TY - THES A1 - Mogrovejo Arias, Diana Carolina T1 - Assessment of the frequency and relevance of potentially pathogenic phenotypes in microbial isolates from Arctic environments N2 - The Arctic environments constitute rich and dynamic ecosystems, dominated by microorganisms extremely well adapted to survive and function under severe conditions. A range of physiological adaptations allow the microbiota in these habitats to withstand low temperatures, low water and nutrient availability, high levels of UV radiation, etc. In addition, other adaptations of clear competitive nature are directed at not only surviving but thriving in these environments, by disrupting the metabolism of neighboring cells and affecting intermicrobial communication. Since Arctic microbes are bioindicators which amplify climate alterations in the environment, the Arctic region presents the opportunity to study local microbiota and carry out research about interesting, potentially virulent phenotypes that could be dispersed into other habitats around the globe as a consequence of accelerating climate change. In this context, exploration of Arctic habitats as well as descriptions of the microbes inhabiting them are abundant but microbial competitive strategies commonly associated with virulence and pathogens are rarely reported. In this project, environmental samples from the Arctic region were collected and microorganisms (bacteria and fungi) were isolated. The clinical relevance of these microorganisms was assessed by observing the following virulence markers: ability to grow at a range of temperatures, expression of antimicrobial resistance and production of hemolysins. The aim of this project is to determine the frequency and relevance of these characteristics in an effort to understand microbial adaptations in habitats threatened by climate change. The isolates obtained and described here were able to grow at a range of temperatures, in some cases more than 30 °C higher than their original isolation temperature. A considerable number of them consistently expressed compounds capable of lysing sheep and bovine erythrocytes on blood agar at different incubation temperatures. Ethanolic extracts of these bacteria were able to cause rapid and complete lysis of erythrocyte suspensions and might even be hemolytic when assayed on human blood. In silico analyses showed a variety of resistance elements, some of them novel, against natural and synthetic antimicrobial compounds. In vitro experiments against a number of antimicrobial compounds showed resistance phenotypes belonging to wild-type populations and some non-wild type which clearly denote human influence in the acquisition of antimicrobial resistance. The results of this project demonstrate the presence of virulence-associated factors expressed by microorganisms of natural, non-clinical environments. This study contains some of the first reports, to the best of our knowledge, of hemolytic microbes isolated from the Arctic region. In addition, it provides additional information about the presence and expression of intrinsic and acquired antimicrobial resistance in environmental isolates, contributing to the understanding of the evolution of relevant pathogenic species and opportunistic pathogens. Finally, this study highlights some of the potential risks associated with changes in the polar regions (habitat melting and destruction, ecosystem transition and re-colonization) as important indirect consequences of global warming and altered climatic conditions around the planet. N2 - Die Arktis ist ein reiches und dynamisches Ökosystem, welches von Mikroorganismen dominiert wird, die unter extremen Bedingungen überleben und funktionieren können. Eine Reihe physiologischer Anpassungen ermöglichen es der Mikrobiota, in diesem Lebensraum zu überdauern niedrige Temperaturen, geringe Wasser- und Nährstoffverfügbarkeit, hohe UV-Strahlung, usw. standzuhalten. Andere Fähigkeiten zielen darauf ab, sich einen Konkurrenzvorteil zu verschaffen, indem sie mit antimikrobiellen Substanzen benachbarte Mikroorganismen stören und die intermikrobielle Kommunikation beeinflussen. Arktische Mikroorganismen sind Bioindikatoren, die Klimaveränderungen anzeigen können. Die Arktis bietet Möglichkeiten, die lokale Mikrobiota zu untersuchen, um Rückschlüsse auf den Klimawandel zu ziehen. Insbesondere Forschung über potenziell pathogene Phänotypen, die infolge der Beschleunigung des Klimawandels in andere Lebensräume auf der ganzen Welt verteilt werden könnten, ist hier von herausragender Bedeutung. In diesem Zusammenhang gibt es zahlreiche Untersuchungen zur Erforschung arktischer Lebensräume sowie Beschreibungen der in ihnen lebenden Mikroben, während über bakterielle Konkurrenzstrategien, die üblicherweise mit Virulenz und Krankheitserregern verbunden sind, bisher wenig geforscht wurde. In diesem Projekt