the lipid film. 2. Model system: Lipid bilayer at the solid/fluid-interface Methods: Neutron reflectometry (NR), and Quartz crystal microbalance (QCM-D) Results: A) The zwitterionic phospholipid DMPC (1,2-dimyristoyl phosphatidylcholine) does not form lipid bilayers on top of planar polyelectrolyte multilayers covered with the positively charged PAH (polyallylamine). B) In contrast, DMPC forms a lipid bilayer with defects on top of the negatively charged PSS (polystyrolsulfonate) terminated polyelectrolyte cushion. C) Genomic calf thymus DNA adsorbs only to the DMPC layer in presence of calcium ions. Different ions were not examined. D) The negatively charged phospholipid DLPA (1,2-dilauryl-phosphatidic acid) also forms a lipid bilayer with defects on top of the PAH-terminated cushion. E) The DNA adsorbs also to the DLPA layer only in the presence of calcium ions in the solution. F) By addition of EDTA (ethylenediaminetretraacetic acid) the calcium cations are removed from the DLPA/DNA-complex and the complex dissociates. Thus the calcium induced formation of that complex is reversible. KW - Lipide / Doppelschicht KW - DNA KW - Monoschicht KW - Gentransfer KW - Phospholipide KW - DNA-Lipid-Wechselwirkung KW - künstlicher Virus KW - zwitterionische Phospholipide KW - zweiwertige Kationen KW - zwitterionic phospholipids KW - DNA-lipid-interaction KW - divalent cations KW - artificial virus KW - lipid monolayer Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-7629 ER - TY - THES A1 - Werner, Deljana T1 - Versuche zur Gewinnung von katalytischen Antikörpern zur Hydrolyse von Arylcarbamaten und Arylharnstoffen T1 - Attempts to produce catalytic antibodies for hydrolysis of arylcarbamates and arylureas N2 - Im Rahmen dieser Arbeit gelang es, katalytische Antikörper zur Hydrolyse von Benzylphenylcarbamaten sowie zahlreiche monoklonale Antikörper gegen Haptene herzustellen. Es wurden verschiedene Hapten-Protein-Konjugate unter Verwendung unterschiedlicher Kopplungsmethoden hergestellt und charakterisiert. Zur Generierung der hydrolytisch aktiven Antikörper wurden Inzuchtmäuse mit KLH-Konjugaten von 4 Übergangszustandsanaloga (ÜZA) immunisiert. Mit Hilfe der Hybridomtechnik wurden verschiedene monoklonale Antikörper gegen diese ÜZA gewonnen. Dabei wurden sowohl verschiedene Immunisierungsschemata als auch verschiedene Inzuchtmausstämme und Fusionstechniken verwendet. Insgesamt wurden 32 monoklonale Antikörper gegen die verwendeten ÜZA selektiert. Diese Antikörper wurden in großen Mengen hergestellt und gereinigt. Zum Nachweis der Antikörper-vermittelten Katalyse wurden verschiedene Methoden entwickelt und eingesetzt, darunter immunologische Nachweismethoden mit Anti-Substrat- und Anti-Produkt-Antikörpern und eine photometrische Methode mit Dimethylaminozimtaldehyd. Der Nachweis der hydrolytischen Aktivität gelang mit Hilfe eines Enzymsensors, basierend auf immobilisierter Tyrosinase. Die Antikörper N1-BC1-D11, N1-FA7-C4, N1-FA7-D12 und R3-LG2-F9 hydrolysierten die Benzylphenylcarbamate POCc18, POCc19 und Substanz 27. Der Nachweis der hydrolytischen Aktivität dieser Antikörper gelang auch mit Hilfe der HPLC. Der katalytische Antikörper N1-BC1-D11 wurde kinetisch und thermodynamisch untersucht. Es wurde eine Michaelis-Menten-Kinetik mit Km von 210 µM, vmax von 3 mM/min und kcat von 222 min-1 beobachtet. Diese Werte korrelieren mit den Werten der wenigen bekannten Diphenylcarbamat-spaltenden Abzyme. Die Beschleunigungsrate des Antikörpers N1-BC1-D11 betrug 10. Das ÜZA Hei3 hemmte die hydrolytische Aktivität. Dies beweist, dass die Hydrolyse in der Antigenbindungsstelle stattfindet. Weiter wurde zwischen der Antikörperkonzentration und der Umsatzgeschwindigkeit eine lineare Abhängigkeit festgestellt. Die thermodynamische Gleichtgewichtsdissoziationskonstante KD des Abzyms von 2,6 nM zeugt von einer sehr guten Affinität zum ÜZA. Hydrolytisch aktiv waren nur Antikörper, die gegen das Übergangszustandsanalogon Hei3 hergestellt worden waren. Es wird vermutet, dass die Hydrolyse der Benzylphenylcarbamate über einen Additions-Eliminierungsmechanismus unter Ausbildung eines tetraedrischen Übergangszustandes verläuft, dessen analoge Verbindung Hei3 ist. Im Rahmen der Generierung von Nachweisantikörpern zur Detektion der Substratabnahme bei der Hydrolyse wurden Anti-Diuron-Antikörper hergestellt. Einer der Antikörper (B91-CG5) ist spezifisch für das Herbizid Diuron und hat einen IC50-Wert von 0,19 µg/l und eine untere Nachweisgrenze von 0,04 µg/l. Ein anderer Antikörper (B91-KF5) reagiert kreuz mit einer Palette ähnlicher Herbizide. Mit diesen Antikörpern wurde ein empfindlicher Labortest, der ein Monitoring von Diuron auf Grundlage des durch die Trinkwasserverordnung festgeschriebenen Wertes für Pflanzenschutzmittel von 0,1 µg/l erlaubt, aufgebaut. Der Effekt der Anti-Diuron-Antikörper auf die Diuron-inhibierte Photosynthese wurde in vitro und in vivo untersucht. Es wurde nachgewiesen, dass sowohl in isolierten Thylakoiden, als auch in intakten Algen eine Vorinkubation der Anti-Diuron-Antikörper mit Diuron zur Inaktivierung seiner Photosynthese-hemmenden Wirkung führt. Wurde der Elektronentransport in den isolierten Thylakoiden oder in Algen durch Diuron unterbrochen, so führte die Zugabe der Anti-Diuron-Antikörper zur Reaktivierung der Elektronenübertragung. N2 - Attempts to produce catalytic antibodies for hydrolysis of arylcarbamates and arylureas: The aim of the investigations was to produce antibodies which are able to cleave herbicides resistant to naturally occuring enzymes. Structurally similar carbamate and urea derivatives were chosen for the experiments. Phosphonate derivatives were synthesized that mimick possible transition state analogues in structure and charge. Mice were immunized with 4 different derivatives after conjugating them to carrier proteins. 32 hybridomas were established that produce monoclonal antibodies binding to these derivatives. The possible cleavage of substrates was determined by immunoassays with monoclonal antibodies against the substrate and the products and with a photometric method based on dimethylaminocinammonaldehyde. The measuring of cleavage products was succeeded by an amperometric method. The enzyme sensor was based on immobilized tyrosinase which oxidizes p-chlorophenol and phenol. The antibodies N1-BC1-D11, N1-FA7-C4, N1-FA7-D12 und R3-LG2-F9 hydrolysed the benzylphenylcarbamates POCc18, POCc19 und Substance 27. The hydrolytic activity of these antibodies was also succeeded with HPLC. The catalytic antibody N1-BC1-D11 was investigated kinetically and thermodynamically. A Michaelis-Menten-Kinetic was observed (at pH 8.0 exhibited a Km 210 µM, a vmax 3 mM/min and a kcat 222 min-1). These values are in the range of the values obtained for the antibody-catalysed hydrolysis of diphenylcarbamates. The rate enhancement of N1-BC1 was 10. The reaction was completely inhibited by stoichiometric quantities of the transition state analogue Hei3. This is consistent with the affinity of the abzyme to Hei3 of 2.6 nM, determined by BIAcore assay. Only antibodies generated against Hei3 showed hydrolytic activity. The hydrolysis of benzylphenylcarbamates presumably occurs via an addition-elimination-Mechanism involving a tetrahedral intermediate. In summary, this work presents the first example of antibody-catalysed hydrolysis of benzylphenylcarbamates. Monoclonal anti-diuron antibodies were generated that bind to the herbicide diuron with an extremely low equilibrium dissociation constant. A sensitive immunoassay with a low detection limit of 0.2 nM for diuron was established. This is the most sensitive immunological method for detection of diuron known so far. These antibodies were also used in vitro and in vivo to prevent diuron-dependent inhibition of photosynthesis or to restore photosynthesis after inhibition. In isolated thylakoids prepared from spinach leaves (Spinacia oleracea L.) the diuron-inhibited Hill reaction was reconstituted immediately following the addition of the monoclonal antibodies. In an in vivo approach the photosynthetic oxygen evolution of the cell wall deficient mutant (cw 15) of the green alga Chlamydomonas reinhardtii Dangeard was monitored. The antibodies prevented the diuron-dependent inhibition of photosynthesis and restored photosynthesis after inhibition. Transgenic plants that synthesize and accumulate these antibodies or antibody fragments and are therefore diuron-resistant can be created. KW - katalytische Antikörper KW - Arylcarbamate KW - Arylharnstoffe KW - monoklonale Antikörper KW - Haptene KW - Diuron KW - Anti-Diuron-Antikörper KW - Herbizide KW - Photosynthese KW - catalytic antibodies KW - arylcarbamates KW - arylureas KW - monoclonal antibodies KW - haptens KW - diuron KW - anti-diuron-antibodies KW - herbicides KW - photosynthesis Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0000463 ER - TY - THES A1 - Frömmel, Ulrike T1 - Vergleichende geno- und phänotypische Charakterisierung von Escherichia coli aus Menschen, Hausschweinen und Wildtieren T1 - Comparative genotypic and phenotypic characterization of Escherichia coli from humans, domestic pigs and wild animals N2 - Escherichia (E.) coli ist als kommensales Bakterium ein wichtiger Bestandteil des Mikrobioms von Säugern, jedoch zudem der häufigste Infektionserreger des Menschen. Entsprechend des Infektionsortes werden intestinal (InPEC) und extraintestinal pathogene E. coli (ExPEC) unterschieden. Die Pathogenese von E. coli-Infektionen ist durch Virulenzfaktoren determiniert, welche von jeweils spezifischen virulenzassoziierten Genen (inVAGs und exVAGs) kodiert werden. Häufig werden exVAGs auch in E. coli-Isolaten aus dem Darm gesunder Wirte nachgewiesen. Dies führte zu der Vermutung, dass exVAGs die intestinale Kolonisierung des Wirtes durch E. coli unterstützen. Das Hauptziel dieser Arbeit bestand darin, das Wissen über den Einfluss von exVAGs auf die Besiedlung und damit die Adhäsion von E. coli an Epithelzellen des Darmtraktes zu erweitern. Die Durchführung einer solch umfassenden E. coli-Populationsstudie erforderte die Etablierung neuer Screeningmethoden. Für die genotypische Charakterisierung wurden mikropartikelbasierte Multiplex-PCR-Assays zum Nachweis von 44 VAGs und der Phylogenie etabliert. Für die phänotypische Charakterisierung wurden Adhäsions- und Zytotoxizitätsassays etabliert. Die Screeningmethoden basieren auf der VideoScan-Technologie, einem automatisierten bildbasierten Multifluoreszenzdetektionssystem. Es wurden 398 E. coli-Isolate aus 13 Wildsäugerarten und 5 Wildvogelarten sowie aus gesunden und harnwegserkrankten Menschen und Hausschweinen charakterisiert. Die Adhäsionsassays hatten zum Ziel, sowohl die Adhäsionsraten als auch die Adhäsionsmuster der 317 nicht hämolytischen Isolate auf 5 Epithelzelllinien zu bestimmen. Die Zytotoxizität der 81 hämolytischen Isolate wurde in Abhängigkeit der Inkubationszeit auf 4 Epithelzelllinien geprüft. In den E. coli-Isolaten wurde eine Reihe von VAGs nachgewiesen. Potentielle InPEC, insbesondere shigatoxinproduzierende und enteropathogene E. coli wurden aus Menschen, Hausschweinen und Wildtieren, vor allem aus Rehen und Feldhasen isoliert. exVAGs wurden mit stark variierender Prävalenz in Isolaten aus allen Arten detektiert. Die größte Anzahl und das breiteste Spektrum an exVAGs wurde in Isolaten aus Urin harnwegserkrankter Menschen, gefolgt von Isolaten aus Dachsen und Rehen nachgewiesen. In Isolaten der phylogenetischen Gruppe B2 wurden mehr exVAGs detektiert als in den Isolaten der phylogenetischen Gruppen A, B1 und D. Die Ergebnisse der Adhäsionsassays zeigten, dass die meisten Isolate zelllinien-, gewebe- oder wirtsspezifisch adhärierten. Ein Drittel der Isolate adhärierte an keiner Zelllinie und nur zwei Isolate adhärierten stark an allen Zelllinien. Grundsätzlich adhärierten mehr Isolate an humanen sowie an intestinalen Zelllinien. Besonders Isolate aus Eichhörnchen und Amseln sowie aus Urin harnwegserkrankter Menschen und Hausschweine waren in der Lage, stark zu adhärieren. Hierbei bildeten die Isolate als Adhäsionsmuster diffuse Adhäsion, Mikrokolonien, Ketten und Agglomerationen. Mittels statistischer Analysen wurden Assoziationen zwischen exVAGs und einer hohen Adhäsionsrate ersichtlich. So war beispielsweise das Vorkommen von afa/dra mit einer höheren Adhäsionsrate auf Caco-2- und 5637-Zellen und von sfa/foc auf IPEC-J2-Zellen assoziiert. Die Ergebnisse der Zytotoxizitätsassays zeigten eine sehr starke und zeitabhängige Zerstörung der Monolayer aller Epithelzelllinien durch die α-Hämolysin-positiven Isolate. Auffallend war die hohe Toxizität hämolytischer Isolate aus Wildtieren gegenüber den humanen Zelllinien. Mit den innerhalb dieser Arbeit entwickelten Screeningmethoden war es möglich, große Mengen an Bakterien zu charakterisieren. Es konnte ein Überblick über die Verbreitung von VAGs in E. coli aus unterschiedlichen Wirten gewonnen werden. Besonders Wildtiere wurden sowohl durch den Nachweis von VAGs in den entsprechenden Isolaten, verbunden mit deren Adhäsionsfähigkeit und ausgeprägter Zytotoxizität als Reservoire pathogener E. coli identifiziert. Ebenso wurde eine zelllinienspezifische Adhäsion von Isolaten mit bestimmten exVAGs deutlich. Damit konnte der mögliche Einfluss von exVAGs auf die intestinale Kolonisierung bestätigt werden. In weiterführenden Arbeiten sind jedoch Expressions- und Funktionsanalysen der entsprechenden Proteine unerlässlich. Es wird anhand der Mikrokoloniebildung durch kommensale E. coli vermutet, dass Adhäsionsmuster und demzufolge Kolonisierungsstrategien, die bisher pathogenen E. coli zugeschrieben wurden, eher als generelle Kolonisierungsstrategien zu betrachten sind. Das E. coli-α-Hämolysin wirkt im Allgemeinen zytotoxisch auf Epithelzellen. Ein in der Fachliteratur diskutierter adhäsionsunterstützender Mechanismus dieses Toxins ist demnach fragwürdig. Innerhalb dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die entwickelten Screeningmethoden umfassende Analysen einer großen Anzahl an E. coli-Isolaten ermöglichen. N2 - Escherichia (E.) coli is as commensal bacterium an important component of the microbiome of humans and animals, but also the most common infectious agent of human. According to the site of infection intestinal pathogenic (InPEC) and extraintestinal pathogenic E. coli (ExPEC) are differentiated. The pathogenesis of E. coli infections is determined by virulence factors encoded by specific virulence-associated genes (inVAGs and exVAGs). Frequently, exVAGs also be detected in E. coli isolates from the intestine of clinically healthy hosts. This led to the assumption that exVAGs support the intestinal colonization of the host by E. coli. The main objective of this work was to extend the knowledge about the influence of exVAGs on the settlement and adhesion of E. coli to epithelial cells of the intestinal tract. The implementation of such a comprehensive E. coli population study required the establishment of new screening methods. For the genotypic characterization novel microbead-based multiplex PCR assays were established to detect 44 VAGs and phylogeny. For the phenotypic characterization novel in vitro adhesion and cytotoxicity assays were established. These screening methods based on the VideoScan technology, which is an automated image-based multi-fluorescence detection system. There have been characterized 398 E. coli isolates from 13 wild mammal species and 5 species of wild birds as well as from healthy and urinary diseased humans and domestic pigs. The adhesion assays were aimed at both the adhesion rates and the adhesion patterns of the 317 non-hemolytic isolates on intestinal human Caco-2 and porcine IPEC-J2 cells and on human urinary bladder 5637, porcine kidney PK-15 epithelial and HEp-2 cells. The cytotoxicity of 81 hemolytic isolates was compared on the human intestinal epithelium LoVo, and on 5637, IPEC-J2 and PK-15 according to the incubation period. The E. coli isolates showed a series of VAGs. Potential InPEC, especially shigatoxin-producing and enteropathogenic E. coli were isolated from humans, domestic pigs and wild animals, especially from deers (Capreolus capreolus) and hares (Lepus europaeus). exVAGs were detected with widely varying prevalence in E. coli isolates from all species studied. The largest number and the widest range of exVAGs were shown in isolates from urine of urinary diseased patients, followed by isolates from badgers (Meles meles) and deer. Within the isolates of the phylogenetic group B2 more exVAGs were detected as within the isolates of the phylogenetic groups A, B1, and D. Adhesion of the E. coli isolates was specific to cells, host, and tissue, though it was also unspecific. A third of the isolates adhered to any cell line and only two isolates adhered strongly to all cell lines. Basically, more bacteria adhered to human as well as to intestinal cell lines. Especially isolates from squirrels (Sciurus vulgaris) and blackbirds (Turdus merula) and from the urine of urinary diseased humans and domestic pigs were able to strongly adhere. Commensal and pathogenic isolates can adhere in various forms, including diffuse distribution, microcolonies, chains and clumps. Using statistical analyzes associations between the occurrence of some VAGs and a high adhesion rates were seen. Several known adhesins were associated with host cell specific adhesion. Other new potential adhesion genes were described. The results of the cytotoxicity assays showed a very strong and time-dependent degradation of the epithelial cell monolayer of all the α-hemolysin-positive E. coli isolates. The high toxicity of hemolytic isolates from wild animals against the human cell lines was striking. The screening methods enabled both, the genotypic and phenotypic characterisation of large amounts of bacterial isolates. An overview of the distribution of VAGs in E. coli from different hosts was obtained. Especially wild animals were either by the detection of VAGs in the corresponding E. coli isolates, combined with the adhesion and marked cytotoxicity identified as reservoirs of pathogenic E. coli. As well, a cell-line specific adhesion of E. coli isolates with certain exVAGs became clear. Thus, the possible influence on the intestinal colonization of exVAGs could be confirmed. In further work, however, expression and functional analysis of the corresponding proteins are essential. It is suspected on the basis of microcolony formation by commensal E. coli that adhesion patterns and consequently colonization strategies that were previously attributed to pathogenic E. coli, are to be regarded rather as a general colonization strategy. The E. coli α-hemolysin acts generally cytotoxic to epithelial cells. An in the literature discussed adhesion supporting mechanism of this toxin is therefore questionable. Within this work it was shown that the developed screening methods enable comprehensive analyzes of a large number of E. coli isolates. KW - Escherichia coli KW - Adhäsion KW - virulenzassoziierte Gene KW - Hämolyse KW - ExPEC KW - Escherichia coli KW - adhesion KW - virulence-associated genes KW - hemolysis KW - ExPEC Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-69147 ER - TY - THES A1 - Johnen, Heiko T1 - Vergleich von rekombinanten Vaccinia- und DNA-Vektoren zur Tumorimmuntherapie im C57BL/6-Mausmodell N2 - In der vorliegenden Arbeit wurden Tumorimpfstoffe auf der Basis des Plasmid-Vektors pCI, modified vaccinia virus Ankara (MVA) und MVA-infizierten dendritischen Zellen entwickelt und durch Sequenzierung, Western blotting und durchflußzytometrische Analyse überprüft. Die in vivo Wirksamkeit der Vakzinen wurde in verschiedenen Tumormodellen in C57BL/6 Mäusen verglichen. Die auf dem eukaryotischen Expressionsvektor pCI basierende DNA-Vakzinierung induzierte einen sehr wirksamen, antigenspezifischen und langfristigen Schutz vor Muzin, CEA oder beta-Galactosidase exprimierenden Tumoren. Eine MVA-Vakzinierung bietet in den in dieser Arbeit durchgeführten Tumormodellen keinen signifikanten Schutz vor Muzin oder beta-Galactosidase exprimierenden Tumoren. Sowohl humane, als auch murine in vitro generierte dendritische Zellen lassen sich mit MVA – im Vergleich zu anderen viralen Vektoren – sehr gut infizieren. Die Expressionsrate der eingefügten Gene ist aber gering im Vergleich zur Expression in permissiven Wirtszellen des Virus (embryonale Hühnerfibroblasten). Es konnte gezeigt werden, daß eine MVA-Infektion dendritischer Zellen ähnliche Auswirkungen auf den Reifezustand humaner und muriner dendritischer Zellen hat, wie eine Infektion mit replikationskompetenten Vakzinia-Stämmen, und außerdem die Hochregulation von CD40 während der terminalen Reifung von murinen dendritischen Zellen inhibiert wird. Die während der langfristigen in vitro Kultur auf CEF-Zellen entstandenen Deletionen im MVA Genom führten zu einer starken Attenuierung und dem Verlust einiger Gene, die immunmodulatorische Proteine kodieren, jedoch nicht zu einer Verminderung des zytopathischen Effekts in dendritischen Zellen. Die geringe Expressionsrate und die beobachtete Inhibition der Expression kostimulatorischer Moleküle auf dendritischen Zellen kann für eine wenig effektive Induktion einer Immunantwort in MVA vakzinierten Tieren durch cross priming oder die direkte Infektion antigenpräsentierender Zellen verantwortlich sein. Durch die Modifikation einer Methode zur intrazellulären IFN-gamma Färbung konnten in vakzinierten Mäusen tumorantigenspezifische CTL sensitiv und quantitativ detektiert werden. Die so bestimmte CTL-Frequenz, nicht jedoch die humorale Antwort, korrelierte mit der in vivo Wirksamkeit der verschiedenen Vakzinen: DNA vakzinierte Tiere entwickeln starke tumorantigenspezifische CTL-Antworten, wohingegen in MVA-vakzinierten Tieren überwiegend gegen virale Epitope gerichtete CD4 und CD8-T-Zellen detektiert wurden. Die Wirksamkeit der pCI-DNA-Vakzine spricht für die Weiterentwicklung in weiteren präklinischen Mausmodellen, beispielsweise unter Verwendung von MUC1 oder HLA-A2 transgenen Mäusen. Die Methoden zur Detektion Tumorantigen-spezifischer CTL in 96-Loch-Mikrotiterplatten können dabei zur systematischen Suche nach im Menschen immundominanten T-Zell-Epitopen im Muzin-Molekül genutzt werden. Der durchgeführte Vergleich der auf den Vektoren pCI und MVA basierenden Vakzinen und die Analyse neuerer Publikationen führen zu dem Ergebnis, daß vor allem DNA-Vakzinen in Zukunft eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von aktiven Tumorimpfstoffen spielen werden. Rekombinante MVA-Viren, eventuell in Kombination mit DNA- oder anderen Vektoren, haben sich dagegen in zahlreichen Studien als wirksame Impfstoffe zur Kontrolle von durch Pathogene hervorgerufenen Infektionserkrankungen erwiesen. N2 - In this study, tumor vaccines based on the plasmid pCI, the attenuated vaccinia virus strain modified vaccinia virus Ankara (MVA) and MVA-infected dendritic cells were constructed and characterized by sequencing, Western blot and flow cytometric analysis. The efficiency to induce tumor immunity in vivo was compared in several C57BL/6 mouse tumor models. Naked DNA Vaccination based on the eukaryotic expression vector pCI did induce very effective, antigen-specific and long-term protection against tumor cell lines expressing mucin, CEA or beta-Gal whereas MVA vaccination did not elicit protective immunity against Mucin or beta-Gal expressing tumors. MVA does infect human or murine in vitro generated dendritic cells very efficiently compared to other viral vectors, however expression levels of the inserted antigens in dendritic cells are significantly lower than in permissive host cells (chicken embryo fibroblasts). It could be shown that the effect of MVA infection on the maturation status of dendritic cells is similar to the effects described for dendritic cells infected with replication competent vaccinia strains. In addition it was shown that the upregulation of the important costimulatory molecule CD40 through LPS stimulation is strongly inhibited in MVA infected cells. During passage in tissue culture, MVA has accumulated a number of large deletions, including a number of immunomodulatory molecules and resulting in a strong attenuation. However the strong cytopathic effect on dendritic cells is maintained. The low level of expression and the effect on dendritic cell maturation may be responsible for the failure of MVA to induce tumor immunity through either cross presentation or direct infection of antigen presenting cells. To detect and quantify tumor-antigen-specific CTL a method based on intracellular IFN-gamma staining was modified and it could be shown that the cellular – but not the humoral – response does correlate with in vivo protection: DNA but not MVA vaccines do induce high levels of tumorantigen-specific CTL whereas MVA-vaccines do induce strong and long lasting CD4 and CD8-T-cell responses against vaccinia antigens. The excellent protection induced by pCI-DNA-vaccination in different tumor models does encourage us to further investigate the elicitation of tumor immunity in MUC1 or HLA-A2 transgenic mice. In mice transgenic for human MHC-I, the IFN-gamma staining protocol could be used to systematically screen for mucin T-cell epitopes that are relevant in humans. KW - Tumorimmuntherapie KW - MVA KW - Modified Vaccinia Virus Ankara KW - Muzin KW - CEA KW - MUC1 KW - beta-Galactosidase KW - DNA-Vakzinierung KW - pCI KW - MC38 KW - tumor immunotherapy KW - MVA KW - Modified Vaccinia Virus Ankara KW - Mucin KW - MUC1 KW - beta-Galactosidase KW - CEA KW - DNA vaccine KW - pCI KW - MC38 Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0000593 ER - TY - THES A1 - Nolte, Björn T1 - Variabilität des Reviergesangs des Buchfinken (Fringilla coelebs) zur Raum-Zeit-Beschreibung von Metapopulationen N2 - Der Buchfinkengesang wurde in Potsdam in zwei Hauptpopulationen über drei Jahre aufgenommen. Jedes Individuum wurde eindeutig am individuellen Strophentypenrepertoire identifiziert. Ein weiterer Punkt der die individuelle Wiedererkennung bestätigt ist die hohe Standorttreue der adulten Männchen. Die beschriebene Methode eignet sich für die Untersuchung von gesamten Populationen, um den Wandel des Gesangs von Populationen in Raum und Zeit zu beschreiben. Die Haupterkenntnisse der Arbeit sind: - Die Gesamtanzahl der Grundstrophentypen innerhalb einer Population bleibt über Jahre konstant. - Die relative Häufigkeit jedes einzelnen Strophentyps variiert von Jahr zu Jahr und von Population zu Population. - Gesangslernen erfolgt exakt mit einem Korrektheitsgrad von mindestens 96%. - Das Song-Sharing ist innerhalb der Population hoch. Die diskutierten Mechanismen für das Song-Sharing sind: Die Lebenserwartung, das Zugverhalten, das Lernverhalten, die Etabliertheit von Strophentypen, Weibchenpräferenzen und die Reaktionen der territorialen Männchen. - Weiterhin wurde ein Modell zur kulturellen Evolution des Buchfinkengesangs programmiert, um die Rolle der Einflussfaktoren, wie Fehlerquote, Abwanderungsrate und Laufzeit zu ermitteln. Der Wandel des Dialektes erfolgt graduell in Raum und Zeit. Daher sind keine scharfen Dialektgrenzen anzutreffen. Trotz dieser Tatsache markieren die etablierten Strophentypen die Population. 50 % der Juvenilen siedeln am Geburtsort, auf diese Weise bleibt der Dialekt erhalten und Inzest wird vermieden. -Analysiert man das Repertoire benachbarten Männchen bei isolierten Alleen, so entspricht die Gesangsangleichung in etwa dem Zufall. -Intraindividuelle Vergleiche der quantitativen Parameter des jeweiligen Strophentyps wurden saisonal und annuell durchgeführt. Saisonal konnten für einen Strophentyp ein Trend ermittelt werden. Bei jährlichen Vergleichen konnten intraindividuell ausschließlich nicht signifikante Ergebnisse ermittelt werden, wohingegen die interindividuelle Variation in zwei Fällen signifikant war. In einem Fall bestand ein Trend und in einem weiteren Fall war die Variationsunterschiede nicht signifikant. - Der Verlauf der Brutsaison lässt sich an der jährlichen Gesangsaktivität nachvollziehen. N2 - Chaffinch song was recorded in Potsdam in two major populations of chaffinches over a period of three years. Each male was identified unambiguously because of their individual song type repertoires. These are usually easy to distinguish from sonagrams as the variation is discontinuous. A further point for individual recognition is the fixed territorial behaviour of adult males. The described method is employed to examine whole populations and to observe changes with space and time in the song of a population. The major findings of the study are: - The total amount of basic song types in each population is constant over years. - The quantity of each basic song type is different and varies from year to year and from population to population. - Song copying is extremely accurate on at least 96% of occasions. - Song-type sharing is high within populations. Discussed mechanisms for song neighbourhoods are: expectation of life, semi-migratory behaviour, learning skills, establishment of song types, female choice and male vs male interaction. Furthermore a model of cultural evolution of chaffinch song was programmed to determine the role of factors like error rate, rate of emigration and running time. The changes are gradual in space and time. Hence the dialect borders are smooth. Despite this fact established song types mark the population. As every second juvenile bird settles in the population of his birth inbreeding is avoided and the dialect structure is retained. - Analysing the repertoires of neighbouring males (“next door neighbours”) in isolated avenues to examine mutual influences suggests that these have the same amount of song types in common than would be expected by chance. - Within intraindividual comparisons the quantitative parameters of the same song types remain seasonal and annual constant, whereas interindividual variations within the same song tip are statistically significant. - The breeding biology of the chaffinch can be observed by seasonal singing activity during the breeding cycle. KW - Buchfink KW - Gesangsdialekte KW - Strophentypen KW - Gesangslernen KW - Gesangsangleich KW - Gesangsaktivität KW - Chaffinch KW - Songdialects KW - song-types KW - songlearning KW - song-sharing KW - song-matching KW - singing activity Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0000882 ER - TY - THES A1 - Crawford, Michael Scott T1 - Using individual-based modeling to understand grassland diversity and resilience in the Anthropocene N2 - The world’s grassland systems are increasingly threatened by anthropogenic change. Susceptible to a variety of different stressors, from land-use intensification to climate change, understanding the mechanisms driving the maintenance of these systems’ biodiversity and stability, and how these mechanisms may shift under human-mediated disturbance, is thus critical for successfully navigating the next century. Within this dissertation, I use an individual-based and spatially-explicit model of grassland community assembly (IBC-grass) to examine several processes, thought key to understanding their biodiversity and stability and how it changes under stress. In the first chapter of my thesis, I examine the conditions under which intraspecific trait variation influences the diversity of simulated grassland communities. In the second and third chapters of my thesis, I shift focus towards understanding how belowground herbivores influence the stability of these grassland systems to either a disturbance that results in increased, stochastic, plant mortality, or eutrophication. Intraspecific trait variation (ITV), or variation in trait values between individuals of the same species, is fundamental to the structure of ecological communities. However, because it has historically been difficult to incorporate into theoretical and statistical models, it has remained largely overlooked in community-level analyses. This reality is quickly shifting, however, as a consensus of research suggests that it may compose a sizeable proportion of the total variation within an ecological community and that it may play a critical role in determining if species coexist. Despite this increasing awareness that ITV matters, there is little consensus of the magnitude and direction of its influence. Therefore, to better understand how ITV changes the assembly of grassland communities, in the first chapter of my thesis, I incorporate it into an established, individual-based grassland community model, simulating both pairwise invasion experiments as well as the assembly of communities with varying initial diversities. By varying the amount of ITV in these species’ functional traits, I examine the magnitude and direction of ITV’s influence on pairwise invasibility and community coexistence. During pairwise invasion, ITV enables the weakest species to more frequently invade the competitively superior species, however, this influence does not generally scale to the community level. Indeed, unless the community has low alpha- and beta- diversity, there will be little effect of ITV in bolstering diversity. In these situations, since the trait axis is sparsely filled, the competitively inferior may suffer less competition and therefore ITV may buffer the persistence and abundance of these species for some time. In the second and third chapters of my thesis, I model how one of the most ubiquitous trophic interactions within grasslands, herbivory belowground, influences their diversity and stability. Until recently, the fundamental difficulty in studying a process within the soil has left belowground herbivory “out of sight, out of mind.” This dilemma presents an opportunity for simulation models to explore how this understudied process may alter community dynamics. In the second chapter of my thesis, I implement belowground herbivory – represented by the weekly removal of plant biomass – into IBC-grass. Then, by introducing a pulse disturbance, modelled as the stochastic mortality of some percentage of the plant community, I observe how the presence of belowground herbivores influences the resistance and recovery of Shannon diversity in these communities. I find that high resource, low diversity, communities are significantly more destabilized by the presence of belowground herbivores after disturbance. Depending on the timing of the disturbance and whether the grassland’s seed bank persists for more than one season, the impact of the disturbance – and subsequently the influence of the herbivores – can be greatly reduced. However, because human-mediated eutrophication increases the amount of resources in the soil, thus pressuring grassland systems, our results suggest that the influence of these herbivores may become more important over time. In the third chapter of my thesis, I delve further into understanding the mechanistic underpinnings of belowground herbivores on the diversity of grasslands by replicating an empirical mesocosm experiment that crosses the presence of herbivores above- and below-ground with eutrophication. I show that while aboveground herbivory, as predicted by theory and frequently observed in experiments, mitigates the impact of eutrophication on species diversity, belowground herbivores counterintuitively reduce biodiversity. Indeed, this influence positively interacts with the eutrophication process, amplifying its negative impact on diversity. I discovered the mechanism underlying this surprising pattern to be that, as the herbivores consume roots, they increase the proportion of root resources to root biomass. Because root competition is often symmetric, herbivory fails to mitigate any asymmetries in the plants’ competitive dynamics. However, since the remaining roots have more abundant access to resources, the plants’ competition shifts aboveground, towards asymmetric competition for light. This leads the community towards a low-diversity state, composed of mostly high-performance, large plant species. We further argue that this pattern will emerge unless the plants’ root competition is asymmetric, in which case, like its counterpart aboveground, belowground herbivory may buffer diversity by reducing this asymmetry between the competitively superior and inferior plants. I conclude my dissertation by discussing the implications of my research on the state of the art in intraspecific trait variation and belowground herbivory, with emphasis on the necessity of more diverse theory development in the study of these fundamental interactions. My results suggest that the influence of these processes on the biodiversity and stability of grassland systems is underappreciated and multidimensional, and must be thoroughly explored if researchers wish to predict how the world’s grasslands will respond to anthropogenic change. Further, should researchers myopically focus on understanding central ecological interactions through only mathematically tractable analyses, they may miss entire suites of potential coexistence mechanisms that can increase the coviability of species, potentially leading to coexistence over ecologically-significant timespans. Individual-based modelling, therefore, with its focus on individual interactions, will prove a critical tool in the coming decades for understanding how local interactions scale to larger contexts, and how these interactions shape ecological communities and further predicting how these systems will change under human-mediated stress. N2 - Grasland ist durch anthropogene Veränderungen bedroht. Im Rahmen dieser Dissertation verwende ich ein individuelles und räumlich-explizites Modell der Grasland-Gemeinschaftsversammlung (IBC-Gras), um verschiedene Prozesse zu untersuchen, die als Schlüssel zum Verständnis ihrer Biodiversität und Stabilität und deren Veränderung unter Stress gelten. Im ersten Kapitel meiner Dissertation untersuche ich die Bedingungen, unter denen eine intraspezifische Merkmalsvariation die Vielfalt der simulierten Graslandgemeinschaften beeinflusst. Im zweiten und dritten Kapitel meiner Dissertation verlege ich den Schwerpunkt auf das Verständnis, wie unterirdische Pflanzenfresser die Stabilität dieser Grünlandsysteme beeinflussen, und zwar entweder durch eine Störung, die zu erhöhter, stochastischer Pflanzensterblichkeit oder Eutrophierung führt. Intraspezifische Merkmalsvariation (ITV) oder Variation der Merkmalswerte zwischen Individuen derselben Art ist für die Struktur ökologischer Gemeinschaften von grundlegender Bedeutung. Da sie sich jedoch historisch gesehen nur schwer in theoretische und statistische Modelle einbauen lässt, wurde sie bei Analysen auf Gemeindeebene weitgehend übersehen. Diese Realität ändert sich jedoch schnell, da ein Forschungskonsens darauf hindeutet, dass sie einen beträchtlichen Anteil der Gesamtvariation innerhalb einer ökologischen Gemeinschaft ausmachen kann und dass sie eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung der Koexistenz von Arten spielen kann. Trotz dieses zunehmenden Bewusstseins, dass das ITV von Bedeutung ist, gibt es kaum einen Konsens über das Ausmaß und die Richtung seines Einflusses. Um besser zu verstehen, wie ITV die Zusammensetzung von Grünlandgesellschaften verändert, beziehe ich daher im ersten Kapitel meiner Dissertation diese in ein etabliertes, auf dem Individuum basierendes Modell der Grünlandgesellschaften ein. Indem ich die Menge an ITV in den funktionellen Merkmalen dieser Arten variiere, untersuche ich das Ausmaß und die Richtung des Einflusses von ITV auf die paarweise Unsichtbarkeit und die Koexistenz von Gemeinschaften. Im zweiten und dritten Kapitel meiner Dissertation modelliere ich, wie eine der allgegenwärtigsten trophischen Interaktionen innerhalb von Grasland, die Pflanzenfresserei unter der Erde, deren Vielfalt und Stabilität beeinflusst. Bis vor kurzem hat die grundlegende Schwierigkeit, einen Prozess im Boden zu untersuchen, dazu geführt, dass Pflanzenfresser unter der Erde "aus den Augen, aus dem Sinn" geraten sind. Dieses Dilemma bietet eine Gelegenheit für Simulationsmodelle zu erforschen, wie dieser noch nicht untersuchte Prozess die Dynamik von Gemeinschaften verändern kann. Im zweiten Kapitel meiner Dissertation implementiere ich unterirdische Pflanzenfresserei - repräsentiert durch die wöchentliche Entfernung von pflanzlicher Biomasse - in IBC-Gras. Dann beobachte ich durch die Einführung einer Pulsstörung, die als stochastische Mortalität eines gewissen Prozentsatzes der Pflanzengemeinschaft modelliert wird, wie die Anwesenheit von unterirdischen Pflanzenfressern die Resistenz und Erholung der Shannon-Diversität in diesen Gemeinschaften beeinflusst. Ich stelle fest, dass Gemeinschaften mit hohen Ressourcen und geringer Diversität durch die Anwesenheit von unterirdischen Pflanzenfressern nach einer Störung wesentlich stärker destabilisiert werden. Abhängig vom Zeitpunkt der Störung und davon, ob die Saatgutbank des Graslandes länger als eine Saison besteht, können die Auswirkungen der Störung - und damit der Einfluss der Pflanzenfresser - stark reduziert werden. Im dritten Kapitel meiner Dissertation vertiefe ich das Verständnis der mechanistischen Grundlagen der unterirdischen Herbivoren für die Diversität von Grasland, indem ich ein empirisches Mesokosmos-Experiment repliziere, das die Anwesenheit von Herbivoren über- und unterirdisch mit Eutrophierung kreuzt. Ich zeige, dass, während oberirdische Pflanzenfresser, wie von der Theorie vorhergesagt und häufig in Experimenten beobachtet, die Auswirkungen der Eutrophierung auf die Artenvielfalt abschwächen, unterirdische Pflanzenfresser die Artenvielfalt kontraintuitiv reduzieren. Tatsächlich interagiert dieser Einfluss positiv mit dem Eutrophierungsprozess und verstärkt seine negativen Auswirkungen auf die Vielfalt. Ich schließe meine Dissertation mit einer Erörterung der Auswirkungen meiner Forschung auf den Stand der Technik bei der Variation intraspezifischer Merkmale und der unterirdischen Pflanzenfresserei, wobei der Schwerpunkt auf der Notwendigkeit einer vielfältigeren Theorieentwicklung bei der Untersuchung dieser grundlegenden Wechselwirkungen liegt. Meine Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Einfluss dieser Prozesse auf die biologische Vielfalt und Stabilität von Graslandsystemen unterschätzt wird und mehrdimensional ist und gründlich erforscht werden muss, wenn Forscher vorhersagen wollen, wie die Grasländer der Welt auf anthropogene Veränderungen reagieren werden. Sollten sich Forscherinnen und Forscher darüber hinaus myopisch darauf konzentrieren, zentrale ökologische Wechselwirkungen nur durch mathematisch nachvollziehbare Analysen zu verstehen, könnten sie ganze Suiten potenzieller Koexistenzmechanismen übersehen, die die Begehrlichkeit von Arten erhöhen können und möglicherweise zu einer Koexistenz über ökologisch signifikante Zeitspannen hinweg führen. Daher wird sich die individuenbasierte Modellierung mit ihrem Schwerpunkt auf individuellen Interaktionen in den kommenden Jahrzehnten als ein entscheidendes Instrument erweisen, um zu verstehen, wie lokale Interaktionen sich auf größere Zusammenhänge ausdehnen und wie diese Interaktionen ökologische Gemeinschaften formen, und um weiter vorherzusagen, wie sich diese Systeme unter vom Menschen verursachtem Stress verändern werden. T2 - Einsatz von individualbasierten Modellen zum Verständnis der Grasland-Diversität und -Resilienz im Anthropozän KW - intraspecific trait variation KW - eutrophication KW - belowground herbivory KW - grassland KW - ecological modelling KW - intraspezifische Merkmalsvariation KW - Eutrophierung KW - Grasland KW - ökologische Modellierung KW - unterirdische Pflanzenfresser Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-479414 ER - TY - THES A1 - Numberger, Daniela T1 - Urban wastewater and lakes as habitats for bacteria and potential vectors for pathogens T1 - Urbane Abwässer und Seen als Habitat für Bakterien und potentielle Vektoren für Krankheitserreger N2 - Wasser ist lebensnotwendig und somit eine essentielle Ressource. Jedoch sind unsere Süßwasser-Ressourcen begrenzt und ihre Erhaltung daher besonders wichtig. Verschmutzungen mit Chemikalien und Krankheitserregern, die mit einer wachsenden Bevölkerung und Urbanisierung einhergehen, verschlechtern die Qualität unseres Süßwassers. Außerdem kann Wasser als Übertragungsvektor für Krankheitserreger dienen und daher wasserbürtige Krankheiten verursachen. Der Leibniz-Forschungsverbund INFECTIONS‘21 untersuchte innerhalb der interdisziplinären Forschungsgruppe III - „Wasser", Gewässer als zentralen Mittelpunkt für Krankheiterreger. Dabei konzentrierte man sich auf Clostridioides difficile sowie aviäre Influenza A-Viren, von denen angenommen wird, dass sie in die Gewässer ausgeschieden werden. Ein weiteres Ziel bestand darin, die bakterielle Gemeinschaften eines Klärwerkes der deutschen Hauptstadt Berlin zu charakterisieren, um anschließend eine Bewertung des potentiellen Gesundheitsrisikos geben zu können. Bakterielle Gemeinschaften des Roh- und Klarwassers aus dem Klärwerk unterschieden sich signifikant voneinander. Der Anteil an Darm-/Fäkalbakterien war relativ niedrig und potentielle Darmpathogene wurden größtenteils aus dem Rohwasser entfernt. Ein potentielles Gesundheitsrisiko konnte allerdings von potentiell pathogenen Legionellen wie L. lytica festgestellt werden, deren relative Abundanz im Klarwasser höher war als im Rohwasser. Es wurden außerdem drei C. difficile-Isolate aus den Klärwerk-Rohwasser und einem städtischen Badesee in Berlin (Weisser See) gewonnen und sequenziert. Die beiden Isolate aus dem Klärwerk tragen keine Toxin-Gene, wohingegen das Isolat aus dem See Toxin-Gene besitzt. Alle drei Isolate sind sehr nah mit humanen Stämmen verwandt. Dies deutet auf ein potentielles, wenn auch sporadisches Gesundheitsrisiko hin. (Aviäre) Influenza A-Viren wurden in 38.8% der untersuchten Sedimentproben mittels PCR detektiert, aber die Virusisolierung schlug fehl. Ein Experiment mit beimpften Wasser- und Sedimentproben zeigte, dass für die Isolierung aus Sedimentproben eine relativ hohe Viruskonzentration nötig ist. In Wasserproben ist jedoch ein niedriger Titer an Influenza A-Viren ausreichend, um eine Infektion auszulösen. Es konnte zudem auch festgestellt werden, dass sich „Madin-Darby Canine Kidney (MDCK)―-Zellkulturen im Gegensatz zu embryonierten Hühnereiern besser eignen, um Influenza A-Viren aus Sediment zu isolieren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Arbeit mögliche Gesundheitsrisiken aufgedeckt hat, wie etwa durch Legionellen im untersuchten Berliner Klärwerk, deren relative Abundanz in geklärtem Abwasser höher ist als im Rohwasser. Desweiteren wird indiziert, dass Abwasser und Gewässer als Reservoir und Vektor für pathogene Organismen dienen können, selbst für nicht-typische Wasser-Pathogene wie C. difficile. N2 - Water is essential to life and thus, an essential resource. However, freshwater resources are limited and their maintenance is crucial. Pollution with chemicals and pathogens through urbanization and a growing population impair the quality of freshwater. Furthermore, water can serve as vector for the transmission of pathogens resulting in water-borne illness. The Interdisciplinary Research Group III – "Water" of the Leibniz alliance project INFECTIONS‘21 investigated water as a hub for pathogens focusing on Clostridioides difficile and avian influenza A viruses that may be shed into the water. Another aim of this study was to characterize the bacterial communities in a wastewater treatment plant (WWTP) of the capital Berlin, Germany to further assess potential health risks associated with wastewater management practices. Bacterial communities of WWTP inflow and effluent differed significantly. The proportion of fecal/enteric bacteria was relatively low and OTUs related to potential enteric pathogens were largely removed from inflow to effluent. However, a health risk might exist as an increased relative abundance of potential pathogenic Legionella spp. such as L. lytica was observed. Three Clostridioides difficile isolates from wastewater inflow and an urban bathing lake in Berlin (‗Weisser See‘) were obtained and sequenced. The two isolates from the wastewater did not carry toxin genes, whereas the isolate from the lake was positive for the toxin genes. All three isolates were closely related to human strains. This indicates a potential, but rather sporadic health risk. Avian influenza A viruses were detected in 38.8% of sediment samples by PCR, but virus isolation failed. An experiment with inoculated freshwater and sediment samples showed that virus isolation from sediment requires relatively high virus concentrations and worked much better in Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cell cultures than in embryonated chicken eggs, but low titre of influenza contamination in freshwater samples was sufficient to recover virus. In conclusion, this work revealed potential health risks coming from bacterial groups with pathogenic potential such as Legionella spp. whose relative abundance is higher in the released effluent than in the inflow of the investigated WWTP. It further indicates that water bodies such as wastewater and lake sediments can serve as reservoir and vector, even for non-typical water-borne or water-transmitted pathogens such as C. difficile. KW - water KW - Wasser KW - bacteria KW - Bakterien KW - influenza A viruses KW - Influenza A Viren KW - pathogens KW - Krankheitserreger Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-437095 ER - TY - THES A1 - Andres, Janin T1 - Untersuchungen über Regulationsmechanismen der 11beta-Hydroxysteroid Dehydrogenase Typ 1 T1 - Analysis of regulation of 11beta-Hydroxysteroid dehydrogenase type 1 N2 - Die 11beta-HSD1 reguliert intrazellulär die Cortisolkonzentration durch Regeneration von Cortison z.B. aus dem Blutkreislauf, zu Cortisol. Daher stellt diese ein wichtiges Element in der Glucocorticoid-vermittelten Genregulation dar. Die 11beta-HSD1 wird ubiquitär exprimiert, auf hohem Niveau besonders in Leber, Fettgewebe und glatten Muskelzellen. Insbesondere die Bedeutung der 11beta-HSD1 in Leber und Fettgewebe konnte mehrfach nachgewiesen werden. In der Leber führte eine erhöhte Aktivität aufgrund einer Überexpression in Mäusen zu einer verstärkten Gluconeogeneserate. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass eine erhöhte Expression und erhöhte Enzymaktivität der 11beta-HSD1 im subkutanen und viszeralen Fettgewebe assoziiert ist mit Fettleibigkeit, Insulinresistenz und Dyslipidämie. Über die Regulation ist jedoch noch wenig bekannt. Zur Untersuchung der Promotoraktivität wurde der Promotorbereich von -3034 bis +188, vor und nach dem Translations- und Transkriptionsstart, der 11beta-HSD1 kloniert. 8 Promotorfragmente wurden mittels Dual-Luciferase-Assay in humanen HepG2-Zellen sowie undifferenzierten und differenzierten murinen 3T3-L1-Zellen untersucht. Anschließend wurde mittels nicht-radioaktiven EMSA die Bindung des TATA-Binding Proteins (TBP) sowie von CCAAT/Enhancer-Binding-Proteinen (C/EBP) an ausgewählte Promotorregionen analysiert. Nach der Charakterisierung des Promotors wurden spezifische endogene und exogene Regulatoren untersucht. Fettsäuren modifizieren die Entstehung von Adipositas und Insulinresistenz. Ihre Wirkung wird u.a. PPARgamma-abhängig vermittelt und kann durch das Inkretin (Glucose-dependent insulinotropic Peptide) GIP modifiziert werden. So wurden die Effekte von unterschiedlichen Fettsäuren, vom PPARgamma Agonisten Rosiglitazon sowie dem Inkretin GIP auf die Expression und Enzymaktivität der 11beta-HSD1 untersucht. Dies wurde in-vitro-, tierexperimentell und in humanen in-vivo-Studien realisiert. Zuletzt wurden 2 Single Nucleotide Polymorphismen (SNP) im Promotorbereich der 11beta-HSD1 in der Zellkultur im Hinblick auf potentielle Funktionalität analysiert sowie die Assoziation mit Diabetes mellitus Typ 2 und Körpergewicht in der MeSyBePo-Kohorte bei rund 1.800 Personen untersucht. Die Luciferase-Assays zeigten basal eine zell-spezifische Regulation der 11beta-HSD1, wobei in allen 3 untersuchten Zelltypen die Bindung eines Repressors nachgewiesen werden konnte. Zudem konnte eine mögliche Bindung des TBPs sowie von C/EBP-Proteinen an verschiedene Positionen gezeigt werden. Die Transaktivierungsassays mit den C/EBP-Proteinen -alpha, -beta und -delta zeigten eben-falls eine zellspezifische Regulation des 11beta-HSD1-Promotors. Die Aktivität und Expression der 11beta-HSD1 wurde durch die hier untersuchten endogenen und exogenen Faktoren spezifisch modifiziert, was sowohl in-vitro als auch in-vivo in unterschiedlichen Modellsystemen dargestellt werden konnte. Die Charakterisierung der MeSyBePo-Kohorte ergab keine direkten Assoziationen zwischen Polymorphismus und klinischem Phänotyp, jedoch Tendenzen für eine erhöhtes Körper-gewicht und Typ 2 Diabetes mellitus in Abhängigkeit des Genotyps. Der Promotor der 11beta-HSD1 konnte aufgrund der Daten aus den Luciferaseassays sowie den Daten aus den EMSA-Analysen näher charakterisiert werden. Dieser zeigt eine variable und zell-spezifische Regulation. Ein wichtiger Regulator stellen insbesondere in den HepG2-Zellen die C/EBP-Proteine -alpha, -beta und -delta dar. Aus den in-vivo-Studien ergab sich eine Regulation der 11beta-HSD1 durch endogene, exogene und pharmakologische Substanzen, die durch die Zellkulturversuche bestätigt und näher charakterisiert werden konnten. N2 - The enzyme 11beta-HSD1 regulates intracellular the cortisol concentration by regeneration of cortisone to cortisol. Hence, 11beta-HSD1 is an important factor in glucocorticoid-mediated gene expression. It is ubiquitously expressed, but high levels have been specifically described in liver, adipose tissue and smooth muscle cells. A pivotal role for 11beta-HSD1 has been demonstrated with respect to metabolism in liver and adipose tissue. Thus, a liver-specific overexpression results in an elevated gluconeogenesis and hepatic glucose output. Furthermore, a fat-specific overexpression was associated with obesity, insulin resistance and dyslipidemia. Despite these intriguing data, the regulation of the human 11beta-HSD1 gene is still in its infancies. 8 promoter fragments from -3034 to +188 of 11beta-HSD1-gene were cloned to analyze promoter activity. Dual-Luciferase-Assay was used in humane HepG2 cells and in undifferentiated and differentiated 3T3-L1 cells. Furthermore, the region close to the transcription start was studied with a non-radioactive EMSA for binding of TATA-binding protein (TBP) and CCAAT/enhancer-binding-protein (C/EBP). The role of the endogenous and exogenous regulators fatty acids, PPARgamma and the incretin (Glucose-dependent insulinotropic Peptide) GIP was investigated in-vitro and in-vivo. Finally, the functional consequences of 2 Single Nucleotide Polymorphisms (SNP) within the promoter region were studied in cell culture and the MeSyBePo-cohorts for association with diabetes mellitus type 2 and body weight. The Luciferase-assay revealed a cell-specific regulation of 11beta-HSD1 and a repressor, which was active in all 3 cell models. Accordingly, a cell-specific regulation was observed in transactivation-assays with C/EBP-proteins -alpha, -beta and -delta. The 11beta-HSD1 enzyme expression and activity was specifically modified by the here investigated endogenous and exogenous factors, which was demonstrated in-vitro but also in-vivo in various experimental settings. The characterisation of the MeSyBePo-cohorte revealed no association between genotype and clinical phenotype, although a trend for an increased body weight and diabetes mellitus type 2 was detected. This work demonstrated a cell-specific regulation of the 11beta-HSD1 promoter. Furthermore, a binding site for TATA-binding proteins was detected in HepG2 and undifferentiated 3T3-L1 cells. A pivotal role in regulation of 11beta-HSD1 promoter activity was demonstrated for the C/EBP-proteins, especially in liver cells. The in-vivo-Studies revealed a regulation of enzyme expression and activity by endogenous, exogenous and pharmacological substances, which was confirmed and analyzed in more detail in cell culture experiments. KW - Promotor KW - 11beta-HSD1 KW - Fettleibigkeit KW - Diabetes KW - Regulation KW - Promoter KW - 11beta-HSD1 KW - Obesity KW - Diabetes KW - Regulation Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-33033 ER - TY - THES A1 - Senger, Toralf T1 - Untersuchungen zur Metallhomöostase in Arabidopsis thaliana T1 - Investigations to study metal homeostasis in Arabidopsis thaliana N2 - Alle Organismen sind für ihr Überleben auf Metalle angewiesen. Hierbei gibt es für jedes Metall einen Konzentrationsbereich, der das Optimum zwischen Metallmangel, -bedarf und -toxizität darstellt. Es gilt mittlerweile als erwiesen, dass alle Organismen zur Aufrechterhaltung des Metallgleichgewichts ein komplexes Netzwerk von Proteinen und niedermolekularen Verbindungen entwickelt haben. Die molekularen Komponenten dieses Netzwerks sind nur zu einem Teil bekannt und charakterisiert: In den letzten Jahren wurden einige Proteinfamilien identifiziert, deren Mitglieder Metalle durch Lipidmembranen transportieren. Eine dieser Metalltransporterfamilien ist die Cation Diffusion Facilitator (CDF)-Familie: Alle charakterisierten Mitglieder exportieren Metalle aus dem Zytoplasma – entweder in zelluläre Kompartimente oder aus der Zelle heraus. Von den zwölf Mitgliedern dieser Familie in Arabidopsis thaliana (A. thaliana) – Metall Toleranz Protein (MTP)-1 bis -12 – wurden bisher AtMTP1 und AtMTP3 charakterisiert. In dieser Arbeit wird die Charakterisierung von AtMTP2 beschrieben. Wie die homologen Proteine AtMTP1 und AtMTP3 führt AtMTP2 zu Zn-Toleranz, wenn es heterolog in Zn-sensitiven Hefemutanten exprimiert wird. Mit AtMTP2 transformierte Hefemutanten zeigten darüber hinaus erhöhte Co-Toleranz. Expression von chimären AtMTP2/GFP Fusionsproteinen in Hefe, A.thaliana protoplasten und in stabil transformierten A.thalinana Planzenlinien deutet auf Lokalisation of AtMTP2 in Membranen des Endoplasmatischen Retikulums (ER) hin, wenn GFP an den C-Terminus von MTP2 fusioniert wird. Fusion of GFP an den N-Terminus von AtMTP2 führte zu Lokalisation in der vakuolären Membran, was wahrscheinlichsten auf Fehllokalisierung durch Maskierung eines ER-Retentionsmotivs (XXRR) am N-Terminus von AtMTP2 zurückgeht. Dies legt nahe, dass AtMTP2 die erwähnten Metalle in das Endomembransystem der Zelle transportieren kann. Eine gewebespezifische Lokalisierung wurde mit Pflanzen durchgeführt, die das β-Glucuronidase (GUS)-Reporterprotein bzw. chimäre Fusionsproteine aus EGFP und AtMTP2 unter Kontrolle des nativen pMTP2-Promotors exprimierten. Diese Experimente bestätigten zum einen, dass der pMTP2-Promotor nur unter Zn-Defizienz aktiv ist. GUS-Aktivität wurde unter diesen Bedingungen in zwei Zonen der Wurzelspitze beobachtet: in den isodiametrischen Zellen der meristematischen Zone und in der beginnenden Wurzelhaarzone. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die EGFP-Fusionsproteine unter Kontrolle des nativen pMTP2-Promotors nur in epidermalen Zellen exprimiert werden. Für eine homozygote Knockout- Linie, mtp2-S3, konnte bisher kein eindeutiger Phänotyp identifiziert werden. Auf Grundlage der bisher durchgeführten Charakterisierung von AtMTP2 erscheinen zwei Modelle der Funktion von AtMTP2 in der Pflanze möglich: AtMTP2 könnte essentiell für die Versorgung des ER mit Zn unter Zn-Mangelbedingungen sein. Hierfür spricht, dass AtMTP2 in jungen, teilungsaktiven und damit Zn-benötigenden Wurzelzonen exprimiert wird. Die auf die Epidermis beschränkte Lokalisation könnte bei diesem Modell auf die Möglichkeit der zwischenzellulären Zn-Verteilung innerhalb des ER über Desmotubules hindeuten. Alternativ könnte AtMTP2 eine Funktion bei der Detoxifizierung von Zn unter Zn-Schock Bedingungen haben: Es ist bekannt, dass unter Zn- Mangelbedingungen die Expression der zellulären Zn-Aufnahmesysteme hochreguliert wird. Wenn nun die Zn-Verfügbarkeit im Boden z. B durch eine pH-Änderung innerhalb kurzer Zeit stark ansteigt, besteht die Notwendigkeit der Entgiftung von Zn innerhalb der Zelle, bis der starke Einstrom von Zn ins Zytoplasma durch die Deaktivierung der Zn-Aufnahmesysteme und einer geringeren Expression in der Pflanze gedrosselt ist. Ein ähnlicher Mechanismus wurde in der Bäckerhefe S. cerevisae beschrieben, in der darüber hinaus ein Zn-Transporter verstärkt exprimiert wird, der Zn durch Transport in die Vakuole entgiften kann. Es ist durchaus möglich, dass in Arabidopsis AtMTP2 die Zn-Detoxifizierung unter diesen speziellen Bedingungen durch Zn-Transport in das ER oder die Vakuole vermittelt. Zur Identifikation weiterer Komponenten des Metallhomöostasenetzwerks sind verschiedene Ansätze denkbar. In dieser Arbeit wurde in Hefe ein heterologer Screen durchgeführt, um Interaktoren für vier Mitglieder der Arabidopsis-CDF-Familie zu identifizieren. Unter den 11 im Hefesystem bestätigten Kandidaten befindet sich mit AtSPL1 ein AtMTP1-Interaktionskandidat, der möglicherweise eine Rolle bei der Cu-,Zn-Homöostase spielt. Als wahrscheinliche AtMTP3-Interaktionskandidaten wurde die c”-Untereinheit der vakuolären H+-ATPase AtVHA identifiziert sowie mit AtNPSN13 ein Protein, das vermutlich eine Rolle bei Fusionen von Vesikeln mit Zielmembranen spielt. Ein anderer Ansatz zur Identifikation neuer Metallhomöostasegene ist die vergleichende Elementanalyse von natürlichen oder mutagenisierten Pflanzenpopulationen. Voraussetzung für diesen Ansatz ist die schnelle und genaue Analyse des Elementgehalts von Pflanzen. Eine etablierte Methode zur simultanen Bestimmung von bis zu 65 Elementen in einer Probe ist die Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectrometry (ICP OES). Der limitierende Faktor für einen hohen Probendurchsatz ist die Notwendigkeit, Proben für die Analyse zu verflüssigen. Eine alternative Methode der Probenzuführung zum Analysegerät ist die elektrothermale Verdampfung (ETV) der Probe. Zur weitgehend automatisierten Analyse von Pflanzenmaterial mit minimiertem Arbeitsaufwand wurde eine Methode entwickelt, die auf der Kopplung der ETV mit der ICP OES basiert. N2 - All organisms require for their survival essential metals. For each required metal exists an optimal concentration between metal deficiency and -toxicity. It has become evident that all organisms developed a complex network of proteins and low molecular compounds to maintain the equilibrium between all metals. Only few molecular components of this metal-homeostasis network are characterized in detail: A number of protein families whose members transport metals over the barrier of lipid-membranes have been identified during the last couple of years. One of those metal-transport families is the Cation Diffusion Facilitator (CDF) family. All characterized members export metals from the cytoplasm – either into cellular compartments or outside the cell. From the 12 Arabidopsis thaliana (A.thaliana) members – Metal Tolerance Protein (MTP)-1 to 1-2 – only MTP1 and MTP3 have been characterized yet. In this work, characterization of MTP2 is described. As was found for the homologous proteins AtMTP1 and AtMTP3, heterologous expression of AtMTP2 in Zn-sensitive yeast mutants leads to enhanced Zn-tolerance. Less pronounced, enhanced tolerance was also found for Co when AtMTP2 was expressed in Co sensitive yeast mutants. Expression of chimeric AtMTP2/GFP fusion proteins in yeast, A.thaliana protoplasts and in stably transformed A.thalinana plant lines indicated localization of MTP2 in membranes of the endoplasmic reticulum, when GFP was fused to the C-terminal end of MTP2. Fusion of GFP to the N-terminal end of MTP2 lead to vacuolar localization that is most likely explained as mistargeting due to masking of an ER retrieval motive (XXRR) found at the N-terminus of MTP2. This suggests that AtMTP2 mediates the transport of Zn and Co into the endomembrane system of the cell. Tissue specific localization was performed with plant lines expressing the β-Glucuronidase (GUS) reporter protein and with plant lines expressing chimeric fusions of GFP with AtMTP2 under control of the native pMTP2 promoter. Those experiments confirmed Affymetrix Genechip® data suggesting activity of the pMTP2 promoter only under Zn-deficiency. GUS activity was only found under Zn-deficiency in two zone of root tips – the meristematic zone, characterized by isodiamtric cells, and in the beginning differentiation zone, characterized by appearing root hairs. Confocal microscopy with plant lines expressing chimeric MTP2 /GFP fusions demonstrated that expression of AtMTP2 is restricted to epidermal cells. A phenotype for the homozygous mtp2-S3 knockout mutant could not be identified yet. Based on the data obtained as yet , two mode of action of AtMTP2 in planta seam likely: AtMTP2 could be essential for delivery of Zn to the ER under Zn-deficiency. This is supported by the fact, that AtMTP2 is active in young, dividing (and therefore Zn-requiring) zones of the root. The epidermal-restricted expression of AtMTP2 points towards a distribution of Zn in these root zones of Zn within desmotubules. Alternatively, AtMTP2 could have a Zn-detoxifying function under Zn-shock. It is known that in yeast under Zn-deficiency not only the expression of an Zn-uptake transporter is up-regulated, but also the expression of a vacuolar Zn-transporter. It mediates Zn-detoxification of surplus Zn that enters cells upon Zn-resupply before shut down of the Zn uptake system. AtMTP2 could exert this function when soil Zn-availability raises suddenly, for example due to rain after a drought. Different means/methods are perceivable to identify further components of the metal homeostasis network. In this work, a heterologuos screen was performed in yeast to identify interacting proteins for four members of the Arabidopsis CDF-family. Among 11 candidates identified and confirmed in the Split Ubiquitin System (SUS, a Yeast-2-Hybrid variant) is with AtSPL1 an AtMTP1 interaction candidate, which plays putatively a role in Zn,Cu homoestasis. The c” subunit of the vacuolar H+-ATPase AtVHA was found as likely AtMTP3-interaction candidate, as well as AtNPSN13, an protein that plays putatively a role in fusion of vesicles with target-membranes. Another method to identify new metal homeostasis genes is the comparative elemental analysis of natural and mutagenized plant populations. Prerequisite for this approach is the fast and accurate analysis of the elemental composition of plants. An established method for elemental analysis is Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectrometry (ICP OES). The limiting factor for high thoughput is the requirement for laborious wet digest of plant samples before analysis. An alternative mean of sample delivery to the ICP OES is electrothermal vaporization (ETV). For faster, less laborious analysis of plant material, a method based on the established coupling of ETV with ICP OES was developed, which is optimized for plant material and automated as far as possible. KW - CDF KW - MTP KW - MTP1 KW - MTP2 KW - MTP3 KW - Interaktoren KW - Split Ubiquitin KW - ETV KW - ICP OES KW - CDF KW - MTP KW - MTP1 KW - MTP2 KW - MTP3 KW - Interactors KW - Split Ubiquitin KW - ETV KW - ICP OES Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-13234 ER - TY - THES A1 - Schäfer, Marjänn Helena T1 - Untersuchungen zur Evolution der 15-Lipoxygenase (ALOX15) bei Säugetieren und funktionelle Charakterisierung von Knock-in-Mäusen mit humanisierter Reaktionsspezifität der 15-Lipoxygenase-2 (Alox15b) T1 - Studies on the evolution of 15-lipoxygenase (ALOX15) in mammals and functional characterization of Knock-in mice with humanized reaction specificity of 15-lipoxygenase-2 (Alox15b) N2 - Arachidonsäurelipoxygenasen (ALOX-Isoformen) sind Lipid-peroxidierenden Enzyme, die bei der Zelldifferenzierung und bei der Pathogenese verschiedener Erkrankungen bedeutsam sind. Im menschlichen Genom gibt es sechs funktionelle ALOX-Gene, die als Einzelkopiegene vorliegen. Für jedes humane ALOX-Gen gibt es ein orthologes Mausgen. Obwohl sich die sechs humanen ALOX-Isoformen strukturell sehr ähnlich sind, unterscheiden sich ihre funktionellen Eigenschaften deutlich voneinander. In der vorliegenden Arbeit wurden vier unterschiedliche Fragestellungen zum Vorkommen, zur biologischen Rolle und zur Evolutionsabhängigkeit der enzymatischen Eigenschaften von Säugetier-ALOX-Isoformen untersucht: 1) Spitzhörnchen (Tupaiidae) sind evolutionär näher mit dem Menschen verwandt als Nagetiere und wurden deshalb als Alternativmodelle für die Untersuchung menschlicher Erkrankungen vorgeschlagen. In dieser Arbeit wurde erstmals der Arachidonsäurestoffwechsel von Spitzhörnchen untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass im Genom von Tupaia belangeri vier unterschiedliche ALOX15-Gene vorkommen und die Enzyme sich hinsichtlich ihrer katalytischen Eigenschaften ähneln. Diese genomische Vielfalt, die weder beim Menschen noch bei Mäusen vorhanden ist, erschwert die funktionellen Untersuchungen zur biologischen Rolle des ALOX15-Weges. Damit scheint Tupaia belangeri kein geeigneteres Tiermodel für die Untersuchung des ALOX15-Weges des Menschen zu sein. 2) Entsprechend der Evolutionshypothese können Säugetier-ALOX15-Orthologe in Arachidonsäure-12-lipoxygenierende- und Arachidonsäure-15-lipoxygenierende Enzyme eingeteilt werden. Dabei exprimieren Säugetierspezies, die einen höheren Evolutionsgrad als Gibbons aufweisen, Arachidonsäure-15-lipoxygenierende ALOX15-Orthologe, während evolutionär weniger weit entwickelte Säugetiere Arachidonsäure-12 lipoxygenierende Enzyme besitzen. In dieser Arbeit wurden elf neue ALOX15-Orthologe als rekombinante Proteine exprimiert und funktionell charakterisiert. Die erhaltenen Ergebnisse fügen sich widerspruchsfrei in die Evolutionshypothese ein und verbreitern deren experimentelle Basis. Die experimentellen Daten bestätigen auch das Triadenkonzept. 3) Da humane und murine ALOX15B-Orthologe unterschiedliche funktionelle Eigenschaften aufweisen, können Ergebnisse aus murinen Krankheitsmodellen zur biologischen Rolle der ALOX15B nicht direkt auf den Menschen übertragen werden. Um die ALOX15B-Orthologen von Maus und Mensch funktionell einander anzugleichen, wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit Knock-in Mäuse durch die In vivo Mutagenese mittels CRISPR/Cas9-Technik hergestellt. Diese exprimieren eine humanisierte Mutante (Doppelmutation von Tyrosin603Asparaginsäure+Histidin604Valin) der murinen Alox15b. Diese Mäuse waren lebens- und fortpflanzungsfähig, zeigten aber geschlechtsspezifische Unterschiede zu ausgekreuzten Wildtyp-Kontrolltieren im Rahmen ihre Individualentwicklung. 4) In vorhergehenden Untersuchungen zur Rolle der ALOX15B in Rahmen der Entzündungsreaktion wurde eine antiinflammatorische Wirkung des Enzyms postuliert. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob eine Humanisierung der murinen Alox15b die Entzündungsreaktion in zwei verschiedenen murinen Entzündungsmodellen beeinflusst. Eine Humanisierung der murinen Alox15b führte zu einer verstärkten Ausbildung von Entzündungssymptomen im induzierten Dextran-Natrium-Sulfat-Kolitismodell. Im Gegensatz dazu bewirkte die Humanisierung der Alox15b eine Abschwächung der Entzündungssymptome im Freund‘schen Adjuvans Pfotenödemmodell. Diese Daten deuten darauf hin, dass sich die Rolle der ALOX15B in verschiedenen Entzündungsmodellen unterscheidet. N2 - Arachidonic acid lipoxygenases (ALOX-isoforms) are lipid peroxidizing enzymes that have been implicated in cell differentiation and in the pathogenesis of different diseases. In the human genome six different ALOX genes have been identified and all of them occur as single copy genes. For each human ALOX gene an ortholog exists in the mouse genome. Although human and mouse ALOX orthologs share a high degree of structural similarity ALOX15 and ALOX15B orthologs exhibit distinct functional characteristics. In the present study addressed four different questions on the occurrence, the biological role and enzyme evolution of mammalian ALOX15 and ALOX15B orthologs. 1) Tupaiidae are more closely related to humans than rodents and therefore these mammals have frequently been suggested as better animal models than mice for investigations into patho-physiological basis of human diseases. This work explored for the first time the arachidonic acid metabolism of a Tupaiidae representative (Tupaia belangeri) and found that this mammal carries four distinct ALOX15 genes in its genome. The enzymes encoded by these four genes share a high degree of functional similarity but the observed genomic multiplicity, which is neither present in mice nor in humans, makes studies into the biological role of ALOX15 orthologs more complex. Thus, Tupaia belangeri is not more suitable than mice for investigations into the biological role of mammalian ALOX15 orthologs since loss-of-function studies on one ALOX15 ortholog may easily be compensated by upregulation of an orthologous gene. 2) According to the Evolutionary Hypothesis mammalian ALOX15 orthologs can be subdivided into arachidonic acid 12-lipoxygenating and arachidonic acid 15-lipoxygenating enzymes. Mammalian species, which are ranked above gibbons express arachidonic acid 15 lipoxygenating ALOX15 orthologs. In contrast mammals ranked below gibbons express arachidonic acid 12-lipoxygenating enzymes. In this study the ALOX15 orthologs of eleven different mammals expressed as recombinant proteins and characterized their functional properties. The results of these experiments were consistent with the Evolutionary Hypothesis and put this theory on a broader experimental basis. Moreover, the obtained in vitro mutagenesis data indicate that the novel enzymes follow Triad Concept. 3) Since human and mouse ALOX15B orthologs exhibit different functional properties, conclusion drawn in mouse models of human diseases may be misleading. To make human and mouse ALOX15B orthologs more like each other were generated Alox15b knock-in mice, which express the humanized Tyr603Asp+His604Val double mutant of mouse Alox15b instead of the endogenous wildtype enzyme employing the CRISPR/Cas9 in vivo mutagenesis strategy. These Alox15b-KI mice are viable, reproduce normally but exhibit gender-specific differences to outbred wildtype control animals when the bodyweight kinetics during adolescence and early adulthood were followed. 4) In previous studies an anti-inflammatory role of ALOX15B in the pathogenesis of inflammation has been suggested. Here we explored whether functional humanization of mouse Alox15b impacts the severity of inflammatory symptoms in two mouse inflammation models. In the dextran-sodium sulfate colitis model humanization of mouse Alox15b induced more severe inflammatory symptoms. In contrast, humanization of this enzyme protected mice in the Freund’s complete adjuvants induced paw edema model. Taken together, these data suggest that the patho-physiological roles of Alox15b may vary depending on the type of the animal inflammation model used. KW - Lipoxygenase KW - ALOX15B KW - Knock in Mäuse KW - enzymatische Reaktionsspezifität KW - Tupaia belangeri KW - DSS-Colitis KW - Pfotenödem Mausmodell KW - mammalian ALOX15 orthologs Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-620340 ER - TY - THES A1 - Usadel, Björn T1 - Untersuchungen zur Biosynthese der pflanzlichen Zellwand = [Identification and characterization of genes involved in plant cell wall synthesis] T1 - Untersuchungen zur Biosynthese der pflanzlichen Zellwand N2 - Even though the structure of the plant cell wall is by and large quite well characterized, its synthesis and regulation remains largely obscure. However, it is accepted that the building blocks of the polysaccharidic part of the plant cell wall are nucleotide sugars. Thus to gain more insight into the cell wall biosynthesis, in the first part of this thesis, plant genes possibly involved in the nucleotide sugar interconversion pathway were identified using a bioinformatics approach and characterized in plants, mainly in Arabidopsis. For the computational identification profile hidden markov models were extracted from the Pfam and TIGR databases. Mainly with these, plant genes were identified facilitating the “hmmer” program. Several gene families were identified and three were further characterized, the UDP-rhamnose synthase (RHM), UDP-glucuronic acid epimerase (GAE) and the myo-inositol oxygenase (MIOX) families. For the three-membered RHM family relative ubiquitous expression was shown using variuos methods. For one of these genes, RHM2, T-DNA lines could be obtained. Moreover, the transcription of the whole family was downregulated facilitating an RNAi approach. In both cases a alteration of cell wall typic polysaccharides and developmental changes could be shown. In the case of the rhm2 mutant these were restricted to the seed or the seed mucilage, whereas the RNAi plants showed profound changes in the whole plant. In the case of the six-membered GAE family, the gene expressed to the highest level (GAE6) was cloned, expressed heterologously and its function was characterized. Thus, it could be shown that GAE6 encodes for an enzyme responsible for the conversion of UDP-glucuronic acid to UDP-galacturonic acid. However, a change in transcript level of variuos GAE family members achieved by T-DNA insertions (gae2, gae5, gae6), overexpression (GAE6) or an RNAi approach, targeting the whole family, did not reveal any robust changes in the cell wall. Contrary to the other two families the MIOX gene family had to be identified using a BLAST based approach due to the lack of enough suitable candidate genes for building a hidden markov model. An initial bioinformatic characterization was performed which will lead to further insights into this pathway. In total it was possible to identify the two gene families which are involved in the synthesis of the two pectin backbone sugars galacturonic acid and rhamnose. Moreover with the identification of the MIOX genes a genefamily, important for the supply of nucleotide sugar precursors was identified. In a second part of this thesis publicly available microarray datasets were analyzed with respect to co-responsive behavior of transcripts on a global basis using nearly 10,000 genes. The data has been made available to the community in form of a database providing additional statistical and visualization tools (http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de). Using the framework of the database to identify nucleotide sugar converting genes indicated that co-response might be used for identification of novel genes involved in cell wall synthesis based on already known genes. N2 - Obwohl der Aufbau der pflanzlichen Zellwand im Großen und Ganzen relativ gut charakterisiert ist, ist relativ wenig über ihre Synthese bekannt. Allgemein akzeptiert ist jedoch, dass die Nukleotidzucker die Vorstufe für den polysaccharidären Teil der Zellwand stellen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden neue Kandidatengene für die Zellwandbiosynthese mittels bioinformatorischer Analysen ermittelt und deren Rolle in Pflanzen, hauptsächlich Arabidopsis thaliana untersucht. Zur Identifizierung von Arabidopsis thaliana Kandidatengenen des Nukleotidzucker-Stoffwechselweges wurden „hidden Markov Modelle“ für Gene desselben aus den Datenbanken Pfam und TIGR extrahiert. Unter anderem wurden diese dann unter Zuhilfenahme des Programms hmmer zur Identifikation von pflanzlichen Genen benutzt. Es wurden einige Genfamilien identifiziert und drei von diesen wurden weiter charakterisiert. Hierbei handelte sich um eine UDP-Rhamnose Synthase Familie (RHM), eine UDP-Glucuronsäurepimerase Familie (GAE) und eine myo-Inositol Oxygenase Familie (MIOX). Für die RHM Kandidatengenfamilie, mit drei Mitgliedern, wurde die relativ ubiquitäre Expression aller Gene mittels verschiedener Methoden gezeigt und für eines der Gene, RHM2, konnten T-DNA Linien bezogen werden. Außerdem wurde die Transkription der gesamten Familie mittels eines RNAi Konstruktes herunter geregelt. In beiden Fällen konnte eine Veränderung von zellwandtypischen Polysacchariden sowie schwere Entwicklungsstörungen gezeigt werden. Diese waren bei der rhm2 Funktionsverlustpflanze auf den Samenschleim bzw. den Samen reduziert, bei den RNAi Pflanzen hingegen war die gesamte Pflanze betroffen. Im Falle der zweiten Kandidatengenfamilie, GAE, wurde das höchst-exprimierte Gen (GAE6) kloniert, heterolog exprimiert und die Funktion charakterisiert. So konnte gezeigt werden, dass GAE6 für ein Enzym kodiert, welches UDP-Glukuronsäure in UDP-Galakturonsäure wandelt. Allerdings zeigten Pflanzen mit veränderter Transkriptmenge, erreicht durch T-DNA Insertionen (gae2, gae5, gae6), Überexpression (GAE6) oder RNAi , keine robuste Veränderung der Zellwand. Die letzte betrachtete Kandiatengenfamilie myo-Inositol Oxygenase wurde im Gegensatz zu den beiden anderen Familien, durch eine BLAST Suche gefunden, da zur Zeit der Durchführung noch zu wenig myo-inositol Oxygenasen bekannt waren, um daraus „hidden Markov Modelle“ abzuleiten. Dennoch konnten erste bioinformatorische Analysen zu dieser Genfamilie gemacht werden. Insgesamt gesehen wurden in diesem Teil der Arbeit die beiden Genfamilien identifiziert und charkterisiert, die bei der Synthese der beiden Pektinrückgradzucker Rhamnose und Galakturonsäure die tragende Rolle spielen. Weiterhin wurde mit der Identifizierung der MIOX Genfamilie, eine Genfamilie identifiziert, die wichtige Vorstufen in der Synthese der Nukleotidzucker liefert. In einem zweiten Teil der Arbeit wurden öffentlich zugängliche Mikroarray-Daten durch ihr Gleich -oder Ungleichverhalten charakterisiert. Dieses erfolgte auf globaler Ebene für zunächst fast 10.000 Gene. Die Daten wurden in Form einer allgemein zugänglichen Datenbank der Allgemeinheit zur Verfügung gestellt (http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de). Eine Anwendung der Methode auf Gene des Nukleotidzuckerstoffwechsels, deutet darauf hin, dass so neue Kandiatengene, die bei der Zellwandsynthese eine Rolle spielen, von bereits bekannten Genen abgeleitet werden können. T2 - Identification and Characterization of Genes Involved in Plant Cell Wall Synthesis KW - Zellwand KW - Rhamnose KW - Galacturonsäure KW - Pektinsäure KW - Pektine KW - Inosite KW - Korrelationsanalyse KW - plant cell wall biosynthesis KW - udp-rhamnose KW - udp-galacturonic acid KW - correlation networks Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-2947 ER - TY - THES A1 - Lehmann, Cathleen T1 - Untersuchungen zum Aufnahmemechanismus und intrazellulärem Transport von fusogenen und kationischen Liposomen-DNA-Komplexen für den Gentransfer N2 - Mit der vorliegenden Arbeit sollten mit Hilfe elektronenmikroskopischer Methoden verschiedene Liposomen-DNA-Komplexe zum Gentransfer charakterisiert sowie die Aufnahme und Verteilung in der Zellkultur untersucht werden. Dabei waren vor allem solche Präparationen von besonderem Interesse, die in unserer Arbeitsgruppe 'Drug Targeting' getestet oder entwickelt und verwendet wurden, wie Sendai-Virus Liposomen (HVJ-Liposomen), Virosomen sowie DAC-Chol und DOCSPER-Liposomen als Vertreter der kationischen Lipide. Im ersten Teil der Arbeit wurden fusogene Liposomen und Virosomen charakterisiert. Bei diesen Untersuchungen wurden folgende Ergebnisse erzielt: ·Sendai-Viren fusionieren mit Liposomen unterschiedlicher Lipidzusammensetzung. ·Die daraus resultierenden HVJ-Liposomen sind mit elektronenmikroskopischen Methoden identifizierbar. ·Die Spikes auf den HVJ-Liposomen besitzen fusogene Eigenschaften. ·HVJ-Liposomen eignen sich auf Grund der geringen Ausbeute sowie der geringen Transfektionseffizienz nicht zum in vitro Gentransfer. ·Virosomen stellen einen weiteren Typ fusogener Gentransfervesikel dar. ·Ihre Größe und fusogenen Eigenschaften sind abhängig von der externen Zugabe einer optimierten Lipidmischung. ·Im Innenraum der Virosomen kann mit Poly-L-Lysin vorkomplexierte DNA verkapselt werden. ·Die fusogenen Eigenschaften der Virosomen wurden mit Hilfe immunelektronenmikroskopischer Techniken und monoklonaler Antikörper gegen Hämagglutinin/Neuraminidase und das Fusionsprotein sowie mit polyklonalen Antiseren gezeigt. ·An Hand goldmarkierter DNA sind Virosomen nach der Transfektion in der Zelle nachweisbar. Da in unserer Arbeitsgruppe bevorzugt kationische Liposomen zum Gentransfer verwendet werden, wurde auch die Struktur der Liposomen untersucht und folgende Ergebnisse dokumentiert: ·Die Struktur und die Größe kationischer Liposomen werden hauptsächlich durch die Lipidzusammensetzung bestimmt. ·Die Bildung von Liposomen-DNA-Komplexen ist mit einer Größenzunahme der Komplexe gekoppelt. ·Die Anzahl gebundener Plasmide steigt mit der Größe der Lipoplexe. ·Gentransferaktive Lipopolyplexe (mit Protaminsulfat komplexierte DNA und DAC-Chol- Liposomen) sind kleiner als Lipoplexe. Ihre Struktur wird von der Zusammensetzung bestimmt. Eine weitere wichtige Frage betrifft den Weg der Gencarrier in der Zelle. Kenntnisse über diese Vorgänge sind vorteilhaft, um die einzelnen Schritte zu verstehen und möglichst gezielt zu verbessern. Bei der Untersuchung der Partikel im Hinblick auf zelluläre Barrieren beim Gentransfer konnten folgende Ergebnisse erzielt werden: ·Die Bindung der Partikel an die Zellmembran und Aufnahme sind abhängig von den eingesetzten Zellen und Komplexen sowie derInkubationszeit. ·Die Aufnahme erfolgt über endozytotische Mechanismen, wobei Lipopolyplexe schneller als Lipoplexe in die Zellen gelangen. Nicht alle gebundenen Komplexe werden aufgenommen. ·Die aufgenommenen Partikel befinden sich in Endosomen und werden ins Innere der Zelle transportiert. ·Freisetzung der DNA und Eintritt in den Zellkern über Kernporen konnte nicht beobachtet werden. ·DNA-haltige Vesikel in Kernnähe deuten auf einen weiteren Mechanismus hin (Vesikeltransfer zum Zellkern). N2 - The aim of this work is the characterisation of several liposome DNA complexes for in vitro gene transfer and uptake as well as their distribution in cultured cell lines using electron microscopy. The particles used were fusogenic liposomes made from Sendai virus, virosomes and cationic liposomes. At first fusogenic liposomes and virosomes were characterised. The results obtained are summarised below: ·Sendai virus can fuse with liposomes made from different lipid composition. ·HVJ-liposomes are detectable using electron microscopy techniques. ·The spikes from HVJ-liposomes have fusogenic properties. ·HVJ-liposomes are not suitable for in vitro gene transfer due to the low amount of fusogenic liposomes leading to low transfection efficiency. ·Virosomes, reconstituted virus envelopes, are another type of fusogenic vesicles. ·Size and morphology of virosomes depends on the addition of an optimised lipid mixture. ·PLL treated DNA is entrapped into virosomes. ·Monoclonal and polyclonal antibodies and protein A gold technique can be used for the detection of viral glycoproteins on virosomes. ·Gold labelled DNA was used to show the distribution in cultured cells. In order to characterise the structure of cationic liposomes following results were obtained: ·Size and structure depends on the lipid composition. ·The formation of liposomes leads to an increase of the size. ·Larger lipoplexes contain more DNA. ·Lipopolyplexes composed of DNA complexed with protamine sulphate and DAC- Chol liposomes are smaller than lipoplexes. Their structure depends on the composition. To improve transfection ability examination of the cellular barriers is useful. With regard to the fate of lipoplexes following results were obtained. ·Binding depends on the cell line, kind of particles and incubation time. ·Uptake occurs through endocytosis. Lipopolyplexes enter the cells faster than larger lipoplexes. ·Lipoplexes are enclosed in endosomes and were carried into the centre of the cell. ·Escape of DNA from endosomes and entry into nucleus were not visible. ·Vesicles with DNA were observed near the nucleus. There is an opportunity for another pathway to the nucleus. KW - Gentherapie KW - kationische Liposomen KW - Virosomen KW - Elektronenmikroskopie KW - gene therapy KW - cationic liposome KW - virosome KW - electron microscopy Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0001196 ER - TY - THES A1 - Drechsel, Oliver T1 - Untersuchungen zu Struktur und Expression des Plastidengenoms höherer Pflanzen T1 - Investigation of structure and expression of the plastid genome of higher plants N2 - Auf dem Weg der genetischen Information stellt die Translation der RNA in eine Aminosäuresequenz den letzten Schritt dar. In Chloroplasten, den grünen Organellen der Pflanzenzellen, findet ein Großteil der Regulation der Genexpression auf Ebene der Initiation dieses Schrittes statt. Eine Vielzahl von Eigenschaften der RNA und von Faktoren, die an die RNA binden, entfalten einen Einfluss auf diesen Schritt. Bisher unvollständig aufgeklärt ist die Rolle einer konservierten Nukleotidsequenz in der untranslatierten Region der RNA -- der Shine-Dalgarno-Sequenz. Diese stellt in Bakterien, wie z.B. E. coli als Ribosomenbindestelle sicher, dass Ribosomen den Anfang der zu translatierenden Sequenz zuverlässig erkennen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden diverse DNA-Konstrukte in Plastiden von Tabak eingebracht. Hierzu zählten Konstrukte, die sowohl eine erhöhte Anzahl von Ribosomenbindestellen enthielten als auch vermehrte Startpunkte der Translation. Zusätzlich wurden Konstrukte hergestellt, die die Situation von mehreren zu translatierenden Regionen in der RNA nachstellten. Es konnte festgestellt werden, dass plastidäre Ribosomen die strangaufwärts gelegenen Translationsstartpunkte bevorzugen -- im Gegensatz zu E. coli, wo alle Startpunkte gleichmäßig genutzt wurden. Hierdurch zeigten die prokaryotischen Ribosomen aus Chloroplasten, die sich aus bakteriellen Systemen ableiten, Eigenschaften von eukaryotischen Ribosomen. Ein zweites Teilprojekt dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Inkompatibilität von Chloroplasten mit dem Kerngenom. In Kreuzungen von Arten der Gattung Pelargonium fielen Kombinationen auf, bei denen die Tochterpflanzen bleiche Blattbereiche bis hin zu vollständig weißen Pflanzen zeigten. Dieses Phänomen wird als Bastardbleichheit bezeichnet. In der Gattung Pelargonium werden Chloroplasten von beiden Elternteilen an die Tochterpflanzen vererbt. Da das Phänomen der Bastardbleichheit nur in einem der Plastiden vorkommt, nicht jedoch im anderen in der gleichen Pflanze, muss von einem Effekt ausgegangen werden, der von Plastiden ausgeht. Die Interaktionen zwischen Zellkern und Chloroplasten sind offensichtlich stark gestört. Zur detaillierten Untersuchung dieses Effekts wurde die Nukleotidsequenz von drei Chloroplastengenomen aufgeklärt. Es konnte eine Reihe von Sequenzunterschieden der Genome ermittelt werden. Aus diesen wurde eine Reihe von Unterschieden beobachtet, die einen solchen Effekt zur Folge haben können. Aus diesen Unterschieden wurde eine Reihe von potentiellen Kandidatengenen zusammengestellt, die in weiteren Arbeiten auf ihre Rolle in der Entstehung der Bastardbleichheit untersucht werden. N2 - Chloroplasts are the green organelles of plants with a evolutionary prokaryotic background. During evolution chloroplasts established translation initiation as the major step in regulation of gene expression. A vast number of factors, e.g. sequence elements, secondary structures or RNA binding proteins, influences the regulation of translation initiation. A conserved sequence – Shine-Dalgarno sequence – can be identified both in prokaryotes as well as chloroplasts. In prokaryotes this sequence provides a faithful means for positioning of the ribosome to the start codon. Due to lower conservation of Shine-Dalgarno sequences the role of this sequence in translation initiation is not completely understood. We designed a series of constructs that contain different arrangements of these sequences in the 5’ UTR resulting in an increased number of potential ribosome binding sites or translation initiation sites. Additionally we constructed a series of 5’ UTRs that resembled polycistronic transcripts. The results showed a dramatic effect of the different constructs on the translation efficiency of the reporter protein. It could be shown that numerous translation initiation sites increase translation efficiency, whereas increased numbers of ribosome binding sites do not. Additionally it could be shown, that plastidic ribosomes preferentially initiate on 5’ translations initiation sites in contrast to prokaryotic ribosomes that recognize initiation sites equally. This illustrates that plastidic ribosomes in contrast to prokaryotic ribosomes show a scanning like mechanism. Hence plastidic ribosomes gained some eukaryotic properties during evolution. A second project was dealing with hybrid variegation. This phenomenon is based on plastid-nuclear genome incompatibility. Due to biparental plastid inheritance in Pelargonium hybrids may show chimeric phenotypes with bleached (incompatible) and green (compatible) sectors. This points to the plastome as cause for the hybrid variegation. To this end the nucleotide sequence of three plastid genomes was determined and an array of candidate genes causing the incompatibility could be compiled. KW - Shine-Dalgarno-Sequenzen KW - Translationsinitiation KW - Plastid KW - Bastardbleichheit KW - Shine-Dalgarno sequences KW - translation initiation KW - plastid KW - hybrid variegation Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-31056 ER - TY - THES A1 - Uhlig, Katja T1 - Untersuchungen PEG-basierter thermo-responsiver Polymeroberflächen zur Steuerung der Zelladhäsion T1 - Analysis of PEG-based thermo-responsive polymer surfaces to control cell adhesion N2 - Moderne Methoden für die Einzelzellanalyse werden dank der fortschreitenden Weiterentwicklung immer sensitiver. Dabei steigen jedoch auch die Anforderungen an das Probenmaterial. Viele Aufbereitungsprotokolle adhärenter Zellen beinhalten eine enzymatische Spaltung der Oberflächenproteine, um die Ablösung vom Zellkultursubstrat zu ermöglichen. Verschiedene Methoden, wie die Patch-Clamp-Technik oder eine auf der Markierung extrazellulärer Domänen von Membranproteinen basierende Durchflusszytometrie können dann nur noch eingeschränkt eingesetzt werden. Daher ist die Etablierung neuer Zellablösemethoden dringend notwendig. In der vorliegenden Arbeit werden erstmals PEG-basierte thermo-responsive Oberflächen erfolgreich für die Zellkultur eingesetzt. Dabei wird das zerstörungsfreie Ablösen verschiedener Zelllinien von den Oberflächen durch Temperatursenkung realisiert. Die Funktionalität der Oberflächen wird durch Variation der Polymerstruktur, sowie der Konzentration der Beschichtungslösung, durch Beschichtung der Oberflächen mit einem zelladhäsionsfördernden Protein (Fibronektin) und durch Adsorption zelladhäsionsvermittelnder Peptide (RGD) optimiert. Um den Zellablösungsprozess detaillierter zu untersuchen, wird hier zum ersten Mal der direkte Zellkontakt mit thermo-responsiven Oberflächen mittels oberflächensensitiver Mikroskopie (TIRAF) sichtbar gemacht. Mit dieser Technik sind die exakte Quantifizierung und die Analyse der Reduktion der Zelladhäsionsfläche während des Abkühlens möglich. Hierbei werden in Abhängigkeit von der Zelllinie Unterschiede im Zellverhalten während des Ablösens festgestellt: Zellen, wie eine Brustkrebszelllinie und eine Ovarzelllinie, die bekanntermaßen stärker mit ihrer Umgebung in Kontakt treten, vergrößern im Verlauf des Beobachtungszeitraumes den Abstand zwischen Zellmembran und Oberfläche, reduzieren jedoch ihre Zell-Substratkontaktfläche kaum. Mausfibroblasten hingegen verkleinern drastisch die Zelladhäsionsfläche. Der Ablösungsprozess wird vermutlich aktiv von den Zellen gesteuert. Diese Annahme wird durch zwei Beobachtungen gestützt: Erstens verläuft die Reduktion der Zelladhäsionsfläche bei Einschränkung des Zellmetabolismus durch eine Temperatursenkung auf 4 °C verzögert. Zweitens hinterlassen die Zellen Spuren, die nach dem Ablösen der Zellen auf den Oberflächen zurückbleiben. Mittels Kombination von TIRAF- und TIRF-Mikroskopie werden die Zelladhäsionsfläche und die Aktinstruktur gleichzeitig beobachtet. Die Verknüpfung beider Methoden stellt eine neue Möglichkeit dar, intrazelluläre Prozesse mit der Zellablösung von thermo-responsiven Oberflächen zu korrelieren. N2 - Modern methods for single-cell analysis are becoming increasingly sensitive. At the same time, requirements for the sample material are on the rise. Today, sample preparation of adherent cells usually includes steps of enzymatic treatment to digest surface proteins thus, inducing cell detachment from culture substrates. This strongly limits the application of different techniques like patch clamp or labelling of extracellular domains of membrane proteins for flow cytometry. Therefore, a new cell detachment method is urgently required. In the present work, new PEG-based thermo-responsive polymers are used for cell culture for the first time. Here, non-destructive detachment of different cell lines from polymer-coated surfaces is realised by controlled temperature reduction. The surface functionality is systematically optimised by varying the concentration of the coating solutions, by artificial surface coating of a cell adhesion-mediating protein (fibronectin) and by co-adsorption of a cell adhesion-mediating peptide (RGD). For detailed analysis of the cell detachment process, TIRF microscopy is used to directly visualise the cell contacts on the thermo-responsive surfaces. Using this technique allows both the quantification and analysis of the reduction of the cell adhesion area during sample cooling. Furthermore, for several cell lines, different behaviours in cell detachment are observed. Cells that have close contact to their substrate like MCF-7 breast cancer cell line and CHO-K1 ovary cells increase the distance between cell membrane and surface, but there is only little decrease of cell-substrate adhesion area. In contrast, L929 fibroblasts reduce the cell adhesion area drastically. Furthermore, the hypothesis that the cell detachment is an active process is shown by lowering the cell metabolism by temperature reduction to 4 °C and by the cell traces that are left behind after rinsing the surfaces. A combination of TIRAF and TIRF enables visualising the cell adhesion area and actin structures. Measuring both parameters simultaneously opens up new possibilities to correlate intracellular and cell detachment processes on thermo-responsive surfaces. KW - thermo-responsive Polymere KW - Polyethylenglykol KW - TIRF KW - Zelladhäsion KW - thermo-responsive polymers KW - polyethylene glycol KW - TIRF KW - cell adhesion Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-47784 ER - TY - THES A1 - Matallana-Ramírez, Lilian Paola T1 - Unraveling the ORE1 regulon in Arabidopsis thaliana : molecular and functional characterization of up- and down-stream components T1 - Aufklärung des ORE1-Regulationsnetzwerks in Arabidopsis thaliana : molekulare und funktionelle Charakterisierung von Über- und untergeordneten Komponenten N2 - Leaf senescence is an active process required for plant survival, and it is flexibly controlled, allowing plant adaptation to environmental conditions. Although senescence is largely an age-dependent process, it can be triggered by environmental signals and stresses. Leaf senescence coordinates the breakdown and turnover of many cellular components, allowing a massive remobilization and recycling of nutrients from senescing tissues to other organs (e.g., young leaves, roots, and seeds), thus enhancing the fitness of the plant. Such metabolic coordination requires a tight regulation of gene expression. One important mechanism for the regulation of gene expression is at the transcriptional level via transcription factors (TFs). The NAC TF family (NAM, ATAF, CUC) includes various members that show elevated expression during senescence, including ORE1 (ANAC092/AtNAC2) among others. ORE1 was first reported in a screen for mutants with delayed senescence (oresara1, 2, 3, and 11). It was named after the Korean word “oresara,” meaning “long-living,” and abbreviated to ORE1, 2, 3, and 11, respectively. Although the pivotal role of ORE1 in controlling leaf senescence has recently been demonstrated, the underlying molecular mechanisms and the pathways it regulates are still poorly understood. To unravel the signaling cascade through which ORE1 exerts its function, we analyzed particular features of regulatory pathways up-stream and down-stream of ORE1. We identified characteristic spatial and temporal expression patterns of ORE1 that are conserved in Arabidopsis thaliana and Nicotiana tabacum and that link ORE1 expression to senescence as well as to salt stress. We proved that ORE1 positively regulates natural and dark-induced senescence. Molecular characterization of the ORE1 promoter in silico and experimentally suggested a role of the 5’UTR in mediating ORE1 expression. ORE1 is a putative substrate of a calcium-dependent protein kinase named CKOR (unpublished data). Promising data revealed a positive regulation of putative ORE1 targets by CKOR, suggesting the phosphorylation of ORE1 as a requirement for its regulation. Additionally, as part of the ORE1 up-stream regulatory pathway, we identified the NAC TF ATAF1 which was able to transactivate the ORE1 promoter in vivo. Expression studies using chemically inducible ORE1 overexpression lines and transactivation assays employing leaf mesophyll cell protoplasts provided information on target genes whose expression was rapidly induced upon ORE1 induction. First, a set of target genes was established and referred to as early responding in the ORE1 regulatory network. The consensus binding site (BS) of ORE1 was characterized. Analysis of some putative targets revealed the presence of ORE1 BSs in their promoters and the in vitro and in vivo binding of ORE1 to their promoters. Among these putative target genes, BIFUNCTIONAL NUCLEASE I (BFN1) and VND-Interacting2 (VNI2) were further characterized. The expression of BFN1 was found to be dependent on the presence of ORE1. Our results provide convincing data which support a role for BFN1 as a direct target of ORE1. Characterization of VNI2 in age-dependent and stress-induced senescence revealed ORE1 as a key up-stream regulator since it can bind and activate VNI2 expression in vivo and in vitro. Furthermore, VNI2 was able to promote or delay senescence depending on the presence of an activation domain located in its C-terminal region. The plasticity of this gene might include alternative splicing (AS) to regulate its function in different organs and at different developmental stages, particularly during senescence. A model is proposed on the molecular mechanism governing the dual role of VNI2 during senescence. N2 - Der Alterungsprozess lebender Organismen wird seit vielen Jahren wissenschaftlich untersucht. In Pflanzen wird der Alterungsprozess Seneszenz genannt. Er ist für das Überleben der Pflanze von großer Bedeutung. Dennoch ist unser Wissen über die molekularen Mechanismen der Blattseneszenz, dessen komplexe Steuerung und die Wechselwirkungen mit Umweltsignale noch sehr limitiert. Ein wichtiges Steuerungselement besteht in der Aktivierung bestimmter Transkriptionsfaktoren (TFs) die während der Seneszenz unterschiedlich exprimiert werden. Aus der Literatur ist bekannt, dass Mitglieder der NAC TF Familie (NAM/ATAF/CUC) an der Regulation der Seneszenz bei Pflanzen beteiligt sind. ORE1 (ANAC092/AtNAC2), ein NAC TF mit erhöhter Genexpression während der Seneszenz, wurde erstmals in Mutanten mit verzögerte Seneszenz beschrieben, die molekularen Mechanismen, wie ORE1 die Seneszenz kontrolliert und die Stoffwechselwege reguliert, sind aber noch weitgehend unbekannt. Die Arbeiten im Rahmen dieser Dissertation wurden durchgeführt, um einen tieferen Einblick in die Regulationsmechanismen von ORE1 auf natürliche, dunkel induzierte sowie Salzstress-induzierte Seneszenz zu erhalten. Ergebnisse von Untersuchungen an zwei unterschiedlichen Pflanzenspezies (Arabidopsis thalinana und Nicotiana tabacum) deuten auf ein ähnliches Expressionsmuster von ORE1 während der natürlichen als auch der Salz-induzierten Seneszenz hin. In der Promotorregion von ORE1 wurde ein für natürliche Seneszenz charakteristisches Muster identifiziert. In vivo Analysen ergaben darüber hinaus. Hinweise auf zwei weitere ORE1 Regulatoren. Debei handelt es sich umeinen weiteren NAC TF (ATAF1) und (ii) CKOR, einer Calcium-abhängige Protein-Kinase (CDPK).In weiteren Studien wurden sechs Gene identifiziert, die durch ORE1 reguliert werden. In den Promotoren dieser Gene wurden entsprechende Bindestellen für ORE1 lokalisiert. Die ORE1-Bindung an die Promotoren wurde daraufhin sowohl in vitro als auch in vivo verifiziert. Zwei dieser Gene, die BIFUNCTIONAL Nuclease I (BFNI) und VND-Interacting2 (VNI2), wurden zudem auf molekularer und physiologischer Ebene untersucht. KW - Blattalterung KW - Transkriptionsfaktor KW - Regulationsweg KW - Leaf senescence KW - transcription factor KW - regulatory pathway Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-62646 ER - TY - THES A1 - Westbury, Michael V. T1 - Unraveling evolution through Next Generation Sequencing T1 - Entschlüsselung von Evolution durch Sequenzierung der nächsten Generation N2 - The sequencing of the human genome in the early 2000s led to an increased interest in cheap and fast sequencing technologies. This interest culminated in the advent of next generation sequencing (NGS). A number of different NGS platforms have arisen since then all promising to do the same thing, i.e. produce large amounts of genetic information for relatively low costs compared to more traditional methods such as Sanger sequencing. The capabilities of NGS meant that researchers were no longer bound to species for which a lot of previous work had already been done (e.g. model organisms and humans) enabling a shift in research towards more novel and diverse species of interest. This capability has greatly benefitted many fields within the biological sciences, one of which being the field of evolutionary biology. Researchers have begun to move away from the study of laboratory model organisms to wild, natural populations and species which has greatly expanded our knowledge of evolution. NGS boasts a number of benefits over more traditional sequencing approaches. The main benefit comes from the capability to generate information for drastically more loci for a fraction of the cost. This is hugely beneficial to the study of wild animals as, even when large numbers of individuals are unobtainable, the amount of data produced still allows for accurate, reliable population and species level results from a small selection of individuals. The use of NGS to study species for which little to no previous research has been carried out on and the production of novel evolutionary information and reference datasets for the greater scientific community were the focuses of this thesis. Two studies in this thesis focused on producing novel mitochondrial genomes from shotgun sequencing data through iterative mapping, bypassing the need for a close relative to serve as a reference sequence. These mitochondrial genomes were then used to infer species level relationships through phylogenetic analyses. The first of these studies involved reconstructing a complete mitochondrial genome of the bat eared fox (Otocyon megalotis). Phylogenetic analyses of the mitochondrial genome confidently placed the bat eared fox as sister to the clade consisting of the raccoon dog and true foxes within the canidae family. The next study also involved reconstructing a mitochondrial genome but in this case from the extinct Macrauchenia of South America. As this study utilised ancient DNA, it involved a lot of parameter testing, quality controls and strict thresholds to obtain a near complete mitochondrial genome devoid of contamination known to plague ancient DNA studies. Phylogenetic analyses confidently placed Macrauchenia as sister to all living representatives of Perissodactyla with a divergence time of ~66 million years ago. The third and final study of this thesis involved de novo assemblies of both nuclear and mitochondrial genomes from brown and striped hyena and focussed on demographic, genetic diversity and population genomic analyses within the brown hyena. Previous studies of the brown hyena hinted at very low levels of genomic diversity and, perhaps due to this, were unable to find any notable population structure across its range. By incorporating a large number of genetic loci, in the form of complete nuclear genomes, population structure within the brown hyena was uncovered. On top of this, genomic diversity levels were compared to a number of other species. Results showed the brown hyena to have the lowest genomic diversity out of all species included in the study which was perhaps caused by a continuous and ongoing decline in effective population size that started about one million years ago and dramatically accelerated towards the end of the Pleistocene. The studies within this thesis show the power NGS sequencing has and its utility within evolutionary biology. The most notable capabilities outlined in this thesis involve the study of species for which no reference data is available and in the production of large amounts of data, providing evolutionary answers at the species and population level that data produced using more traditional techniques simply could not. N2 - Die Sequenzierung des ersten menschlichen Genoms Anfang der 2000er Jahre förderte das Interesse an kostengünstigen und gleichzeitig schnelleren Sequenziertechniken. Dieses Interesse erreichte seinen derzeitigen Höhepunkt in der Einführung des sogenannten Next Generation Sequencings (NGS). Seitdem wurden zahlreiche NGS-Plattformen entwickelt, die alle dem gleichen Prinzip folgen, nämlich das Erzeugen großer Mengen genetischer Information zu relativ geringen Preisen verglichen mit herkömmlichen Methoden wie der Sanger-Sequenzierung. Die neue Leistungsfähigkeit von NGS bedeutete, dass Forscher nicht mehr länger an Organismen gebunden waren an denen bereits seit Jahren geforscht wurde (bspw. Modellorganismen oder der Mensch), sondern ermöglichte eine Verschiebung in Richtung neuerer und unterschiedlicher Arten von Interesse. Dieses Potential hat viele Wissenschaftsfelder positiv beeinflusst innerhalb der Biowissenschaften, u.a. das Feld der Evolutionsbiologie. Forscher haben angefangen sich zunehmend von Modellorganismen in Laboratorien wegzubewegen hinzu wildlebenden, natürlich vorkommenden Populationen und Arten, was unser Verständnis von Evolution maßgeblich erweitert hat. NGS hat mehrere Vorteile aufzuweisen gegenüber den herkömmlichen Sequenziermethoden. Der wohl größte Vorteil ist die Gewinnung genetischer Daten für mehrere Genorte (Loci) gleichzeitig zu einem Bruchteil der bisherigen Kosten. Das ist besonders nützlich für die Untersuchung wildlebender Tiere da, selbst wenn nicht ausreichend viele Individuen vorliegen, die gewonnene Menge an Daten genaue und verlässliche Ergebnisse auf Populations- sowie Artebene für eine kleine Auswahl an Individuen liefert. Die Verwendung von NGS zur Untersuchung von Arten, für die bisher wenig oder gar keine vorherigen Forschungsergebnisse vorliegen sowie die Gewinnung neuartiger Informationen im Bereich Evolution ebenso wie die Erstellung eines Referenzdatensatzes, der der wissenschaftlichen Gemeinschaft zur Verfügung gestellt werden kann, waren der Fokus dieser Arbeit. Zwei Studien in dieser Arbeit setzten ihren Fokus in der Gewinnung noch nicht publizierter, mitochondrialer Genome, die mittels iterative mapping erstellt wurden und so das Vorhandensein einer Referenzsequenz eines nahen Verwandten der untersuchten Art unnötig machten. In beiden Fällen wurden Shotgun Sequenzierungsdaten verwendet. Die so gewonnenen mitochondrialen Genome wurden dann genutzt, um innerartliche Verwandtschaftsverhältnisse mit hilfe von phylogenetischen Analysen zu klären. Die erste Studie befasste sich mit der Rekonstruktion des kompletten mitochondrialen Genoms des Löffelhundes (Otocyon megalotis). Die phylogenetische Analyse des mitochondrialen Genoms positionierten den Löffelhund sicher als Schwestergruppe der Klade bestehend aus Marderhund und echten Füchsen innerhalb der Familie Canidae. Die zweite Studie hat sich ebenfalls mit der Rekonstruktion eines mitochondrialen Genoms auseinandergesetzt, diesmal von einer bereits ausgestorbenen Art Südamerikas, dem Macrauchenia. Da diese Studie auf sehr alter DNA (ancient DNA) basiert, schließt sie viele Parametertests, Qualitätskontrollen sowie strenge Filterkriterien ein um ein fast vollständiges mitochondriales Genom erhalten zu können, frei von den für ancient DNA typischen Kontaminationen. Phylogenetische Analysen positionieren Macrauchenia als Schwestergruppe zu allen anderen lebenden Vertretern der Perissodactyla mit einer Abspaltung vor ~66 Millionen Jahren. Die dritte und letzte Studie dieser Arbeit beinhaltet die de novo Konstruktionen von nukleären und mitochondrialen Genomen der Schabracken- und Streifenhyäne mit Fokus auf demographische, genetische Diversität sowie Populationsgenomische Analysen innerhalb der Schabrackenhyänen. Vorausgehende Studien an der Schabrackenhyäne gaben Hinweise für einen geringen Grad an genomischer Diversität und, waren vielleicht deshalb, bisher nicht in der Lage eine nennenswerte Populationsstruktur der Schabrackenhyäne aufzudecken. Zusätzlich wurde die genomische Diversität mit der von einer Reihe anderer Arten verglichen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Schabrackenhyäne die niedrigste genomische Diversität aufweist im Vergleich zu den in dieser Studie verwendeten Arten, was vielleicht mit einem kontinuierlichen und fortschreitenden Rückgang der effektiven Populationsgröße dieser Spezies zu erklären ist, der vor ca. einer Million Jahre eingesetzt hat und dramatisch zugenommen hat zum Ende des Pleistozän. Die Studien dieser Arbeit zeigen das Potential von NGS Sequenzierung und ihren Nutzen innerhalb der Evolutionsbiologie. Die nennenswertesten Anwendungen von NGS, die in dieser Arbeit hervorgehoben wurden, sind zum Einen der Nutzen für Organismen bzw. Arten für die es keine verfügbaren Referenzdaten gibt sowie zum Anderen die Gewinnung von großen Datenmengen, die die Grundlage bilden zur Beantwortung evolutionsbiologischer Fragestellungen auf Art- und Populationsebene, was vorhergegangene, traditionelle Methoden bisher nicht leisten konnten. KW - Next generation sequencing KW - Evolution KW - Hyena KW - Evolution KW - Hyäne KW - Sequenzierung der nächsten Generation Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-409981 ER - TY - THES A1 - Rodriguez Cubillos, Andres Eduardo T1 - Understanding the impact of heterozygosity on metabolism, growth and hybrid necrosis within a local Arabidopsis thaliana collection site T1 - Den Einfluss von Heterozygotie auf Stoffwechsel, Wachstum und Hybridnekrose innerhalb einer lokalen Arabidopsis thaliana-Sammelstelle verstehen N2 - Plants are unable to move away from unwanted environments and therefore have to locally adapt to changing conditions. Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), a model organism in plant biology, has been able to rapidly colonize a wide spectrum of environments with different biotic and abiotic challenges. In recent years, natural variation in Arabidopsis has shown to be an excellent resource to study genes underlying adaptive traits and hybridization’s impact on natural diversity. Studies on Arabidopsis hybrids have provided information on the genetic basis of hybrid incompatibilities and heterosis, as well as inheritance patterns in hybrids. However, previous studies have focused mainly on global accessions and yet much remains to be known about variation happening within a local growth habitat. In my PhD, I investigated the impact of heterozygosity at a local collection site of Arabidopsis and its role in local adaptation. I focused on two different projects, both including hybrids among Arabidopsis individuals collected around Tübingen in Southern Germany. The first project sought to understand the impact of hybridization on metabolism and growth within a local Arabidopsis collection site. For this, the inheritance patterns in primary and secondary metabolism, together with rosette size of full diallel crosses among seven parents originating from Southern Germany were analyzed. In comparison to primary metabolites, compounds from secondary metabolism were more variable and showed pronounced non-additive inheritance patterns. In addition, defense metabolites, mainly glucosinolates, displayed the highest degree of variation from the midparent values and were positively correlated with a proxy for plant size. In the second project, the role of ACCELERATED CELL DEATH 6 (ACD6) in the defense response pathway of Arabidopsis necrotic hybrids was further characterized. Allelic interactions of ACD6 have been previously linked to hybrid necrosis, both among global and local Arabidopsis accessions. Hence, I characterized the early metabolic and ionic changes induced by ACD6, together with marker gene expression assays of physiological responses linked to its activation. An upregulation of simple sugars and metabolites linked to non-enzymatic antioxidants and the TCA cycle were detected, together with putrescine and acids linked to abiotic stress responses. Senescence was found to be induced earlier in necrotic hybrids and cytoplasmic calcium signaling was unaffected in response to temperature. In parallel, GFP-tagged constructs of ACD6 were developed. This work therefore gave novel insights on the role of heterozygosity in natural variation and adaptation and expanded our current knowledge on the physiological and molecular responses associated with ACD6 activation. N2 - Pflanzen sind sessile Organismen, die nicht in der Lage sind sich unerwünschten Lebensräumen zu entziehen, sodass sie sich an verschiedene Umweltbedingungen anpassen müssen. Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) als Modellorganismus der Pflanzenbiologie war in der Lage eine Vielzahl von Lebensräumen zu kolonisieren und dabei verschiedenen biotischen und abiotischen Problemen zu trotzen. Natürliche Variation in Arabidopsis hat sich in den letzten Jahren als Mittel bewährt, um Gene zu analysieren, welche für adaptive Eigenschaften und natürliche Vielfalt verantwortlich sind. Studien über Arabidopsis-Hybride haben Erkenntnisse über die genetische Basis von Hybridinkompatibilitäten, Heterosis und Vererbungsmustern von Hybriden geliefert. Jedoch haben diese sich bisher lediglich mit globalen ökotyp befasst, sodass noch viele Informationen über Variation in einem lokalen Wachstumsgebiet fehlen. In meiner Doktorarbeit habe ich den Einfluss von Heterozygotie in einer lokalen Arabidopsis-Population und deren Rolle bei der Adaption untersucht. Dabei habe ich mich auf zwei Themen fokussiert. Beide Themen beinhalteten Arabidopsis-Hybride zwischen Individuen, welche in der Region um Tübingen in Deutschland gesammelt wurden. Das erste Projekt zielte darauf ab, den Einfluss der Hybridisierung auf den Metabolismus und das Wachstum der Pflanzen in einer lokalen Arabidopsis-Population zu verstehen. Dafür wurden das Vererbungsmuster von Primär- und Sekundärmetaboliten, sowie die Rosettengröße von diallelen Kreuzungen zwischen sieben Elternpflanzen analysiert. Im Vergleich zum Primärstoffwechsel variierten Sekundärmetabolite stärker und zeigten nicht-additive Vererbungsmuster. Zusätzlich zeigten Abwehrstoffe – hauptsächlich Glukosinolate – die höchste Abweichung vom Mittelwert beider Eltern und waren in positiver Korrelation mit der Größe der Pflanzen. In dem zweiten Projekt wurde die Rolle von ACCELERATED CELL DEATH 6 (ACD6) im Abwehrsignalweg von nekrotischen Arabidopsis-Hybriden detaillierter charakterisiert. Da die genetische Interaktion zwischen ACD6-Allelen von globalen und lokalen Arabidopsis-ökotypen bereits mit Hybridnekrose verknüpft wurde, habe ich frühe Metaboliten-, Ionen- und Expressionsänderungen von Markergenen charakterisiert, welche durch die Aktivierung von ACD6 induziert wurden. Eine Erhöhung von einfachen Zuckern und Metaboliten nicht-enzymatischer Antioxidantien und dem TCA-Zyklus wurde detektiert, sowie von Putrescin und anderen Säuren abiotischer Stressantworten. Es wurde nachgewiesen, dass Seneszenz früher in nekrotischen Hybriden induziert und zytoplasmatisches Calcium-Signaling nicht durch Temperatur beeinflusst wurde. Zusätzlich wurden GFP-markierte Konstrukte von ACD6 generiert. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass diese Arbeit weitere Erkenntnisse über die Rolle von Heterozygotie in natürlicher Variation und Adaptation liefert und sie unser Wissen über die physiologischen und molekularen Veränderungen, verursacht durch die ACD6-Aktivierung, erweitert. KW - arabidopsis KW - diallel KW - nonadditive KW - inheritance KW - metabolism KW - variation KW - ACD6 KW - adaptation KW - defense KW - necrosis KW - Arabidopsis KW - Dialel KW - nicht additiv KW - Erbe KW - Stoffwechsel KW - Variation KW - ACD6 KW - Anpassung KW - Verteidigung KW - Nekrose Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-416758 ER - TY - THES A1 - Teckentrup, Lisa T1 - Understanding predator-prey interactions T1 - Verstehen von Räuber-Beute-Interaktionen BT - the role of fear in structuring prey communities BT - die Rolle der Angst bei der Strukturierung von Beutetiergemeinschaften N2 - Predators can have numerical and behavioral effects on prey animals. While numerical effects are well explored, the impact of behavioral effects is unclear. Furthermore, behavioral effects are generally either analyzed with a focus on single individuals or with a focus on consequences for other trophic levels. Thereby, the impact of fear on the level of prey communities is overlooked, despite potential consequences for conservation and nature management. In order to improve our understanding of predator-prey interactions, an assessment of the consequences of fear in shaping prey community structures is crucial. In this thesis, I evaluated how fear alters prey space use, community structure and composition, focusing on terrestrial mammals. By integrating landscapes of fear in an existing individual-based and spatially-explicit model, I simulated community assembly of prey animals via individual home range formation. The model comprises multiple hierarchical levels from individual home range behavior to patterns of prey community structure and composition. The mechanistic approach of the model allowed for the identification of underlying mechanism driving prey community responses under fear. My results show that fear modified prey space use and community patterns. Under fear, prey animals shifted their home ranges towards safer areas of the landscape. Furthermore, fear decreased the total biomass and the diversity of the prey community and reinforced shifts in community composition towards smaller animals. These effects could be mediated by an increasing availability of refuges in the landscape. Under landscape changes, such as habitat loss and fragmentation, fear intensified negative effects on prey communities. Prey communities in risky environments were subject to a non-proportional diversity loss of up to 30% if fear was taken into account. Regarding habitat properties, I found that well-connected, large safe patches can reduce the negative consequences of habitat loss and fragmentation on prey communities. Including variation in risk perception between prey animals had consequences on prey space use. Animals with a high risk perception predominantly used safe areas of the landscape, while animals with a low risk perception preferred areas with a high food availability. On the community level, prey diversity was higher in heterogeneous landscapes of fear if individuals varied in their risk perception compared to scenarios in which all individuals had the same risk perception. Overall, my findings give a first, comprehensive assessment of the role of fear in shaping prey communities. The linkage between individual home range behavior and patterns at the community level allows for a mechanistic understanding of the underlying processes. My results underline the importance of the structure of the landscape of fear as a key driver of prey community responses, especially if the habitat is threatened by landscape changes. Furthermore, I show that individual landscapes of fear can improve our understanding of the consequences of trait variation on community structures. Regarding conservation and nature management, my results support calls for modern conservation approaches that go beyond single species and address the protection of biotic interactions. N2 - Raubtiere beeinflussen ihre Beute durch die Verringerung der Anzahl (numerische Effekte) und durch das Hervorrufen von Verhaltensänderungen (Verhaltenseffekte). Während die Auswirkungen von numerischen Effekten gut erforscht sind, sind die Auswirkungen von Verhaltenseffekten unklar. Außerdem werden bei Verhaltensänderungen selten die Auswirkungen auf die Beutetiergemeinschaft betrachtet, sondern nur die Effekte auf einzelne Individuen bzw. Arten oder auf andere Stufen der Nahrungskette. Eine Betrachtung auf der Stufe der Beutetiergemeinschaft ist jedoch sehr wichtig, da nur so ein umfassendes Verständnis von Räuber-Beute-Gemeinschaften möglich ist. In der vorliegenden Arbeit habe ich die Auswirkungen von Verhaltenseffekten auf die Raumnutzung und die Struktur von Beutetiergemeinschaften untersucht. Dazu habe ich ein räumliches Modell benutzt, welches die Bildung von Beutetiergemeinschaften über den individuellen Aufbau von Aktionsräumen der Beutetiere simuliert. Die Einrichtung von Aktionsräumen basiert dabei auf der Nahrungsverfügbarkeit in der Landschaft und auf dem vom Beutetier wahrgenommenen Risiko von einem Räuber gefressen zu werden. Die räumliche Verteilung des wahrgenommenen Risikos wird auch als Landschaft der Angst bezeichnet. Meine Ergebnisse zeigen, dass sich die Raumnutzung und die Struktur der Beutetiergemeinschaft durch Verhaltenseffekte verändern. Unter dem Einfluss von Angst haben die Beutetiere ihre Aktionsräume in sicherere Bereiche der Landschaft verlegt. Außerdem hat sich in risikoreichen Landschaften die Vielfalt der Beutetiere verringert und die Zusammensetzung zu Arten mit einem geringen Körpergewicht verschoben. Wenn die Beutetiergemeinschaft Landschaftsveränderungen wie z.B. dem Verlust oder der Zerschneidung von Lebensraum ausgesetzt war, haben sich die Auswirkungen von Verhaltenseffekten weiter verstärkt. Durch eine Erhöhung der Größe und Anzahl von Rückzugsräumen, die nicht von Räubern erreicht werden können, sowie deren Verbindung in der Landschaft, kann die Stärke dieser Effekte jedoch begrenzt werden. In einem weiteren Schritt habe ich die Auswirkungen von Unterschieden in der Risikowahrnehmung zwischen Individuen untersucht. Diese Unterschiede haben dazu geführt, dass Tiere mit einer hohen Risikowahrnehmung sich ihren Aktionsraum vornehmlich in sicheren Bereichen gesucht haben, während Tiere mit einer geringen Risikowahrnehmung Bereiche mit einer hohen Nahrungsverfügbarkeit genutzt haben. Dadurch konnten sich in Landschaften mit unterschiedlichen Risiken, vielfältigere Beutetiergemeinschaften etablieren, als in Landschaften mit gleichmäßigem Risiko. Insgesamt geben meine Ergebnisse einen guten Überblick über die Auswirkungen von Verhaltenseffekten auf Beutetiergemeinschaften. Die Verknüpfung von individuellem Verhalten mit Mustern auf der Gemeinschaftsebene erlaubt es die zugrundeliegenden Mechanismen zu identifizieren und zu verstehen. In Bezug auf den Naturschutz unterstützen meine Ergebnisse den Ruf nach modernen Schutzmaßnahmen, die über den Erhalt von einzelnen Arten hinausgehen und den Schutz von Beziehungen zwischen Arten einbeziehen. KW - ecology KW - landscape of fear KW - predator-prey KW - movement KW - biodiversity KW - Ökologie KW - Landschaft der Angst KW - Räuber-Beute KW - Bewegung KW - Biodiversität Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-431624 ER - TY - THES A1 - Ullmann, Wiebke T1 - Understanding animal movement behaviour in dynamic agricultural landscapes T1 - Tierbewegungen in dynamischen Agrarlandschaften N2 - The movement of organisms has formed our planet like few other processes. Movements shape populations, communities, entire ecosystems, and guarantee fundamental ecosystem functions and services, like seed dispersal and pollination. Global, regional and local anthropogenic impacts influence animal movements across ecosystems all around the world. In particular, land-use modification, like habitat loss and fragmentation disrupt movements between habitats with profound consequences, from increased disease transmissions to reduced species richness and abundance. However, neither the influence of anthropogenic change on animal movement processes nor the resulting effects on ecosystems are well understood. Therefore, we need a coherent understanding of organismal movement processes and their underlying mechanisms to predict and prevent altered animal movements and their consequences for ecosystem functions. In this thesis I aim at understanding the influence of anthropogenically caused land-use change on animal movement processes and their underlying mechanisms. In particular, I am interested in the synergistic influence of large-scale landscape structure and fine-scale habitat features on basic-level movement behaviours (e.g. the daily amount of time spend running, foraging, and resting) and their emerging higher-level movements (home range formation). Based on my findings, I identify the likely consequences of altered animal movements that lead to the loss of species richness and abundances. The study system of my thesis are hares in agricultural landscapes. European brown hares (Lepus europaeus) are perfectly suited to study animal movements in agricultural landscapes, as hares are hermerophiles and prefer open habitats. They have historically thrived in agricultural landscapes, but their numbers are in decline. Agricultural areas are undergoing strong land-use changes due to increasing food demand and fast developing agricultural technologies. They are already the largest land-use class, covering 38% of the world’s terrestrial surface. To consider the relevance of a given landscape structure for animal movement behaviour I selected two differently structured agricultural landscapes – a simple landscape in Northern Germany with large fields and few landscape elements (e.g. hedges and tree stands), and a complex landscape in Southern Germany with small fields and many landscape elements. I applied GPS devices (hourly fixes) with internal high-resolution accelerometers (4 min samples) to track hares, receiving an almost continuous observation of the animals’ behaviours via acceleration analyses. I used the spatial and behavioural information in combination with remote sensing data (normalized difference vegetation index, or NDVI, a proxy for resource availability), generating an almost complete idea of what the animal was doing when, why and where. Apart from landscape structure (represented by the two differently structured study areas), I specifically tested whether the following fine-scale habitat features influence animal movements: resource, agricultural management events, habitat diversity, and habitat structure. My results show that, irrespective of the movement process or mechanism and the type of fine-scale habitat features, landscape structure was the overarching variable influencing hare movement behaviour. High resource variability forces hares to enlarge their home ranges, but only in the simple and not in the complex landscape. Agricultural management events result in home range shifts in both landscapes, but force hares to increase their home ranges only in the simple landscape. Also the preference of habitat patches with low vegetation and the avoidance of high vegetation, was stronger in the simple landscape. High and dense crop fields restricted hare movements temporarily to very local and small habitat patch remnants. Such insuperable barriers can separate habitat patches that were previously connected by mobile links. Hence, the transport of nutrients and genetic material is temporarily disrupted. This mechanism is also working on a global scale, as human induced changes from habitat loss and fragmentation to expanding monocultures cause a reduction in animal movements worldwide. The mechanisms behind those findings show that higher-level movements, like increasing home ranges, emerge from underlying basic-level movements, like the behavioural modes. An increasing landscape simplicity first acts on the behavioural modes, i.e. hares run and forage more, but have less time to rest. Hence, the emergence of increased home range sizes in simple landscapes is based on an increased proportion of time running and foraging, largely due to longer travelling times between distant habitats and scarce resource items in the landscape. This relationship was especially strong during the reproductive phase, demonstrating the importance of high-quality habitat for reproduction and the need to keep up self-maintenance first, in low quality areas. These changes in movement behaviour may release a cascade of processes that start with more time being allocated to running and foraging, resulting into an increased energy expenditure and may lead to a decline in individual fitness. A decrease in individual fitness and reproductive output will ultimately affect population viability leading to local extinctions. In conclusion, I show that landscape structure has one of the most important effects on hare movement behaviour. Synergistic effects of landscape structure, and fine-scale habitat features, first affect and modify basic-level movement behaviours, that can scales up to altered higher-level movements and may even lead to the decline of species richness and abundances, and the disruption of ecosystem functions. Understanding the connection between movement mechanisms and processes can help to predict and prevent anthropogenically induced changes in movement behaviour. With regard to the paramount importance of landscape structure, I strongly recommend to decrease the size of agricultural fields and increase crop diversity. On the small-scale, conservation policies should assure the year round provision of areas with low vegetation height and high quality forage. This could be done by generating wildflower strips and additional (semi-) natural habitat patches. This will not only help to increase the populations of European brown hares and other farmland species, but also ensure and protects the continuity of mobile links and their intrinsic value for sustaining important ecosystem functions and services. N2 - Wenige biologische Prozesse haben unseren Planeten so stark geformt wie die Bewegungen von Organismen. Individuelle Tierbewegungen haben weitreichende Auswirkungen auf ganze Populationen, Artengemeinschaften und Ökosysteme. Tier-bewegungen sind außerdem verantwortlich für fundamentale Ökosystemfunktionen und –leistungen, wie z.B. die Verbreitung von Samen und die Bestäubung von Wild- und Nutzpflanzen. Globale, regionale und lokale Einflüsse durch den Menschen verändern die ursprünglichen Bewegungsmuster von Organismen und damit auch die Auswir-kungen dieser Bewegungen auf die Ökosysteme. Insbesondere Landnutzungs-änderungen, wie z.B. der Verlust und die Fragmentierung von Lebensräumen, stören die Tierbewegungen zwischen verschiedenen Habitaten und können schwerwiegende Folgen nach sich ziehen. Diese Folgen reichen von der Verminderung der biologischen Artenvielfalt bis hin zu einer erhöhten Wahrscheinlichkeit der Krankheitsübertragung. Dennoch sind weder die Auswirkungen von Landnutzungsveränderungen auf die Bewegungsabläufe von Tieren, noch deren Einfluss auf die Ökosysteme bis heute gut verstanden. Um die Veränderungen der Bewegungsprozesse und deren Folgen für die Funktionstüchtigkeit von Ökosystemen vorhersagen zu können oder gar zu verhindern, benötigen wir ein ganzheitliches Verständnis der organismischen Bewegungsprozesse. Das Ziel meiner Arbeit ist es, den Einfluss von anthropogenen Landnutzungs-änderungen auf tierische Bewegungsprozesse und die zugrundeliegende Mechanismen zu verstehen. Im Speziellen untersuche ich die synergetischen Effekte großflächiger Landschaftsstrukturen und kleinflächiger Habitatmerkmale auf das Bewegungsverhalten von Tieren. Dabei untersuche ich sowohl die Bewegungsprozesse, wie z.B. die Ent-stehung von Streifgebieten, als auch die zugrundeliegenden täglichen Verhaltensweisen wie das Laufen, die Nahrungssuche und das Schlafen. Die hierbei gewonnen Erkennt-nisse ermöglichen es mir, die voraussichtlichen Folgen von veränderten Tierbewe-gungen auf Ökosysteme abzuleiten. Das Modelsystem meiner Doktorarbeit ist der Feldhase (Lepus europaeus) in Agrarlandschaften. Feldhasen eignen sich hervorragend zur Untersuchung von Tier-bewegungen in landwirtschaftlich genutzten Gebieten, da sie Kulturfolger sind und offene Lebensräume, wie Agrarlandschaften und Steppen bevorzugen. Sie konnten sich in landwirtschaftlichen Regionen ausbreiten und entfalten. Jedoch sind die Bestände seit den 1960er Jahren stark zurückgegangen. Die Intensivierung der Landwirtschaft stellt einen Grund für diesen Rückgang dar. Aufgrund des steigenden Nahrungsmittelbedarfs und der sich schnell entwickelnden Agrartechnologien unterliegen Agrarlandschaften starken Landnutzungsänderungen. Agrarlandschaften stellen weltweit das flächenmäßig größte Landnutzungssystem dar und bedecken 38% der Erdoberfläche. Um die Auswirkungen großflächiger Landschaftsstrukturen auf das Bewegungsverhalten von Tieren zu untersuchen, habe ich zwei unterschiedlich strukturierte Agrarlandschaften ausgewählt: eine relativ einfach strukturierte Landschaft in Norddeutschland, die sich v.a. durch große Feldern und wenige Landschaftselementen (z.B. Hecken und kleinere Baumbestände) auszeichnet und eine komplexere Landschaft in Süddeutschland, die durch kleinere Felder und vielen dieser Landschaftselementen charakterisiert ist. Mit Hilfe von GPS-Halsbändern, die mit internen hochauflösenden Beschleu-nigungssensoren ausgestattet sind, wurden die Bewegungen der Feldhasen aufge-zeichnet. Die Beschleunigungssensoren liefern nahezu kontinuierliche Daten, die mit Hilfe von statistischen Klassifikationsverfahren das Verhalten der Tiere wiedergeben können. Die räumlichen Daten (GPS) und die Informationen über die Verhaltensweisen wurden anschließend mit Fernerkundungsdaten kombiniert, die wiederum Aufschluss über die Ressourcenverfügbarkeit geben. Hierdurch kann ein fast vollständiges Bild davon generiert werden, was das Tier wann, warum und wo getan hat. Neben der Landschaftsstruktur (dargestellt durch die beiden unterschiedlich strukturierten Unter-suchungsgebiete) habe ich getestet, ob die folgenden kleinflächigen Habitatmerkmale einen Einfluss auf die Tierbewegungen ausüben: raum-zeitliche Variabilität in der Ressourcenverfügbarkeit, landwirtschaftliche Managementmaßnahmen, Habitatdiversität und Habitatstruktur. Die Ergebnisse meiner Forschungsarbeit zeigen, dass unabhängig vom Bewegungsprozess oder -mechanismus und der Art der Habitatmerkmale, die Land-schaftsstruktur die Bewegungen der Feldhasen am stärksten beeinflusst. Eine hohe Ressourcenvariabilität zwingt die Feldhasen dazu, ihre Streifgebiete zu vergrößern, jedoch nur in der einfachen und nicht in der komplexen Landschaft. Landwirtschaftliche Managementmaßnahmen führen zu einer Verschiebung der Streifgebiete in beiden Landschaftstypen. In der einfachen Landschaft jedoch, vergrößern die Feldhasen zusätzlich ihre Streifgebiete. Feldhasen bevorzugen niedrige und vermeiden hohe Vegetation. Im Vergleich zur komplexen Landschaft ist diese Art der Habitatselektion stärker in der einfachen Landschaft ausgeprägt. Hohe und dichte Feldfrüchte, wie z.B. Raps oder Weizen, beschränken die Bewegungen der Feldhasen vorübergehend auf viel kleinere und lokale Gebiete. Derartige unüberwindbare Barrieren können Habitate voneinander trennen, die vorher durch sogenannte „mobile links“ miteinander verbunden waren. „Mobile links“ transportieren z.B. Nährstoffe oder genetisches Material zwischen entfernten Habitaten. Durch die Trennung wird dieser Transport vorübergehend unterbrochen und stört somit die Funktionstüchtigkeit des Ökosystems. Die Reduktion von „mobile links“ durch die vom Menschen verursachten Landnutzungsänderungen und damit einhergehenden Einschränkungen von Tierbewegungen ist weltweit vorzufinden. Die Resultate meiner Untersuchungen zeigen zudem, dass Bewegungsprozesse, wie z.B. die Vergrößerung der Streifgebiete, durch die zugrundeliegenden Verhaltens-weisen ausgelöst werden. Eine zunehmende Vereinfachung von Landschaftsstrukturen wirkt sich zunächst auf die Verhaltensweisen aus, d.h. Feldhasen laufen mehr und begeben sich häufiger auf die Suche nach Nahrung und anderen Ressourcen. Demnach verringern sich die Ruhezeiten der Feldhasen. Die Vergrößerung von Streifgebieten in der einfach strukturierten Landschaft beruht daher auf einem erhöhten Anteil an Lauf- und Nahrungssuchzeiten. Dies ist vor allem auf die längeren Wege zwischen den weiter entfernten Habitaten und eine geringere Ressourcenverfügbarkeit in einfach strukturierten Landschaften zurück zu führen. In meinen Untersuchungen zeige ich außerdem, dass die Beziehung zwischen der Landschaftsstruktur und den Verhaltens-weisen während der Fortpflanzungsphase besonders stark ausgeprägt ist. Dies zeigt zum einen die besondere Bedeutung eines qualitativ hochwertigen Lebensraums während der Fortpflanzungsphase und zum anderen, dass sich Tiere in Gebieten mit geringer Habitatqualität erst um das eigene tägliche Überleben kümmern müssen. Erst wenn ausreichend Zeit und Ressourcen verfügbar sind, können die Feldhasen sich erfolgreich fortpflanzen. Veränderungen im Bewegungsverhalten können also eine ganze Kaskade von Prozessen auslösen. Diese Kaskade beginnen mit der Veränderung der Verhaltensweisen durch z.B. weniger strukturierte Habitate und führt zu einem erhöhten Anteil an Laufen und Futtersuche, was wiederum einen erhöhten Energieaufwand bedeutet. Wenn Tiere zu viel Energie aufwenden müssen, um das eigene tägliche Überleben zu sichern, kann dies einen Rückgang ihrer individuellen Fitness bedeuten. Die Abnahme der Fitness und der Reproduktionsleistung wird sich letztendlich auf die Überlebensfähigkeit der Population auswirken und kann zum lokalen Aussterben führen. Die Struktur der Agrarlandschaft stellt eine der wichtigsten Einflussgrößen für das Bewegungsverhalten von Feldhasen dar. Die synergistischen Effekte der großflächigen Landschaftsstruktur und der kleinflächigen Habitatmerkmale beeinflussen und modifizieren zunächst die täglichen Verhaltensweisen, die dann wiederum zu veränderten Bewegungsprozessen führen und damit zu Störungen der Ökosystem-funktionen und zum Rückgang der biologischen Vielfalt beitragen. Im Hinblick auf die große Bedeutung der Landschaftsstruktur empfehle ich daher dringend die Größe der landwirtschaftlichen Felder zu verringern und die Vielfalt der Anbaukulturen zu erhöhen. Kleinräumige Naturerhaltungsmaßnahmen sollten die ganzjährige Bereitstellung von Habitaten mit geringer Vegetationshöhe und hochwertigem Futter sicherstellen. Dies kann durch den Anbau von Blühstreifen und der Schaffung bzw. dem Erhalt zusätzlicher (halb-)natürlicher Lebensräume erreicht werden. Diese Maßnahmen werden nicht nur dazu beitragen, die Populationen der Feldhasen und anderer Kulturfolgern zu vergrößern, sondern helfen auch dabei das Fortbestehen der „mobile links“ und der damit verbundenen Ökosystemfunktionen und –leistungen zu gewährleisten und zu schützen. KW - European hare KW - Feldhase KW - movemen ecology KW - Bewegungsökologie KW - agricultural landscapes KW - Agrarlandschaft KW - telemetry KW - Telemetrie KW - GPS KW - GPS Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-427153 ER - TY - THES A1 - Schäfer, Merlin T1 - Understanding and predicting global change impacts on migratory birds T1 - Verständnis und Vorhersage von Auswirkungen des globalen Wandels auf Zugvögel N2 - This is a publication-based dissertation comprising three original research stud-ies (one published, one submitted and one ready for submission; status March 2019). The dissertation introduces a generic computer model as a tool to investigate the behaviour and population dynamics of animals in cyclic environments. The model is further employed for analysing how migratory birds respond to various scenarios of altered food supply under global change. Here, ecological and evolutionary time-scales are considered, as well as the biological constraints and trade-offs the individual faces, which ultimately shape response dynamics at the population level. Further, the effect of fine-scale temporal patterns in re-source supply are studied, which is challenging to achieve experimentally. My findings predict population declines, altered behavioural timing and negative carry-over effects arising in migratory birds under global change. They thus stress the need for intensified research on how ecological mechanisms are affected by global change and for effective conservation measures for migratory birds. The open-source modelling software created for this dissertation can now be used for other taxa and related research questions. Overall, this thesis improves our mechanistic understanding of the impacts of global change on migratory birds as one prerequisite to comprehend ongoing global biodiversity loss. The research results are discussed in a broader ecological and scientific context in a concluding synthesis chapter. N2 - Dies ist eine publikationsbasierte Dissertation, welche aus drei wissenschaftlichen Originalstudien (eine publiziert, eine eingereicht und eine einreichbar; Stand März 2019) besteht. Die Dissertation stellt ein generisches Computermodell bereit, um das Verhalten und die Populationsdynamik von Tieren zu untersuchen, welche saisonale Umweltbedingungen erfahren. Mit diesem Computermodell untersuche ich in der vorliegenden Thesis, wie Zugvögel auf verschiedene Szenarien veränderter Nahrungsverfügbarkeit reagieren, welche im Rahmen des globalen Wandels wahrscheinlich sind. Dabei werden ökologische und evolutionäre Zeitskalen berücksichtigt. Außerdem werden biologisch bedingte Einschränkungen und Zielkonflikte einbezogen, welche das einzelne Individuum erfährt, die aber letztendlich auch das Geschehen auf Populationsebene bestimmen. Weiterhin studiere ich mit dem erstellten Computermodell am Beispiel des Weißstorchs, wie sich feinskalige Zeitmuster in der Nahrungsverfügbarkeit auf Zugvögel auswirken. Solche Studien würden eine enorme experimentelle Herausforderung darstellen. Die im Rahmen dieser Dissertation entstandene frei verfügbare Modellierungs-Software kann nun für andere Taxa und verwandte Forschungsfragen eingesetzt werden. Nach meinen Ergebnissen ist im Zuge des globalen Wandels mit verstärkten Populationsabnahmen bei Zugvögeln zu rechnen, sowie mit Änderungen im zeitlichen Verhaltensablauf und nichtlinearen negativen Carry-over-Effekten. Dies verdeutlicht, wie wichtig es ist, die vom globalen Wandel betroffenen ökologischen Mechanismen näher zu erforschen sowie effektive Schutzmaßnahmen für Zugvögel zu entwickeln. Allgemein erhöht die Dissertation unser mechanistisches Verständnis davon, wie sich der globale Wandel auf bedrohte Zugvogelarten auswirkt und damit die globale Biodiversität beeinflusst. Die Forschungsergebnisse werden in einem abschließenden Synthese-Kapitel zusammenführend diskutiert. KW - global change KW - migratory birds KW - life-history theory KW - movement ecology KW - bird migration KW - optimal annual routine model KW - stochastic dynamic programming KW - full annual cycle KW - population dynamics KW - carry-over effects KW - white stork KW - behavioural ecology KW - adaptation KW - mechanistic model KW - energetics KW - behavioural timing KW - reproduction KW - globaler Wandel KW - Zugvögel KW - Lebenszyklustheorie KW - Bewegungsökologie KW - Vogelzug KW - "Optimal annual routine"-Modell KW - stochastisch-dynamische Optimierung KW - vollständiger Jahreszyklus KW - Populationsdynamik KW - Carry-over-Effekte KW - Weißstorch KW - Verhaltensökologie KW - Anpassung KW - mechanistisches Modell KW - Energetik KW - Verhaltens-Timing KW - Reproduktion Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-439256 ER - TY - THES A1 - Duensing, Nina T1 - Transport processes in the arbuscular mycorrhizal symbiosis T1 - Transportprozesse in der arbuskulären Mykorrhizasymbiose N2 - The nutrient exchange between plant and fungus is the key element of the arbuscular mycorrhizal (AM) symbiosis. The fungus improves the plant’s uptake of mineral nutrients, mainly phosphate, and water, while the plant provides the fungus with photosynthetically assimilated carbohydrates. Still, the knowledge about the mechanisms of the nutrient exchange between the symbiotic partners is very limited. Therefore, transport processes of both, the plant and the fungal partner, are investigated in this study. In order to enhance the understanding of the molecular basis underlying this tight interaction between the roots of Medicago truncatula and the AM fungus Rhizophagus irregularis, genes involved in transport processes of both symbiotic partners are analysed here. The AM-specific regulation and cell-specific expression of potential transporter genes of M. truncatula that were found to be specifically regulated in arbuscule-containing cells and in non-arbusculated cells of mycorrhizal roots was confirmed. A model for the carbon allocation in mycorrhizal roots is suggested, in which carbohydrates are mobilized in non-arbusculated cells and symplastically provided to the arbuscule-containing cells. New insights into the mechanisms of the carbohydrate allocation were gained by the analysis of hexose/H+ symporter MtHxt1 which is regulated in distinct cells of mycorrhizal roots. Metabolite profiling of leaves and roots of a knock-out mutant, hxt1, showed that it indeed does have an impact on the carbohydrate balance in the course of the symbiosis throughout the whole plant, and on the interaction with the fungal partner. The primary metabolite profile of M. truncatula was shown to be altered significantly in response to mycorrhizal colonization. Additionally, molecular mechanisms determining the progress of the interaction in the fungal partner of the AM symbiosis were investigated. The R. irregularis transcriptome in planta and in extraradical tissues gave new insight into genes that are differentially expressed in these two fungal tissues. Over 3200 fungal transcripts with a significantly altered expression level in laser capture microdissection-collected arbuscules compared to extraradical tissues were identified. Among them, six previously unknown specifically regulated potential transporter genes were found. These are likely to play a role in the nutrient exchange between plant and fungus. While the substrates of three potential MFS transporters are as yet unknown, two potential sugar transporters are might play a role in the carbohydrate flow towards the fungal partner. In summary, this study provides new insights into transport processes between plant and fungus in the course of the AM symbiosis, analysing M. truncatula on the transcript and metabolite level, and provides a dataset of the R. irregularis transcriptome in planta, providing a high amount of new information for future works. N2 - In der arbuskulären Mykorrhiza (AM) Symbiose werden die Wurzeln fast aller Landpflanzen von Pilzen der Abteilung Glomeromycota besiedelt. Der Pilz erleichtert der Pflanze die Aufnahme von Mineralien, hauptsächlich Phosphat, und Wasser. Im Gegenzug versorgt die Pflanze ihn mit Photoassimilaten. Trotz der zentralen Bedeutung der Austauschmechanismen zwischen Pilz und Pflanze ist nur wenig darüber bekannt. Um die molekularen Grundlagen der Interaktion zwischen den Wurzeln der Leguminose Medicago truncatula und dem arbuskulären Mykorrhizapilz Rhizophagus irregularis besser zu verstehen, werden hier die Transportprozesse, die zwischen den Symbiosepartnern ablaufen, näher untersucht. Die zellspezifische Regulation der Transkription potentieller M. truncatula Transporter Gene in arbuskelhaltigen und nicht-arbuskelhaltigen Zellen mykorrhizierter Wurzeln wird bestätigt. Ein Modell zur möglichen Verteilung von Kohlenhydraten in mykorrhizierten Wurzeln, nach dem Zucker in nicht-arbuskelhaltigen Zellen mobilisiert und symplastisch an arbuskelhaltige Zellen abgegeben werden, wird vorgestellt. Die Analyse eines Mykorrhiza-induzierten Hexose/H+ Symporter Gens, MtHxt1, liefert neue Einsichten in die Mechanismen der Kohlenhydratverteilung in mykorrhizierten Pflanzen. Metabolitanalysen von Wurzeln und Blättern einer knock-out Mutante dieses Gens zeigen dessen Einfluss auf den Kohlenhydrathaushalt der ganzen Pflanze und auf die Interaktion mit dem Pilz. Die Metabolitzusammensetzung von M. truncatula wird durch die Mykorrhiza Symbiose signifikant beeinflusst. Darüber hinaus werden durch Transkriptomanalysen die molekularen Grundlagen der AM Symbiose auf der Seite des Pilzes analysiert. Arbuskeln wurden mittels Laser Capture Mikrodissektion direkt aus mykorrhizierten Wurzeln isoliert. Über 3200 pilzliche Transkripte weisen in diesen Arbuskeln im Vergleich zu extraradikalen Geweben ein deutlich verändertes Expressionslevel auf. Unter diesen Transkripten sind auch sechs zuvor unbekannte Gene, die für potentielle Transporter codieren und mit großer Wahrscheinlichkeit eine Rolle im Nährstoffaustausch zwischen Pilz und Pflanze spielen. Während die Substrate von drei potentiellen MFS Transportern noch unbekannt sind, spielen zwei potentiellen Zuckertransporter möglicherweise eine Rolle im Transport von Kohlenhydraten in Richtung des Pilzes. Zusammengefasst bietet diese Arbeit neue Einsichten in Transportprozesse zwischen Pilz und Pflanze im Laufe der AM Symbiose. M. truncatula Transkript- und Metabolitlevel werden analysiert und die Transkriptomanalyse von R. irregularis liefert einen umfassenden Datensatz mit einer großen Menge an Informationen zu der noch unzureichend erforschten pilzlichen Seite der Symbiose für folgende Arbeiten. KW - arbuskuläre Mykorrhizasymbiose KW - Zuckertransporter KW - Medicago truncatula KW - Rhizophagus irregularis KW - Transkriptom Sequenzierung KW - arbuscular mycorrhizal symbiosis KW - sugar transporter KW - Medicago truncatula KW - Rhizophagus irregularis KW - transcriptome sequencing Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-68210 ER - TY - THES A1 - Hammer, Paul T1 - Transkriptomweite Untersuchungen von Prostata-Krebszelllinien im Kontext medizinischer Strahlentherapie T1 - Transcriptome-wide studies of prostate cancer cell lines in the context of medical radiation N2 - Die Strahlentherapie ist neben der Chemotherapie und einer operativen Entfernung die stärkste Waffe für die Bekämpfung bösartiger Tumore in der Krebsmedizin. Nach Herz-Kreislauf-Erkrankungen ist Krebs die zweithäufigste Todesursache in der westlichen Welt, wobei Prostatakrebs heutzutage die häufigste, männliche Krebserkrankung darstellt. Trotz technologischer Fortschritte der radiologischen Verfahren kann es noch viele Jahre nach einer Radiotherapie zu einem Rezidiv kommen, was zum Teil auf die hohe Resistenzfähigkeit einzelner, entarteter Zellen des lokal vorkommenden Tumors zurückgeführt werden kann. Obwohl die moderne Strahlenbiologie viele Aspekte der Resistenzmechanismen näher beleuchtet hat, bleiben Fragestellungen, speziell über das zeitliche Ansprechen eines Tumors auf ionisierende Strahlung, größtenteils unbeantwortet, da systemweite Untersuchungen nur begrenzt vorliegen. Als Zellmodelle wurden vier Prostata-Krebszelllinien (PC3, DuCaP, DU-145, RWPE-1) mit unterschiedlichen Strahlungsempfindlichkeiten kultiviert und auf ihre Überlebensfähigkeit nach ionisierender Bestrahlung durch einen Trypanblau- und MTT-Vitalitätstest geprüft. Die proliferative Kapazität wurde mit einem Koloniebildungstest bestimmt. Die PC3 Zelllinie, als Strahlungsresistente, und die DuCaP Zelllinie, als Strahlungssensitive, zeigten dabei die größten Differenzen bezüglich der Strahlungsempfindlichkeit. Auf Grundlage dieser Ergebnisse wurden die beiden Zelllinien ausgewählt, um anhand ihrer transkriptomweiten Genexpressionen, eine Identifizierung potentieller Marker für die Prognose der Effizienz einer Strahlentherapie zu ermöglichen. Weiterhin wurde mit der PC3 Zelllinie ein Zeitreihenexperiment durchgeführt, wobei zu 8 verschiedenen Zeitpunkten nach Bestrahlung mit 1 Gy die mRNA mittels einer Hochdurchsatz-Sequenzierung quantifiziert wurde, um das dynamisch zeitversetzte Genexpressionsverhalten auf Resistenzmechanismen untersuchen zu können. Durch das Setzen eines Fold Change Grenzwertes in Verbindung mit einem P-Wert < 0,01 konnten aus 10.966 aktiven Genen 730 signifikant differentiell exprimierte Gene bestimmt werden, von denen 305 stärker in der PC3 und 425 stärker in der DuCaP Zelllinie exprimiert werden. Innerhalb dieser 730 Gene sind viele stressassoziierte Gene wiederzufinden, wie bspw. die beiden Transmembranproteingene CA9 und CA12. Durch Berechnung eines Netzwerk-Scores konnten aus den GO- und KEGG-Datenbanken interessante Kategorien und Netzwerke abgeleitet werden, wobei insbesondere die GO-Kategorien Aldehyd-Dehydrogenase [NAD(P)+] Aktivität (GO:0004030) und der KEGG-Stoffwechselweg der O-Glykan Biosynthese (hsa00512) als relevante Netzwerke auffällig wurden. Durch eine weitere Interaktionsanalyse konnten zwei vielversprechende Netzwerke mit den Transkriptionsfaktoren JUN und FOS als zentrale Elemente identifiziert werden. Zum besseren Verständnis des dynamisch zeitversetzten Ansprechens der strahlungsresistenten PC3 Zelllinie auf ionisierende Strahlung, konnten anhand der 10.840 exprimierten Gene und ihrer Expressionsprofile über 8 Zeitpunkte interessante Einblicke erzielt werden. Während es innerhalb von 30 min (00:00 - 00:30) nach Bestrahlung zu einer schnellen Runterregulierung der globalen Genexpression kommt, folgen in den drei darauffolgenden Zeitabschnitten (00:30 - 01:03; 01:03 - 02:12; 02:12 - 04:38) spezifische Expressionserhöhungen, die eine Aktivierung schützender Netzwerke, wie die Hochregulierung der DNA-Reparatursysteme oder die Arretierung des Zellzyklus, auslösen. In den abschließenden drei Zeitbereichen (04:38 - 09:43; 09:43 - 20:25; 20:25 - 42:35) liegt wiederum eine Ausgewogenheit zwischen Induzierung und Supprimierung vor, wobei die absoluten Genexpressionsveränderungen ansteigen. Beim Vergleich der Genexpressionen kurz vor der Bestrahlung mit dem letzten Zeitpunkt (00:00 - 42:53) liegen mit 2.670 die meisten verändert exprimierten Gene vor, was einer massiven, systemweiten Genexpressionsänderung entspricht. Signalwege wie die ATM-Regulierung des Zellzyklus und der Apoptose, des NRF2-Signalwegs nach oxidativer Stresseinwirkung und die DNA-Reparaturmechanismen der homologen Rekombination, des nicht-homologen End Joinings, der MisMatch-, der Basen-Exzision- und der Strang-Exzision-Reparatur spielen bei der zellulären Antwort eine tragende Rolle. Äußerst interessant sind weiterhin die hohen Aktivitäten RNA-gesteuerter Ereignisse, insbesondere von small nucleolar RNAs und Pseudouridin-Prozessen. Demnach scheinen diese RNA-modifizierenden Netzwerke einen bisher unbekannten funktionalen und schützenden Einfluss auf das Zellüberleben nach ionisierender Bestrahlung zu haben. All diese schützenden Netzwerke mit ihren zeitspezifischen Interaktionen sind essentiell für das Zellüberleben nach Einwirkung von oxidativem Stress und zeigen ein komplexes aber im Einklang befindliches Zusammenspiel vieler Einzelkomponenten zu einem systemweit ablaufenden Programm. N2 - The use of radiotherapy in addition to chemotherapy and surgical removal is the most powerful instrument in the fight against malignant tumors in cancer medicine. After cardiovascular diseases, cancer is the second leading cause of death in the western world, in which prostate cancer is the most frequent male cancer. Despite continuous technological improvements in radiological instruments and prognosis, it may occur a recurrence up to many years after radiotherapy due to a high resistance capability of individual malignant cells of the locally occurring tumor. Although modern radiation biology has studied many aspects of the resistance mechanisms, questions are largely unanswered especially in regards to prognostic terms and time response of tumor cells to ionizing radiation. As cellular models four prostate cancer cell lines with different radiation sensitivities (PC3, DuCaP, DU-145, RWPE-1) were cultured and tested for their ability to survive after exposure to ionizing radiation by a trypane blue and MTT viability assay. The proliferative capacity of the four cell lines was determined using a colony formation assay. The PC3 cell line (radiation-resistant) and the DuCaP cell line (radiation-sensitive) showed the maximal differences in terms of radiation sensitivity. Based on these results the two cell lines were selected to allow identification of potential prognostic marker for predicting the effectiveness of radiation therapy via their transcriptome-wide gene expression. Furthermore, a time series experiment with the radiation-resistant PC3 cell line was performed. At 8 different time points, during the period from 00:00 - 42:53 (hh:mm) after exposure with 1 Gy, the mRNA was quantified by next generation sequencing to investigate the dynamic behavior of time-delayed gene expression and to discover resistance mechanisms. Of 10,966 expressed genes 730 were significant differentially expressed, determined by setting a fold change threshold in conjunction with a P-value < 0.01. Of those 305 were more strongly expressed in PC3 cell line and 425 were more strongly expressed in the DuCaP cell line. Within these 730 genes many known stress-associated genes could be found, such as the two trans-membrane protein genes CA9 and CA12, which are associated with increased radiation resistance. By calculating a network score interesting networks were derived by the GO and KEGG databases. In particular the GO categories aldehyde dehydrogenase [NAD(P)+] activity (GO:0004030) as well as the KEGG pathway of O-glycan biosynthesis (hsa00512) seems to be remarkably relevant. An interaction analysis revealed two promising networks with the transcription factors JUN and FOS as central elements. High expression of the JUN network would be stand as indicator for radiation resistance whereas a high expression of the FOS network is equated with radiation sensitivity. Interesting insights could be achieved by analyzing the 10,840 expressed genes of the PC3 cell line and its expression profile over the 8 time points. Shortly after irradiation (00:00 - 00:30) a transcriptome-wide down-regulation occurred, within the next three, short time periods (00:30 - 01:03; 01:03 - 02:12; 02:12 - 04:38) a predominant increase of gene expression and the activation of protective networks followed, such as the up-regulation of DNA repair systems or the arresting of cell cycle. In the ensuing three time periods (4:38 - 09:43; 09:43 - 20:25; 20:25 - 42:35) a balance between gene induction and suppression was present and the absolute gene expression change was increased. When comparing the gene expression prior to irradiation with the last time point (00:00 - 42:53) 2,670 genes were differentially expressed, suggesting a massive and system-wide change of gene expression. Signaling pathways such as the ATM-regulated cell cycle and apoptosis, the Nrf2 pathway after oxidative stress exposure, the DNA repair mechanisms of homologous recombination, the non-homologous end joining, the mismatch repair, base-excision repair and strand-excision repair play a major role. Very interesting are the high activity of RNA-driven events, especially activities of small nucleolar RNAs and pseudouridine processes. This suggests that these RNA-modifying networks could have a hitherto unknown functional and protective effect on cell survival after exposure to ionizing radiation. All these protective networks and their time-specific interactions are essential for the survival of cells after exposure to oxidative stress and show a complex but consistent interaction of many individual components to a system-wide running program. KW - Strahlenbiologie KW - Sequenzierung KW - Resistenzmechanismen KW - Genexpression KW - Prostatakrebs KW - radiation biology KW - next generation sequencing KW - prostate cancer KW - resistance mechanisms KW - gene expression Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-63190 ER - TY - THES A1 - Steffen, Jenny T1 - Transkription von Markergenen an immbolisierten Nukleinsäuren T1 - Transcription of reportegenes with immobilized nucleic acids N2 - Die Etablierung der Transkription von kompletten Genen auf planaren Oberflächen soll eine Verbindung zwischen der Mikroarraytechnologie und der Transkriptomforschung herstellen. Darüber hinaus kann mit diesem Verfahren ein Brückenschlag zwischen der Synthese der Gene und ihrer kodierenden Proteine auf einer Oberfläche erfolgen. Alle transkribierten RNAs wurden mittels RT-PCR in cDNA umgeschrieben und in einer genspezifischen PCR amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden hierfür entweder per Hand oder maschinell auf die Oberfläche transferiert. Über eine Oberflächen-PCR war es möglich, die Gensequenz des Reportergens EGFP direkt auf der Oberfläche zu synthetisieren und anschließend zu transkribieren. Somit war eine Transkription mit weniger als 1 ng an Matrize möglich. Der Vorteil einer Oberflächen-Transkription gegenüber der in Lösung liegt in der mehrfachen Verwendung der immobilisierten Matrize, wie sie in dieser Arbeit dreimal erfolgreich absolviert wurde. Die Oberflächen-Translation des EGFP-Gens konnte ebenfalls zweimal an einer immobilisierten Matrize gezeigt werden, wobei Zweifel über eine echte Festphasen-Translation nicht ausgeräumt werden konnten. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass die Transkription und Translation von immobilisierten Gensequenzen auf planaren Oberflächen möglich ist, wofür die linearen Matrizen direkt auf der Oberfläche synthetisiert werden können. N2 - In vitro mRNA synthesis and in vitro translation are of great interest for biochemical and molecular biological basic research, and also for biotechnology and other applications. Solid phase coupled synthesis is very useful for the development of high throughput procedures to elucidate and manipulate gene products. An artificial gene was constructed combining the T7 promoter and terminator with the EGFP-gene from the plasmid pEGFP. The functionality of the construct was shown by in vitro translation. The gene-construct was immobilised on a planar glass surface. The transcription was performed on the immobilised gene and mRNA was determined by RT-PCR. These results demonstrate that the complete gene is transcribed from the covalently coupled PCR product. Thus, it is possible to transfer a standard transcription technique onto an On-chip reaction. The direct PCR amplification of transcriptionable sequences of EGFP bound on surfaces was successfully used for solid phase transcription. Successful transcriptions were also performed at least to 1 ng of used template. The RNA synthesis was also successful in the second and third reaction on the same slide as observed by signals after RT-PCR. It seems to be possible to transfer the translation of reportergenes in a solid phase coupled synthesis, too. For further integration of cellular procedures on a chip, the cell-free RNA synthesis on immobilised templates is an crucial technical hurdle to conquer. Major advantages of using immobilised templates for transcription are, low risk of contamination occuring in solution, and no necessity of further purification steps for downstream applications of the RNA product. KW - Immobilisierung KW - Transkription KW - Translation KW - Bakteriophage T7 KW - Lab on chip KW - EGFP KW - Stammschleife KW - Lab on chip KW - transcription KW - translation KW - EGFP KW - stem loop KW - immobilization KW - T7 Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-10282 ER - TY - THES A1 - Bergholz, Kolja T1 - Trait-based understanding of plant species distributions along environmental gradients T1 - Zum Verständnis der Verbreitung von Pflanzen entlang von umweltgradienten auf der Basis von funktionellen Eigenschaften N2 - For more than two centuries, plant ecologists have aimed to understand how environmental gradients and biotic interactions shape the distribution and co-occurrence of plant species. In recent years, functional trait–based approaches have been increasingly used to predict patterns of species co-occurrence and species distributions along environmental gradients (trait–environment relationships). Functional traits are measurable properties at the individual level that correlate well with important processes. Thus, they allow us to identify general patterns by synthesizing studies across specific taxonomic compositions, thereby fostering our understanding of the underlying processes of species assembly. However, the importance of specific processes have been shown to be highly dependent on the spatial scale under consideration. In particular, it remains uncertain which mechanisms drive species assembly and allow for plant species coexistence at smaller, more local spatial scales. Furthermore, there is still no consensus on how particular environmental gradients affect the trait composition of plant communities. For example, increasing drought because of climate change is predicted to be a main threat to plant diversity, although it remains unclear which traits of species respond to increasing aridity. Similarly, there is conflicting evidence of how soil fertilization affects the traits related to establishment ability (e.g., seed mass). In this cumulative dissertation, I present three empirical trait-based studies that investigate specific research questions in order to improve our understanding of species distributions along environmental gradients. In the first case study, I analyze how annual species assemble at the local scale and how environmental heterogeneity affects different facets of biodiversity—i.e. taxonomic, functional, and phylogenetic diversity—at different spatial scales. The study was conducted in a semi-arid environment at the transition zone between desert and Mediterranean ecosystems that features a sharp precipitation gradient (Israel). Different null model analyses revealed strong support for environmentally driven species assembly at the local scale, since species with similar traits tended to co-occur and shared high abundances within microsites (trait convergence). A phylogenetic approach, which assumes that closely related species are functionally more similar to each other than distantly related ones, partly supported these results. However, I observed that species abundances within microsites were, surprisingly, more evenly distributed across the phylogenetic tree than expected (phylogenetic overdispersion). Furthermore, I showed that environmental heterogeneity has a positive effect on diversity, which was higher on functional than on taxonomic diversity and increased with spatial scale. The results of this case study indicate that environmental heterogeneity may act as a stabilizing factor to maintain species diversity at local scales, since it influenced species distribution according to their traits and positively influenced diversity. All results were constant along the precipitation gradient. In the second case study (same study system as case study one), I explore the trait responses of two Mediterranean annuals (Geropogon hybridus and Crupina crupinastrum) along a precipitation gradient that is comparable to the maximum changes in precipitation predicted to occur by the end of this century (i.e., −30%). The heterocarpic G. hybridus showed strong trends in seed traits, suggesting that dispersal ability increased with aridity. By contrast, the homocarpic C. crupinastrum showed only a decrease in plant height as aridity increased, while leaf traits of both species showed no consistent pattern along the precipitation gradient. Furthermore, variance decomposition of traits revealed that most of the trait variation observed in the study system was actually found within populations. I conclude that trait responses towards aridity are highly species-specific and that the amount of precipitation is not the most striking environmental factor at this particular scale. In the third case study, I assess how soil fertilization mediates—directly by increased nutrient addition and indirectly by increased competition—the effect of seed mass on establishment ability. For this experiment, I used 22 species differing in seed mass from dry grasslands in northeastern Germany and analyzed the interacting effects of seed mass with nutrient availability and competition on four key components of seedling establishment: seedling emergence, time of seedling emergence, seedling survival, and seedling growth. (Time of) seedling emergence was not affected by seed mass. However, I observed that the positive effect of seed mass on seedling survival is lowered under conditions of high nutrient availability, whereas the positive effect of seed mass on seedling growth was only reduced by competition. Based on these findings, I developed a conceptual model of how seed mass should change along a soil fertility gradient in order to reconcile conflicting findings from the literature. In this model, seed mass shows a U-shaped pattern along the soil fertility gradient as a result of changing nutrient availability and competition. Overall, the three case studies highlight the role of environmental factors on species distribution and co-occurrence. Moreover, the findings of this thesis indicate that spatial heterogeneity at local scales may act as a stabilizing factor that allows species with different traits to coexist. In the concluding discussion, I critically debate intraspecific trait variability in plant community ecology, the use of phylogenetic relationships and easily measured key functional traits as a proxy for species’ niches. Finally, I offer my outlook for the future of functional plant community research. N2 - Seit über 200 Jahre erforschen Ökologen den Einfluss von Umweltgradienten, biotischen Interaktionen und neutralen Prozessen auf die Artenzusammensetzung von Pflanzengemeinschaften. Um generelle Muster und die zugrundeliegenden Mechanismen unabhängig von der gegeben Artenzusammensetzung besser zu verstehen, wurden in den letzten Jahren vermehrt funktionellen Eigenschaften (‚functional traits‘) als methodischen Ansatz genutzt. Es wurde deutlich, dass die bestimmenden Prozesse abhängig von der betrachteten räumlichen Skala sind. Vor allem ist unklar, in wieweit Umweltheterogenität auf kleiner, lokaler Skala die Artenzusammensetzung beeinflusst. Des Weiteren ist Skalenabhängigkeit wichtig um den Einfluss von spezifischen Umweltgradienten, wie Trockenheit oder Bodenfertilität, auf die funktionelle Eigenschaften von Pflanzengemeinschaften zu ermitteln. In der vorliegenden Dissertation untersuche ich in drei unabhängigen, empirischen Studien den Einfluss von Umweltgradienten bzw. Umweltheterogenität auf die funktionellen Eigenschaften von Pflanzengemeinschaften unter besonderer Berücksichtigung der Skalenabhängigkeit. In der ersten Fallstudie prüfe ich welche Faktoren die Artenzusammensetzung in einem semi-ariden Ökosystem (Israel), das von einjährigen Pflanzen dominiert wird, auf lokaler Skala bestimmen. Ich kann zeigen, dass vor allem Arten mit ähnlichen funktionellen Eigenschaften in Mikrohabitaten auftreten, das auf eine Selektion durch Umweltfaktoren hindeutet. Des Weiteren kann ich zeigen, dass mit Zunahme der Umweltheterogenität des Habitats die Diversität der funktionellen Eigenschaften sowie die Artendiversität in den Pflanzengemeinschaften zunehmen. Aus diesen Ergebnissen folgere ich, dass lokale Umweltheterogenität ein wichtiger Faktor für die Koexistenz der Pflanzenarten ist. Im selben Untersuchungsgebiet, untersuche ich in der zweiten Studie die Anpassung von mediterranen Pflanzen entlang eines Niederschlagsgradienten, der den vorausgesagten Niederschlagsveränderungen bis zum Ende dieses Jahrhunderts entspricht. Dafür wurden die funktionellen Eigenschaften von zwei typischen mediterranen Arten in 16 Populationen gemessen. Überraschenderweise zeigten die Arten unterschiedliche Anpassungen entlang des Gradienten, dass auf eine artspezifische Anpassung an Trockenheit hinweist. Des Weiteren wird in der Studie deutlich, dass der Regengradient zwar ein wichtiger, aber kein bestimmender Faktor auf der entsprechenden Skala ist, da ein großer Anteil der intraspezifischen Merkmalsvariation innerhalb der Populationen gefunden wird. In der dritten Studie untersuche ich inwieweit Bodenfertilität die Etablierungswahrscheinlichkeit von Pflanzen mit unterschiedlichen Samenmassen direkt (durch erhöhte Nährstoffverfügbarkeit) und indirekt (durch erhöhte Konkurrenz) beeinflusst. Das Experiment wurde mit 22 Trockenrasenarten aus Nordost Brandenburg durchgeführt. Es zeigte sich, dass der positive Effekt von Samenmasse auf die Etablierungsfähigkeit abhängig von den jeweiligen Bedingungen ist und verschiedene Prozesse während der Etablierungsphase beeinflusst werden. Auf der Basis dieser Ergebnisse und Literatur, stelle ich ein konzeptionelles Model vor, dass widersprüchliche Ergebnisse aus der Literatur synthetisiert. Zusammengenommen zeigen die Ergebnisse meiner Dissertation, dass funktionelle Eigenschaften wichtige Erkenntnisse über die Prozesse liefern, die das Auftreten von Pflanzen und deren Anpassung entlang von Umweltgradienten bestimmen. In der abschließenden Diskussion hinterfrage ich kritisch die Verwendung von intraspezifischer Variabilität funktioneller Eigenschaften in der Gemeinschaftsökologie, Phylogenie als Surrogat für die Nische einer Art und die Standardisierung funktioneller Eigenschaften als methodische Aspekte. Abschließend gebe ich einen Ausblick über zukünftige Pflanzenökologie-Forschung mit funktionellen Eigenschaften. KW - functional ecology KW - plant community KW - species coexistence KW - biodiversity KW - funktionelle Ökologie KW - Pflanzengemeinschaften KW - Koexistenz von Arten KW - Biodiversität Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-426341 ER - TY - THES A1 - Eckert, Silvia T1 - Trait variation in changing environments: Assessing the role of DNA methylation in non-native plant species T1 - Merkmalsvariation in sich verändernden Umgebungen: Bewertung der Rolle der DNA-Methylierung bei nicht einheimischen Pflanzenarten N2 - The increasing introduction of non-native plant species may pose a threat to local biodiversity. However, the basis of successful plant invasion is not conclusively understood, especially since these plant species can adapt to the new range within a short period of time despite impoverished genetic diversity of the starting populations. In this context, DNA methylation is considered promising to explain successful adaptation mechanisms in the new habitat. DNA methylation is a heritable variation in gene expression without changing the underlying genetic information. Thus, DNA methylation is considered a so-called epigenetic mechanism, but has been studied in mainly clonally reproducing plant species or genetic model plants. An understanding of this epigenetic mechanism in the context of non-native, predominantly sexually reproducing plant species might help to expand knowledge in biodiversity research on the interaction between plants and their habitats and, based on this, may enable more precise measures in conservation biology. For my studies, I combined chemical DNA demethylation of field-collected seed material from predominantly sexually reproducing species and rearing offsping under common climatic conditions to examine DNA methylation in an ecological-evolutionary context. The contrast of chemically treated (demethylated) plants, whose variation in DNA methylation was artificially reduced, and untreated control plants of the same species allowed me to study the impact of this mechanism on adaptive trait differentiation and local adaptation. With this experimental background, I conducted three studies examining the effect of DNA methylation in non-native species along a climatic gradient and also between climatically divergent regions. The first study focused on adaptive trait differentiation in two invasive perennial goldenrod species, Solidago canadensis sensu latu and S. gigantea AITON, along a climate gradient of more than 1000 km in length in Central Europe. I found population differences in flowering timing, plant height, and biomass in the temporally longer-established S. canadensis, but only in the number of regrowing shoots for S. gigantea. While S. canadensis did not show any population structure, I was able to identify three genetic groups along this climatic gradient in S. gigantea. Surprisingly, demethylated plants of both species showed no change in the majority of traits studied. In the subsequent second study, I focused on the longer-established goldenrod species S. canadensis and used molecular analyses to infer spatial epigenetic and genetic population differences in the same specimens from the previous study. I found weak genetic but no epigenetic spatial variation between populations. Additionally, I was able to identify one genetic marker and one epigenetic marker putatively susceptible to selection. However, the results of this study reconfirmed that the epigenetic mechanism of DNA methylation appears to be hardly involved in adaptive processes within the new range in S. canadensis. Finally, I conducted a third study in which I reciprocally transplanted short-lived plant species between two climatically divergent regions in Germany to investigate local adaptation at the plant family level. For this purpose, I used four plant families (Amaranthaceae, Asteraceae, Plantaginaceae, Solanaceae) and here I additionally compared between non-native and native plant species. Seeds were transplanted to regions with a distance of more than 600 kilometers and had either a temperate-oceanic or a temperate-continental climate. In this study, some species were found to be maladapted to their own local conditions, both in non-native and native plant species alike. In demethylated individuals of the plant species studied, DNA methylation had inconsistent but species-specific effects on survival and biomass production. The results of this study highlight that DNA methylation did not make a substantial contribution to local adaptation in the non-native as well as native species studied. In summary, my work showed that DNA methylation plays a negligible role in both adaptive trait variation along climatic gradients and local adaptation in non-native plant species that either exhibit a high degree of genetic variation or rely mainly on sexual reproduction with low clonal propagation. I was able to show that the adaptive success of these non-native plant species can hardly be explained by DNA methylation, but could be a possible consequence of multiple introductions, dispersal corridors and meta-population dynamics. Similarly, my results illustrate that the use of plant species that do not predominantly reproduce clonally and are not model plants is essential to characterize the effect size of epigenetic mechanisms in an ecological-evolutionary context. N2 - Die zunehmende Eintragung nicht-heimischer Pflanzenarten kann eine Gefahr für die lokale Artenvielfalt darstellen. Die Grundlagen einer erfolgreichen pflanzlichen Ausbreitung sind jedoch nicht abschließend geklärt, zumal sich diese Arten innerhalb kurzer Zeit an das neue Verbreitungsgebiet anpassen können trotz anfänglich reduzierter genetischer Vielfalt der Startpopulationen. In diesem Kontext gilt DNA-Methylierung als vielversprechend, um erfolgreiche Anpassungsmechanismen im neuen Lebensraum zu erklären. Bei der DNA-Methylierung handelt es sich um eine vererbbare Variation der Genaktivität, ohne dass die zugrundeliegende genetische Erbinformation verändert wird. Damit gehört DNA-Methylierung zu den sogenannten epigenetischen Mechanismen, wurde jedoch vorwiegend bei sich klonal vermehrenden Pflanzenarten oder genetischen Modellpflanzen untersucht. Ein Verständnis dieses epigenetischen Mechanismus im Zusammenhang mit nicht-einheimischen, sich vorwiegend sexuell reproduzierenden Pflanzenarten erweitert das Wissen in der Biodiversitätsforschung zur Interaktion zwischen Pflanzen und ihrem Lebensraum und kann, darauf aufbauend, präzisere Maßnahmen in der Naturschutzbiologie ermöglichen. Für meine Studien kombinierte ich die chemische DNA-Demethylierung von im Freiland gesammeltem Samenmaterial sich vorwiegend sexuell fortpflanzender Arten und die Aufzucht unter gemeinsamen klimatischen Bedingungen, um DNA-Methylierung im ökologisch-evolutionären Kontext zu untersuchen. Der Kontrast von chemisch behandelten (demethylierten) Pflanzen, deren Methylierungsvariation nun künstlich verringert war, und unbehandelten Kontrollpflanzen derselben Art ermöglichte mir die Auswirkung dieses Mechanismus auf adaptive Merkmalsvariationen und lokale Anpassung zu studieren. Vor diesem experimentellen Hintergrund führte ich drei Studien durch, um die Auswirkung von DNA-Methylierung bei nicht-einheimischen Pflanzenarten entlang eines klimatischen Gradienten und zwischen zwei klimatisch unterschiedlichen Regionen zu untersuchen. Die erste Studie konzentrierte sich auf adaptive Merkmalsveränderungen bei Nachkommen von zwei invasiven, mehrjährigen Goldrutenarten, Solidago canadensis sensu latu und S. gigantea AITON, entlang eines Klimagradienten von mehr als 1000 km Länge in Zentraleuropa. Ich fand graduelle Unterschiede im Blühzeitpunkt, in der Pflanzenhöhe und der Biomasse bei der zeitlich länger etablierten S. canadensis, bei S. gigantea jedoch nur in der Anzahl der nachwachsenden Triebe. Während S. canadensis keinerlei Populationsstruktur aufwies, konnte ich bei S. gigantea drei genetische Gruppen entlang dieses Klimagradienten identifizieren. Überraschenderweise zeigten demethylierte Pflanzen beider Arten keine Veränderung in der überwiegenden Anzahl der untersuchten Merkmale. In der darauffolgenden zweiten Studie konzentrierte ich mich auf die länger etablierte Goldrutenart S. canadensis und verwendete molekulare Analysen, um räumliche epigenetische und genetische Populationunterschiede aus den Exemplaren der vorhergehenden Studie abzuleiten. Ich fand schwache genetische aber keine epigenetische räumliche Variation zwischen den Populationen. Zusätzlich konnte ich einen genetischen und einen epigenetischen Marker identifizieren, welcher potentiell unter Selektion stehen könnte. Allerdings bestätigten die Ergebnisse dieser Studie erneut, dass DNA-Methylierung bei S. canadensis kaum in die Anpassung an das neue Verbreitungsgebiet involviert zu sein scheint. Schließlich führte ich eine dritte Studie durch, in welcher ich Samen kurzlebiger Pflanzenarten reziprok zwischen zwei klimatisch unterschiedlichen Regionen in Deutschland transplantierte, um lokale Anpassung auf Ebene der Pflanzenfamilien zu untersuchen. Zu diesem Zweck nutze ich vier Pflanzenfamilien (Amaranthaceae, Asteraceae, Plantaginaceae, Solanaceae), wobei ich hier auch zwischen nicht-heimischen und heimischen Pflanzenarten verglich. Beide Regionen lagen mehr als 600 Kilometer voneinander entfernt und wiesen entweder ein gemäßigt-ozeanisches oder gemäßigt-kontinentales Klima auf. In dieser Studie zeigte sich für einige—sowohl nicht-einheimische als auch einhimische—Arten eine Fehlanpassung an die eigenen lokalen Bedingungen. In demethylierten Individuen der untersuchten Pflanzenarten wirkte sich die DNA-Methylierung widersprüchlich, aber artspezifisch auf das Überleben und die Biomasseproduktion aus. Die Ergebnisse dieser Studie unterstreichen, dass DNA-Methylierung einen vernachlässigbaren Beitrag zur lokalen Anpassung bei den untersuchten nicht-heimischen, aber auch einheimischen Arten leistete. Zusammenfassend konnte ich mit dieser Arbeit festellen, dass DNA-Methylierung bei nicht-einheimischen Pflanzenarten eine untergeordnete Rolle sowohl bei der adaptiven Merkmalsvariation entlang von Klimagradienten als auch der lokalen Anpassung an klimatisch unterschiedliche Regionen spielt, wenn diese Pflanzenarten eine hohe genetische Vielfalt aufweisen und sich hauptsächlich sexuell vermehren. Ich konnte zeigen, dass der Anpassungserfolg dieser nicht-einheimischen Pflanzenarten kaum durch DNA-Methylierung erklärbar ist, sondern vielmehr eine mögliche Folge mehrfacher Eintragungen, von Ausbreitungskorridoren und Meta-Populationsdynamiken sein könnte. Die Ergebnisse dieser Studien verdeutlichen ebenso, dass die Verwendung von Pflanzenarten, die sich nicht überwiegend klonal vermehren und keine genetischen Modellpflanzen sind, unerlässlich ist, um die Effektstärke epigenetischer Mechanismen im ökologisch-evolutionären Kontext zu charakterisieren. KW - common-garden experiment KW - reciprocal transplant experiment KW - epigenetics KW - cytosine methylation KW - zebularine KW - adaptive differentiation KW - local adaptation KW - microsatellites KW - Solidago canadensis KW - Solidago gigantea KW - Amaranthus retroflexus KW - Chenopodium album KW - Erigeron canadensis KW - Erigeron annuus KW - Lactuca serriola KW - Senecio vulgaris KW - Sonchus oleraceus KW - Tripleurospermum inodorum KW - Veronica persica KW - Plantago major KW - Datura stramonium KW - Solanum nigrum KW - latitudinal clines KW - population structure KW - invasive KW - ruderal KW - non-native KW - Central Europe KW - Germany KW - AFLP KW - MSAP KW - spatial autocorrelation KW - genome scan KW - Gemeinschaftsgarten-Experiment KW - reziprokes Transplantationsexperiment KW - Epigenetik KW - Cytosin-Methylierung KW - Zebularin KW - adaptive Differenzierung KW - lokale Anpassung KW - Mikrosatelliten KW - Breitengrad KW - Ökokline KW - Populationsstruktur KW - invasiv KW - ruderal KW - nicht-einheimisch KW - Mitteleuropa KW - Deutschland KW - AFLP KW - MSAP KW - räumliche Autokorrelation KW - Genom-Scan Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-568844 ER - TY - THES A1 - Grimbs, Sergio T1 - Towards structure and dynamics of metabolic networks T1 - Struktur und Dynamik metabolischer Netzwerke N2 - This work presents mathematical and computational approaches to cover various aspects of metabolic network modelling, especially regarding the limited availability of detailed kinetic knowledge on reaction rates. It is shown that precise mathematical formulations of problems are needed i) to find appropriate and, if possible, efficient algorithms to solve them, and ii) to determine the quality of the found approximate solutions. Furthermore, some means are introduced to gain insights on dynamic properties of metabolic networks either directly from the network structure or by additionally incorporating steady-state information. Finally, an approach to identify key reactions in a metabolic networks is introduced, which helps to develop simple yet useful kinetic models. The rise of novel techniques renders genome sequencing increasingly fast and cheap. In the near future, this will allow to analyze biological networks not only for species but also for individuals. Hence, automatic reconstruction of metabolic networks provides itself as a means for evaluating this huge amount of experimental data. A mathematical formulation as an optimization problem is presented, taking into account existing knowledge and experimental data as well as the probabilistic predictions of various bioinformatical methods. The reconstructed networks are optimized for having large connected components of high accuracy, hence avoiding fragmentation into small isolated subnetworks. The usefulness of this formalism is exemplified on the reconstruction of the sucrose biosynthesis pathway in Chlamydomonas reinhardtii. The problem is shown to be computationally demanding and therefore necessitates efficient approximation algorithms. The problem of minimal nutrient requirements for genome-scale metabolic networks is analyzed. Given a metabolic network and a set of target metabolites, the inverse scope problem has as it objective determining a minimal set of metabolites that have to be provided in order to produce the target metabolites. These target metabolites might stem from experimental measurements and therefore are known to be produced by the metabolic network under study, or are given as the desired end-products of a biotechological application. The inverse scope problem is shown to be computationally hard to solve. However, I assume that the complexity strongly depends on the number of directed cycles within the metabolic network. This might guide the development of efficient approximation algorithms. Assuming mass-action kinetics, chemical reaction network theory (CRNT) allows for eliciting conclusions about multistability directly from the structure of metabolic networks. Although CRNT is based on mass-action kinetics originally, it is shown how to incorporate further reaction schemes by emulating molecular enzyme mechanisms. CRNT is used to compare several models of the Calvin cycle, which differ in size and level of abstraction. Definite results are obtained for small models, but the available set of theorems and algorithms provided by CRNT can not be applied to larger models due to the computational limitations of the currently available implementations of the provided algorithms. Given the stoichiometry of a metabolic network together with steady-state fluxes and concentrations, structural kinetic modelling allows to analyze the dynamic behavior of the metabolic network, even if the explicit rate equations are not known. In particular, this sampling approach is used to study the stabilizing effects of allosteric regulation in a model of human erythrocytes. Furthermore, the reactions of that model can be ranked according to their impact on stability of the steady state. The most important reactions in that respect are identified as hexokinase, phosphofructokinase and pyruvate kinase, which are known to be highly regulated and almost irreversible. Kinetic modelling approaches using standard rate equations are compared and evaluated against reference models for erythrocytes and hepatocytes. The results from this simplified kinetic models can simulate acceptably the temporal behavior for small changes around a given steady state, but fail to capture important characteristics for larger changes. The aforementioned approach to rank reactions according to their influence on stability is used to identify a small number of key reactions. These reactions are modelled in detail, including knowledge about allosteric regulation, while all other reactions were still described by simplified reaction rates. These so-called hybrid models can capture the characteristics of the reference models significantly better than the simplified models alone. The resulting hybrid models might serve as a good starting point for kinetic modelling of genome-scale metabolic networks, as they provide reasonable results in the absence of experimental data, regarding, for instance, allosteric regulations, for a vast majority of enzymatic reactions. N2 - In dieser Arbeit werden mathematische und informatische Ansätze zur Behandlung diverser Probleme im Zusammenhang mit der Modellierung metabolischer Netzwerke vorgestellt, insbesondere unter Berücksichtigung der eingeschränkten Verfügbarkeit detaillierter Enzymkinetiken. Es wird gezeigt, dass präzise mathematische Formulierungen der Probleme notwendig sind, um erstens angemessene und, falls möglich, effiziente Algorithmen zur Lösung zu entwickeln. Und zweitens, um die Güte der so gefundenen Lösungen zu bewerten. Des weiteren werden Methoden zur Analyse dynamischer Eigenschaften metabolischer Netzwerke eingeführt, welche entweder nur auf der Struktur der Netzwerke basieren oder zusätzlich noch Informationen über stationäre Zustände mit berücksichtigen. Außerdem wird eine Strategie zur Bestimmung von Schlüsselreaktionen eines Netzwerkes vorgestellt, welche die Entwicklung kinetischer Modelle vereinfacht. Der Erfolg neuer Technologien ermöglicht eine immer billigere und schnellere Sequenzierung des Genoms. Dies wird in naher Zukunft die Analyse biologischer Netzwerke nicht nur für Spezies, sondern auch für einzelne Individuen ermöglichen. Die automatische Rekonstruktion metabolischer Netzwerke ist bestens dafür geeignet, diese großen Datenmengen auszuwerten. Eine mathematische Formulierung der Rekonstruktion als Optimierungsproblem wird vorgestellt, die sowohl bereits vorhandenes Wissen als auch theoretische Vorhersagen verschiedenster bioinformatischer Methoden berücksichtigt. Die rekonstruierten Netzwerke sind hinsichtlich möglichst großer und plausibler Zusammenhangskomponenten hin optimiert, um fragmentierte und isolierte Teilnetzwerke zu vermeiden. Als Beispiel dient die Rekonstruktion der Saccharosesynthese in Chlamydomonas reinhardtii. Es wird gezeigt, dass das Problem sehr rechenintensiv ist und somit Approximationsalgorithmen erforderlich macht. Das 'inverse scope' Problem hat als Optimierungsziel, für ein gegebenes metabolisches Netzwerk die minimale Menge notwendiger Metabolite zu bestimmen, um eine ebenfalls gegebene Menge von gewünschten Zielmetaboliten zu produzieren. Diese Zielmetabolite können entweder durch experimentellen Messungen festgelegt werden, oder sie sind die gewünschten Endprodukte einer biotechnologischen Anwendung. Es wird gezeigt, dass das 'inverse scope' Problem rechenintensiv ist. Allerdings wird angenommen, dass die Berechnungskomplexität stark von der Anzahl gerichteter Zyklen innerhalb des metabolischen Netzwerkes abhängt. Dies könnte die Entwicklung effizienter Approximationsalgorithmen ermöglichen. Unter der Annahme von Massenwirkungskinetiken erlaubt es die 'chemical reaction network theory' (CRNT), anhand der Struktur metabolischer Netzwerke Rückschlüsse auf Multistabilität zu ziehen. Auch weitere Kinetiken können durch Modellierung von Enzymmechanismen mit berücksichtigt werden. CRNT wird zum Vergleich von mehreren Modellen des Calvinzyklus, welche sich in Größe und Abstraktionsniveau unterscheiden, verwendet. Obwohl für kleinere Modelle Ergebnisse erzielt werden, erlauben es die verfügbaren Theoreme und Algorithmen der CRNT nicht, Aussagen für größere Modelle zu machen, da die gegenwärtigen Implementierungen der Algorithmen an ihre Berechnungsgrenzen stoßen. Sind sowohl die Stoichiometrie eines metabolischen Netzwerkes, als auch die Metabolitkonzentrationen und Flüsse im stationären Zustand bekannt, so kann 'structural kinetic modelling' angewandt werden, um das dynamische Verhalten des Netzwerkes zu analysieren, selbst wenn die expliziten Ratengleichung unbekannt sind. Dieser Ansatz wird verwendet, um den stabilisierenden Einfluss allosterischer Regulation in menschlichen Erythrozyten zu untersuchen. Des weiteren werden die Reaktionen anhand ihrer Bedeutung hinsichtlich Stabilität im stationären Zustand angeordnet. Die wichtigsten Reaktionen bezüglich dieser Ordnung sind Hexokinase, Phosphofructokinase und Pyruvatkinase, welche bekanntermaßen stark reguliert und irreversibel sind. Kinetische Modelle, die auf generischen Ratengleichung beruhen, werden mit detaillierten Referenzmodellen für Erythrozyten und Hepatozyten verglichen. Die generischen Modelle simulieren das Verhalten nur in der Nähe eines gegebenen stationären Zustandes recht gut. Der zuvor erwähnte Ansatz, wichtige Reaktionen bezüglich Stabilität zu identifizieren, wird zur Bestimmung von Schlüsselreaktionen genutzt. Diese Schlüsselreaktionen werden im Detail modelliert, während für alle anderen Reaktionen weiterhin generische Ratengleichung verwendet werden. Die so entstandenen Hybridmodelle können das Verhalten des Referenzmodells signifikant besser beschreiben. Die Hybridmodelle können als Ausgangspunkt zur Erstellung genomweiter kinetischer Modelle dienen. KW - metabolische Netzwerke KW - Modellierung KW - Struktur KW - Dynamik KW - Bioinformatik KW - metabolic networks KW - modelling KW - structure KW - dynamics KW - bioinformatics Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-32397 ER - TY - THES A1 - Behm, Laura Vera Johanna T1 - Thermoresponsive Zellkultursubstrate für zeitlich-räumlich gesteuertes Auswachsen neuronaler Zellen T1 - Thermoresponsive cell culture substrates for spatio-temporal controlled outgrowth of neuronal cells N2 - Ein wichtiges Ziel der Neurowissenschaften ist das Verständnis der komplexen und zugleich faszinierenden, hochgeordneten Vernetzung der Neurone im Gehirn, welche neuronalen Prozessen, wie zum Beispiel dem Wahrnehmen oder Lernen wie auch Neuropathologien zu Grunde liegt. Für verbesserte neuronale Zellkulturmodelle zur detaillierten Untersuchung dieser Prozesse ist daher die Rekonstruktion von geordneten neuronalen Verbindungen dringend erforderlich. Mit Oberflächenstrukturen aus zellattraktiven und zellabweisenden Beschichtungen können neuronale Zellen und ihre Neuriten in vitro strukturiert werden. Zur Kontrolle der neuronalen Verbindungsrichtung muss das Auswachsen der Axone zu benachbarten Zellen dynamisch gesteuert werden, zum Beispiel über eine veränderliche Zugänglichkeit der Oberfläche. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob mit thermoresponsiven Polymeren (TRP) beschichtete Zellkultursubstrate für eine dynamische Kontrolle des Auswachsens neuronaler Zellen geeignet sind. TRP können über die Temperatur von einem zellabweisenden in einen zellattraktiven Zustand geschaltet werden, womit die Zugänglichkeit der Oberfläche für Zellen dynamisch gesteuert werden kann. Die TRP-Beschichtung wurde mikrostrukturiert, um einzelne oder wenige neuronale Zellen zunächst auf der Oberfläche anzuordnen und das Auswachsen der Zellen und Neuriten über definierte TRP-Bereiche in Abhängigkeit der Temperatur zeitlich und räumlich zu kontrollieren. Das Protokoll wurde mit der neuronalen Zelllinie SH-SY5Y etabliert und auf humane induzierte Neurone übertragen. Die Anordnung der Zellen konnte bei Kultivierung im zellabweisenden Zustand des TRPs für bis zu 7 Tage aufrecht erhalten werden. Durch Schalten des TRPs in den zellattraktiven Zustand konnte das Auswachsen der Neuriten und Zellen zeitlich und räumlich induziert werden. Immunozytochemische Färbungen und Patch-Clamp-Ableitungen der Neurone demonstrierten die einfache Anwendbarkeit und Zellkompatibilität der TRP-Substrate. Eine präzisere räumliche Kontrolle des Auswachsens der Zellen sollte durch lokales Schalten der TRP-Beschichtung erreicht werden. Dafür wurden Mikroheizchips mit Mikroelektroden zur lokalen Jouleschen Erwärmung der Substratoberfläche entwickelt. Zur Evaluierung der generierten Temperaturprofile wurde eine Temperaturmessmethode entwickelt und die erhobenen Messwerte mit numerisch simulierten Werten abgeglichen. Die Temperaturmessmethode basiert auf einfach zu applizierenden Sol-Gel-Schichten, die den temperatursensitiven Fluoreszenzfarbstoff Rhodamin B enthalten. Sie ermöglicht oberflächennahe Temperaturmessungen in trockener und wässriger Umgebung mit hoher Orts- und Temperaturauflösung. Numerische Simulationen der Temperaturprofile korrelierten gut mit den experimentellen Daten. Auf dieser Basis konnten Geometrie und Material der Mikroelektroden hinsichtlich einer lokal stark begrenzten Temperierung optimiert werden. Ferner wurden für die Kultvierung der Zellen auf den Mikroheizchips eine Zellkulturkammer und Kontaktboard für die elektrische Kontaktierung der Mikroelektroden geschaffen. Die vorgestellten Ergebnisse demonstrieren erstmalig das enorme Potential thermoresponsiver Zellkultursubstrate für die zeitlich und räumlich gesteuerte Formation geordneter neuronaler Verbindungen in vitro. Zukünftig könnte dies detaillierte Studien zur neuronalen Informationsverarbeitung oder zu Neuropathologien an relevanten, humanen Zellmodellen ermöglichen. N2 - An important goal of neurosciences is to understand the fascinating, complex and highly ordered neuronal circuits of the brain that are underlying important neuronal processes such as learning and memory, as well as neuropathologies. For detailed studies of these processes improved neuronal cell culture models that allow a reconstruction of ordered neuronal connections are crucial. Neuronal cells can be patterned in vitro with structured surface coatings of cell repellent and cell attractive substances. For controlling also the direction of neuronal cell connections the outgrowth of the axons towards neighbouring cells needs to be dynamically controlled, which can be achieved for example by surface structures that can be changed due to switchable surface properties. The main goal of this work was to explore if cell culture substrates with coatings of thermoresponsive polymer (TRP) are suitable for dynamically controlling the outgrowth of neuronal cells. TRPs can be switched via temperature between a cell repellent and a cell attractive state, which enables a dynamic change of surface properties. The TRP coating was microstructured in order to pattern neuronal cells and to spatio-temporally control the outgrowth of cells and neurites across defined TRP-coated areas in dependence of the temperature. The protocol was established with the neuronal cell line SH-SY5Y and transferred to human induced neuronal cells. The cell patterns could be maintained for up to 7 days of cultivation when the TRP was kept in the cell repellent state. By switching the TRP to the cell attractive state the outgrowth of neurites and cells was induced at defined time points and areas. Immunocytochemical staining and patch-clamp recordings of the neurons demonstrated the cell compatibility and easy applicability of these TRP-substrates. A more precise spatial control of the outgrowth of cells should be further achieved by local switching of the TRP-coating. Therefore, microheaters comprising microelectrodes were developed for locally heating the substrate surface. For evaluation of the generated temperature profiles a thermometry method was developed and the values obtained were correlated with numerically simulated data. The thermometry method is based on easily applicable sol-gel-films containing the temperature-sensitive fluorophore Rhodamine B. It allows temperature measurements close to the surface under both dry and liquid conditions with high resolution regarding space (lower µm-range) and temperature (≤ 1°C). Numerical simulations of the temperature profiles correlated well with experimental data. On this basis geometry and material of the microelectrodes were optimized with regard to locally restricted temperature changes. Furthermore, a chip environment for cultivating the cells on the microheater chips was developed comprising a cell culture chamber and a contact board for electrically contacting the microelectrodes. The results presented in this work demonstrate for the first time the great potential of thermoresponsive cell culture substrates for a spatio-temporally controlled formation of neuronal connections in vitro. In future this could facilitate detailed studies of information processing in neuronal networks or of neuropathologies using relevant human neuronal cell models. KW - neuronale Netzwerke KW - Mikrostrukturierung KW - Neuritenwachstum KW - thermoresponsive Polymere KW - Lab-on-a-chip KW - Rhodamin B KW - Thermometrie KW - Mikroheizung KW - Oberflächentemperatur KW - Sol-Gel KW - Zelladhäsionskontrolle KW - neuronal networks KW - microstructures KW - neurite outgrowth KW - thermoresponsive polymers KW - lab-on-a-chip KW - Rhodamine B KW - thermometry KW - microheating KW - surface temperature KW - sol-gel KW - cell adhesion control Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-436196 ER - TY - THES A1 - Makower, Katharina T1 - The roles of secondary metabolites in microcystis inter-strain interactions T1 - Die Rolle von Sekundärmetaboliten in den Wechselbeziehungen zwischen Microcystis-Stämmen N2 - Among the bloom-forming and potentially harmful cyanobacteria, the genus Microcystis represents a most diverse taxon, on the genomic as well as on morphological and secondary metabolite levels. Microcystis communities are composed of a variety of diversified strains. The focus of this study lies on potential interactions between Microcystis representatives and the roles of secondary metabolites in these interaction processes. The role of secondary metabolites functioning as signaling molecules in the investigated interactions is demonstrated exemplary for the prevalent hepatotoxin microcystin. The extracellular and intracellular roles of microcystin are tested in microarray-based transcriptomic approaches. While an extracellular effect of microcystin on Microcystis transcription is confirmed and connected to a specific gene cluster of another secondary metabolite in this study, the intracellularly occurring microcystin is related with several pathways of the primary metabolism. A clear correlation of a microcystin knockout and the SigE-mediated regulation of carbon metabolism is found. According to the acquired transcriptional data, a model is proposed that postulates the regulating effect of microcystin on transcriptional regulators such as the alternative sigma factor SigE, which in return captures an essential role in sugar catabolism and redox-state regulation. For the purpose of simulating community conditions as found in the field, Microcystis colonies are isolated from the eutrophic lakes near Potsdam, Germany and established as stably growing under laboratory conditions. In co-habitation simulations, the recently isolated field strain FS2 is shown to specifically induce nearly immediate aggregation reactions in the axenic lab strain Microcystis aeruginosa PCC 7806. In transcriptional studies via microarrays, the induced expression program in PCC 7806 after aggregation induction is shown to involve the reorganization of cell envelope structures, a highly altered nutrient uptake balance and the reorientation of the aggregating cells to a heterotrophic carbon utilization, e.g. via glycolysis. These transcriptional changes are discussed as mechanisms of niche adaptation and acclimation in order to prevent competition for resources. N2 - Die Gattung Microcystis stellt unter den blüten-bildenden Cyanobakterien ein Taxon besonderer Diversität dar. Dies gilt sowohl für die Genomstruktur als auch für morphologische Charakteristika und Sekundärmetabolite. Microcystis-Communities weisen eine Zusammensetzung aus einer Vielzahl von diversifizierten Stämmen auf. Das Hauptaugenmerk dieser Arbeit lag darauf, potentielle Wechselwirkungen zwischen Microcystis-Vertretern zu charakterisieren und die Rolle von Sekundärmetaboliten in Interaktions-Prozessen zu untersuchen. Die Rolle von Sekundärmetaboliten als Signalstoffe in Microcystis-Interaktionen wurde exemplarisch für das Hepatotoxin Microcystin demonstriert. Sowohl die extrazelluläre als auch die intrazellulare Funktion von Microcystin wurde anhand von Microarray-basierten Transkriptomstudien getestet. Dabei konnte eine extrazelluläre Wirkung von Microcystin bestätigt werden und mit der Transkription eines spezifischen anderen Sekundärmetaboliten in Verbindung gebracht werden. Intrazellulär vorkommendes Microcystin wurde hingegen mit verschiedenen Stoffwechselwegen des Primärstoffwechsels verknüpft. Es konnte ein deutlicher Zusammenhang zwischen einem Microcystin-Knockout und der SigE-vermittelten Regulation des Kohlenstoffmetabolismus festgestellt werden. Anhand der erworbenen Transkriptionsdaten wurde ein Modell vorgeschlagen, das eine regulierende Wirkung von Microcystin auf Transkriptionsfaktoren wie den alternativen Sigmafaktor SigE postuliert, welcher seinerseits eine zentrale Rolle in Zuckerabbauprozessen und zellulärer Redoxregulation einnimmt. Mit dem Ziel, Community-ähnliche Bedingungen zu simulieren, wurden Microcystis-Freiland-Kolonien aus eutrophen Gewässern in der Umgebung von Potsdam isoliert und ein stabiles Wachstum unter Laborbedingungen etabliert. Es konnte gezeigt werden, dass der frisch isolierte Freilandstamm FS2 spezifisch eine starke Zellaggregation in Microcystis aeruginosa PCC 7806 (einem axenischen Labortstamm) auslösen konnte. In Transkriptionsstudien mit Hilfe von Microarrays wurden Expressionsprogramme gefunden, die sowohl einen Umbau von Zellhüllstrukturen, als auch einen stark veränderten transmembranen Nährstofftransport beinhalteten. Darüber hinaus konnte in den aggregierenden PCC 7806-Zellen eine Verlagerung zu heterotrophen Kohlenstoffabbauprozessen wie der Glykolyse gefunden werden. Die transkriptionellen Veränderungen wurden als Akklimationsmechanismen zur Positionierung in ökologische Nischen diskutiert, um Konkurrenzen um Ressourcen zu vermeiden. KW - microcystis KW - microcystin KW - secondary metabolites KW - transcriptomics KW - interactions KW - Sekundärmetabolite KW - Transkriptomik KW - Wechselwirkungen Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-93916 ER - TY - THES A1 - Schmitt, Clemens Nikolaus Zeno T1 - The role of protein metal complexes in the mechanics of Mytilus californianus byssal threads T1 - Der Einfluss von Protein-Metall-Komplexen auf die mechanischen Eigenschaften der Byssusfäden von Mytilus californianus N2 - Protein-metal coordination complexes are well known as active centers in enzymatic catalysis, and to contribute to signal transduction, gas transport, and to hormone function. Additionally, they are now known to contribute as load-bearing cross-links to the mechanical properties of several biological materials, including the jaws of Nereis worms and the byssal threads of marine mussels. The primary aim of this thesis work is to better understand the role of protein-metal cross-links in the mechanical properties of biological materials, using the mussel byssus as a model system. Specifically, the focus is on histidine-metal cross-links as sacrificial bonds in the fibrous core of the byssal thread (Chapter 4) and L-3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA)-metal bonds in the protective thread cuticle (Chapter 5). Byssal threads are protein fibers, which mussels use to attach to various substrates at the seashore. These relatively stiff fibers have the ability to extend up to about 100 % strain, dissipating large amounts of mechanical energy from crashing waves, for example. Remarkably, following damage from cyclic loading, initial mechanical properties are subsequently recovered by a material-intrinsic self-healing capability. Histidine residues coordinated to transition metal ions in the proteins comprising the fibrous thread core have been suggested as reversible sacrificial bonds that contribute to self-healing; however, this remains to be substantiated in situ. In the first part of this thesis, the role of metal coordination bonds in the thread core was investigated using several spectroscopic methods. In particular, X-ray absorption spectroscopy (XAS) was applied to probe the coordination environment of zinc in Mytilus californianus threads at various stages during stretching and subsequent healing. Analysis of the extended X-ray absorption fine structure (EXAFS) suggests that tensile deformation of threads is correlated with the rupture of Zn-coordination bonds and that self-healing is connected with the reorganization of Zn-coordination bond topologies rather than the mere reformation of Zn-coordination bonds. These findings have interesting implications for the design of self-healing metallopolymers. The byssus cuticle is a protective coating surrounding the fibrous thread core that is both as hard as an epoxy and extensible up to 100 % strain before cracking. It was shown previously that cuticle stiffness and hardness largely depend on the presence of Fe-DOPA coordination bonds. However, the byssus is known to concentrate a large variety of metals from seawater, some of which are also capable of binding DOPA (e.g. V). Therefore, the question arises whether natural variation of metal composition can affect the mechanical performance of the byssal thread cuticle. To investigate this hypothesis, nanoindentation and confocal Raman spectroscopy were applied to the cuticle of native threads, threads with metals removed (EDTA treated), and threads in which the metal ions in the native tissue were replaced by either Fe or V. Interestingly, replacement of metal ions with either Fe or V leads to the full recovery of native mechanical properties with no statistical difference between each other or the native properties. This likely indicates that a fixed number of metal coordination sites are maintained within the byssal thread cuticle – possibly achieved during thread formation – which may provide an evolutionarily relevant mechanism for maintaining reliable mechanics in an unpredictable environment. While the dynamic exchange of bonds plays a vital role in the mechanical behavior and self-healing in the thread core by allowing them to act as reversible sacrificial bonds, the compatibility of DOPA with other metals allows an inherent adaptability of the thread cuticle to changing circumstances. The requirements to both of these materials can be met by the dynamic nature of the protein-metal cross-links, whereas covalent cross-linking would fail to provide the adaptability of the cuticle and the self-healing of the core. In summary, these studies of the thread core and the thread cuticle serve to underline the important and dynamic roles of protein-metal coordination in the mechanical function of load-bearing protein fibers, such as the mussel byssus. N2 - Protein-Metall Bindungen sind vor allem durch ihre Rolle in physiologischen Prozessen bekannt. Vor kurzem jedoch wurde eine völlig andere Funktion dieser chemischen Bindungen, als lasttragendes Vernetzungselement in Kieferzangen mariner Ringelwürmer der Gattung Nereis und Byssusfäden mariner Muscheln der Gattung Mytilus (Miesmuscheln) entdeckt. Ziel dieser Dissertation ist es, am Beispiel von M. californianus Byssusfäden, ein besseres Verständnis des Einflusses von Protein-Metall Komplexen auf die mechanischen Eigenschaften biologischer Materialien zu erlangen. Byssusfäden sind Proteinfasern, welche Miesmuscheln zur sicheren Befestigung verwenden. Diese relativ steifen Fäden können bis zu 100 % gedehnt zu werden, ohne zu brechen. Bei sofortiger Wiederbelastung zeigt sich jedoch eine Verschlechterung der mechanischen Eigenschaften des Materials. Erstaunlicherweise können sich die mechanischen Eigenschaften der Fäden hiervon wieder erholen. Es wird angenommen, dass im Faserkern der Byssusfäden die Aminosäure Histidin Bindungen mit Metallionen eingeht, welche als reversible Opferbindungen fungieren können und so einen Selbstheilungsprozess ermöglichen. In dieser Arbeit wurde der Beitrag von Protein-Zink Bindungen zur Mechanik der Byssusfäden mittels Röntgenabsorptionsspektroskopie (XAS), untersucht. Die ermittelten Daten legen nahe, dass Zn-Aminosäure Bindungen unter Dehnung der Byssusfäden brechen. Des Weiteren scheint der Selbstheilungsprozess nicht auf der bloßen Wiederherstellung dieser Bindungen zu beruhen, sondern viel mehr auf der Regenerierung der anfänglichen Bindungsstruktur und -verteilung. Diese Erkenntnisse stellen interessante Konzepte für die Entwicklung von selbstheilenden Metallopolymeren bereit. Die relativ harte Hülle der Byssusfäden schützt den Faserkern vor Abrieb. Laut Literatur basiert ihre Härte und Steifigkeit hauptsächlich auf der Quervernetzung durch Fe-DOPA (eine modifizierte Aminosäure) Bindungen. Jedoch können verschiedene Metalle aus dem Meerwasser in Byssusfäden aufgenommen werden und auch Bindungen mit DOPA bilden. Daher stellt sich die Frage, nach dem Zusammenhang zwischen mechanischen Eigenschaften und der Metallzusammensetzung der Byssushülle. Um dieser Frage nachzugehen, wurden die Metallionen aus der Hülle natürlicher Byssusfäden entfernt, und durch entweder Fe oder V ersetzt. Anschließend wurden die mechanischen Eigenschaften der Hüllen der behandelten und unbehandelten Byssusfäden mittels Nanoindentierung bestimmt. Interessanterweise besteht kein Unterschied der mechanischen Eigenschaften der natürlichen und modifizierten Hüllen der Byssusfäden, was dafür spricht, dass in der Hülle der Byssusfäden eine feste Anzahl an Protein-Metall Quervernetzungspunkten vorhanden ist, die möglicherweise durch den speziellen Produktionsprozess der Fäden festgelegt wird. Dies könnte eine evolutionäre Anpassung des Byssus darstellen, um eine verlässliche Verankerung des Organismus in verschiedenen Umgebungen zu gewährleisten. Während die Dynamik der Protein-Metall Bindungen ihnen eine Rolle als chemische Opferbindung im selbstheilenden Faserkern erlaubt, ermöglicht sie die Funktion der Hülle unter Verwendung verschiedener Metalle. Andere nicht-kovalente Wechselwirkungen haben sicherlich eine ähnliche Dynamik, und kovalente Bindungen sind stabiler, aber nur Protein-Metall Bindungen erlauben eine stabile und dynamische Quervernetzung, ohne die weder das Anpassungsvermögen der Hülle, noch das Selbstheilungsvermögen des Faserkerns möglich wären. Die Untersuchungen der Hülle und des Faserkerns der Byssusfäden verdeutlichen die Wichtigkeit der Protein-Metall Bindungen und ihrer Dynamik für die mechanische Funktion lasttragender Proteinfasern, wie dem Byssus der Miesmuscheln. KW - biomaterials KW - self-healing materials KW - protein-metal interaction KW - Biomaterialien KW - selbstheilende Materialien KW - Protein-Metall-Wechselwirkung Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-74216 ER - TY - THES A1 - Kartal, Önder T1 - The role of interfacial and 'entropic' enzymes in transitory starch degradation : a mathematical modeling approach T1 - Zur Aufklärung der Rolle grenzflächenaktiver und "entropischer" Enzyme beim Abbau transitorischer Stärke auf Grundlage mathematischer Modelle N2 - Plants and some unicellular algae store carbon in the form of transitory starch on a diurnal basis. The turnover of this glucose polymer is tightly regulated and timely synthesis as well as mobilization is essential to provide energy for heterotrophic growth. Especially for starch degradation, novel enzymes and mechanisms have been proposed recently. However, the catalytic properties of these enzymes and their coordination with metabolic regulation are still to be discovered. This thesis develops theoretical methods in order to interpret and analyze enzymes and their role in starch degradation. In the first part, a novel description of interfacial enzyme catalysis is proposed. Since the initial steps of starch degradation involve reactions at the starch-stroma interface it is necessary to have a framework which allows the derivation of interfacial enzyme rate laws. A cornerstone of the method is the introduction of the available area function - a concept from surface physics - to describe the adsorption step in the catalytic cycle. The method is applied to derive rate laws for two hydrolases, the Beta-amylase (BAM3) and the Isoamylase (DBE/ISA3), as well as to the Glucan, water dikinase (GWD) and a Phosphoglucan phosphatase (DSP/SEX4). The second part uses the interfacial rate laws to formulate a kinetic model of starch degradation. It aims at reproducing the stimulatory effect of reversible phosphorylation by GWD and DSP on the breakdown of the granule. The model can describe the dynamics of interfacial properties during degradation and suggests that interfacial amylopectin side-chains undergo spontaneous helix-coil transitions. Reversible phosphorylation has a synergistic effect on glucan release especially in the early phase dropping off during degradation. Based on the model, the hypothesis is formulated that interfacial phosphorylation is important for the rapid switch from starch synthesis to starch degradation. The third part takes a broader perspective on carbohydrate-active enzymes (CAZymes) but is motivated by the organization of the downstream pathway of starch breakdown. This comprises Alpha-1,4-glucanotransferases (DPE1 and DPE2) and Alpha-glucan-phosphorylases (Pho or PHS) both in the stroma and in the cytosol. CAZymes accept many different substrates and catalyze numerous reactions and therefore cannot be characterized in classical enzymological terms. A concise characterization is provided by conceptually linking statistical thermodynamics and polymer biochemistry. Each reactant is interpreted as an energy level, transitions between which are constrained by the enzymatic mechanisms. Combinations of in vitro assays of polymer-active CAZymes essential for carbon metabolism in plants confirmed the dominance of entropic gradients. The principle of entropy maximization provides a generalization of the equilibrium constant. Stochastic simulations confirm the results and suggest that randomization of metabolites in the cytosolic pool of soluble heteroglycans (SHG) may contribute to a robust integration of fluctuating carbon fluxes coming from chloroplasts. N2 - Stärke hat eine herausragende Bedeutung für die menschliche Ernährung. Sie ist ein komplexes, wasserunlösliches Glucosepolymer und dient - als eine der wichtigsten Speicherformen von Kohlenhydraten in Pflanzen - der Aufrechterhaltung des Energiestoffwechsels. Unterschiedliche Organe enthalten Stärke. In Knollen und Samen wird die sogenannte Speicherstärke über lange Zeiträume auf- und abgebaut. Die im Allgemeinen weniger bekannte transitorische Stärke in Blättern und einigen einzelligen Algen wird in einem täglichen Rhythmus umgesetzt: Sie wird während der Photosynthese aufgebaut und in der Nacht abgebaut. Experimentelle Studien haben nachgewiesen, dass die Fähigkeit der Pflanze, den Abbau transitorischer Stärke zu regeln, essentiell ist, um während der Nacht das Wachstum der Pflanze zu gewährleisten. Da die Geschwindigkeit von biochemischen Reaktionen über Enzyme reguliert wird, ist die Aufklärung ihrer Funktion im Stoffwechsel eine notwendige Voraussetzung, um den komplexen Prozess des Wachstums zu erklären. Die vorliegende Arbeit stellt einen Versuch dar, die Funktion von Enzymen beim Stärkeabbau anhand von mathematischen Modellen und Computersimulationen besser zu verstehen. Dieser Ansatz erlaubt es, Eigenschaften des Systems durch Abstraktion anhand eines idealisierten Abbildes herzuleiten. Die mathematisch notwendigen Folgerungen dienen der Aufstellung von Hypothesen, die wiederum mit experimentellen Resultaten konfrontiert werden können. Stoffwechselsysteme sind komplexe Untersuchungsobjekte, bei denen eine rein qualitative Argumentation schnell an Grenzen gerät, wo mathematische Methoden die Möglichkeit von Aussagen noch zulassen. Der erste Teil der Arbeit entwickelt einen theoretischen Rahmen, um Gleichungen für die Geschwindigkeit oberflächenaktiver Enzyme herzuleiten. Dies ist notwendig, da die ersten Reaktionen, die dem Stärkeabbau zugeordnet werden, an ihrer Oberfläche stattfinden. Die Methode wird auf vier essentielle Enzyme angewandt: zwei abbauende Enzyme (Beta-Amylase und Isoamylase) und zwei den Abbau unterstützende Enzyme (Alpha-Glucan,Wasser-Dikinase und Phosphoglucan Phosphatase). Der zweite Teil entwickelt ein kinetisches Modell des Stärkeabbaus unter Verwendung der hergeleiteten Ratengleichungen. Das Modell bildet die Dynamik des Systems realistisch ab und legt nahe, dass ein spontaner Phasenübergang an der Oberfläche von geordneten zu weniger geordneten Zuständen stattfindet. Ferner wird die Hypothese aufgestellt, dass die reversible Modifikation der Oberfläche durch Enzyme besonders in der Anfangsphase des Abbaus einen synergetischen Effekt hat, d.h. den Abbau enorm beschleunigt. Dies könnte beim schnellen Umschalten von Stärkeaufbau zu Stärkeabbau regulatorisch relevant sein. Im letzten Teil werden kohlenhydrataktive Enzyme betrachtet, die in der löslichen Phase die Produkte des Stärkeabbaus weiterverarbeiten. Da diese sogenannten Transferasen auch in vielen anderen Organismen und Stoffwechselwegen vorkommen, wird ein allgemeiner Standpunkt eingenommen. Anhand von Methoden aus der statistischen Physik wird theoretisch wie experimentell nachgewiesen, dass diese Enzyme spontan die Entropie innerhalb des Stoffwechselsystems erhöhen. Diese Neigung, "Unordnung" zu schaffen, wird vom Organismus aber paradoxerweise ausgenutzt, um die Weiterverarbeitung von Kohlenhydraten im Stärkestoffwechsel zu stabilisieren. Dieser Mechanismus eröffnet einen neuen Blick auf energie- und entropiegetriebene Prozesse in Zellen. KW - Enzymkinetik KW - Enzymadsorption KW - Disproportionierungsenzym KW - Polysaccharide KW - Statistische Physik KW - Enzyme kinetics KW - Enzyme adsorption KW - Disproportionating Enzyme KW - Polysaccharides KW - Statistical Physics Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-53947 ER - TY - THES A1 - Riewe, David T1 - The relevance of adenylate levels and adenylate converting enzymes on metabolism and development of potato (Solanum tuberosum L.) tubers T1 - Einfluss der Adenylate und Adenylat-umsetzender Enzyme auf Entwicklung und Stoffwechsel der Kartoffelknolle (Solanum Tuberosum L.) N2 - Adenylates are metabolites with essential function in metabolism and signaling in all living organisms. As Cofactors, they enable thermodynamically unfavorable reactions to be catalyzed enzymatically within cells. Outside the cell, adenylates are involved in signalling processes in animals and emerging evidence suggests similar signaling mechanisms in the plants’ apoplast. Presumably, apoplastic apyrases are involved in this signaling by hydrolyzing the signal mediating molecules ATP and ADP to AMP. This PhD thesis focused on the role of adenylates on metabolism and development of potato (Solanum tuberosum) by using reverse genetics and biochemical approaches. To study the short and long term effect of cellular ATP and the adenylate energy charge on potato tuber metabolism, an apyrase from Escherichia coli targeted into the amyloplast was expressed inducibly and constitutively. Both approaches led to the identification of adaptations to reduced ATP/energy charge levels on the molecular and developmental level. These comprised a reduction of metabolites and pathway fluxes that require significant amounts of ATP, like amino acid or starch synthesis, and an activation of processes that produce ATP, like respiration and an immense increase in the surface-to-volume ratio. To identify extracellular enzymes involved in adenylate conversion, green fluorescent protein and activity localization studies in potato tissue were carried out. It was found that extracellular ATP is imported into the cell by an apoplastic enzyme complement consisting of apyrase, unspecific phosphatase, adenosine nucleosidase and an adenine transport system. By changing the expression of a potato specific apyrase via transgenic approaches, it was found that this enzyme has strong impact on plant and particular tuber development in potato. Whereas metabolite levels were hardly altered, transcript profiling of tubers with reduced apyrase activity revealed a significant upregulation of genes coding for extensins, which are associated with polar growth. The results are discussed in context of adaptive responses of plants to changes in the adenylate levels and the proposed role of apyrase in apoplastic purinergic signaling and ATP salvaging. In summary, this thesis provides insight into adenylate regulated processes within and outside non-photosynthetic plant cells. N2 - Adenylate haben essentielle Funktionen in Stoffwechselprozessen und fungieren als Signalmoleküle in allen Organismen. Als Cofaktoren ermöglichen sie die Katalyse thermodynamisch ungünstiger Reaktionen innerhalb der Zelle, und außerhalb der Zelle wirken sie als Signalmoleküle in Tieren und nach neueren Forschungsergebnissen wohl auch in Pflanzen. Vermutlich wird die Signalwirkung von ATP und ADP durch Hydrolyse zu AMP unter Beteiligung apoplastische Apyrasen terminiert. Diese Arbeit behandelt den Einfluss der Adenylate auf Stoffwechsel- und Entwicklungsprozesse in der Kartoffelpflanze (Solanum tuberosum) mittels biochemischer und revers-genetischer Ansätze. Um kurzfristige und langfristige Einflüsse zellulären ATPs und der Energieladung auf den Stoffwechsel von Kartoffelknollen zu untersuchen, wurde eine mit einem plastidären Transitpeptid fusionierte Apyrase aus Escherichia coli induzierbar und dauerhaft exprimiert. Beide Ansätze führten zur Identifizierung von Anpassungen an eine reduzierte ATP Verfügbarkeit bzw. verringerte Energieladung. Die Anpassungen beinhalteten eine Reduzierung von ATP-verbrauchenden Stoffwechselaktivitäten und Stoffwechselprodukten, wie die Aminosäure- oder Stärkesynthese, und eine Aktivierung von Prozessen, welche die ATP-Bildung oder eine effizientere ATP-Bildung ermöglichen, wie Zellatmung und die Vergrößerung des Oberfächen/Volumen-Verhältnisses der Kartoffelknolle. Extrazelluläre Adenylat-umsetzende Enzyme wurden mit Hilfe des grün fluoreszierenden Proteins und Aktivitätsmessungen identifiziert und charakterisiert. Es wurde ein potentieller ATP Bergungsstoffwechselweg gefunden, der ATP über die Enzyme Apyrase, unspezifische Phosphatase und Adenosin-Nukleosidase zu Adenin umsetzt, welches über eine Purin-Permease in die Zelle transportiert wird. Transgene Manipulation der Aktivität der kartoffelspezifischen Apyrase zeigte, dass dieses Enzym einen großen Einfluss auf die Pflanzen-, insbesondere die Knollenentwicklung hat. Obwohl sich Stoffwechselaktivitäten kaum verändert hatten, führte die Verringerung der Apyrase Aktivität in den Knollen zur übermäßigen Expression von Extensin-Genen, die eine Funktion im polaren Wachstum von Pflanzenzellen besitzen. Die Ergebnisse wurden mit Hinblick auf Anpassungen der Pflanze an veränderte Adenylat-Spiegel und der potentiellen Beteiligung der endogenen Apyrase an einem apoplastischen ATP-Signalweg bzw. ATP-Bergungsstoffwechselweg diskutiert. Zusammengefasst, präsentiert diese Arbeit neue Einsichten in Adenylat-regulierte Prozesse in- und außerhalb nicht-photosynthetischer Pflanzenzellen. KW - Apyrase KW - ATP KW - Kartoffel KW - Stoffwechsel KW - Nukleosidase KW - apyrase KW - ATP KW - potato KW - metabolism KW - nucleosidase Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-27323 ER - TY - THES A1 - Breuer, David T1 - The plant cytoskeleton as a transportation network T1 - Modellierung des pflanzliche Zytoskeletts als Transportnetzwerk N2 - The cytoskeleton is an essential component of living cells. It is composed of different types of protein filaments that form complex, dynamically rearranging, and interconnected networks. The cytoskeleton serves a multitude of cellular functions which further depend on the cell context. In animal cells, the cytoskeleton prominently shapes the cell's mechanical properties and movement. In plant cells, in contrast, the presence of a rigid cell wall as well as their larger sizes highlight the role of the cytoskeleton in long-distance intracellular transport. As it provides the basis for cell growth and biomass production, cytoskeletal transport in plant cells is of direct environmental and economical relevance. However, while knowledge about the molecular details of the cytoskeletal transport is growing rapidly, the organizational principles that shape these processes on a whole-cell level remain elusive. This thesis is devoted to the following question: How does the complex architecture of the plant cytoskeleton relate to its transport functionality? The answer requires a systems level perspective of plant cytoskeletal structure and transport. To this end, I combined state-of-the-art confocal microscopy, quantitative digital image analysis, and mathematically powerful, intuitively accessible graph-theoretical approaches. This thesis summarizes five of my publications that shed light on the plant cytoskeleton as a transportation network: (1) I developed network-based frameworks for accurate, automated quantification of cytoskeletal structures, applicable in, e.g., genetic or chemical screens; (2) I showed that the actin cytoskeleton displays properties of efficient transport networks, hinting at its biological design principles; (3) Using multi-objective optimization, I demonstrated that different plant cell types sustain cytoskeletal networks with cell-type specific and near-optimal organization; (4) By investigating actual transport of organelles through the cell, I showed that properties of the actin cytoskeleton are predictive of organelle flow and provided quantitative evidence for a coordination of transport at a cellular level; (5) I devised a robust, optimization-based method to identify individual cytoskeletal filaments from a given network representation, allowing the investigation of single filament properties in the network context. The developed methods were made publicly available as open-source software tools. Altogether, my findings and proposed frameworks provide quantitative, system-level insights into intracellular transport in living cells. Despite my focus on the plant cytoskeleton, the established combination of experimental and theoretical approaches is readily applicable to different organisms. Despite the necessity of detailed molecular studies, only a complementary, systemic perspective, as presented here, enables both understanding of cytoskeletal function in its evolutionary context as well as its future technological control and utilization. N2 - Das Zytoskelett ist ein notwendiger Bestandteil lebender Zellen. Es besteht aus verschiedenen Arten von Proteinfilamenten, die ihrerseits komplexe, sich dynamisch reorganisierende und miteinander verknüpfte Netzwerke bilden. Das Zytoskelett erfüllt eine Vielzahl von Funktionen in der Zelle. In Tierzellen bestimmt das Aktin-Zytoskelett maßgeblich die mechanischen Zelleigenschaften und die Zellbewegung. In Pflanzenzellen hingegen kommt dem Aktin-Zytoskelett eine besondere Bedeutung in intrazellulären Transportprozessen zu, bedingt insbesondere durch die starre pflanzliche Zellwand sowie die Zellgröße. Als wesentlicher Faktor für Zellwachstum und somit auch die Produktion von Biomasse, ist Zytoskelett-basierter Transport daher von unmittelbarer ökologischer und ökonomischer Bedeutung. Während das Wissen über die molekularen Grundlagen Zytoskelett-basierter Transportprozesse beständig wächst, sind die zugrunde liegenden Prinzipien zellweiter Organisation bisher weitgehend unbekannt. Diese Dissertation widmet sich daher folgender Frage: Wie hängt die komplexe Architektur des pflanzlichen Zytoskeletts mit seiner intrazellulären Transportfunktion zusammen? Eine Antwort auf diese Frage erfordert eine systemische Perspektive auf Zytoskelettstruktur und -transport. Zu diesem Zweck habe ich Mikroskopiedaten mit hoher raumzeitlicher Auflösung sowie Computer-gestützte Bildanalysen und mathematische Ansätzen der Graphen- und Netzwerktheorie kombiniert. Die vorliegende Dissertation umfasst fünf meiner Publikationen, die sich einem systemischen Verständnis des pflanzlichen Zytoskeletts als Transportnetzwerk widmen: (1) Dafür habe ich Bilddaten-basierte Netzwerkmodelle entwickelt, die eine exakte und automatisierte Quantifizierung der Architektur des Zytoskeletts ermöglichen. Diese Quantifizierung kann beispielsweise in genetischen oder chemischen Versuchen genutzt werden und für eine weitere Erforschung der genetischen Grundlagen und möglicher molekularer Interaktionspartner des Zytoskeletts hilfreich sein; (2) Ich habe nachgewiesen, dass das pflanzliche Aktin-Zytoskelett Eigenschaften effizienter Transportnetzwerk aufweist und Hinweise auf seine evolutionären Organisationsprinzipien liefert; (3) Durch die mathematische Optimierung von Transportnetzwerken konnte ich zeigen, dass unterschiedliche Pflanzenzelltypen spezifische und optimierte Organisationsstrukturen des Aktin-Zytoskeletts aufweisen; (4) Durch quantitative Analyse des Transports von Organellen in Pflanzenzellen habe ich nachgewiesen, dass sich Transportmuster ausgehend von der Struktur des Aktin-Zytoskeletts vorhersagen lassen. Dabei spielen sowohl die Organisation des Zytoskeletts auf Zellebene als auch seine Geometrie eine zentrale Rolle. (5) Schließlich habe ich eine robuste, optimierungs-basierte Methode entwickelt, die es erlaubt, individuelle Filamente eines Aktin-Netzwerks zu identifizieren. Dadurch ist es möglich, die Eigenschaften einzelner Zytoskelettfilamente im zellulären Kontext zu untersuchen. Die im Zuge dieser Dissertation entwickelten Methoden wurden frei und quelloffen als Werkzeuge zur Beantwortung verwandter Fragestellung zugänglich gemacht. Insgesamt liefern die hier präsentierten Ergebnisse und entwickelten Methoden quantitative, systemische Einsichten in die Transportfunktion des Zytoskeletts. Die hier etablierte Kombination von experimentellen und theoretischen Ansätzen kann, trotz des Fokusses auf das pflanzliche Zytoskelett, direkt auf andere Organismen angewendet werden. Als Ergänzung molekularer Studien bildet ein systemischer Blickwinkel, wie er hier entwickelt wurde, die Grundlage für ein Verständnis sowohl des evolutionären Kontextes als auch zukünftiger Kontroll- und Nutzungsmöglichkeiten des pflanzlichen Zytoskeletts. KW - systems biology KW - mathematical modeling KW - cytoskeleton KW - plant science KW - graph theory KW - image analysis KW - Systembiologie KW - mathematische Modellierung KW - Zytoskelett KW - Zellbiologie KW - Graphtheorie KW - Bildanalyse Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-93583 ER - TY - THES A1 - Kolk, Jens T1 - The long-term legacy of historical land cover changes T1 - Die Langzeitfolgen historischer Landbedeckungsveränderungen BT - patterns and dynamics in herb-layer species richness in deciduous forests of the Prignitz region (NE Germany) BT - Muster und Dynamik der Artenvielfalt von Waldpflanzengemeinschaften in Laubwäldern der Prignitz (Nordostdeutschland) N2 - Over the last years there is an increasing awareness that historical land cover changes and associated land use legacies may be important drivers for present-day species richness and biodiversity due to time-delayed extinctions or colonizations in response to historical environmental changes. Historically altered habitat patches may therefore exhibit an extinction debt or colonization credit and can be expected to lose or gain species in the future. However, extinction debts and colonization credits are difficult to detect and their actual magnitudes or payments have rarely been quantified because species richness patterns and dynamics are also shaped by recent environmental conditions and recent environmental changes. In this thesis we aimed to determine patterns of herb-layer species richness and recent species richness dynamics of forest herb layer plants and link those patterns and dynamics to historical land cover changes and associated land use legacies. The study was conducted in the Prignitz, NE-Germany, where the forest distribution remained stable for the last ca. 100 years but where a) the deciduous forest area had declined by more than 90 per cent (leaving only remnants of "ancient forests"), b) small new forests had been established on former agricultural land ("post-agricultural forests"). Here, we analyzed the relative importance of land use history and associated historical land cover changes for herb layer species richness compared to recent environmental factors and determined magnitudes of extinction debt and colonization credit and their payment in ancient and post-agricultural forests, respectively. We showed that present-day species richness patterns were still shaped by historical land cover changes that ranged back to more than a century. Although recent environmental conditions were largely comparable we found significantly more forest specialists, species with short-distance dispersal capabilities and clonals in ancient forests than in post-agricultural forests. Those species richness differences were largely contingent to a colonization credit in post-agricultural forests that ranged up to 9 species (average 4.7), while the extinction debt in ancient forests had almost completely been paid. Environmental legacies from historical agricultural land use played a minor role for species richness differences. Instead, patch connectivity was most important. Species richness in ancient forests was still dependent on historical connectivity, indicating a last glimpse of an extinction debt, and the colonization credit was highest in isolated post-agricultural forests. In post-agricultural forests that were better connected or directly adjacent to ancient forest patches the colonization credit was way smaller and we were able to verify a gradual payment of the colonization credit from 2.7 species to 1.5 species over the last six decades. N2 - In den vergangenen Jahren reift immer mehr die Erkenntnis, dass historische Landnutzungsveränderungen und deren Folgewirkungen einen wichtigen Einfluss auf die heutige Artenvielfalt und Biodiversität haben können. In Habitaten, deren Landnutzung und Fläche sich in historischer Zeit verändert hat kann aufgrund von verzögerten Aussterbe- und Einwanderungsprozessen eine erhöhte oder verringerte Artenvielfalt vorliegen, die nicht den heutigen Umweltbedingungen entspricht. Es liegen Aussterbeschulden oder Einwanderungs- bzw. Kolonisierungskredite vor, welcher über die Zeit mit Artverlusten oder Zugewinnen von Arten bezahlt werden. Aussterbeschulden oder Einwanderungskredite und deren Bezahlung sind schwierig zu ermitteln, da einerseits Informationen zu historischen Landnutzungsveränderungen oft fehlen und andererseits auch heutige Umweltfaktoren einen wichtigen Einfluss auf die Artenvielfalt haben. Das Ziel dieser Arbeit war es die heutigen Muster der Artenvielfalt von Waldbodenpflanzen in Laub- und Mischwäldern und deren Veränderungen über die letzten 60 Jahre zu ermitteln und diese Muster im Hinblick auf historische Landnutzungsveränderungen zu untersuchen. Das Studiengebiet umfasst große Teile der Prignitz (Brandenburg und angrenzende Teile von Sachsen-Anhalt), ein Gebiet, dessen Waldanteil sich in den letzten 100 Jahren kaum verändert hat, in dem sich jedoch seit dem Ende des 19ten Jahrhunderts der Anteil historisch alter Wälder (ohne historische nachgewiesene agrarliche Nutzung) um mehr als 90% reduziert hat, während an anderer Stelle wenige neue Wälder auf vorigen Agrarflächen etabliert wurden. Im Rahmen dieser Studie wurde zunächst die Artenvielfalt und deren aktuelle Veränderung in historisch-alten Wäldern und neu etablierten Wäldern untersucht und verglichen. Um den Einfluss von historischen Landnutzungsveränderungen auf die Artenvielfalt zu ermittlen, wurde die historische und heutige Vernetzung der Waldflächen analysiert, die Umweltbedingungen in historisch-alten Wäldern und neu etablierten Wäldern verglichen und der Umfang und die Bezahlung der Aussterbeschulden und der Kolonisierungskredite ermittelt. Die Arbeit zeigt, dass historische Landnutzungsveränderungen die heutige Artenvielfalt noch immer beeinflussen. Obwohl die heutigen Umweltbedingungen in historisch-alten und neu etablierten Wäldern vergleichbar waren, war die Gesamtartenzahl in historisch-alten Wäldern signifikant höher und in diesen Wäldern wurden insbesondere mehr Waldspezialisten und sich nur über kurze Enfernung ausbreitende Pflanzenarten gefunden. Die Unterschiede in den Artenzahlen sind vor allem auf einen Kolonisierungskredit in neu etablierten Wäldern zurückzuführen, während die Aussterbeschulden in historisch-alten Wäldern weitgehend bezahlt wurden. Der Kolonisierungskredits war am höchsten in isoliert gelegenen Waldflächen und belief sich auf bis zu 9 Arten (im Mittel 4,7). Der Kolonisierungskredit in besser vernetzten und in direkt an historisch-alten Wäldern angrenzenden Flächen war deutlich geringer. In diesen Wäldern konnte eine Verringerung des Kolonisierungskredites von im Mittel 2,7 zu 1,5 Arten über die letzten sechs Jahrzehnte nachgewiesen werden. KW - ecology KW - plant science KW - extinction debt KW - colonization credit KW - species richness KW - land use history KW - Ökologie KW - Pflanzenwissenschaften KW - Botanik KW - Aussterbeschuld KW - Einwanderungskredit KW - Biodiversität KW - Landnutzungshistorie Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-439398 ER - TY - THES A1 - Wasiolka, Bernd T1 - The impact of overgrazing on reptile diversity and population dynamics of Pedioplanis l. lineoocellata in the southern Kalahari T1 - Der Einfluss von Überweidung auf Reptiliendiversität und die Poplationsdynamik von Pedioplanis l. lineoocellata in der südlichen Kalahari N2 - Die Vegetationskomposition und –struktur, beispielsweise die unterschiedliche Architektur von Bäumen, Sträuchern, Gräsern und Kräutern, bietet ein großes Spektrum an Habitaten und Nischen, die wiederum eine hohe Tierdiversität in den Savannensystemen des südlichen Afrikas ermöglichen. Dieses Ökosystem wurde jedoch über Jahrzehnte weltweit durch intensive anthropogene Landnutzung (z.B. Viehwirtschaft) nachhaltig verändert. Dabei wurden die Zusammensetzung, Diversität und Struktur der Vegetation stark verändert. Überweidung in Savannensystemen führt zu einer Degradation des Habitates einhergehend mit dem Verlust von perennierenden Gräsern und krautiger Vegetation. Dies führt zu einem Anstieg an vegetationsfreien Bodenflächen. Beides, sowohl der Verlust an perennierenden Gräsern und krautiger Vegetation sowie der Anstieg an vegetationsfreien Flächen führt zu verbesserten Etablierungsbedingungen für Sträucher (z.B. Rhigozum trichotomum, Acacia mellifera) und auf lange Sicht zu stark verbuschten Flächen. Die Tierdiversität in Savannen ist hiervon entscheidend beeinflusst. Mit sinkender struktureller Diversität verringert sich auch die Tierdiversität. Während der Einfluss von Überweidung auf die Vegetation relativ gut untersucht ist sind Informationen über den Einfluss von Überweidung auf die Tierdiversität, speziell für Reptilien, eher spärlich vorhanden. Zusätzlich ist sehr wenig bekannt zum Einfluss auf die Populationsdynamik (z.B. Verhaltensanpassungen, Raumnutzung, Überlebensrate, Sterberate) einzelner Reptilienarten. Ziel meiner Doktorarbeit ist es den Einfluss von Überweidung durch kommerzielle Farmnutzung auf die Reptiliengemeinschaft und auf verschiedene Aspekte der Populationsdynamik der Echse Pedioplanis lineoocellata lineoocellata zu untersuchen. Hinsichtlich bestimmter Naturschutzmaßnahmen ist es einerseits wichtig zu verstehen welchen Auswirkungen Überweidung auf die gesamte Reptiliengemeinschaft hat. Und zum anderen wie entscheidende Faktoren der Populationsdynamik beeinflusst werden. Beides führt zu einem besseren Verständnis der Reaktion von Reptilien auf Habitatdegradation zu erlangen. Die Ergebnisse meiner Doktorarbeit zeigen eindeutig einen negativen Einfluss der Überweidung und der daraus resultierende Habitatdegradation auf (1) die gesamte Reptiliengemeinschaft und (2) auf einzelne Aspekte der Populationsdynamik von P. lineoocellata. Im Teil 1 wird die signifikante Reduzierung der Reptiliendiversität und Abundanz in degradierten Habitaten beschrieben. Im zweiten Teil wird gezeigt, dass P. lineoocellata das Verhalten an die verschlechterten Lebensbedingungen anpassen kann. Die Art bewegt sich sowohl häufiger als auch über einen längeren Zeitraum und legt dabei größere Distanzen zurück. Zusätzlich vergrößerte die Art ihr Revier (home range) (Teil 3). Im abschließenden Teil wird der negative Einfluss von Überweidung auf die Populationsdynamik von P. lineoocellata beschrieben: In degradierten Habitaten nimmt die Populationsgröße von adulten und juvenilen Echsen ab, die Überlebens- und Geburtenrate sinken, währen zusätzlich das Prädationsrisiko ansteigt. Verantwortlich hierfür ist zum einen die ebenfalls reduzierte Nahrungsverfügbarkeit (Arthropoden) auf degradierten Flächen. Dies hat zur Folge, dass die Populationsgröße abnimmt und die Fitness der Individuen verringert wird, welches sich durch eine Reduzierung der Überlebens- und Geburtenrate bemerkbar macht. Und zum anderen ist es die Reduzierung der Vegetationsbedeckung und der Rückgang an perennierenden Gräsern welche sich negativ auswirken. Als Konsequenz hiervon gehen Nischen und Mikrohabitate verloren und die Möglichkeiten der Reptilien zur Thermoregulation sind verringert. Des Weiteren hat dieser Verlust an perennierender Grasbedeckung auch ein erhöhtes Prädationsrisikos zur Folge. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass nicht nur Bäume und Sträucher, wie in anderen Studien gezeigt, eine bedeutende Rolle für die Diversität spielen, sondern auch das perennierende Gras eine wichtige Rolle für die Faunendiversität spielt. Weiterhin zeigte sich, dass Habitatdegradation nicht nur die Population als gesamtes beeinflusst, sondern auch das Verhalten und Populationsparameter einzelner Arten. Des Weiteren ist es Reptilien möglich durch Verhaltensflexibilität auf verschlechterte Umweltbedingen zu reagieren. N2 - In semi-arid savannah ecosystems, the vegetation structure and composition, i.e. the architecture of trees, shrubs, grass tussocks and herbaceous plants, offer a great variety of habitats and niches to sustain animal diversity. In the last decades intensive human land use practises like livestock farming have altered the vegetation in savannah ecosystems worldwide. Extensive grazing leads to a reduction of the perennial and herbaceous vegetation cover, which results in an increased availability of bare soil. Both, the missing competition with perennial grasses and the increase of bare soils favour shrub on open ground and lead to area-wide shrub encroachment. As a consequence of the altered vegetation structure and composition, the structural diversity declines. It has been shown that with decreasing structural diversity animal diversity decline across a variety of taxa. Knowledge on the effects of overgrazing on reptiles, which are an important part of the ecosystem, are missing. Furthermore, the impact of habitat degradation on factors of a species population dynamic and life history, e.g., birth rate, survival rate, predation risk, space requirements or behavioural adaptations are poorly known. Therefore, I investigated the impact of overgrazing on the reptile community in the southern Kalahari. Secondly I analysed population dynamics and the behaviour of the Spotted Sand Lizard, Pedioplanis l. lineoocellata. All four chapters clearly demonstrate that habitat degradation caused by overgrazing had a severe negative impact upon (i) the reptile community as a whole and (ii) on population parameters of Pedioplanis l. lineoocellata. Chapter one showed a significant decline of regional reptile diversity and abundance in degraded habitats. In chapter two I demonstrated that P. lineoocellata moves more frequently, spends more time moving and covers larger distances in degraded than in non-degraded habitats. In addition, home range size of the lizard species increases in degraded habitats as shown by chapter three. Finally, chapter four showed the negative impacts of overgrazing on several population parameters of P. lineoocellata. Absolute population size of adult and juvenile lizards, survival rate and birth rate are significantly lower in degraded habitats. Furthermore, the predation risk was greatly increased in degraded habitats. A combination of a variety of aspects can explain the negative impact of habitat degradation on reptiles. First, reduced prey availability negatively affects survival rate, the birth rate and overall abundance. Second, the loss of perennial plant cover leads to a loss of niches and to a reduction of opportunities to thermoregulate. Furthermore, a loss of cover and is associated with increased predation risk. A major finding of my thesis is that the lizard P. lineoocellata can alter its foraging strategy. Species that are able to adapt and change behaviour, such as P. lineoocellata can effectively buffer against changes in their environment. Furthermore, perennial grass cover can be seen as a crucial ecological component of the vegetation in the semi-arid savannah system of the southern Kalahari. If perennial grass cover is reduced to a certain degree reptile diversity will decline and most other aspects of reptile life history will be negatively influenced. Savannah systems are characterised by a mixture of trees, shrubs and perennial grasses. These three vegetation components determine the composition and structure of the vegetation and accordingly influence the faunal diversity. Trees are viewed as keystone structures and focal points of animal activity for a variety of species. Trees supply animals with shelter, shade and food and act as safe sites, nesting sites, observation posts and foraging sites. Recent research demonstrates a positive influence of shrub patches on animal diversity. Moreover, it would seem that intermediate shrub cover can also sustain viable populations in savannah landscapes as has been demonstrated for small carnivores and rodent species. The influence of perennial grasses on faunal diversity did not receive the same attention as the influence of trees and shrubs. In my thesis I didn’t explicitly measure the direct effects of perennial grasses but my results strongly imply that it has an important role. If the perennial grass cover is significantly depleted my results suggest it will negatively influence reptile diversity and abundance and on several populations parameters of P. lineoocellata. Perennial grass cover is associated with the highest prey abundance, reptile diversity and reptile abundance. It provides reptiles both a refuge from predators and opportunities to optimise thermoregulation. The relevance of each of the three vegetation structural elements is different for each taxa and species. In conclusion, I can all three major vegetation structures in the savannah system are important for faunal diversity. KW - Shrub encroachment KW - overgrazing KW - biodiversity KW - reptiles Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-16611 ER - TY - THES A1 - Périllon, Cécile T1 - The effect of groundwater on benthic primary producers and their interaction T1 - Der Einfluss von Grundwasser auf benthische Primärproduzenten und ihre Interaktionen N2 - In littoral zones of lakes, multiple processes determine lake ecology and water quality. Lacustrine groundwater discharge (LGD), most frequently taking place in littoral zones, can transport or mobilize nutrients from the sediments and thus contribute significantly to lake eutrophication. Furthermore, lake littoral zones are the habitat of benthic primary producers, namely submerged macrophytes and periphyton, which play a key role in lake food webs and influence lake water quality. Groundwater-mediated nutrient-influx can potentially affect the asymmetric competition between submerged macrophytes and periphyton for light and nutrients. While rooted macrophytes have superior access to sediment nutrients, periphyton can negatively affect macrophytes by shading. LGD may thus facilitate periphyton production at the expense of macrophyte production, although studies on this hypothesized effect are missing. The research presented in this thesis is aimed at determining how LGD influences periphyton, macrophytes, and the interactions between these benthic producers. Laboratory experiments were combined with field experiments and measurements in an oligo-mesotrophic hard water lake. In the first study, a general concept was developed based on a literature review of the existing knowledge regarding the potential effects of LGD on nutrients and inorganic and organic carbon loads to lakes, and the effect of these loads on periphyton and macrophytes. The second study includes a field survey and experiment examining the effects of LGD on periphyton in an oligotrophic, stratified hard water lake (Lake Stechlin). This study shows that LGD, by mobilizing phosphorus from the sediments, significantly promotes epiphyton growth, especially at the end of the summer season when epilimnetic phosphorus concentrations are low. The third study focuses on the potential effects of LGD on submerged macrophytes in Lake Stechlin. This study revealed that LGD may have contributed to an observed change in macrophyte community composition and abundance in the shallow littoral areas of the lake. Finally, a laboratory experiment was conducted which mimicked the conditions of a seepage lake. Groundwater circulation was shown to mobilize nutrients from the sediments, which significantly promoted periphyton growth. Macrophyte growth was negatively affected at high periphyton biomasses, confirming the initial hypothesis. More generally, this thesis shows that groundwater flowing into nutrient-limited lakes may import or mobilize nutrients. These nutrients first promote periphyton, and subsequently provoke radical changes in macrophyte populations before finally having a possible influence on the lake’s trophic state. Hence, the eutrophying effect of groundwater is delayed and, at moderate nutrient loading rates, partly dampened by benthic primary producers. The present research emphasizes the importance and complexity of littoral processes, and the need to further investigate and monitor the benthic environment. As present and future global changes can significantly affect LGD, the understanding of these complex interactions is required for the sustainable management of lake water quality. N2 - Im Uferbereich von Seen bestimmen eine Vielzahl von Prozessen das ökologische Gefüge und die Wasserqualität. Grundwasserzustrom, welcher häufig im Uferbereich eines Sees auftritt, kann zum Import von Nährstoffen führen und so signifikant zur Eutrophierung eines Gewässers beitragen. Darüber hinaus bildet der Uferbereich von Seen das Habitat für benthische Primärproduzenten wie Makrophyten (Wasserpflanzen) und Periphyton (Aufwuchs), welche eine Schlüsselrolle im Nahrungsnetz von Seen einnehmen und deren Wasserqualität beeinflussen können. Der durch Grundwasser gesteuerte Eintrag von Nährstoffen kann sich unterschiedlich auf die um Licht und Nährstoffe konkurrierenden Makrophyten und Periphyton auswirken. Während Makrophyten häufig über Wurzeln verfügen und damit Nährstoffe aus dem Sediment aufnehmen, kann Periphyton zu einer Beschattung der Makrophyten beitragen. Grundwasserzustrom könnte deshalb durch Nährstoffzufuhr das Wachstum von Periphyton fördern und damit zu einer Abnahme der Makrophytenabundanz führen. Die in dieser Doktorarbeit vorgestellten Forschungsergebnisse zeigen den Einfluss von einströmendem Grundwasser in Seen auf Makrophyten und Periphyton, und insbesondere die Interaktionen zwischen diesen beiden benthischen Primärproduzenten. Dafür wurden Laborexperimente, sowie Feldexperimente und Messungen in einem oligo-mesotrophen, kalkreichen See miteinander kombiniert. In der ersten Studie wurden im Rahmen einer Literaturrecherche die Auswirkungen des Einstroms von Grundwasser auf das Wachstum von Makrophyten und Periphyton untersucht. Dafür wurden Einträge von Nährstoffen sowie anorganischem und organischem Kohlenstoff berücksichtigt und abschließend ein Konzept entwickelt, das die Interaktion zwischen benthischen Primärproduzenten betrachtet. Die zweite Studie zeigt den Einfluss von Grundwasser auf das Wachstum von Periphyton im geschichteten, oligo-mesotrophen, kalkreichen Stechlinsee (Brandenburg) auf der Basis von Freilanduntersuchungen und -experimenten. Es konnte nachgewiesen werden, dass einströmendes Grundwasser Phosphor aus dem Sediment mobilisiert und so das Wachstum von Periphyton signifikant fördert. Dies war insbesondere am Ende des Sommers relevant, wenn Phosphor im Epilimnion nur noch in sehr geringer Konzentration vorlag. Der Fokus der dritten Studie liegt auf den potenziellen Auswirkungen des Einstroms von Grundwasser auf die Makrophyten in flachen Litoralbereichen des Stechlinsees. Die in den letzten Jahrzehnten beobachteten Veränderungen in der Abundanz und Artenzusammensetzung der Makrophyten, insbesondere der Rückgang der Armleuchteralgen, könnten auch auf Veränderungen im Einstrom von Grundwasser zurückzuführen sein. In der letzten Studie wurden in einem Laborexperiment der Grundwasserzustrom ins Litoral simuliert, um die kombinierte Auswirkung auf Makrophyten- und Periphytonentwicklung unter kontrollierten Umweltbedingungen zu testen. Die Ergebnisse bestätigen die Hypothese, dass die durch den Grundwasserzustrom mobilisierten Nährstoffe aus dem Sediment das Wachstum von Periphyton fördern. Oberhalb eines Grenzwertes der Periphytonbiomasse wird die Entwicklung von Makrophyten behindert. