TY - THES A1 - Krehl, Susanne T1 - Das Selenoprotein Glutathionperoxidase-2 : physiologische Funktion und Einfluss auf die entzündungsassoziierte Colonkarzinogenese T1 - The selenoprotein glutathione peroxidase-2 : physiological function and influence on inflammation triggered coloncarcinogenesis N2 - Bei der Entdeckung der Glutathionperoxidase-2 (GPx2) wurde zunächst davon ausgegangen, dass die Funktion dieses Enzyms im Kryptengrund des Colons einzig in der Reduktion von H2O2 besteht. Im Laufe der weiteren Erforschung zeigte sich, dass GPx2 auch in verschiedenen Tumorgeweben vermehrt exprimiert wird. Dabei wird diskutiert, ob die Wirkung von GPx2 im Tumor eher als pro- oder als antikarzinogen einzustufen ist. Mehrere Experimente in vitro und in vivo zeigten antiinflammatorische Eigenschaften der GPx2. Aufgrund dieser Befunde wird derzeit über weitere Funktionen der GPx2 spekuliert. In dieser Arbeit wurde die physiologische Funktion von GPx2 näher erforscht, dazu wurden Wildtyp- und GPx2-Knockout-Mäuse in Hinblick auf Veränderungen der Enzymexpression und der Colonmorphologie untersucht. Es wurden drei verschiedene Selendiäten verfüttert: selenarmes, selenadäquates und selensupplementiertes Futter. Unter physiologischen Bedingungen ist am Kryptengrund des Colons, innerhalb der proliferierenden Zone, die Mitoserate am höchsten. Der Großteil der apoptotischen Zellen ist hingegen an der Kryptenspitze vorzufinden. Durch den Knockout von GPx2 kam es zu einer signifikanten Erhöhung der Apoptoserate am Kryptengrund. Dabei war der größte Effekt auf selenarmem Futter zu verzeichnen. Hierbei wurde sogar eine Veränderung der Colonmorphologie dokumentiert, da die Verschiebung der Proliferationszone in Richtung Kryptenspitze eine Verlängerung der Krypten nach sich zog. Im Wildtyp wurden keine Apoptosen im Kryptengrund detektiert. GPx1 wird unter physiologischen Bedingungen im Gegensatz zur GPx2 in der Kryptenspitze exprimiert und ist im Selenmangel nicht mehr detektierbar. Der Knockout von GPx2 erhöhte die GPx1-Expression im Kryptengrund auf allen drei Selendiäten. Diese Überexpression von GPx1 am Kryptengrund soll vermutlich den Verlust von GPx2 an dieser Stelle kompensieren. Da jedoch dort die massive Apoptoserate detektiert wurde, kann die GPx1 nicht die komplette Funktion von GPx2 kompensieren. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Funktion von GPx2 nicht nur in der Reduktion von H2O2 liegt. Vielmehr kann eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase von Zellen postuliert werden. Ein weiterer Bestandteil dieser Arbeit war die Klärung der Frage, welchen Einfluss GPx2 auf die entzündungsassoziierte Colonkarzinogenese ausübt. In dem hierfür verwendeten AOM/DSS-Model wird der karzinogene Prozess durch Entzündung vorangetrieben. Es erfolgte sowohl im Wildtyp als auch im GPx2-Knockout zum einen die Bewertung des Entzündungsstatus des Colons und zum anderen wurde die Anzahl von ACF und Tumoren verglichen. Das Colon im GPx2-Knockout war wesentlich stärker entzündet als im Wildtyp. Diese Ergebnisse bestätigen die für die GPx2 postulierte antiinflammatorische Funktion. Normalerweise führt eine Erhöhung der Mitoseanzahl zur Regeneration des entzündeten Gewebes. Jedoch beeinflusst der Verlust von GPx2 vermutlich den Ablauf der Entzündung, indem beispielsweise die Regeneration des Gewebes durch die enorm hohe Apoptoserate am Kryptengrund verlangsamt wird. Des Weiteren hatten sich im GPx2-Knockout tendenziell mehr Tumore entwickelt. Somit korrelierte die Entzündung des Colons mit der Entwicklung von Tumoren. Der Verlust von GPx2 begünstigte vermutlich sowohl die Tumorinitiation als auch die Tumorprogression. Allerdings stimulierte die Expression von GPx2 ebenfalls das Tumorwachstum. Es kann geschlussfolgert werden, dass eine adäquate GPx2-Expression vor Entzündung schützt und somit das Risiko für Colonkrebs senkt. Ob GPx2 aber insgesamt pro- oder antikarzinogen wirkt, hängt vermutlich vom Stadium des Colonkarzinogenese ab. N2 - Since the detection of glutathione peroxidase-2 (GPx2) it was assumed that reducing hydroperoxides is the only function of this enzyme in the crypt ground of the colon. But further studies showed that GPx2 is also highly expressed in tumor tissue. However, it is not known whether it acts a pro- or anticarcinogenic manner at this site. In