wurden Umweltproben aus der Arktis entnommen und Bakterien und Pilze isoliert. Die klinische Relevanz dieser Mikroorganismen wurde durch Untersuchung der folgenden Virulenzmarker bewertet: Fähigkeit, in einem bestimmten Temperaturbereich zu wachsen, Expression von Antibiotikaresistenz und Produktion von Hämolysinen. Ziel dieses Projekts war es, das Vorkommen dieser Eigenschaften zu bestimmen, um die mikrobiellen Anpassungen in vom Klimawandel bedrohten Lebensräumen zu verstehen. Die beschriebenen Bakterienisolate konnten in einem relevanten Temperaturbereich wachsen, in einigen Fällen von mehr als 30 °C höher als ihre ursprüngliche Isolationstemperatur. Eine beträchtliche Anzahl der Isolate exprimierte konsistent Verbindungen, die Schaf- und Rindererythrozyten auf Blutagar bei verschiedenen Inkubationstemperaturen lysieren können. Die Extrakte einiger dieser Bakterien konnten eine schnelle und vollständige Lyse von Schaf- und Rindererythrozytensuspensionen verursachen und sind möglicherweise sogar hämolytisch gegenüber humanem Blut. Darüber hinaus zeigten Genomanalysen eine Vielzahl von Resistenzgenen gegen natürliche und synthetische antimikrobielle Verbindungen, einige neuartige. In-vitro-Experimente zeigten, dass einige Resistenzphänotypen zu Wildtyp-Populationen während andere zu Nicht-Wildtyp gehören, was auf einen menschlichen Einfluss auf den Erwerb von Antibiotikaresistenzen in der Umwelt eindeutig hindeutet. Die Ergebnisse dieses Projekts zeigen das Vorhandensein von Virulenz-assoziierten Faktoren, die von Mikroorganismen natürlicher, nicht klinischer Umgebungen exprimiert werden. Diese Studie enthält nach unserem besten Wissen einige der ersten Berichte über hämolytische Mikroben, die aus der Arktis isoliert wurden. Darüber hinaus liefert es zusätzliche Informationen über das Vorhandensein und die Expression von intrinsischer und erworbener antimikrobieller Resistenz in Umweltisolaten und trägt zum Verständnis der Entwicklung relevanter pathogener Spezies und opportunistischer Pathogene bei. Schließlich beleuchtet diese Studie einige der potenziellen Risiken, die mit Veränderungen in den Polarregionen (Schmelzen und Zerstörung des Lebensraums, Übergang des Ökosystems und Wiederbesiedlung) als wichtige indirekte Folgen der globalen Erwärmung und veränderter klimatischer Bedingungen auf dem Planeten verbunden sind. KW - Arctic KW - pathogens KW - virulence KW - hemolysis KW - antimicrobial resistance KW - climate change KW - bacteria KW - fungi KW - thermotolerance KW - antibiotic resistance KW - Arktis KW - Krankheitserreger KW - Virulenz KW - Hämolyse KW - Antibiotikaresistenz KW - Klimawandel KW - Bakterien KW - Pilze KW - Thermotoleranz Y1 - 2021 N1 - The author would like to acknowledge that the project leading to this doctoral dissertation has received funding from the European Union’s Horizon 2020 research and innovation programme under the Marie Skłodowska-Curie grant agreement No. 675546, research project “Microorganisms in Warming Arctic Environments - MicroArctic”. ER - TY - THES A1 - Stephan, Mareike Sophia T1 - A bacterial mimetic system to study bacterial inactivation and infection N2 - The emerging threat of antibiotic-resistant bacteria has become a global challenge in the last decades, leading to a rising demand for alternative treatments for bacterial infections. One approach is to target the bacterial cell envelope, making understanding its biophysical properties crucial. Specifically, bacteriophages use the bacterial envelope as an entry point to initiate infection, and they are considered important building blocks of new antibiotic strategies against drug-resistant bacteria.. Depending on the structure of the cell wall, bacteria are classified as Gram-negative and Gram-positive. Gram-negative bacteria are equipped with a complex cell envelope composed of two lipid membranes enclosing a rigid peptidoglycan layer. The synthesis machinery of the Gram-negative cell envelope is the target of antimicrobial agents, including new physical sanitizing procedures addressing the outer membrane (OM). It is therefore very important to study the biophysical properties of the Gram-negative bacterial cell envelope. The high complexity of the Gram-negative OM sets the demand for a model system in which the contribution of individual components can be evaluated separately. In this respect, giant unilamellar vesicles (GUVs) are promising membrane systems to study membrane properties while controlling parameters such as membrane composition and surrounding medium conditions. The aim of this work was to develop methods and approaches for the preparation and characterization of a GUV-based membrane model that mimics the OM of the Gram-negative cell envelope. A major component of the OM is the lipopolysaccharide (LPS) on the outside of the OM heterobilayer. The vesicle model was designed to