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass einströmendes Grundwasser zur Mobilisierung und zum Import von Nährstoffen in Seen führen kann und damit weitreichende Konsequenzen für das ökologische Gefüge und die Wasserqualität haben kann. Die grundwassergesteuerte Nährstoffzufuhr fördert das Wachstum von Periphyton und führt bei genügend großer Periphytonbiomasse zu Änderungen der Makrophytenpopulation bis hin zum Verlust. Die Arbeit verdeutlicht die Relevanz und Komplexität von Prozessen im Litoral von Seen und zeigt zugleich die Notwendigkeit auf, diese benthische Habitate tiefgreifender zu untersuchen. Da globale Veränderungen des Klimas einen weitreichenden Einfluss auf den Grundwassereinstrom in Seen haben können, ist es von entscheidender Bedeutung, die komplexen Auswirkungen dieser Prozesse zu verstehen, um einen nachhaltigen Schutz dieser Ökosysteme zu gewährleisten. KW - groundwater KW - littoral eutrophication KW - benthic primary producers KW - asymmetric competition KW - macrophytes KW - periphyton KW - Grundwasser KW - Makrophyten KW - Periphyton KW - Eutrophierung KW - Litoral KW - benthische Primärproduzenten KW - asymmetrische Konkurrenz Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-406883 ER - TY - THES A1 - Tronci, Giuseppe T1 - Synthesis, characterization, and biological evaluation of gelatin-based scaffolds T1 - Synthese, Charakterisierung und biologische Evaluierung Gelatine-basierter Scaffolds N2 - This work presents the development of entropy-elastic gelatin based networks in the form of films or scaffolds. The materials have good prospects for biomedical applications, especially in the context of bone regeneration. Entropy-elastic gelatin based hydrogel films with varying crosslinking densities were prepared with tailored mechanical properties. Gelatin was covalently crosslinked above its sol gel transition, which suppressed the gelatin chain helicity. Hexamethylene diisocyanate (HDI) or ethyl ester lysine diisocyanate (LDI) were applied as chemical crosslinkers, and the reaction was conducted either in dimethyl sulfoxide (DMSO) or water. Amorphous films were prepared as measured by Wide Angle X-ray Scattering (WAXS), with tailorable degrees of swelling (Q: 300-800 vol. %) and wet state Young’s modulus (E: 70 740 kPa). Model reactions showed that the crosslinking reaction resulted in a combination of direct crosslinks (3-13 mol.-%), grafting (5-40 mol.-%), and blending of oligoureas (16-67 mol.-%). The knowledge gained with this bulk material was transferred to the integrated process of foaming and crosslinking to obtain porous 3-D gelatin-based scaffolds. For this purpose, a gelatin solution was foamed in the presence of a surfactant, Saponin, and the resulting foam was fixed by chemical crosslinking with a diisocyanate. The amorphous crosslinked scaffolds were synthesized with varied gelatin and HDI concentrations, and analyzed in the dry state by micro computed tomography (µCT, porosity: 65±11–73±14 vol.-%), and scanning electron microscopy (SEM, pore size: 117±28–166±32 µm). Subsequently, the work focused on the characterization of the gelatin scaffolds in conditions relevant to biomedical applications. Scaffolds showed high water uptake (H: 630-1680 wt.-%) with minimal changes in outer dimension. Since a decreased scaffold pore size (115±47–130±49 µm) was revealed using confocal laser scanning microscopy (CLSM) upon wetting, the form stability could be explained. Shape recoverability was observed after removal of stress when compressing wet scaffolds, while dry scaffolds maintained the compressed shape. This was explained by a reduction of the glass transition temperature upon equilibration with water (dynamic mechanical analysis at varied temperature (DMTA)). The composition dependent compression moduli (Ec: 10 50 kPa) were comparable to the bulk micromechanical Young’s moduli, which were measured by atomic force microscopy (AFM). The hydrolytic degradation profile could be adjusted, and a controlled decrease of mechanical properties was observed. Partially-degraded scaffolds displayed an increase of pore size. This was likely due to the pore wall disintegration during degradation, which caused the pores to merge. The scaffold cytotoxicity and immunologic responses were analyzed. The porous scaffolds enabled proliferation of human dermal fibroblasts within the implants (up to 90 µm depth). Furthermore, indirect eluate tests were carried out with L929 cells to quantify the material cytotoxic response. Here, the effect of the sterilization method (Ethylene oxide sterilization), crosslinker, and surfactant were analyzed. Fully cytocompatible scaffolds were obtained by using LDI as crosslinker and PEO40 PPO20-PEO40 as surfactant. These investigations were accompanied by a study of the endotoxin material contamination. The formation of medical-grade materials was successfully obtained (<0.5 EU/mL) by using low-endotoxin gelatin and performing all synthetic steps in a laminar flow hood. N2 - Diese Arbeit beschreibt die Entwicklung Entropie-elastischer Gelatine-basierter Netzwerke als Filme und Scaffolds. Mögliche Anwendungen für die entwickelten Materialien liegen im biomedizinischen Bereich, insbesondere der Knochenregeneration. Im ersten Schritt der Arbeit wurden Entropie-elastische, Gelatine-basierte Hydrogel-Filme entwickelt, deren mechanische Eigenschaften durch die Veränderung der Quervernetzungsdichte eingestellt werden konnten. Dazu wurde Gelatine in Lösung oberhalb der Gel-Sol-Übergangstemperatur kovalent quervernetzt, wodurch die Ausbildung helikaler Konformationen unterdrückt wurde. Als Quervernetzer wurden Hexamethylendiisocyanat (HDI) oder Lysindiisocyanat ethylester (LDI) verwendet, und die Reaktionen wurden in Dimethylsulfoxid (DMSO) oder Wasser durchgeführt. Weitwinkel Röntgenstreuungs Spektroskopie (WAXS) zeigte, dass die Netzwerke amorph waren. Der Quellungsgrad (Q: 300-800 vol. %) und der Elastizitätsmodul (E: 70 740 kPa) konnten dabei durch die systematische Veränderung der Quervernetzungsdichte eingestellt werden. Die Analyse der Quervernetzungsreaktion durch Modellreaktionen zeigte, dass die Stabilisierung der Hydrogele sowohl auf kovalente Quervernetzungen (3-13 mol.-%) als auch auf Grafting von (5-40 mol.-%) und Verblendung mit Oligoharnstoffen (16-67 mol.-%) zurückgeführt werden kann. Die Erkenntnisse aus dem Umgang mit dem Bulk-Material wurden dann auf einen integrierten Prozess der Verschäumung und chemischen Quervernetzung transferiert, so dass poröse, dreidimensionale Scaffolds erhalten wurden. Dafür wurde eine wässrige Gelatinelösung in Gegenwart eines Tensids, Saponin, verschäumt, und durch chemische Quervernetzung mit einem Diisocyanat zu einem Scaffold fixiert. Die Scaffolds hergestellt mit unterschiedlichen Mengen HDI und Gelatine, wurden im trockenen Zustand mittels Mikro Computertomographie (µCT, Porosität: 65±11–73±14 vol.-%) und Rasterelektronenmikroskopie (SEM, Porengröße: 117±28–166±32) charakterisiert. Anschließend wurden die Scaffolds unter Bedingungen charakterisiert, die für biomedizinische Anwendungen relevant sind. Die Scaffolds nahmen große Mengen Wasser auf (H: 630 1680 wt.-%) bei nur minimalen Änderungen der äußeren Dimensionen. Konfokale Laser Scanning Mikroskopie zeigte, dass die Wasseraufnahme zu einer verminderten Porengröße führte (115±47–130±49 µm), wodurch die Formstabilität erklärbar ist. Eine Formrückstellung der Scaffolds wurde beobachtet, wenn Scaffolds im nassen Zustand komprimiert wurden und dann entlastet wurden, während trockene Proben in der komprimierten Formen blieben (kalte Deformation). Dieses Entropie-elastische Verhalten der nassen Scaffolds konnte durch die Verminderung der Glasübergangstemperatur des Netzwerks nach Wasseraufnahme erklärt werden (DMTA). Die zusammensetzungsabhängigen Kompressionsmoduli (Ec: 10 50 kPa) waren mit den mikromechanischen Young’s moduli vergleichbar, die mittels Rasterkraftmikroskopie (AFM) gemessen wurden. Das hydrolytische Degradationsprofil konnte variiert werden, und während des Abbaus kam es nur zu kontrolliert-graduellen Änderungen der mechanischen Eigenschaften. Während der Degradation konnte ein Anstieg der mittleren Porengröße beobachtet werden, was durch das Verschmelzen von Poren durch den Abbau der Wände erklärt werden kann. Die Endotoxinbelastung und die Zytotoxizität der Scaffolds wurden untersucht. Humane Haut-Fibroblasten wuchsen auf und innerhalb der Scaffolds (bis zu einer Tiefe von 90 µm). Indirekte Eluat-Tests mit L929 Mausfibroblasten wurden genutzt, um die Zytotoxizität der Materialien, insbesondere den Einfluss des Quervernetzertyps und des Tensids, zu bestimmen. Vollständig biokompatible Materialien wurden erzielt, wenn LDI als Quervernetzer und PEO40 PPO20-PEO40 als Tensid verwendet wurden. Durch den Einsatz von Gelatine mit geringem Endotoxin-Gehalt, und die Synthese in einer Sterilarbeitsblank konnten Materialien für medizinische Anwendungen (Endotoxin-Gehalt < 0.5 EU/mL) hergestellt werden. KW - Hydrogele KW - Polymer-Netzwerke KW - Gelatine KW - poröse Gerüste KW - Abbau KW - regenerative Medizin KW - hydrogels KW - polymer networks KW - gelatin KW - porous scaffolds KW - degradation KW - regenerative medicine Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-49727 ER - TY - THES A1 - Lohmann, Dirk T1 - Sustainable management of semi-arid African savannas under environmental and political change T1 - Nachhaltige Nutzung semiarider Savannen in Afrika unter dem Einfluss von klimatischem und politischem Wandel N2 - Drylands cover about 40% of the earth’s land surface and provide the basis for the livelihoods of 38% of the global human population. Worldwide, these ecosystems are prone to heavy degradation. Increasing levels of dryland degradation result a strong decline of ecosystem services. In addition, in highly variable semi-arid environments changing future environmental conditions will potentially have severe consequences for productivity and ecosystem dynamics. Hence, global efforts have to be made to understand the particular causes and consequences of dryland degradation and to promote sustainable management options for semi-arid and arid ecosystems in a changing world. Here I particularly address the problem of semi-arid savanna degradation, which mostly occurs in form of woody plant encroachment. At this, I aim at finding viable sustainable management strategies and improving the general understanding of semi-arid savanna vegetation dynamics under conditions of extensive livestock production. Moreover, the influence of external forces, i.e. environmental change and land reform, on the use of savanna vegetation and on the ecosystem response to this land use is assessed. Based on this I identify conditions and strategies that facilitate a sustainable use of semi-arid savanna rangelands in a changing world. I extended an eco-hydrological model to simulate rangeland vegetation dynamics for a typical semi-arid savanna in eastern Namibia. In particular, I identified the response of semi-arid savanna vegetation to different land use strategies (including fire management) also with regard to different predicted precipitation, temperature and CO2 regimes. Not only environmental but also economic and political constraints like e.g. land reform programmes are shaping rangeland management strategies. Hence, I aimed at understanding the effects of the ongoing process of land reform in southern Africa on land use and the semi-arid savanna vegetation. Therefore, I developed and implemented an agent-based ecological-economic modelling tool for interactive role plays with land users. This tool was applied in an interdisciplinary empirical study to identify general patterns of management decisions and the between-farm cooperation of land reform beneficiaries in eastern Namibia. The eco-hydrological simulations revealed that the future dynamics of semi-arid savanna vegetation strongly depend on the respective climate change scenario. In particular, I found that the capacity of the system to sustain domestic livestock production will strongly depend on changes in the amount and temporal distribution of precipitation. In addition, my simulations revealed that shrub encroachment will become less likely under future climatic conditions although positive effects of CO2 on woody plant growth and transpiration have been considered. While earlier studies predicted a further increase in shrub encroachment due to increased levels of atmospheric CO2, my contrary finding is based on the negative impacts of temperature increase on the drought sensitive seedling germination and establishment of woody plant species. Further simulation experiments revealed that prescribed fires are an efficient tool for semi-arid rangeland management, since they suppress woody plant seedling establishment. The strategies tested have increased the long term productivity of the savanna in terms of livestock production and decreased the risk for shrub encroachment (i.e. savanna degradation). This finding refutes the views promoted by existing studies, which state that fires are of minor importance for the vegetation dynamics of semi-arid and arid savannas. Again, the difference in predictions is related to the bottleneck at the seedling establishment stage of woody plants, which has not been sufficiently considered in earlier studies. The ecological-economic role plays with Namibian land reform beneficiaries showed that the farmers made their decisions with regard to herd size adjustments according to economic but not according to environmental variables. Hence, they do not manage opportunistically by tracking grass biomass availability but rather apply conservative management strategies with low stocking rates. This implies that under the given circumstances the management of these farmers will not per se cause (or further worsen) the problem of savanna degradation and shrub encroachment due to overgrazing. However, as my results indicate that this management strategy is rather based on high financial pressure, it is not an indicator for successful rangeland management. Rather, farmers struggle hard to make any positive revenue from their farming business and the success of the Namibian land reform is currently disputable. The role-plays also revealed that cooperation between farmers is difficult even though obligatory due to the often small farm sizes. I thus propose that cooperation needs to be facilitated to improve the success of land reform beneficiaries. N2 - Semiaride (halbtrockene) Savannen bedecken große Teile der Erdoberfläche und sichern die Lebensgrundlage von vielen Millionen Menschen. Die häufigste Form der Landnutzung in diesen Trockengebieten ist die Produktion von Vieh in extensiver Weidelandbewirtschaftung. In Folge klimatischer Veränderungen und als Konsequenz aus der teils intensiven Beweidung dieser Trockengebiete kommt es häufig zur Degradierung derselben in Form einer Zunahme von ‚unerwünschter‘ holziger Vegetation auf Kosten von futterverwertbaren Gräsern. Dieser als Verbuschung bezeichnete Prozess hat schwere negative Auswirkungen auf die betroffenen Ökosysteme und ist die Ursache für einen zunehmenden Rückgang der ökonomischen Leistungsfähigkeit der betroffenen Betriebe. In meiner Dissertation befasse ich mich mit den Auswirkungen von Klimawandel und politischen Veränderungen auf die Savannenvegetation im südlichen Afrika und auf die Möglichkeiten für die Nutzung dieser Ökosysteme in Form von Viehwirtschaft. Hierbei möchte ich sowohl das allgemeine Verständnis der ökologischen Zusammenhänge verbessern, als auch Strategien für die nachhaltige Nutzung der Savannen identifizieren und bewerten. Da nicht nur ökologische, sondern auch ökonomische und politische Einflussfaktoren, wie zum Beispiel die umfangreichen Landumverteilungen im Rahmen der Bodenreform im südlichen Afrika auf die tatsächliche Landnutzung wirken, habe ich im Rahmen der Dissertation zudem untersucht, nach welchen Umwelt und Kapitalvariablen sich die Farmer, welche Ihr Land im Rahmen der Bodenreform zugeteilt bekommen haben, bei Ihren Entscheidungen richten. Methodisch verwende ich verschiedene Simulationsmodelle, welche zur Untersuchung der langfristigen Veränderungen von verschiedensten Szenarien (Klimawandel, Landnutzung) geeignet sind. Hierbei habe ich teilweise bestehende Modelle angepasst, aber auch ein neues Modell, welches zur Befragung von Farmern in Namibia verwendet wurde, entwickelt. Meine Dissertation führt im Wesentlichen zu vier Erkenntnissen: Erstens, zeigen meine Ergebnisse, welche große Bedeutung die spezifischen ökologischen Eigenschaften der Bäume und Sträucher in semiariden Savannen für die Vorhersage der Entwicklung dieser Systeme unter Klimawandel hat. Hierbei zeigte sich, dass insbesondere die Sensitivität der Keimlinge gegenüber Trockenheit und Feuer eine entscheidende Rolle spielt. Daraus folgt die zweite wesentliche Erkenntnis: Feuer eignet sich in herausragender Weise, um halbtrockene Savannen vor der Verbuschung zu bewahren. Drittens haben die Rollenspiele mit Farmern in Namibia gezeigt, dass deren Entscheidungen im Wesentlichen von finanziellen Schwierigkeiten und nicht von Umwelteinflüssen getrieben werden. Dennoch zeigten meine Ergebnisse, dass diese Farmer mit Ihrem derzeitigen Verhalten wahrscheinlich nicht zur weiteren Degradierung der Savannenvegetation beitragen. Die vierte, und mit am bedeutendste Erkenntnis aus meiner Arbeit ist, dass konservative Beweidungsstrategien mit geringen und konstanten Viehdichten notwendig sind um semiaride Savannen dauerhaft in ökologisch und ökonomisch nachhaltiger Weise zu Nutzen. KW - Savanne KW - nachhaltige Landnutzung KW - ökohydrologische Modellierung KW - Land Reform KW - Klimawandel KW - Savanna KW - sustainable land use KW - eco-hydrological modelling KW - land reform KW - climate change Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-65069 ER - TY - THES A1 - Junker, Björn H. T1 - Sucrose breakdown in the potato tuber N2 - In dieser Arbeit wurden verschiedene Ansätze verfolgt, um das Verständnis des Saccharose-zu-Stärke Stoffwechselweges in sich entwickelnden Kartoffelknollen zu untersuchen. Zunächst wurde ein induzierbares Genexpressions-System aus dem Schimmelpilz Aspergillus nidulans für die Untersuchung des Metabolismus von Kartoffelknollen optimiert. Es wurde herausgefunden, dass dieses sogenannte alc system schneller auf Acetaldehyd reagiert als auf Ethanol, und dass Acetaldehyd weniger Seiteneffekte auf den Metabolismus hat. Die optimalen Induktionsbedingungen wurden dann benutzt um die Effekte einer zeitlich kontrollierten zytosolischen Expression einer Hefe-Invertase auf den Metabolismus der Kartoffelknolle zu untersuchen. Die beobachteten Unterschiede zwischen induzierter und konstitutiver Expression der Invertase führten zu der Feststellung, dass die Glycolyse erst induziert wird nachdem ein ATP-Mangel durch erhöhtes Saccharose-Cycling kreiert wurde. Weiterhin lassen die Ergebnisse darauf schließen, dass Maltose in der Kartoffelknolle eher ein Produkt der Kondensation zweier Glucose-Einheiten ist statt ein Produkt des Stärke-Abbaus zu sein. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die Expression einer Hefe-Invertase in der Vakuole von Kartoffelknollen ähnliche Effekte auf deren Metabolismus hat wie die Expression des gleichen Enzymes im Apoplasten. Diese Beobachtung ist ein weiterer Beleg für die Präsenz eines Mechanismus, bei dem Saccharose mittels Endozytose in die Vakuole aufgenommen wird anstatt über Transporter direkt ins Zytosol aufgenommen zu werden. Zum Schluß wird ein kinetisches Modell des Saccharose-Abbaus vorgestellt, das in der Lage ist diesen Teil des Stoffwechsels der Kartoffelknolle quantitativ zu simulieren. Weiterhin kann dieses Modell die metabolischen Effekte der Einführung einer Hefe-Invertase in das Zytosol von Kartoffelknollen mit erstaunlicher Präzision vorhersagen. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass induzierbare Genexpression sowie Computermodelle von Stoffwechselwegen nützliche Hilfsmittel für eine Verbesserung des Verständnisses des Pflanzenmetabolismus sind. N2 - In this work different approaches are undertaken to improve the understanding of the sucrose-to-starch pathway in developing potato tubers. At first an inducible gene expression system from fungal origin is optimised for the use of studying metabolism in the potato tuber. It is found that the alc system from Aspergillus nidulans responds more rapidly to acetaldehyde than ethanol, and that acetaldehyde has less side-effects on metabolism. The optimal induction conditions then are used to study the effects of temporally controlled cytosolic expression of a yeast invertase on metabolism of potato tubers. The observed differences between induced and constitutive expression of the invertase lead to the conclusion that glycolysis is induced after an ATP demand has been created by an increase in sucrose cycling. Furthermore, the data suggest that in the potato tuber maltose is a product of glucose condensation rather than starch degradation. In the second part of the work it is shown that the expression of a yeast invertase in the vacuole of potato tubers has similar effects on metabolism than the expression of the same enzyme in the apoplast. These observations give further evidence to the presence of a mechanism by which sucrose is taken up via endocytosis to the vacuole rather than via transporters directly to the cytosol. Finally, a kinetic in silico model of sucrose breakdown is presented that is able to simulate this part of potato tuber metabolism on a quantitative level. Furthermore, it can predict the metabolic effects of the introduction of a yeast invertase in the cytosol of potato tubers with an astonishing precision. In summary, these data prove that inducible gene expression and kinetic computer models of metabolic pathways are useful tools to greatly improve the understanding of plant metabolism. T2 - Sucrose breakdown in the potato tuber KW - Saccharose KW - Solanum tuberosum KW - Invertase KW - induzierbare Genexpression KW - Stoffwechselmodellierung KW - sucrose KW - Solanum tuberosum KW - invertase KW - inducible gene expression KW - metabolic modelling Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0001673 ER - TY - THES A1 - Vosloh, Daniel T1 - Subcellular compartmentation of primary carbon metabolism in mesophyll cells of Arabidopsis thaliana T1 - Subzelluläre Kompartimentierung des primären Kohlenstoffmetabolismus in Mesophyllzellen von Arabidopsis thaliana N2 - Metabolismus in Pflanzenzellen ist stark kompartimentiert. Viele Stoffwechselwege haben Reaktionen in mehr als einem Kompartiment. Zum Beispiel wird während der Photosynthese in pflanzlichen Mesophyllzellen Kohlenstoff in Form von Stärke in den Chloroplasten synthetisiert, während es im Zytosol in Form von Sacharose gebildet und in der Vakuole gespeichert wird. Diese Reaktionen sind strikt reguliert um ein Gleichgewicht der Kohlenstoffpools der verschiedenen Kompartimente aufrecht zu erhalten und die Energieversorgung aller Teile der Zelle für anabolische Reaktionen sicher zu stellen. Ich wende eine Methode an, bei der die Zellen unter nicht-wässrigen Bedingungen fraktioniert werden und daher der metabolische Status der während der Ernte herrschte über den ganzen Zeitraum der Auftrennung beibehalten wird. Durch die Kombination von nichtwässriger Fraktionierung und verschiedener Massenspektrometrietechniken (Flüssigchromotagraphie- und Gaschromotagraphie basierende Massenspekrometrie) ist es möglich die intrazelluläre Verteilung der meisten Intermediate des photosynthetischen Kohlenstoffstoffwechsels und der Produkte der nachgelagerten metabolischen Reaktionen zu bestimmen. Das Wissen über die in vivo Konzentrationen dieser Metabolite wurde genutzt um die Änderung der freien Gibbs Energie in vivo zu bestimmen. Mit Hilfe dessen kann bestimmt werden, welche Reaktion sich in einem Gleichgewichtszustand befinden und welche davon entfernt sind. Die Konzentration der Enzyme und der Km Werte wurden mit den Konzentrationen der Metabolite in vivo verglichen, um festzustellen, welche Enzyme substratlimitiert sind und somit sensitiv gegenüber Änderungen der Substratkonzentration sind. Verschiedene Intermediate des Calvin-Benson Zyklus sind gleichzeitig Substrate für andere Stoffwechselwege, als da wären Dihyroxyaceton-phosphat (DHAP, Saccharosesynthese), Fructose 6-phosphat (Fru6P, Stärkesynthese), Erythrose 4-phosphat (E4P, Shikimat Stoffwechselweg) und Ribose 5-phosphat (R5P, Nukleotidbiosynthese). Die Enzyme, die diese Intermediate verstoffwechseln, liegen an den Abzweigungspunkten zu diesen Stoffwechselwegen. Diese sind Trisose phosphat isomerase (DHAP), Transketolase (E4P), Sedoheptulose-1,7 biphosphat aldolase (E4P) und Ribose-5-phosphat isomerase (R5P), welche nicht mit ihren Substraten gesättigt sind, da die jeweilige Substratkonzentration geringer als der zugehörige Km Wert ist. Für metabolische Kontrolle bedeutet dies, dass diese Schritte am sensitivsten gegenüber Änderungen der Substratkonzentrationen sind. Im Gegensatz dazu sind die regulierten irreversiblen Schritte von Fructose-1,6.biphosphatase und Sedoheptulose-1,7-biphosphatase relativ insensitiv gegenüber Änderungen der Substratkonzentration. Für den Stoffwechselweg der Saccharosesynthese konnte gezeigt werden, dass die zytosolische Aldolase eine geringer Bindeseitenkonzentration als Substratkonzentration (DHAP) aufweist, und dass die Konzentration von Saccharose-6-phosphat geringer als der Km Wert des synthetisierenden Enzyms Saccharose-phosphatase ist. Sowohl die Saccharose-phosphat-synthase, also auch die Saccharose-phosphatase sind in vivo weit von einem Gleichgewichtszustand entfernt. In Wildtyp Arabidopsis thaliana Columbia-0 Blättern wurde der gesamte Pool von ADPGlc im Chloroplasten gefunden. Das Enzyme ADPGlc pyrophosphorylase ist im Chloroplasten lokalisiert und synthetisiert ADPGlc aus ATP und Glc1P. Dieses Verteilungsmuster spricht eindeutig gegen die Hypothese von Pozueta-Romero und Kollegen, dass ADPGlc im Zytosol durch ADP vermittelte Spaltung von Saccharose durch die Saccharose Synthase erzeugt wird. Basierend auf dieser Beobachtung und anderen veröffentlichten Ergebnissen wurde geschlußfolgert, dass der generell akzeptierte Stoffwechselweg der Stärkesynthese durch ADPGlc Produktion via ADPGlc pyrophosphorylase in den Chloroplasten korrekt ist, und die Hypothese des alternativen Stoffwechselweges unhaltbar ist. Innerhalb des Stoffwechselweges der Saccharosesynthsese wurde festgestellt, dass die Konzentration von ADPGlc geringer als der Km Wert des Stärkesynthase ist, was darauf hindeutet, dass das Enzym substratlimitiert ist. Eine generelle Beobachtung ist, dass viele Enzmye des Calvin-Benson Zyklus ähnliche Bindeseitenkonzentrationen wie Metabolitkonzentrationen aufweisen, wohingegen in den Synthesewegen von Saccharose und Stärke die Bindeseitenkonzentrationen der Enzyme viel geringer als die Metabolitkonzentrationen sind. N2 - Metabolism in plant cells is highly compartmented, with many pathways involving reactions in more than one compartment. For example, during photosynthesis in leaf mesophyll cells, primary carbon fixation and starch synthesis take place in the chloroplast, whereas sucrose is synthesized in the cytosol and stored in the vacuole. These reactions are tightly regulated to keep a fine balance between the carbon pools of the different compartments and to fulfil the energy needs of the organelles. I applied a technique which fractionates the cells under non-aqueous conditions, whereby the metabolic state is frozen at the time of harvest and held in stasis throughout the fractionation procedure. With the combination of non-aqueous fractionation and mass spectrometry based metabolite measurements (LC-MS/MS, GC-MS) it was possible to investigate the intracellular distributions of the intermediates of photosynthetic carbon metabolism and its products in subsequent metabolic reactions. With the knowledge about the in vivo concentrations of these metabolites under steady state photosynthesis conditions it was possible to calculate the mass action ratio and change in Gibbs free energy in vivo for each reaction in the pathway, to determine which reactions are near equilibrium and which are far removed from equilibrium. The Km value and concentration of each enzyme were compared with the concentrations of its substrates in vivo to assess which reactions are substrate limited and so sensitive to changes in substrate concentration. Several intermediates of the Calvin-Benson cycle are substrates for other pathways, including dihydroxyacetone-phosphate (DHAP,sucrose synthesis), fructose 6-phosphate (Fru6P, starch synthesis), erythrose 4-phosphate (E4P,shikimate pathway) and ribose 5-phosphate (R5P, nucleotide synthesis). Several of the enzymes that metabolise these intermediates, and so lie at branch points in the pathway, are triose-phosphate isomerase (DHAP), transketolase (E4P, Fru6P), sedoheptulose-1,7-bisphosphate aldolase (E4P) and ribose-5-phosphate isomerase (R5P) are not saturated with their respective substrate as the metabolite concentration is lower than the respective Km value. In terms of metabolic control these are the steps that are most sensitive to changes in substrate availability, while the regulated irreversible reactions of fructose-1,6-bisphosphatase and sedoheptulose-1,7-bisphosphatase are relatively insensitive to changes in the concentrations of their substrates. In the pathway of sucrose synthesis it was shown that the concentration of the catalytic binding site of the cytosolic aldolase is lower than the substrate concentration of DHAP, and that the concentration of Suc6P is lower than the Km of sucrose-phosphatase for this substrate. Both the sucrose-phosphate synthase and sucrose-phosphatase reactions are far removed from equilibrium in vivo. In wild type A. thaliana Columbia-0 leaves, all of the ADPGlc was found to be localised in the chloroplasts. ADPglucose pyrophosphorylase is localised to the chloroplast and synthesises ADPGlc from ATP and Glc1P. This distribution argues strongly against the hypothesis proposed by Pozueta-Romero and colleagues that ADPGlc for starch synthesis is produced in the cytosol via ADP-mediated cleavage of sucrose by sucrose synthase. Based on this observation and other published data it was concluded that the generally accepted pathway of starch synthesis from ADPGlc produced by ADPglucose pyrophosphorylase in the chloroplasts is correct, and that the alternative pathway is untenable. Within the pathway of starch synthesis the concentration of ADPGlc was found to be well below the Km value of starch synthase for ADPGlc, indicating that the enzyme is substrate limited. A general finding in the comparison of the Calvin-Benson cycle with the synthesis pathways of sucrose and starch is that many enzymes in the Calvin Benson cycle have active binding site concentrations that are close to the metabolite concentrations, while for nearly all enzymes in the synthesis pathways the active binding site concentrations are much lower than the metabolite concentrations. KW - Pflanze KW - Kohlenstoffmetabolismus KW - Mesophyll KW - Zelle KW - plant KW - carbon metabolism KW - mesophyll KW - cell Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-55534 ER - TY - THES A1 - Gehmlich, Katja T1 - Strukturen der Kraftübertragung im quergestreiften Muskel : Protein-Protein-Wechselwirkungen und Regulationsmechanismen T1 - Structures of force transduction in cross-striated muscle tissues : protein-protein interactions and mechanisms of their regulation N2 - Im Mittelpunkt dieser Arbeit standen Signaltransduktionsprozesse in den Strukturen der Kraftübertragung quergestreifter Muskelzellen, d. h. in den Costameren (Zell-Matrix-Kontakten) und den Glanzstreifen (Zell-Zell-Kontakten der Kardiomyozyten).Es ließ sich zeigen, dass sich die Morphologie der Zell-Matrix-Kontakte während der Differenzierung von Skelettmuskelzellen dramatisch ändert, was mit einer veränderten Proteinzusammensetzung einhergeht. Immunfluoreszenz-Analysen von Skelettmuskelzellen verschiedener Differenzierungsstadien implizieren, dass die Signalwege, welche die Dynamik der Fokalkontakte in Nichtmuskelzellen bestimmen, nur für frühe Stadien der Muskeldifferenzierung Relevanz haben können. Ausgehend von diesem Befund wurde begonnen, noch unbekannte Signalwege zu identifizieren, welche die Ausbildung von Costameren kontrollieren: In den Vorläuferstrukturen der Costamere gelang es, eine transiente Interaktion der Proteine Paxillin und Ponsin zu identifizieren. Biochemische Untersuchungen legen nahe, dass Ponsin über eine Skelettmuskel-spezifische Insertion im Carboxyterminus das Adapterprotein Nck2 in diesen Komplex rekrutiert. Es wird vorgeschlagen, dass die drei Proteine einen ternären Signalkomplex bilden, der die Umbauvorgänge der Zell-Matrix-Kontakte kontrolliert und dessen Aktivität von mitogen activated protein kinases (MAPK) reguliert wird.Die Anpassungsvorgänge der Strukturen der Kraftübertragung an pathologische Situtation (Kardiomyopathien) in der adulten quergestreiften Muskulatur wurden ausgehend von einem zweiten Protein, dem muscle LIM protein (MLP), untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass ein mutiertes MLP-Protein, das im Menschen eine hypertrophe Kardiomyopathie (HCM) auslöst, strukturelle Defekte aufweist und weniger stabil ist. Weiterhin zeigte dieses mutierte Protein eine verringerte Bindungsfähigkeit an die beiden Liganden N-RAP und alpha-Actinin. Die molekulare Grundlage der HCM-verursachenden Mutationen im MLP-Gen könnte folglich eine Veränderung der Homöostase im ternären Komplex MLP – N-RAP – alpha-Actinin sein. Die Expressionsdaten eines neu generierten monoklonalen MLP-Antikörpers deuten darauf hin, dass die Funktionen des MLP nicht nur für die Integrität des Myokards, sondern auch für die der Skelettmuskulatur notwendig sind. N2 - The cell-matrix-contacts (costameres) and cell-cell-contacts (intercalated discs of cardiomyocytes) of cross-striated muscle cells transmit mechanical forces to the exterior. On top of this mechanical function, both structures have been implied to be involved in signal transduction processes.Dramatic morphological changes in the overall structure of cell-matrix-contacts of skeletal muscle cells were revealed during differentiation. Moreover, this reorganisation was accompanied by alterations in protein composition. Immunofluorescence microscopy indicated that signalling pathways which control the dynamics of focal contacts in non-muscle cells seem to be important only for early differentiation stages of skeletal muscle cells. To explore novel signalling pathways involved in regulating the formation of costameres, signalling molecules engaged were identified. Thus, paxillin and ponsin transiently interact at the precursors of costameres during muscle development. In addition, biochemical data indicate that a skeletal muscle specific module in the carboxyterminal part of ponsin can recruit the adapter protein Nck2 to this complex. Hence, the three proteins might form a ternary signalling complex involved in controlling the reorganisation of cell-matrix-contacts. Apparently, the activity of this signalling complex is regulated by mitogen activated protein kinases (MAPK).A second approach has focussed on adaptational processes of the same structures observed in pathological situations. In particular, the role of muscle LIM protein (MLP) in hypertrophic cardiomyopathy (HCM) was investigated. It was shown that a HCM-causing mutant MLP protein fails to fold properly and that the consequent loss of stability is reflected in altered binding properties: the mutant MLP protein shows decreased binding to both N-RAP and alpha-actinin. Hence, the molecular basis for HCM-causing mutations in the MLP gene might be an altered homeostasis of the ternary complex MLP – N-RAP – alpha-actinin. Increasing evidence indicates that the functions of MLP are required not only for the integrity of the myocardium. In addition, MLP seems to have regulatory functions in skeletal muscle tissues. KW - Herzmuskelkrankheit KW - Quergestreifte Muskulatur KW - Protein-Protein-Wechselwirkung KW - Phosphorylierung KW - Costamer KW - Fokalkontakt KW - Zell-Matrix-Kontakt KW - Ponsin KW - Muscle LIM Protein (MLP) KW - protein-protein interactions KW - costamere KW - focal adhesion KW - ponsin KW - cross-striated muscle cells Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-2576 ER - TY - THES A1 - Raatz, Michael T1 - Strategies within predator-prey interactions – from individuals to ecosystems T1 - Strategien in Räuber-Beute Interaktionen – vom Individuum bis zum Ökosystem N2 - Predator-prey interactions provide central links in food webs. These interaction are directly or indirectly impacted by a number of factors. These factors range from physiological characteristics of individual organisms, over specifics of their interaction to impacts of the environment. They may generate the potential for the application of different strategies by predators and prey. Within this thesis, I modelled predator-prey interactions and investigated a broad range of different factors driving the application of certain strategies, that affect the individuals or their populations. In doing so, I focused on phytoplankton-zooplankton systems as established model systems of predator-prey interactions. At the level of predator physiology I proposed, and partly confirmed, adaptations to fluctuating availability of co-limiting nutrients as beneficial strategies. These may allow to store ingested nutrients or to regulate the effort put into nutrient assimilation. We found that these two strategies are beneficial at different fluctuation frequencies of the nutrients, but may positively interact at intermediate frequencies. The corresponding experiments supported our model results. We found that the temporal structure of nutrient fluctuations indeed has strong effects on the juvenile somatic growth rate of {\itshape Daphnia}. Predator colimitation by energy and essential biochemical nutrients gave rise to another physiological strategy. High-quality prey species may render themselves indispensable in a scenario of predator-mediated coexistence by being the only source of essential biochemical nutrients, such as cholesterol. Thereby, the high-quality prey may even compensate for a lacking defense and ensure its persistence in competition with other more defended prey species. We found a similar effect in a model where algae and bacteria compete for nutrients. Now, being the only source of a compound that is required by the competitor (bacteria) prevented the competitive exclusion of the algae. In this case, the essential compounds were the organic carbon provided by the algae. Here again, being indispensable served as a prey strategy that ensured its coexistence. The latter scenario also gave rise to the application of the two metabolic strategies of autotrophy and heterotrophy by algae and bacteria, respectively. We found that their coexistence allowed the recycling of resources in a microbial loop that would otherwise be lost. Instead, these resources were made available to higher trophic levels, increasing the trophic transfer efficiency in food webs. The predation process comprises the next higher level of factors shaping the predator-prey interaction, besides these factors that originated from the functioning or composition of individuals. Here, I focused on defensive mechanisms and investigated multiple scenarios of static or adaptive combinations of prey defense and predator offense. I confirmed and extended earlier reports on the coexistence-promoting effects of partially lower palatability of the prey community. When bacteria and algae are coexisting, a higher palatability of bacteria may increase the average predator biomass, with the side effect of making the population dynamics more regular. This may facilitate experimental investigations and interpretations. If defense and offense are adaptive, this allows organisms to maximize their growth rate. Besides this fitness-enhancing effect, I found that co-adaptation may provide the predator-prey system with the flexibility to buffer external perturbations. On top of these rather internal factors, environmental drivers also affect predator-prey interactions. I showed that environmental nutrient fluctuations may create a spatio-temporal resource heterogeneity that selects for different predator strategies. I hypothesized that this might favour either storage or acclimation specialists, depending on the frequency of the environmental fluctuations. We found that many of these factors promote the coexistence of different strategies and may therefore support and sustain biodiversity. Thus, they might be relevant for the maintenance of crucial ecosystem functions that also affect us humans. Besides this, the richness of factors that impact predator-prey interactions might explain why so many species, especially in the planktonic regime, are able to coexist. N2 - Organismen interagieren miteinander und mit ihrer Umwelt. Innerhalb dieses Netzwerks von Interaktionen sind Fraßbeziehungen zwischen Räubern und ihrer Beute von zentraler Bedeutung. Sie werden auf verschiedenen Ebenen von unterschiedlichen Faktoren beeinflusst, was zur Ausprägung von diversen Strategien von Räuber oder Beute führen kann. Diese Faktoren und die Strategien die sie hervor bringen sind Gegenstand dieser Doktorarbeit. In mehreren Modellierungsstudien habe ich vielseitige Faktoren untersucht, die sich dem Aufbau einzelner Organismen, Verteidigungs- und Angriffsmechanismen sowie Umwelteinflüssen zuordnen lassen. Dabei konzentrierte ich mich auf ein etabliertes Modellsystem zur Erforschung von Räuber-Beute-Dynamiken und untersuchte die Fraßbeziehung zwischen Phytoplankton als Beute und Zooplankton als Räuber. Ich fand heraus, dass die Bereitstellung von essentiellen Ressourcen für Konkurrenten oder Räuber eine Strategie sein kann, mit der Beutearten sich vor dem Aussterben schützen können. Auch die direkte Verteidigung gegen den Räuber ist eine häufige Strategie zur Verringerung des Fraßdrucks und kann ebenfalls Koexistenz fördern. Für anpassungsfähige Verteidigung der Beute und Angriffsstärke des Räubers konnte ich zeigen, dass dies sowohl die Fitness erhöhen, als auch die Robustheit der Räuber-Beute-Dynamiken gegen äußere Störungen erhöhen kann. Weiterhin fand ich heraus, dass physiologische Anpassungsmechanismen wie Speicherung oder anpassungsfähige Aufnahme von Nährstoffen die Wachstumsrate des Räubers verbessern können, wenn die Qualität der verfügbaren Beute in der Umwelt des Räubers fluktuiert. Viele der Strategien, die ich in dieser Arbeit herausgestellt habe, können die Koexistenz von verschiedenen Arten fördern und damit zu erhöhter Biodiversität beitragen, welche wiederum entscheidend ist für die Stabilität von Ökosystemen und deren Nutzbarkeit. KW - predator-prey KW - biodiversity KW - modelling KW - Räuber-Beute KW - Biodiversität KW - Modellierung Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-426587 ER - TY - THES A1 - Folikumah, Makafui Yao T1 - Stimuli-promoted in situ formation of hydrogels with thiol/thioester containing peptide precursors T1 - Stimuli-induzierte In-Situ-Bildung von Hydrogelen durch Peptid-Prekursor mit Thiol/Thioestergruppen N2 - Hydrogels are potential synthetic ECM-like substitutes since they provide functional and structural similarities compared to soft tissues. They can be prepared by crosslinking of macromolecules or by polymerizing suitable precursors. The crosslinks are not necessarily covalent bonds, but could also be formed by physical interactions such as π-π interactions, hydrophobic interactions, or H-bonding. On demand in situ forming hydrogels have garnered increased interest especially for biomedical applications over preformed gels due to the relative ease of in vivo delivery and filling of cavities. The thiol-Michael addition reaction provides a straightforward and robust strategy for in situ gel formation with its fast reaction kinetics and ability to proceed under physiological conditions. The incorporation of a trigger function into a crosslinking system becomes even more interesting since gelling can be controlled with stimulus of choice. The use of small molar mass crosslinker precursors with active groups orthogonal to thiol-Michael reaction type electrophile provides the opportunity to implement an on-demand in situ crosslinking without compromising the fast reaction kinetics. It was postulated that short peptide sequences due to the broad range structural-function relations available with the different constituent amino acids, can be exploited for the realisation of stimuli-promoted in situ covalent crosslinking and gelation applications. The advantages of this system over conventional polymer-polymer hydrogel systems are the ability tune and predict material property at the molecular level. The main aim of this work was to develop a simplified and biologically-friendly stimuli-promoted in situ crosslinking and hydrogelation system using peptide mimetics as latent crosslinkers. The approach aims at using a single thiodepsipeptide sequence to achieve separate pH- and enzyme-promoted gelation systems with little modification to the thiodepsipeptide sequence. The realization of this aim required the completion of three milestones. In the first place, after deciding on the thiol-Michael reaction as an effective in situ crosslinking strategy, a thiodepsipeptide, Ac-Pro-Leu-Gly-SLeu-Leu-Gly-NEtSH (TDP) with expected propensity towards pH-dependent thiol-thioester exchange (TTE) activation, was proposed as a suitable crosslinker precursor for pH-promoted gelation system. Prior to the synthesis of the proposed peptide-mimetic, knowledge of the thiol-Michael reactivity of the would-be activated thiol moiety SH-Leu, which is internally embedded in the thiodepsipeptide was required. In line with pKa requirements for a successful TTE, the reactivity of a more acidic thiol, SH-Phe was also investigated to aid the selection of the best thiol to be incorporated in the thioester bearing peptide based crosslinker precursor. Using ‘pseudo’ 2D-NMR investigations, it was found that only reactions involving SH-Leu yielded the expected thiol-Michael product, an observation that was attributed to the steric hindrance of the bulkier nature of SH-Phe. The fast reaction rates and complete acrylate/maleimide conversion obtained with SH-Leu at pH 7.2 and higher aided the direct elimination of SH-Phe as a potential thiol for the synthesis of the peptide mimetic. Based on the initial studies, for the pH-promoted gelation system, the proposed Ac-Pro-Leu-Gly-SLeu-Leu-Gly-NEtSH was kept unmodified. The subtle difference in pKa values between SH-Leu (thioester thiol) and the terminal cysteamine thiol from theoretical conditions should be enough to effect a ‘pseudo’ intramolecular TTE. In polar protic solvents and under basic aqueous conditions, TDP successfully undergoes a ‘pseudo’ intramolecular TTE reaction to yield an α,ω-dithiol tripeptide, HSLeu-Leu-Gly-NEtSH. The pH dependence of thiolate ion generation by the cysteamine thiol aided the incorporation of the needed stimulus (pH) for the overall success of TTE (activation step) – thiol-Michael addition (crosslinking) strategy. Secondly, with potential biomedical applications in focus, the susceptibility of TDP, like other thioesters, to intermolecular TTE reaction was probed with a group of thiols of varying thiol pKa values, since biological milieu characteristically contain peptide/protein thiols. L-cysteine, which is a biologically relevant thiol, and a small molecular weight thiol, methylthioglycolate both with relatively similar thiol pKa, values, led to an increase concentration of the dithiol crosslinker when reacted with TDP. In the presence of acidic thiols (p-NTP and 4MBA), a decrease in the dithiol concentration was observed, an observation that can be attributed to the inability of the TTE tetrahedral intermediate to dissociate into exchange products and is in line with pKa requirements for successful TTE reaction. These results additionally makes TDP more attractive and the potentially the first crosslinker precursor for applications in biologically relevant media. Finally, the ability of TDP to promote pH-sensitive in situ gel formation was probed with maleimide functionalized 4-arm polyethylene glycol polymers in tris-buffered media of varying pHs. When a 1:1 thiol: maleimide molar ratio was used, TDP-PEG4MAL hydrogels formed within 3, 12 and 24 hours at pH values of 8.5, 8.0 and 7.5 respectively. However, gelation times of 3, 5 and 30 mins were observed for the same pH trend when the thiol: maleimide molar was increased to 2:1. A direct correlation of thiol content with G’ of the gels at each pH could also be drawn by comparing gels with thiol: maleimide ratios of 1:1 to those with 2:1 thiol: maleimide mole ratios. This is supported by the fact that the storage modulus (G') is linearly dependent on the crosslinking density of the polymer. The values of initial G′ for all gels ranged between (200 – 5000 Pa), which falls in the range of elasticities of certain tissue microenvironments for example brain tissue 200 – 1000 Pa and adipose tissue (2500 – 3500 Pa). Knowledge so far gained from the study on the ability to design and tune the exchange reaction of thioester containing peptide mimetic will give those working in the field further insight into the development of new sequences tailored towards specific applications. TTE substrate design using peptide mimetic as presented in this work has revealed interesting new insights considering the state-of-the-art. Using the results obtained as reference, the strategy provides a possibility to extend the concept to the controlled delivery of active molecules needed for other robust and high yielding crosslinking reactions for biomedical applications. Application for this sequentially coupled functional system could be seen e.g. in the treatment of inflamed tissues associated with urinary tract like bladder infections for which pH levels above 7 were reported. By the inclusion of cell adhesion peptide motifs, the hydrogel network formed at this pH could act as a new support layer for the healing of damage epithelium as shown in interfacial gel formation experiments using TDP and PEG4MAL droplets. The versatility of the thiodepsipeptide sequence, Ac-Pro-Leu-Gly-SLeu-Leu-Gly-(TDPo) was extended for the design and synthesis of a MMP-sensitive 4-arm PEG-TDPo conjugate. The purported cleavage of TDPo at the Gly-SLeu bond yields active thiol units for subsequent reaction of orthogonal Michael acceptor moieties. One of the advantages of stimuli-promoted in situ crosslinking systems using short peptides should be the ease of design of required peptide molecules due to the predictability of peptide functions their sequence structure. Consequently the functionalisation of a 4-arm PEG core with the collagenase active TDPo sequence yielded an MMP-sensitive 4-arm thiodepsipeptide-PEG conjugate (PEG4TDPo) substrate. Cleavage studies using thiol flourometric assay in the presence of MMPs -2 and -9 confirmed the susceptibility of PEG4TDPo towards these enzymes. The resulting time-dependent increase in fluorescence intensity in the presence of thiol assay signifies the successful cleavage of TDPo at the Gly-SLeu bond as expected. It was observed that the cleavage studies with thiol flourometric assay introduces a sigmoid non-Michaelis-Menten type kinetic profile, hence making it difficult to accurately determine the enzyme cycling parameters, kcat and KM . Gelation studies with PEG4MAL at 10 % wt. concentrations revealed faster gelation with MMP-2 than MMP-9 with 28 and 40 min gelation times respectively. Possible contributions by hydrolytic cleavage of PEG4TDPo has resulted in the gelation of PEG4MAL blank samples but only after 60 minutes of reaction. From theoretical considerations, the simultaneous gelation reaction would be expected to more negatively impact the enzymatic than hydrolytic cleavage. The exact contributions from hydrolytic cleavage of PEG4TDPo would however require additional studies. In summary this new and simplified in situ crosslinking system using peptide-based crosslinker precursors with tuneable properties exhibited in situ crosslinking gelation kinetics on similar levels with already active dithiols reported. The advantageous on-demand functionality associated with its pH-sensitivity and physiological compatibility makes it a strong candidate worth further research as biomedical applications in general and on-demand material synthesis is concerned. Results from MMP-promoted gelation system unveils a simple but unexplored approach for in situ synthesis of covalently crosslinked soft materials, that could lead to the development of an alternative pathway in addressing cancer metastasis by making use of MMP overexpression as a trigger. This goal has so far not being reach with MMP inhibitors despite the extensive work this regard. N2 - Hydrogele sind synthetische, potenziell ECM-ähnliche Substituenten, die funktionelle und strukturelle Ähnlichkeiten mit Weichteilgeweben aufweisen. Sie können durch Vernetzung von Makromolekülen oder durch Polymerisation geeigneter Precursoren hergestellt werden. Die Vernetzungen müssen nicht unbedingt aus kovalenten Bindungen bestehen, sondern können auch durch physikalische Wechselwirkungen wie π-π-Wechselwirkungen, hydrophoben Wechselwirkungen oder Wasserstoff-Brückenbindungen entstehen. In-situ-Hydrogele, die on-demand gebildet werden, haben vor allem für biomedizinische Anwendungen gegenüber vorgefertigten Gelen zunehmend an Interesse gewonnen, da sie relativ einfach in-vivo eingebracht und somit Fehlstellen gefüllt werden können. Die Thiol-Michael-Additionsreaktion bietet mit ihrer schnellen Reaktionskinetik und ihrer Fähigkeit, unter physiologischen Bedingungen abzulaufen, eine unkomplizierte und robuste Strategie für die in-situ-Gelbildung. Der Einbau einer Triggerfunktion in ein Vernetzungssystem ist besonders interessant, da die Gelierung durch einen gewählten Stimulus gesteuert werden kann. Die Verwendung eines Precursors mit geringer Molmasse und aktiven Gruppen, die orthogonal zu den Elektrophilen des Thiol-Michael-Reaktionstyps sind, bietet die Möglichkeit, eine bedarfsgesteuerte in-situ-Vernetzung zu realisieren, ohne die schnelle Reaktionskinetik zu beeinträchtigen. Es wurde postuliert, dass kurze Peptidsequenzen aufgrund der weitreichenden Struktur-Funktions-Beziehungen, die mit den verschiedenen konstituierenden Aminosäuren zur Verfügung stehen, für die Realisierung von Stimulus-ausgelösten, in-situ kovalenten Vernetzungs- und Gelierungsanwendungen genutzt werden können. Die Vorteile dieses Systems gegenüber herkömmlichen Polymer-Polymer-Hydrogelsystemen liegen in der Möglichkeit, die Materialeigenschaften auf molekularer Ebene zu justieren und vorherzusagen. Das Hauptziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines vereinfachten und biologisch-geeigneten, stimulierungsgeförderten in-situ-Vernetzungs- und Hydrogelierungssystems unter Verwendung von Peptidmimetika als latente Vernetzer. Der Ansatz zielt darauf ab, eine einzige Thiodepsipeptidsequenz zu verwenden, um getrennte pH- und enzymausgelöste Gelierungssysteme mit geringen Modifikationen der Thiodepsipeptidsequenz zu erreichen. Zur Verwirklichung dieses Ziels, mussten drei Meilensteine erreicht werden. Nach der Wahl der Thiol-Michael-Reaktion als in-situ-Vernetzungsstrategie, musste ein Thiodepsipeptid, Ac-Pro-Leu-Gly-SLeu-Leu-Gly-NEtSH (TDP) mit einer zu erwartenden Neigung zu einer pH-abhängigen Thiol-Thioester-Austausch-Aktivierung (TTE), als geeignetem Vernetzer-Precursor für das pH-unterstützte Gelierungssystem designt werden. Vor der Synthese dieses Peptid-Mimetikums war die Untersuchung der Thiol-Michael-Reaktivität der potenziell aktivierten Thiolkomponente SH-Leu erforderlich, die intern in das Thiodepsipeptid eingebettet ist. In Übereinstimmung mit den pKa-Anforderungen für eine erfolgreiche TTE wurde auch die Reaktivität eines saureren Thiols, SH-Phe, untersucht, um die Auswahl des besten Thiols zu ermöglichen, das in den Thioester-tragenden Peptid-basierten Vernetzer-Precursor eingebaut werden sollte. Pseudo-2D-NMR-Untersuchungen zeigten, dass nur Reaktionen mit SH-Leu das erwartete Thiol-Michael-Produkt ergaben, eine Beobachtung, die auf die sterische Hinderung durch die sperrige Natur von SH-Phe zurückzuführen ist. Wegen der schnellen Reaktionsgeschwindigkeiten und der vollständigen Acrylat/Maleimid-Umwandlung, die mit SH-Leu bei einem pH-Wert von 7,2 und höher erzielt wurde, kam SH-Phe als potenzielles Thiol für die Synthese des Peptidmimetikums nicht mehr infrage. Auf der Grundlage der ersten Studien wurde für das pH-basierte Gelierungssystem das vorgeschlagene Ac-Pro-Leu-Gly-SLeu-Leu-Gly-NEtSH unverändert beibehalten. Der geringe Unterschied in den pKa-Werten zwischen SH-Leu (Thioesterthiol) und dem terminalen Cysteaminthiol sollte ausreichen, um eine "pseudo"-intramolekulare TTE zu bewirken. In polaren protischen Lösungsmitteln und unter basischen wässrigen Bedingungen verläuft die "pseudo"-intramolekulare TTE-Reaktion bei TDP erfolgreich, bei der ein α,ω-Dithiol-Tripeptid, HSLeu-Leu-Gly-NEtSH, entsteht. Die pH-Abhängigkeit der Thiolat-Ionen-Generierung durch das Cysteamin-Thiol trug dazu bei, den notwendigen Stimulus (pH) für den Gesamterfolg der TTE (Aktivierungsschritt) - Thiol-Michael-Addition (Vernetzung) Strategie einzubauen. Zweitens wurde mit Blick auf potenzielle biomedizinische Anwendungen die Empfindlichkeit von TDP, wie auch anderer Thioester, für die intermolekulare TTE-Reaktion mit einer Gruppe von Thiolen mit unterschiedlichen Thiol-pKa-Werten untersucht, da biologische Milieus typischerweise Peptid-/Proteinthiole enthalten. L-Cystein, ein biologisch relevantes Thiol, und ein Thiol mit geringem Molekulargewicht, Methylthioglykolat, die beide relativ ähnliche Thiol-pKa-Werte besitzen, führten bei der Reaktion mit TDP zu einer erhöhten Konzentration des Dithiol-Vernetzers. In Gegenwart von sauren Thiolen (p-NTP und 4MBA) wurde eine Abnahme der Dithiolkonzentration beobachtet, eine Beobachtung, die auf die Unfähigkeit des tetraedrischen TTE-Zwischenprodukts in Austauschprodukte zu dissoziieren zurückgeführt werden kann und mit den pKa-Anforderungen für eine erfolgreiche TTE-Reaktion in Einklang steht. Diese Ergebnisse machen TDP noch attraktiver und zum potenziell ersten Vernetzer-Precursor für Anwendungen in biologisch relevanten Medien. Schließlich wurde die Fähigkeit von TDP, die pH-empfindliche in-situ-Gelbildung zu fördern, mit Maleimid-funktionalisierten 4-armigen Polyethylenglykolpolymeren in tris-gepufferten Medien mit unterschiedlichen pH-Werten untersucht. Bei einem Molverhältnis von 1:1 Thiol zu Maleimid bildeten sich TDP-PEG4MAL-Hydrogele innerhalb von 3, 12 und 24 Stunden bei pH-Werten von 8,5, 8,0 bzw. 7,5. Bei einer Erhöhung des Molverhältnisses von Thiol zu Maleimid auf 2:1 wurden jedoch Gelierzeiten von 3, 5 und 30 Minuten für denselben pH-Trend beobachtet. Ein direkter Zusammenhang zwischen dem Thiolgehalt und G' der Gele bei jedem pH-Wert konnte auch durch den Vergleich von Gelen mit einem Thiol/Maleimid-Molverhältnis von 1:1 mit solchen mit einem Thiol/Maleimid-Molverhältnis von 2:1 hergestellt werden. Dies wird durch die Tatsache unterstützt, dass der Speichermodulus (G') linear von der Vernetzungsdichte des Polymers abhängig ist. Die Werte des anfänglichen G′ für alle Gele lagen bei 200 - 5000 Pa, was in den Bereich der Elastizitäten bestimmter Gewebe-Mikroumgebungen fällt, z. B. Gehirngewebe (200 - 1000 Pa) und Fettgewebe (2500 - 3500 Pa). Die bisher aus der Studie gewonnenen Erkenntnisse über die Möglichkeit, die Austauschreaktion von Thioester-haltigen Peptidmimetika zu entwerfen und abzustimmen, geben weitere Einblicke in die Entwicklung neuer, auf spezifische Anwendungen zugeschnittener Sequenzen. Das Design von TTE-Substraten unter Verwendung von Peptidmimetika, wie es in dieser Arbeit vorgestellt wurde, hat interessante neue Erkenntnisse im Hinblick auf den Stand der Technik gebracht. Mit den erzielten Ergebnissen als Basis bietet die Strategie die Möglichkeit, das Konzept auf die kontrollierte Freisetzung aktiver Moleküle zu erweitern, die für andere robuste Vernetzungsreaktionen mit hohem Umsatz für biomedizinische Anwendungen benötigt werden. Dieses sequentiell gekoppelte funktionelle System könnte z. B. bei der Behandlung von entzündetem Gewebe im Zusammenhang mit Harnwegsinfektionen wie Blasenentzündungen eingesetzt werden, für die pH-Werte über 7 berichtet wurden. Durch die Einbeziehung von Zelladhäsionspeptidmotiven könnte das bei diesem pH-Wert gebildete Hydrogelnetz als neue Stützschicht für die Heilung von geschädigtem Epithel fungieren, wie in Experimenten zur Bildung von Grenzflächengelen mit TDP- und PEG4MAL-Tropfen gezeigt wurde. Die Vielseitigkeit der Thiodepsipeptidsequenz Ac-Pro-Leu-Gly-SLeu-Leu-Gly-(TDPo) wurde um Design und die Synthese eines MMP-empfindlichen 4-armigen PEG-TDPo-Konjugats erweitert. Die beabsichtigte Spaltung von TDPo an der Gly-SLeu-Bindung liefert aktive Thiol-Einheiten für die anschließende Reaktion orthogonaler Michael-Akzeptor-Einheiten. Einer der Vorteile stimulierungsgestützter in-situ-Vernetzungssysteme unter Verwendung kurzer Peptide dürfte darin liegen, dass sich die erforderlichen Peptidmoleküle aufgrund der Vorhersagbarkeit der Peptidfunktionen und ihrer Sequenzstruktur leicht entwerfen lassen. Die Funktionalisierung eines vierarmigen PEG-Kerns mit der kollagenaseaktiven TDPo-Sequenz führte zu einem MMP-empfindlichen vierarmigen Thiodepsipeptid-PEG-Konjugat (PEG4TDPo). Spaltungs-Studien unter Verwendung eines thiolfluorimetrischen Assays in Gegenwart der MMPs -2 und -9 bestätigten die Spaltbarkeit von PEG4TDPo durch diese Enzyme. Der daraus resultierende zeitabhängige Anstieg der Fluoreszenzintensität in Anwesenheit des Thiol-Assays deutet auf die erfolgreiche Spaltung von TDPo an der Gly-SLeu-Bindung hin. Es wurde festgestellt, dass die Spaltungsstudien mit dem thiol-fluorimetrischen Assay ein sigmoides, nicht-Michaelis-Menten-artiges kinetisches Profil ergeben, was eine genaue Bestimmung der Enzymzyklusparameter, kcat und KM, erschwert. Gelierungsstudien mit PEG4MAL in einer Konzentration von 10 Gew.-% ergaben eine schnellere Gelierung mit MMP-2 als mit MMP-9 mit Gelierungszeiten von 28 bzw. 40 Minuten. Eventuelle Beiträge durch hydrolytische Spaltung von PEG4TDPo an der Gelierung wurden an PEG4MAL-Blindproben untersucht und führten erst nach 60 Minuten Reaktionszeit zu einer Gelierung. Aus theoretischen Überlegungen heraus wäre zu erwarten, dass sich die gleichzeitige Gelierungsreaktion negativer auf die enzymatische als auf die hydrolytische Spaltung auswirkt. Genaues zum Beitrag der hydrolytischen Spaltung von PEG4TDPo bedürfte jedoch weiterer Untersuchungen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses neue in-situ-Vernetzungssystem, bei dem Peptid-basierte Vernetzungs-Precursor mit einstellbaren Eigenschaften verwendet werden, eine in-situ-Vernetzungs-Gelierungskinetik auf ähnlichem Niveau wie bei bereits berichteten aktiven Dithiole aufweist. Die vorteilhafte On-Demand-Funktionalität in Verbindung mit ihrer pH-Sensitivität und physiologischen Verträglichkeit macht sie zu einem interessanten Kandidaten für weitere Forschungen im Bereich biomedizinischer Anwendungen im Allgemeinen und der On-Demand-Materialsynthese. Die Ergebnisse des MMP-geförderten Gelierungssystems weisen einen einfachen, aber unerforschten Ansatz für die in-situ-Synthese kovalent vernetzter weicher Materialien, der zur Entwicklung eines alternativen Weges zur Bekämpfung der Krebsmetastasierung führen könnte, indem er die MMP-Überexpression als Auslöser nutzt. Mit MMP-Inhibitoren wurde dieses Ziel trotz umfangreicher Arbeiten in dieser Hinsicht bisher nicht erreicht. KW - hydrogels KW - stimuli KW - peptide KW - thioester KW - crosslinker KW - Hydrogele KW - Vernetzer KW - Peptid KW - Thioester KW - Stimuli Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-569713 ER - TY - THES A1 - Egli, Lukas T1 - Stabilizing agricultural systems through diversity N2 - In the light of climate change, rising demands for agricultural products and the intensification and specialization of agricultural systems, ensuring an adequate and reliable supply of food is fundamental for food security. Maintaining diversity and redundancy has been postulated as one generic principle to increase the resilience of agricultural production and other ecosystem services. For example, if one crop fails due to climate instability and extreme events, others can compensate the losses. Crop diversity might be particularly important if different crops show asynchronous production trends. Furthermore, spatial heterogeneity has been suggested to increase stability at larger scales as production losses in some areas can be buffered by surpluses in undisturbed ones. Besides systematically investigating the mechanisms underlying stability, identifying transformative pathways that foster them is important. In my thesis, I aim at answering the following questions: (i) How does yield stability differ between nations, regions and farms, and what is the effect of crop diversity on yield stability in relation to agricultural inputs, climate heterogeneity, climate instability and time at the national, regional or farm level? (ii) Is asynchrony between crops a better predictor of production stability than crop diversity? (iii) What is the effect of asynchrony between and within crops on stability and how is it related to crop diversity and space, respectively? (iv) What is the state of the art and what are knowledge gaps in exploring resilience and its multidimensionality in ecological and social-ecological systems with agent-based models and what are potential ways forward? In the first chapter, I provide the theoretical background for the subsequent analyses. I stress the need to better understand the resilience of social-ecological systems and particularly the stability of agricultural production. Moreover, I introduce diversity and spatial heterogeneity as two prominently discussed resilience mechanisms and describe approaches to assess resilience. In the second chapter, I combined agriculture and climate data at three levels of organization and spatial extents to investigate yield stability patterns and their relation to crop diversity, fertilizer, irrigation, climate heterogeneity and instability and time of nations globally, regions in Europe and farms in Germany using statistical analyses. Yield stability decreased from the national to the farm level. Several nations and regions substantially contributed to larger-scale stability. Crop diversity was positively associated with yield stability across all three levels of organization. This effect was typically more profound at smaller scales and in variable climates. In addition to crop diversity, climate heterogeneity was an important stabilizing mechanism especially at larger scales. These results confirm the stabilizing effect of crop diversity and spatial heterogeneity, yet their importance depends on the scale and agricultural management. Building on the findings of the second chapter, I deepened in the third chapter my research on the effect of crop diversity at the national level. In particular, I tested if asynchrony between crops, i.e. between the temporal production patterns of different crops, better predicts agricultural production stability than crop diversity. The stabilizing effect of asynchrony was multiple times higher than the effect of crop diversity, i.e. asynchrony is one important property that can explain why a higher diversity supports the stability of national food production. Therefore, strategies to stabilize agricultural production through crop diversification also need to account for the asynchrony of the crops considered. The previous chapters suggest that both asynchrony between crops and spatial heterogeneity are important stabilizing mechanisms. In the fourth chapter, I therefore aimed at better understanding the relative importance of asynchrony between and within crops, i.e. between the temporal production patterns of different crops and between the temporal production patterns of different cultivation areas of the same crop. Better understanding their relative importance is important to inform agricultural management decisions, but so far this has been hardly assessed. To address this, I used crop production data to study the effect of asynchrony between and within crops on the stability of agricultural production in regions in Germany and nations in Europe. Both asynchrony between and within crops consistently stabilized agricultural production. Adding crops increased asynchrony between crops, yet this effect levelled off after eight crops in regions in Germany and after four crops in nations in Europe. Combining already ten farms within a region led to high asynchrony within crops, indicating distinct production patters, while this effect was weaker when combining multiple regions within a nation. The results suggest, that both mechanisms need to be considered in agricultural management strategies that strive for more resilient farming systems. The analyses in the foregoing chapters focused at different levels of organization, scales and factors potentially influencing agricultural stability. However, these statistical analyses are restricted by data availability and investigate correlative relationships, thus they cannot provide a mechanistic understanding of the actual processes underlying resilience. In this regard, agent-based models (ABM) are a promising tool. Besides their ability to measure different properties and to integrate multiple situations through extensive manipulation in a fully controlled system, they can capture the emergence of system resilience from individual interactions and feedbacks across different levels of organization. In the fifth chapter, I therefore reviewed the state of the art and potential knowledge gaps in exploring resilience and its multidimensionality in ecological and social-ecological systems with ABMs. Next, I derived recommendations for a more effective use of ABMs in resilience research. The review suggests that the potential of ABMs is not utilized in most models as they typically focus on a single dimension of resilience and are mostly limited to one reference state, disturbance type and scale. Moreover, only few studies explicitly test the ability of different mechanisms to support resilience. To solve real-world problems related to the resilience of complex systems, ABMs need to assess multiple stability properties for different situations and under consideration of the mechanisms that are hypothesized to render a system resilient. In the sixth chapter, I discuss the major conclusions that can be drawn from the previous chapters. Moreover, I showcase the use of simulation models to identify management strategies to enhance asynchrony and thus stability, and the potential of ABMs to identify pathways to implement such strategies. The results of my thesis confirm the stabilizing effect of crop diversity, yet its importance depends on the scale, agricultural management and climate. Moreover, strategies to stabilize agricultural production through crop diversification also need to account for the asynchrony of the crops considered. As spatial heterogeneity and particularly asynchrony within crops strongly enhances stability, integrated management approaches are needed that simultaneously address multiple resilience mechanisms at different levels of organization, scales and time horizons. For example, the simulation suggests that only increasing the number of crops at both the pixel and landscape level avoids trade-offs between asynchrony between and within crops. If their potential is better exploited, agent-based models have the capacity to systematically assess resilience and to identify comprehensive pathways towards resilient farming systems. N2 - In Anbetracht des Klimawandels, steigender Nachfrage nach landwirtschaftlichen Produkten und der weitgehenden Intensivierung und Spezialisierung landwirtschaftlicher Systeme ist eine ausreichende und zuverlässige Nahrungsmittelproduktion zentral für die Ernährungssicherheit. Eine hohe Nutzpflanzenvielfalt und räumliche Heterogenität können helfen, die Resilienz bzw. Widerstandsfähigkeit der landwirtschaftlichen Produktion zu stärken. Fällt zum Beispiel die Ernte einer Nutzpflanze aufgrund einer Dürre aus, können andere die Verluste ausgleichen. Außerdem können Produktionsverluste in einigen Gebieten durch Überschüsse in anderen Gebieten kompensiert werden. In meiner Arbeit habe ich mittels umfassender Landwirtschafts- und Klimadaten und statistischer Analysen untersucht, wie sich insbesondere Nutzpflanzenvielfalt und Klimaheterogenität auf zeitliche Ertragsstabilität auswirken. Zudem habe ich evaluiert, ob asynchrone Produktionstrends unterschiedlicher Nutzpflanzen den stabilisierenden Effekt einer hohen Nutpflanzenvielfalt erklären können. Außerdem habe ich den Effekt asynchroner Produktionstrends unterschiedlicher Nutzpflanzen und von unterschiedlichen Anbaugebieten derselben Nutzpflanze in Bezug auf Produktionsstabilität verglichen und mit einer Computersimulation eruiert, wie diese Mechanismen durch Diversifizierung verändert werden. Zum Schluss habe ich untersucht, wie umfassend die Resilienz ökologischer und sozioökologischer Systeme mittels agentenbasierter Modelle bislang erforscht wurde. Die Untersuchungen dieser Arbeit zeigen, dass Nutzpflanzenvielfalt die landwirtschaftliche Produktion auf sämtlichen untersuchten Organisationsebenen stabilisiert. Asynchrone Produktionstrends unterschiedlicher Nutzpflanzen können erklären, warum eine höhere Diversität die Produktion stabilisiert. Daneben sind asynchrone Produktionstrends unterschiedlicher Anbaugebiete besonders wichtig. Meine Simulation zeigt, dass nur eine Diversifizierung auf Feld- und Landschaftsebene asynchrone Produktionsmuster zwischen Nutpflanzen und Anbaugebieten gleichzeitig erhöht oder zumindest keine der beiden Mechanismen verringert. Agentenbasierte Modelle bieten die Möglichkeit, Resilienz systematisch zu untersuchen und Wege aufzuzeigen, die zu resilienteren Anbausystemen führen. Meine Ergebnisse unterstreichen die Notwendigkeit umfassenderer Ansätze um eine resiliente, produktive und nachhaltige landwirtschaftliche Produktion in Zeiten globaler Veränderungsprozesse zu erreichen. Dies beinhaltet insbesondere eine Diversifizierung der Nutzpflanzen auf unterschiedlichen Ebenen unter Berücksichtigung der zeitlichen Produktionstrends sowie eine nachhaltige Nutzung landwirtschaftlicher Betriebsmittel. T2 - Stabilisierung landwirtschaftlicher Systeme durch Diversität KW - Agent-based models KW - Agroecology KW - Resilience KW - Social-ecological systems KW - Sustainability KW - Agentenbasierte Modelle KW - Agrarökologie KW - Resilienz KW - Sozialökologische Systeme KW - Nachhaltigkeit Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-496848 ER - TY - THES A1 - Mungur, Rajsree T1 - Spatio-temporal analysis of florigenic signals in Arabidopsis thaliana, Sinapis alba and Brassica napus T1 - Zeitabhängige Analyse von blühinduzierenden Signalen in Arabidopsis thaliana, Sinapis alba und Brassica napus N2 - Daylength is one of several parameters controlling flowering time in many plant species. The day length is perceived in leaves, but how the floral signal is transduced to the shoot apex via the phloem to induce flowering remains to be elucidated. This study aimed at the identification of new candidates involved in the induction of flowering by employing three plant species, Arabidopsis thaliana, Sinapis alba and Brassica napus in combination with transcript profiling by Affymetrix chip hybridization, metabolite profiling by gas chromatography – mass spectrometry and targeted protein analysis using antibodies. All analyses were performed on tissue-specific samples and focused on phloem sap or phloem exudates. To find common transcript and metabolite candidates potentially associated with the floral transition, two independent induction systems in Arabidopsis were used: a photoextension system, whereby plants received fourteen additional hours of light, and a parallel dexamethasone-inducible system, which was centered on the induction of the known flowering gene CONSTANS (CO). Identification of signals preceding the CO cascade was possible using the light extension regime, while downstream events dependent on CO activation were compared in both systems. Altogether, a number of interesting transcript and metabolite candidates were identified in both systems with some degree of overlap. Sinapis alba was used to investigate the universality of the floral signals between species. Comparisons of metabolite data revealed a few common candidates that may prove interesting for further studies. In addition, a targeted approach was carried out to investigate the presence of the Flowering Locus T (FT) protein during different stages of flower development using an antibody. Interesting changes in the sizes of antigens from rape phloem were seen and appeared consistent in Arabidopsis and to a lesser extent in Sinapis. Overall, the broad surveying approaches for transcripts and metabolites used in this study revealed several new potential candidates involved in the induction and/or regulation of flowering. As far as the protein work, additional experiments will reveal the link between FT and floral induction as well as its role in maintaining the floral state using the abovementioned plant species. N2 - Die Tageslänge ist in vielen Pflanzenarten einer der Parameter, welche die Blütenbildung kontrollieren. Die Tageslänge wird in Blättern gemessen, aber wie das blühinduzierende Signal über das Phloem in den Apex übertragen wird ist bisher nicht aufgeklärt. Die vorliegende Arbeit hatte das Ziel neue Kandidaten zu identifizieren, die an der Blühinduktion beteiligt sind. Dazu wurden die drei Pflanzenarten Arabidopsis thaliana, Sinapis alba und Brassica napus auf der Ebene von Transkripten durch Affymetrix Chip Hybridisierungen, Metaboliten durch Gaschromatographie-Massenspektrometrie und ausgesuchten Proteinen durch Antikörper analysiert. Alle Untersuchungen wurden an gewebespezifischen Proben vorgenommen und waren auf Phloemsaft bzw. Phloemexsudate fokussiert. Um gemeinsame Transkript- und Metabolitkandidaten zu ermitteln, welche mit der Blühinduktion in Zusammenhang stehen, wurden zwei unabhängige Induktionssysteme in Arabidopsis verwendet: Ein Photoextensions-System, in dem die Pflanzen vierzehn zusätzlichen Stunden Licht ausgesetzt wurden und ein paralleles Dexamethason-induzierbares System, das die gezielte Aktivierung des bekannten blühinduzierenden Gens CONSTANS (CO) ermöglicht. Die Identifikation von CO-vorgelagerten Signalen war in dem Photoextensions-System möglich, während der CO-Aktivierung nachgelagerte Ereignisse in beiden Systemen verglichen werden konnten. Zusammengenommen konnten mit beiden Systemen eine Reihe von interessanten Transkript- und Metabolitkandidaten ermittelt werden, welche auch teilweise überlappten. Anschließend wurde Sinapis alba verwendet, um die Universalität der blühinduzierenden Signale in verschiedenen Pflanzenarten zu untersuchen. Vergleiche der Metabolitendaten ergaben ein paar gemeinsame Kandidaten, welche für weitergehende Untersuchungen interessant sein könnten. Zusätzlich wurden mittels Antikörpern gezielte Untersuchungen bezüglich der Präsenz des Flowering Locus T (FT) Proteins während verschiedener Stadien der Blütenentwicklung durchgeführt. Diese Untersuchungen zeigten interessante Änderungen der Größe des Antigens in Raps Phloemsaft, welche auch in Arabidopsis und in geringerem Maße in Sinapis sichtbar waren. Zusammengefasst resultierten die umfassenden Transkript- und Metabolitenmessungen, die in dieser Arbeit verwendet wurden, in einer Reihe von neuen möglichen Kandidaten, welche an der Induktion und/oder Regulation der Blütenbildung beteiligt sein könnten. Bezüglich des Proteins FT sind zusätzliche Experimente notwendig, um seine Rolle bei der Blühinduktion bzw. bei der Aufrechterhaltung des blühenden Zustandes aufzudecken. KW - Florigen KW - Florigen Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-9861 ER - TY - THES A1 - May, Felix T1 - Spatial models of plant diversity and plant functional traits : towards a better understanding of plant community dynamics in fragmented landscapes T1 - Räumliche Modelle der Diversität und der funktionellen Eigenschaften von Pflanzen : für ein besseres Verständnis der Dynamik von Pflanzengemeinschaften in fragmentierten Landschaften N2 - The fragmentation of natural habitat caused by anthropogenic land use changes is one of the main drivers of the current rapid loss of biodiversity. In face of this threat, ecological research needs to provide predictions of communities' responses to fragmentation as a prerequisite for the effective mitigation of further biodiversity loss. However, predictions of communities' responses to fragmentation require a thorough understanding of ecological processes, such as species dispersal and persistence. Therefore, this thesis seeks an improved understanding of community dynamics in fragmented landscapes. In order to approach this overall aim, I identified key questions on the response of plant diversity and plant functional traits to variations in species' dispersal capability, habitat fragmentation and local environmental conditions. All questions were addressed using spatially explicit simulations or statistical models. In chapter 2, I addressed scale-dependent relationships between dispersal capability and species diversity using a grid-based neutral model. I found that the ratio of survey area to landscape size is an important determinant of scale-dependent dispersal-diversity relationships. With small ratios, the model predicted increasing dispersal-diversity relationships, while decreasing dispersal-diversity relationships emerged, when the ratio approached one, i.e. when the survey area approached the landscape size. For intermediate ratios, I found a U-shaped pattern that has not been reported before. With this study, I unified and extended previous work on dispersal-diversity relationships. In chapter 3, I assessed the type of regional plant community dynamics for the study area in the Southern Judean Lowlands (SJL). For this purpose, I parameterised a multi-species incidence-function model (IFM) with vegetation data using approximate Bayesian computation (ABC). I found that the type of regional plant community dynamics in the SJL is best characterized as a set of isolated “island communities” with very low connectivity between local communities. Model predictions indicated a significant extinction debt with 33% - 60% of all species going extinct within 1000 years. In general, this study introduces a novel approach for combining a spatially explicit simulation model with field data from species-rich communities. In chapter 4, I first analysed, if plant functional traits in the SJL indicate trait convergence by habitat filtering and trait divergence by interspecific competition, as predicted by community assembly theory. Second, I assessed the interactive effects of fragmentation and the south-north precipitation gradient in the SJL on community-mean plant traits. I found clear evidence for trait convergence, but the evidence for trait divergence fundamentally depended on the chosen null-model. All community-mean traits were significantly associated with the precipitation gradient in the SJL. The trait associations with fragmentation indices (patch size and connectivity) were generally weaker, but statistically significant for all traits. Specific leaf area (SLA) and plant height were consistently associated with fragmentation indices along the precipitation gradient. In contrast, seed mass and seed number were interactively influenced by fragmentation and precipitation. In general, this study provides the first analysis of the interactive effects of climate and fragmentation on plant functional traits. Overall, I conclude that the spatially explicit perspective adopted in this thesis is crucial for a thorough understanding of plant community dynamics in fragmented landscapes. The finding of contrasting responses of local diversity to variations in dispersal capability stresses the importance of considering the diversity and composition of the metacommunity, prior to implementing conservation measures that aim at increased habitat connectivity. The model predictions derived with the IFM highlight the importance of additional natural habitat for the mitigation of future species extinctions. In general, the approach of combining a spatially explicit IFM with extensive species occupancy data provides a novel and promising tool to assess the consequences of different management scenarios. The analysis of plant functional traits in the SJL points to important knowledge gaps in community assembly theory with respect to the simultaneous consequences of habitat filtering and competition. In particular, it demonstrates the importance of investigating the synergistic consequences of fragmentation, climate change and land use change on plant communities. I suggest that the integration of plant functional traits and of species interactions into spatially explicit, dynamic simulation models offers a promising approach, which will further improve our understanding of plant communities and our ability to predict their dynamics in fragmented and changing landscapes. N2 - Die Fragmentierung von Landschaften umfasst die Zerschneidung und den Verlust von Flächen mit natürlicher Vegetationsentwicklung und ist eine der Hauptursachen für den gegenwärtigen drastischen Verlust an Biodiversität. Diese Dissertation soll zu einem besseren Verständnis der Vegetationsdynamik in fragmentierten Landschaften beitragen. Damit verbunden ist das Ziel, Vorhersagen über die Reaktion von Pflanzengemeinschaften auf Fragmentierung zu verbessern. Diese Vorhersagen sind notwendig, um gezielte Naturschutzmaßnahmen zur Verminderung eines weiteren Verlustes an Biodiversität umsetzen zu können. In Kapitel 2 der Dissertation wird mit einem Simulationsmodell untersucht, wie sich die Ausbreitungsdistanz von Samen auf die lokale Artenzahl von Pflanzengemeinschaften auswirkt. Dabei zeigte sich, dass längere Ausbreitungsdistanzen die lokale Artenvielfalt sowohl erhöhen, als auch verringern können. Der wichtigste Einflussfaktor war dabei die Artenvielfalt der über-geordneten Pflanzengemeinschaft, in der die betrachtete lokale Gemeinschaft eingebettet war. Im dritten Kapitel wird die Konnektivität zwischen Pflanzengemeinschaften in Habitat-fragmenten, d.h. der Austausch von Arten und Individuen durch Samenausbreitung, im Unter-suchungsgebiet in Israel analysiert. Dafür wurde ein zweites räumliches Simulationsmodell mit statistischen Verfahren an Felddaten angepasst. Der Vergleich des Modells mit den Daten wies auf eine sehr geringe Konnektivität zwischen den Habitatfragmenten hin. Das Modell sagte vorher, dass innerhalb von 1000 Jahren 33% - 60% der Arten aussterben könnten. In Kapitel 4 wird zuerst analysiert, welche Prozesse die Verteilung von funktionellen Eigenschaften in Pflanzengemeinschaften bestimmen. In einem zweiten Schritt wird dann unter-sucht, wie sich funktionelle Eigenschaften von Pflanzengemeinschaften mit dem Niederschlag und der Fragmentierung im Untersuchungsgebiet in Israel verändern. Der Zusammenhang zwischen den Eigenschaften Pflanzenhöhe, sowie spezifischer Blattfläche und der Fragmentierung änderte sich nicht entlang des Niederschlagsgradienten. Im Gegensatz dazu, änderte sich der Zusammenhang zwischen der Samenmasse bzw. der Samenzahl und der Fragmentierung mit dem Niederschlag. Aus den Ergebnissen der ersten Teilstudie wird deutlich, dass Naturschutzmaßnahmen, die natürliche Habitate stärker vernetzen sollen, die Diversität, sowie die Zusammensetzung der übergeordneten Artengemeinschaft berücksichtigen müssen, um Verluste an Biodiversität zu vermeiden. Die Verknüpfung eines räumlichen Simulationsmodells mit Felddaten in der zweiten Teilstudie stellt einen neuen und vielversprechenden Ansatz für die Untersuchung der Auswirkungen verschiedener Management-Szenarien dar. Die dritte Teilstudie ist die erste Analyse der gemeinsamen Auswirkungen von Klima und Fragmentierung auf funktionelle Pflanzen-eigenschaften und zeigt die hohe Bedeutung der Untersuchung von Synergie-Effekten verschiedener Umweltfaktoren. Für zukünftige Forschung legt diese Dissertation nahe, funktionelle Eigenschaften und Konkurrenz zwischen Arten in räumlichen Simulationsmodellen zu berücksichtigen, um das Verständnis von Artengemeinschaften in fragmentierten Landschaften noch weiter zu verbessern. KW - Diversität KW - Ausbreitung KW - Pflanzengemeinschaften KW - Fragmentierung KW - ökologische Modellierung KW - diversity KW - dispersal KW - plant communities KW - fragmentation KW - ecological modelling Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-68444 ER - TY - THES A1 - Milles, Alexander T1 - Sources and consequences of intraspecific trait variation in movement behaviour T1 - Ursachen und Konsequenzen intraspezifischer Merkmalsvariation im Bewegungsverhalten N2 - Variation in traits permeates and affects all levels of biological organisation, from within individuals to between species. Yet, intraspecific trait variation (ITV) is not sufficiently represented in many ecological theories. Instead, species averages are often assumed. Especially ITV in behaviour has only recently attracted more attention as its pervasiveness and magnitude became evident. The surge in interest in ITV in behaviour was accompanied by a methodological and technological leap in the field of movement ecology. Many aspects of behaviour become visible via movement, allowing us to observe inter-individual differences in fundamental processes such as foraging, mate searching, predation or migration. ITV in movement behaviour may result from within-individual variability and consistent, repeatable among-individual differences. Yet, questions on why such among-individual differences occur in the first place and how they are integrated with life-history have remained open. Furthermore, consequences of ITV, especially of among-individual differences in movement behaviour, on populations and species communities are not sufficiently understood. In my thesis, I approach timely questions on the sources and consequences of ITV, particularly, in movement behaviour. After outlining fundamental concepts and the current state of knowledge, I approach these questions by using agent-based models to integrate concepts from behavioural and movement ecology and to develop novel perspectives. Modern coexistence theory is a central pillar of community ecology, yet, insufficiently considers ITV in behaviour. In chapter 2, I model a competitive two-species system of ground-dwelling, central-place foragers to investigate the consequences of among-individual differences in movement behaviour on species coexistence. I show that the simulated among-individual differences, which matched with empirical data, reduce fitness differences betweem species, i.e. provide an equalising coexistence mechanism. Furthermore, I explain this result mechanistically and, thus, resolve an apparent ambiguity of the consequences of ITV on species coexistence described in previous studies. In chapter 3, I turn the focus to sources of among-individual differences in movement behaviour and their potential integration with life-history. The pace-of-life syndrome (POLS) theory predicts that the covariation between among-individual differences in behaviour and life-history is mediated by a trade-off between early and late reproduction. This theory has generated attention but is also currently scrutinised. In chapter 3, I present a model which supports a recent conceptual development that suggests fluctuating density-dependent selection as a cause of the POLS. Yet, I also identified processes that may alter the association between movement behaviour and life-history across levels of biological organization. ITV can buffer populations, i.e. reduce their extinction risk. For instance, among-individual differences can mediate portfolio effects or increase evolvability and, thereby, facilitate rapid evolution which can alleviate extinction risk. In chapter 4, I review ITV, environmental heterogeneity, and density-dependent processes which constitute local buffer mechanisms. In the light of habitat isolation, which reduces connectivity between populations, local buffer mechanisms may become more relevant compared to dispersal-related regional buffer mechanisms. In this chapter, I argue that capacities, latencies, and interactions of local buffer mechanisms should motivate more process-based and holistic integration of local buffer mechanisms in theoretical and empirical studies. Recent perspectives propose to apply principles from movement and community ecology to study filamentous fungi. It is an open question whether and how the arrangement and geometry of microstructures select for certain movement traits, and, thus, facilitate coexistence-stabilising niche partitioning. As a coauthor of chapter 5, I developed an agent-based model of hyphal tips navigating in soil-like microstructures along a gradient of soil porosity. By measuring network properties, we identified changes in the optimal movement behaviours along the gradient. Our findings suggest that the soil architecture facilitates niche partitioning. The core chapters are framed by a general introduction and discussion. In the general introduction, I outline fundamental concepts of movement ecology and describe theory and open questions on sources and consequences of ITV in movement behaviour. In the general discussion, I consolidate the findings of the core chapters and critically discuss their respective value and, if applicable, their impact. Furthermore, I emphasise promising avenues for further research. N2 - Die Variation von Merkmalen durchdringt und beeinflusst alle Ebenen der biologischen Organisation, von Individuen bis hin zu Artgemeinschaften. Dennoch wird die intraspezifische Merkmalsvariation (ITV) in vielen ökologischen Theorien nicht ausreichend berücksichtigt. Stattdessen wird oft von Durchschnittswerten der Arten ausgegangen. Insbesondere ITV im Verhalten hat erst in jüngster Zeit mehr Aufmerksamkeit erfahren, als dessen Verbreitung und Ausmaß deutlich wurden. Der Anstieg des Interesses an ITV im Verhalten ging mit einem methodischen und technologischen Sprung auf dem Gebiet der Bewegungsökologie einher. Viele Aspekte des Verhaltens werden durch die Bewegung sichtbar und ermöglichen es uns, interindividuelle Unterschiede bei grundlegenden Prozessen wie Nahrungssuche, Partnersuche, Räuber-Beute-Beziehungen oder Migration zu beobachten. ITV im Bewegungsverhalten kann aus intraindividueller Variabilität und konsistenten, wiederholbaren Unterschieden zwischen einzelnen Individuen resultieren. Die Fragen, weshalb solche Unterschiede interindividuellen Unterschiede überhaupt auftreten und wie sie mit der Lebensgeschichte ("life-history") zusammenhängen, sind jedoch bislang ungeklärt. Darüber hinaus sind die Folgen von ITV, insbesondere von individuellen Unterschieden im Bewegungsverhalten, für Populationen und Artengemeinschaften nicht ausreichend bekannt. In meiner Dissertation gehe ich aktuellen Fragen zu den Quellen und Folgen von ITV, insbesondere im Bewegungsverhalten, nach. Nach einer Darstellung grundlegender Konzepte und des aktuellen Wissensstandes nähere ich mich diesen Fragen mit Hilfe agentenbasierter Modelle, um Konzepte aus der Verhaltens- und Bewegungsökologie zu integrieren und neue Perspektiven zu entwickeln. Die moderne Koexistenztheorie ist ein zentraler Pfeiler der Gemeinschaftsökologie, berücksichtigt aber ITV im Verhalten nur unzureichend. In Kapitel 2 modelliere ich ein System zweiter konkurrierender, bodenbewohnender Arten mit zentralisierten Streifgebieten, um die Folgen von Unterschieden im Bewegungsverhalten zwischen Individuen auf die Koexistenz der Arten zu untersuchen. Ich zeige, dass die simulierten interindividuellen Unterschiede, die mit empirischen Daten übereinstimmen, die Fitnessunterschiede zwischen den Arten verringern, d. h. einen ausgleichenden Koexistenzmechanismus darstellen. Darüber hinaus erkläre ich dieses Ergebnis mechanistisch und löse damit eine scheinbare Zweideutigkeit der in früheren Studien beschriebenen Folgen von ITV auf die Koexistenz von Arten auf. In Kapitel 3 richte ich den Fokus auf die Quellen individueller Unterschiede im Bewegungsverhalten und deren mögliche Integration in die Lebensgeschichte. Die Theorie des "pace-of-life" Syndroms (POLS) sagt voraus, dass die Kovariation zwischen individuellen Unterschieden im Verhalten und der Lebensgeschichte durch einen Zielkonflikt zwischen früher und später Reproduktion vermittelt wird. Diese Theorie hat viel Aufmerksamkeit erregt, wird aber derzeit auch kritisch betrachtet. In Kapitel 3 stelle ich ein Modell vor, das Hypothesen einer neuere konzeptionelle Entwicklung stützt, die eine fluktuierende, dichteabhängige Selektion als Ursache des POLS nahelegt. Ich habe jedoch auch Prozesse identifiziert, die den Zusammenhang zwischen Bewegungsverhalten und Lebensgeschichte auf verschiedenen Ebenen der biologischen Organisation verändern können. ITV kann Populationen puffern, d. h. ihr Aussterberisiko verringern. So können beispielsweise Unterschiede zwischen Individuen Portfolioeffekte vermitteln oder die Fähigkeit zur Anpassung erhöhen und damit etwa eine schnelle Evolution erleichtern, die das Aussterberisiko verringern kann. In Kapitel 4 gebe ich einen Überblick über ITV, Umweltheterogenität und dichteabhängige Prozesse, die lokale Puffermechanismen darstellen. Angesichts der Isolierung von Lebensräumen, die die Konnektivität zwischen Populationen verringert, können lokale Puffermechanismen im Vergleich zu ausbreitungsbedingten regionalen Puffermechanismen an Bedeutung gewinnen. In diesem Kapitel argumentiere ich, dass Kapazitäten, Latenzen und Interaktionen lokaler Puffermechanismen zu einer prozessbasierten und ganzheitlichen Integration lokaler Puffermechanismen in theoretischen und empirischen Studien motivieren sollten. Neuere konzeptionelle Einsichten legen nahe, dass Prinzipien aus der Bewegungs- und Gemeinschaftsökologie auf die Untersuchung filamentöser Pilze angewendet können. In diesem Zusammenhang ist es eine offene Frage, ob und wie die Anordnung und Geometrie von Mikrostrukturen für bestimmte Bewegungseigenschaften selektieren und damit eine koexistenzstabilisierende Nischenaufteilung erleichtern. Als Koautor von Kapitel 5 habe ich ein agentenbasiertes Modell der Hyphenspitzen entwickelt. In diesem Modell navigieren die Hyphenspitzen in bodenähnlichen Mikrostrukturen entlang eines Gradienten der Bodenporosität. Durch die Messung von Netzwerkeigenschaften konnten wir Veränderungen des optimalen Bewegungsverhaltens entlang des Gradienten feststellen. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Bodenarchitektur eine ökologische Nische mit verschiedenen Bewegungsoptima darstellt. Die Hauptkapitel werden von einer allgemeinen Einführung und einer Diskussion eingerahmt. In der allgemeinen Einführung umreiße ich die grundlegenden Konzepte der Bewegungsökologie und beschreibe die Theorie und die offenen Fragen zu den Ursachen und Folgen von ITV im Bewegungsverhalten. In der allgemeinen Diskussion fasse ich die Ergebnisse der Kernkapitel zusammen und diskutiere kritisch ihren jeweiligen Wert und gegebenenfalls ihre Auswirkungen. Darüber hinaus zeige ich vielversprechende Wege für künftige Forschungsarbeiten auf. KW - ecology KW - movement ecology KW - agent-based model KW - intraspecific variation KW - species coexistence KW - pace-of-life syndrome KW - population persistence KW - Ökologie KW - Bewegungsökologie KW - Agentenbasierte Modelle KW - Intraspezifische Variation KW - Koexistenz KW - Pace-of-Life Syndrom KW - Populationspersistenz Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-565011 ER - TY - THES A1 - Reeg, Jette T1 - Simulating the impact of herbicide drift exposure on non-target terrestrial plant communities T1 - Simulation der Auswirkungen von Herbizid-Drift-Expositionen auf Gemeinschaften von Nichtzielpflanzen N2 - In Europe, almost half of the terrestrial landscape is used for agriculture. Thus, semi-natural habitats such as field margins are substantial for maintaining diversity in intensively managed farmlands. However, plants located at field margins are threatened by agricultural practices such as the application of pesticides within the fields. Pesticides are chemicals developed to control for undesired species within agricultural fields to enhance yields. The use of pesticides implies, however, effects on non-target organisms within and outside of the agricultural fields. Non-target organisms are organisms not intended to be sprayed or controlled for. For example, plants occurring in field margins are not intended to be sprayed, however, can be impaired due to herbicide drift exposure. The authorization of plant protection products such as herbicides requires risk assessments to ensure that the application of the product has no unacceptable effects on the environment. For non-target terrestrial plants (NTTPs), the risk assessment is based on standardized greenhouse studies on plant individual level. To account for the protection of plant populations and communities under realistic field conditions, i.e. extrapolating from greenhouse studies to field conditions and from individual-level to community-level, assessment factors are applied. However, recent studies question the current risk assessment scheme to meet the specific protection goals for non-target terrestrial plants as suggested by the European Food Safety Authority (EFSA). There is a need to clarify the gaps of the current risk assessment and to include suitable higher tier options in the upcoming guidance document for non-target terrestrial plants. In my thesis, I studied the impact of herbicide drift exposure on NTTP communities using a mechanistic modelling approach. I addressed main gaps and uncertainties of the current risk assessment and finally suggested this modelling approach as a novel higher tier option in future risk assessments. Specifically, I extended the plant community model IBC-grass (Individual-based community model for grasslands) to reflect herbicide impacts on plant individuals. In the first study, I compared model predictions of short-term herbicide impacts on artificial plant communities with empirical data. I demonstrated the capability of the model to realistically reflect herbicide impacts. In the second study, I addressed the research question whether or not reproductive endpoints need to be included in future risk assessments to protect plant populations and communities. I compared the consequences of theoretical herbicide impacts on different plant attributes for long-term plant population dynamics in the community context. I concluded that reproductive endpoints only need to be considered if the herbicide effect is assumed to be very high. The endpoints measured in the current vegetative vigour and seedling emergence studies had high impacts for the dynamic of plant populations and communities already at lower effect intensities. Finally, the third study analysed long-term impacts of herbicide application for three different plant communities. This study highlighted the suitability of the modelling approach to simulate different communities and thus detecting sensitive environmental conditions. Overall, my thesis demonstrates the suitability of mechanistic modelling approaches to be used as higher tier options for risk assessments. Specifically, IBC-grass can incorporate available individual-level effect data of standardized greenhouse experiments to extrapolate to community-level under various environmental conditions. Thus, future risk assessments can be improved by detecting sensitive scenarios and including worst-case impacts on non-target plant communities. N2 - Fast die Hälfte der gesamten Landfläche in Europa wird für landwirtschaftliche Zwecke genutzt. Daher sind halb-natürliche Gebiete, wie zum Beispiel Ackerränder, von besonderer Bedeutung für den Artenreichtum in intensiv genutzten Ackerlandschaften. Vor allem in den intensiv genutzten Äckern werden Chemikalien eingesetzt um die Erträge zu erhöhen. So werden zum Beispiel Pflanzenschutzmittel eingesetzt, um Unkräuter im Acker zu vernichten. Allerdings kann dieser Einsatz auch Auswirkungen auf sogenannte Nicht-Zielarten haben. Dies sind solche Arten oder Artindividuen, die z.B. innerhalb vom Acker nicht in Konkurrenz mit den darauf wachsenden Getreidesorten stehen oder sich nicht innerhalb vom Feld befinden aber dennoch den Pflanzenschutzmitteln ausgesetzt sind. Um den Artenreichtum in halb-natürlichen Gebieten zu schützen, ist es daher notwendig eine Risikoabschätzung durchzuführen bevor ein Pflanzenschutzmittel für den Verkauf und die Anwendung zugelassen wird. Für terrestrische Nicht-Zielpflanzen erfolgt eine solche Risikoabschätzung basierend auf standardisierten Gewächshausexperimenten, in denen die Effekte auf der Ebene von Einzelindividuen gemessen werden. Um das letztliche Risiko im Freiland für ganze Pflanzengemeinschaften abzuschätzen, werden sogenannte Unsicherheitsfaktoren hinzugenommen. Allerdings stellen neuere Studien in Frage, ob der derzeitige Ansatz ausreichend sicher ist. Dies gilt vor allem in Bezug auf die aktuellen speziellen Schutzziele, die den Fokus auf den Schutz von Pflanzengemeinschaften und Artenreichtum legen. Es ist daher zwingend notwendig die Wissenslücken der derzeitigen Risikoabschätzung zu schließen und Optionen zu weiteren Studien zu geben, die das Risiko vom Einsatz von Pflanzenschutzmitteln für Nicht-Zielpflanzen realistischer abschätzen können. In meiner Dissertation nutze ich einen mechanistischen Modellierungsansatz um den Einfluss von Pflanzenschutzmitteln auf Nicht-Zielpflanzengemeinschaften zu untersuchen. Hierbei spreche ich die wesentlichen Wissenslücken und Unklarheiten der aktuellen Risikoabschätzung an und schlage zusammenfassend eine neue Option für eine realistischere Abschätzung des Risikos vor. Hierzu integriere ich den Einfluss von Herbiziden auf Einzelindividuen in das Pflanzengemeinschaftsmodell IBC-grass. In meiner ersten Studie vergleiche ich Modellvorhersagen von kurzzeitigen Herbizideffekten in künstlichen Artgemeinschaften mit experimentellen Daten. Mit der Studie zeige ich, dass das Modell den Einfluss von Herbiziden auf die Pflanzengemeinschaft realistisch vorhersagen kann. In der zweiten Studie fokussiere ich mich auf die Frage, ob Effekte auf weitere Pflanzeneigenschaften, insbesondere Fortpflanzungseigenschaften, wie zum Beispiel die Samenproduktion, im Rahmen der standardisierten Gewächshausstudien gemessen werden sollten. Die Studie zeigt, dass die derzeitig gemessenen Pflanzeneigenschaften am meisten Einfluss auf die Dynamiken einer Pflanzengesellschaft haben und somit schon geringe Schädigungen dieser Eigenschaften auf Individuenebene Auswirkungen für die Gemeinschaft haben. Dahingegen führten nur sehr starke Effekte auf die Fortpflanzungseigenschaften zu einem Einfluss auf Gemeinschaftsebene. Mit der letzten Studie zeige ich, dass der Modellansatz dazu genutzt werden kann Auswirkungen für unterschiedliche Pflanzengemeinschaften darzustellen. Zusammengefasst zeigen die Studien meiner Dissertation, dass mechanistische Modellierung eine geeignete Option für eine realistischere Risikoabschätzung ist. Auf Grund des besonderen Designs von IBC-grass können die durch derzeitige Gewächshausstudien zur Verfügung stehenden empirischen Daten in das Modell eingearbeitet werden und somit das Risiko auf Gemeinschaftsebene abgeschätzt werden. Mit Hilfe des Modells können mehrere Umweltbedingungen getestet werden und somit Extremszenarien abgedeckt werden. Meine Studien tragen dazu bei, zukünftige Risikoabschätzungen für Nicht-Zielpflanzen zu verbessern. KW - ecological modelling KW - pesticide KW - risk assessment KW - plant community KW - non-target organisms KW - ökologische Modellierung KW - Pestizide KW - Risikoabschätzung KW - Pflanzengemeinschaft KW - Nicht-Zielorganismen Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-429073 ER - TY - THES A1 - Schmidt, Ruth Maria T1 - Signalkaskaden und Steuermechanismen in den Speicheldrüsen von Dipteren T1 - Signalling pathways and control mechanisms in the salivary glands of Diptera N2 - Flüssigkeitssekretion und Proteinsekretion werden in Speicheldrüsen von Insekten über Hormone und Neurotransmitter gesteuert. Diese entfalten ihre physiologische Wirkung in den sekretorischen Drüsenzellen hauptsächlich über den zyklischen Adenosinmonophosphat (cAMP)-Signalweg und den Inositoltrisphosphat (IP3) / Ca2+-Signalweg. Die Mechanismen möglicher Wechselwirkungen zwischen diesen Signalwegen und ihre physiologischen Auswirkungen sind unzureichend bekannt. Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand die Frage, ob und wie sich der Ca2+-Signalweg und der cAMP-Signalweg in der Speicheldrüse der Diptere Calliphora vicina beeinflussen. Substanzen wie 5-Fluoro-α-Methyltryptamin und Histamin wurden in früheren Arbei-ten als Agonisten genutzt, um in den Speicheldrüsen von C. vicina selektiv den cAMP-Signalweg (getrennt vom IP3/Ca2+-Signalweg) zu aktivieren. Es zeigte sich in transepithelialen Potentialmessungen und mikrofluorometrischen Ca2+-Untersuchungen, dass beide Substanzen sowohl den cAMP-Weg als auch den Ca2+-Signalweg aktivierten. Die physiologischen Ursachen der Histamin-induzierten Ca2+-Erhöhung wurden genauer untersucht. Zusammengefasst zeigten diese Untersuchungen, dass Histamin wie 5-HT den cAMP-Weg und die Phosphoinositidkaskade aktivierte. Im Gegensatz zu den 5-HT-induzierten Ca2+-Oszillationen, welche durch interzelluläre Ca2+-Wellen synchronisiert werden, verursachte Histamin bei niedrigen Konzentrationen lokale Ca2+-Oszillationen in einzelnen Zellen (keine Wellen). Bei höheren Histamin-Konzentrationen war eine anhaltende Ca2+-Erhöhung oder ein synchrones Ca2+-beating in der gesamten Drüse zu beobachten. Des Weiteren wurde die Frage untersucht, ob eine Erhöhung der intrazellulären cAMP-Konzentration den IP3 Ca2+-Signalweg in den Epithelzellen der Speicheldrüse beeinflussen kann. Es zeigte sich, dass cAMP den durch schwellennahe 5-HT-Konzentrationen induzierten Ca2+-Anstieg verstärkte. Diese Verstärkung wurde durch eine PKA-vermittelte Sensitivierung des IP3-Rezeptor/Ca2+-Kanals für IP3 verursacht. Immunzytochemische Untersuchungen deuten dar-auf hin, dass die Proteinkinase A eng mit dem IP3-Rezeptor/Ca2+-Kanal assoziiert ist. Diese Messungen zeigen erstmals, dass auch bei Invertebraten der Botenstoff cAMP, PKA-vermittelt, den IP3-Rezeptor/Ca2+-Kanal des ER für IP3 sensitiviert. N2 - Fluid- and protein-secretion in the salivary glands of insects are controlled by hormones or neurotransmitters. These agonists activate two signalling cascades: the cAMP-pathway and the IP>sub>3/Ca-pathway. The functional crosstalk between these two signalling pathways is poorly understood. Functional crosstalk between cAMP-pathway and IP3/Ca2+-pathway was investigated in the salivary glands of the blowfly, Calliphora vicina. Histamine and 5-alpha-methyltryptamine were used in an attempt to activate the cAMP-pathway selectively, as suggested previously. By using transepithelial potential-measurements and microfluorometric Ca2+-imaging it was demonstrated that both substances activate the cAMP- and the IP3/Ca2+-pathway. The physiological effects of histamine were investigated in detail. These experiments show that histamine causes an intracellular Ca2+-elevation that, in some preparations exhibits oscillations with concentration-dependent frequencies. In contrast to 5-HT induced intracellular Ca2+-oscillations and propagating intercellular Ca2+-waves histamine produces local Ca2+-oscillations in single cells or synchronous Ca2+-beating in the whole gland. In addition the effects of increasing cAMP on the IP3/Ca2+-pathway in the salivary glands of the blowfly were studied. It could be demonstrated that cAMP augments the 5-HT-induced Ca2+-increase in glands stimulated with low doses of 5-HT. This potentiation is the result of a PKA-mediated sensitisation of the IP3-receptor/Ca2+-channel for IP3. Results of immunocytochemical analyses show that the PKA is spatially associated with the ER. These results show for the first time that in invertebrates as well as in vertebrates the second messenger cAMP sensitises the IP3-receptor/Ca2+-channel for IP3 by the action of a PKA. KW - Speichel KW - Speicheldrüse KW - Insekten KW - Calcium-Imaging KW - transepitheliales Potential KW - Signalkakaden KW - IP3 KW - cAMP KW - PKA KW - IP3-Rezeptor KW - salivary gland KW - blowfly KW - signalling pathways KW - IP3 KW - cyclic AMP KW - IP3-receptor Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-7714 ER - TY - THES A1 - Birkemeyer, Claudia Sabine T1 - Signal-metabolome interactions in plants T1 - Signalmolekuel-Metabolom Interaktionen in Pflanzen N2 - From its first use in the field of biochemistry, instrumental analysis offered a variety of invaluable tools for the comprehensive description of biological systems. Multi-selective methods that aim to cover as many endogenous compounds as possible in biological samples use different analytical platforms and include methods like gene expression profile and metabolite profile analysis. The enormous amount of data generated in application of profiling methods needs to be evaluated in a manner appropriate to the question under investigation. The new field of system biology rises to the challenge to develop strategies for collecting, processing, interpreting, and archiving this vast amount of data; to make those data available in form of databases, tools, models, and networks to the scientific community. On the background of this development a multi-selective method for the determination of phytohormones was developed and optimised, complementing the profile analyses which are already in use (Chapter I). The general feasibility of a simultaneous analysis of plant metabolites and phytohormones in one sample set-up was tested by studies on the analytical robustness of the metabolite profiling protocol. The recovery of plant metabolites proved to be satisfactory robust against variations in the extraction protocol by using common extraction procedures for phytohormones; a joint extraction of metabolites and hormones from plant tissue seems practicable (Chapter II). Quantification of compounds within the context of profiling methods requires particular scrutiny (Chapter II). In Chapter III, the potential of stable-isotope in vivo labelling as normalisation strategy for profiling data acquired with mass spectrometry is discussed. First promising results were obtained for a reproducible quantification by stable-isotope in vivo labelling, which was applied in metabolomic studies. In-parallel application of metabolite and phytohormone analysis to seedlings of the model plant Arabidopsis thaliana exposed to sulfate limitation was used to investigate the relationship between the endogenous concentration of signal elements and the ‘metabolic phenotype’ of a plant. An automated evaluation strategy was developed to process data of compounds with diverse physiological nature, such as signal elements, genes and metabolites – all which act in vivo in a conditional, time-resolved manner (Chapter IV). Final data analysis focussed on conditionality of signal-metabolome interactions. N2 - Die instrumentelle Analytik stellt mit ihrem unschätzbaren Methodenreichtum Analysenwerkzeuge zur Verfügung, die seit ihrem Einzug in die Biologie die Aufzeichnung immer komplexerer ‚Momentaufnahmen’ von biologischen Systemen ermöglichen. Konkret hervorzuheben sind dabei vor allem die sogenannten ‚Profilmethoden’. Die Anwendung von Profilmethoden zielt darauf ab, aus einer bestimmten Stoffklasse so viele zugehörige Komponenten wie nur möglich gleichzeitig zu erfassen. Für die Auswertung derart komplexer Daten müssen nun auch entsprechende Auswertungsmethoden bereit gestellt werden. Das neu entstandene Fachgebiet der Systembiologie erarbeitet deshalb Strategien zum Sammeln, Auswerten und Archivieren komplexer Daten, um dieses gesammelte Wissen in Form von Datenbanken, Modellen und Netzwerken der allgemeinen Nutzung zugänglich zu machen. Vor diesem Hintergrund wurde den vorhandenen Profilanalysen eine Methode zur Erfassung von Pflanzenhormonen hinzugefügt. Verschiedene Experimente bestätigten die Möglichkeit zur Kopplung von Pflanzenhormon- und Pflanzeninhaltsstoff(=metabolit)-Profilanalyse. In weiteren Untersuchungen wurde das Potential einer innovativen Standardisierungstechnologie für die mengenmässige Erfassung von Pflanzeninhaltsstoffen in biologischen Proben betrachtet (in vivo labelling mit stabilen Isotopen). Hormon- und Metabolitprofilanalyse wurden dann parallel angewandt, um Wechselwirkungen zwischen der Konzentration von Signalkomponenten und der Ausprägung des Stoffwechsels in Keimlingen der Modellpflanze Arabidopsis thaliana zu untersuchen. Es wurde eine Prozessierungsmethode entwickelt, die es auf einfache Art und Weise erlaubt, Daten oder Komponenten verschiedenen Ursprungs wie Signalelemente, Gene und Metabolite, die in biologischen Systemen zeitlich versetzt aktiv oder verändert erscheinen, im Zusammenhang zu betrachten. Die abschließende Analyse aller Daten richtet sich auf die Abschätzung der Bedingtheit von Signal-Metabolismus Interaktionen. KW - Pflanzenhormon KW - Metabolom KW - Metabolit KW - Massenspektrometrie KW - GC-MS KW - Profilmessung KW - Profilmethode KW - Derivatisierung KW - Wissensextraktion KW - Datenbank KW - Zeatin KW - Pathwaysuche KW - Pathway Abbildung KW - Metabolitprofil KW - Signalstoffe KW - zeatin KW - pathway search KW - pathway mapping KW - metabolite profiling KW - signal compounds Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-7144 ER - TY - THES A1 - Nwosu, Ebuka Canisius T1 - Sedimentary DNA-based reconstruction of cyanobacterial communities from Lake Tiefer See, NE Germany, for the last 11,000 years N2 - Climate change and human-driven eutrophication promote the spread of harmful cyanobacteria blooms in lakes worldwide, which affects water quality and impairs the aquatic food chain. In recent times, sedimentary ancient DNA-based (sedaDNA) studies were used to probe how centuries of climate and environmental changes have affected cyanobacterial assemblages in temperate lakes. However, there is a lack of information on the consistency between sediment-deposited cyanobacteria communities versus those of the water column, and on the individual role of natural climatic changes versus human pressure on cyanobacteria community dynamics over multi-millennia time scales. Therefore, this thesis uses sedimentary ancient DNA of Lake Tiefer See in northeastern Germany to trace the deposition of cyanobacteria along the water column into the sediment, and to reconstruct cyanobacteria communities spanning the last 11,000 years using a set of molecular techniques including quantitative PCR, biomarkers, metabarcoding, and metagenome sequence analyses. The results of this thesis proved that cyanobacterial composition and species richness did not significantly differ among different water depths, sediment traps, and surface sediments. This means that the cyanobacterial community composition from the sediments reflects the water column communities. However, there is a skewed sediment deposition of different cyanobacteria groups because of DNA alteration and/or deterioration during transport along the water column to the sediment. Specifically, single filament taxa, such as Planktothrix, are poorly represented in sediments despite being abundant in the water column as shown by an additional study of the thesis on cyanobacteria seasonality. In contrast, aggregate-forming taxa, like Aphanizomenon, are relatively overrepresented in sediment although they are not abundant in the water column. These different deposition patterns of cyanobacteria taxa should be considered in future DNA-based paleolimnological investigations. The thesis also reveals a substantial increase in total cyanobacteria abundance during the Bronze Age which is not apparent in prior phases of the early to middle Holocene and is suggested to be caused by human farming, deforestation, and excessive nutrient addition to the lake. Not only cyanobacterial abundance was influenced by human activity but also cyanobacteria community composition differed significantly between phases of no, moderate, and intense human impact. The data presented in this thesis are the first on sedimentary cyanobacteria DNA since the early Holocene in a temperate lake. The results bring together archaeological, historical climatic, and limnological data with deep DNA-sequencing and paleoecology to reveal a legacy impact of human pressure on lake cyanobacteria populations dating back to approximately 4000 years. N2 - Der Klimawandel und die vom Menschen verursachte Eutrophierung fördern die Ausbreitung schädlicher Cyanobakterienblüten in Seen weltweit, was die Wasserqualität und die aquatische Nahrungskette beeinträchtigt. In jüngster Zeit wurden sedimentäre DNA (sedaDNA)-Studien verwendet, um zu untersuchen, wie sich klimatische- und menschliche Umweltveränderungen von Jahrhunderten auf Cyanobakteriengemeinschaften in Seen ausgewirkt haben. Jedoch fehlen bislang Informationen, wie repräsentativ die im Sediment abgelagerten Cyanobakterien und deren DNA für die Gemeinschaften der Wassersäule sind, sowie zur individuellen Rolle natürlicher klimatischer Veränderungen gegenüber dem menschlichen Einflusses auf die Dynamik von Cyanobakterien über Zeitskalen von Jahrtausenden. Daher wurde in dieser Arbeit sedimentäre alte DNA (sedaDNA) des Tiefen Sees in Nordostdeutschland verwendet, um die Ablagerung von Cyanobakterien entlang der Wassersäule in das Sediment zu verfolgen. Ein Hauptteil dieser Arbeit bildete jedoch die Rekonstruktion von Cyanobakteriengemeinschaften der letzten 11.000 Jahre, unter Verwendung einer Reihe von molekularen Techniken, darunter quantitative PCR, Biomarker, Metabarcoding und Metagenom-Sequenzanalysen. Die Ergebnisse dieser Arbeit beweisen, dass die Cyanobakterien-Zusammensetzung und der Artenreichtum zwischen verschiedenen Wassertiefen, Sedimentfallen und Oberflächensedimenten nicht signifikant unterschiedlich ist. Das bedeutet, dass die Zusammensetzung der Cyanobakteriengemeinschaften aus den Sedimenten die Gemeinschaften der Wassersäule widerspiegelt. Aufgrund von DNA-Veränderungen und/oder -Abbau während des Transports entlang der Wassersäule zum Sediment kommt es jedoch zu einer verzerrten Sedimentablagerung verschiedener Cyanobakterien Arten. Insbesondere sind filamentose Arten wie Planktothrix in Sedimenten schlecht vertreten, obwohl sie, laut Ergebnissen einer zusätzlichen Studie dieser Arbeit zur Saisonalität von Cyanobakterien, in der Wassersäule reichlich vorhanden sind. Im Gegensatz dazu sind aggregatbildende Arten wie Aphanizomenon in Sedimenten relativ gesehen überrepräsentiert, obwohl sie in der Wassersäule relativ selten vorkommen. Diese unterschiedlichen Muster zur Sedimentablagerung verschiedener Cyanobakterien Arten sollten in zukünftigen DNA-basierten paläolimnologischen Untersuchungen berücksichtigt werden. Die Dissertation zeigt auch eine deutliche Zunahme der Cyanobakterien Abundanz während der Bronzezeit, die in vorhergehenden Phasen des frühen und mittleren Holozäns nicht erkennbar war. Dies ist wahrscheinlich durch menschliche Landwirtschaft, Entwaldung und übermäßige Nährstoffzufuhr in den See verursacht worden. Nicht nur die Abundanz von Cyanobakterien wurde durch menschliche Aktivitäten beeinflusst, sondern auch die Zusammensetzung von deren Gemeinschaften, die sich signifikant zwischen Phasen unterscheidet, die durch keinen, moderaten, und intensiven menschlichen Einfluss gekennzeichnet sind. Die in dieser Dissertation präsentierten Daten sind die ersten zu sedimentärer Cyanobakterien-DNA seit dem frühen Holozän eines Sees der gemäßigte Klimazone. Die Ergebnisse vereinen archäologische, historische, klimatische und limnologische Daten mit hochaufgelöster und Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierung und belegen, dass der menschliche Einfluss auf Cyanobakteriengemeinschaften in Seen etwa 4000 Jahre zurückreicht. KW - anthropogenic impact KW - paleoecology KW - high throughput sequencing KW - cyanobacteria biomarker KW - microbial diversity KW - microbial ecology KW - 7-methylheptadecane KW - 7-Methylheptadecan KW - anthropogene Einwirkung KW - Cyanobakterien-Biomarker KW - hoher Durchsatz Sequenzierung KW - mikrobielle Vielfalt KW - mikrobielle Ökologie KW - Paläoökologie Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-563590 ER - TY - THES A1 - Synodinos, Alexios D. T1 - Savanna dynamics under extreme conditions T1 - Savannendynamik unter extremen Bedingungen BT - insights from a mathematical model N2 - Savannas cover a broad geographical range across continents and are a biome best described by a mix of herbaceous and woody plants. The former create a more or less continuous layer while the latter should be sparse enough to leave an open canopy. What has long intrigued ecologists is how these two competing plant life forms of vegetation coexist. Initially attributed to resource competition, coexistence was considered the stable outcome of a root niche differentiation between trees and grasses. The importance of environmental factors became evident later, when data from moister environments demonstrated that tree cover was often lower than what the rainfall conditions would allow for. Our current understanding relies on the interaction of competition and disturbances in space and time. Hence, the influence of grazing and fire and the corresponding feedbacks they generate have been keenly investigated. Grazing removes grass cover, initiating a self-reinforcing process propagating tree cover expansion. This is known as the encroachment phenomenon. Fire, on the other hand, imposes a bottleneck on the tree population by halting the recruitment of young trees into adulthood. Since grasses fuel fires, a feedback linking grazing, grass cover, fire, and tree cover is created. In African savannas, which are the focus of this dissertation, these feedbacks play a major role in the dynamics. The importance of these feedbacks came into sharp focus when the notion of alternative states began to be applied to savannas. Alternative states in ecology arise when different states of an ecosystem can occur under the same conditions. According to this an open savanna and a tree-dominated savanna can be classified as alternative states, since they can both occur under the same climatic conditions. The aforementioned feedbacks are critical in the creation of alternative states. The grass-fire feedback can preserve an open canopy as long as fire intensity and frequency remain above a certain threshold. Conversely, crossing a grazing threshold can force an open savanna to shift to a tree-dominated state. Critically, transitions between such alternative states can produce hysteresis, where a return to pre-transition conditions will not suffice to restore the ecosystem to its original state. In the chapters that follow, I will cover aspects relating to the coexistence mechanisms and the role of feedbacks in tree-grass interactions. Coming back to the coexistence question, due to the overwhelming focus on competition and disturbance another important ecological process was neglected: facilitation. Therefore, in the first study within this dissertation I examine how facilitation can expand the tree-grass coexistence range into drier conditions. For the second study I focus on another aspect of savanna dynamics which remains underrepresented in the literature: the impacts of inter-annual rainfall variability upon savanna trees and the resilience of the savanna state. In the third and final study within this dissertation I approach the well-researched encroachment phenomenon from a new perspective: I search for an early warning indicator of the process to be used as a prevention tool for savanna conservation. In order to perform all this work I developed a mathematical ecohydrological model of Ordinary Differential Equations (ODEs) with three variables: soil moisture content, grass cover and tree cover. Facilitation: Results showed that the removal of grass cover through grazing was detrimental to trees under arid conditions, contrary to expectation based on resource competition. The reason was that grasses preserved moisture in the soil through infiltration and shading, thus ameliorating the harsh conditions for trees in accordance with the Stress Gradient Hypothesis. The exclusion of grasses from the model further demonstrated this: tree cover was lower in the absence of grasses, indicating that the benefits of grass facilitation outweighed the costs of grass competition for trees. Thus, facilitation expanded the climatic range where savannas persisted into drier conditions. Rainfall variability: By adjusting the model to current rainfall patterns in East Africa, I simulated conditions of increasing inter-annual rainfall variability for two distinct mean rainfall scenarios: semi-arid and mesic. Alternative states of tree-less grassland and tree-dominated savanna emerged in both cases. Increasing variability reduced semi-arid savanna tree cover to the point that at high variability the savanna state was eliminated, because variability intensified resource competition and strengthened the fire disturbance during high rainfall years. Mesic savannas, on the other hand, became more resilient along the variability gradient: increasing rainfall variability created more opportunities for the rapid growth of trees to overcome the fire disturbance, boosting the chances of savannas persisting and thus increasing mesic savanna resilience. Preventing encroachment: The breakdown in the grass-fire feedback caused by heavy grazing promoted the expansion of woody cover. This could be irreversible due to the presence of alternative states of encroached and open savanna, which I found along a simulated grazing gradient. When I simulated different short term heavy grazing treatments followed by a reduction to the original grazing conditions, certain cases converged to the encroached state. Utilising woody cover changes only during the heavy grazing treatment, I developed an early warning indicator which identified these cases with a high risk of such hysteresis and successfully distinguished them from those with a low risk. Furthermore, after validating the indicator on encroachment data, I demonstrated that it appeared early enough for encroachment to be prevented through realistic grazing-reduction treatments. Though this dissertation is rooted in the theory of savanna dynamics, its results can have significant applications in savanna conservation. Facilitation has only recently become a topic of interest within savanna literature. Given the threat of increasing droughts and a general anticipation of drier conditions in parts of Africa, insights stemming from this research may provide clues for preserving arid savannas. The impacts of rainfall variability on savannas have not yet been thoroughly studied, either. Conflicting results appear as a result of the lack of a robust theoretical understanding of plant interactions under variable conditions. . My work and other recent studies argue that such conditions may increase the importance of fast resource acquisition creating a ‘temporal niche’. Woody encroachment has been extensively studied as phenomenon, though not from the perspective of its early identification and prevention. The development of an encroachment forecasting tool, as the one presented in this work, could protect both the savanna biome and societies dependent upon it for (economic) survival. All studies which follow are bound by the attempt to broaden the horizons of savanna-related research in order to deal with extreme conditions and phenomena; be it through the enhancement of the coexistence debate or the study of an imminent external threat or the development of a management-oriented tool for the conservation of savannas. N2 - Savannen sind gekennzeichnet durch die Koexistenz von Gräsern und Bäumen. Sie bedecken circa 20% der globalen Landfläche und Millionen Menschen hängen von ihrer Intaktheit ab. Allerdings bedrohen sowohl der Klimawandel als auch Landnutzung dieses Biom. In dieser Studie werden die Existenz von Savannen unter sehr trockenen Bedingungen, ihre Reaktionen auf steigende Fluktuationen des Niederschlags und die Quantifizierung ihrer Resilienz untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass unter extrem trockenen Bedingungen der positive Einfluss von Gräsern auf Bäume eine wichtige Rolle für das Überleben der Bäume spielt. Kommt es hingegen zu einer Erhöhung der Niederschlagsvariabilität, wird dadurch eine starke Konkurrenz zwischen den beiden Lebensformen verursacht. Die Resilienz der Savannen und ihre Veränderungen lassen sich quantifizieren und mit dem im letzten Teil dieser Dissertation präsentierten Werkzeug erkennen. Meine Arbeit demonstriert, dass sich der Fokus der aktuellen Savannenforschung weiten muss, um die Reaktionen von Savannen auf sich ändernde Umweltbedingungen vorherzusagen. Um Savannen langfristig zu erhalten, müssen jedoch die bereits vorhandenen Grundlagen in einem soliden Framework zusammen gebracht werden. KW - Savanna ecology KW - mathematical modelling KW - coexistence mechanisms KW - Savanna resilience KW - woody encroachment KW - early warning signals KW - mathematische Modelierung KW - Koexistenz Mechanismen KW - Savannen Resilienz KW - Verbuschung Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-395000 ER - TY - THES A1 - Hiller, Matthias T1 - Sample preparation of membrane proteins suitable for solid-state MAS NMR and development of assignment strategies T1 - Präparation von Membranproteinen für Strukturuntersuchungen mittels Festkörper MAS NMR und die Entwicklung von Zuordnungsstrategien N2 - Although the basic structure of biological membranes is provided by the lipid bilayer, most of the specific functions are carried out by membrane proteins (MPs) such as channels, ion-pumps and receptors. Additionally, it is known, that mutations in MPs are directly or indirectly involved in many diseases. Thus, structure determination of MPs is of major interest not only in structural biology but also in pharmacology, especially for drug development. Advances in structural biology of membrane proteins (MPs) have been strongly supported by the success of three leading techniques: X-ray crystallography, electron microscopy and solution NMR spectroscopy. However, X-ray crystallography and electron microscopy, require highly diffracting 3D or 2D crystals, respectively. Today, structure determination of non-crystalline solid protein preparations has been made possible through rapid progress of solid-state MAS NMR methodology for biological systems. Castellani et. al. solved and refined the first structure of a microcrystalline protein using only solid-state MAS NMR spectroscopy. These successful application open up perspectives to access systems that are difficult to crystallise or that form large heterogeneous complexes and insoluble aggregates, for example ligands bound to a MP-receptor, protein fibrils and heterogeneous proteins aggregates. Solid-state MAS NMR spectroscopy is in principle well suited to study MP at atomic resolution. In this thesis, different types of MP preparations were tested for their suitability to be studied by solid-state MAS NMR. Proteoliposomes, poorly diffracting 2D crystals and a PEG precipitate of the outer membrane protein G (OmpG) were prepared as a model system for large MPs. Results from this work, combined with data found in the literature, show that highly diffracting crystalline material is not a prerequirement for structural analysis of MPs by solid-state MAS NMR. Instead, it is possible to use non-diffracting 3D crystals, MP precipitates, poorly diffracting 2D crystals and proteoliposomes. For the latter two types of preparations, the MP is reconstituted into a lipid bilayer, which thus allows the structural investigation in a quasi-native environment. In addition, to prepare a MP sample for solid-state MAS NMR it is possible to use screening methods, that are well established for 3D and 2D crystallisation of MPs. Hopefully, these findings will open a fourth method for structural investigation of MP. The prerequisite for structural studies by NMR in general, and the most time consuming step, is always the assignment of resonances to specific nuclei within the protein. Since the last few years an ever-increasing number of assignments from solid-state MAS NMR of uniformly carbon and nitrogen labelled samples is being reported, mostly for small proteins of up to around 150 amino acids in length. However, the complexity of the spectra increases with increasing molecular weight of the protein. Thus the conventional assignment strategies developed for small proteins do not yield a sufficiently high degree of assignment for the large MP OmpG (281 amino acids). Therefore, a new assignment strategy to find starting points for large MPs was devised. The assignment procedure is based on a sample with [2,3-13C, 15N]-labelled Tyr and Phe and uniformly labelled alanine and glycine. This labelling pattern reduces the spectral overlap as well as the number of assignment possibilities. In order to extend the assignment, four other specifically labelled OmpG samples were used. The assignment procedure starts with the identification of the spin systems of each labelled amino acid using 2D 13C-13C and 3D NCACX correlation experiments. In a second step, 2D and 3D NCOCX type experiments are used for the sequential assignment of the observed resonances to specific nuclei in the OmpG amino acid sequence. Additionally, it was shown in this work, that biosynthetically site directed labelled samples, which are normally used to observe long-range correlations, were helpful to confirm the assignment. Another approach to find assignment starting points in large protein systems, is the use of spectroscopic filtering techniques. A filtering block that selects methyl resonances was used to find further assignment starting points for OmpG. Combining all these techniques, it was possible to assign nearly 50 % of the observed signals to the OmpG sequence. Using this information, a prediction of the secondary structure elements of OmpG was possible. Most of the calculated motifs were in good aggreement with the crystal structures of OmpG. The approaches presented here should be applicable to a wide variety of MPs and MP-complexes and should thus open a new avenue for the structural biology of MPs. N2 - Biologische Membranen bestehen hauptsächlich aus Lipiden, ihre Funktion wird jedoch vor allem durch die eingebetteten Membranproteine (z.B. Kanäle, Ionenpumpen und Rezeptoren) bestimmt. Mutationen in dieser Proteinklasse können zum Auftreten verschiedener Krankheitsbilder führen, weshalb die Untersuchung der dreidimensionalen Struktur von Membranproteinen nicht nur von strukturbiologischem, sondern auch von pharmakologischem Interesse ist. In den letzten Jahren wurde eine Methode, die Festkörper NMR Spektroskopie, für Strukturuntersuchungen an Proteinproben im festen Aggregatzustand entwickelt. Diese Arbeit beschäftigt sich mit drei verschiedenen Präparationsarten von Membranproteinen, die eine Aufnahme von hochaufgelösten Festkörper NMR Spektren erlauben. Als Modelsystem wurde das Protein G der äußeren Membrane (outer membrane protein G, OmpG) von Escherichia coli gewählt. Eine wichtige Vorraussetzung zur Berechnung der Proteinstruktur aus den NMR-Spektren, ist die Zuordnung der einzelnen Signale zur jeweiligen Aminosäure in der Proteinsequenz. In dieser Arbeit wurde eine Methode entwickelt, die das Auffinden von Startpunkten für die sequentielle Zuordnung in großen Membranproteinen, wie zum Bsp. OmpG (281 Aminosäuren), erlaubt. Multidimensionale NMR Experimente mit verschieden spezifisch markierten Proben wurden durchgeführt und ermöglichten die Zuordnung von 50 % der NMR Signale der OmpG Proteinsequenz. Zur Überprüfung der gewonnenen Daten wurden diese zur Vorhersage von Sekundärstrukturelementen genutzt. Es konnte gezeigt werden, dass die berechneten Strukturmotive in guter Übereinstimmung zu den bisher veröffentlichten OmpG Strukturen liegen. Die in dieser Arbeit angewendeten Methoden sollten auf eine Vielzahl anderer Membranprotein anwendbar und somit einen neuen Weg zur Strukturbiologischen Untersuchung von Membranproteinen eröffnen. KW - Membranproteine KW - Festkörper NMR Spektroskopie KW - Proteinstruktur KW - OmpG KW - Membrane protein KW - solid-state MAS NMR KW - protein structure KW - OmpG Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-37246 ER - TY - THES A1 - Rolke, Daniel T1 - Räumliche und zeitliche Expressionsmuster sowie Funktionen der Serotonin-Rezeptor-Subtypen der Honigbiene, Apis mellifera L., 1758 T1 - Spatial and temporal expression patterns as well as functions of the serotonin-receptor-subtypes in the honey bee, Apis mellifera L., 1758 N2 - Das biogene Amin Serotonin (5-Hydroxytryptamin, 5-HT) agiert als wichtiger chemischer Botenstoff bei einer Vielzahl von Organismen. Das durch 5 HT vermittelte Signal wird dabei durch spezifische Rezeptoren wahrgenommen und in eine zelluläre Reaktion umgesetzt. Diese 5 HT Rezeptoren gehören überwiegend zur Familie der G Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCRs). Die Honigbiene Apis mellifera bietet unter anderem aufgrund ihrer eusozialen Lebensweise vielfältige Ansatzpunkte zur Erforschung der Funktionen des serotonergen Systems in Insekten. Bei A. mellifera wurden bereits vier 5-HT-Rezeptor-Subtypen beschrieben und molekular sowie pharmakologisch charakterisiert: Am5 HT1A, Am5 HT2α, Am5 HT2β und Am5 HT7. Ziel dieser Arbeit war es, gewebespezifische sowie alters- und tageszeitabhängige Expressionsmuster der 5 HT Rezeptor-Subtypen zu untersuchen, um zu einem umfassenden Verständnis des serotonergen Systems der Honigbiene beizutragen und eine Basis zur Hypothesenentwicklung für mögliche physiologische Funktionen zu schaffen. Es wurde die Expression der 5 HT Rezeptorgene sowohl im zentralen Nervensystem, als auch in Teilen des Verdauungs-, Exkretions- und Speicheldrüsensystems gemessen. Dabei konnte gezeigt werden, dass die untersuchten 5-HT-Rezeptor-Subtypen generell weit im Organismus der Honigbiene verbreitet sind. Interessanterweise unterschieden sich die untersuchten Gewebe hinsichtlich der mRNA-Expressionsmuster der untersuchten Rezeptoren. Während beispielsweise im Gehirn Am5 ht1A und Am5 ht7 stärker als Am5 ht2α und Am5 ht2β exprimiert wurden, zeigte sich in Darmgewebe ein umgekehrtes Muster. Es war bereits bekannt, dass es bei der Expression der Am5-ht2-Gene zu alternativem Spleißen kommt. Dies führt zur Entstehung der verkürzten mRNA-Varianten Am5 ht2αΔIII und Am5 ht2βΔII. Die daraus resultierenden Proteine können nicht als funktionelle GPCRs agieren. Es konnte gezeigt werden, dass diese verkürzten Spleißvarianten dennoch ubiquitär in der Honigbiene exprimiert werden. Bemerkenswerterweise wurden gewebeübergreifende Ähnlichkeiten der Expressionsmuster der Spleißvarianten gegenüber deren zugehörigen Volllängenvarianten festgestellt, welche auf Funktionen der verkürzten Varianten in vivo hindeuten. Im Hinblick auf die bei A. mellifera hauptsächlich altersbedingte Arbeitsteilung wurde die Expression der 5 HT Rezeptor-Subtypen in Gehirnen von unterschiedlich alten Arbeiterinnen mit unterschiedlichen sozialen Rollen verglichen. Während auf mRNA-Ebene keines der vier 5 HT Rezeptor-Subtypen eine altersabhängig unterschiedliche Expression zeigte, konnte für das Am5-HT1A-Protein eine höhere Konzentration in den Gehirnen älterer Tiere gefunden werden. Dies deutet auf eine posttranskriptionale Regulation der 5 HT1A Rezeptorexpression hin, welche im Zusammenhang mit der Arbeitsteilung stehen könnte. Es erfolgte die Untersuchung tageszeitlicher Änderungen sowohl der Expression der 5 HT Rezeptor-Subtypen, als auch des biogenen Amins 5 HT selbst. Während es in den Gehirnen von Arbeiterinnen, welche unter natürlichen Bedingungen gehalten wurden, zu keiner tageszeitabhängigen Veränderung des 5 HT-Titers kam, zeigte die mRNA-Expression von Am5-ht2α und Am5-ht2β eine periodische Oszillation mit Zunahme während des Tages und Abnahme während der Nacht. Diese Regulation wird durch externe Faktoren hervorgerufen und ist nicht auf einen endogenen circadianen Rhythmus zurückzuführen. Dies ging aus der Wiederholung der Expressionsmessungen an Gehirnen von Bienen, welche unter konstanten Laborbedingungen gehalten wurden, hervor. Weiterhin wurde die Beteiligung des serotonergen Systems an der Steuerung von Aspekten des circadianen lokomotorischen Aktivitätsrhythmus anhand von Verhaltensexperimenten untersucht. Mit 5 HT gefütterte Arbeiterinnen zeigten dabei unter konstanten Bedingungen eine längere Periode des Aktivitätsrhythmus als Kontrolltiere. Dies deutet auf einen Einfluss von 5 HT auf die Modulation der Synchronisation der inneren Uhr hin. Die vorliegenden Ergebnisse tragen wesentlich zum tieferen Verständnis des serotonergen Systems der Honigbiene bei und bieten Ansatzpunkte für weitergehende Studien zur Funktion von 5 HT im Zusammenhang mit der Modulation von physiologischen Prozessen, Arbeitsteilung und circadianen Rhythmen. N2 - The biogenic amine serotonin (5-hydroxytryptamine, 5-HT) acts as an important chemical messenger in a variety of organisms. The 5 HT-mediated signal is perceived by specific receptors and converted to a cellular response. This 5 HT receptors mainly belong to the family of G protein-coupled receptors (GPCRs). The honeybee offers various starting points to explore the functions of the serotonergic system in insects, among other things because of their eusocial lifestyle. In A. mellifera four 5-HT receptor subtypes have been described and molecularly and pharmacologically characterized: Am5 HT1A, Am5 HT2α, Am5 HT2β and Am5 HT7. The aim of this study was to investigate the tissue-specific and age- and daytime-dependent expression patterns of the 5 HT receptor subtypes in order to contribute to a comprehensive understanding of the serotonergic system in A. mellifera. The expression of the 5 HT receptor genes was measured in the central nervous system, as well as in parts of the digestive, excretory and salivary system. It was shown that the investigated 5-HT receptor subtypes are widely distributed in the honeybee. Interestingly, the tissues examined differed with regard to the mRNA expression pattern of the studied receptors. While in the brain the expression of Am5 ht1A and Am5 ht7 was higher than that of Am5 ht2α and Am5 ht2β, the opposite held true for intestinal tissue. It was already known that alternative splicing occurs in the expression of both Am5-ht2 genes. This leads to the formation of the truncated mRNA variants Am5 ht2αΔIII and Am5 ht2βΔII. The resulting proteins cannot act as functional GPCRs. However, it was demonstrated that these truncated splice variants are still ubiquitously expressed in the honeybee. Remarkably, similarities in the expression patterns of the shortened splice variants towards their corresponding full length variants were found throughout different tissues that indicate in vivo functions of the shortened variants. In view of the mainly age related division of labor in A. mellifera, the expression of the 5 HT receptor subtypes was compared in brains of different aged workers with different social roles. While none of the four 5 HT receptor subtypes showed an age-dependent differential expression at the mRNA level, a higher concentration in the brains of older animals could be found for the Am5-HT1A protein. This points to a post-transcriptional regulation of 5 HT1A receptor expression, which could be associated with the division of labor. It was carried out the investigation of diurnal changes in both the expression of the 5 HT receptor subtypes, and of the biogenic amine 5 HT itself. While in the brains of workers, which were kept under natural conditions, no daytime-dependent changes of the 5 HT titer could be found, the mRNA expression of Am5 ht2α and Am5-ht2β showed a periodic oscillation with an increase during the day and a decrease at night. This regulation is caused by external factors and not due to an endogenous circadian rhythm. That was shown by the repetition of the expression measurements on brains of bees, which were kept under constant laboratory conditions. Furthermore, the involvement of the serotonergic system in controlling aspects of circadian locomotor activity rhythm was investigated in behavioral experiments. Under constant conditions, worker bees which were fed with 5 HT showed a longer period of locomotor rhythm than control animals. This suggests an influence of 5 HT in the modulation of the synchronization of the internal clock. In conclusion, the present results contribute to a more detailed understanding of the serotonergic system of the honeybee and provide a basis for further studies on the function of 5 HT in connection with the modulation of physiological processes, division of labor and circadian rhythms. KW - Serotonin KW - Rezeptor KW - Honigbiene KW - serotonin KW - receptors KW - honey bee Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-96667 ER - TY - THES A1 - Schewe, Bettina T1 - Räumliche und zeitliche Aspekte der intrazellulären pH-Regulation in Epithelien T1 - Spatial and temporal characteristics of intracellular pH-regulation in epithelial cells N2 - Die Speicheldrüsen der Schmeißfliege Calliphora vicina produzieren bei Stimulierung mit dem Neurohormon Serotonin (5-Hydroxytryptamine, 5-HT) einen KCl-reichen Primärspeichel. Der transepitheliale K+-Transport wird durch eine apikal lokalisierte vakuoläre H+-ATPase (V-ATPase) energetisiert. Stimulierung der Speicheldrüsen mit 5-HT aktiviert die apikale V-ATPase, die Protonen aus der Zelle in das Drüsenlumen transportiert. Trotz des auswärts gerichteten Protonentransportes führt die 5-HT-Stimulierung kurioserweise zu einer intrazellulären Ansäuerung. Die Ursachen dieser 5-HT-induzierten Ansäuerung waren unzureichend untersucht. Deshalb war das Ziel dieser Arbeit die Identifikation aller Transporter, die an der intrazellulären pH-(pHi)-Regulation in unstimulierten Speicheldrüsen von Calliphora vicina beteiligt sind und an der Entstehung und Regulation der 5-HT-induzierten pHi-Änderungen mitwirken. Von besonderem Interesse war hierbei die funktionelle Mitwirkung der V-ATPase, deren Beteiligung an der pHi-Regulation in tierischen Zellen bisher wenig untersucht war. Wesentliche Ergebnisse dieser Arbeit waren: • Messungen des pHi-Wertes in der unstimulierten Drüse zeigten, dass vor allem die V-ATPase und mindestens ein Na+-abhängiger HCO3--Transporter an der Aufrechterhaltung des Ruhe-pHi beteiligt sind. • Zur Wiederherstellung des Ruhe-pHi nach einer intrazellulären Ansäuerung (NH4Cl-Vorpuls) tragen ebenfalls im Wesentlichen die V-ATPase und mindestens ein Na+-abhängiger HCO3--Transporter bei. Der Na+/H+-Antiporter hat in der unstimulierten Drüse keinen messbaren Einfluss auf den Ruhe-pHi. • Die Wiederherstellung des Ruhe-pHi nach einer intrazellulären Alkalisierung (Na-acetat-Vorpuls) ist Cl--abhängig, aber auch unter extremen Bedingungen waren die Zellen noch in der Lage sich vollständig von einer intrazellullären Alkalisierung zu erholen. Einen entscheidenden Anteil daran hat offenbar die hohe intrazelluläre Pufferkapazität. • Ein Na+-abhängiger Glutamat-Transporter ist per se kein pHi-regulierender Transporter, seine Aktivität hat jedoch Einfluss auf den Ruhe-pHi in der unstimulierten Speicheldrüse von Calliphora vicina. • 10 nM 5-HT induzieren in den Calliphora Speicheldrüsen eine intrazelluläre Ansäuerung. An dieser Ansäuerung ist der Na+/H+-Antiporter entscheidend beteiligt. Auch eine klare Cl--Abhängigkeit der 5-HT-induzierten Ansäuerung konnte beobachtet werden. Wahrscheinlich ist eine gekoppelte Aktivität von Na+/H+-Antiporter und Cl-/HCO3--Antiporter. • Messungen mit einem O2-empfindlichen Fluoreszenzfarbstoff zeigten, dass Stimulierung der Speicheldrüsen mit 5-HT die Zellatmung aktivierte. Der cAMP- und der IP3/Ca2+-Weg tragen auf komplexe Weise zu der 5-HT-induzierten Aktivierung der Zellatmung und damit auch zu den 5-HT-induzierten pHi-Änderungen bei. • Mit molekularbiologischen Untersuchungen ist es gelungen den Na+-abhängigen Glutamat-Transporter, den Na+/H+-Antiporter, die Carboanhydrase und die Untereinheit C der V-ATPase in den Calliphora Speicheldrüsen direkt nachzuweisen. Zudem konnte erstmals der direkte Nachweis für die Expression eines nH+/K+-Antiporters in den Speicheldrüsen von Calliphora vicina erbracht werden. Diese Arbeit trug ganz wesentlich zum Verständnis der pHi-Regulation in der unstimulierten und stimulierten Speicheldrüse von Calliphora vicina bei. Mechanismen die zur Aufrechterhaltung und Wiederherstellung des Ruhe-pHi nach einer intrazellulären Ansäuerung bzw. Alkalisierung beitragen, konnten mit pHi-Messungen und auch molekularbiologisch nachgewiesen werden. Die Mechanismen, welche die 5-HT-induzierte intrazelluläre Ansäuerung verursachen, konnten ebenfalls aufgeklärt werden. Zudem wurde an den Calliphora Speicheldrüsen eine neue optische Methode zur Messung des O2-Verbrauchs in tierischen Geweben etabliert. N2 - The tubular salivary glands of the blowfly Calliphora vicina consist of a single layer of epithelial cells. Stimulation with the neurohormone serotonin (5-hydroxytryptamine,5-HT) induces the secretion of a KCl-rich primary saliva. Transepithelial K+-transport is energized by a vacuolar-type H+-ATPase (V-ATPase) which is located in the apical membrane. 5-HT stimulates the apical V-ATPase which transports protons out of the cells into the lumen of the glands. Despite this outward directed proton transport, 5-HT stimulation leads to an intracellular acidification. The causes of this intracellular acidification were poorly understood. Therefore the aim of this thesis was the identification of all pHi regulating transporters which are involved in pHi regulation in the unstimulated salivary glands of Calliphora vicina and which contribute to the 5-HT-induced pHi changes. Of special interest was the functional role of the V-ATPase,whose contribution to pHi regulation in animal cells is, as yet, not well studied. Key results were: • pHi measurements in unstimulated glands showed that mainly the V-ATPase and at least one Na+-dependent HCO3--transporter are involved in maintenance of resting pHi. • V-ATPase and at least one Na+-dependent HCO3--transporter are also necessary for the recovery from an intracellular acidification (NH4Cl prepulse). • Recovery from an intracellular alkali load (Na-acetate prepulse) is partially Cl--dependent. • A Na+ dependent gluatamate-transporter is present in Calliphora salivary glands and its activity affects the resting pHi. • 10 nM 5-HT induce an intracellular acidification. This acidification is Na+-dependent, EIPA-sensitive and also Cl--dependent. No DIDS-sensitivity was observed. A coupled activity of a Na+/H+-antiporter and a Cl-/HCO3- -antiporter was suggested. • Using O2-sensitive fluorescent microbeads I could show that 5-HT stimulation of the Calliphora salivary glands activates cellular respiration. The cAMP and Ca2+-signalling pathways contribute in a complex manner to the 5-HT-induced activation of cellular respiration and consequently, also to the 5-HT-induced intracellular acidification. • The expression of a Na+ dependent glutamate-transporter, a Na+/H+-antiporter, a carbonic anhydrase, subunit C of the V-ATPase and a nH+/K+-antiporter were determined on mRNA level by RT-PCR. This thesis contributes significantly to the understanding of pHi regulation in unstimulated and stimulated salivary glands of Calliphora vicina. Mechanisms which contribute to the maintenance and recovery of resting pHi were identified by using pHi measurements and molecular biological techniques. Mechanisms which are responsible for the 5-HT-induced intracellular acidification were also clarified. Furthermore a new optical method for measuring O2 consumption in animals cells was established by using the Calliphora salivary glands as a model. KW - pH-Regulation KW - V-ATPase KW - Speichelsekretion KW - Epithelien KW - Calliphora KW - pH-regulation KW - V-ATPase KW - saliva secretion KW - epithelia KW - Calliphora Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-26879 ER - TY - THES A1 - Esmaeeli Moghaddam Tabalvandani, Mariam T1 - ROS Generation in Human Aldehyde Oxidase And the Effects of ROS and Reactive Sulfhydryl on the Activity of the Enzyme T1 - ROS-Erzeugung in Humane Aldehydoxidase und die Auswirkungen von ROS und reaktivem Sulfhydryl auf die Aktivität des Enzyms N2 - Aldehyde oxidases (AOXs) (E.C. 1.2.3.1) are molybdoflavo-enzymes belonging to the xanthine oxidase (XO) family. AOXs in mammals contain one molybdenum cofactor (Moco), one flavin adenine dinucleotide (FAD) and two [2Fe-2S] clusters, the presence of which is essential for the activity of the enzyme. Human aldehyde oxidase (hAOX1) is a cytosolic enzyme mainly expressed in the liver. hAOX1is involved in the metabolism of xenobiotics. It oxidizes aldehydes to their corresponding carboxylic acids and hydroxylates N-heterocyclic compounds. Since these functional groups are widely present in therapeutics, understanding the behaviour of hAOX1 has important implications in medicine. During the catalytic cycle of hAOX1, the substrate is oxidized at Moco and electrons are internally transferred to FAD via the FeS clusters. An electron acceptor juxtaposed to the FAD receives the electrons and re-oxidizes the enzyme for the next catalytic cycle. Molecular oxygen is the endogenous electron acceptor of hAOX1 and in doing so it is reduced and produces reactive oxygen species (ROS) including hydrogen peroxide (H2O2) and superoxide (O2.-). The production of ROS has patho-physiological importance, as ROS can have a wide range of effects on cell components including the enzyme itself. In this thesis, we have shown that hAOX1 loses its activity over multiple cycles of catalysis due to endogenous ROS production and have identified a cysteine rich motif that protects hAOX1 from the ROS damaging effects. We have also shown that a sulfido ligand, which is bound at Moco and is essential for the catalytic activity of the enzyme, is vulnerable during turnover. The ROS produced during the course of the reaction are also able to remove this sulfido ligand from Moco. ROS, in addition, oxidize particular cysteine residues. The combined effects of ROS on the sulfido ligand and on specific cysteine residues in the enzyme result in its inactivation. Furthermore, we report that small reducing agents containing reactive sulfhydryl groups, in a selective manner, inactivate some of the mammalian AOXs by modifying the sulfido ligand at Moco. The mechanism of ROS production by hAOX1 is another scope that has been investigated as part of the work in this thesis. We have shown that the ratio of type of ROS, i.e. hydrogen peroxide (H2O2) and superoxide (O2.-), produced by hAOX1 is determined by a particular position on a flexible loop that locates in close proximity of FAD. The size of the cavity at the ROS producing site, i.e. the N5 position of the FAD isoalloxazine ring, kinetically affects the amount of each type of ROS generated by hAOX1. Taken together, hAOX1 is an enzyme with emerging importance in pharmacological and medical studies, not only due to its involvement in drug metabolism, but also due to ROS production which has physiological and pathological implications. N2 - Aldehyd-Oxidasen (AOXs) (E.C. 1.2.3.1) sind Molybdo-Flavo-Enzyme aus der Familie der Xanthin-Oxidasen (XO). AOXs in Säugetieren enthalten einen Molybdän-Cofaktor (Moco), ein Flavin-Adenosin-Dinukleotid (FAD) und zwei [2Fe-2S]-Cluster, deren Anwesenheit für die Aktivität des Enzyms essentiell ist. Die Humane Aldehyd-Oxidase (hAOX1) ist ein zytosolisches Enzym, das hauptsächlich in der Leber exprimiert wird und am Stoffwechsel von Xenobiotika beteiligt ist. hAOX1 oxidiert Aldehyde zu ihren entsprechenden Carbonsäuren und hydroxyliert N-heterocyclische Verbindungen. Da diese funktionellen Gruppen in Therapeutika weit verbreitet sind, hat das Verständnis des Verhaltens von hAOX1 wichtige Auswirkungen auf medizinische Studien. Während des Katalysezyklus von hAOX1 wird das Substrat an Moco oxidiert und die Elektronen werden über die FeS-Cluster intern auf FAD übertragen. Ein Elektronenakzeptor am FAD nimmt die Elektronen auf und re-oxidiert das Enzym für den nächsten Katalysezyklus. Molekularer Sauerstoff ist der endogene Elektronenakzeptor von hAOX1, der reduziert wird und reaktive Sauerstoffspezies (ROS) einschließlich Wasserstoffperoxid (H2O2) und Superoxid (O2.-) produziert. Die Produktion von ROS hat pathophysiologische Bedeutung mit weitreichenden Auswirkungen auf die Zellbestandteile und das Enzym selbst. In der vorliegenden Arbeit haben wir gezeigt, dass hAOX1 aufgrund der endogenen ROS-Produktion seine Aktivität über mehrere Katalysezyklen verliert und haben ein Cystein-reiches Motiv identifiziert, das hAOX1 vor den ROS-schädigenden Wirkungen schützt. Wir haben auch gezeigt, dass ein an Moco gebundener und für die katalytische Aktivität des Enzyms essentieller Sulfidoligand unter reduzierenden Bedingungen anfällig ist. Die im Verlauf der Reaktion entstehenden ROS sind in der Lage, diesen Sulfidoliganden aus dem Moco zu entfernen. ROS oxidieren auch bestimmte Cysteinreste. Die kombinierten Effekte von ROS auf den Sulfidoliganden und Cysteine führen zu einer Inaktivierung des Enzyms. Darüber hinaus berichten wir, dass Reduktionsmittel, die eine reaktive Sulfhydrylgruppe enthalten, selektiv einige der Säuger-AOX inaktivieren, indem sie den Sulfidoliganden beim Moco modifizieren. Der Mechanismus der ROS-Produktion durch hAOX1 ist ein weiterer Bereich, der im Rahmen dieser Arbeit untersucht wurde. Wir haben gezeigt, dass die Art von ROS, d. h. Wasserstoffperoxid (H2O2) und Superoxid (O2.-), die von hAOX1 produziert wird, durch eine bestimmte Position auf einem flexiblen Loop bestimmt wird, die sich in der Nähe von FAD befindet. Es scheint, dass die Größe der Kavität an der ROS-produzierenden Stelle, d. h. die N5-Position des FAD-Isoalloxazin-Rings, die Menge jedes ROS-Typs, der von hAOX1 erzeugt wird, kinetisch beeinflusst. Zusammenfassend ist hAOX1 ein Enzym mit zunehmender Bedeutung in pharmakologischen und medizinischen Studien, nicht nur aufgrund seiner Beteiligung am Arzneimittelstoffwechsel, sondern auch aufgrund der ROS-Produktion, die physiologische und pathologische Auswirkungen hat. KW - human aldehyde oxidase KW - reactive oxygen species (ROS) KW - Aldehydoxidase KW - reaktive Sauerstoffspezies (ROS) Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-534600 ER - TY - THES A1 - Ogunkola, Moses T1 - Role of the tRNA thiouridine modification protein (TUM1) as a sulfurtransferase in humans T1 - Die Rolle des tRNA-Thiouridin-Modifikationsproteins (TUM1) als Sulfurtransferase beim Menschen N2 - Sulfur is essential for the functionality of some important biomolecules in humans. Biomolecules like the Iron-sulfur clusters, tRNAs, Molybdenum cofactor, and some vitamins. The trafficking of sulfur involves proteins collectively called sulfurtransferase. Among these are TUM1, MOCS3, and NFS1. This research investigated the role of TUM1 for molybdenum cofactor biosynthesis and cytosolic tRNA thiolation in humans. The rhodanese-like protein MOCS3 and the L-cysteine desulfurase (NFS1) have been previously demonstrated to interact with TUM1. These interactions suggested a dual function of TUM1 in sulfur transfer for Moco biosynthesis and cytosolic tRNA thiolation. TUM1 deficiency has been implicated to be responsible for a rare inheritable disorder known as mercaptolactate cysteine disulfiduria (MCDU), which is associated with a mental disorder. This mental disorder is similar to the symptoms of sulfite oxidase deficiency which is characterised by neurological disorders. Therefore, the role of TUM1 as a sulfurtransferase in humans was investigated, in CRISPR/Cas9 generated TUM1 knockout HEK 293T cell lines. For the first time, TUM1 was implicated in Moco biosynthesis in humans by quantifying the intermediate product cPMP and Moco using HPLC. Comparing the TUM1 knockout cell lines to the wild-type, accumulation and reduction of cPMP and Moco were observed respectively. The effect of TUM1 knockout on the activity of a Moco-dependent enzyme, Sulfite oxidase, was also investigated. Sulfite oxidase is essential for the detoxification of sulfite to sulfate. Sulfite oxidase activity and protein abundance were reduced due to less availability of Moco. This shows that TUM1 is essential for efficient sulfur transfer for Moco biosynthesis. Reduction in cystathionin -lyase in TUM1 knockout cells was quantified, a possible coping mechanism of the cell against sulfite production through cysteine catabolism. Secondly, the involvement of TUM1 in tRNA thio-modification at the wobble Uridine-34 was reported by quantifying the amount of mcm5s2U and mcm5U via HPLC. The reduction and accumulation of mcm5s2U and mcm5U in TUM1 knockout cells were observed in the nucleoside analysis. Herein, exogenous treatment with NaHS, a hydrogen sulfide donor, rescued the Moco biosynthesis, cytosolic tRNA thiolation, and cell proliferation deficits in TUM1 knockout cells. Further, TUM1 was shown to impact mitochondria bioenergetics through the measurement of the oxygen consumption rate and extracellular acidification rate (ECAR) via the seahorse cell Mito stress analyzer. Reduction in total ATP production was also measured. This reveals how important TUM1 is for H2S biosynthesis in the mitochondria of HEK 293T. Finally, the inhibition of NFS1 in HEK 293T and purified NFS1 protein by 2-methylene 3-quinuclidinone was demonstrated via spectrophotometric and radioactivity quantification. Inhibition of NFS1 by MQ further affected the iron-sulfur cluster-dependent enzyme aconitase activity. N2 - Schwefel ist für die Funktionalität einiger wichtiger Biomoleküle beim Menschen wie die Eisen-Schwefel-Cluster, tRNA, Molybdän-Cofaktoren und einige Vitamine unerlässlich. Am Schwefelverkehr ist eine weit verbreitete Gruppe von Proteinen beteiligt, die als Rhodanese (Sulfurtransferase) bezeichnet wird. Zu dieser Klasse von Enzymen gehören die humanen (Proteine) TUM1, MOCS3 und NFS1. Es hat sich gezeigt, dass TUM1 mit der L-Cystein-Desulfurase (NFS1) und dem rhodaneseähnlichen Protein MOCS3 interagiert. Diese Wechselwirkungen deuten auf eine Doppelfunktion von TUM1 beim Schwefeltransfer für die Moco-Biosynthese und die zytosolische tRNA-Thiolierung hin. Ein TUM1-Mangel wird für eine seltene vererbbare Störung verantwortlich gemacht, die als Mercaptolactat-Cystein-Disulfidurie (MCDU) bekannt ist und mit geistigen Störungen einhergeht. Diese psychische Störung könnte auf die Symptome des Sulfit-Oxidase-Mangels zurückzuführen sein, der auch durch neurologische Störungen gekennzeichnet ist. In dieser Studie wurde zum ersten Mal die Rolle von TUM1 bei der Biosynthese von Molybdän-Cofaktoren und der zytosolischen tRNA-Thiolierung beim Menschen untersucht. Dies wurde durch die Verwendung von einer zuvor generierten TUM1-Deletion in HEK 293T-Zelllinien unter Verwendung von CRISPR/Cas9 erreicht. Hier wurde zum ersten Mal die Funktion von TUM1 in der Moco-Biosynthese im Menschen untersucht, wobei das Zwischenprodukt cPMP und Moco mittels HPLC quantifiziert wurde. Beim Vergleich der TUM1-deletierten-Zelllinien mit dem Wildtyp wurde eine Akkumulation bzw. Reduktion von cPMP und Moco beobachtet. Die Auswirkungen der TUM1-Deletion auf die Aktivität eines Moco-abhängigen Enzyms, der Sulfit-Oxidase, wurden ebenfalls untersucht. Sulfit ist wichtig für die Entgiftung von Sulfit zu Sulfat. Die Aktivität der Sulfit-Oxidase und die Proteinquantität waren aufgrund der geringeren Verfügbarkeit von Moco reduziert. Dies zeigt, dass TUM1 für einen effizienten Schwefeltransfer für die Moco-Biosynthese wichtig ist. Wir berichteten auch über die Verringerung der Cystathionin -Lyase in TUM1-deletierten-Zellen, ein möglicher Bewältigungsmechanismus der Zelle gegen die Sulfitproduktion. Zweitens wurde die Beteiligung von TUM1 an der tRNA-ThioModifikation am Wobble Uridin-34 durch Quantifizierung der Menge an mcm5s2U und mcm5U mittels HPLC untersucht. Es wurde eine Reduktion bzw. Akkumulation von mcm5s2U und mcm5U in TUM1-Knockout-Zellen beobachtet. Die exogene Behandlung mit NaHS, einem Schwefelwasserstoff-Donor, rettete die Moco-Biosynthese, die zytosolische tRNA-Thiolation und das Defizit der Zellproliferation in TUM1-deletion-Zellen. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass TUM1 die Bioenergetik der Mitochondrien beeinflusst, indem die Sauerstoffverbrauchsrate und die extrazelluläre Versauerungsrate (ECAR) über den Seahorse XF Analyzer gemessen wurden. Eine Verringerung der gesamten ATP-Produktion war ebenfalls erkennbar. Dies zeigt, wie wichtig TUM1 für die H2S-Biosynthese in den Mitochondrien von HEK 293T ist. Schließlich wurde die Hemmung von NFS1 in HEK 293T und gereinigtem NFS1-Protein durch 2-Methylen-3-chinuclidinon mittels spektrophotometrischer und radioaktiver Quantifizierung nachgewiesen. Die Hemmung von NFS1 durch 2-Methylen-3-chinuclidinon verringerte die Aktivität des von Eisen-Schwefel-Clustern abhängigen Enzyms Aconitase in HEK 293T. KW - Moco biosynthesis KW - sulfite oxidase KW - cytosolic tRNA thiolation KW - 5-methoxycarbonylmethyl-2-thiouridine KW - H2S biosynthesis KW - cellular bioenergetics KW - Moco-Biosynthese KW - Sulfit-Oxidase KW - zytosolische tRNA-Thiolierung KW - 5-Methoxycarbonylmethyl-2-Thiouridin KW - H2S-Biosynthese KW - zelluläre Bioenergetik Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-611357 ER - TY - THES A1 - Korovila, Ioanna T1 - Role of proteolytic systems in lipotoxicity-induced hepatocellular damage T1 - Lipotoxizität und Leberzellschädigung - Die Rolle der proteolytischen Systeme N2 - Scope: Several studies show that excessive lipid intake can cause hepatic steatosis. To investigate lipotoxicity on cellular level, palmitate (PA) is often used to highly increase lipid droplets (LDs). One way to remove LDs is autophagy, while it is controversially discussed if autophagy is also affected by PA. It is aimed to investigate whether PA-induced LD accumulation can impair autophagy and punicalagin, a natural autophagy inducer from pomegranate, can improve it. Methods and results: To verify the role of autophagy in LD degradation, HepG2 cells are treated with PA and analyzed for LD and perilipin 2 content in presence of autophagy inducer Torin 1 and inhibitor 3-Methyladenine. PA alone seems to initially induce autophagy-related proteins but impairs autophagic-flux in a time-dependent manner, considering 6 and 24 h PA. To examine whether punicalagin can prevent autophagy impairment, cells are cotreated for 24 h with PA and punicalagin. Results show that punicalagin preserves expression of autophagy-related proteins and autophagic flux, while simultaneously decreasing LDs and perilipin 2. Conclusion: Data provide new insights into the role of PA-induced excessive LD content on autophagy and suggest autophagy-inducing properties of punicalagin, indicating that punicalagin can be a health-beneficial compound for future research on lipotoxicity in liver. N2 - Lebersteatose entsteht durch eine übermäßige Zufuhr von Nahrungslipiden und ist durch eine chronische Ansammlung von Lipidtröpfchen (LD) in der Leber gekennzeichnet, die wiederum zu einer hepatozellulären Dysfunktion führen. Dieser pathogene Zustand ist ein grundlegendes Merkmal der nichtalkoholischen Fettleber (NAFLD) und ein Risikofaktor für viele weit verbreitete Stoffwechselerkrankungen, einschließlich Fettleibigkeit und Typ-2-Diabetes. Abgesehen von der Menge der aufgenommenen Nahrungsfette wird die Entwicklung der Lebersteatose auch stark von der Art der Fettsäure beeinflusst. Palmitat (PA) ist die am häufigsten vorkommende gesättigte Fettsäure und spielt eine bedeutende Rolle bei der Pathogenese der Lebersteatose. Sie wird häufig verwendet, um Lipotoxizität zu induzieren und die Entwicklung von LDs auf zellulärer Ebene zu untersuchen. Die beiden wichtigsten intrazellulären proteolytischen Systeme, das Ubiquitin-Proteasom-System und das Autophagie-Lysosom-System, sind am LD-Abbau beteiligt und kontrollieren das Gleichgewicht der Lipidhomöostase. Der Einfluss der Lipotoxizität auf ihre Funktion ist jedoch noch umstritten. Das Ziel der vorliegenden Dissertation ist es zu untersuchen, ob eine erhöhte LD-Akkumulation die Funktion der proteolytischen Systeme beeinträchtigt und ob die Effekte durch Kontrolle ihrer Aktivität umgekehrt werden können. In-vivo Untersuchungen an New Zealand Obese (NZO) Mäusen, einem polygenen Modell für Fettleibigkeit, zeigten, dass eine fettreiche Ernährung eine Akkumulation von LDs und hepatozelluläre Schäden verursacht. Diese Effekte wurden von einem Verlust der Autophagieeffizienz und einer verminderten Expression der Proteasomaler Untereinheiten begleitet. Ähnliche Effekte wurden in vitro in PA-beladenen HepG2-Zellen beobachtet. PA induziert LD-Akkumulation und verändert den Redoxstatus in Mitochondrien und im Endoplasmatische Retikulum (ER). Zusätzlich beeinflusst PA die Funktion beider proteolytischer Systeme (proteasomal und lysosomal) zeitabhängig nach 6- und 24-stündiger Behandlung. Um die Rolle des Proteasome und der Autophagie beim LD-Abbau unter PAinduzierten lipotoxischen Bedingungen zu untersuchen, wurden beide Systeme inhibiert oder induziert und die Veränderungen des LD-Gehalts analysiert. Dazu wurden die HepG2 Zellen wurden mit PA in Gegenwart des Autophagie-Aktivators Torin 1, des Autophagie-Inhibitors 3-Methyladenin, des Proteasom-Aktivators Ursolsäure und des Proteasom-Inhibitors Lactacystin behandelt. Die erhaltenen Daten aus unseren Modellen belegen, dass vorrangig Autophagie am Abbau der LDs beteiligt ist. Die PA-vermittelte Lipidakkumulation könnte auf ein Versagen der Autophagie hinweisen und zu einer Störung der Proteostase sowie einer weiteren LD-Stabilisierung und Anreicherung beitragen. Experimente mit dem natürlichen Autophagie-Aktivator Punicalagin weisen darauf hin, dass die PA-vermittelten lipotoxischen Wirkungen reduziert werden können. Insbesondere zeigen die Ergebnisse, dass Punicalagin die Expression von Autophagie-Proteinen erhält und durch PA-beeinträchtigten autophagischen Fluss wiederherstellt. Parallel dazu wird der durch PA-induzierte Gehalt an LD durch Punicalagin verringert. Zusammenfassend, liefern die Daten dieser Dissertation neue Einblicke in die Rolle des Proteasoms und des Autophagie-Lysosomalen Systems bei der PA-induzierten Lipotoxizität. Zudem werden die Autophagie-induzierenden Eigenschaften von Punicalagin aufgezeigt, die einen vielversprechenden Ansatz für die zukünftige Forschung zur hepatischen Lipotoxizität bieten. KW - HepG2 hepatocytes KW - autophagy KW - lipophagy KW - lysosome KW - palmitate KW - punicalagin KW - HepG2-Zellen KW - Autophagie KW - Lipophagie KW - Lysosom KW - Palmitat KW - Punicalagin Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-552385 ER - TY - THES A1 - Martinez-Seidel, Federico T1 - Ribosome Heterogeneity and Specialization during Temperature Acclimation in Plants N2 - Ribosomes decode mRNA to synthesize proteins. Ribosomes, once considered static, executing machines, are now viewed as dynamic modulators of translation. Increasingly detailed analyses of structural ribosome heterogeneity led to a paradigm shift toward ribosome specialization for selective translation. As sessile organisms, plants cannot escape harmful environments and evolved strategies to withstand. Plant cytosolic ribosomes are in some respects more diverse than those of other metazoans. This diversity may contribute to plant stress acclimation. The goal of this thesis was to determine whether plants use ribosome heterogeneity to regulate protein synthesis through specialized translation. I focused on temperature acclimation, specifically on shifts to low temperatures. During cold acclimation, Arabidopsis ceases growth for seven days while establishing the responses required to resume growth. Earlier results indicate that ribosome biogenesis is essential for cold acclimation. REIL mutants (reil-dkos) lacking a 60S maturation factor do not acclimate successfully and do not resume growth. Using these genotypes, I ascribed cold-induced defects of ribosome biogenesis to the assembly of the polypeptide exit tunnel (PET) by performing spatial statistics of rProtein changes mapped onto the plant 80S structure. I discovered that growth cessation and PET remodeling also occurs in barley, suggesting a general cold response in plants. Cold triggered PET remodeling is consistent with the function of Rei-1, a REIL homolog of yeast, which performs PET quality control. Using seminal data of ribosome specialization, I show that yeast remodels the tRNA entry site of ribosomes upon change of carbon sources and demonstrate that spatially constrained remodeling of ribosomes in metazoans may modulate protein synthesis. I argue that regional remodeling may be a form of ribosome specialization and show that heterogeneous cytosolic polysomes accumulate after cold acclimation, leading to shifts in the translational output that differs between wild-type and reil-dkos. I found that heterogeneous complexes consist of newly synthesized and reused proteins. I propose that tailored ribosome complexes enable free 60S subunits to select specific 48S initiation complexes for translation. Cold acclimated ribosomes through ribosome remodeling synthesize a novel proteome consistent with known mechanisms of cold acclimation. The main hypothesis arising from my thesis is that heterogeneous/ specialized ribosomes alter translation preferences, adjust the proteome and thereby activate plant programs for successful cold acclimation. N2 - Ribosomen dekodieren mRNA, um Proteine zu synthetisieren. Ribosomen, früher als statische, ausführende Maschinen betrachtet, werden heute als dynamische Modulatoren der Translation angesehen. Zunehmend detailliertere Analysen der Strukturheterogenität von Ribosomen führte zu einem Paradigmenwechsel hin zu einer Spezialisierung von Ribosomen für eine selektive Translation. Als sessile Organismen können Pflanzen schädlichen Umwelteinflüssen nicht ausweichen und haben Strategien entwickelt, um diesen zu widerstehen. Zytosolische Ribosomen von Pflanzen sind in mancher Hinsicht vielfältiger, als die von anderen Metazoen. Diese Vielfalt könnte zur Stressakklimatisierung der Pflanzen beitragen. Ziel dieser Arbeit war es, festzustellen, ob Pflanzen die Heterogenität der Ribosomen nutzen, um die Proteinsynthese durch spezialisierte Translation zu regulieren. Ich habe mich auf die Temperaturakklimatisierung konzentriert, insbesondere auf den Wechsel zu niedrigen Temperaturen. Im Verlauf der Kälteakklimatisierung stellt Arabidopsis das Wachstum für sieben Tage ein. Währenddessen etabliert sie die für die Wiederaufnahme des Wachstums erforderlichen Anpassungen. Vorherige Ergebnisse deuten darauf hin, dass Ribosomenbiogenese für die Kälteakklimatisierung essentiell ist. REIL-Mutanten (reil-dkos), denen ein 60S-Reifungsfaktor fehlt, akklimatisieren sich nicht erfolgreich und nehmen das Wachstum nicht wieder auf. Anhand dieser Genotypen habe ich kältebedingte Defekte der Ribosomenbiogenese auf den Aufbau des Polypeptidaustritts-Tunnels (PET) zurückgeführt, indem ich räumliche statistische Analysen von rProtein-Veränderungen auf die pflanzliche 80S-Struktur abgebildet habe. Ich habe entdeckt, dass Wachstumsstillstand und PET-Umbau auch in Gerste auftreten, was auf eine allgemeine Kältereaktion in Pflanzen hindeutet. Der durch Kälte ausgelöste PET-Umbau stimmt über ein mit der Funktion von Rei-1, einem REIL-homologen Protein aus Hefe, in der Rei-1 die PET-Qualitätskontrolle durchführt. Anhand bahnbrechender Daten zur Ribosomenspezialisierung zeige ich, dass Hefe die tRNA-Eintrittsstelle von Ribosomen bei einem Wechsel von Kohlenstoffquellen umbaut, und demonstriere, dass ein räumlich begrenzter Umbau von Ribosomen in Metazoen die Proteinsynthese modulieren kann. Ich argumentiere, dass die regionale Umgestaltung eine Form der Ribosomenspezialisierung sein kann, und zeige, dass nach einer Kälteakklimatisierung heterogene zytosolische Polysomen akkumulieren, was zu Verschiebungen im Translationsoutput führt, der sich zwischen Wildtyp und reil-dkos unterscheidet. Ich habe festgestellt, dass die heterogenen Komplexe aus neu synthetisierten und wiederverwendeten Proteinen bestehen. Ich schlage vor, dass maßgeschneiderte Ribosomenkomplexe freie 60S-Untereinheiten in die Lage versetzen, spezifische 48S-Initiationskomplexe für die Translation auszuwählen. Kälte-akklimatisierte Ribosomen synthetisieren durch Ribosomenumbau ein neues Proteom, das mit bekannten Mechanismen der Kälteakklimatisierung übereinstimmt. Die Haupthypothese, die sich aus meiner Arbeit ergibt, ist, dass heterogene/spezialisierte Ribosomen ihre Translationspräferenzen verändern, das Proteom anpassen und dadurch Pflanzenprogramme für eine erfolgreiche Kälteakklimatisierung aktivieren. T2 - Ribosomenheterogenität und -spezialisierung während der Temperaturakklimatisierung in Pflanzen KW - Ribosome specialization KW - Ribosomal protein heterogeneity KW - Ribosomal protein substoichiometry KW - Protein synthesis KW - Translational regulation KW - Plant cytosolic translation KW - Cold acclimation KW - Ribosome biogenesis KW - 60S maturation KW - Hordeum vulgare KW - Arabidopsis thaliana KW - 60S-Reifung KW - Kälteakklimatisierung KW - Cytosolische Translation in Pflanzen KW - Proteinsynthese KW - Ribosomale Proteinheterogenität KW - Ribosomale Protein Substöchiometrie KW - Ribosomen-Biogenese KW - Ribosomen-Spezialisierung KW - Translationsregulation Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-580724 ER - TY - THES A1 - Witte, Jeannine T1 - Rhabdomerorganisation und –morphogenese im Komplexauge von Drosophila T1 - Rhabdomere organization and morphogenesis in the compound eye of Drosophila N2 - Sehzellen von Insekten sind epitheliale Zellen mit einer charakteristischen, hochpolaren Morphologie und Organisation. Die molekularen Komponenten der Sehkaskade befinden sich im Rhabdomer, einem Saum dicht gepackter Mikrovilli entlang der Sehzelle. Bereits in den 70er Jahren des letzten Jahrhunderts wurde beschrieben, dass die Mikrovilli entlang einer Sehzelle eine unterschiedliche Ausrichtung besitzen, oder in anderen Worten, die Rhabdomere entlang der Sehzell-Längsachse verdreht sind. So sind in den Sehzellen R1-R6 bei dipteren Fliegen (Calliphora, Drosophila) die Mikrovilli im distalen und proximalen Bereich eines Rhabdomers etwa rechtwinkelig zueinander angeordnet. Dieses Phänomen wird in der Fachliteratur als rhabdomere twisting bezeichnet und reduziert die Empfindlichkeit für polarisiertes Licht. Es wurde für das Drosophila-Auge gezeigt, dass diese strukturelle Asymmetrie der Sehzellen mit einer molekularen Asymmetrie in der Verteilung phosphotyrosinierter Proteine an die Stielmembran (einem nicht-mikrovillären Bereich der apikalen Plasmamembran) einhergeht. Zudem wurde gezeigt, dass die immuncytochemische Markierung mit anti-Phosphotyrosin (anti-PY) als lichtmikroskopischer Marker für das rhabdomere twisting verwendet werden kann. Bisher wurde hauptsächlich die physiologische Bedeutung der Rhabdomerverdrehung untersucht. Es ist wenig über die entwicklungs- und zellbiologischen Grundlagen bekannt. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Identität der phosphotyrosinierten Proteine an der Stielmembran zu klären und ihre funktionelle Bedeutung für die Entwicklung des rhabdomere twisting zu analysieren. Zudem sollte untersucht werden, welchen Einfluss die inneren Sehzellen R7 und R8 auf die Verdrehung der Rhabdomere von R1-R6 haben. Für die zwei Proteinkinasen Rolled (ERK) und Basket (JNK) vom Typ der Mitogen-aktivierten Proteinkinasen (MAPK) konnte ich zeigen, dass sie in ihrer aktivierten (= phosphorylierten) Form (pERK bzw. pJNK) eine asymmetrische Verteilung an der Stielmembran aufweisen vergleichbar der Markierung mit anti-PY. Weiterhin wurde diese asymmetrische Verteilung von pERK und pJNK ebenso wie die von PY erst kurz vor Schlupf der Fliegen (bei ca. 90% pupaler Entwicklung) etabliert. Durch Präinkubationsexperimente mit anti-PY wurde die Markierung mit anti-pERK bzw. anti-pJNK unterbunden. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass pERK und pJNK zu den Proteinen gehören, die von anti-PY an der Stielmembran erkannt werden. Da es sich bei ERK und JNK um Kinasen handelt, ist es naheliegend, dass diese an der Entwicklung des rhabdomere twisting beteiligt sein könnten. Diese Hypothese wurde durch die Analyse von hypermorphen (rl SEM)und hypomorphen (rl 1/rl 10a) Rolled-Mutanten überprüft. In der rl SEM-Mutante mit erhöhter Aktivität der Proteinkinase erfolgte die asymmetrische Positionierung von pERK an der Stielmembran sowie die Mikrovillikippung schon zu einem früheren Zeitpunkt in der pupalen Entwicklung. Im adulten Auge war die anti-PY-Markierung im distalen Bereich der Sehzellen intensiver sowie der Kippwinkel vergrößert. In der rl 1/rl 10a-Mutanten mit reduzierter Kinaseaktivität waren die anti-PY-Markierung und der Kippwinkel im proximalen Bereich der Sehzellen verringert. Die Proteinkinase ERK hat somit einen Einfluss auf die zeitliche Etablierung des rhabdomere twisting wie auch auf dessen Ausprägung im Adulttier. Die Rhabdomerverdrehung sowie die Änderung im anti-PY-Markierungsmuster erfolgen an den Sehzellen R1-R6 relativ abrupt auf halber Ommatidienlänge, dort wo das Rhabdomer von R7 endet und das von R8 beginnt. Es stellte sich deshalb die Frage, ob die Rhabdomerverdrehung an R1-R6 durch die Sehzelle R7 und/oder R8 beeinflusst wird. Um dieser Frage nachzugehen wurden Mutanten analysiert, denen die R7- oder die R8-Photorezeptoren bzw. R7 und R8 fehlten. Das wichtigste Ergebnis dieser Untersuchungen war, dass bei Fehlen von R8 die Rhabdomerverdrehung bei R1-R6 nach keinen erkennbaren Regeln erfolgt. R8 ist somit Voraussetzung für die Etablierung der Rhabdomerverdrehung in R1-R6. Folgendes Modell wurde auf Grundlage dieses und weiterer Ergebnisse erarbeitet: Im dritten Larvenstadium rekrutiert R8 die Sehzellpaare R2/R5, R3/R4 und R1/R6. Dabei werden R1-R6 durch den Kontakt zu R8 „polarisiert“. Abschließend wird R7 durch R8 rekrutiert. Dies führt zu einer Fixierung der Polarität von R1-R6 durch R7. Die Ausführung der Mikrovillikippung anhand der festgelegten Polarität erfolgt in der späten Puppenphase. Die Proteinkinase ERK ist an diesem letzten Morphogeneseprozess beteiligt. N2 - Visual cells of insects are epithelial cells with a characteristic morphology and organization. The molecular components of the signalling cascade are arranged in the rhabdomere, an array of densely packed microvilli along the side of the cell body. Already in the 70s of the last century it was described that microvilli point in different directions in various segments of the rhabdomere. Thus, in Dipteran flies (Calliphora, Drosophila) microvilli in the distal part of visual cells R1-R6 are nearly perpendicular to the microvilli in the proximal portion. This phenomenon is termed rhabdomere twisting and decreases the sensitivity of visual cells to polarized light. For Drosophila, structural asymmetry was shown to correlate with molecular asymmetry in the distribution of phosphotyrosinated proteins to the stalk (a non-microvillar region of the apical plasma membrane). Furthermore, this asymmetric distribution of antiphosphotyrosine (anti-PY) provides a light microscopic marker for rhabdomere twisting. So far little is known about the developmental and cell biological basis of rhabdomere twisting. Purpose of the present study was to identify the phosphotyrosinated proteins at the stalk und to analyse their functional relevance for the development of rhabdomere twisting. Moreover, influence of the inner visual cells R7 and R8 on rhabdomere twisting should be examined. Two protein kinases of the MAPK-type, Rolled (ERK) and Basket (JNK), show for their activated (= phosphorylated) forms (pERK and pJNK respectively) an asymmetric distribution to the stalk comparable to labelling with anti-PY. In addition, this asymmetric distribution of pERK, pJNK and also PY is established shortly before eclosion of the fly. Preincubation experiments with anti-PY abolished labelling with anti-pERK and anti-pJNK respectively. These results indicate that pERK and pJNK belong to the proteins on the stalk recognized by anti-PY. ERK and JNK are kinases and therefore are likely to be involved in the development of rhabdomere twisting. To test this hypothesis I analysed hypermorph (rl SEM) and hypomorph (rl 1/rl 10a) rolled mutants. In rl SEM mutants with increased kinase activity asymmetric positioning of pERK to the stalk and tilting of microvilli occurred earlier during pupal development. In the adult eye anti-PY labelling was more intensive in the distal part of the visual cells, and congruently the microvillar tilt angle was increased. In rl 1/rl 10a mutants with reduced kinase activity anti-PY labelling and microvillar tilt angle were reduced in the proximal part of visual cells. Hence, protein kinase ERK has an influence on developmental establishment of rhabdomere twisting and its specification in the adult eye. In R1-R6 rhabdomere twisting as well as changes in anti-PY labelling pattern take place within a narrow range halfway along the rhabdomere where the rhabdomere of R7 ceases and that of R8 begins. So the question arises whether rhabdomere twisting of R1-R6 is influenced by R7 and/or R8. To answer that question I analysed mutants that lack R7 or R8 or both visual cells. Most importantly absence of R8 leads to a disorganized rhabdomere twisting in R1-R6. Consequently R8 seems to be required for the establishment of rhabdomere twisting in R1-R6. Following working model was developed: in the third larval instar R8 recruits pairs of visual cells R2/R5, R3/R4 and R1/R6. In that process R1-R6 become „polarised“ by the contact to R8. Finally R7 is recruited by R8. That fixes polarity of R1-R6 by R7. The active tilting of the microvilli on the basis of the given polarity is carried out in late pupal development with the help of protein kinase ERK. KW - Komplexauge KW - Drosophila KW - Rhabdomerverdrehung KW - MAPK KW - compound eye KW - Drosophila KW - rhabdomere twisting KW - MAP kinase Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-41847 ER - TY - THES A1 - Voß, Martin T1 - Regulation der vakuolären H(+)-ATPase durch reversible Proteinphosphorylierung T1 - Regulation of the vacuolar H(+)-ATPase by reversible protein phosphorylation N2 - Die vakuoläre Protonen-ATPase, kurz V-ATPase, ist ein multimerer Enzymkomplex, der in fast jeder eukaryotischen Zelle zu finden ist und den aktiven elektrogenen Transport von Protonen über Membranen katalysiert. Die Aktivität der V-ATPase ist essentiell für eine Vielzahl physiologischer Prozesse. Ein grundlegender Mechanismus zur Regulation der V-ATPase-Aktivität ist die reversible Dissoziation des Holoenzyms in den integralen VO-Komplex, der als Protonenkanal dient, und den cytosolischen V1-Komplex, der ATP hydrolysiert und somit den Protonentransport energetisiert. Die Untereinheit C, die im dissoziierten Zustand der V-ATPase als einzige Untereinheit isoliert im Cytoplasma vorliegt, scheint bei der Bildung des aktiven Holoenzyms eine Schlüsselrolle zu übernehmen. In den Speicheldrüsen der Schmeißfliege Calliphora vicina ist die V-ATPase an der Speichelsekretion beteiligt. In den sekretorischen Zellen wird die Bildung des V-ATPase-Holoenzyms in der apikalen Plasmamembran durch das Neurohormon Serotonin (5-HT) stimuliert. Der Effekt von 5-HT auf die V-ATPase wird intrazellulär durch die Proteinkinase A (PKA) vermittelt und hält nur für die Dauer der Stimulierung an. In der vorliegenden Arbeit wurde mittels Phosphoproteinfärbungen und 2D-Elektrophorese nachgewiesen, dass infolge einer Stimulierung der Drüsenzellen mit 5-HT die Untereinheit C der V-ATPase durch die PKA reversibel phosphoryliert wird. Die Phosphorylierung geht einher mit einer Umverteilung der Untereinheit C aus dem Cytoplasma zur apikalen Plasmamembran und der Bildung des aktiven Holoenzyms. Immuncytochemische Untersuchungen zeigten, dass die katalytische Untereinheit der PKA ebenfalls umverteilt wird und in stimulierten Zellen im Bereich der apikalen Plasmamembran konzentriert vorliegt. Um herauszufinden welche Proteinphosphatase der PKA entgegenwirkt, wurden luminale pH-Messungen durchgeführt und der Effekt von spezifischen Proteinphosphatase-Inhibitoren und veresterten Komplexbildnern zweiwertiger Kationen auf die V-ATPase-Aktivität untersucht. Diese Messungen führten zu der Schlussfolgerung, dass eine Proteinphosphatase des Typs 2C an der Inaktivierung der V-ATPase beteiligt ist. Mit weiteren Phosphoproteinfärbungen konnte gezeigt werden, dass die Dephosphorylierung der Untereinheit C ebenfalls durch eine Proteinphosphatase 2C katalysiert wird und dies vermutlich die Dissoziation des VO- und V1-Komplexes begünstigt. Darüber hinaus konnte durch luminale pH-Messungen und ergänzende biochemische Untersuchungen eine Calcineurin-vermittelte Modulation des cAMP/PKA-Signalweges durch den parallel aktivierten IP3/Ca2+-Signalweg und damit einhergehend eine Beeinflussung der V-ATPase-Aktivität durch den [Ca2+]-Spiegel nachgewiesen werden. N2 - The vacuolar-type H+-ATPase (V-ATPase) is a multimeric enzyme that can be found in nearly every eukaryotic cell. It catalyses the active electrogenic transport of protons across membranes and is essential for a multitude of physiological processes. A fundamental mechanism to regulate V-ATPase activity is the reversible dissociation of the holoenzyme into an integral proton conducting VO-complex and a cytosolic V1-complex that hydrolyses ATP and thus energises proton translocation. Subunit C occurs isolated in the cytoplasm upon dissociation of the V-ATPase complexes and seems to be critical for the formation of active holoenzymes. In the salivary glands of the blowfly Calliphora vicina the V-ATPase is involved in fluid secretion. In secretory cells, formation of the V-ATPase holoenzyme is stimulated by the hormone serotonin (5-HT). The effect of 5-HT on V-ATPase activity is mediated by protein kinase A (PKA) and persists for the duration of the 5-HT stimulus. In this study, it was shown by phosphoprotein stainings and two-dimensional electrophoresis that subunit C of the V-ATPase becomes phosphorylated by PKA upon exposure of blowfly salivary glands to 5-HT. Parallel to the phosphorylation event, subunit C translocates from the cytoplasm to the apical plasma membrane for the assembly of active V-ATPase holoenzymes. Using immunofluorescence staining, it could be shown that PKA catalytic subunit translocates as well to the apical membrane upon 5-HT stimulation. To examine which protein phosphatase counteracts PKA, luminal pH-measurements were carried out. Based on the results with protein phosphatase inhibitors and esterified chelating agents of bivalent cations, it may be concluded that a protein phosphatase 2C is involved in the process leading to V-ATPase inactivation. Phosphoprotein stainings revealed that dephosphorylation of subunit C is likewise catalysed by a protein phosphatase 2C. Therefore the dephosphorylation of subunit C seems to promote dissociation of VO- and V1-complexes. Finally, luminal pH-measurements and supplemental biochemical experiments revealed a Ca2+/calcineurin-mediated modulation of the cAMP/PKA signalling cascade and an influence of intracellular calcium on the V-ATPase activity. KW - V-ATPase KW - PKA KW - Proteinphosphorylierung KW - Proteinphosphatasen KW - V-ATPase KW - PKA KW - protein phosphorylation KW - protein phosphatases Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-19617 ER - TY - THES A1 - Kolbe, Anna T1 - Redox-regulation of starch and lipid synthesis in leaves T1 - Redox-Regulation von Stärke- und Lipidsynthese in Blättern N2 - Post-translational redox-regulation is a well-known mechanism to regulate enzymes of the Calvin cycle, oxidative pentose phosphate cycle, NADPH export and ATP synthesis in response to light. The aim of the present thesis was to investigate whether a similar mechanism is also regulating carbon storage in leaves. Previous studies have shown that the key-regulatory enzyme of starch synthesis, ADPglucose pyrophosphorylase (AGPase) is inactivated by formation of an intermolecular disulfide bridge between the two catalytic subunits (AGPB) of the heterotetrameric holoenzyme in potato tubers, but the relevance of this mechanism to regulate starch synthesis in leaves was not investigated. The work presented in this thesis shows that AGPase is subject to post-translational redox-regulation in leaves of pea, potato and Arabidopsis in response to day night changes. Light was shown to trigger posttranslational redox-regulation of AGPase. AGPB was rapidly converted from a dimer to a monomer when isolated pea chloroplasts were illuminated and from a monomer to a dimer when preilluminated leaves were darkened. Conversion of AGPB from dimer to monomer was accompanied by an increase in activity due to changes in the kinetik properties of the enzyme. Studies with pea chloroplast extracts showed that AGPase redox-activation is mediated by thioredoxins f and m from spinach in-vitro. In a further set of experiments it was shown that sugars provide a second input leading to AGPase redox activation and increased starch synthesis and that they can act as a signal which is independent from light. External feeding of sugars such as sucrose or trehalose to Arabidopsis leaves in the dark led to conversion of AGPB from dimer to monomer and to an increase in the rate of starch synthesis, while there were no significant changes in the level of 3PGA, an allosteric activator of the enyzme, and in the NADPH/NADP+ ratio. Experiments with transgenic Arabidopsis plants with altered levels of trehalose 6-phosphate (T6P), the precursor of trehalose synthesis, provided genetic evidence that T6P rather than trehalose is leading to AGPase redox-activation. Compared to Wt, leaves expressing E.coli trehalose-phosphate synthase (TPS) in the cytosol showed increased activation of AGPase and higher starch level during the day, while trehalose-phosphate phosphatase (TPP) overexpressing leaves showed the opposite. These changes occurred independently of changes in sugar and sugar-phosphate levels and NADPH/NADP+ ratio. External supply of sucrose to Wt and TPS-overexpressing leaves led to monomerisation of AGPB, while this response was attenuated in TPP expressing leaves, indicating that T6P is involved in the sucrose-dependent redox-activation of AGPase. To provide biochemical evidence that T6P promotes redox-activation of AGPase independently of cytosolic elements, T6P was fed to intact isolated chloroplasts for 15 min. incubation with concentrations down to 100 µM of T6P, but not with sucrose 6-phosphate, sucrose, trehalose or Pi as controls, significantly and specifically increased AGPB monomerisation and AGPase activity within 15 minutes, implying T6P as a signal reporting the cytosolic sugar status to the chloroplast. The response to T6P did not involve changes in the NADPH/NADP+ ratio consistent with T6P modulating redox-transfer to AGPase independently of changes in plastidial redox-state. Acetyl-CoA carboxylase (ACCase) is known as key-regulatory enzyme of fatty acid and lipid synthesis in plants. At the start of the present thesis there was mainly in vitro evidence in the literature showing redox-regulation of ACCase by DTT, and thioredoxins f and m. In the present thesis the in-vivo relevance of this mechanism to regulate lipid synthesis in leaves was investigated. ACCase activity measurement in leaf tissue collected at the end of the day and night in Arabidopsis leaves revealed a 3-fold higher activation state of the enzyme in the light than in the dark. Redox-activation was accompanied by change in kinetic properties of ACCase, leading to an increase affinity to its substrate acetyl-CoA . In further experiments, DTT as well as sucrose were fed to leaves, and both treatments led to a stimulation in the rate of lipid synthesis accompanied by redox-activation of ACCase and decrease in acetyl-CoA content. In a final approach, comparison of metabolic and transcript profiling after DTT feeding and after sucrose feeding to leaves provided evidence that redox-modification is an important regulatory mechanism in central metabolic pathways such as TCA cycle and amino acid synthesis, which acts independently of transcript levels. N2 - Es ist bereits seit längerem bekannt, dass viele Enzyme des Calvinzyklus, des oxidativen Pentosephosphatwegs, des NAD(P)H-Exports und der ATP-Synthese durch post-translationale Redox-Modifikation in Antwort auf Licht reguliert werden. In der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, ob ein ähnlicher Mechanismus auch die Kohlenstoffspeicherung in Blättern reguliert. Vorangegangene Studien mit Kartoffelknollen zeigten, dass das Schlüsselenzym der Stärkesynthese ADP-Glukose-Pyrophosphorylase (AGPase) durch die Bildung einer Disulfidbrücke zwischen den zwei kleinen Untereinheiten (AGPB) des tetrameren Proteins inaktiviert wird, die Bedeutung dieses Mechanismus für die Stärkesynthese in Blättern blieb jedoch bislang ungeklärt. Die vorliegenden Arbeiten zeigen, das AGPase in Erbsen-, Kartoffel- und Arabidopsis-Blättern über post-translationale Redox-Modifikation in Antwort auf Tag-Nacht Änderungen reguliert wird. Dies erfolgt über ein Licht-abhängiges Signal, da, erstens, AGPB in isolierten Chloroplasten durch Belichtung sehr schnell von Dimer zu Monomer umgewandelt wird und, zweitens, ein Abdunkeln der Blätter zu einer schnellen Umwandlung von AGPB von Monomer zu Dimer führt. Die Monomerisierung von AGPB ging mit Änderungen in den kinetischen Eigenschaften des Enzyms einher, die zu einer Aktivierung führten. Studien mit Extrakten aus Erbsenchloroplasten zeigten, dass die AGPase-Redoxaktivierung in-vitro durch die Thioredoxine f und m aus Spinat vermittelt wird. In einem weiteren experimentellen Ansatz konnte gezeigt werden, dass auch Zucker zu Redox-Aktivierung der AGPase und erhöhter Stärkesynthese in Blättern führen, und dass diese unabhängig von Licht wirken. Externe Zugabe von Zuckern wie Saccharose oder Trehalose an Arabidopsis-Blätter im Dunkeln führten zu Monomerisierung von AGPB und einer Erhöhung der Stärkesyntheserate , während die Spiegel des allosterischen Aktivators 3PGA unverändert blieben und keine Änderungen im NADPH/NADP+-Verhältnis auftraten. Experimente mit transgenen Arabidopsis-Pflanzen mit veränderten Spiegeln des Vorläufers der Trehalosesynthese, Trehalose-6-phosphat (T6P), zeigten, dass T6P und nicht Trehalose zu Redox-Aktivierung von AGPase führt. Expression einer E. coli T6P synthase (TPS) im Zytosol führte zu erhöhter Redox-Aktivierung von AGPase und erhöhter Stäreksynthese in Blättern, während die Expression einer T6P-Phosphatase (TPP) gegenteilige Änderungen bewirkte. Diese Auswirkungen erfolgten unabhängig von Änderungen in den Spiegeln von Zuckern und Zuckerphosphaten oder im NADPH/NADP+-Verhältnis. Externe Zugabe von Saccharose führte zu Monomerisierung von AGPB in Wildtyp und TPS exprimierenden Blättern, während diese Antwort in TPP exprimierenden Blättern stark abgeschwächt war. Dies zeigt, dass T6P eine wesentliche Komponente darstellt, die die Redox-Aktivierung der AGPase in Antwort auf Saccharose vermittelt. T6P wurde auch für 15 min direkt an intakte, isolierte Erbsenchloroplasten gefüttert. T6P Konzentrationen im Bereich von 100 µM bis 10 mM führten zu einem signifikanten und spezifischen Anstieg der AGPB-Monomersierung und der AGPase Aktivität. Dies zeigt, dass T6P auch ohne zytosolische Elemente die Redox-Aktivierung der AGPase stimuliert und somit ein Signal zwischen Zytosol und Plastid darstellt. Diese Antwort erfolgte ohne Änderungen im NADPH/NADP+-Verhältnis, was zeigt, dass T6P eher den Redox-Transfer zu AGPase als den Redoxzustand des Chloroplasten moduliert. Acetyl-CoA-Carboxylase (ACCase) ist als Schlüsselenzym der Fettsäure- und Lipidsynthese in Pflanzen bekannt. Zu Beginn der vorliegenden Arbeit lagen hauptsächlich in-vitro Befunde vor, die zeigten, dass ACCase durch DTT und thioredoxine f und m über Redox-Modulation reguliert wird. In der Arbeit sollte daher die in-vivo Relevanz dieses Mechanismus für die Regulation der Lipidsynthese in Blättern untersucht werden. ACCase zeigte einen höheren Redox-Aktivierungszustand in Arabidopsis-Blätter, die während des Tages im Vergleich zur Nacht geerntet wurden. Die Redox-Aktivierung der ACCase wurde von Änderungen in den kinetischen Eigenschaften begleitet und führte zu einer erhöhten Affinität des Enzymes gegenüber Acetyl-CoA als Substrat. In weiteren Versuchen wurde sowohl DTT als auch Saccharose an Blätter gefüttert, und beide Behandlungen führten zu Redox-Aktivierung von ACCase, was mit erhöhten Lipidsynthesraten und einem Rückgang des Acetyl-CoA-Spiegels einherging. KW - Redoxreaktion KW - Thioredoxine KW - ADP-Glukosepyrophosphorylase KW - Acetyl-CoA carboxylase KW - Trehalose-6-Phosphat KW - Lipid Synthese KW - Stärke Synthese KW - Lipid synthesis KW - Starch synthesis KW - thioredoxin KW - redox Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-6388 ER - TY - THES A1 - Siemiatkowska, Beata T1 - Redox signalling in plants N2 - Once proteins are synthesized, they can additionally be modified by post-translational modifications (PTMs). Proteins containing reactive cysteine thiols, stabilized in their deprotonated form due to their local environment as thiolates (RS-), serve as redox sensors by undergoing a multitude of oxidative PTMs (Ox-PTMs). Ox-PTMs such as S-nitrosylation or formation of inter- or intra-disulfide bridges induce functional changes in these proteins. Proteins containing cysteines, whose thiol oxidation state regulates their functions, belong to the so-called redoxome. Such Ox-PTMs are controlled by site-specific cellular events that play a crucial role in protein regulation, affecting enzyme catalytic sites, ligand binding affinity, protein-protein interactions or protein stability. Reversible protein thiol oxidation is an essential regulatory mechanism of photosynthesis, metabolism, and gene expression in all photosynthetic organisms. Therefore, studying PTMs will remain crucial for understanding plant adaptation to external stimuli like fluctuating light conditions. Optimizing methods suitable for studying plants Ox-PTMs is of high importance for elucidation of the redoxome in plants. This study focusses on thiol modifications occurring in plant and provides novel insight into in vivo redoxome of Arabidopsis thaliana in response to light vs. dark. This was achieved by utilizing a resin-assisted thiol enrichment approach. Furthermore, confirmation of candidates on the single protein level was carried out by a differential labelling approach. The thiols and disulfides were differentially labelled, and the protein levels were detected using immunoblot analysis. Further analysis was focused on light-reduced proteins. By the enrichment approach many well studied redox-regulated proteins were identified. Amongst those were fructose 1,6-bisphosphatase (FBPase) and sedoheptulose-1,7-bisphosphatase (SBPase) which have previously been described as thioredoxin system targeted enzymes. The redox regulated proteins identified in the current study were compared to several published, independent results showing redox regulated proteins in Arabidopsis leaves, root, mitochondria and specifically S-nitrosylated proteins. These proteins were excluded as potential new candidates but remain as a proof-of-concept to the enrichment experiments to be effective. Additionally, CSP41A and CSP41B proteins, which emerged from this study as potential targets of redox-regulation, were analyzed by Ribo-Seq. The active translatome study of csp41a mutant vs. wild-type showed most of the significant changes at end of the night, similarly as csp41b. Yet, in both mutants only several chloroplast-encoded genes were altered. Further studies of CSP41A and CSP41B proteins are needed to reveal their functions and elucidate the role of redox regulation of these proteins. N2 - Wenn Proteine synthetisiert sind, können sie zusätzlich noch post-translationelle Modifikationen (PTM) aufweisen. Proteine, die wegen ihres lokalen Umfeldes reaktive Cysteinthiole in ihrer stabilen deprotonierten Thiolat-Form aufweisen, dienen als Redoxsensoren indem sie eine Vielzahl von oxidativen PTMs (Ox-PTMs) enthalten können. Ox-PTMs wie die S-Nitrosylierung oder die Bildung von Inter- oder Intradisulfidbrücken induzieren funktionelle Veränderungen in diesen Proteinen. Cystein-haltige Proteine, deren Funktion durch diese Thioloxidierung gesteuert werden, gehören zu dem so genannten Redoxom. Die Ox-PTMs werden durch ortsspezifische zelluläre Prozesse gesteuert, die eine essentielle Rolle bei der Proteinregulation spielen und welche das katalytische Zentrum, die Ligandenbindungsaffinität, Protein-Protein-Interaktionen oder die Proteinstabilität beeinflussen können. Die umkehrbare Proteinthioloxidierung ist ein essentieller regulatorischer Mechanismus in der Photosynthese, dem Metabolismus und der Genexpression photosynthetischer Organismen. Es ist demnach wichtig PTMs zu untersuchen, um zu verstehen wie sich Pflanzen an externe Stimuli wie das Licht anpassen können. Es ist von großer Bedeutung für das Redoxom-Forschungsgebiet Methoden zur Untersuchung von pflanzlichen Ox-PTMs zu verbessern. Die vorliegende Arbeit konzentriert sich auf Thiolveränderungen, die in Pflanzen auftreten, und gibt einen Einblick in das in vivo Redoxom von Arabidopsis thaliana als Reaktion auf Licht oder Dunkelheit. Dieses wurde ermöglicht durch eine auf Harz-basierende Thiol-Anreicherung. Darüber hinaus konnten Kandidaten auf dem Einzelproteinlevel durch eine Differentialmarkierungsmethode bestätigt werden. Thiole und Disulfide wurden unterschiedlich markiert und die Proteine durch spezifische Antikörper mittels Proteinblotanalyse erkannt. Weitere Analysen fokussierten sich auf im Licht reduzierte Proteine. Durch die Anreicherungsmethode konnten viele bereits untersuchte redox-regulierte Proteine identifiziert werden. Unter diesen waren unter anderem die Fruktose-1,6-Bisphosphatase (FBPase) sowie die Seduheptulose-1,7-Bisphosphatase (SBPase), welche als Thioredoxin-gesteuerte Enzyme beschrieben sind. Die redox-regulierten Proteine, die in dieser Studie identifiziert werden konnten, wurden mit veröffentlichten unabhängigen Ergebnissen verglichen und dieses führte zu einer Vielzahl an redox-regulierten Proteinen in Arabidopsisblättern, -Wurzeln und -Mitochondrien sowie S-nitrosylierten Proteinen. Diese Proteine wurden zwar als neue potentielle Kandidaten ausgeschlossen, zeigten allerdings die Effektivität der Anreicherungsmethode. Darüber hinaus wurden die Proteine CSP41 A and CSP41 B, welche in dieser Studie als potentielle Ziele der Redox-Regulation identifiziert wurden, durch Ribo-seq analysiert. T2 - Redoxsignalisierung in Pflanzen KW - redox KW - signalling KW - plants KW - enrichments methods KW - post-translational modifications KW - oxidative protein modifications KW - Redox KW - Signalübertragung KW - Pflanzen KW - Anreicherungsmethoden KW - posttranslationale Modifikationen KW - oxidative Proteinmodifikationen Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-489119 ER - TY - THES A1 - Moga, Akanksha T1 - Reconstitution of molybdenum cofactor biosynthesis in giant vesicles N2 - Bottom-up synthetic biology is used for the understanding of how a cell works. It is achieved through developing techniques to produce lipid-based vesicular structures as cellular mimics. The most common techniques used to produce cellular mimics or synthetic cells is through electroformation and swelling method. However, the abovementioned techniques cannot efficiently encapsulate macromolecules such as proteins, enzymes, DNA and even liposomes as synthetic organelles. This urges the need to develop new techniques that can circumvent this issue and make the artificial cell a reality where it is possible to imitate a eukaryotic cell through encapsulating macromolecules. In this thesis, the aim to construct a cell system using giant unilamellar vesicles (GUVs) to reconstitute the mitochondrial molybdenum cofactor biosynthetic pathway. This pathway is highly conserved among all life forms, and therefore is known for its biological significance in disorders induced through its malfunctioning. Furthermore, the pathway itself is a multi-step enzymatic reaction that takes place in different compartments. Initially, GTP in the mitochondrial matrix is converted to cPMP in the presence of cPMP synthase. Further, produced cPMP is transported across the membrane to the cytosol, to be converted by MPT synthase into MPT. This pathway provides a possibility to address the general challenges faced in the development of a synthetic cell, to encapsulate large biomolecules with good efficiency and greater control and to evaluate the enzymatic reactions involved in the process. For this purpose, the emulsion-based technique was developed and optimised to allow rapid production of GUVs (~18 min) with high encapsulation efficiency (80%). This was made possible by optimizing various parameters such as density, type of oil, the impact of centrifugation speed/time, lipid concentration, pH, temperature, and emulsion droplet volume. Furthermore, the method was optimised in microtiter plates for direct experimentation and visualization after the GUV formation. Using this technique, the two steps - formation of cPMP from GTP and the formation of MPT from cPMP were encapsulated in different sets of GUVs to mimic the two compartments. Two independent fluorescence-based detection systems were established to confirm the successful encapsulation and conversion of the reactants. Alternatively, the enzymes produced using bacterial expression and measured. Following the successful encapsulation and evaluation of enzymatic reactions, cPMP transport across mitochondrial membrane has been mimicked using GUVs using a complex mitochondrial lipid composition. It was found that the cPMP interaction with the lipid bilayer results in transient pore-formation and leakage of internal contents. Overall, it can be concluded that in this thesis a novel technique has been optimised for fast production of functional synthetic cells. The individual enzymatic steps of the Moco biosynthetic pathway have successfully implemented and quantified within these cellular mimics. N2 - Die synthetische Biologie wird in der von unten-nach-oben-Methode eingesetzt, um zu verstehen, wie eine Zelle funktioniert. Dafür werden Techniken zur Herstellung lipidbasierter vesikul rer Strukturen als zellul re Nachahmungen entwickelt. Die gebräuchlichste Technik zur Herstellung von Zellnachahmungen oder synthetischen Zellen ist die Elektroformations- und Schwellmethode. Diese Techniken können jedoch Makromoleküle wie Proteine, Enzyme, DNA und sogar Liposomen nicht effizient als synthetische Organellen einkapseln. Daher ist es dringend erforderlich, neue Techniken zu entwickeln, die dieses Problem umgehen und die künstliche Zelle zu einer Realität machen, in der es möglich ist, eine eukaryotische Zelle durch Einkapselung von Makromolekülen zu imitieren. Das Ziel dieser Arbeit war es, ein komplexes Zellensystemmodel zu konstruieren, bei dem riesige unilamellare Vesikel (GUVs) zur Rekonstruktion des mitochondrialen Molybd n-Kofaktor-Biosynthesewegs verwendet werden. Dieser Stoffwechselweg ist bei allen Lebensformen hoch konserviert und daher aufgrund von St rungen, die durch Fehlfunktionen hervorgerufen werden, für seine biologische Bedeutung relevant. Darüber hinaus ist die Biosynthese selbst eine mehrstufige enzymatische Reaktion, die in verschiedenen Kompartimenten abläuft. Zunächst wird GTP in der mitochondrialen Matrix in Gegenwart von cPMP-Synthase zu cPMP umgewandelt. Anschlie end wird das produzierte cPMP über die Membran zum Zytosol transportiert, wo es von der MPT-Synthase in MPT umgewandelt wird. Dieser Biosyntheseweg bietet eine M glichkeit, den allgemeinen Herausforderungen bei der Entwicklung einer synthetischen Zelle zu begegnen, um große Biomoleküle mit guter Effizienz und Kontrolle zu verkapseln und die am Prozess beteiligten enzymatischen Reaktionen zu bewerten. Zu diesem Zweck wurde die emulsionsbasierte Technik entwickelt und optimiert, die eine schnelle Produktion von GUVs (~18 min) mit hoher Verkapselungseffizienz (80%) ermöglicht. M glich wurde dies durch die Optimierung verschiedener Parameter wie Dichte,  ltyp, Einfluss von Zentrifugationsgeschwindigkeit/-zeit, Lipidkonzentration, pH-Wert, Temperatur und Emulsionstropfenvolumen. Darüber hinaus wurde die Methode in Mikrotiterplatten für das direkte Experimentieren und die Visualisierung nach der GUV-Bildung optimiert. Mit dieser Technik wurden die beiden Schritte, die Bildung von cPMP aus GTP und die Bildung von MPT aus cPMP, in verschiedenen GUVs eingekapselt, um die beiden Kompartimente nachzuahmen. Zwei unabhängige fluoreszenzbasierte Detektionssysteme wurden eingerichtet, um die erfolgreiche Einkapselung und Umwandlung der Reaktanten zu best tigen. Alternativ wurden die Enzyme mittels bakterieller Expression produziert und gemessen. Nach der erfolgreichen Einkapselung und Auswertung der enzymatischen Reaktionen wurde der cPMP-Transport durch die mitochondriale Membran mit Hilfe von GUVs unter Verwendung einer komplexen mitochondrialen Lipidzusammensetzung nachgeahmt. Es wurde festgestellt, dass die cPMP-Wechselwirkung mit der Lipiddoppelschicht zu einer transienten Porenbildung und zum Auslaufen des inneren Inhalts führt. Insgesamt kann der Schluss gezogen werden, dass in dieser Arbeit eine neuartige Technik für die schnelle Herstellung funktioneller synthetischer Zellen optimiert wurde. Einzelne enzymatische Schritte des Moco-Biosynthesewegs wurden in diesen zellul ren Mimiken erfolgreich implementiert und quantifiziert. KW - GUVs KW - Molybdenum cofactor biosynthetic KW - Microscopy KW - Inverted emulsion-based method KW - Mikroskop KW - Biochemie Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-510167 ER - TY - THES A1 - Shevtsova, Iuliia T1 - Recent and future vegetation change in the treeline region of Chukotka (NE Russia) inferred from field data, satellite data and modelling N2 - Vegetation change at high latitudes is one of the central issues nowadays with respect to ongoing climate changes and triggered potential feedback. At high latitude ecosystems, the expected changes include boreal treeline advance, compositional, phenological, physiological (plants), biomass (phytomass) and productivity changes. However, the rate and the extent of the changes under climate change are yet poorly understood and projections are necessary for effective adaptive strategies and forehanded minimisation of the possible negative feedbacks. The vegetation itself and environmental conditions, which are playing a great role in its development and distribution are diverse throughout the Subarctic to the Arctic. Among the least investigated areas is central Chukotka in North-Eastern Siberia, Russia. Chukotka has mountainous terrain and a wide variety of vegetation types on the gradient from treeless tundra to northern taiga forests. The treeline there in contrast to subarctic North America and north-western and central Siberia is represented by a deciduous conifer, Larix cajanderi Mayr. The vegetation varies from prostrate lichen Dryas octopetala L. tundra to open graminoid (hummock and non-hummock) tundra to tall Pinus pumila (Pall.) Regel shrublands to sparse and dense larch forests. Hence, this thesis presents investigations on recent compositional and above-ground biomass (AGB) changes, as well as potential future changes in AGB in central Chukotka. The aim is to assess how tundra-taiga vegetation develops under changing climate conditions particularly in Fareast Russia, central Chukotka. Therefore, three main research questions were considered: 1) What changes in vegetation composition have recently occurred in central Chukotka? 2) How have the above-ground biomass AGB rates and distribution changed in central Chukotka? 3) What are the spatial dynamics and rates of tree AGB change in the upcoming millennia in the northern tundra-taiga of central Chukotka? Remote sensing provides information on the spatial and temporal variability of vegetation. I used Landsat satellite data together with field data (foliage projective cover and AGB) from two expeditions in 2016 and 2018 to Chukotka to upscale vegetation types and AGB for the study area. More specifically, I used Landsat spectral indices (Normalised Difference Vegetation Index (NDVI), Normalised Difference Water Index (NDWI) and Normalised Difference Snow Index (NDSI)) and constrained ordination (Redundancy analysis, RDA) for further k-means-based land-cover classification and general additive model (GAM)-based AGB maps for 2000/2001/2002 and 2016/2017. I also used Tandem-X DEM data for a topographical correction of the Landsat satellite data and to derive slope, aspect, and Topographical Wetness Index (TWI) data for forecasting AGB. Firstly, in 2016, taxa-specific projective cover data were collected during a Russian-German expedition. I processed the field data and coupled them with Landsat spectral Indices in the RDA model that was used for k-means classification. I could establish four meaningful land-cover classes: (1) larch closed-canopy forest, (2) forest tundra and shrub tundra, (3) graminoid tundra and (4) prostrate herb tundra and barren areas, and accordingly, I produced the land cover maps for 2000/2001/2002 and 2016/20017. Changes in land-cover classes between the beginning of the century (2000/2001/2002) and the present time (2016/2017) were estimated and interpreted as recent compositional changes in central Chukotka. The transition from graminoid tundra to forest tundra and shrub tundra was interpreted as shrubification and amounts to a 20% area increase in the tundra-taiga zone and 40% area increase in the northern taiga. Major contributors of shrubification are alder, dwarf birch and some species of the heather family. Land-cover change from the forest tundra and shrub tundra class to the larch closed-canopy forest class is interpreted as tree infilling and is notable in the northern taiga. We find almost no land-cover changes in the present treeless tundra. Secondly, total AGB state and change were investigated for the same areas. In addition to the total vegetation AGB, I provided estimations for the different taxa present at the field sites. As an outcome, AGB in the study region of central Chukotka ranged from 0 kg m-2 at barren areas to 16 kg m-2 in closed-canopy forests with the larch trees contributing the highest. A comparison of changes in AGB within the investigated period from 2000 to 2016 shows that the greatest changes (up to 1.25 kg m 2 yr 1) occurred in the northern taiga and in areas where land cover changed to larch closed-canopy forest. Our estimations indicate a general increase in total AGB throughout the investigated tundra-taiga and northern taiga, whereas the tundra showed no evidence of change in AGB within the 15 years from 2002 to 2017. In the third manuscript, potential future AGB changes were estimated based on the results of simulations of the individual-based spatially explicit vegetation model LAVESI using different climate scenarios, depending on Representative Concentration Pathways (RCPs) RCP 2.6, RCP 4.5 and RCP 8.5 with or without cooling after 2300 CE. LAVESI-based AGB was simulated for the current state until 3000 CE for the northern tundra-taiga study area for larch species because we expect the most notable changes to occur will be associated with forest expansion in the treeline ecotone. The spatial distribution and current state of tree AGB was validated against AGB field data, AGB extracted from Landsat satellite data and a high spatial resolution image with distinctive trees visible. The simulation results are indicating differences in tree AGB dynamics plot wise, depending on the distance to the current treeline. The simulated tree AGB dynamics are in concordance with fundamental ecological (emigrational and successional) processes: tree stand formation in simulated results starts with seed dispersion, tree stand establishment, tree stand densification and episodic thinning. Our results suggest mostly densification of existing tree stands in the study region within the current century in the study region and a lagged forest expansion (up to 39% of total area in the RCP 8.5) under all considered climate scenarios without cooling in different local areas depending on the closeness to the current treeline. In scenarios with cooling air temperature after 2300 CE, forests stopped expanding at 2300 CE (up to 10%, RCP 8.5) and then gradually retreated to their pre-21st century position. The average tree AGB rates of increase are the strongest in the first 300 years of the 21st century. The rates depend on the RCP scenario, where the highest are as expected under RCP 8.5. Overall, this interdisciplinary thesis shows a successful integration of field data, satellite data and modelling for tracking recent and predicting future vegetation changes in mountainous subarctic regions. The obtained results are unique for the focus area in central Chukotka and overall, for mountainous high latitude ecosystems. N2 - Die Veränderung der Vegetation in den hohen Breiten ist heutzutage eines der zentralen Themen im Hinblick auf den anhaltenden Klimawandel und hat potenziell auslösende Rückkopplungen. In den Ökosystemen der hohen Breiten umfassen die erwarteten Veränderungen das Fortschreiten der borealen Baumgrenze, sowie kompositorische, phänologische, physiologische, Biomassen- (Phytomasse) und Produktivitätsveränderungen. Die Geschwindigkeit und das Ausmaß der Veränderungen im Rahmen des Klimawandels sind jedoch noch wenig verstanden, und Projektionen sind für wirksame Anpassungsstrategien und eine vorausschauende Minimierung möglicher negativer Rückkopplungen erforderlich. Die Vegetation selbst und die Umweltbedingungen, die bei ihrer Entwicklung und Verbreitung eine große Rolle spielen, sind in der gesamten Subarktis bis zur Arktis unterschiedlich. Zu den am wenigsten untersuchten Gebieten gehört Zentral-Tschukotka, in Nordost-Sibirien, Russland. Tschukotka hat gebirgiges Terrain und eine weite Bandbreite von Vegetationstypen entlang des Gradienten von der baumlosen Tundra bis zu den nördlichen Taiga-Wäldern. Die Baumgrenze dort wird im Gegensatz zum subarktischen Nordamerika sowie Nordwest- und Mittelsibirien durch eine laubabwerfende Nadelbaumart, Larix cajanderi Mayr, aufgebaut. Die Vegetation variiert von Tundra mit Flechten und Dryas octopetala L. über offene graminoide (Horstgras und nicht Horstgras) Tundra und hohe Pinus pumila (Pall.) Regel Strauchlandschaften zu lockeren Lärchenbeständen bis zu dichten Lärchenwäldern. Somit werden in meiner Dissertation Untersuchungen zu den jüngsten Veränderungen der Vegetationszusammensetzung und der oberirdischen Biomasse (aus dem Englischen above-ground biomass, bzw. AGB), sowie zu potenziellen zukünftigen Veränderungen der AGB vorgestellt. Das Ziel meiner Arbeit ist es abzuschätzen, wie sich die Tundra-Taiga-Vegetation unter Klimawandel entwickelt, insbesondere in Fernost Russland, Zentral-Tschukotka. Daher wurden drei Hauptforschungsfragen berücksichtigt: 1) Welche Veränderungen in der Vegetationszusammensetzung sind in den letzten Jahrzehnten in Zentral-Tschukotka aufgetreten? 2) Wie haben sich die AGB-Raten und die Verteilung der oberirdischen Biomasse in Zentral-Tschukotka verändert? 3) Wie sind die räumlichen Dynamiken und Änderungsraten der Baum-AGB in dem kommenden Jahrtausend in der nördlichen Tundra-Taiga in Zentral-Tschukotka? Fernerkundung liefert Informationen über die räumliche und zeitliche Vegetationsvariabilität. Ich habe Landsat-Satellitendaten zusammen mit Felddaten (Projektive Vegetationsbedeckung und AGB) von zwei Expeditionen in den Jahren 2016 und 2018 nach Tschukotka verwendet, um Vegetationstypen und AGB für das Untersuchungsgebiet räumlich abzubilden. Insbesondere habe ich die Landsat-Spektralindizes (Normalized Difference Vegetation Index (NDVI), Normalized Difference Water Index (NDWI) und Normalized Difference Snow Index (NDSI)) und eine Ordination mit Randbedingungen (Redundanzanalyse, RDA) verwendet, um eine Land-Klassifizierung mittels der k-means Methode zu entwickeln, und AGB-Karten mittels des General Additive Model (GAM) für 2000/2001/2002 und 2016/2017 zu erstellen. Außerdem verwendete ich Tandem-X-DEM-Daten, um die Landsat-Satellitendaten topografisch zu korrigieren und um die Hangneigung-, Hangaspekt- und TWI- (Topographical Wetness Index) Daten für die Vorhersage von AGB abzuleiten. Auf einer russisch-deutschen Expedition im Jahr 2016 wurden Vegetationsdaten erhoben. Ich prozessierte die Felddaten zu taxaspezifischen-projektiven Vegetationsbedeckungsdaten. Ich habe die taxaspezifisch-projektive Vegetationsbedeckung mit Landsat-Spektralindizes im RDA-Modell gekoppelt, das für die k-means-Klassifizierung verwendet wurde. Ich konnte vier repräsentative Landbedeckungsklassen einrichten: (1) Lärchen-Wald mit geschlossenem Blätterdach, (2) Waldtundra und Strauch-Tundra, (3) graminoide Tundra und (4) Kräutertundra und vegetationsarme Gebiete. Dementsprechend prozessierte ich dann die Landbedeckungskarten für 2000/2001/2002 und 2016/20017. Ich ermittelte die Änderungen der Landbedeckungsklassen zwischen dem Beginn des Jahrhunderts (2000/2001/2002) und der Gegenwart (2016/2017) und konnte sie als aktuelle Kompositionsänderungen in der Vegetation von Zentral-Tschukotka interpretieren. Die Transformation von der graminoiden Tundra zur Waldtundra oder zur Strauch-Tundra habe ich als Prozess der Strauchbildung interpretiert, die einer Flächenvergrößerung von 20% in der Tundra-Taiga Zone und einer Flächenvergrößerung von 40% in der nördlichen Taiga entspricht. Hauptakteure der Strauchung sind Erle, Zwergbirke und einige Arten der Heidekrautfamilie. Der Landbedeckungswechsel von der Waldtundra- und Strauch-Tundra-Klasse zur Klasse des Lärchen-Waldes mit geschlossenen Blätterdach wird als eine Verdichtung des Baumbestandes interpretiert und ist in der nördlichen Taiga bemerkenswert. In der heutigen baumlosen Tundra finden wir fast keine Landbedeckungsänderungen. Im zweiten Projekt bestimmte ich den Gesamt-AGB-Zustand und die gesamte AGB-Veränderung für dieselben Regionen in Zentral-Chukotka. Zusätzlich zur gesamten AGB lieferte ich Schätzungen für die verschiedenen Taxa, die an den Feldstandorten vorhanden sind. Als Ergebnis lag die AGB in der Untersuchungsregion von Zentral-Tschukotka zwischen 0 kg m-2 in vegetationsarmen Gebieten und 16 kg m-2 in den Wäldern mit geschlossenem Blätterdach mit dem größten Anteil von Lärchen. Ein Vergleich der Veränderungen der AGB im Untersuchungszeitraum von 2000 bis 2016 zeigt, dass die größten Veränderungen (bis zu 1,25 kg m-2 Jahr-1) in der nördlichen Taiga und in den Gebieten auftraten, in denen sich die Landbedeckung hin zu einen Lärchenwald mit geschlossenen Blätterdach änderte. Unsere Schätzungen deuten auf einen allgemeinen Anstieg der gesamten AGB in der untersuchten Tundra-Taiga und der nördlichen Taiga hin. Im Gegensatz zeigte die Tundra innerhalb der 15 Jahre von 2002 bis 2017 keine Hinweise auf eine Veränderung der AGB. Im dritten Projekt wurden potenzielle zukünftige Änderungen der oberirdischen Biomasse (AGB) basierend auf den Ergebnissen von Simulationen des individuell basierten räumlich expliziten Vegetationsmodells LAVESI unter Verwendung verschiedener Klimaszenarien, abhängig von RCP (Representative Concentration Pathways) 2.6, RCP 4.5 und RCP 8.5 (mit und ohne die Temperaturminderung nach den 2300 CE), geschätzt. Die LAVESI-basierte AGB wurde für den aktuellen Zustand bis 3000 CE für Lärchen-AGB simuliert, da wir davon ausgehen, dass die bemerkenswertesten Veränderungen im Baumgrenze-Ökoton mit einer Waldausdehnung zusammenhängen. Die räumliche Verteilung und der aktuelle Zustand der Baum-AGB wurden anhand von AGB-Felddaten, aus Landsat-Satellitendaten extrahierten AGB und einem Satellitenbild mit hoher räumlicher Auflösung und dadurch sichtbaren Einzelbäumen validiert. Die Simulationsergebnisse deuten auf Unterschiede in der Baum-AGB-Dynamik in Abhängigkeit von der Entfernung zur aktuellen Baumgrenze hin. Die simulierte Baum-AGB-Dynamik stimmt mit grundlegenden ökologischen (Auswanderungs- und Sukzessions-) Prozessen überein: die simulierte Baumbestandsentwicklung fängt mit Samenverbreitung an, Schaffung des Baumbestands, Baumbestand Verdichtung und episodische Verdünnung. Unsere Ergebnisse weisen auf eine Verdichtung des bestehenden Baumbestandes im Laufe dieses Jahrhunderts hin in der Untersuchungsregion, und auf eine zeitlich verzögerte Waldverbreitung (bis zu 39% der Fläche im RCP 8.5) unter allen betrachteten Klima-Szenarien ohne Abkühlung in verschiedenen lokalen Bereichen, abhängig von der Nähe zur heutigen Baumgrenze. In Szenarien mit Abkühlung nach 2300 CE beenden die Wälder ihre Ausbreitung um 2300 CE; bis zu 10%, RCP 8.5) um dann graduell zu ihrer vor 21. Jhd. Position zurückzuweichen. Die gemittelten Änderungsraten der Baum AGB sind am höchsten in den ersten 300 Jahren des 21. Jahrhunderts. Die Änderungsraten hängen ab von dem RCP Szenarium, mit den höchsten Änderungsraten unter RCP 8.5, wie zu erwarten war. Insgesamt zeigt diese interdisziplinäre Arbeit eine erfolgreiche Integration von Felddaten, Satellitendaten und Modellen zur Verfolgung der aktuellen und vorhergesagten zukünftigen Vegetationsänderungen in subarktischen Gebirgsregionen. Die erzielten Ergebnisse sind einzigartig für den Schwerpunktbereich in Zentral-Tschukotka und insgesamt für Gebirgsregionen in den hohen Breiten. T2 - Aktuelle und zukünftige Vegetationsveränderung in der Baumgrenzenregion von Chukotka (Nordost-Russland), abgeleitet aus Felddaten, Satellitendaten und Modellierung KW - plant ecology KW - vegetation change KW - Chukotka vegetation KW - above-ground biomass KW - land-cover classification KW - LAVESI KW - tree infilling KW - shrubification KW - subarctic vegetation change KW - treeline KW - tundra-taiga KW - Larix cajanderi KW - Vegetation von Tschukotka KW - oberirdische Biomasse KW - Klassifikation der Landbedeckung KW - Pflanzenökologie KW - Vegetationsveränderungen in der Subarktis KW - Waldausdehnung KW - Vegetationsveränderungen KW - Baumgrenze KW - Tundra-Taiga Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-548452 ER - TY - THES A1 - Schauer, Nicolas T1 - Quantitative trait loci (QTL) for metabolite accumulation and metabolic regulation : metabolite profiling of interspecific crosses of tomato T1 - Metabolomische Analyse von interspezifischen Tomaten N2 - The advent of large-scale and high-throughput technologies has recently caused a shift in focus in contemporary biology from decades of reductionism towards a more systemic view. Alongside the availability of genome sequences the exploration of organisms utilizing such approach should give rise to a more comprehensive understanding of complex systems. Domestication and intensive breeding of crop plants has led to a parallel narrowing of their genetic basis. The potential to improve crops by conventional breeding using elite cultivars is therefore rather limited and molecular technologies, such as marker assisted selection (MAS) are currently being exploited to re-introduce allelic variance from wild species. Molecular breeding strategies have mostly focused on the introduction of yield or resistance related traits to date. However given that medical research has highlighted the importance of crop compositional quality in the human diet this research field is rapidly becoming more important. Chemical composition of biological tissues can be efficiently assessed by metabolite profiling techniques, which allow the multivariate detection of metabolites of a given biological sample. Here, a GC/MS metabolite profiling approach has been applied to investigate natural variation of tomatoes with respect to the chemical composition of their fruits. The establishment of a mass spectral and retention index (MSRI) library was a prerequisite for this work in order to establish a framework for the identification of metabolites from a complex mixture. As mass spectral and retention index information is highly important for the metabolomics community this library was made publicly available. Metabolite profiling of tomato wild species revealed large differences in the chemical composition, especially of amino and organic acids, as well as on the sugar composition and secondary metabolites. Intriguingly, the analysis of a set of S. pennellii introgression lines (IL) identified 889 quantitative trait loci of compositional quality and 326 yield-associated traits. These traits are characterized by increases/decreases not only of single metabolites but also of entire metabolic pathways, thus highlighting the potential of this approach in uncovering novel aspects of metabolic regulation. Finally the biosynthetic pathway of the phenylalanine-derived fruit volatiles phenylethanol and phenylacetaldehyde was elucidated via a combination of metabolic profiling of natural variation, stable isotope tracer experiments and reverse genetic experimentation. N2 - Die Einführung von Hochdurchsatzmethoden zur Analyse von biologischen Systemen, sowie die umfangreiche Sequenzierung von Genomen haben zu einer Verlagerung der Forschung „im Detail“ zu einer ganzheitlicheren Betrachtungsweise auf Systemebene geführt. Aus einer jahrhundertlangen, intensiven Züchtung und Selektion von Nutzpflanzen resultierte gleichzeitig eine Abnahme der genetischen Varianz. Daraus resultierend sind Nutzpflanzen anfälliger gegenüber Stressfaktoren, wie Pathogenen, hohen Salzkonzentrationen oder Trockenheit, als ihre Wildarten. Das Potential konventioneller Züchtung scheint somit heute an seine Grenzen gekommen zu sein. Daher versucht man mittels moderner Molekulartechnik, wie zum Beispiel Marker-gestützte Selektion, Gene oder ganze Genombereiche von Wildarten mit hoher genetischer Variation in Nutzpflanzen einzukreuzen, vornehmlich mit dem Ziel einer Ertrags- bzw. Resistenzsteigerung. Neueste medizinische Studien belegen, dass die Ernährung eine wesentliche Rolle für die menschliche Gesundheit spielt. Besonders wichtig sind hierbei die gesundheitsfördernden Substanzen in pflanzlichen Nahrungsmitteln. Aus diesem Grund kommt der Erforschung der biochemischen Zusammensetzung von biologischen Proben eine immer größere Bedeutung zu. Diese Untersuchung kann elegant durch Metabolitenprofile, welche die multivariate Analyse komplexer biologischer Proben erlauben, durchgeführt werden. In dieser Arbeit wurde zur Untersuchung der biochemischen Zusammensetzung von Tomatenwildarten und interspezifischen S. pennellii Tomatenintrogressionslinien (IL) eine GC/MS basierte Metabolitenanalyseplattform verwendet. Hierzu war es zunächst notwendig eine Massenspektrenbibliothek, zur Annotierung von Massenspektren und Retentionsindices von, in pflanzlichen Proben vorkommenden, Metaboliten anzulegen. Die Analyse der Tomatenwildarten ergab große Unterschiede gegenüber der Kulturtomate im Hinblick auf den Gehalt an Amino- und organischen Säuren, sowie der Zuckerzusammensetzung und den Gehalt an Sekundärmetaboliten. Die darauf folgende Analyse der ILs, von den jede ein genau definiertes genomisches Segment von S. pennellii beinhaltet, bestätigte diese enorme Variation mit 889 metabolischen und 326 ertragsassozierten-Veränderungen in den ILs. Die metabolischen Veränderungen zeichneten sich durch abnehmende bzw. steigende Gehalte von einzelnen Metaboliten, aber auch durch eine koordinierte Änderung aus. In dieser Arbeit wurde weiterhin der Biosyntheseweg der Volatilenstoffe Phenylethanol und Phenylacetaldehyd mit Hilfe einer IL untersucht. Hierbei konnten durch stabile Isotopenmarkierung und eines „reverse genetics“-Ansatzes Gene bzw. Enzyme identifiziert werden, die für die Dekarboxylierung des Eduktes Phenylalanin verantwortlich sind. Diese Arbeit beschreibt erstmals die umfassende Analyse von biochemischen Komponenten auf Genombasis in Tomatenintrogressionslinien und zeigt damit ein Werkzeug auf zur Identifizierung von qualitativen biochemischen Merkmalen in der modernen molekularen Züchtung. KW - Tomate KW - Metabolit KW - GC-MS KW - Introgression KW - Frucht KW - Metabolome KW - Züchtung KW - metabolic genomics KW - Tomato KW - metabolite profiling KW - metabolome KW - breeding KW - crops KW - fruit KW - metabolite breeding KW - metabolic genomics Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-7643 ER - TY - THES A1 - Koikkarah Aji, Amit T1 - Quantitative sub cellular characterization of Hantavirus structural proteins T1 - Quantitativ Subzellulär Charakterisierung Von Hantavirus-Strukturproteine. N2 - Hantaviruses (HVs) are a group of zoonotic viruses that infect human beings primarily through aerosol transmission of rodent excreta and urine samplings. HVs are classified geographically into: Old World HVs (OWHVs) that are found in Europe and Asia, and New World HVs (NWHVs) that are observed in the Americas. These different strains can cause severe hantavirus diseases with pronounced renal syndrome or severe cardiopulmonary system distress. HVs can be extremely lethal, with NWHV infections reaching up to 40 % mortality rate. HVs are known to generate epidemic outbreaks in many parts of the world including Germany, which has seen periodic HV infections over the past decade. HV has a trisegmented genome. The small segment (S) encodes the nucleocapsid protein (NP), the middle segment (M) encodes the glycoproteins (GPs) Gn and Gc which forms up to tetramers and primarily monomers \& dimers upon independent expression respectively and large segment (L) encodes RNA dependent RNA polymerase (RdRp). Interactions between these viral proteins are crucial in providing mechanistic insights into HV virion development. Despite best efforts, there continues to be lack of quantification of these associations in living cells. This is required in developing the mechanistic models for HV viral assembly. This dissertation focuses on three key questions pertaining to the initial steps of virion formation that primarily involves the GPs and NP. The research investigations in this work were completed using Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS) approaches. FCS is frequently used in assessing the biophysical features of bio-molecules including protein concentration and diffusion dynamics and circumvents the requirement of protein overexpression. FCS was primarily applied in this thesis to evaluate protein multimerization, at single cell resolution. The first question addressed which GP spike formation model proposed by Hepojoki et al.(2010) appropriately describes the evidence in living cells. A novel in cellulo assay was developed to evaluate the amount of fluorescently labelled and unlabeled GPs upon co-expression. The results clearly showed that Gn and Gc initially formed a heterodimeric Gn:Gc subunit. This sub-unit then multimerizes with congruent Gn:Gc subunits to generate the final GP spike. Based on these interactions, models describing the formation of GP complex (with multiple GP spike subunits) were additionally developed. HV GP assembly primarily takes place in the Golgi apparatus (GA) of infected cells. Interestingly, NWHV GPs are hypothesized to assemble at the plasma membrane (PM). This led to the second research question in this thesis, in which a systematic comparison between OWHV and NWHV GPs was conducted to validate this hypothesis. Surprisingly, GP localization at the PM was congruently observed with OWHV and NWHV GPs. Similar results were also discerned with OWHV and NWHV GP localization in the absence of cytoskeletal factors that regulate HV trafficking in cells. The final question focused on quantifying the NP-GP interactions and understanding their influence of NP and GP multimerization. Gc mutlimers were detected in the presence of NP and complimented by the presence of localized regions of high NP-Gc interactions in the perinuclear region of living cells. Gc-CT domain was shown to influence NP-Gc associations. Gn, on the other hand, formed up to tetrameric complexes, independent from the presence of NP. The results in this dissertation sheds light on the initial steps of HV virion formation by quantifying homo and heterotypic interactions involving NP and GPs, which otherwise are very difficult to perform. Finally, the in cellulo methodologies implemented in this work can be potentially extended to understand other key interactions involved in HV virus assembly. N2 - Hantaviren (HVs) gehören zu einer Gruppe von Zoonosenviren, die den Menschen hauptsächlich über Aerosolübertragung von Nagetierausscheidungen und Urinproben infizieren. HVs werden geografisch unterteilt in: Alte Welt-HVs (OWHVs), die in Europa und Asien vorkommen, und Neue Welt-HVs (NWHVs), die auf dem amerikanischen Kontinent beobachtet werden. Diese verschiedenen Stämme können schwere Krankheiten verursachen, wie hämorrhagisches Fieber mit Nierensyndrom oder schwere Herz-Lungen-Störungen. HVs haben eine hohe Sterblichkeitsrate, wobei NWHV-Infektionen eine Sterblichkeitsrate von bis zu 40 % erreichen. Es ist bekannt, dass HVs in vielen Teilen der Welt epidemische Ausbrüche verursachen können, so auch in Deutschland, wo in den letzten zehn Jahren regelmäßig HV-Infektionen vorkamen. HV besitzt ein trisegmentiertes Genom. Das kleine Segment (S) kodiert das Nukleokapsidprotein (NP), das mittlere Segment (M) kodiert die Glykoproteine (GPs) Gn und Gc, die bei unabhängiger Expression Tetramere und Dimere bilden, und das große Segment (L) kodiert die RNA-abhängige RNA-Polymerase (RdRp). Die Wechselwirkungen zwischen diesen viralen Proteinen sind von entscheidender Bedeutung für die Aufklärung der Mechanismen der HV-entwicklung. Trotz aller Bemühungen fehlt es nach wie vor an der Quantifizierung dieser Verbindungen in lebenden Zellen. Dies ist für die Entwicklung komplexer Modelle für den Aufbau von HV erforderlich. Diese Arbeit konzentriert sich auf drei Schlüsselfragen im Zusammenhang mit den ersten Phasen der Virionenbildung, an denen hauptsächlich die GPs und NP beteiligt sind. Die Forschungsaufgaben in dieser Arbeit wurden mit Hilfe der Fluoreszenzkorrelationspektroskopie (FCS) untersucht. Die FCS wird häufig zur Bewertung der biophysikalischen Eigenschaften von Biomolekülen, einschließlich der Proteinkonzentration und Diffusionsdynamik, eingesetzt und macht eine Überexpression von Proteinen überflüssig. In dieser Arbeit wurde FFS in erster Linie eingesetzt, um die Multimerisierung von Proteinen bei Einzelzellauflösung zu untersuchen. Die erste Frage lautete, welches das von Hepojoki et al. (2010) vorgeschlagene Modell der GP-Spike-Bildung den Vorgang in lebenden Zellen adäquat beschreibt. Es wurde ein neuartiger in cellulo-Assay entwickelt, um die Konzentration von fluoreszenzmarkierten und unmarkierten GPs bei der Ko-expression zu bestimmen. Die Ergebnisse zeigten deutlich, dass Gn und Gc zunächst eine heterodimere Gn:Gc-Untereinheit bilden. Diese Untereinheit multimerisiert dann mit kongruenten Gn:Gc-Untereinheiten, um den finalen GP-Spike zu erzeugen. Auf der Grundlage dieser Interaktionen wurden zusätzlich Modelle entwickelt, die die Bildung des GP-Komplexes (mit mehreren GP-Spike-Untereinheiten) beschreiben. Die HV-GP-Assemblierung findet hauptsächlich im Golgi-Apparat (GA) von infizierten Zellen statt. Interessanterweise wird angenommen, dass NWHV GPs an der Plasmamembran (PM) assembliert werden. Dies führte zur zweiten Frage dieser Arbeit, bei der ein systematischer Vergleich zwischen OWHV- und NWHV-GP durchgeführt wurde, um diese Hypothese zu bestätigen. Überraschenderweise wurde die GP-Lokalisierung an der PM bei OWHV- und NWHV-GPs gleichermaßen beobachtet. Ähnliche Ergebnisse wurden auch bei der Lokalisierung von OWHV- und NWHV-GP in Abwesenheit von zytoskelettalen Faktoren festgestellt, die die HV-Infektion regulieren. Die letzte Frage dieser Arbeit konzentrierte sich auf die Quantifizierung der NP-GP-Wechselwirkungen und das Verständnis ihres Einflusses auf die Multimerisierung von NP und GPs. Gc-Multimere, die in Gegenwart von NP nachgewiesen wurden, wurden durch das Vorhandensein von perinukleär lokalisierten Regionen mit starken NP-Gc-Wechselwirkungen in lebenden Zellen komplettiert. Es wurde gezeigt, dass die Gc-CT-Domäne die NP-Gc-Assoziationen beeinflusst. Gn hingegen bildete unabhängig von der Anwesenheit von NP tetramerische Komplexe. Die Ergebnisse dieser Arbeit geben Aufschluss über die ersten Phasen der HV-Assemblierung, indem sie die Homo- und Hetero-Interaktionen zwischen NP und GPs quantifizieren, was sonst nur sehr schwer möglich ist. Schließlich können die in dieser Arbeit implementierten in cellulo-Methoden potenziell erweitert werden, um andere Schlüsselinteraktionen zu verstehen, die an der HV-Assemblierung beteiligt sind. KW - Hantavirus KW - fluorescence microscopy KW - fluorescence correlation spectroscopy KW - protein multimerization KW - virus assembly KW - single cell imaging KW - Hantaviren KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Fluoreszenzkorrelationspektroskopie KW - Virionenbildung KW - Proteinmultimerisierung Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-586612 ER - TY - THES A1 - Petrich, Annett T1 - Quantitative fluorescence microscopy methods to investigate molecular interactions and dynamics in living cells T1 - Quantitative Fluoreszenzmikroskopiemethoden zur Untersuchung molekularer Interaktionen und Dynamik in lebenden Zellen N2 - Biomolecules such as proteins and lipids have vital roles in numerous cellular functions, including biomolecule transport, protein functions, cellular homeostasis and biomembrane integrity. Traditional biochemistry methods do not provide precise information about cellular biomolecule distribution and behavior under native environmental conditions since they are not transferable to live cell samples. Consequently, this can lead to inaccuracies in quantifying biomolecule interactions due to potential complexities arising from the heterogeneity of native biomembranes. To overcome these limitations, minimal invasive microscopic techniques, such as fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) in combination with fluorescence proteins (FPs) and fluorescence lipid analogs, have been developed. FFS techniques and membrane property sensors enable the quantification of various parameters, including concentration, dynamics, oligomerization, and interaction of biomolecules in live cell samples. In this work, several FFS approaches and membrane property sensors were implemented and employed to examine biological processes of diverse context. Multi-color scanning fluorescence fluctuation spectroscopy (sFCS) was used the examine protein oligomerization, protein-protein interactions (PPIs) and protein dynamics at the cellular plasma membrane (PM). Additionally, two-color number and brightness (N&B) analysis was extended with the cross-correlation analysis in order to quantify hetero-interactions of proteins in the PM with very slow motion, which would not accessible with sFCS due strong initial photobleaching. Furthermore, two semi-automatic analysis pipelines were designed: spectral Förster resonance energy transfer (FRET) analysis to study changes in membrane charge at the inner leaflet of the PM, and spectral generalized polarization (GP) imaging and spectral phasor analysis to monitor changes in membrane fluidity and order. An important parameter for studying PPIs is molecular brightness, which directly determines oligomerization and can be extracted from FFS data. However, FPs often display complex photophysical transitions, including dark states. Therefore, it is crucial to characterize FPs for their dark-states to ensure reliable oligomerization measurements. In this study, N&B and sFCS analysis were applied to determine photophysical properties of novel green FPs under different conditions (i.e., excitation power and pH) in living cells. The results showed that the new FPs, mGreenLantern (mGL) and Gamillus, exhibited the highest molecular brightness at the cost of lower photostability. The well-established monomeric enhanced green fluorescent protein (mEGFP) remained the best option to investigate PPIs at lower pH, while mGL was best suited for neutral pH, and Gamillus for high pH. These findings provide guidance for selecting an appropriate FP to quantify PPIs via FFS under different environmental conditions. Next, several biophysical fluorescence microscopy approaches (i.e., sFCS, GP imaging, membrane charge FRET) were employed to monitor changes in lipid-lipid-packing in biomembranes in different biological context. Lipid metabolism in cancer cells is known to support rapid proliferation and metastasis. Therefore, targeting lipid synthesis or membrane integrity holds immense promise as an anticancer strategy. However, the mechanism of action of the novel agent erufosine (EPC3) on membrane stability is not fully under stood. The present work revealed that EPC3 reduces lipid packing and composition as well as increased membrane fluidity and dynamic, hence, modifies lipid-lipid-interaction. These effects on membrane integrity were likely triggered by modulations in lipid metabolism and membrane organization. In the case of influenza A virus (IAV) infection, regulation of lipid metabolism is crucial for multiple steps in IAV replication and is related to the pathogenicity of IAV. Here, it is shown for the first time that IAV infection triggers a local enrichment of negatively charged lipids at the inner leaflet of the PM, which decreases membrane fluidity and dynamic, as well as increases lipid packing at the assembly site in living cells. This suggests that IAV alters lipid-lipid interactions and organization at the PM. Overall, this work highlights the potential of biophysical techniques as a screening platform for studying membrane properties in living cells at the single-cell level. Finally, this study addressed remaining questions about the early stage of IAV assembly. The recruitment of matrix protein 1 (M1) and its interaction with other viral surface proteins, hemagglutinin (HA), neuraminidase (NA), and matrix protein 2 (M2), has been a subject of debate due to conflicting results. In this study, different FFS approaches were performed in transfected cells to investigate interactions between IAV proteins themselves and host factors at the PM. FFS measurements revealed that M2 interacts strongly with M1, leading to the translocation of M1 to the PM. This interaction likely took place along the non-canonical pathway, as evidenced by the detection of an interaction between M2 and the host factor LC3-II, leading to the recruitment of LC3-II to the PM. Moreover, weaker interaction was observed between HA and membrane-bound M1, and no interaction between NA and M1. Interestingly, higher oligomeric states of M1 were only detectable in infected cells. These results indicate that M2 initiates virion assembly by recruiting M1 to the PM, which may serve as a platform for further interactions with viral proteins and host factors. N2 - Biomoleküle wie Proteine und Lipide spielen eine wichtige Rolle bei zahlreichen Zellfunktionen, darunter Biomolekültransport, Proteinfunktionen, zelluläre Homöostase und Biomembranintegrität. Traditionelle biochemische Methoden liefern keine Informationen über die Verteilung und das Verhalten zellulärer Biomolekülen unter natürlichen Bedingungen, da sie nicht auf lebende Zellproben übertragbar sind. Folglich kann dies zu Ungenauigkeiten bei der Quantifizierung von Biomolekülinteraktionen führen und potenzielle Komplexitäten der Heterogenität nativer Biomembranen übersehen. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden minimalinvasive mikroskopische Techniken wie die Fluoreszenzfluktuationsspektroskopie (FFS) in Kombination mit Fluoreszenzproteinen (FPs) und Fluoreszenzlipidanaloga entwickelt. FFS-Techniken und Membraneigenschaftssensoren ermöglichen die Quantifizierung verschiedener Parameter, einschließlich Konzentration, Dynamik, Oligomerisierung und Wechselwirkung von Biomolekülen in lebenden Zellproben. In dieser Arbeit wurden mehrere FFS-Ansätze und Sensoren für Membraneigenschaften implementiert und eingesetzt, um biologische Prozesse in verschiedenen Zusammenhängen zu untersuchen. Die Mehrfarben-Scanning-Fluoreszenzfluktuationsspektroskopie (sFCS) wurde zur Untersuchung von Protein-Oligomerisierung, Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPIs) und Proteindynamik an der zellulären Plasmamembran (PM) eingesetzt. Zusätzlich wurde die Zweifarben-Analyse von Anzahl und Helligkeit (N&B) mit der Kreuzkorrelationsanalyse erweitert, um Hetero-Interaktionen von Proteinen in der PM mit sehr langsamer Dynamik zu quantifizieren, die mit sFCS aufgrund starker anfänglicher Bleiche der Fluorophore nicht zugänglich wären. Darüber hinaus wurden zwei halbautomatische Analysepipelines entwickelt: die spektrale Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET)-Analyse zur Untersuchung von Änderungen der Membranladung auf der Innenseite der PM und die spektrale generalisierte Polarisation (GP)-Bildgebung sowie die spektrale Phasor-Analyse zur Überwachung von Änderungen der Membranfluidität und -ordnung. Ein wichtiger Parameter zur Untersuchung von PPIs ist die molekulare Helligkeit, die die Oligomerisierung direkt bestimmt und aus FFS daten extrahiert werden kann. Allerdings weisen FPs häufig komplexe photophysikalische Übergänge auf, einschließlich nichtfluoreszierender Zustände. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, FPs hinsichtlich ihrer dunklen Zustände zu charakterisieren, um zuverlässige Oligomerisierungsmessungen sicherzustellen. In dieser Studie wurden N&B- und sFCS-Analysen angewendet, um die photophysikalischen Eigenschaften neuartiger grüner FPs unter verschiedenen Bedingungen (d. h. Anregungsleistung und pH-Wert) in lebenden Zellen zu bestimmen. Die Ergebnisse zeigten, dass die neuen FPs mGreenLantern (mGL) und Gamillus die höchste molekulare Helligkeit aufwiesen, allerdings auf Kosten einer geringeren Photostabilität. Das etablierte mEGFP blieb die beste Option, um PPIs bei niedrigerem pH-Wert zu untersuchen, während mGL am besten für neutralen pH-Wert und Gamillus für hohen pH-Wert geeignet war. Diese Ergebnisse bieten Orientierung für die Auswahl eines geeigneten FP zur Quantifizierung von PPIs über FFS unter verschiedenen Umgebungsbedingungen. Als nächstes wurden mehrere biophysikalische Fluoreszenzmikroskopie-Ansätze (z. B. sFCS, GP-Bildgebung, Membranladung-FRET) eingesetzt, um Veränderungen in der Lipid-Lipid-Packung in Biomembranen in verschiedenen biologischen Kontexten zu überwachen. Es ist bekannt, dass der Lipidstoffwechsel in Krebszellen die schnelle Vermehrung und Metastasierung fördert. Daher ist die gezielte Beeinflussung der Lipidsynthese oder der Membranintegrität eine vielversprechende Strategie zur Krebsbekämpfung. Der Wirkungsmechanismus des neuartigen Wirkstoffs Erufosin (EPC3) auf die Membranstabilität ist nicht vollständig geklärt. Die vorliegende Arbeit ergab, dass EPC3 die Lipidpackung und -zusammensetzung reduziert sowie die Fluidität und Dynamik der Membran erhöht und somit die Lipid-Lipid-Wechselwirkung verändert. Diese Auswirkungen auf die Membranintegrität wurden wahrscheinlich durch Modulationen des Lipidstoffwechsels und der Membranorganisation ausgelöst. Im Falle einer Infektion mit dem Influenza-A-Virus (IAV) ist die Regulierung des Lipidstoffwechsels für mehrere Schritte der IAV-Replikation von entscheidender Bedeutung und hängt mit der Pathogenität von IAV zusammen. Hier wird zum ersten Mal gezeigt, dass eine IAV-Infektion eine lokale Anreicherung negativ geladener Lipide an der Innenseite der PM auslöst, die Fluidität und Dynamik der Membran verringert und die Lipidpackung an der Assemblierungsstelle in lebenden Zellen erhöht. Dies legt nahe, dass IAV die Lipid-Lipid-Wechselwirkungen und die Organisation am PM verändert. Insgesamt unterstreicht diese Arbeit das Potenzial biophysikalischer Techniken als Screening-Plattform zur Untersuchung von Membraneigenschaften in lebenden Zellen auf Einzelzellebene. Abschließend ging diese Studie auf verbleibende Fragen zur frühen Phase der IAV-Assemblierung ein. Die Rekrutierung von Matrixprotein 1 (M1) und seine Wechselwirkung mit anderen viralen Oberflächenproteinen, Hämagglutinin (HA), Neuraminidase (NA) und Matrixprotein 2 (M2), war aufgrund widersprüchlicher Ergebnisse Gegenstand von Debatten. In dieser Studie wurden verschiedene FFS-Ansätze in transfizierten Zellen durchgeführt, um Wechselwirkungen zwischen IAV-Proteinen untereinander und Wirtsfaktoren an der PM zu untersuchen. FFS-Messungen ergaben, dass M2 stark mit M1 interagiert, was zur Translokation von M1 zur PM führt. Diese Interaktion fand wahrscheinlich entlang des nichtkanonischen Weges statt, was durch den Nachweis einer Interaktion zwischen M2 und dem Wirtsfaktor LC3-II belegt wurde, die zur Rekrutierung von LC3-II zur PM führte. Darüber hinaus wurde eine schwächere Wechselwirkung zwischen HA und membrangebundenem M1 beobachtet und keine Wechselwirkung zwischen NA und M1. Interessanterweise waren höhere oligomere Zustände von M1 nur in infizierten Zellen nachweisbar. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass M2 den Zusammenbau von Virionen initiiert, indem es M1 zur PM rekrutiert, welches als Plattform für weitere Interaktionen mit viralen Proteinen und Wirtsfaktoren dienen könnte. KW - influenza A virus KW - virus-host interaction KW - cancer KW - biomolecule interactions KW - membrane fluidity KW - fluorescence fluctuation spectroscopy KW - fluorescent proteins KW - biosensors KW - Biomolekülinteraktionen KW - Biosensoren KW - Krebs KW - Fluoreszenzfluktuationsspektroskopie KW - fluoreszierende Proteine KW - Influenza A Virus KW - Membranfluidität KW - Virus-Wirt-Interaktion Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-611800 ER - TY - THES A1 - Beissenhirtz, Moritz Karl T1 - Proteinmultischichten und Proteinmutanten für neuartige empfindliche Superoxidbiosensoren T1 - Protein Multilayers and Protein Mutants for novel sensitive Superoxide Biosensors N2 - Das Superoxidradikal kann mit fast allen Bestandteilen von Zellen reagieren und diese schädigen. Die medizinische Forschung stellte eine Beteiligung des Radikals an Krebs, Herzinfarkten und neuraler Degeneration fest. Ein empfindlicher Superoxidnachweis ist daher zum besseren Verständnis von Krankheitsverläufen wichtig. Dabei stellen die geringen typischen Konzentrationen und seine kurze Lebensdauer große Anforderungen. Ziel dieser Arbeit war es zum einen, zwei neuartige Proteinarchitekturen auf Metallelektroden zu entwickeln und deren elektrochemisches Ansprechverhalten zu charakterisieren. Zum anderen waren diese Elektroden zur empfindlichen quantitativen Superoxiddetektion einzusetzen. Im ersten Teil der Arbeit wurde eine Protein-Multischichtelektrode aus Cytochrom c und dem Polyelektrolyten Poly(anilinsulfonsäure) nach dem Layer-by-layer-Verfahren aufgebaut. Für zwei bis 15 Schichten an Protein wurde eine deutliche Zunahme an elektrodenaktivem Cytochrom c mit jedem zusätzlichen Aufbringungsschritt nachgewiesen. Die Zunahme verlief linear und ergab bei 15 Schichten eine Zunahme der redoxaktiven Proteinmenge um deutlich mehr als eine Größenordnung. Während das formale Potential im Multischichtsystem sich im Vergleich zur Monoschichtelektrode nicht veränderte, wurde für die Kinetik eine Abhängigkeit der Geschwindigkeit des Elektronentransfers von der Zahl der Proteinschichten beobachtet. Mit zunehmender Scangeschwindigkeit trat ein reversibler Kontaktverlust zu den äußeren Schichten auf. Die lineare Zunahme an elektroaktivem Protein mit steigender Zahl an Depositionsschritten unterscheidet sich deutlich von in der Literatur beschriebenen Protein/Polyelektrolyt-Multischichtelektroden, bei denen ab etwa 6-8 Schichten keine Zunahme an elektroaktivem Protein mehr festgestelltwurde. Auch ist bei diesen die Zunahme an kontaktierbaren Proteinmolekülen auf das Zwei- bis Fünffache limitiert. Diese Unterschiede des neu vorgestellten Systems zu bisherigen Multischichtassemblaten erklärt sich aus einem in dieser Arbeit für derartige Systeme erstmals beschriebenen Elektronentransfermechanismus. Der Transport von Elektronen zwischen der Elektrodenoberfläche und den Proteinmolekülen in den Schichten verläuft über einen Protein-Protein-Elektronenaustausch. Dieser Mechanismus beruht auf dem schnellen Selbstaustausch von Cytochrom c-Molekülen und einer verbleibenden Rotationsflexibilität des Proteins im Multischichtsystem. Die Reduzierung des Proteins durch das Superoxidradikal und eine anschließende Reoxidation durch die Elektrode konnten nachgewiesen werden. In einem amperometrischen Messansatz wurde das durch Superoxidradikale hervorgerufene elektrochemische Signal in Abhängigkeit von der Zahl an Proteinschichten gemessen. Ein maximales Ansprechverhalten auf das Radikal wurde mit 6-Schichtelektroden erzielt. Die Empfindlichkeit der 6-Schichtelektroden wurde im Vergleich zum Literaturwert der Monoschichtelektrode um Faktor 14, also mehr als eine Größenordnung, verbessert. Somit konnte eine Elektrode mit 6 Schichten aus Cytochrom c und Poly(anilinsulfonsäure) als neuartiger Superoxidsensor mit einer 14-fachen Verbesserung der Empfindlichkeit im Vergleich zum bislang benutzten System entwickelt werden. Der zweite Teil dieser Arbeit beschreibt die Auswahl, Gewinnung und Charakterisierung von Mutanten des Proteins Cu,Zn-Superoxiddismutase zur elektrochemischen Quantifizierung von Superoxidradikalen. Monomere Mutanten des humanen dimeren Enzyms wurden entworfen, die durch Austausch von Aminosäuren ein oder zwei zusätzliche Cysteinreste besaßen, mit welchem sie direkt auf der Goldelektrodenoberfläche chemisorbieren sollten. 6 derartige Mutanten konnten in ausreichender Menge und Reinheit in aktiver Form gewonnen werden. Die Bindung der Superoxiddismutase-Mutanten an Goldoberflächen konnte durch Oberflächen-plasmonresonanz und Impedanzspektroskopie nachgewiesen werden. Alle Mutanten wiesen einen quasi-reversiblen Elektronentransfer zwischen SOD und Elektrode auf. Durch Untersuchung von kupferfreien SOD-Mutanten sowie des Wildtyps konnte nachgewiesen werden, das die Mutanten über die eingefügten Cysteinreste auf der Elektrode chemisorptiv gebunden wurden und der Elektronentransfer zwischen der Elektrode und dem Kupfer im aktiven Zentrum der SOD erfolgte. Die Superoxiddismutase katalysiert die Zersetzung von Superoxidmolekülen durch Oxidation und durch Reduktion der Radikale. Somit sind beide Teilreaktionen von analytischem Interesse. Zyklovoltammetrisch konnte sowohl die Oxidation als auch die Reduktion des Radikals durch die immobilisierten Superoxiddismutase-Mutanten nachgewiesen werden. In amperometrischen Messanordnungen konnten beide Teilreaktionen zur analytischen Quantifizierung von Superoxidradikalen genutzt werden. Im positiven Potentialfenster wurde die Empfindlichkeit um einen Faktor von etwa 10 gegenüber der Cytochrom c–Monoschichtelektrode verbessert. N2 - The superoxide radical can react with almost all components of a cell and thus damage them. Enzymatic and non-enzymatic scavengers remove it from the body. An implication of the radical in cancer, heart disease, and neuronal degredation has been found in medical research. Therefore, a sensitive quantification of superoxide is necessary for a better understanding of diseases as well as for the study of biological degradation processes. The aim of this work was to develop two new protein architectures on metal electrodes and to characterize their electrochemical behavior. Secondly, both electrodes were to be applied as superoxide biosensors. In the first part of the work, a protein multilayer electrode consisting of cytochrome c and the polyelectrolyte poly(aniline sulfonated acid) was built up by the layer-by-layer procedure. SPR experiments proved the formation of multilayers. For 2 to 15 protein layers, a significant increase in electroactive protein was found with every deposition step in a linear fashion. For 15 layers, this increase was found to be more than one order of magnitude. While the formal potential did not change for the proteins in the layers, the rate of electron transfer was found to be dependent on the number of layers deposited. With increased scanning speed, a reversible loss of contact to the outer layers was noted. The linear increase in electroactive protein loading differed significantly from protein/polyelectrolyte electrodes described in the literature, where after 6-8 layers no further increase was found. Additionally, these systems increase the number of electroactive protein molecules only by a factor of 2 to 5. These differences can be explained by an electron transfer mechanism which was demonstrated in this work for the first time. The transport of electrons between the electrode surface and the proteins in the layers takes place by a protein-protein electron transfer. This mechanism relies on the fast self-exchange of cytochrome c and a residual rotational flexibility of the protein molecules inside the structure. The reduction of the protein by the radical and its subsequent reoxidation by the electrode could be shown. In the amperometric mode, the sensor signal was determined for 2 to 15 layer electrodes. A maximum signal was found for 6 layers, where the sensitivity was improved by a factor of 14, compared to monolayer sensors. The second part of this work describes the selection, production and characterization of mutants of the protein Cu,Zn-superoxide dismutase and their application as superoxide sensors. Monomeric mutants of the human dimeric enzyme were designed, which contained one ore two additional cysteines in order to chemisorb directly onto gold surfaces. 6 such mutants were gained in sufficient amount and purity. The binding to gold was characterized by surface plasmon resonance studies. All mutants showed quasi-reversible electrochemistry on gold electrodes. Experiments with copper-free mutants and the wildtype enzyme proved that the mutants bind to gold via the additional cysteines, while the electron transfer takes place between the electrode and the active site copper. Superoxide dismutases catalyze the removal of superoxide by both oxidation and reduction. Thus, both partial reactions are of analytical interest. In cyclic voltammetry, both oxidation and reduction of the radical could be proved. In amperometric experiments, both reactions were used for a quantification of superoxide concentrations. In the positive potential window, the sensitivity was found to be increased by about one order of magnitude, as compared to the cytochrome c monolayer electrode. ----------- Hinweis zum Copyright:Einige Abbildungen dieser Arbeit sind in Artikeln des Verfassers in den Zeitschriften Angewandte Chemie, Angewandte Chemie International Edition, Analytical Chemisty und Elektroanalysis erschienen. Ihre Darstellung im Rahmen dieser Arbeit erfolgt auch online mit ausdrücklicher Genehmigung der Verlage. KW - Biosensor KW - Superoxiddismutasen KW - Hyperoxide KW - Mutation KW - Cytochrom c KW - Polyelektrolyt KW - Biosensor KW - Cytochome c KW - Superoxide Dismutase KW - Mutations KW - Multilayers Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-5661 ER - TY - THES A1 - Pramanik, Shreya T1 - Protein reconstitution in giant vesicles N2 - Das Leben auf der Erde ist vielfältig und reicht von einzelligen Organismen bis hin zu mehrzelligen Lebewesen wie dem Menschen. Obwohl es Theorien darüber gibt, wie sich diese Organismen entwickelt haben könnten, verstehen wir nur wenig darüber, wie "Leben" aus Molekülen entstanden ist. Die synthetische Bottom-up-Biologie zielt darauf ab, minimale Zellen zu schaffen, indem sie verschiedene Module wie Kompartimentierung, Wachstum, Teilung und zelluläre Kommunikation kombiniert. Alle lebenden Zellen haben eine Membran, die sie von dem sie umgebenden wässrigen Medium trennt und sie schützt. Darüber hinaus haben alle eukaryotischen Zellen Organellen, die von intrazellulären Membranen umschlossen sind. Jede Zellmembran besteht hauptsächlich aus einer Lipiddoppelschicht mit Membranproteinen. Lipide sind amphiphile Moleküle, die molekulare Doppelschichten aus zwei Lipid-Monoschichten oder Blättchen bilden. Die hydrophoben Ketten der Lipide sind einander zugewandt, während ihre hydrophilen Kopfgruppen die Grenzflächen zur wässrigen Umgebung bilden. Riesenvesikel sind Modellmembransysteme, die Kompartimente mit einer Größe von mehreren Mikrometern bilden und von einer einzigen Lipiddoppelschicht umgeben sind. Die Größe der Riesenvesikel ist mit der Größe von Zellen vergleichbar und macht sie zu guten Membranmodellen, die mit einem Lichtmikroskop untersucht werden können. Allerdings fehlen den Riesenvesikelmembranen nach der ersten Präparation Membranproteine, die in weiteren Präparationsschritten in diese Membranen eingebaut werden müssen. Je nach Protein kann es entweder über Ankerlipide an eines der Membranblättchen gebunden oder über seine Transmembrandomänen in die Lipiddoppelschicht eingebaut werden. Diese Arbeit befasst sich mit der Herstellung von Riesenvesikeln und der Rekonstitution von Proteinen in diesen Vesikeln. Außerdem wird ein mikrofluidischer Chip entworfen, der in verschiedenen Experimenten verwendet werden kann. Die Ergebnisse dieser Arbeit werden anderen Forschern helfen, die Protokolle für die Herstellung von GUVs zu verstehen, Proteine in GUVs zu rekonstituieren und Experimente mit dem mikrofluidischen Chip durchzuführen. Auf diese Weise wird die vorliegende Arbeit für das langfristige Ziel von Nutzen sein, die verschiedenen Module der synthetischen Biologie zu kombinieren, um eine Minimalzelle zu schaffen. N2 - Life on Earth is diverse and ranges from unicellular organisms to multicellular creatures like humans. Although there are theories about how these organisms might have evolved, we understand little about how ‘life’ started from molecules. Bottom-up synthetic biology aims to create minimal cells by combining different modules, such as compartmentalization, growth, division, and cellular communication. All living cells have a membrane that separates them from the surrounding aqueous medium and helps to protect them. In addition, all eukaryotic cells have organelles that are enclosed by intracellular membranes. Each cellular membrane is primarily made of a lipid bilayer with membrane proteins. Lipids are amphiphilic molecules that assemble into molecular bilayers consisting of two leaflets. The hydrophobic chains of the lipids in the two leaflets face each other, and their hydrophilic headgroups face the aqueous surroundings. Giant unilamellar vesicles (GUVs) are model membrane systems that form large compartments with a size of many micrometers and enclosed by a single lipid bilayer. The size of GUVs is comparable to the size of cells, making them good membrane models which can be studied using an optical microscope. However, after the initial preparation, GUV membranes lack membrane proteins which have to be reconstituted into these membranes by subsequent preparation steps. Depending on the protein, it can be either attached via anchor lipids to one of the membrane leaflets or inserted into the lipid bilayer via its transmembrane domains. The first step is to prepare the GUVs and then expose them to an exterior solution with proteins. Various protocols have been developed for the initial preparation of GUVs. For the second step, the GUVs can be exposed to a bulk solution of protein or can be trapped in a microfluidic device and then supplied with the protein solution. To minimize the amount of solution and for more precise measurements, I have designed a microfluidic device that has a main channel, and several dead-end side channels that are perpendicular to the main channel. The GUVs are trapped in the dead-end channels. This design exchanges the solution around the GUVs via diffusion from the main channel, thus shielding the GUVs from the flow within the main channel. This device has a small volume of just 2.5 μL, can be used without a pump and can be combined with a confocal microscope, enabling uninterrupted imaging of the GUVs during the experiments. I used this device for most of the experiments on GUVs that are discussed in this thesis. In the first project of the thesis, a lipid mixture doped with an anchor lipid was used that can bind to a histidine chain (referred to as His-tag(ged) or 6H) via the metal cation Ni2+. This method is widely used for the biofunctionalization of GUVs by attaching proteins without a transmembrane domain. Fluorescently labeled His-tags which are bound to a membrane can be observed in a confocal microscope. Using the same lipid mixture, I prepared the GUVs with different protocols and investigated the membrane composition of the resulting GUVs by evaluating the amount of fluorescently labeled His-tagged molecules bound to their membranes. I used the microfluidic device described above to expose the outer leaflet of the vesicle to a constant concentration of the His-tagged molecules. Two fluorescent molecules with a His-tag were studied and compared: green fluorescent protein (6H-GFP) and fluorescein isothiocyanate (6H-FITC). Although the quantum yield in solution is similar for both molecules, the brightness of the membrane-bound 6H-GFP is higher than the brightness of the membrane-bound 6H-FITC. The observed difference in the brightness reveals that the fluorescence of the 6H-FITC is quenched by the anchor lipid via the Ni2+ ion. Furthermore, my measurements also showed that the fluorescence intensity of the membranebound His-tagged molecules depends on microenvironmental factors such as pH. For both 6H-GFP and 6H-FITC, the interaction with the membrane is quantified by evaluating the equilibrium dissociation constant. The membrane fluorescence is measured as a function of the fluorophores’ molar concentration. Theoretical analysis of these data leads to the equilibrium dissociation constants of (37.5 ± 7.5) nM for 6H-GFP and (18.5 ± 3.7) nM for 6H-FITC. The anchor lipid mentioned previously used the metal cation Ni2+ to mediate the bond between the anchor lipid and the His-tag. The Ni2+ ion can be replaced by other transition metal ions. Studies have shown that Co3+ forms the strongest bonds with the His-tags attached to proteins. In these studies, strong oxidizing agents were used to oxidize the Co2+ mediated complex with the His-tagged protein to a Co3+ mediated complex. This procedure puts the proteins at risk of being oxidized as well. In this thesis, the vesicles were first prepared with anchor lipids without any metal cation. The Co3+ was added to these anchor lipids and finally the His-tagged protein was added to the GUVs to form the Co3+ mediated bond. This system was also established using the microfluidic device. The different preparation procedures of GUVs usually lead to vesicles with a spherical morphology. On the other hand, many cell organelles have a more complex architecture with a non spherical topology. One fascinating example is provided by the endoplasmic reticulum (ER) which is made of a continuous membrane and extends throughout the cell in the form of tubes and sheets. The tubes are connected by three-way junctions and form a tubular network of irregular polygons. The formation and maintenance of these reticular networks requires membrane proteins that hydrolyize guanosine triphosphate (GTP). One of these membrane proteins is atlastin. In this thesis, I reconstituted the atlastin protein in GUV membranes using detergent-assisted reconstitution protocols to insert the proteins directly into lipid bilayers. This thesis focuses on protein reconstitution by binding His-tagged proteins to anchor lipids and by detergent-assisted insertion of proteins with transmembrane domains. It also provides the design of a microfluidic device that can be used in various experiments, one example is the evaluation of the equilibrium dissociation constant for membrane-protein interactions. The results of this thesis will help other researchers to understand the protocols for preparing GUVs, to reconstitute proteins in GUVs, and to perform experiments using the microfluidic device. This knowledge should be beneficial for the long-term goal of combining the different modules of synthetic biology to make a minimal cell. KW - protein reconstitution KW - giant vesicles KW - microfluidics KW - synthetic biology KW - Riesenvesikel KW - Mikrofluidik KW - Proteinrekonstitution KW - synthetische Biologie Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-612781 ER - TY - THES A1 - Spinti, Daniela T1 - Proteasomal protein turnover during defense priming in Arabidopsis T1 - Proteasomaler Proteinabbau während der erworbenen Immunantwort in Arabidopsis N2 - The ubiquitin-proteasome-system (UPS) is a cellular cascade involving three enzymatic steps for protein ubiquitination to target them to the 26S proteasome for proteolytic degradation. Several components of the UPS have been shown to be central for regulation of defense responses during infections with phytopathogenic bacteria. Upon recognition of the pathogen, local defense is induced which also primes the plant to acquire systemic resistance (SAR) for enhanced immune responses upon challenging infections. Here, ubiquitinated proteins were shown to accumulate locally and systemically during infections with Psm and after treatment with the SAR-inducing metabolites salicylic acid (SA) and pipecolic acid (Pip). The role of the 26S proteasome in local defense has been described in several studies, but the potential role during SAR remains elusive and was therefore investigated in this project by characterizing the Arabidopsis proteasome mutants rpt2a-2 and rpn12a-1 during priming and infections with Pseudomonas. Bacterial replication assays reveal decreased basal and systemic immunity in both mutants which was verified on molecular level showing impaired activation of defense- and SAR-genes. rpt2a-2 and rpn12a-1 accumulate wild type like levels of camalexin but less SA. Endogenous SA treatment restores local PR gene expression but does not rescue the SAR-phenotype. An RNAseq experiment of Col-0 and rpt2a-2 reveal weak or absent induction of defense genes in the proteasome mutant during priming. Thus, a functional 26S proteasome was found to be required for induction of SAR while compensatory mechanisms can still be initiated. E3-ubiquitin ligases conduct the last step of substrate ubiquitination and thereby convey specificity to proteasomal protein turnover. Using RNAseq, 11 E3-ligases were found to be differentially expressed during priming in Col-0 of which plant U-box 54 (PUB54) and ariadne 12 (ARI12) were further investigated to gain deeper understanding of their potential role during priming. PUB54 was shown to be expressed during priming and /or triggering with virulent Pseudomonas. pub54 I and pub54-II mutants display local and systemic defense comparable to Col-0. The heavy-metal associated protein 35 (HMP35) was identified as potential substrate of PUB54 in yeast which was verified in vitro and in vivo. PUB54 was shown to be an active E3-ligase exhibiting auto-ubiquitination activity and performing ubiquitination of HMP35. Proteasomal turnover of HMP35 was observed indicating that PUB54 targets HMP35 for ubiquitination and subsequent proteasomal degradation. Furthermore, hmp35-I benefits from increased resistance in bacterial replication assays. Thus, HMP35 is potentially a negative regulator of defense which is targeted and ubiquitinated by PUB54 to regulate downstream defense signaling. ARI12 is transcriptionally activated during priming or triggering and hyperinduced during priming and triggering. Gene expression is not inducible by the defense related hormone salicylic acid (SA) and is dampened in npr1 and fmo1 mutants consequently depending on functional SA- and Pip-pathways, respectively. ARI12 accumulates systemically after priming with SA, Pip or Pseudomonas. ari12 mutants are not altered in resistance but stable overexpression leads to increased resistance in local and systemic tissue. During priming and triggering, unbalanced ARI12 levels (i.e. knock out or overexpression) leads to enhanced FMO1 activation indicating a role of ARI12 in Pip-mediated SAR. ARI12 was shown to be an active E3-ligase with auto-ubiquitination activity likely required for activation with an identified ubiquitination site at K474. Mass spectrometrically identified potential substrates were not verified by additional experiments yet but suggest involvement of ARI12 in regulation of ROS in turn regulating Pip-dependent SAR pathways. Thus, data from this project provide strong indications about the involvement of the 26S proteasome in SAR and identified a central role of the two so far barely described E3-ubiquitin ligases PUB54 and ARI12 as novel components of plant defense. N2 - Das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) ist ein in drei Schritten enzymatisch ablaufender Prozess zur Ubiquitinierung von Proteinen, wodurch diese zum proteolytischen Abbau an das 26S Proteasom geschickt werden. Verschiedene Komponenten des UPS sind zentral an der Regulation von Immunantworten während der Infektion mit phytopathogenen Bakterien beteiligt. Beim Erkennen einer Infektion werden lokale Abwehrreaktionen initiiert, wobei auch mobile Signale in distalen Pflanzenteilen verteilt werden, welche die Pflanze primen (vorbereiten). Mit dem Erwerb der systemischen Resistenz (SAR) kann die Immunantwort bei einer zweiten Infektion verstärkt aktiviert werden. Es wurde hier gezeigt, dass ubiquitinierte Proteine in lokalem und systemischem Gewebe akkumulieren, wenn Arabidopsis mit Pseudomonas infiziert oder mit SAR-induzierender Salizylsäure (SA) oder Pipecolinsäure (Pip) behandelt wird. Die genaue Rolle des 26S Proteasoms in der systemischen Immunantwort ist bisher unklar und wurde daher in diesem Projekt mithilfe der Charakterisierung der Proteasommutanten rpt2a-2 und rpn12a-1 während des Primings genauer untersucht. In Bakterienwachstumsversuchen zeigte sich eine lokal und systemisch erhöhte Suszeptibilität der Proteasommutanten, welche auf molekularer Ebene durch ausbleibende Aktivierung von Abwehrgenen verifiziert wurde. Beide Mutanten akkumulieren ähnliche Mengen Camalexin während einer Infektion, sind aber in der Biosynthese von SA gestört. Die endogene Applikation von SA löst lokale PR-Gen Expression aus, kann aber nicht das SAR-Defizit ausgleichen. In einem RNAseq Experiment wurde das Transkriptom von Col-0 und rpt2a-2 während des Primings analysiert und zeigte, dass zentrale Abwehr- und SAR-Gene nicht oder nur schwach induziert werden. Es konnte somit gezeigt werden, dass ein funktionales 26S Proteasom zur vollen Induktion aller Teile der lokalen und systemischen Immunantwort benötigt wird, während ausgleichende Prozesse weiterhin aktiviert werden können. E3-Ubiquitin Ligasen führen den letzten Schritt der Substratubiquitinierung durch und vermitteln dadurch die Spezifität des proteasomalen Proteinabbaus. Mithilfe des RNAseq Experiments konnten 11 differentiell exprimierte Transkripte, annotiert als E3-Ligasen, identifiziert werden. Von diesen wurden PLANT U-BOX 54 (PUB54) und ARIADNE 12 (ARI12) weiter analysiert, um ein tiefergehendes Verständnis ihres Einflusses auf die systemische Immunantwort zu erhalten. PUB54 wird während des Primings und bei Infektionen mit virulenten Pseudomonas exprimiert. Die pub54 I und pub54-II Mutanten zeigen lokal und systemisch eine wildtyp-ähnliche Resistenz. Das „heavy-metal associated protein 35” (HMP35) wurde in Hefe als potentielles Substrat von PUB54 identifiziert und in vitro und in vivo verifiziert. PUB54 ist eine aktive E3-Ligase mit Autoubiquitinierungsaktivität, welche HMP35 ubiquitiniert. HMP35 wird außerdem in planta proteasomal abgebaut, wodurch eine Ubiquitinierung von HMP35 durch PUB54 zum proteasomalen Abbau nahegelegt wird. Des Weiteren wurde gezeigt, dass hmp35 Mutanten von erhöhter Resistenz profitieren. HMP35 agiert möglicherweise als negativer Regulator der Immunantwort und wird zur Aktivierung von Abwehrreaktionen durch PUB54 für den proteasomalen Abbau markiert. ARI12 wird nach Priming oder Infektion mit Pseudomonas transkriptionell aktiviert und nach sekundärer Infektion hyperinduziert, wobei die Behandlung mit SA keine Expression induziert. ARI12 ist jedoch reduziert in npr1 und fmo1 Mutanten, wodurch eine Abhängigkeit der Genexpression von funktionalen SA- und Pip-Signalwegen angedeutet wird. ARI12 akkumuliert in systemischem Gewebe nach lokaler Behandlung mit SA, Pip, oder Pseudomonas. Die ari12 Mutante zeigt wildtypähnliche Resistenz gegenüber bakteriellen Infektionen, wohingegen die Überexpression zu einer verstärkten Resistenz in lokalem und systemischem Gewebe führt. Unausgewogene Level von ARI12 (d.h. knockout oder Überexpression) führen zur erhöhten Expression von FMO1, sodass ARI12 potentiell eine regulatorische Rolle in der Pip-vermittelten systemischen Immunantwort übernimmt. Es konnte gezeigt werden, dass ARI12 eine aktive E3-Ligase mit Autoubiquitinierungsaktivität an Lys474 ist, welche vermutlich für die Aktivierung benötigt wird. Massenspektrometrisch identifizierte, mögliche Substrate von ARI12 konnten noch nicht experimentell bestätigt werden, deuten aber auf eine Rolle von ARI12 in der Regulation von reaktiven Oxygen Spezies (ROS) hin, welche wiederum Pip-anhängige Signalwege regulieren. Zusammengenommen deuten die Daten aus diesem Projekt darauf hin, dass das 26S Proteasom durch den regulierten Proteinabbau zentral ist für die systemische erworbene Resistenz und dass die bisher wenig untersuchten E3-Ligasen PUB54 und ARI12 neue regulatorische Komponenten der pflanzlichen Immunabwehr darstellen. KW - defense priming KW - Arabidopsis KW - Ubiquitin-proteasome-system KW - E3-ubiquitin ligases KW - Arabidopsis KW - E3-Ubiquitin Ligasen KW - Ubiquitin-Proteasom-System KW - erworbene Immunantwort Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-505909 ER - TY - THES A1 - Tirok, Katrin T1 - Predator-prey dynamics under the influence of exogenous and endogenous regulation : a data-based modeling study on spring plankton with respect to climate change T1 - Räuber-Beute Beziehungen unter dem Einfluss exogener und endogener Regulation : eine datenbasierte Modellstudie zur Planktonentwicklung im Frühjahr mit Bezug auf den Klimawandel N2 - Understanding the interactions of predators and their prey and their responses to environmental changes is one of the striking features of ecological research. In this thesis, spring dynamics of phytoplankton and its consumers, zooplankton, were considered in dependence on the environmental conditions in a deep lake (Lake Constance) and a shallow marine water (mesocosms from Kiel Bight), using descriptive statistics, multiple regression models, and process-oriented dynamic simulation models. The development of the spring phytoplankton bloom, representing a dominant feature in the plankton dynamics in temperate and cold oceans and lakes, may depend on temperature, light, and mixing intensity, and the success of over-wintering phyto- and zooplankton. These factors are often correlated in the field. Unexpectedly, irradiance often dominated algal net growth rather than vertical mixing even in deep Lake Constance. Algal net losses from the euphotic layer to larger depth were induced by vertical mixing, but were compensated by the input from larger depth when algae were uniformly distributed over the water column. Dynamics of small, fast-growing algae were well predicted by abiotic variables, such as surface irradiance, vertical mixing intensity, and temperature. A simulation model additionally revealed that even in late winter, grazing may represent an important loss factor of phytoplankton during calm periods when losses due to mixing are small. The importance of losses by mixing and grazing changed rapidly as it depended on the variable mixing intensity. Higher temperature, lower global irradiance and enhanced mixing generated lower algal biomass and primary production in the dynamic simulation model. This suggests that potential consequences of climate change may partly counteract each other. The negative effect of higher temperatures on phytoplankton biomass was due to enhanced temperature-sensitive grazing losses. Comparing the results from deep Lake Constance to those of the shallow mesocosm experiments and simulations, confirmed the strong direct effect of light in contrast to temperature, and the importance of grazing already in early spring as soon as moderate algal biomasses developed. In Lake Constance, ciliates dominated the herbivorous zooplankton in spring. The start of ciliate net growth in spring was closely linked to that of edible algae, chlorophyll a and the vertical mixing intensity but independent of water temperature. The duration of ciliate dominance in spring was largely controlled by the highly variable onset of the phytoplankton bloom, and little by the less variable termination of the ciliate bloom by grazing of meta-zooplankton. During years with an extended spring bloom of algae and ciliates, they coexisted at relatively high biomasses over 15-30 generations, and internally forced species shifts were observed in both communities. Interception feeders alternated with filter feeders, and cryptomonads with non-cryptomonads in their relative importance. These dynamics were not captured by classical 1-predator-1-prey models which consistently predict pronounced predator-prey cycles or equilibria with either the predator or the prey dominating or suppressed. A multi-species predator-prey model with predator species differing in their food selectivity, and prey species in their edibility reproduced the observed patterns. Food-selectivity and edibility were related to the feeding and growth characteristics of the species, which represented ecological trade-offs. For example, the prey species with the highest edibility also had the highest maximum growth rate. Data and model revealed endogenous driven ongoing species alternations, which yielded a higher variability in species-specific biomasses than in total predator and prey biomass. This holds for a broad parameter space as long as the species differ functionally. A more sophisticated model approach enabled the simulation of a continuum of different functional types and adaptability of predator and prey communities to altered environmental conditions, and the maintenance of a rather low model complexity, i.e., low number of equations and free parameters. The community compositions were described by mean functional traits --- prey edibility and predator food-selectivity --- and their variances. The latter represent the functional diversity of the communities and thus, the potential for adaptation. Oscillations in the mean community trait values indicated species shifts. The community traits were related to growth and grazing characteristics representing similar trade-offs as in the multi-species model. The model reproduced the observed patterns, when nonlinear relationships between edibility and capacity, and edibility and food availability for the predator were chosen. A constant minimum amount of variance represented ongoing species invasions and thus, preserved a diversity which allows adaptation on a realistic time-span. N2 - Eine der großen Herausforderungen der heutigen ökologischen Forschung ist es, Veränderungen von Ökosys­temen vorher­zusagen, die mit dem Klimawandel einhergehen. Dafür sind ein umfassendes Verständnis der ver­schiedenen Steuerungsfaktoren des entsprechenden Systems und Kenntnisse zur Anpassungs­fähigkeit des Systems nötig. Auf der Grundlage dieses Wissens, können mit mathemati­schen Modellen Klima­szenarien gerechnet und Vorhersagen erstellt werden. Die vorliegende Arbeit untersuchte die Regulation des Phytoplanktons (kleine freischwebende einzellige Algen) und seiner Konsumenten (Zooplankton, tierische Kleinstlebewesen) sowie deren Wechselspiel während des Frühjahrs mit Bezug auf den Klimawandel. Als Basis dienten langjährige Daten von einem großen tiefen See (Bodensee) sowie Daten von Versuchen mit Organis­men aus einem flachen marinen Ge­wässer (Kieler Förde, Ostsee). Diese Daten wurden mit statistischen Verfahren und mathematischen Modellen ausge­wertet. In Gewässern sind Algen als Primärproduzenten die Nahrungsgrundlage für tieri­sche Organismen bis hin zu Fischen und Meeresfrüchten, und bestimmen die Wasserqualität der Ge­wässer. Daher ist es wichtig zu verstehen, welche Mechanismen die Dynamik der Algen steuern. Der Grundstein für die saisonale Entwicklung von Phyto- und Zooplankton in Gewässern un­serer Breiten wird mit dem Be­ginn des Wachstums im Frühjahr gelegt. Diese Arbeit zeigt, dass es bereits im zeitigen, noch kalten Frühjahr ein Wechselspiel physikalischer und biologischer Steuerungsmechanismen für die Algenent­wicklung gibt. Physikalische Faktoren sind die Wassertemperatur, die Globalstrahlung und die Durchmischung des Gewässers, die durch die Stärke des Windes beeinflusst wird. All diese Steue­rungsmechanismen sind eng miteinander verwoben und werden unterschiedlich stark vom Klimawan­del beeinflusst. Mit mathematischen Modellen gelang es den Einfluss einzelner Faktoren voneinander zu trennen und zu zeigen, dass Effekte durch den Klimawandel sich gegenseitig aufheben oder aber auch verstärken können. Schon geringe Änderungen an der Basis der Nahrungsnetze können weitrei­chende Auswirkungen auf höhere Ebenen habe. Wie stark diese Auswirkungen im Einzelnen sind, hängt entscheidend von der Anpassungsfähigkeit gesamter Ökosysteme und ihrer Artengemeinschaf­ten sowie einzelner Individuen ab. Beispielsweise reagiert die Algengemeinschaft auf einen starken Fraßdruck ihrer Räuber mit einer Verschiebung zu weniger gut fressbaren Algenarten. Diese weniger gut fressbaren Arten unterscheiden sich jedoch auch in anderen Eigenschaften, wie zum Beispiel der Ressourcenausnutzung, von besser fressbaren Algen. In dieser Arbeit wurden Modellansätze entwi­ckelt, die diese Fähigkeit zur Anpassung berücksichtigen. Auf dieser Grundlage und mit Einbeziehung der physikalischen Steuerungsfaktoren können Klimaszenarien gerechnet werden und Vorhersagen für den Einfluss des Klimawandels auf unsere Gewässer gemacht werden, die letztlich auch Perspektiven für Handlungsmöglichkeiten aufzeigen. KW - Ökologie KW - mathematische Simulationsmodelle KW - Plankton KW - Tiefer See KW - Räuber-Beute Beziehungen KW - ecology KW - mathematical simulation models KW - plankton KW - deep lake KW - predator-prey relationships Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-24528 ER - TY - THES A1 - Flores Castellanos, Junio T1 - Potato tuber (Solanum tuberosum L. cv Desiree) — characterization of starch interacting proteins and maltodextrin metabolism T1 - Kartoffelknolle (Solanum tuberosum L. cv Desiree) - Charakterisierung von Stärke-interagierenden Proteinen und Maltodextrin-Stoffwechsel N2 - Starch is a biopolymer for which, despite its simple composition, understanding the precise mechanism behind its formation and regulation has been challenging. Several approaches and bioanalytical tools can be used to expand the knowledge on the different parts involved in the starch metabolism. In this sense, a comprehensive analysis targeting two of the main groups of molecules involved in this process: proteins, as effectors/regulators of the starch metabolism, and maltodextrins as starch components and degradation products, was conducted in this research work using potato plants (Solanum tuberosum L. cv. Desiree) as model of study. On one side, proteins physically interacting to potato starch were isolated and analyzed through mass spectrometry and western blot for their identification. Alternatively, starch interacting proteins were explored in potato tubers from transgenic plants having antisense inhibition of starch-related enzymes and on tubers stored under variable environmental conditions. Most of the proteins recovered from the starch granules corresponded to previously described proteins having a specific role in the starch metabolic pathway. Another set of proteins could be grouped as protease inhibitors, which were found weakly interacting to starch. Variations in the protein profile obtained after electrophoresis separation became clear when tubers were stored under different temperatures, indicating a differential expression of proteins in response to changing environmental conditions. On the other side, since maltodextrin metabolism is thought to be involved in both starch initiation and degradation, soluble maltooligosaccharide content in potato tubers was analyzed in this work under diverse experimental variables. For this, tuber disc samples from wild type and transgenic lines strongly repressing either the plastidial or cytosolic form of the -glucan phosphorylase and phosphoglucomutase were incubated with glucose, glucose-6-phosphate, and glucose-1-phosphate solutions to evaluate the influence of such enzymes on the conversion of the carbon sources into soluble maltodextrins, in comparison to wild-type samples. Relative maltodextrin amounts analyzed through capillary electrophoresis equipped with laser-induced fluorescence (CE-LIF) revealed that tuber discs could immediately uptake glucose-1-phosphate and use it to produce maltooligosaccharides with a degree of polymerization of up to 30 (DP30), in contrast to transgenic tubers with strong repression of the plastidial glucan phosphorylase. The results obtained from the maltodextrin analysis support previous indications that a specific transporter for glucose-1-phosphate may exist in both the plant cells and the plastidial membranes, thereby allowing a glucose-6-phosphate independent transport. Furthermore, it confirms that the plastidial glucan phosphorylase is responsible for producing longer maltooligosaccharides in the plastids by catalyzing a glucan polymerization reaction when glucose-1-phosphate is available. All these findings contribute to a better understanding of the role of the plastidial glucan phosphorylase as a key enzyme directly involved in the synthesis and degradation of glucans and their implication on starch metabolism. N2 - Stärke ist ein Biopolymer, bei dem es trotz seiner einfachen Zusammensetzung schwierig ist, den genauen Mechanismus seiner Bildung und Regulierung zu verstehen. Verschiedene Ansätze und bioanalytische Instrumente können genutzt werden, um das Wissen über die verschiedenen am Stärkemetabolismus beteiligten Komponenten zu erweitern. In diesem Sinne wurde in dieser Forschungsarbeit eine umfassende Analyse durchgeführt, die auf zwei der wichtigsten Molekülgruppen abzielt, die an diesem Prozess beteiligt sind: Proteine als Effektoren/Regulatoren des Stärkestoffwechsels und Maltodextrine als Stärkebestandteile und Abbauprodukte, wobei Kartoffelpflanzen (Solanum tuberosum L. cv. Desiree) als Untersuchungsmodell dienten. Einerseits wurden Proteine, die physisch mit Kartoffelstärke interagieren, isoliert und mittels Massenspektrometrie und Western Blot analysiert, um sie zu identifizieren. Andererseits wurden die mit Stärke interagierenden Proteine in Kartoffelknollen von transgenen Pflanzen mit Antisense-Hemmung von stärkeverwandten Enzymen und in Knollen, die unter variablen Umweltbedingungen gelagert wurden, untersucht. Die meisten der aus den Stärkekörnchen gewonnenen Proteine entsprachen zuvor beschriebenen Proteinen, die eine spezifische Rolle im Stärkestoffwechselweg spielen. Eine andere Gruppe von Proteinen konnte als Proteaseinhibitoren gruppiert werden, die nur schwach mit der Stärke interagieren. Variationen im Proteinprofil nach der Elektrophorese-Trennung wurden deutlich, wenn die Knollen bei unterschiedlichen Temperaturen gelagert wurden, was auf eine unterschiedliche Expression von Proteinen als Reaktion auf wechselnde Umweltbedingungen hindeutet. Da man davon ausgeht, dass der Maltodextrin-Stoffwechsel sowohl an der Entstehung als auch am Abbau von Stärke beteiligt ist, wurde in dieser Arbeit der Gehalt an löslichen Maltooligosacchariden in Kartoffelknollen unter verschiedenen experimentellen Variablen analysiert. Zu diesem Zweck wurden Knollenscheibenproben von Wildtypen und transgenen Linien, die entweder die plastidiale oder die cytosolische Form der α-Glucanphosphorylase und Phosphoglucomutase stark unterdrücken, mit Glucose-, Glucose-6-Phosphat- und Glucose-1-Phosphat-Lösungen inkubiert, um den Einfluss dieser Enzyme auf die Umwandlung der Kohlenstoffquellen in lösliche Maltodextrine im Vergleich zu Wildtyp-Proben zu bewerten. Relative Maltodextrinmengen, die durch Kapillarelektrophorese mit laserinduzierter Fluoreszenz (CE-LIF) analysiert wurden, zeigten, dass die Knollenscheiben Glukose-1-Phosphat sofort aufnehmen und zur Herstellung von Maltooligosacchariden mit einem Polymerisationsgrad von bis zu 30 (DP30) verwenden konnten, im Gegensatz zu transgenen Knollen mit starker Unterdrückung der plastidialen Glukanphosphorylase. Die Ergebnisse der Maltodextrin-Analyse stützen frühere Hinweise darauf, dass ein spezifischer Transporter für Glucose-1-Phosphat sowohl in den Pflanzenzellen als auch in den plastidialen Membranen vorhanden sein könnte, was einen von Glucose-6-Phosphat unabhängigen Transport ermöglicht. Außerdem wird bestätigt, dass die plastidiale Glucanphosphorylase für die Herstellung längerer Maltooligosaccharide in den Plastiden verantwortlich ist, indem sie eine Glucanpolymerisationsreaktion katalysiert, wenn Glucose-1-Phosphat verfügbar ist. All diese Erkenntnisse tragen zu einem besseren Verständnis der Rolle der plastidialen Glucanphosphorylase als Schlüsselenzym bei, das direkt an der Synthese und dem Abbau von Glucanen und deren Auswirkungen auf den Stärkemetabolismus beteiligt ist. KW - Solanum tuberosum KW - potato KW - maltodextrin KW - starch KW - Stärke KW - Solanum tuberosum KW - Maltodextrin KW - Kartoffel Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-615055 ER - TY - THES A1 - Sin, Celine T1 - Post-transcriptional control of gene expression T1 - Post-Transkription Steuerung der Genexpression N2 - Gene expression describes the process of making functional gene products (e.g. proteins or special RNAs) from instructions encoded in the genetic information (e.g. DNA). This process is heavily regulated, allowing cells to produce the appropriate gene products necessary for cell survival, adapting production as necessary for different cell environments. Gene expression is subject to regulation at several levels, including transcription, mRNA degradation, translation and protein degradation. When intact, this system maintains cell homeostasis, keeping the cell alive and adaptable to different environments. Malfunction in the system can result in disease states and cell death. In this dissertation, we explore several aspects of gene expression control by analyzing data from biological experiments. Most of the work following uses a common mathematical model framework based on Markov chain models to test hypotheses, predict system dynamics or elucidate network topology. Our work lies in the intersection between mathematics and biology and showcases the power of statistical data analysis and math modeling for validation and discovery of biological phenomena. N2 - Das „zentrale Dogma der Molekularbiologie“ besagt, dass der Fluss genetischer Information mit der DNS startet, die dann auf die RNS kopiert und in Proteine übersetzt wird (Crick 1970). Dieses System der Informationsübertragung bietet zwei natürliche Eingriffspunkte, an denen Genausprägungen manipuliert werden können -- entweder auf dem Level der mRNS (z.B. durch Kontrolle der Transkriptions- oder mRNS- Degradationsprozesse) oder auf dem Level des Proteins (z.B. durch Kontrolle der Translations- oder Proteindegradationsprozesse). An jedem Eingriffspunkt sind eine Vielzahl unterschiedlicher Prozesse zeitgleich aktiv, um die Konzentrationen von mRNS und Proteinen präzise einzustellen. All diese Prozesse tragen dazu bei, die Zelle intern im stationäzen Zustand zu halten, denn eine Fehlfunktion im System kann zu Krankheitszuständen oder zum Zelltot führen. In dieser Arbeit untersuchen wir verschiedene Aspekte der Kontrolle der Genausprägungs, indem wir Daten biologischer Experimente analysieren. Unsere Arbeit liegt hierbei zwischen den Bereichen der mathematischer Modellierung und der Biologie und zeigt den immensen Nutzen von statistischen Analysemethoden und mathematischer Modellbildung zur Validierung und Neuentdeckung biologischer Phänomene auf. KW - mRNA degradation KW - protein degradation KW - gene expression control KW - mathematical modeling KW - stochastic modeling KW - data analysis and statistics KW - next generation sequencing (NGS) KW - ribosome KW - Datenanalyse und Statistik KW - Regulierung der Genexpression KW - mRNA Degradierung KW - mathematisches Modellierung KW - Proteindegradierung KW - Ribosom KW - stochastische Modellierung Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-102469 ER - TY - THES A1 - Leicht, Katja T1 - Positionelle Klonierung von Tbc1d1 als Kandidatengen für Adipositas T1 - Positional cloning of Tbc1d1 as candidate gene for obesity N2 - Nob1 (New Zealand obese 1) bezeichnet einen Adipositas-QTL auf Chr. 5 der Maus (LODBMI >3,3), der in einem Rückkreuzungsexperiment der Mausstämme NZO (adipös) und SJL (schlank) identifiziert wurde. Um Kandidatengene für Adipositas zu finden, wurden mehr als 300 Nob1-Transkripte mit Hilfe von Genexpressionsanalysen auf Unterschiede in stoffwechselrelevanten Geweben zwischen beiden Mausstämmen untersucht. Sieben Gene zeigten eine differentielle Expression: 2310045A20Rik, Tbc1d1, Ppp1cb, Mll5, Insig1, Abhd1 und Alox5ap. Die codierenden Bereiche dieser Gene wurden anschließend auf Sequenzunterschiede zwischen NZO und SJL untersucht. Nur im Gen Tbc1d1, das im Peak-Bereich des Nob1 lokalisiert ist, wurde eine SJL-spezifische Deletion von sieben Basen detektiert, die zu einer Leserasterverschiebung und einem vorzeitigen Abbruch des Proteins in der funktionellen Rab-GAP-Domäne führt (Loss-of-Function-Mutation). Interessanterweise wurde eine Variante von TBC1D1 (R125W) in Kopplungsanalysen mit Adipositas beim Menschen assoziiert (Stone et al., 2006). TBC1D1 zeigt eine hohe Homologie zu TBC1D4 (AS160), das im Insulinsignalweg eine wichtige Rolle spielt. In 17 weiteren Genen im Peak-Bereich des Nob1 wurde keine weitere SJL-spezifischen Mutation detektiert. Bei NZO-Tieren erfolgte die Tbc1d1-mRNA-Expression vorwiegend in glycolytischen Fasern des Skelettmuskels. Zudem wurden zwei gewebsspezifisch exprimierte Tbc1d1-Isoformen identifiziert, die sich durch alternatives Splicen der Exone 12 und 13 unterscheiden. Die im Rahmen dieser Arbeit gefundenen Ergebnisse machen Tbc1d1 zu einem plausiblen Kandidatengen für den Nob1-QTL. Welche Funktion Tbc1d1 im Glucose- und Fettstoffwechsel des Skelettmuskels hat, muss in weiteren Analysen untersucht werden. N2 - Nob1 (New Zealand obese 1) has been identified as an obesity QTL on chromosome 5 (LODBMI >3,3) in a backcross experiment of obese NZO and lean SJL mice. To identify candidate genes for obesity expression profiling experiments with RNA from metabolic tissues were performed with more than 300 Nob1-genes. Seven genes showed differences in mRNA expression levels between both strains: 2310045A20Rik, Tbc1d1, Ppp1cb, Mll5, Insig1, Abhd1, and Alox5ap. Sequencing of the coding regions of these genes revealed a SJL-specific deletion of seven basepairs in the Tbc1d1 gene that is located in the peak region of Nob1. This mutation leads to a frameshift resulting in a truncated protein that lacks the important Rab-GAP-domain (Loss-of-Function-mutation). Interestingly, linkage analysis of the R125W-variant of TBC1D1 has been recently associated with human obesity. TBC1D1 shows high homology to TBC1D4 (AS160) that plays an important role in the insulin signaling pathway. No other SJL-specific mutations were detected in 17 further genes in the Nob1 peak region. In NZO mice Tbc1d1 mRNA is predominantly expressed in glycolytic fibres of skeletal muscle. Two isoformes were identified differing in alternative spliced exons 12 and 13 and showing a tissue specific mRNA expression. The results presented in this work make Tbc1d1 a very feasible candidate gene to be causal for Nob1. The function of Tbc1d1 in the metabolism of carbohydrates and fat has yet to be analyzed. KW - Tbc1d1 KW - Adipositas KW - SJL KW - loss-of-function-Mutation KW - QTL KW - Tbc1d1 KW - Obesity KW - SJL KW - loss-of-function mutation KW - QTL Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-34610 ER - TY - THES A1 - Trost, Gerda T1 - Poly(A) Polymerase 1 (PAPS1) influences organ size and pathogen response in Arabidopsis thaliana T1 - Poly(A) Polymerase 1 (PAPS1) beeinflusst die Organgröße und Pathogenantwort in Arabidopsis thaliana N2 - Polyadenylation of pre-mRNAs is critical for efficient nuclear export, stability, and translation of the mature mRNAs, and thus for gene expression. The bulk of pre-mRNAs are processed by canonical nuclear poly(A) polymerase (PAPS). Both vertebrate and higher-plant genomes encode more than one isoform of this enzyme, and these are coexpressed in different tissues. However, in neither case is it known whether the isoforms fulfill different functions or polyadenylate distinct subsets of pre-mRNAs. This thesis shows that the three canonical nuclear PAPS isoforms in Arabidopsis are functionally specialized owing to their evolutionarily divergent C-terminal domains. A moderate loss-of-function mutant in PAPS1 leads to increase in floral organ size, whereas leaf size is reduced. A strong loss-of-function mutation causes a male gametophytic defect, whereas a weak allele leads to reduced leaf growth. By contrast, plants lacking both PAPS2 and PAPS4 function are viable with wild-type leaf growth. Polyadenylation of SMALL AUXIN UP RNA (SAUR) mRNAs depends specifically on PAPS1 function. The resulting reduction in SAUR activity in paps1 mutants contributes to their reduced leaf growth, providing a causal link between polyadenylation of specific pre-mRNAs by a particular PAPS isoform and plant growth. Additionally, opposite effects of PAPS1 on leaf and flower growth reflect the different identities of these organs. The overgrowth of paps1 mutant petals is due to increased recruitment of founder cells into early organ primordia whereas the reduced leaf size is due to an ectopic pathogen response. This constitutive immune response leads to increased resistance to the biotrophic oomycete Hyaloperonospora arabidopsidis and reflects activation of the salicylic acid-independent signalling pathway downstream of ENHANCED DISEASE SUSCEPTIBILITY1 (EDS1)/PHYTOALEXIN DEFICIENT4 (PAD4). Immune responses are accompanied by intracellular redox changes. Consistent with this, the redox-status of the chloroplast is altered in paps1-1 mutants. The molecular effects of the paps1-1 mutation were analysed using an RNA sequencing approach that distinguishes between long- and short tailed mRNA. The results shown here suggest the existence of an additional layer of regulation in plants and possibly vertebrate gene expression, whereby the relative activities of canonical nuclear PAPS isoforms control de novo synthesized poly(A) tail length and hence expression of specific subsets of mRNAs. N2 - Polyadenylierung von prä-mRNAs ist entscheidend für den Export aus dem Zellkern, die Stabilität und die Translation der reifen mRNAs und dadurch für die Genexpression. Der Großteil der mRNAs wird durch sogenannte canonische Poly(A) Polymerasen (cPAPS) prozessiert. Die Genome von sowohl Wirbeltieren als auch Pflanzen kodieren mehr als eine Isoform dieser Enzyme, welche gleichzeitig in verschiedenen Geweben exprimiert werden. Es ist jedoch kein Beispiel bekannt, das zeigt, ob die verschiedenen Isoformen unterschiedliche Funktionen einnehmen bzw. verschiedene Untergruppen von mRNAs polyadenylieren. Diese Arbeit zeigt, dass drei canonische PAPS Isoformen in Arabidopsis thaliana aufgrund ihrer evolutionär unterschiedlichen C-terminalen Domänen spezialisierte Funktionen haben. Eine schwache Verlust-Mutation im PAPS1 Gen bewirkt eine Vergrößerung der Blütenorgane, während die Blattgröße vermindert ist. Eine starke Verlust-Mutation bewirkt zusätzlich einen Defekt der männlichen Keimzellen. Im Gegenzug dazu sind Mutanten des PAPS2 oder PAPS4 Gens gesund und zeigen ein normales Wachstum. Polyadenylierung von SMALL AUXIN UP RNA (SAUR) mRNAs hängt spezifisch von der Funktion von PAPS1 ab. Die daraus entstehende Reduzierung der SAUR Aktivität in den paps1 Mutanten trägt zur Verringerung der Blattgröße bei und stellt eine kausale Verbindung zwischen Polyadenylierung spezifischer mRNAs durch bestimmte PAPS Isoformen und Pflanzenwachstum dar. Zusätzlich spiegeln die unterschiedlichen Effekte von PAPS1 auf Blüten und Blätter die Identitäten dieser Organe wieder. Das übermäßige Wachstum der mutanten Petalen beruht auf einer erhöhten Anzahl an Gründer-Zellen im frühen Primordium, wohingegen die verminderte Blattgröße auf eine ektopische Pathogen Antwort zurückzuführen ist. Diese konstitutive Immunantwort bewirkt eine erhöhte Resistenz der Mutanten gegenüber dem biotrophen Oomyceten Hyaloperonospora arabidopsidis und reflektiert die Aktivierung des Salizylsäure unabhängigen Signalweges von ENHANCED DISEASE SUSCEPTIBILITY1 (EDS1)/PHYTOALEXIN DEFICIENT4 (PAD4). Immunantworten sind von Veränderungen des intrazellulären Redoxpotenzials gekennzeichnet. Damit übereinstimmend zeigen die Chloroplasten der paps1-1 Mutanten ein verändertes Redoxpotenzial. Zur genaueren Aufklärung der molekularen Effekte der paps1 1 mutation wurde eine RNA-Sequenzierungsmethode verwendet, die zwischen mRNAs mit langem oder kurzem Poly(A) Schwanz unterscheidet. Die Aktivitäten der verschiedenen canonischen PAPS Isoformen kontrollieren die Länge des neu synthetisierten poly(A) Schwanzes und damit die Expression spezifischer Untergruppen von mRNAs. Dadurch lassen die hier gezeigten Ergebnisse eine weitere Ebene der Genregulierung in Pflanzen, und möglicherweise auch in anderen Eukaryoten, vermuten. KW - Polyadenylierung KW - Pathogenantwort KW - Organgröße KW - polyadenylation KW - pathogen response KW - organ size Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-72345 ER - TY - THES A1 - Naseri, Gita T1 - Plant-derived transcription factors and their application for synthetic biology approaches in Saccharomyces cerevisiae T1 - Pflanzenbasierte Transkriptionsfaktoren und ihre Anwendungen in der synthetischen Biologie in Saccharomyces cerevisiae N2 - Bereits seit 9000 Jahren verwendet die Menschheit die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae für das Brauen von Bier, aber erst seit 150 Jahren wissen wir, dass es sich bei diesem unermüdlichen Helfer im Brauprozess um einzellige, lebende Organismen handelt. Und die Bäckerhefe kann noch viel mehr. Im Rahmen des Forschungsgebietes der Synthetischen Biologie soll unter anderem die Bäckerhefe als innovatives Werkzeug für die biobasierte Herstellung verschiedenster Substanzen etabliert werden. Zu diesen Substanzen zählen unter anderem Feinchemikalien, Biokraftstoffe und Biopolymere sowie pharmakologisch und medizinisch interessante Pflanzenstoffe. Damit diese verschiedensten Substanzen in der Bäckerhefe hergestellt werden können, müssen große Mengen an Produktionsinformationen zum Beispiel aus Pflanzen in die Hefezellen übertragen werden. Darüber hinaus müssen die neu eingebrachten Biosynthesewege reguliert und kontrolliert in den Zellen ablaufen. Auch Optimierungsprozesse zur Erhöhung der Produktivität sind notwendig. Für alle diese Arbeitsschritte mangelt es bis heute an anwendungsbereiten Technologien und umfassenden Plattformen. Daher wurden im Rahmen dieser Doktorarbeit verschiedene Technologien und Plattformen zur Informationsübertragung, Regulation und Prozessoptimierung geplant und erzeugt. Für die Konstruktion von Biosynthesewegen in der Bäckerhefe wurde als erstes eine Plattform aus neuartigen Regulatoren und Kontrollelementen auf der Basis pflanzlicher Kontrollelemente generiert und charakterisiert. Im zweiten Schritt erfolgte die Entwicklung einer Technologie zur kombinatorischen Verwendung der Regulatoren in der Planung und Optimierung von Biosynthesewegen (COMPASS). Abschließend wurde eine Technologie für die Prozessoptimierung der veränderten Hefezellen entwickelt (CapRedit). Die Leistungsfähigkeit der entwickelten Plattformen und Technologien wurde durch eine Optimierung der Produktion von Carotenoiden (Beta-Carotin und Beta-Ionon) und Flavonoiden (Naringenin) in Hefezellen nachgewiesen. Die im Rahmen der Arbeit etablierten neuartigen Plattformen und innovativen Technologien sind ein wertvoller Grundbaustein für die Erweiterung der Nutzbarkeit der Bäckerhefe. Sie ermöglichen den Einsatz der Hefezellen in kosteneffizienten Produktionswegen und alternativen chemischen Wertschöpfungsketten. Dadurch können zum Beispiel Biokraftstoffe und pharmakologisch interessante Pflanzenstoffe unter Verwendung von nachwachsenden Rohstoffen, Reststoffen und Nebenprodukten hergestellt werden. Darüber hinaus ergeben sich Anwendungsmöglichkeiten zur Bodensanierung und Wasseraufbereitung. N2 - Plant-derived Transcription Factors for Orthologous Regulation of Gene Expression in the Yeast Saccharomyces cerevisiae Control of gene expression by transcription factors (TFs) is central in many synthetic biology projects where tailored expression of one or multiple genes is often needed. As TFs from evolutionary distant organisms are unlikely to affect gene expression in a host of choice, they represent excellent candidates for establishing orthogonal control systems. To establish orthogonal regulators for use in yeast (Saccharomyces cerevisiae), we chose TFs from the plant Arabidopsis thaliana. We established a library of 106 different combinations of chromosomally integrated TFs, activation domains (yeast GAL4 AD, herpes simplex virus VP64, and plant EDLL) and synthetic promoters harbouring cognate cis-regulatory motifs driving a yEGFP reporter. Transcriptional output of the different driver / reporter combinations varied over a wide spectrum, with EDLL being a considerably stronger transcription activation domain in yeast, than the GAL4 activation domain, in particular when fused to Arabidopsis NAC TFs. Notably, the strength of several NAC - EDLL fusions exceeded that of the strong yeast TDH3 promoter by 6- to 10-fold. We furthermore show that plant TFs can be used to build regulatory systems encoded by centromeric or episomal plasmids. Our library of TF – DNA-binding site combinations offers an excellent tool for diverse synthetic biology applications in yeast. COMPASS: Rapid combinatorial optimization of biochemical pathways based on artificial transcription factors We established a high-throughput cloning method, called COMPASS for COMbinatorial Pathway ASSembly, for the balanced expression of multiple genes in Saccharomyces cerevisiae. COMPASS employs orthogonal, plant-derived artificial transcription factors (ATFs) for controlling the expression of pathway genes, and homologous recombination-based cloning for the generation of thousands of individual DNA constructs in parallel. The method relies on a positive selection of correctly assembled pathway variants from both, in vivo and in vitro cloning procedures. To decrease the turnaround time in genomic engineering, we equipped COMPASS with multi-locus CRISPR/Cas9-mediated modification capacity. In its current realization, COMPASS allows combinatorial optimization of up to ten pathway genes, each transcriptionally controlled by nine different ATFs spanning a 10-fold difference in expression strength. The application of COMPASS was demonstrated by generating cell libraries producing beta-carotene and co-producing beta-ionone and biosensor-responsive naringenin. COMPASS will have many applications in other synthetic biology projects that require gene expression balancing. CaPRedit: Genome editing using CRISPR-Cas9 and plant-derived transcriptional regulators for the redirection of flux through the FPP branch-point in yeast. Technologies developed over the past decade have made Saccharomyces cerevisiae a promising platform for production of different natural products. We developed CRISPR/Ca9- and plant derived regulator-mediated genome editing approach (CaPRedit) to greatly accelerate strain modification and to facilitate very low to very high expression of key enzymes using inducible regulators. CaPRedit can be implemented to enhance the production of yeast endogenous or heterologous metabolites in the yeast S. cerevisiae. The CaPRedit system aims to faciltiate modification of multiple targets within a complex metabolic pathway through providing new tools for increased expression of genes encoding rate-limiting enzymes, decreased expression of essential genes, and removed expression of competing pathways. This approach is based on CRISPR/Cas9-mediated one-step double-strand breaks to integrate modules containing IPTG-inducible plant-derived artificial transcription factor and promoter pair(s) in a desired locus or loci. Here, we used CaPRedit to redirect the yeast endogenous metabolic flux toward production of farnesyl diphosphate (FPP), a central precursor of nearly all yeast isoprenoid products, by overexpression of the enzymes lead to produce FPP from glutamate. We found significantly higher beta-carotene accumulation in the CaPRedit-mediated modified strain than in the wild type (WT) strain. More specifically, CaPRedit_FPP 1.0 strain was generated, in which three genes involved in FPP synthesis, tHMG1, ERG20, and GDH2, were inducibly overexpressed under the control of strong plant-derived ATFPs. The beta–carotene accumulated in CaPRedit_FPP 1.0 strain to a level 1.3-fold higher than the previously reported optimized strain that carries the same overexpressed genes (as well as additional genetic modifications to redirect yeast endogenous metabolism toward FPP production). Furthermore, the genetic modifications implemented in CaPRedit_FPP 1.0 strain resulted in only a very small growth defect (growth rate relative to the WT is ~ -0.03). KW - synthetic biology KW - Saccharomyces cerevisiae KW - artificial transcription factor KW - combinatorial optimization KW - biosensor KW - DNA assembly KW - pathway engineering KW - artifizielle Transkriptionsfaktoren KW - Biosensor KW - kombinatorische Optimierung KW - DNA assembly KW - Saccharomyces cerevisiae KW - synthetische Biologie KW - pathway engineering Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-421514 ER - TY - THES A1 - Kanwischer, Marion T1 - Phytol aus dem Chlorophyllabbau ist limitierend für die Tocopherol (Vitamin E)-Synthese T1 - Phytol from chlorophyll degradation is limiting for tocopherol (vitamin E)-synthesis N2 - Phytol aus dem Chlorophyllabbau ist limitierend für die Tocopherol (Vitamin E)-Synthese Als Bestandteil von Chlorophyll ist Phytol das am häufigsten vorkommende Isoprenoid in der Biosphäre. Große Mengen an Chlorophyll werden jährlich degradiert und dabei wird Phytol freigesetzt, über dessen Verbleib jedoch wenig bekannt ist. Es sollte der Nachweis erbracht werden, dass im Zuge des Chlorophyllabbaus hydrolysiertes Phytol Eingang in die Synthese anderer Phytylderivate findet. Während der Gehalt an Tocopherol, Chlorophyll und Fettsäurephytylester entwicklungs- bzw. seneszenzabhängig ist, bleibt der Gehalt an Phyllochinon etwa gleich. Auch in Samen ist der Gehalt von Tocopherol, Chlorophyll und Fettsäurephytylester entwicklungsabhängig. Es wurde gefolgert, dass nur die Synthesen von Tocopherol und Fettsäurephytylester während des Chlorophyllabbaus stimuliert werden. Daher sollten Mutanten analysiert werden, welche im Chlorophyllabbau inhibiert sind. Da Chlorophyllase den ersten Schritt des Chlorophyllabbaus katalysiert, wurden zwei unabhängige T-DNA-Insertionsmutanten für Chlorophyllase1 (CHL1) und eine T-DNA-Insertionsmutante für Chlorophyllase2 (CHL2) identifiziert und eine chl1-1chl2-Doppelmutante erzeugt. Die Analyse der Chlorophyllidanteile ergab eine im Vergleich zum Wildtyp starke Reduktion in den chl1-Mutanten, während der Chlorophyllidanteil von chl2 ähnlich hoch dem Wildtyp ist. Der Chlorophyllidanteil sich entwickelnder chl1-1chl2-Pflanzen nahm in der Seneszenz zu. Die Chlorophyllasemutanten zeigten kein verändertes Seneszenzverhalten im Vergleich zu den Wildtypen. Ferner konnte in den chl1-Linien nur geringfügig weniger Tocopherol und Fettsäurephytylester als in den Wildtypen nachgewiesen werden. Auch der Tocopherolgehalt der Samen war in den Chlorophyllasemutanten unverändert zu den Wildtypen. Aufgrund dessen wurde gefolgert, dass neben den Chorophyllasen CHL1 und CHL2 weitere Chlorophyllhydrolasen in Samen und Blättern von Arabidopsis existieren. Daher wurde auf andere Mutanten zurückgegriffen, in denen der Chlorophyllabbau stark inhibiert ist und die Seneszenz nach Dunkelinkubation im Vergleich zum Wildtyp deutlich verzögert ist. Eine deutliche Korrelation zwischen vermindertem Chlorophyllabbau und Gehalt an Tocopherol und Fettsäurephytylester konnte in den staygreen-Mutanten pao1 und zwei unabhängigen SGR (staygreen)-RNAi-Linien nachgewiesen werden. Damit konnte eindeutig gezeigt werden, dass die Synthese von Tocopherol und der Fettsäurephytylester durch die Chlorophyllhydrolyse induziert wird. Es wurde gefolgert, dass vor allem unter Seneszenz- bzw. Stressbedingungen dieser alternative Syntheseweg von Phytol eine Rolle spielt. Dennoch kommt der Phytylsynthese durch die de novo-Isoprenoidsynthese auch eine Bedeutung zu. Nach Behandlung von stickstoffmangelgestressten Wildtyppflanzen mit dem Inhibitor Fosmidomycin, welcher die plastidäre de novo-Isoprenoidsynthese hemmt, war der Tocopherolgehalt gegenüber stickstoffmangelgestressten Kontrollpflanzen stark reduziert. Ferner konnte eine T-DNA-Insertionsmutante der Geranylgeranylreduktase (GGR) identifiziert werden. Diese Mutante kann nur auf Nährmedium überleben, hat nur wenige grüne Blätter und bildet keine Samen. Es konnte kein Phyllochinon, Chlorophyll und keine Fettsäurephytylester, jedoch geringe Mengen Tocopherol nachgewiesen werden. Der Resttocopherolgehalt wird auf die Nebenaktivität einer anderen Reduktase zurückgeführt. Weiterhin wurde nur das Geranylgeranylderivat des Chlorophylls identifiziert. Diese Ergebnisse erlauben den Schluss, dass die phytylgruppenübertragenen Enzyme der Tocopherol-, Phyllochinon- und Fettsäurephytylestersynthese eine hohe Substratspezifität für die Phytylgruppe aufweisen. Nach Fütterung von Phytol konnte in ggr Tocopherol und Chlorophyll bestimmt werden. Aufgrund dessen kann gefolgert werden, dass Chlorophyllsynthetase aus Arabidopsis sowohl Geranylgeranyl-, als auch Phytylpyrophosphat als Substrat nutzen kann und damit ein breiteres Substratspektrum aufweist. N2 - Phytol from chlorophyll degradation is limiting for tocopherol (vitamin E)-synthesis As a part of the chlorophyll molecule phytol belongs to the most abundant isoprenoid of the biosphere. Huge amounts of chlorophyll are degraded annually. During this process phytol is released, but only little is known about the fate of phytol. The goal of the project was to provide evidence that during chlorophyll degradation released phytol enters the pathway of the synthesis of further phytyl derivatives. While the content of tocopherol, chlorophyll and fatty acid phytyl esters are growth and stress related the content of phylloquinone does not change during development or under stress conditions. Also in seeds the content of these phytyl derivates are dependent on development. Hence only tocopherol and fatty acid phytyl ester synthesis are induced during chlorophyll degradation. Therefore mutants were analysed that are inhibited in chlorophyll degradation. Chorophyllase catalyses the first step during chlorophyll degradation. Two independent T-DNA insertion mutants of Chlorophyllase1 (CHL1) and one for Chlorophyllase2 (CHL2) were identified. Furthermore chl1-1 and chl2 were crossed to produce the chl1-1chl2 double mutant. The mutation resulted in a strong reduction of the chlorophyllide fraction in chl1 mutants while the chlorophyllide fraction of chl2 was similar to wild type. The chlorophyllide fraction in developing chl1-1chl2 plants increased during senescence. For all chlorophyllase mutants no retardation of senescence was observed. Compared to wild type only marginal reductions in tocopherol and fatty acid phytyl ester contents could be observed for the chl1 mutants. The seed tocopherol content of the chlorophyllase mutants was similar to wild type. Therefore, it was concluded that in leaves and seeds of Arabidopsis besides CHL1 and CHL2 further chlorophyll hydrolases exist that induce chlorophyll degradation. Thus, staygreen mutants exhibiting strongly inhibited chlorophyll degradation were analysed. Compared to wild type the staygreen mutants pao1 and two independent SGR (staygreen)-RNAi-lines show a strong retardation of senescence under dark incubation. A clear correlation between reduced chlorophyll degradation and tocopherol and fatty acid phytyl ester content could be demonstrated. With this it was possible to verify that tocopherol and fatty acid phytyl ester synthesis are induced by chlorophyll hydrolysis. This alternative pathway seems to play an important role in particular under stress and senescence conditions. Nevertheless, after application of Fosmidomycin, an inhibitor of the plastidic de novo isoprenoid synthesis pathway, to nitrogen starved wild type plants the tocopherol content was strongly reduced compared to nitrogen starved control plants. Therefore, also the plastidic de novo isoprenoid synthesis plays a significant role for tocopherol synthesis. Moreover, a T-DNA insertion mutant for Geranylgeranyl reductase (ggr) was identified and isolated. This mutant can survive only on nutrition medium, contains only a few green leaves and produces no seeds. There was no phylloquinone, chlorophyll and fatty acid phytyl ester detectable, but minor amounts of tocopherol. The residual amounts of tocopherol were attributed to side activities of another reductase. Obviously, the phytyl transferring enzymes of tocopherol, phylloquinone and fatty acid phytyl ester synthesis exhibit a strong substrate specificity of the phytyl group. After feeding phytol to ggr tocopherol and chlorophyll were detectable in this mutant. Therefore, it was concluded that chlorophyll synthetase from Arabidopsis can use geranylgeranyl pyrophosphate as well as phytyl pyrophosphate as substrates. KW - Phytol KW - Chlorophyll KW - Tocopherol KW - Vitamin E KW - phytol KW - chlorophyll KW - tocopherol KW - vitamin E Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-15957 ER - TY - THES A1 - Fuhrmann, Saskia T1 - Physiologically-based pharmacokinetic and mechanism-based pharmacodynamic modelling of monoclonal antibodies with a focus on tumour targeting T1 - Physiologie-basierte pharmakokinetische und mechanistische pharmakodynamische Modellierung von monoklonalen Antikörpern mit Fokus auf zielgerichtete Tumortherapie N2 - Monoclonal antibodies (mAbs) are an innovative group of drugs with increasing clinical importance in oncology, combining high specificity with generally low toxicity. There are, however, numerous challenges associated with the development of mAbs as therapeutics. Mechanistic understanding of factors that govern the pharmacokinetics (PK) of mAbs is critical for drug development and the optimisation of effective therapies; in particular, adequate dosing strategies can improve patient quality life and lower drug cost. Physiologically-based PK (PBPK) models offer a physiological and mechanistic framework, which is of advantage in the context of animal to human extrapolation. Unlike for small molecule drugs, however, there is no consensus on how to model mAb disposition in a PBPK context. Current PBPK models for mAb PK hugely vary in their representation of physiology and parameterisation. Their complexity poses a challenge for their applications, e.g., translating knowledge from animal species to humans. In this thesis, we developed and validated a consensus PBPK model for mAb disposition taking into account recent insights into mAb distribution (antibody biodistribution coefficients and interstitial immunoglobulin G (IgG) pharmacokinetics) to predict tissue PK across several pre-clinical species and humans based on plasma data only. The model allows to a priori predict target-independent (unspecific) mAb disposition processes as well as mAb disposition in concentration ranges, for which the unspecific clearance (CL) dominates target-mediated CL processes. This is often the case for mAb therapies at steady state dosing. The consensus PBPK model was then used and refined to address two important problems: 1) Immunodeficient mice are crucial models to evaluate mAb efficacy in cancer therapy. Protection from elimination by binding to the neonatal Fc receptor is known to be a major pathway influencing the unspecific CL of both, endogenous and therapeutic IgG. The concentration of endogenous IgG, however, is reduced in immunodeficient mouse models, and this effect on unspecific mAb CL is unknown, yet of great importance for the extrapolation to human in the context of mAb cancer therapy. 2) The distribution of mAbs into solid tumours is of great interest. To comprehensively investigate mAb distribution within tumour tissue and its implications for therapeutic efficacy, we extended the consensus PBPK model by a detailed tumour distribution model incorporating a cell-level model for mAb-target interaction. We studied the impact of variations in tumour microenvironment on therapeutic efficacy and explored the plausibility of different mechanisms of action in mAb cancer therapy. The mathematical findings and observed phenomena shed new light on therapeutic utility and dosing regimens in mAb cancer treatment. N2 - Monoklonale Antikörper (mAK) stellen durch ihre hohe Spezifität und geringe Toxizität eine innovative Arzneistoffklasse mit großer klinischer Bedeutung in der Krebstherapie dar. Es gibt jedoch eine Vielzahl an Herausforderungen, die mit der Entwicklung von mAK als Krebstherapeutika verbunden sind. Mechanistisches Verständnis der Pharmakokinetik (PK) von mAK ist wichtig für die Arzneimittelentwicklung sowie für die Therapieoptimierung. Adäquate Dosierungsstrategien können die Lebensqualität der Patienten erhöhen und die Gesundheitskosten senken. Physiologie-basierte PK (PBPK) Modelle bieten einen physiologischen und mechanistischen Rahmen für die Extrapolation von Tiermodellen auf den Menschen. Im Gegensatz zu kleinen chemischen Molekülen besteht für die PBPK Modellierung von mAK kein Konsens: Aktuelle Modelle unterscheiden sich stark hinsichtlich Physiologie und deren Parameterisierung. Die Komplexität dieser Modelle stellt eine große Herausforderung für ihre Anwendung dar. In der vorliegenden Arbeit entwickelten und validierten wir ein Konsens-PBPK-Modell für die mAK Disposition. Dabei wurden aktuelle Erkenntnisse zur mAK Verteilung berücksichtigt, um basierend auf Plasmadaten Vorhersagen für die PK im Gewebe verschiedener präklinischer sowie klinischer Spezies zu treffen. Das Modell erlaubt a priori Vorhersagen für die unspezifische (target-unabhängige) mAK Disposition als auch für die mAK Disposition in einem Konzentrationsbereich, für den die unspezifische Clearance (CL) die target-abhängige CL dominiert. Dies ist oft der Fall für mAK Therapien bei Steady-state-Dosierung. Anschließend wurde das Konsens-PBPK-Modell genutzt und verfeinert, um zwei wichtige Aspekte näher zu untersuchen: 1) Immundefiziente Mäuse sind wichtige Tiermodelle für die Evaluierung der mAK Wirksamkeit in der Tumortherapie. Die Bindung von Antikörpern an den neonatalen Fc Rezeptor schützt diese vor dem Abbau und beeinflusst somit maßgeblich die unspezifische CL von endogenen sowie therapeutischen Antikörpern. Die Konzentration von endogenem IgG in immundefizienten Mäusen ist reduziert. Dieser Effekt auf die unspezifische mAK CL ist unbekannt, jedoch wichtig für die Extrapolation auf den Menschen in der mAK Tumortherapie. 2) Die Verteilung von mAK innerhalb eines soliden Tumors ist von großer Bedeutung. Für die umfassende Untersuchung der mAK Verteilung innerhalb des Tumorgewebes wurde das Konsens-PBPK-Modell um ein detailliertes Tumor-Verteilungsmodell, welches die mAK-Target Interaktion auf Zellebene berücksichtigt, erweitert. Wir untersuchten den Einfluss von Variationen in der Tumor-Mikroumgebung auf die klinische Wirksamkeit von mAK und untersuchten die Plausibilität verschiedener Wirkmechanismen in der mAK Tumortherapie. Die mathematischen Ergebnisse sowie beobachteten Phänomene werfen ein neues Licht auf den therapeutischen Nutzen sowie Dosierungsschemata in der mAK Krebstherapie. KW - PBPK KW - monoclonal antibodies KW - modelling KW - PBPK KW - monoklonale Antikörper KW - Modellierung Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-418861 ER - TY - THES A1 - Zaupa, Alessandro T1 - Physical crosslinking of gelatin : a supramolecular approach to biomaterials T1 - Physikalische Quervernetzung von Gelatine : ein supramolekularer Zugang zu Biomaterialien N2 - This work describes the realization of physically crosslinked networks based on gelatin by the introduction of functional groups enabling specific supramolecular interactions. Molecular models were developed in order to predict the material properties and permit to establish a knowledge-based approach to material design. The effect of additional supramolecular interactions with hydroxyapaptite was then studied in composite materials. The calculated properties are compared to experimental results to validate the models. The models are then further used for the study of physically crosslinked networks. Gelatin was functionalized with desaminotyrosine (DAT) and desaminotyrosyl-tyrosine (DATT) side groups, derived from the natural amino acid tyrosine. These group can potentially undergo to π-π and hydrogen bonding interactions also under physiological conditions. Molecular dynamics (MD) simulations were performed on models with 0.8 wt.-% or 25 wt.-% water content, using the second generation forcefield CFF91. The validation of the models was obtained by the comparison with specific experimental data such as, density, peptide conformational angles and X-ray scattering spectra. The models were then used to predict the supramolecular organization of the polymer chain, analyze the formation of physical netpoints and calculate the mechanical properties. An important finding of simulation was that with the increase of aromatic groups also the number of observed physical netpoints increased. The number of relatively stable physical netpoints, on average zero 0 for natural gelatin, increased to 1 and 6 for DAT and DATT functionalized gelatins respectively. A comparison with the Flory-Rehner model suggested reduced equilibrium swelling by factor 6 of the DATT-functionalized materials in water. The functionalized gelatins could be synthesized by chemoselective coupling of the free carboxylic acid groups of DAT and DATT to the free amino groups of gelatin. At 25 wt.-% water content, the simulated and experimentally determined elastic mechanical properties (e.g. Young Modulus) were both in the order of GPa and were not influenced by the degree of aromatic modification. The experimental equilibrium degree of swelling in water decreased with increasing the number of inserted aromatic functions (from 2800 vol.-% for pure gelatin to 300 vol.-% for the DATT modified gelatin), at the same time, Young’s modulus, elongation at break, and maximum tensile strength increased. It could be show that the functionalization with DAT and DATT influences the chain organization of gelatin based materials together with a controlled drying condition. Functionalization with DAT and DATT lead to a drastic reduction of helical renaturation, that could be more finely controlled by the applied drying conditions. The properties of the materials could then be influenced by application of two independent methods. Composite materials of DAT and DATT functionalized gelatins with hydroxyapatite (HAp) show a drastic reduction of swelling degree. In tensile tests and rheological measurements, the composites equilibrated in water had increased Young’s moduli (from 200 kPa up to 2 MPa) and tensile strength (from 57 kPa up to 1.1 MPa) compared to the natural polymer matrix without affecting the elongation at break. Furthermore, an increased thermal stability from 40 °C to 85 °C of the networks could be demonstrated. The differences of the behaviour of the functionalized gelatins to pure gelatin as matrix suggested an additional stabilizing bond between the incorporated aromatic groups to the hydroxyapatite. N2 - Diese Arbeit beschreibt die Entwicklung von durch spezifische physikalische Wechselwirkungen quervernetzten Gelatine-basierten Materialien. Dazu wurden zunächst Computermodelle entwickelt, mit denen Eigenschaften der Materialien vorhergesagt werden sollten, um so eine wissensbasierte Entwicklung zu ermöglichen, um dann die Ergebnisse mit experimentellen Daten zu vergleichen und die Materialien und Modelle als Grundlage für weitere Entwicklungen zu nutzen. Gelatine wurde mit Desaminotyrosin (DAT) und Desaminotyrosyltyrosin (DATT) funktionalisiert, die sich von der natürlichen Aminosäure Tyrosin ableiten. Diese Gruppen können potentiell π-π Wechselwirkungen und Wasserstoffbrückenbindungen auch unter physiologischen Bedingungen eingehen. Es wurden Computersimulationen der Materialien mittels Moleküldynamik durchgeführt, wobei Modelle mit 0.8 Gew.-% und 25 Gew.-% Wassergehalt betrachtet wurden. Die Validierung der Modelle erfolgte durch Vergleich der errechneten mit experimentellen Daten wie z.B. der Dichte, Bindungswinkeln sowie Röntgenstreuungsspektren. Die Modelle wurden dann zur Vorhersage der molekularen Organisation der Polymerketten, Formierung physikalischer Netzpunkte und Berechnung der mechanischen Eigenschaften eingesetzt. Die Funktionalisierung der Gelatine mit DAT bzw. DATT führten wie gewünscht zur Ausbildung physikalischer Netzpunkte durch π-π Wechselwirkungen und Wasserstoffbrücken¬bindungen. Ein Schlüsselergebnis der Simulationen war, dass mit zunehmender Zahl an aromatischen Gruppen auch eine Zunahme der physikalischen Netzpunkte beobachtet werden konnte. Die funktionalisierten Gelatinen konnten durch chemoselektive Reaktion der Aminogruppen der Gelatine mit den freien Carboxylgruppen von DAT und DATT hergestellt werden. Materialien mit 25 Gew.-% Wassergehalt hatten in der Simulation und im Experiment mechanische Eigenschaften derselben Größenordnung (z.B. E-Moduln im unteren GPa-Bereich). Der Quellungsgrad der Materialien im Experiment nahm mit zunehmender Zahl an aromatische Gruppen ab (von 2800 Vol.-% auf 300 Vol.