contain LPS in the outer leaflet and lipids in the inner leaflet. Furthermore, the interaction of the prepared LPS-GUVs with bacteriophages was tested. LPS containing GUVs were prepared by adapting the inverted emulsion technique to meet the challenging properties of LPS, namely their high self-aggregation rate in aqueous solutions. Notably, an additional emulsification step together with the adaption of solution conditions was employed to asymmetrically incorporate LPS containing long polysaccharide chains into the artificial membranes. GUV membrane asymmetry was verified with a fluorescence quenching assay. Since the necessary precautions for handling the quenching agent sodium dithionite are often underestimated and poorly described, important parameters were tested and identified to obtain a stable and reproducible assay. In the context of varied LPS incorporation, a microscopy-based technique was introduced to determine the LPS content on individual GUVs and to directly compare vesicle properties and LPS coverage. Diffusion coefficient measurements in the obtained GUVs showed that increasing LPS concentrations in the membranes resulted in decreased diffusivity. Employing LPS-GUVs we could demonstrate that a Salmonella bacteriophage bound with high specificity to its LPS receptor when presented at the GUV surface, and that the number of bound bacteriophages scaled with the amount of presented LPS receptor. In addition to binding, the bacteriophages were able to eject their DNA into the vesicle lumen. LPS-GUVs thus provide a starting platform for bottom-up approaches for the generation of more complex membranes, in which the effects of individual components on the membrane properties and the interaction with antimicrobial agents such as bacteriophages could be explored. N2 - Die wachsende Bedrohung durch antibiotikaresistente Bakterien ist in den letzten Jahrzehnten zu einer globalen Herausforderung geworden, was zu einer steigenden Nachfrage nach alternativen Behandlungsmethoden für bakterielle Infektionen geführt hat. Ein Ansatz besteht darin, die bakterielle Zellhülle anzugreifen, weshalb das Verständnis ihrer biophysikalischen Eigenschaften entscheidend ist. Insbesondere Bakteriophagen, Viren, die Bakterien infizieren, nutzen die Bakterienhülle als ersten Angriffspunkt für die Infektion und gelten als wichtige Bausteine für neue Antibiotikastrategien gegen arzneimittelresistente Bakterien. Je nach Struktur der Zellwand werden Bakterien in gramnegative und grampositive Bakterien eingeteilt. Gramnegative Bakterien sind mit einer komplexen Zellhülle ausgestattet. Daher ist es sehr wichtig, ihre biophysikalischen Eigenschaften zu untersuchen. Die hohe Komplexität der äußeren Zellhülle, auch äußere Membran genannt, erfordert ein Modellsystem, in dem der Beitrag jeder einzelnen Komponente separat bewertet werden kann. In dieser Hinsicht sind Vesikel-basierte Modellsysteme sehr vielversprechend, da sie wichtige Eigenschaften der äußeren Membran simulieren können, aber in ihrer Komplexität stark reduziert und kontrollierbar sind. Ziel dieser Arbeit war es, Methoden und Ansätze für die Herstellung und Charakterisierung eines Vesikel-basierten Modells zu entwickeln, das die äußere Membran der gramnegativen bakteriellen Zellhülle nachahmt. Ein Hauptbestandteil der äußeren Membran ist Lipopolysaccharid (LPS), das asymmetrisch auf der Außenseite der äußeren Membran vorhanden ist. Das Vesikelmodell wurde so konzipiert, dass es außen LPS und innen Phospholipide enthält. Die Herstellung des beschriebenen Modellsystems erforderte einige Anpassungen, da die Hüllkomponente LPS eine hohe Tendenz zur Bildung von Selbstaggregaten aufweist. Durch die Einführung eines zusätzlichen Schrittes in das Standardprotokoll konnten Vesikel mit LPS-Inkorporation erzeugt werden. Es wurde sowohl die Menge als auch die asymmetrische Verteilung des LPS-Einbaus bestimmt. Mit Hilfe von Bakteriophagen sollte die biologische Wirkung des Modellsystems getestet werden. Es wurde gezeigt, dass Bakteriophagen, die spezifisch LPS erkennen und binden, nach Zugabe zum Modellsystem die Vesikel binden und ihr genetisches Material in das Vesikel-Innere injizieren. Die hier beschriebenen LPS-haltigen Vesikel können als Ausgangsplattform für Bottom-up-Ansätze zur Herstellung komplexerer Membranen verwendet werden. Mit diesen komplexeren, aber kontrollierbaren Systemen lassen sich die Auswirkungen einzelner Komponenten der bakteriellen Zellhülle auf die Eigenschaften der Zellhülle sowie ihre Wechselwirkung mit antimikrobiellen Wirkstoffen wie Bakteriophagen untersuchen. KW - Bakterien KW - Bakteriophagen KW - Zellmembran KW - Vesikel KW - Konfokale Mikroskopie KW - Lipopolysaccharid KW - gramnegativ KW - bacteria KW - bacteriophage KW - cell membrane KW - vesicle KW - confocal microscopy KW - lipopolysaccharide KW - gram-negative Y1 - 2023 ER -