-%), wobei der Elastizitätsmodul, die Bruchdehnung sowie die Zugfestigkeit zunahmen. Die Funktionalisierung der Gelatine ist eine chemische Methode, um die Kettenanordnung auf molekularer Ebene zu beeinflussen, während die genaue Kontrolle der Trocknungs¬bedinguungen von Gelatine-basierten Materialien eine physikalische Methode mit demselben Ziel ist. Es konnte gezeigt werden, dass die Funktionalisierung von Gelatine mit DAT oder DATT zu einer stark verminderten Helixausbildungstendenz, die jedoch durch Variation der Trocknunsgbedingungen noch fein abgestimmt werden konnte. Somit konnten die mechanischen Eigenschaften von Filmen aus funktionlisierter Gelatine mit zwei unabhängigen Methoden eingestellt werden. Komposite der mit DAT oder DATT funktionalisierten Gelatine und Hydroxyapatit (HAp) zeigten deutlich verringerter Quellung. In Zugdehnungsexperimenten und rheologischen Untersuchungen zeigten die Komposite im Gleichgewichtsquellungszustand erhöhte Elastizitätsmoduln (von 200 kPa auf bis zu 2 MPa) und Zugfestigkeit (von 57 kPa auf bis zu 1.1 MPa). Darüber hinaus konnte die Übergangstemperatur Tc deutlich gesteigert werden (von ca. 40 °C auf > 85 °C). Dieses Verhalten ließ sich auf stabilisierende Bindungen zwischen den aromatische Gruppen und dem HAp zurückführen. KW - Physikalische Quervernetzung KW - Supramolekularen Wechselwirkung KW - Molekulare Modellierung KW - Biomaterialien KW - Gelatine KW - Komposite KW - Hydroxyapatit KW - Physical Network KW - Supramolecular Interaction KW - Molecular modeling KW - Biomaterial KW - Gelatin KW - Composite KW - Hydroxyapatite Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-52888 ER - TY - THES A1 - Heise, Janine T1 - Phylogenetic and physiological characterization of deep-biosphere microorganisms in El’gygytgyn Crater Lake sediments T1 - Phylogenetische und physiologische Charakterisierung der Tiefen Biosphäre in El'gygytgyn Kraterseesedimenten N2 - The existence of diverse and active microbial ecosystems in the deep subsurface – a biosphere that was originally considered devoid of life – was discovered in multiple microbiological studies. However, most of the studies are restricted to marine ecosystems, while our knowledge about the microbial communities in the deep subsurface of lake systems and their potentials to adapt to changing environmental conditions is still fragmentary. This doctoral thesis aims to build up a unique data basis for providing the first detailed high-throughput characterization of the deep biosphere of lacustrine sediments and to emphasize how important it is to differentiate between the living and the dead microbial community in deep biosphere studies. In this thesis, up to 3.6 Ma old sediments (up to 317 m deep) of the El’gygytgyn Crater Lake were examined, which represents the oldest terrestrial climate record of the Arctic. Combining next generation sequencing with detailed geochemical characteristics and other environmental parameters, the microbial community composition was analyzed in regard to changing climatic conditions within the last 3.6 Ma to 1.0 Ma (Pliocene and Pleistocene). DNA from all investigated sediments was successfully extracted and a surprisingly diverse (6,910 OTUs) and abundant microbial community in the El’gygytgyn deep sediments were revealed. The bacterial abundance (10³-10⁶ 16S rRNA copies g⁻¹ sediment) was up to two orders of magnitudes higher than the archaeal abundance (10¹-10⁵) and fluctuates with the Pleistocene glacial/interglacial cyclicality. Interestingly, a strong increase in the microbial diversity with depth was observed (approximately 2.5 times higher diversity in Pliocene sediments compared to Pleistocene sediments). The increase in diversity with depth in the Lake El’gygytgyn is most probably caused by higher sedimentary temperatures towards the deep sediment layers as well as an enhanced temperature-induced intra-lake bioproductivity and higher input of allochthonous organic-rich material during Pliocene climatic conditions. Moreover, the microbial richness parameters follow the general trends of the paleoclimatic parameters, such as the paleo-temperature and paleo-precipitation. The most abundant bacterial representatives in the El’gygytgyn deep biosphere are affiliated with the phyla Proteobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes, and Acidobacteria, which are also commonly distributed in the surrounding permafrost habitats. The predominated taxon was the halotolerant genus Halomonas (in average 60% of the total reads per sample). Additionally, this doctoral thesis focuses on the live/dead differentiation of microbes in cultures and environmental samples. While established methods (e.g., fluorescence in situ hybridization, RNA analyses) are not applicable to the challenging El’gygytgyn sediments, two newer methods were adapted to distinguish between DNA from live cells and free (extracellular, dead) DNA: the propidium monoazide (PMA) treatment and the cell separation adapted for low amounts of DNA. The applicability of the DNA-intercalating dye PMA was successfully evaluated to mask free DNA of different cultures of methanogenic archaea, which play a major role in the global carbon cycle. Moreover, an optimal procedure to simultaneously treat bacteria and archaea was developed using 130 µM PMA and 5 min of photo-activation with blue LED light, which is also applicable on sandy environmental samples with a particle load of ≤ 200 mg mL⁻¹. It was demonstrated that the soil texture has a strong influence on the PMA treatment in particle-rich samples and that in particular silt and clay-rich samples (e.g., El’gygytgyn sediments) lead to an insufficient shielding of free DNA by PMA. Therefore, a cell separation protocol was used to distinguish between DNA from live cells (intracellular DNA) and extracellular DNA in the El’gygytgyn sediments. While comparing these two DNA pools with a total DNA pool extracted with a commercial kit, significant differences in the microbial composition of all three pools (mean distance of relative abundance: 24.1%, mean distance of OTUs: 84.0%) was discovered. In particular, the total DNA pool covers significantly fewer taxa than the cell-separated DNA pools and only inadequately represents the living community. Moreover, individual redundancy analyses revealed that the microbial community of the intra- and extracellular DNA pool are driven by different environmental factors. The living community is mainly influenced by life-dependent parameters (e.g., sedimentary matrix, water availability), while the extracellular DNA is dependent on the biogenic silica content. The different community-shaping parameters and the fact, that a redundancy analysis of the total DNA pool explains significantly less variance of the microbial community, indicate that the total DNA represents a mixture of signals of the live and dead microbial community. This work provides the first fundamental data basis of the diversity and distribution of microbial deep biosphere communities of a lake system over several million years. Moreover, it demonstrates the substantial importance of extracellular DNA in old sediments. These findings may strongly influence future environmental community analyses, where applications of live/dead differentiation avoid incorrect interpretations due to a failed extraction of the living microbial community or an overestimation of the past community diversity in the course of total DNA extraction approaches. N2 - Innerhalb der letzten 20 Jahre wurden diverse und aktive mikrobielle Gemeinschaften in zahlreichen Habitaten der tiefen Biosphäre gefunden, in denen zuvor kein Leben denkbar war. Die mikrobiologischen Untersuchungen beschränken sich dabei meist auf marine Ökosysteme, wohingegen das Wissen über die tiefe Biosphäre von Seesystemen und die Anpassung der Mikroorganismen an sich ändernde klimatische Bedingungen noch sehr eingeschränkt ist. Ziel dieser Arbeit ist es, die mikrobielle Gemeinschaftsstruktur der tiefen Biosphäre des El‘gygytgyn Kratersees in Hinblick auf klimatische Veränderungen der vergangenen 1,0 bis 3,6 Millionen Jahre zu charakterisieren, beeinflussende Umweltparameter zu detektieren und dabei zwischen der lebenden und toten mikrobiellen Gemeinschaft zu differenzieren. Die Seesedimente (43-317 m tief) weisen eine erstaunlich hohe Diversität (6910 OTUs) und Mikrobenfülle (10³-10⁶ bakterielle, 10¹-10⁵ archaeale 16S rRNA Kopien g⁻¹ Sediment) auf, wobei eine 2,5-fach höhere Diversität in den pliozänen Sedimenten im Vergleich zu den jüngeren pleistozänen Sedimenten detektiert werden konnte. Der Diversitätsanstieg mit zunehmendem Sedimentalter (und Tiefe) basiert höchstwahrscheinlich auf die erhöhte temperaturinduzierte Bioaktivität im See und dem erhöhten Eintrag von Organik reichen Material innerhalb des Pliozäns (feucht und warm). Die Unterscheidung zwischen der DNA lebender Mikroben (intrazellulare DNA) und freier DNA (extrazellulare DNA, meist von toten Mikroben) wurde durch die Adaption von zwei Extraktionsmethoden, der Behandlung mit Propidium-Monoazid (PMA) und der Zellseparation, erreicht. Dabei wurde ein PMA-Protokoll (130 µM PMA, 5 Min Lichtaktivierung mit blauen LEDs) zur erfolgreichen Behandlung von Reinkulturen methanogener Archaeen etabliert, das auch für sandige Umweltproben (Partikelbeladung ≤ 200 mg mL⁻¹) nutzbar ist. Für die feinporigeren Seesedimente des El’gygytgyn Kratersees wurden die zellseparierten DNA-Pools der iDNA und eDNA mit dem Gesamt-DNA-Extrakt (kommerzielles Kit) verglichen, wobei die DNA-Pools starke Unterschiede in ihrer Zusammensetzung aufzeigten (24,1% Distanz basierend auf relative Häufigkeiten) und der Gesamt-DNA-Extrakt die lebende mikrobielle Gemeinschaft nur unzureichend widerspiegeln konnte. Individuelle Redundanzanalysen (RDA) zeigten, dass die mikrobielle Gemeinschaft der iDNA von lebensbeeinflussenden Parametern abhängig ist (u.a. Sedimentmatrix, Wasserverfügbarkeit), wohingegen die der eDNA maßgeblich durch den Anteil an biogener Kieselerde (silica) beeinflusst wird. Diese Arbeit stellt die erste umfangreiche Datenbasis der Diversität und Verteilung von Mikroorganismengemeinschaften in der tiefen Biosphäre eines Seesystems über mehrere Millionen Jahre dar. Zusätzlich zeigt die Studie, dass die Lebend/Tot-Unterscheidung, mit dem ein höherer Anteil der Varianz innerhalb der Gemeinschaft durch Umweltparameter erklärt werden kann, im Vergleich zur Gesamt-DNA-Extraktion ein wesentlicher Schritt zur genauen Widerspiegelung der mikrobiellen Gemeinschaft und deren Funktion in der Tiefen Biosphäre ist. KW - Mikrobiologie KW - El`gygytgyn Kratersee KW - Tiefe Biosphäre KW - Diversität KW - microbiology KW - El’gygytgyn Crater Lake KW - diversity KW - deep biosphere Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-403436 ER - TY - THES A1 - Riedel, Marc T1 - Photonic wiring of enzymatic reactions to photoactive entities for the construction of biohybrid electrodes T1 - Photonische Kontaktierung von enzymatischen Reaktionen mit photoaktiven Entitäten für den Aufbau von biohybriden Elektroden N2 - In this work, different strategies for the construction of biohybrid photoelectrodes are investigated and have been evaluated according to their intrinsic catalytic activity for the oxidation of the cofactor NADH or for the connection with the enzymes PQQ glucose dehydrogenase (PQQ-GDH), FAD-dependent glucose dehydrogenase (FAD-GDH) and fructose dehydrogenase (FDH). The light-controlled oxidation of NADH has been analyzed with InGaN/GaN nanowire-modified electrodes. Upon illumination with visible light the InGaN/GaN nanowires generate an anodic photocurrent, which increases in a concentration-dependent manner in the presence of NADH, thus allowing determination of the cofactor. Furthermore, different approaches for the connection of enzymes to quantum dot (QD)-modified electrodes via small redox molecules or redox polymers have been analyzed and discussed. First, interaction studies with diffusible redox mediators such as hexacyanoferrate(II) and ferrocenecarboxylic acid have been performed with CdSe/ZnS QD-modified gold electrodes to build up photoelectrochemical signal chains between QDs and the enzymes FDH and PQQ-GDH. In the presence of substrate and under illumination of the electrode, electrons are transferred from the enzyme via the redox mediators to the QDs. The resulting photocurrent is dependent on the substrate concentration and allows a quantification of the fructose and glucose content in solution. A first attempt with immobilized redox mediator, i.e. ferrocenecarboxylic acid chemically coupled to PQQ-GDH and attached to QD-modified gold electrodes, reveal the potential to build up photoelectrochemical signal chains even without diffusible redox mediators in solution. However, this approach results in a significant deteriorated photocurrent response compared to the situation with diffusing mediators. In order to improve the photoelectrochemical performance of such redox mediator-based, light-switchable signal chains, an osmium complex-containing redox polymer has been evaluated as electron relay for the electronic linkage between QDs and enzymes. The redox polymer allows the stable immobilization of the enzyme and the efficient wiring with the QD-modified electrode. In addition, a 3D inverse opal TiO2 (IO-TiO2) electrode has been used for the integration of PbS QDs, redox polymer and FAD-GDH in order to increase the electrode surface. This results in a significantly improved photocurrent response, a quite low onset potential for the substrate oxidation and a broader glucose detection range as compared to the approach with ferrocenecarboxylic acid and PQQ-GDH immobilized on CdSe/ZnS QD-modified gold electrodes. Furthermore, IO-TiO2 electrodes are used to integrate sulfonated polyanilines (PMSA1) and PQQ-GDH, and to investigate the direct interaction between the polymer and the enzyme for the light-switchable detection of glucose. While PMSA1 provides visible light excitation and ensures the efficient connection between the IO-TiO2 electrode and the biocatalytic entity, PQQ-GDH enables the oxidation of glucose. Here, the IO-TiO2 electrodes with pores of approximately 650 nm provide a suitable interface and morphology, which is required for a stable and functional assembly of the polymer and enzyme. The successful integration of the polymer and the enzyme can be confirmed by the formation of a glucose-dependent anodic photocurrent. In conclusion, this work provides insights into the design of photoelectrodes and presents different strategies for the efficient coupling of redox enzymes to photoactive entities, which allows for light-directed sensing and provides the basis for the generation of power from sun light and energy-rich compounds. N2 - In dieser Arbeit werden verschiedene Strategien für den Aufbau biohybrider Photoelektroden untersucht und hinsichtlich ihrer intrinsischen katalytischen Aktivität für die Oxidation des Kofaktors NADH oder für die Kontaktierung mit den Enzymen PQQ Glukosedehydrogenase (PQQ-GDH), FAD-abhängige Glukosedehydrogenase (FAD-GDH) und Fruktosedehydrogenase (FDH) evaluiert. Der Licht-gesteuerten Nachweis von NADH wurde mittels InGaN/GaN Nanodraht-modifizierten Elektroden untersucht. Bei Beleuchtung mit sichtbarem Licht generieren die InGaN/GaN Nanodrähte einen anodischen Photostrom, welcher in der Anwesenheit von NADH konzentrationsabhängig ansteigt und somit eine Bestimmung des Kofaktors erlaubt. Des Weiteren werden verschiedene Ansätze für die Kontaktierung von Enzymen mit Quantum Dot (QD)-modifizierten Elektroden unter Verwendung von kleinen Redoxmolekülen oder Redoxpolymeren analysiert und diskutiert. Zunächst wurden Interaktionsstudien mit den Redoxmediatoren Kaliumhexacyanoferrat(II) und Ferrocencarbonsäure in Lösung an CdSe/ZnS QD-modifizierten Goldelektroden durchgeführt um darauf aufbauend photoelektrochemische Signalketten zwischen QDs und den Enzymen FDH und PQQ-GDH aufzubauen und für den Nachweis von Fruktose und Glukose zu nutzen. In Anwesenheit von Substrat und unter Beleuchtung der Elektrode werden Elektronen von dem Enzym über die Redoxmediatoren zu den QDs übertragen. Der daraus resultierende Photostrom ist abhängig von der Substratkonzentration und erlaubt eine Bestimmung des Fruktose- und Glukosegehalts in Lösung. Ein erster Ansatz mit immobilisierten Redoxmediatoren, d.h. Ferrocencarbonsäure kovalent an PQQ-GDH gebunden und auf QD-modifizierten Goldelektroden immobilisiert, zeigt das Potential photoelektrochemische Signalketten auch ohne Redoxmediatoren in Lösung aufzubauen. Jedoch resultierte dieser Ansatz in einer deutlichen Verschlechterung der Photostromantwort im Vergleich zum Ansatz mit Mediatoren in Lösung. Um die photoelektrochemische Leistungsfähigkeit Redoxmediator-basierter, Licht-schaltbarer Signalketten zu verbessern, wurde ein Osmiumkomplex-Redoxpolymer für die elektronische Kontaktierung zwischen QDs und Enzymen untersucht. Das Redoxpolymer erlaubt eine stabile Immobilisierung des Enzymes und eine effiziente Kontaktierung mit der QD-modifizierten Elektrode. Zusätzlich wurde eine 3D „inverse opale“ TiO2 (IO-TiO2) Elektrode für die Integration der PbS QDs, des Redoxpolymers und der FAD-GDH verwendet um die Elektrodenoberfläche zu vergrößern. Dies führt zu einer deutlich verbesserten Leistungsfähigkeit hinsichtlich der Photostromantwort, des Startpotentials für die Substratoxidation und des Nachweisbereiches für Glukose im Vergleich zu dem Ansatz mit Ferrocencarbonsäure und PQQ-GDH immobilisiert auf CdSe/ZnS QD-modifizierten Goldelektroden. Des Weiteren wurden IO-TiO2 Elektroden verwendet um sulfonierte Polyaniline (PMSA1) und PQQ-GDH zu integrieren und die direkte Interaktion zwischen dem Polymer und dem Enzym für den Licht-schaltbaren Nachweis von Glukose zu untersuchen. Während PMSA1 eine Anregung mit sichtbaren Licht ermöglicht und die effiziente Verbindung zwischen der IO-TiO2-Elektrode und der biokatalytischen Einheit sicherstellt, ermöglicht die PQQ-GDH die Oxidation von Glukose. Hierbei bieten die IO-TiO2-Elektroden mit Poren von ca. 650 nm eine geeignete Schnittstelle und Morphologie, welche für eine stabile und funktionelle Assemblierung des Polymers und Enzyms benötigt wird. Die erfolgreiche Integration des Polymers und des Enzyms kann durch die Ausbildung eines Glukose-abhängigen anodischen Photostroms bestätigt werden. Zusammenfassend gibt diese Arbeit Einblicke in den Aufbau von Photoelektroden und präsentiert verschiedene, effiziente Kopplungsstrategien zwischen Redoxenzymen und photoaktiven Komponenten, welche einen Licht-gesteuerten Nachweis von Analyten ermöglichen und die Grundlage für die Energieerzeugung aus Licht und energiereichen Verbindungen bilden. KW - biocatalysis KW - photocatalysis KW - quantum dots KW - photoelectrochemical sensor KW - enzymes KW - Biokatalyse KW - Photokatalyse KW - Quantum Dots KW - Photoelektrchemischer Sensor KW - Enzyme Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-417280 ER - TY - THES A1 - Nitschke, Felix T1 - Phosphorylation of polyglycans, especially glycogen and starch T1 - Phosphorylierung von Polysacchariden, insbesondere bei Glykogen und Stärke N2 - Functional metabolism of storage carbohydrates is vital to plants and animals. The water-soluble glycogen in animal cells and the amylopectin which is the major component of water-insoluble starch granules residing in plant plastids are chemically similar as they consist of α-1,6 branched α-1,4 glucan chains. Synthesis and degradation of transitory starch and of glycogen are accomplished by a set of enzymatic activities that to some extend are also similar in plants and animals. Chain elongation, branching, and debranching are achieved by synthases, branching enzymes, and debranching enzymes, respectively. Similarly, both types of polyglucans contain low amounts of phosphate esters whose abundance varies depending on species and organs. Starch is selectively phosphorylated by at least two dikinases (GWD and PWD) at the glucosyl carbons C6 and C3 and dephosphorylated by the phosphatase SEX4 and SEX4-like enzymes. In Arabidopsis insufficiency in starch phosphorylation or dephosphorylation results in largely impaired starch turnover, starch accumulation, and often in retardation of growth. In humans the progressive neurodegenerative epilepsy, Lafora disease, is the result of a defective enzyme (laforin) that is functional equivalent to the starch phosphatase SEX4 and capable of glycogen dephosphorylation. Patients lacking laforin progressively accumulate unphysiologically structured insoluble glycogen-derived particles (Lafora bodies) in many tissues including brain. Previous results concerning the carbon position of glycogen phosphate are contradictory. Currently it is believed that glycogen is esterified exclusively at the carbon positions C2 and C3 and that the monophosphate esters, being incorporated via a side reaction of glycogen synthase (GS), lack any specific function but are rather an enzymatic error that needs to be corrected. In this study a versatile and highly sensitive enzymatic cycling assay was established that enables quantification of very small G6P amounts in the presence of high concentrations of non-target compounds as present in hydrolysates of polysaccharides, such as starch, glycogen, or cytosolic heteroglycans in plants. Following validation of the G6P determination by analyzing previously characterized starches G6P was quantified in hydrolysates of various glycogen samples and in plant heteroglycans. Interestingly, glucosyl C6 phosphate is present in all glycogen preparations examined, the abundance varying between glycogens of different sources. Additionally, it was shown that carbon C6 is severely hyperphosphorylated in glycogen of Lafora disease mouse model and that laforin is capable of removing C6 phosphate from glycogen. After enrichment of phosphoglucans from amylolytically degraded glycogen, several techniques of two-dimensional NMR were applied that independently proved the existence of 6-phosphoglucosyl residues in glycogen and confirmed the recently described phosphorylation sites C2 and C3. C6 phosphate is neither Lafora disease- nor species-, or organ-specific as it was demonstrated in liver glycogen from laforin-deficient mice and in that of wild type rabbit skeletal muscle. The distribution of 6-phosphoglucosyl residues was analyzed in glycogen molecules and has been found to be uneven. Gradual degradation experiments revealed that C6 phosphate is more abundant in central parts of the glycogen molecules and in molecules possessing longer glucan chains. Glycogen of Lafora disease mice consistently contains a higher proportion of longer chains while most short chains were reduced as compared to wild type. Together with results recently published (Nitschke et al., 2013) the findings of this work completely unhinge the hypothesis of GS-mediated phosphate incorporation as the respective reaction mechanism excludes phosphorylation of this glucosyl carbon, and as it is difficult to explain an uneven distribution of C6 phosphate by a stochastic event. Indeed the results rather point to a specific function of 6-phosphoglucosyl residues in the metabolism of polysaccharides as they are present in starch, glycogen, and, as described in this study, in heteroglycans of Arabidopsis. In the latter the function of phosphate remains unclear but this study provides evidence that in starch and glycogen it is related to branching. Moreover a role of C6 phosphate in the early stages of glycogen synthesis is suggested. By rejecting the current view on glycogen phosphate to be a stochastic biochemical error the results permit a wider view on putative roles of glycogen phosphate and on alternative biochemical ways of glycogen phosphorylation which for many reasons are likely to be mediated by distinct phosphorylating enzymes as it is realized in starch metabolism of plants. Better understanding of the enzymology underlying glycogen phosphorylation implies new possibilities of Lafora disease treatment. N2 - Pflanzen und Tiere speichern Glukose in hochmolekularen Kohlenhydraten, um diese bei Bedarf unter anderem zur Gewinnung von Energie zu nutzen. Amylopectin, der größte Bestandteil des pflanzlichen Speicherkohlenhydrats Stärke, und das tierische Äquivalent Glykogen sind chemisch betrachtet ähnlich, denn sie bestehen aus verzweigten Ketten, deren Bausteine (Glukosylreste) auf identische Weise miteinander verbunden sind. Zudem kommen in beiden Kohlenhydraten kleine aber ähnliche Mengen von Phosphatgruppen vor, die offenbar eine tragende Rolle in Pflanzen und Tieren spielen. Ist in Pflanzen der Einbau oder die Entfernung von Phosphatgruppen in bzw. aus Stärke gestört, so ist oft der gesamte Stärkestoffwechsel beeinträchtigt. Dies zeigt sich unter anderem in der übermäßigen Akkumulation von Stärke und in Wachstumsverzögerungen der gesamten Pflanze. Beim Menschen und anderen Säugern beruht eine schwere Form der Epilepsie (Lafora disease) auf einer Störung des Glykogenstoffwechsels. Sie wird durch das erblich bedingte Fehlen eines Enzyms ausgelöst, das Phosphatgruppen aus dem Glykogen entfernt. Während die Enzyme, die für die Entfernung des Phosphats aus Stärke und Glykogen verantwortlich sind, hohe Ähnlichkeit aufweisen, ist momentan die Ansicht weit verbreitet, dass der Einbau von Phosphat in beide Speicherkohlenhydrate auf höchst unterschiedliche Weise erfolgt. In Pflanzen sind zwei Enzyme bekannt, die Phosphatgruppen an unterschiedlichen Stellen in Glukosylreste einbauen (Kohlenstoffatome 6 und 3). In Tieren soll eine seltene, unvermeidbare und zufällig auftretende Nebenreaktion eines Enzyms, das eigentlich die Ketten des Glykogens verlängert (Glykogen-Synthase), den Einbau von Phosphat bewirken, der somit als unwillkürlich gilt und weithin als „biochemischer Fehler“ (mit fatalen Konsequenzen bei ausbleibender Korrektur) betrachtet wird. In den Glukosylresten des Glykogens sollen ausschließlich die C-Atome 2 und 3 phosphoryliert sein. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen mittels zweier unabhängiger Methoden, dass Glykogen auch am Glukosyl-Kohlenstoff 6 phosphoryliert ist, der Phosphatposition, die in der Stärke am häufigsten vorkommt. Die Tatsache, dass in dieser Arbeit Phosphat neben Stärke auch erstmals an Glukosylresten von anderen pflanzlichen Kohlenhydraten (wasserlösliche Heteroglykane) nachgewiesen werden konnte, lässt vermuten, dass Phosphorylierung ein generelles Phänomen bei Polysacchariden ist. Des Weiteren wiesen die Ergebnisse darauf hin, dass Phosphat im Glykogen, wie auch in der Stärke, einem bestimmten Zweck dient, der im Zusammenhang mit der Regulation von Kettenverzweigung steht, und dass kein zufälliges biochemisches Ereignis für den Einbau verantwortlich sein kann. Aufgrund der grundlegenden Ähnlichkeiten im Stärke- und Glykogenstoffwechsel, liegt es nahe, dass die Phosphorylierung von Glykogen, ähnlich der von Stärke, ebenfalls durch spezifische Enzyme bewirkt wird. Ein besseres Verständnis der Mechanismen, die der Glykogen-Phosphorylierung zugrunde liegen, kann neue Möglichkeiten der Behandlung von Lafora disease aufzeigen. KW - Stärke KW - Glykogen KW - Phosphorylierung KW - NMR KW - Lafora disease KW - starch KW - glycogen KW - phosphorylation KW - NMR KW - Lafora disease Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-67396 ER - TY - THES A1 - Branscheid, Anja T1 - Phosphate homeostasis and posttranscriptional gene regulation during arbuscular mycorrhizal symbiosis in Medicago truncatula T1 - Phosphat-Homoeostase und posttranskriptionelle Genregulation waehrend der arbuskulaeren Mykorrhiza-Symbiose in Medicago truncatula N2 - Since available phosphate (Pi) resources in soil are limited, symbiotic interactions between plant roots and arbuscular mycorrhizal (AM) fungi are a widespread strategy to improve plant phosphate nutrition. The repression of AM symbiosis by a high plant Pi-status indicates a link between Pi homeostasis signalling and AM symbiosis development. This assumption is supported by the systemic induction of several microRNA399 (miR399) primary transcripts in shoots and a simultaneous accumulation of mature miR399 in roots of mycorrhizal plants. However, the physiological role of this miR399 expression pattern is still elusive and offers the question whether other miRNAs are also involved in AM symbiosis. Therefore, a deep sequencing approach was applied to investigate miRNA-mediated posttranscriptional gene regulation in M. truncatula mycorrhizal roots. Degradome analysis revealed that 185 transcripts were cleaved by miRNAs, of which the majority encoded transcription factors and disease resistance genes, suggesting a tight control of transcriptional reprogramming and a downregulation of defence responses by several miRNAs in mycorrhizal roots. Interestingly, 45 of the miRNA-cleaved transcripts showed a significant differentially regulated between mycorrhizal and non-mycorrhizal roots. In addition, key components of the Pi homeostasis signalling pathway were analyzed concerning their expression during AM symbiosis development. MtPhr1 overexpression and time course expression data suggested a strong interrelation between the components of the PHR1-miR399-PHO2 signalling pathway and AM symbiosis, predominantly during later stages of symbiosis. In situ hybridizations confirmed accumulation of mature miR399 in the phloem and in arbuscule-containing cortex cells of mycorrhizal roots. Moreover, a novel target of the miR399 family, named as MtPt8, was identified by the above mentioned degradome analysis. MtPt8 encodes a Pi-transporter exclusively transcribed in mycorrhizal roots and its promoter activity was restricted to arbuscule-containing cells. At a low Pi-status, MtPt8 transcript abundance inversely correlated with a mature miR399 expression pattern. Increased MtPt8 transcript levels were accompanied by elevated symbiotic Pi-uptake efficiency, indicating its impact on balancing plant and fungal Pi-acquisition. In conclusion, this study provides evidence for a direct link of the regulatory mechanisms of plant Pi-homeostasis and AM symbiosis at a cell-specific level. The results of this study, especially the interaction of miR399 and MtPt8 provide a fundamental step for future studies of plant-microbe-interactions with regard to agricultural and ecological aspects. N2 - Phosphat ist ein essentieller Bestandteil der pflanzlichen Ernährung und ein Mangel führt zu schwerwiegenden Folgen für Wachstum, Entwicklung und Reproduktion der Pflanze. Eine der wichtigsten Strategien, um einen Mangel an löslichem Phosphat im Boden auszugleichen, ist die arbuskuläre Mykorrhiza, einer Wurzelsymbiose zwischen Pflanzen und im Boden lebenden Mykorrhizapilzen. Die Symbiose dient dem gegenseitigen Nährstoffaustausch, der über bäumchenartige Strukturen in Wurzelzellen, den Arbuskeln, realisiert wird. Über ein weit reichendes Netzwerk im Boden verbessert der Pilz die Phosphatversorgung der Pflanzen, wohingegen die Pflanze photosynthetisch erzeugte Zucker zur Verfügung stellt. Ein erhöhter Phosphatgehalt in der Pflanze führt zur Unterdrückung der Symbiose. Da weitestgehend unbekannt ist, wie genau Pflanzen diese Einschränkung der Symbiose regulieren, kann die Erforschung dieses Zusammenhangs einen wichtigen Beitrag für Agrarwirtschaft und Umweltschutz leisten. Im Rahmen dieser Arbeit konnte durch die Entdeckung eines neuen, bisher unbekannten Zielgens aufgezeigt werden, dass die für den Ausgleich des pflanzlichen Phosphathaushalts wichtige Mikro-RNA (miR) 399 auch in der Regulation der arbuskulären Mykorrhizasymbiose von besonderer Bedeutung ist. MiRNAs regulieren die Aktivität von Zielgenen indem sie die jeweiligen Transkripte durch Bindung für den Abbau markieren. In kolonisierten Wurzeln, insbesondere in arbuskelhaltigen Wurzelzellen, konnte eine erhöhte Anhäufung der miR399 beobachtet werden. Durch das Verfahren der Hochdurchsatz-Sequenzierung des Wurzeldegradoms, bei dem alle abgebauten Transkripte analysiert werden, konnte das neue Zielgen der miR399 Familie, MtPT8, identifiziert werden. Dieses codiert für einen Phosphat-Transporter, der diesen Studien zufolge ausschließlich in mykorrhizierten Wurzeln vorkommt und dessen Transkription auf arbuskelhaltige Zellen beschränkt ist. Mit der Identifizierung dieses neuen Zielgens konnte erstmals der Beweis für die direkte Verbindung der pflanzlichen Phosphathomöostase durch miR399 und der arbuskulären Mykorrhizasymbiose gezeigt werden. Die Untersuchung der physiologischen Funktion dieses mykorrhizaspezifischen Phosphat-Transporters bietet die Möglichkeit, die Zusammenhänge der phosphatabhängigen Regulation der Symbiose aufzuklären und weit reichende Einblicke in die Regulationsmechanismen während der Pflanze-Pilz-Interaktion zu erhalten. KW - Mykorrhizasymbiose KW - Phosphat KW - mikroRNA399 KW - Degradom KW - symbiose-relevante mikroRNA-Targets KW - Mycorrhizal symbiosis KW - phosphate KW - microRNA399 KW - degradome KW - symbiosis-relevant microRNA targets Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-62106 ER - TY - THES A1 - Devers, Emanuel T1 - Phosphate homeostasis and novel microRNAs are involved in the regulation of the arbuscular mycorrhizal symbiosis in Medicago truncatula T1 - Die Phosphat-Homöostase und neue mikroRNAs sind in die Regulation der arbuskulären Mykorrhiza in Medicago truncatula involviert N2 - Die arbuskuläre Mykorrhiza ist die wahrscheinlich älteste Form der Wurzelsymbiosen zwischen Pflanzen und Pilzen und hat sich vor 420 Millionen Jahren entwickelt. In dieser Symbiose, die zwischen nahezu allen Landpflanzen und Pilzen des Reiches Glomeromycota ausgebildet wird, versorgt der Pilz die Pflanze mit Nährstoffen, wobei die verbesserte Versorgung mit Phosphat für die Pflanze sicher den größten Vorteil darstellt. Im Gegenzug erhält der Pilz Zucker, welche die Pflanze aus der Photosynthese bereitstellt. Zu hohe Phosphatkonzentrationen im Boden oder Dünger führen allerdings zu einer Verringerung in der Ausprägung der arbuskulären Mykorrhiza. Diese Unterdrückung der Symbiose wird nicht durch eine lokale Reaktion der Wurzeln ausgelöst, sondern in erster Linie durch einen hohen Phosphatgehalt im Pflanzenspross. Somit handelt es sich also um eine systemische, also dem Gesamtsystem „Pflanze“ betreffende Antwort. Die molekularen Mechanismen dieser Anpassung sind noch wenig bekannt und sind vor allem für die Agrarwirtschaft von besonderem Interesse. Eine Mikro-RNA (miRNA) des bereits bekannten Phosphathomöostasesignalwegs (PHR1-miRNA399-PHO2 Signalweg) akkumuliert verstärkt in mykorrhizierten Wurzeln. Das deutet daraufhin, dass dieser Signalweg und diese miRNA eine wichtige Rolle in der Regulation der arbuskulären Mykorrhiza spielen. Ziel dieser Studie war es neue Einblicke in die molekularen Mechanismen, die zur Unterdrückung der arbuskulären Mykorrhiza bei hohen Phosphatkonzentrationen führen, zu gewinnen. Dabei sollte der Einfluss von PHO2, sowie von miRNAs in dieser Symbiose genauer untersucht werden. Ein funktionelles Ortholog von PHO2, MtPho2, wurde in der Pflanze Medicago truncatula identifiziert. MtPho2-Mutanten, welche nicht mehr in der Lage waren ein funktionales PHO2 Protein zu exprimieren, zeigten schnellere Kolonisierung durch den AM-Pilz. Jedoch wurde auch in den mtpho2-Mutanten die Symbiose durch hohe Phosphatkonzentrationen unterdrückt. Dies bedeutet, dass PHO2 und somit der PHR1-miRNA399-PHO2 Signalweg eine wichtige Funktion während der fortschreitenden Kolonisierung der Wurzel durch den Pilz hat, aber und weitere Mechanismen in der Unterdückung der Symbiose bei hohen Phosphatkonzentrationen beteiligt sein müssen. Die Analyse von Transkriptionsprofilen von Spross- und Wurzeln mittels Microarrays zeigte, dass die Unterdrückung der AM Symbiose durch hohe Phosphatkonzentrationen möglicherweise auf eine Unterdrückung der Expression einer Reihe symbiosespezifischer Gene im Spross der Pflanze beruht. Um die Rolle weiterer miRNA in der AM Symbiose zu untersuchen, wurden mittels einer Hochdurchsatz-Sequenzierung 243 neue und 181 aus anderen Pflanzen bekannte miRNAs in M. truncatula entdeckt. Zwei dieser miRNAs, miR5229 und miR160f*, sind ausschließlich während der arbuskulären Mykorrhiza zu finden und weitere miRNAs werden während dieser Symbiose verstärkt gebildet. Interessanterweise führen einige dieser miRNAs zum Abbau von Transkripten, die eine wichtige Funktion in der arbuskulären Mykorrhiza und Wurzelknöllchensymbiose besitzen. Die Ergebnisse dieser Studie liefern eine neue Grundlage für die Untersuchung von regulatorischen Netzwerken, die zur zellulären Umprogrammierung während der Interaktion zwischen Pflanzen und arbuskulären Mykorrhiza-Pilzen bei verschiedenen Phosphatbedingungen führen. N2 - AM symbiosis has a positive influence on plant P-nutrition and growth, but little is known about the molecular mechanism of the symbiosis adaptation to different phosphate conditions. The recently described induction of several pri-miR399 transcripts in mycorrhizal shoots and subsequent accumulation of mature miR399 in mycorrhizal roots indicates that local PHO2 expression must be controlled during symbiosis, presumably in order to sustain AM symbiosis development, in spite of locally increased Pi-concentration. A reverse genetic approach used in this study demonstrated that PHO2 and thus the PHR1-miR399-PHO2 signaling pathway, is involved in certain stages of progressive root colonization. In addition, a transcriptomic approach using a split-root system provided a comprehensive insight into the systemic transcriptional changes in mycorrhizal roots and shoots of M. truncatula in response to high phosphate conditions. With regard to the transcriptional responses of the root system, the results indicate that, although the colonization is drastically reduced, AM symbiosis is still functional at high Pi concentrations and might still be beneficial to the plant. Additionally, the data suggest that a specific root-borne mycorrhizal signal systemically induces protein synthesis, amino acid metabolism and photosynthesis at low Pi conditions, which is abolished at high Pi conditions. MiRNAs, such as miR399, are involved in long-distance signaling and are therefore potential systemic signals involved in AM symbiosis. A deep-sequencing approach identified 243 novel miRNAs in the root tissue of M. truncatula. Read-count analysis, qRT-PCR measurements and in situ hybridizations clearly indicated a regulation of miR5229a/b, miR5204, miR160f*, miR160c, miR169 and miR169d*/l*/m*/e.2* during arbuscular mycorrhizal symbiosis. Moreover, miR5204* represses a GRAS TF, which is specifically transcribed in mycorrhizal roots. Since miR5204* is induced by high Pi it might represent a further Pi status-mediating signal beside miR399. This study provides additional evidence that MtNsp2, a key regulator of symbiosis-signaling, is regulated and presumably spatially restricted by miR171h cleavage. In summary, a repression of mycorrhizal root colonization at high phosphate status is most likely due to a repression of the phosphate starvation responses and the loss of beneficial responses in mycorrhizal shoots. These findings provide a new basis for investigating the regulatory network leading to cellular reprogramming during interaction between plants, arbuscular mycorrhizal fungi and different phosphate conditions. KW - Phosphat KW - miRNA KW - Symbiose KW - Medicago KW - phosphate KW - miRNA KW - symbiosis KW - Medicago Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-55572 ER - TY - THES A1 - Nikolovski, Nino T1 - Pectin: New insights from an old polymer through pectinase-based genetic screens T1 - Pektin: Neue Einblicke in ein altes Polymer durch Pektinase-basierte genetische Screens N2 - Pectic polysaccharides, a class of plant cell wall polymers, form one of the most complex networks known in nature. Despite their complex structure and their importance in plant biology, little is known about the molecular mechanism of their biosynthesis, modification, and turnover, particularly their structure-function relationship. One way to gain insight into pectin metabolism is the identification of mutants with an altered pectin structure. Those were obtained by a recently developed pectinase-based genetic screen. Arabidopsis thaliana seedlings grown in liquid medium containing pectinase solutions exhibited particular phenotypes: they were dwarfed and slightly chlorotic. However, when genetically different A. thaliana seed populations (random T-DNA insertional populations as well as EMS-mutagenized populations and natural variations) were subjected to this treatment, individuals were identified that exhibit a different visible phenotype compared to wild type or other ecotypes and may thus contain a different pectin structure (pec-mutants). After confirming that the altered phenotype occurs only when the pectinase is present, the EMS mutants were subjected to a detailed cell wall analysis with particular emphasis on pectins. This suite of mutants identified in this study is a valuable resource for further analysis on how the pectin network is regulated, synthesized and modified. Flanking sequences of some of the T-DNA lines have pointed toward several interesting genes, one of which is PEC100. This gene encodes a putative sugar transporter gene, which, based on our data, is implicated in rhamnogalacturonan-I synthesis. The subcellular localization of PEC100 was studied by GFP fusion and this protein was found to be localized to the Golgi apparatus, the organelle where pectin biosynthesis occurs. Arabidopsis ecotype C24 was identified as a susceptible one when grown with pectinases in liquid culture and had a different oligogalacturonide mass profile when compared to ecotype Col-0. Pectic oligosaccharides have been postulated to be signal molecules involved in plant pathogen defense mechanisms. Indeed, C24 showed elevated accumulation of reactive oxygen species upon pectinase elicitation and had altered response to the pathogen Alternaria brassicicola in comparison to Col-0. Using a recombinant inbred line population three major QTLs were identified to be responsible for the susceptibility of C24 to pectinases. In a reverse genetic approach members of the qua2 (putative pectin methyltransferase) family were tested for potential target genes that affect pectin methyl-esterification. The list of these genes was determined by in silico study of the pattern of expression and co-expression of all 34 members of this family resulting in 6 candidate genes. For only for one of the 6 analyzed genes a difference in the oligogalacturonide mass profile was observed in the corresponding knock-out lines, confirming the hypothesis that the methyl-esterification pattern of pectin is fine tuned by members of this gene family. This study of pectic polysaccharides through forward and reverse genetic screens gave new insight into how pectin structure is regulated and modified, and how these modifications could influence pectin mediated signalling and pathogenicity. N2 - Pektin Polysaccharide, eine Klasse pflanzlicher Zellwand Polymere, formen eine der komplexesten natürlichen Strukturen. Trotz seiner immensen Bedeutung in der Biologie der Pflanzen sind die Kenntisse über die molekularen Mechanismen der Pektin Biosynthese, dessen Modifikation und Abbau überraschend gering. Eine Möglichkeit neue Einblicke in den pflanzlichen Pektin Metabolismus zu erhalten, ist die Identifizierung von Mutanten mit veränderter Pektinstruktur. Solche Mutanten konnten durch ein neuatiges Selektionsverfahren gefunden werden. Zieht man Keimlinge der Ackerschmalwand (Arabidopsis thaliana) in Flüssigmedium mit Pektinase an, so lässt sich ein typischer Phänotyp beobachten: Die Pflanzen sind kleinwüchsig und leicht chlorotisch. Diesem Verfahren wurden Populationen verschiedener Genotypen (Insertions Linien, EMS Mutanten, natürlich vorkommende Varianten) ausgesetzt. Auf diese Weise wurden Individuen identifiziert, die gegenüber der Pektinase Behandlung eine verminderte oder erhöhte Resistenz aufweisen, was auf eine veränderte Pektinstruktur hindeutet. Die EMS Mutanten wurden einer detaillierten Zellwand Analyse unterzogen. die so in dieser Arbeit identifizierte Kollektion von Mutanten stellt eine wertvolle Ressource für weitere Forschungsansätze zur Regulation, Biosynthese und Modifikation des Pektins dar. Die Lokalisation der Insertionen in den T-DNA Linien führte zur Identifikation interessanter Gene, zu denen der putative Zuckertransporter PEC100 gehört. Dieses Gen steht vermutlich in Verbindung mit der Synthese von Rhamnogalakturonan-I, einem Bestandteil des Pektins. In dieser Arbeit konnte PEC100 im Golgi Apparat, dem Ort der Pektin Biosynthese, lokalisiert werden. Die natürlich vorkommende Variante C24 ist besonders empfindlich gegenüber der Pektinase. Diese Empfindlichkeit konnte anhand rekombinanter Inzucht Linien auf drei bedeutende quantitative Merkmalsloci (QTL) eingegrenzt werden. C24 zeigte zudem ein gegenüber der Referenz verändertes Massenprofil der Oligogalakturonide. Diese werden derzeit als Signalmoleküle in der pflanzlichen Pathogenabwehr diskutiert, was mit der in dieser Arbeit geseigten Resistenz von C24 gegenüber Schwarzfleckigkeit verursachende Pilz (Alternaria brassicicola) korreliert. In einem revers-genetischen Ansatz wurden zudem Mitglieder der Pektin Methyltransferase Familie als potentielle Enzyme getestet, die die Pektin Methylesterifikation beeinflussen könnten. Diese Mutation in einer dieser Methyltransferasen führte zu Veränderungen des Oligogalakturonid Massenprofils. Dies bestätigt die Hypothese, dass Mitglieder dieser Genfamilie an der Regulation der Methylesterifikation von Pektin beteiligt sind. Die vorliegende Studie, in der ein genetishen Selektionverfahren und Methoden der reversen Genetik kombiniert wurden, hat neue Einblicke in die Regulation und Modifikation von Pektin geliefert. KW - Pektin KW - Pektinase KW - genetischer Screen KW - Arabidopsis thaliana KW - Zellwand KW - pectin KW - pectinase KW - genetic screen KW - Arabidopsis thaliana KW - cell wall Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-35255 ER - TY - THES A1 - Breitenstein, Michael T1 - Ortsaufgelöster Aufbau von DNA-Nanostrukturen auf Glasoberflächen T1 - Assembly of DNA nanostructures on glass surfaces N2 - Im Fokus dieser Arbeit stand der Aufbau einer auf DNA basierenden Nanostruktur. Der universelle Vier-Buchstaben-Code der DNA ermöglicht es, Bindungen auf molekularer Ebene zu adressieren. Die chemischen und physikalischen Eigenschaften der DNA prädestinieren dieses Makromolekül für den Einsatz und die Verwendung als Konstruktionselement zum Aufbau von Nanostrukturen. Das Ziel dieser Arbeit war das Aufspannen eines DNA-Stranges zwischen zwei Fixpunkten. Hierfür war es notwendig, eine Methode zu entwickeln, welche es ermöglicht, Funktionsmoleküle als Ankerelemente ortsaufgelöst auf eine Oberfläche zu deponieren. Das Deponieren dieser Moleküle sollte dabei im unteren Mikrometermaßstab erfolgen, um den Abmaßen der DNA und der angestrebten Nanostruktur gerecht zu werden. Das eigens für diese Aufgabe entwickelte Verfahren zum ortsaufgelösten Deponieren von Funktionsmolekülen nutzt das Bindungspaar Biotin-Neutravidin. Mit Hilfe eines Rasterkraftmikroskops (AFM) wurde eine zu einem „Stift“ umfunktionierte Rasterkraftmikroskopspitze so mit der zu deponierenden „Tinte“ beladen, dass das Absetzen von Neutravidin im unteren Mikrometermaßstab möglich war. Dieses Neutravidinmolekül übernahm die Funktion als Bindeglied zwischen der biotinylierten Glasoberfläche und dem eigentlichen Adressmolekül. Das somit generierte Neutravidin-Feld konnte dann mit einem biotinylierten Adressmolekül durch Inkubation funktionalisiert werden. Namensgebend für dieses Verfahren war die Möglichkeit, Neutravidin mehrmals zu deponieren und zu adressieren. Somit ließ sich sequenziell ein Mehrkomponenten-Feld aufbauen. Die Einschränkung, mit einem AFM nur eine Substanz deponieren zu können, wurde so umgangen. Ferner mußten Ankerelemente geschaffen werden, um die DNA an definierten Punkten immobilisieren zu können. Die Bearbeitung der DNA erfolgte mit molekularbiologischen Methoden und zielte darauf ab, einen DNA-Strang zu generieren, welcher an seinen beiden Enden komplementäre Adressequenzen enthält, um gezielt mit den oberflächenständigen Ankerelementen binden zu können. Entsprechend der Geometrie der mit dem AFM erzeugten Fixpunkte und den oligonukleotidvermittelten Adressen kommt es zur Ausbildung einer definierten DNA-Struktur. Mit Hilfe von fluoreszenzmikroskopischen Methoden wurde die aufgebaute DNA-Nanostruktur nachgewiesen. Der Nachweis der nanoskaligen Interaktion von DNA-bindenden Molekülen mit der generierten DNA-Struktur wurde durch die Bindung von PNA (peptide nucleic acid) an den DNA-Doppelstrang erbracht. Diese PNA-Bindung stellt ihrerseits ein funktionales Strukturelement im Nanometermaßstab dar und wird als Nanostrukturbaustein verstanden. N2 - The main aim of this work was the development of a DNA-based nanostructure. The universal four-letter code of DNA allows addressing bonds at the molecular level. The chemical and physical property of DNA makes this macromolecule an ideal candidate as a construction element for nanostructures. The aim of this work was to span a DNA strand between two fixed points. For this purpose it was necessary to develop a method which makes it possible to deposit functional molecules as anchoring elements with highly spatial resolution on a surface. These molecules should be immobilized on the lower micrometer scale to meet the requirements of the desired nanostructure. The method that has been developed for this task, which enables to deposit functional molecules, uses the binding pair biotin-neutravidin. Using the tip of an atomic force microscope (AFM), which can be uses like a pen, it was possible to deposit neutravidin on the lower micrometer scale. This neutravidin molecule is the linking element between the biotinylated glass surface and the actual address molecule. The thus generated neutravidin field could then be functionalized with a biotinylated molecule by incubation. The method has been published as sequential spotting method because it enables a sequential functionalization of neutravidin after it has been deposited. It was so possible to build up a multi-component array. The limitation of being able to deposit only one single substance with an AFM has been circumvented. It also was necessary to create anchor elements in order to immobilize the DNA at defined positions. The processing of the DNA was carried out using molecular biological methods and aimed at generating a DNA strand, which at both ends has a complementary sequence for binding to the surface bound anchor elements. The defined structure is a result of the geometry of the fixed points, generated by the AFM. Using fluorescence microscopy, the constructed DNA nanostructure was detected. The proof of the interaction of DNA-binding molecules with the DNA structure was carried out by the binding of PNA (peptide nucleic acid), which is capable of binding to double stranded DNA. The PNA and its DNA-interaction is a functional building block in the nanometer scale and can be regarded as a promising nanostructure. KW - Nanostruktur KW - DNA KW - Rasterkraftmikroskop KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Oberflächenfunktionalisierung KW - nanostructure KW - DNA KW - atomic force microscope KW - fluorescence microscopy KW - surface chemistry Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-61857 ER - TY - THES A1 - Osterloh-Quiroz, Mandy T1 - Optimierung der Expressionsstärke von fremdstoffmetabolisierenden Enzymen in Bakterien und permanenten Zellkulturen für toxikologische Untersuchungen T1 - Optimization of xenobiotic-metabolizing enzyme expression in bacteria and cell culture for toxicological investigations N2 - Die Enzymsuperfamilie der löslichen Sulfotransferasen (SULT) spielt eine wichtige Rolle in der Phase II des Fremdstoffmetabolismus. Sie katalysieren den Transfer einer Sulfonylgruppe auf nucleophile Gruppen endogener und exogener Substrate. Die Sulfokonjugation von Fremdstoffen erhöht deren Wasserlöslichkeit und behindert die passive Permeation von Zellmembranen. Dadurch wird die Ausscheidung dieser konjugierten Substanzen erleichtert. In Abhängigkeit von der Struktur des Zielmoleküls kann die Sulfokonjugation aber auch zur metabolischen Aktivierung von Fremdstoffen durch die Bildung instabiler Metabolite führen. Die SULT-vermittelte Aktivierung promutagener Substanzen ist somit von toxikologischem Interesse. Für die Detektion SULT-vermittelter Mutagenität mittels bakterieller in-vitro Testsysteme ist die heterologe Expression der fremdstoffmetabolisierenden Enzyme direkt in den Indikatorzellen notwendig. S. typhimurium exprimieren selbst keine SULT, und externe Metabolisierungssysteme sind problematisch, weil die negativ geladenen, kurzlebigen Metabolite nur schlecht die Zellmembran penetrieren können. Die Expression humaner Enyme in Bakterien ist jedoch zum Teil sehr kritisch. So zeigen z.B. sehr ähnliche Enzyme (SULT1A2*1 und *2) deutliche Unterschiede im Expressionsniveau bei exakt gleichen äußeren Bedingungen. Dies erschwert den Vergleich der enzymatischen Aktivitäten dieser Enzyme im in-vitro Testsystem. Andere Enzyme (z.B. SULT2B1b) werden unter Verwendung ihrer Wildtyp-cDNA zum Teil nicht detektierbar exprimiert. Deshalb sollte in dieser Arbeit eine Methode zur Optimierung der heterologen Expression fremdstoffmetabolisierender Enzyme für Genotoxizitätsuntersuchungen etabliert werden. Es wurde bereits gezeigt dass synonyme Codonaustausche am 5’-Ende der humanen SULT1A2-cDNA zu einer Erhöhung der Expression des entsprechenden Enzyms in S. typhimurium führten. Dementsprechend wurden in dieser Arbeit Codonaustausche am 5’-Ende der cDNA verschiedener SULT (1A1*1, 1A2*1, 2B1b) sowie der Ratten Glutathion-S-Transferase Theta 2 (rGSTT2) und dem Reportergen Luciferase durchgeführt. Die Expression der so generierten Konstrukte wurde in verschiedenen S. typhimurium und E. coli Stämmen quantifiziert und die Aktivität der überexprimierten Enzyme im Ames-Test bzw. im Enzym-Aktivitätsassay überprüft. Durch das Einführen seltener Codons in die cDNA konnte die Proteinexpression von SULT1A1*1, SULT1A2*1 und SULT2B1b maximal 7-fach, 18-fach und 100-fach im Vergleich zur Wildtyp-cDNA gesteigert werden. Die Expression der rGSTT2 wurde ebenfalls durch das Einführen seltener Codons erhöht (maximal 5-fach). Bei dem Reportergen Luciferase jedoch führte das Austauschen häufiger Codons gegen seltene Codons zu einer Reduktion der Proteinexpression um 80 %. Die Expression von Fusionsproteinen aus 2B1b (5’-Ende) und Luciferase (3’-Ende) wurde durch das Einführen seltener Codons ebenfalls um 50 % reduziert. Die S. typhimurium Stämme mit optimierter SULT 1A1*1- bzw. 1A2*1-Expression wurden im Ames-Test eingesetzt und zeigten im Vergleich zu den geringer exprimierenden Stämmen eine höhere Sensitivität. Für SULT2B1b konnte keine Mutagenaktivierung im Ames-Test nachgewiesen werden. Allerdings zeigte ein Enzym-Aktivitätsassay mit Dehydroepiandosteron, dass das bakteriell exprimierte Enzym funktionell war. Da in der Literatur der Effekt seltener Codons auf die Expression in Bakterien bisher fast ausschließlich als inhibitorisch beschrieben wurde, sollte die Wirkungsweise der hier beobachteten Expressionserhöhung durch seltene Codons genauer untersucht werden. Dazu wurden verschiedene Konstrukte der SULT1A2*1 und der SULT2B1b, die unterschiedlich viele seltene Codons in verschiedenen Kombinationen besaßen, hergestellt. Es konnten jedoch keine einzelnen Codons, die für die Expressionssteigerung allein verantwortlich waren, identifiziert werden. Die Plasmidkopienzahl in den verschiedenen SULT2B1b-Klonen war konstant und die SULT2B1b-mRNA-Konzentration zeigte nur moderate Schwankungen, die nicht als Ursache für die dramatische Erhöhung der SULT2B1b-Expression in Frage kommen. Die berechnete Stabilität der potentiellen mRNA-Sekundärstrukturen wurde durch die seltenen Codons häufig stark gesenkt und ist als eine mögliche Ursache für die Expressionssteigerung anzusehen. Zusätzlich erhöhten die seltenen Codons den Consensus der Downstream Box zur 16S rRNA, was ebenfalls eine Ursache für die Expressionssteigerung sein kann. In dieser Arbeit konnte somit die Expression der humanen SULT1A1*1, 1A2*1 und der 2B1b sowie der rGSTT2 erfolgreich mittels synonymer Codonaustausche erhöht werden. Die so optimierten S. typhimurium Stämme zeigten im Ames-Test eine erhöhte Sensitivität gegenüber SULT aktivierten Promutagenen bzw. erhöhte Aktivität in spezifischen Enymaktivitätsassays. N2 - The enzyme super familiy of human sulfotransferases (SULT) plays an important role in phase II metabolism of xenobiotics. They catalyze the transfer of a sulfonyl moiety to nucleophilic groups of endogenous and exogenous substrates. Sulfoconjugation of xenobiotics facilitates their excretion by increasing the water solubility and inhibiting passive permeation of cell membranes. Depending on the molecular structure of the substance, sulfonation can also lead to metabolic activation. Highly reactive resonance-stabilized carbenium- and nitrenium-ions that are able to covalently bind to cellular nucleophiles, e.g. DNA, can be formed. Thus, SULT-mediated activation of promutagenic compounds is of toxicological interest. The detection of SULT-mediated mutagenicity in bacterial in-vitro testsystems (e.g. S. typhimurium) requires the heterologous expression of xenobiotic-metabolizing enzymes directly in these indicator cells. S. typhimurium do not express endogenous SULT and external metabolic systems are problematic as penetration of cell membranes is hampered for charged and short-lived metabolites. But the expression of human enzymes in bacteria can be problematic too. SULT1A2*1 and *2 for instance are allelic variants that differ only in two amino acids. However, using the same experimental conditions strong differences in their expression level have been observed. This complicates the comparison of the mutagenic activities of the polymorphic enzymes in the in-vitro test system. Other enzymes (e.g. SULT2B1b) show no detectable expression in bacteria when their genuine cDNA obtained from human tissues is used. Therefore, the aim of this study was to to optimize protein levels of heterologously expressed xenobiotic-metabolizing enzymes in indicator cells for mutagenicity testing. So far it has been shown that synonymous codon-exchanges at the 5’end of human SULT1A2-cDNA led to an enhanced expression of the corresponding enzyme in S. typhimurium. Accordingly, codon-exchanges at the 5’end of SULT1A1*1, -1A2*1, -2B1b, rat glutathione-S-transferase theta 2 (rGSTT2) and the reportergene luciferase were conducted. The expression of the resulting constructs was quantified in S. typhimurium and E. coli using specific antibodies and activity of the overexpressed enzymes was proved by Ames test and enzyme activity assays. The introduction of low-usage codons at the 5’end of SULT1A1*1, -1A2*1 and -2B1b cDNA led to a 7-, 18- and 100-fold increase of expression level, respectively. Expression of rGSTT2 was 5-fold enhanced after the introduction of low-usage codons. In contrast, the introduction of low-usage codons into the luciferase cDNA resulted in a decrease of protein expression up to 80 %. Fusionproteins of SULT2B1b (5’end) and luciferase (3’end) showed a reduction of protein expression about 50 % after the introduction of low-usage codons. S. typhimurium strains with optimized SULT1A1*1 and -1A2*1 expression were used in the Ames test and showed a higher sensitivity compared to the lower expressing strains. For SULT2B1b no mutagen-activation could be detected in the Ames test, but enzyme activity was proved through Dehydroepiandosterone sulfation in vitro. Since an inhibitory effect of low-usage codons on expression in bacteria was described in literature, the enhancement of expression after the introduction of low-usage codons observed in this study was analyzed more in detail. Various constructs of SULT1A2*1 and -2B1b cDNAs containing different numbers and combinations of synonymous low-usage codons were generated. No single codon that was responsible for the enhanced expression could be identified. Plasmid copy number of different SULT2B1b constructs was unchanged and SULT2B1b-mRNA showed only moderate variations that could not explain the strong enhancement of SULT2B1b expression. Calculations suggested that the stability of potential mRNA secondary structures was reduced due to the introduction of low-usage codons. Moreover, the consensus of the downstream box and the 16S rRNA was increased. Both effects probably improved the efficiency of translation and thereby increased the yield of protein expression. In this study the heterologous expression of SULT1A1*1, -1A2*1, -2B1b and rGSTT2 could be enhanced by the introduction of synonymous low-usage codons. The optimized S. typhimurium strains showed higher activities in enzyme assays with specific substrates and an increased sensitivity towards SULT-activated promutagens. KW - Mutagenität KW - Bioaktivierung KW - Sulfotransferasen KW - Codon Usage KW - Mutagenität KW - Bioaktivierung KW - Sulfotransferasen KW - Codon Usage KW - mutagenicity KW - bioactivation KW - sulfotranferases KW - codon usage Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-8945 ER - TY - THES A1 - Ehrlich, Elias T1 - On the role of trade-offs in predator-prey interactions T1 - Trade-offs und ihre Bedeutung in Räuber-Beute Interaktionen N2 - Predation drives coexistence, evolution and population dynamics of species in food webs, and has strong impacts on related ecosystem functions (e.g. primary production). The effect of predation on these processes largely depends on the trade-offs between functional traits in the predator and prey community. Trade-offs between defence against predation and competitive ability, for example, allow for prey speciation and predator-mediated coexistence of prey species with different strategies (defended or competitive), which may stabilize the overall food web dynamics. While the importance of such trade-offs for coexistence is widely known, we lack an understanding and the empirical evidence of how the variety of differently shaped trade-offs at multiple trophic levels affect biodiversity, trait adaptation and biomass dynamics in food webs. Such mechanistic understanding is crucial for predictions and management decisions that aim to maintain biodiversity and the capability of communities to adapt to environmental change ensuring their persistence. In this dissertation, after a general introduction to predator-prey interactions and tradeoffs, I first focus on trade-offs in the prey between qualitatively different types of defence (e.g. camouflage or escape behaviour) and their costs. I show that these different types lead to different patterns of predator-mediated coexistence and population dynamics, by using a simple predator-prey model. In a second step, I elaborate quantitative aspects of trade-offs and demonstrates that the shape of the trade-off curve in combination with trait-fitness relationships strongly affects competition among different prey types: Either specialized species with extreme trait combinations (undefended or completely defended) coexist, or a species with an intermediate defence level dominates. The developed theory on trade-off shapes and coexistence is kept general, allowing for applications apart from defence-competitiveness trade-offs. Thirdly, I tested the theory on trade-off shapes on a long-term field data set of phytoplankton from Lake Constance. The measured concave trade-off between defence and growth governs seasonal trait changes of phytoplankton in response to an altering grazing pressure by zooplankton, and affects the maintenance of trait variation in the community. In a fourth step, I analyse the interplay of different tradeoffs at multiple trophic levels with plankton data of Lake Constance and a corresponding tritrophic food web model. The results show that the trait and biomass dynamics of the different three trophic levels are interrelated in a trophic biomass-trait cascade, leading to unintuitive patterns of trait changes that are reversed in comparison to predictions from bitrophic systems. Finally, in the general discussion, I extract main ideas on trade-offs in multitrophic systems, develop a graphical theory on trade-off-based coexistence, discuss the interplay of intra- and interspecific trade-offs, and end with a management-oriented view on the results of the dissertation, describing how food webs may respond to future global changes, given their trade-offs. N2 - Trophische Interaktionen sind von entscheidender Bedeutung für die Biodiversität in Ökosystemen und die daran gekoppelten Ökosystemfunktionen (z.B. Primärproduktion, Nährstoffkreislauf). Außerdem beeinflussen sie die Evolution und Populationsdynamiken von Arten. Die Wirkungsweise von trophischen Interaktionen auf diese Prozesse hängt dabei von den Trade-offs ab, denen Räuber und Beute z.B. auf Grund physiologischer Beschränkungen unterliegen. Als Trade-off wird die Kosten-Nutzen-Beziehung zwischen zwei oder mehr funktionellen Eigenschaften eines Organismus bezeichnet, so zum Beispiel das Einhergehen einer höheren Verteidigung gegen Fraß mit einer geringeren Konkurrenzfähigkeit um Ressourcen. Solche Trade-offs zwischen Verteidigung und Konkurrenzfähigkeit ermöglichen die Koexistenz von Beutearten mit verschiedenen Strategien (verteidigt oder konkurrenzfähig), was sich stabilisierend auf die gesamten Dynamiken im Nahrungsnetz auswirken kann. Obwohl die Annahme weit verbreitet ist, dass Trade-offs die Koexistenz von Arten fördern, mangelt es am Verständnis und an empirischen Nachweisen, wie sich die Vielzahl unterschiedlich geformter Trade-offs von Arten verschiedener trophischer Ebenen auf die Biodiversität, die Anpassung von funktionellen Eigenschaften und die Biomassedynamik in Nahrungsnetzen auswirkt. Solch ein Verständnis ist jedoch entscheidend für die Vorhersagen und Managemententscheidungen bezüglich des Erhalts von Biodiversität, die das Anpassungspotential von Artengemeinschaften an zukünftige Veränderung in der Umwelt und damit das Überdauern von Artengemeinschaften langfristig sicherstellt. Die hier vorliegende Dissertation startet mit einer kurzen Einführung in die Rolle von Räuber-Beute-Beziehungen und Trade-offs in Ökosystemen. In einem ersten Schritt, lege ich den Fokus zunächst auf Trade-offs in Beutegemeinschaften zwischen qualitativ verschiedenen Verteidigungsmechanismen (z.B. Tarnung oder Fluchtverhalten) und -kosten, und zeige anhand von einfachen Räuber-Beute Modellen, wie sich diese Mechanismen hinsichtlich ihrer Wirkungsweise auf die Koexistenz und die Populationsdynamiken von Beutearten unterscheiden. Als Zweites konzentriert sich die Dissertation dann auf quantitative Aspekte der Trade-offs. So wird aufgezeigt, wie die Form der Trade-off-Kurve bei verschiedenen Beziehungen zwischen funktionellen Eigenschaften und der Fitness den Ausgang von Konkurrenzprozessen innerhalb von Beutegemeinschaften beeinflusst. Dabei kann es in Abhängigkeit von der Form der Trade-off-Kurve entweder zu Koexistenz von spezialisierten Arten kommen (unverteidigt oder komplett verteidigt) oder aber zur Dominanz einer Art mit mittlerer Verteidigung. Der dritte Schwerpunkt dieser Arbeit liegt dann auf dem Test der Theorie zur Trade-off-Kurve und Koexistenz anhand von Langzeitfelddaten des Phytoplanktons im Bodensee. Es zeigt sich hierbei, dass der gefundene konkave Trade-off zwischen Verteidung und Wachstumsrate in Kombination mit einem sich verändernden Fraßdruck durch das Zooplankton die Anpassung von funktionellen Eigenschaften und den Erhalt von Variation dieser Eigenschaften innerhalb der Phytoplanktongemeinschaft steuert. In einem vierten Schritt, analysiere ich das Zusammenspiel von Trade-offs auf mehreren trophischen Ebenen, basierend auf Phyto- und Zooplanktondaten aus dem Bodensee und einem dafür entwickelten tritrophischen Nahrungsnetzmodell. Die Ergebnisse zeigen, dass die Dynamiken der funktionellen Eigenschaften und Biomassen durch eine Kaskade über die drei trophischen Ebenen hinweg gekoppelt sind, die zu unintuitiven Mustern in den Anpassungen der funktionellen Eigenschaften zwischen den Ebenen führt. In der generellen Diskussion bringe ich \textit{abschließend} die Ideen zur Wirkung von Trade-offs in multitrophischen System in einen breiteren Kontext. Zudem entwickle ich eine generelle graphische Theorie zur Trade-off basierten Koexistenz in Abhängigkeit von der Fitnesslandschaft, diskutiere das mögliche Zusammenspiel von intra- und interspezifischen Trade-offs, und gebe schlussendlich einen Management-orientierten Einblick in die Relevanz der Ergebnisse dieser Dissertation für das Verhalten von Nahrungsnetzen im Zuge des Globalen Wandels unter der Wirkung von Trade-offs. KW - trade-offs between functional traits KW - predator-prey dynamics KW - food web KW - coexistence KW - trait variation KW - theoretical ecology KW - phytoplankton and zooplankton KW - Trade-offs zwischen funktionellen Eigenschaften KW - Räuber-Beute Dynamiken KW - Nahrungsnetz KW - Koexistenz KW - Variation in funktionellen Eigenschaften KW - theoretische Ökologie KW - Phytoplankton und Zooplankton Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-430631 ER - TY - THES A1 - Winck, Flavia Vischi T1 - Nuclear proteomics and transcription factor profiling in Chlamydomonas reinhardtii T1 - Nukleare Proteomics und Transkriptionsfaktoren : Profiling in Chlamydomonas reinhardtii N2 - The transcriptional regulation of the cellular mechanisms involves many different components and different levels of control which together contribute to fine tune the response of cells to different environmental stimuli. In some responses, diverse signaling pathways can be controlled simultaneously. One of the most important cellular processes that seem to possess multiple levels of regulation is photosynthesis. A model organism for studying photosynthesis-related processes is the unicellular green algae Chlamydomonas reinhardtii, due to advantages related to culturing, genetic manipulation and availability of genome sequence. In the present study, we were interested in understanding the regulatory mechanisms underlying photosynthesis-related processes. To achieve this goal different molecular approaches were followed. In order to indentify protein transcriptional regulators we optimized a method for isolation of nuclei and performed nuclear proteome analysis using shotgun proteomics. This analysis permitted us to improve the genome annotation previously published and to discover conserved and enriched protein motifs among the nuclear proteins. In another approach, a quantitative RT-PCR platform was established for the analysis of gene expression of predicted transcription factor (TF) and other transcriptional regulator (TR) coding genes by transcript profiling. The gene expression profiles for more than one hundred genes were monitored in time series experiments under conditions of changes in light intensity (200 µE m-2 s-1 to 700 µE m-2 s-1), and changes in concentration of carbon dioxide (5% CO2 to 0.04% CO2). The results indicate that many TF and TR genes are regulated in both environmental conditions and groups of co-regulated genes were found. Our findings also suggest that some genes can be common intermediates of light and carbon responsive regulatory pathways. These approaches together gave us new insights about the regulation of photosynthesis and revealed new candidate regulatory genes, helping to decipher the gene regulatory networks in Chlamydomonas. Further experimental studies are necessary to clarify the function of the candidate regulatory genes and to elucidate how cells coordinately regulate the assimilation of carbon and light responses. N2 - Pflanzen nutzen das Sonnenlicht um Substanzen, sogenannte Kohlenhydrate, zu synthetisieren. Diese können anschließend als Energielieferant für das eigene Wachstum genutzt werden. Der aufbauende Prozess wird als Photosynthese bezeichnet. Ein wichtiges Anliegen ist deshalb zu verstehen, wie Pflanzen äußere Einflüsse wahrnehmen und die Photosynthese dementsprechend regulieren. Ihre Zellen tragen diese Informationen in den Genen. Die Pflanzen nutzen aber in der Regel nicht alle ihre Gene gleichzeitig, die sie zur Anpassung an Umwelteinflüsse besitzen. Zu meist wird nur eine Teilfraktion der gesamten Information benötigt. Wir wollten der Frage nachgehen, welche Gene die Zellen für welche Situation regulieren. Im Zellkern gibt es Proteine, sogenannte Transkriptionsfaktoren, die spezifische Gene finden können und deren Transkription modulieren. Wenn ein Gen gebraucht wird, wird seine Information in andere Moleküle übersetzt (transkribiert), sogenannte Transkripte. Die Information dieser Transkripte wird benutzt um Proteine, Makromoleküle aus Aminsäuren, zu synthetisieren. Aus der Transkription eines Gens kann eine große Zahl des Transkripts entstehen. Es ist wahrscheinlich, dass ein Gen, dass gerade gebraucht wird, mehr Transkriptmoleküle hat als andere Gene. Da die Transkriptionsfaktoren mit der Transkription der Gene interferieren können, entwickelten wir in der vorliegenden Arbeit Strategien zur Identifikation dieser im Zellkern zu findenden Proteine mittels eines „Proteomics“-Ansatzes. Wir entwickelten weiterhin eine Strategie zur Identififikation von Transkripten Transkriptionsfaktor-codierender Gene in der Zelle und in welche Menge sie vorkommen. Dieser Ansatz wird als „Transcript-Profiling“ bezeichnet. Wir fanden Zellkern-lokalisierte Proteine, die als Signalmoleküle funktionieren könnten und Transkripte, die bei unterschiedlichen Umweltbedingungen in der Zelle vorhanden waren. Wir benutzten, die oben genannten Ansätze um die einzellige Grünalge Chlamydomonas zu untersuchen. Die Informationen, die wir erhielten, halfen zu verstehen welche Transkriptionsfaktoren notwendig sind, damit Chlamydomonas bei unterschiedlichen Umweltbedingungen, wie z.B. unterschiedliche Lichtintensitäten und unterschiedlicher Konzentration von Kohlenstoffdioxid, überlebt. KW - Proteomics KW - Transkriptionsfaktoren KW - Pflanzen KW - Chlamydomonas KW - Transcriptomics KW - Proteomics KW - Transcription factors KW - Plants KW - Chlamydomonas KW - Transcriptomics Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-53909 ER - TY - THES A1 - Czechowski, Tomasz T1 - Nitrogen signalling in Arabidopsis thaliana T1 - Stickstoff Signalling in Arabidopsis thaliana N2 - Nitrogen is an essential macronutrient for plants and nitrogen fertilizers are indispensable for modern agriculture. Unfortunately, we know too little about how plants regulate their use of soil nitrogen, to maximize fertilizers-N use by crops and pastures. This project took a dual approach, involving forward and reverse genetics, to identify N-regulators in plants, which may prove useful in the future to improve nitrogen-use efficiency in agriculture. To identify nitrogen-regulated transcription factor genes in Arabidopsis that may control N-use efficiency we developed a unique resource for qRT-PCR measurements on all Arabidpsis transcription factor genes. Using closely spaced, gene-specific primer pairs and SYBR® Green to monitor amplification of double-stranded DNA, transcript levels of 83% of all target genes could be measured in roots or shoots of young Arabidopsis wild-type plants. Only 4% of reactions produced non-specific PCR products, and 13% of TF transcripts were undetectable in these organs. Measurements of transcript abundance were quantitative over six orders of magnitude, with a detection limit equivalent to one transcript molecule in 1000 cells. Transcript levels for different TF genes ranged between 0.001-100 copies per cell. Real-time RT-PCR revealed 26 root-specific and 39 shoot-specific TF genes, most of which have not been identified as organ-specific previously. An enlarged and improved version of the TF qRT-PCR platform contains now primer pairs for 2256 Arabidopsis TF genes, representing 53 gene families and sub-families arrayed on six 384-well plates. Set-up of real-time PCR reactions is now fully robotized. One researcher is able to measure expression of all 2256 TF genes in a single biological sample in a just one working day. The Arabidopsis qRT-PCT platform was successfully used to identify 37 TF genes which transcriptionaly responded at the transcriptional level to N-deprivation or to nitrate per se. Most of these genes have not been characterized previously. Further selection of TF genes based on the responses of selected candidates to other macronutrients and abiotic stresses allowed to distinguish between TFs regulated (i) specifically by nitrogen (29 genes) (ii) regulated by general macronutrient or by salt and osmotic stress (6 genes), and (iii) responding to all major macronutrients and to abiotic stresses. Most of the N-regulated TF genes were also regulated by carbon. Further characterization of sixteen selected TF genes, revealed: (i) lack of transcriptional response to organic nitrogen, (ii) two major types of kinetics of induction by nitrate, (iii) specific responses for the majority of the genes to nitrate but not downstream products of nitrate assimilation. All sixteen TF genes were cloned into binary vectors for constitutive and ethanol inducible over expression, and the first generation of transgenic plants were obtained for almost all of them. Some of the plants constitutively over expressing TF genes under control of the 35S promoter revealed visible phenotypes in T1 generation. Homozygous T-DNA knock out lines were also obtained for many of the candidate TF genes. So far, one knock out line revealed a visible phenotype: retardation of flowering time. A forward genetic approach using an Arabidopsis ATNRT2.1 promoter : Luciferase reporter line, resulted in identification of eleven EMS mutant reporter lines affected in induction of ATNRT2.1 expression by nitrate. These lines could by divided in the following classes according to expression of other genes involved in primary nitrogen and carbon metabolism: (i) lines affected exclusively in nitrate transport, (ii) those affected in nitrate transport, acquisition, but also in glycolysis and oxidative pentose pathway, (iii) mutants affected moderately in nitrate transport, oxidative pentose pathway and glycolysis but not in primary nitrate assimilation. Thus, several different N-regulatory genes may have been mutated in this set of mutants. Map-based cloning has begun to identify the genes affected in these mutants. N2 - Stickstoff ist einer der wichtigsten Makroelemente in der Natur und sein eingeschränktes Vorkommen ist häufig ein limitierender Faktor für pflanzliches Wachstum. In der Landwirtschaft eingesetzte Stickstoff-Dünger werden häufig nicht vollständig von Getreide- oder anderen kultivierten Pflanzen genutzt, sondern in die umliegenden Gewässer oder das Grundwasser ausgewaschen. Das Verständnis von pflanzlichen Signalprozessen kann helfen, Stickstoffaufnahme und -assimilation zu kontrollieren und somit den Einsatz von stickstoffhaltigen Düngemitteln in der Landwirtschaft zu reduzieren. Die meisten der in den pflanzlichen Stickstoffstoffwechsel involvierten Gene werden auf Transkriptionsebene reguliert. Dies geschieht durch sogenannte Transkriptionsfaktoren (TFs), Proteine, die von Genen anderer Genfamilien kodiert werden. Im Rahmen dieser Promotion wurde eine einzigartige und neue Ressource zur Quantifizierung der Expressionsniveaus solcher Transkriptionsfaktoren der Modellpflanze Arabidopsis thaliana entwickelt und getestet. Dabei konnte die beispiellose Robustheit, Genauigkeit und Präzision dieser PCR-basierten Methode gezeigt werden. Mit Hilfe dieses experimentellen Aufbaus wurden Transkriptionsfaktoren, potentielle Regulatoren von Genen, die in Stickstoffmetabolismus involviert sind, identifiziert und charakterisiert. Um die Funktionsweise dieser Gene besser zu verstehen, wurden transgene Pflanzen erzeugt und identifiziert, die entweder erhöhte oder chemisch induzierbare Transkription und/oder einen partiellen oder vollständigen Verlust der Aktivität dieser Gene aufweisen. Die Analyse der Transkriptionsfaktoren, die unter die Kontrolle eines induzierbaren Promoters gestellt wurden, soll helfen, die genauen Zielgene dieser TFs zu identifizieren und ihre Rolle im Stickstoffmetabolismus zu erklären. Darüber hinaus bieten sie die Chance, Hierarchieebenen innerhalb der verschiedenen TFs zu erkennen. Überexpression von Transkriptionsfaktoren kann zur Generierung von Phänotypen führen, die von direktem biotechnologischen Interesse sind, wie z.B. Pflanzen mit erhöhtem Stickstoffgehalt (Aminosäuregehalt), die besser an Situationen mit Stickstoffmangel angepasst sind. Neben diesen Transkriptionsfaktoren wurden allerdings auch Mutanten mit einem genetischen Defekt in einem der wichtigsten Gene, das für den Nitrattransport in Wurzeln von Arabidopsis verantwortlich ist, identifiziert. KW - Stickstoff KW - Schmalwand KW - Transkriptionsfaktor KW - qRT-PCR KW - Nitrogen KW - Arabidopsis KW - Transcription facotrs KW - qRT-PCR Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-5445 ER - TY - THES A1 - Castro Marin, Inmaculada T1 - Nitrate: metabolism and development T1 - Charakterisierung der Glutamatdehydrogenase-Familie, einem Schlüsselenzym der Kohlenstoff-Stickstoffinteraktion von Metaboliten und Studie der Regulierung der Blütezeit durch Stickstoff BT - characterization of the glutamate dehydrogenase (GDH) family, an enzyme at the cross-roads of carbon-nitrogen interaction metabolites and study of the regulation of flowering by nitrogen N2 - The major aim of this thesis was to study the effect of nitrate on primary metabolism and in development of the model plant Arabidopsis thaliana. The present work has two separate topics. First, to investigate the GDH family, a small gene family at the interface between nitrogen and carbon metabolisms. Second, to investigate the mechanisms whereby nitrogen is regulating the transition to flowering time in Arabidopsis thaliana. To gain more insights into the regulation of primary metabolism by the functional characterization of the glutamate dehydrogenase (GDH) family, an enzyme putatively involved in the metabolism of amino acids and thus suggested to play different and essential roles in carbon and nitrogen metabolism in plants, knock out mutants and transgenic plants carrying RNA interference construct were generated and characterized. The effect of silencing GDH on carbon and nitrogen metabolisms was investigated, especially the level of carbohydrates and the amino acid pool were further analysed. It has been shown that GDH expression is regulated by light and/or sugar status therefore, phenotypic and metabolic analysis were developed in plants grown at different points of the diurnal rhythm and in response to an extended night period. In addition, we are interested in the effect of nutrient availability in the transition from vegetative growth to flowering and especially in nitrate as a metabolite that triggers widespread and coordinated changes in metabolism and development. Nutrient availability has a dramatic effect on flowering time, with a marked delay of flowering when nitrate is supplied (Stitt, 1999). The use of different mutants and transgenic plants impaired in flowering signalling pathways was crucial to evaluate the impact of different nitrate concentrations on flowering time and to better understand the interaction of nitrate-dependent signals with other main flowering signalling pathways. Plants were grown on glutamine as a constitutive source of nitrogen, and the nitrate supply varied. Low nitrate led to earlier flowering. The response to nitrate is accentuated in short days and in the CONSTANS deficient co2 mutant, whereas long days or overexpression of CONSTANS overrides the nitrate response. These results indicate that nitrates acts downstream of the known flowering signalling pathways for photoperiod, autonomy, vernalization and gibberellic acid. Global analyses of gene expression of two independent flowering systems, a light impaired mutant (co2tt4) and a constitutive over-expresser of the potent repressor of flowering (35S::FLC), were to be investigated under two different concentrations of nitrate in order to identify candidate genes that may be involved in the regulation of flowering time by nitrate. N2 - Das Hauptziel dieser Doktorarbeit war die Untersuchung des Effekts von Stickstoff auf den Primärmetabolisms und auf die Entwicklung der Modellpflanze Arabidopsis thaliana. Die vorliegende Arbeit hat zwei Unterthemen: Auf der einen Seite wurde die GDH Familie untersucht, eine kleine Genfamilie an der Schnittstelle zwischen Stick –und Kohlenstoffmetabolismus. Auf der anderen Seite wurde der Mechanismus, bei dem Stickstoff die Blütezeit in Arabidopsis thaliana kontrolliert, untersucht. Um einen tieferen Einblick in die Regulierung des Primärmetabolismus zu erhalten, wurde eine funktionelle Charakterisierung der Glutamatdehydrogenase-Familie (GDH) mit Hilfe von knock-out Mutanten und transgenen Pflanzen, die ein RNA Interferenzkonstrukt tragen, durchgeführt. GDH ist höchstwahrscheinlich am Aminosäuremetabolismus beteiligt, wobei vermutet wird, dass es verschiedene wichtige Aufgaben im Pflanzenkohlen –und stickstoffmetabolismus übernimmt. Dabei wurde der Effekt des GDH Silencing auf den Kohlen- sowie Stickstoffmetabolismus untersucht und insbesondere die Anteile von Kohlenhydraten und Aminosäuren eingehend analysiert. In vorhergehenden Studien zeigte sich, dass die GDH-Expression durch Licht und/oder die Zuckerverfügbarkeit reguliert wird. Deshalb wurden phenotypische und metabolische Analysen an Pflanzen entwickelt, die zu verschiedenen Zeitpunkten des diurnalen Rhythmus und nach einer längeren Nachtperiode gezüchtet wurden. Ausserdem interesssiert uns der Effekt der Nährstoffverfügbarkeit im Übergang vom vegetativen Wachstum zur Blüte, und vor allen Dingen Nitrat als Metabolit, welches weitreichende und koordinierte Veränderungen im Metabolismus und in der Entwicklung hervorruft. Die Nährstoffverfügbarkeit hat einen dramatischen Effekt auf die Blütezeit, insbesondere führt eine Nitratzugabe zu einer deutlichen Verzögerung der Blüte (Stitt, 1999). Der Einsatz von verschiedenen Mutanten und transgenen Pflanzen, die eine Blockade im Blüte-Signalweg aufwiesen, war ausschlaggebend, um den Einfluss von unterschiedlichen Nitratkonzentrationen auf die Blütezeit zu beurteilen, und um zu einem besserem Verständnis des Zusammenspiels von nitratabhängigen Signalen und anderen Blüte-Signalwegen zu gelangen. Die Pflanzen wuchsen auf Glutamin, das als konstitutive Stickstoffquelle diente, wobei die Nitratversorgung variierte. Niedriger Nitratanteil führte zu einer früheren Blüte. Bei kurzer Tageslänge und bei CONSTANS defizienten Mutanten (co2) ist die Reaktion auf Nitratzugabe erhöht, wohingegen bei fortgeschrittener Tageslänge oder bei Überexpression von CONSTANS die Reaktion auf Nitrat unterbleibt. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass Nitrat unterhalb der bekannten Blüte-Signalwege für Photoperiode, Autonomie, Vernalisierung und Gibberelinsäure fungiert. Globale Expressionsanalysen von zwei unterschiedlichen Blütensystemen, eine licht-unempfindliche Mutante (co2tt4) und eine Mutante mit konstitutiver Expression eines potentiellen Blüte-Repressors (35S::FLC), wurden bei zwei verschiedenen Nitratkonzentrationen durchgeführt, um Kandidatengene zu identifizieren, die eine wichtige Rolle in der Regulation der Blütezeit durch Nitrat spielen könnten. KW - Nitrat KW - Stoffwechsel KW - Entwicklung KW - Arabidopsis thaliana KW - Nitrate KW - Metabolism KW - Development KW - Arabidopsis thaliana Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-18827 ER - TY - THES A1 - Niedl, Robert Raimund T1 - Nichtlineare Kinetik und responsive Hydrogele für papierbasierte Schnelltestanwendungen T1 - Nonlinear kinetics and responsive hydrogels for paperbased point-of-care diagnostics N2 - Viele klinische Schnelltestsysteme benötigen vorpräparierte oder aufgereinigte Analyte mit frisch hergestellten Lösungen. Fernab standardisierter Laborbedingungen wie z.B. in Entwicklungsländern oder Krisengebieten sind solche Voraussetzungen oft nur unter einem hohen Aufwand herstellbar. Zusätzlich stellt die erforderliche Sensitivität die Entwicklung einfach zu handhabender Testsysteme vor große Herausforderungen. Autokatalytische Reaktionen, die sich mit Hilfe sehr geringer Initiatorkonzentrationen auslösen lassen, können hier eine Perspektive für Signalverstärkungsprozesse bieten. Aus diesem Grund wird im ersten Teil der vorliegenden Arbeit das Verhalten der autokatalytischen Arsenit-Jodat-Reaktion in einem mikrofluidischen Kanal untersucht. Dabei werden insbesondere die diffusiven und konvektiven Einflüsse auf die Reaktionskinetik im Vergleich zu makroskopischen Volumenmengen betrachtet. Im zweiten Teil werden thermoresponsive Hydrogele mit einem kanalstrukturierten Papiernetzwerk zu einem neuartigen, kapillargetriebenen, extern steuerbaren Mikrofluidik-System kombiniert. Das hier vorgestellte Konzept durch Hydrogele ein papierbasiertes LOC-System zu steuern, ermöglicht zukünftig die Herstellung von komplexeren, steuerbaren Point-Of-Care Testsystemen (POCT). Durch z.B. einen thermischen Stimulus, wird das Lösungsverhalten eines Hydrogels so verändert, dass die gespeicherte Flüssigkeit freigesetzt und durch die Kapillarkraft des Papierkanals ins System transportiert wird. Die Eigenschaften dieses Gelnetzwerks können dabei so eingestellt werden, dass eine Freisetzung von Flüssigkeiten sogar bei Körpertemperatur möglich wäre und damit eine Anwendung gänzlich ohne weitere Hilfsmittel denkbar ist. Für die Anwendung notwendige Chemikalien oder Enzyme lassen sich hierbei bequem in getrocknetem Zustand im Papiersubstrat vorlagern und bei Bedarf in Lösung bringen. Im abschließenden dritten Teil der Arbeit wird ein durch Hydrogele betriebener, Antikörper-basierter Mikroorganismenschnelltest für Escherichia coli präsentiert. Darüber hinaus wird weiterführend eine einfache Methode zur Funktionalisierung eines Hydrogels mit Biomolekülen über EDC/NHS-Kopplung vorgestellt. N2 - Many test systems for clinical applications require well-prepared or purified analytes. Far away from a laboratory environment, for example in developing countries or crisis regions, such prerequisites are often difficult to establish. Furthermore, the required sensitivity poses a considerable challenge for the development of easy-to-use test systems. . Autocatalytic reactions, which are which are highly sensitive to small initiator concentrations, may offer promising solutions to this problem. For this reason, in the first part of this thesis, the behavior of the autocatalytic arsenit-iodate-clock reaction is studied in a microfluidic environment. Especially the influence of diffusive and convective effects on the kinetics of the reaction were examined and compared to reaction conditions in macroscopic volumes. In the second part thermoresponsive hydrogels and a microstructured papersubstrate are combined to a externally controllable, new microfluidic system driven by capillary force. This offers new opportunities to integrate more complex analytic procedures in small point-of-care devices. For example, initiated by a thermal stimulus, the solubility of the hydrogel network is changed, so that the stored liquid is released and transported into the paper device, driven by capillary forces. The properties of thermoresponsive hydrogels can be tuned in such a way that the liquid release is triggered already by body temperature, so that no pumps or tubings are required anymore for usage. Furthermore chemicals and enzymes can be stored in the paper channels under dried conditions for a long time. Upon operation of the device, they can be taken up by the liquid released from the hydrogel reservoirs when needed. Finally, in the third part of this work, a rapid, easy-to-use hydrogel-driven test system for Escherichia coli is presented, based on an antibody assay. Futhermore a simple method for biofunctionalization of a hydrogel of a hydrogel based on EDC/NHS coupling will be introduced. KW - Hydrogel KW - papierbasiert KW - Mikrofluidik KW - HPµF KW - POCT KW - Pathogenerkennung KW - thermoresponsive KW - hydrogel KW - paperbased KW - POCT KW - nonlinear KW - chemical clock KW - biomolecule KW - functionalization Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-77735 ER -