vitro and in vivo experiments elucidate antiinflammatory features of GPx2, based on these findings additional functions of GPx2 are discussed. In this dissertation the physiological function of GPx2 was investigated. For this purpose in wild type and GPx2-knockout mice, changes of enzyme expression and colon morphology were analyzed. The mice were fed three diets containing different selenium concentrations: selenium deficient, selenium adequate and selenium supplemented. Under physiological conditions the mitosis rate is highest in the proliferating zone in the crypt ground of the colon. The majority of apoptotic cells are located at the tip of the crypt. The knockout of GPx2 significantly increased the rate of apoptosis in the crypt ground. The greatest effect was documented on the selenium deficient diet. Here, changes of the colonic morphology were detectable, because the shift of the proliferating zone towards the tip of the crypt lead to an extension of the crypts. In the wild type mice no apoptotic cells were detected on the crypt ground. Under physiological conditions GPx1, in contrast to GPx2, is mainly expressed on the top of the crypt, and this enzyme is no longer detectable under selenium deficiency. The knockout of GPx2 increased the expression of GPx1 in the crypt ground of the colon on all three selenium diets. It is likely that this over expression of GPx1 compensates for the loss of GPx2. However the massive apoptotic rate in the crypt ground shows that GPx1 can not compensate the complete function of GPx2. These results elucidate that GPx2 not only functions as a hydroperoxide reducer, but that it is also important for the maintenance of the stem cell character and the homeostasis of cells. The question if GPx2 influences the inflammation triggered by the coloncarcinogenic process was next assessed in this dissertation. Therefore the AOM/DSS model was used to trigger the carcinogenic process through inflammation. The amount of aberrant crypt foci (ACF) and tumors in the colon were analyzed in both wild type and GPx2-knockout mice. However initially the inflammation status was compared between the two genotypes. The inflammation of the colon was stronger in the GPx2-knockout mice than in wild type. These results support the postulated antiinflammatory features of GPx2. The loss of GPx2 may influence the inflammation process by decelerating the regeneration of the tissue caused by the increased apoptotic rate in the proliferating zone. Additionally, the GPx2-knockout mice developed more tumors in the colon. Therefore the inflammation of the colon correlated with the development of tumors. The loss of GPx2 may have enhanced both tumor initiation and progression. But the expression of GPx2 also stimulated the growth of tumors. These results indicate that an adequate GPx2-expression can protect from colonic inflammation, and therefore decrease the risk of developing colon cancer. Whether GPx2 acts in a pro- or anticarcinogenic manner appears to depend on the state of the carcinogenic process. KW - Glutathionperoxidase-2 GPx2 KW - Apoptose KW - Colonkrebs KW - Entzündung KW - Selen KW - glutathione peroxidase-2 GPx2 KW - apoptosis KW - colon cancer KW - inflammation KW - selenium Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-50220 ER - TY - THES A1 - Ganesh, Bhanu Priya T1 - Host-microbe interactions in the inflamed gut T1 - Wirt-Mikroben-Interaktionen im entzündenden Darm N2 - Initiation and perpetuation of inflammatory bowel diseases (IBD) may result from an exaggerated mucosal immune response to the luminal microbiota in a susceptible host. We proposed that this may be caused either 1) by an abnormal microbial composition or 2) by weakening of the protective mucus layer due to excessive mucus degradation, which may lead to an easy access of luminal antigens to the host mucosa triggering inflammation. We tested whether the probiotic Enterococcus faecium NCIMB 10415 (NCIMB) is capable of reducing chronic gut inflammation by changing the existing gut microbiota composition and aimed to identify mechanisms that are involved in possible beneficial effects of the probiotic. To identify health-promoting mechanisms of the strain, we used interleukin (IL)-10 deficient mice that spontaneously develop gut inflammation and fed these mice a diet containing NCIMB (106 cells g-1) for 3, 8 and 24 weeks, respectively. Control mice were fed an identically composed diet but without the probiotic strain. No clear-cut differences between the animals were observed in pro-inflammatory cytokine gene expression and in intestinal microbiota composition after probiotic supplementation. However, we observed a low abundance of the mucin-degrading bacterium Akkermansia muciniphila in the mice that were fed NCIMB for 8 weeks. These low cell numbers were associated with significantly lower interferon gamma (IFN-γ) and IFN-γ-inducible protein (IP-10) mRNA levels as compared to the NCIMB-treated mice that were killed after 3 and 24 weeks of intervention. In conclusion, NCIMB was not capable of reducing gut inflammation in the IL-10-/- mouse model. To further identify the exact role of A. muciniphila and uncover a possible interaction between this bacterium, NCIMB and the host in relation to inflammation, we performed in vitro studies using HT-29 colon cancer cells. The HT-29 cells were treated with bacterial conditioned media obtained by growing either A. muciniphila (AM-CM) or NCIMB (NCIMB-CM) or both together (COMB-CM) in Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) for 2 h at 37 °C followed by bacterial cell removal. HT-29 cells treated with COMB-CM displayed reduced cell viability after 18 h (p<0.01) and no viable cells were detected after 24 h of treatment, in contrast to the other groups or heated COMB-CM. Detection of activated caspase-3 in COMB-CM treated groups indicated that death of the HT-29 cells was brought about by apoptosis. It was concluded that either NCIMB or A. muciniphila produce a soluble and heat-sensitive factor during their concomitant presence that influences cell viability in an in vitro system. We currently hypothesize that this factor is a protein, which has not yet been identified. Based on the potential effect of A. muciniphila on inflammation (in vivo) and cell-viability (in vitro) in the presence of NCIMB, we investigated how the presence of A. muciniphila affects the severity of an intestinal Salmonella enterica Typhimurium (STm)-induced gut inflammation using gnotobiotic C3H mice with a background microbiota of eight bacterial species (SIHUMI, referred to as simplified human intestinal microbiota). Presence of A. muciniphila in STm-infected SIHUMI (SIHUMI-AS) mice caused significantly increased histopathology scores and elevated mRNA levels of IFN-γ, IP-10, tumor necrosis factor alpha (TNF-α), IL-12, IL-17 and IL-6 in cecal and colonic tissue. The number of mucin filled goblet cells was 2- to 3- fold lower in cecal tissue of SIHUMI-AS mice compared to SIHUMI mice associated with STm (SIHUMI-S) or A. muciniphila (SIHUMI-A) or SIHUMI mice. Reduced goblet cell numbers significantly correlated with increased IFN-γ (r2 = -0.86, ***P<0.001) in all infected mice. In addition, loss of cecal mucin sulphation was observed in SIHUMI-AS mice. Concomitant presence of A. muciniphila and STm resulted in a drastic change in microbiota composition of the SIHUMI consortium. The proportion of Bacteroides thetaiotaomicron in SIHUMI, SIHUMI-A and SIHUMI-S mice made up to 80-90% but was completely taken over by STm in SIHUMI-AS mice contributing 94% to total bacteria. These results suggest that A. muciniphila exacerbates STm-induced intestinal inflammation by its ability to disturb host mucus homeostasis. In conclusion, abnormal microbiota composition together with excessive mucus degradation contributes to severe intestinal inflammation in a susceptible host. N2 - Die Initiation and die Manifestation von entzündlichen Darmerkrankungen (inflammatory bowel diseases - IBD) können aus einer übersteigerten mukosalen Immunreaktion auf die luminale Mikrobiota in einem empfänglichen Wirt resultieren. Wir schlagen vor, dass dies entweder durch 1) eine abnormale mikrobielle Zusammensetzung oder 2) die Abschwächung der schützenden Schleimschicht, eingeleitet durch deren fortgeschrittenen Abbau, verursacht werden kann. Diese Entwicklung ermöglicht einen erleichterten Zugang des luminalen Antigens zu der Mukosa des Wirts und somit die Auslösung der Entzündung. Wir haben getestet, ob das probiotische Bakterium Enterococcus faecium NCIMB 10415 (NCIMB) in der Lage ist, der chronischen Darmentzündung durch Veränderung der Zusammensetzung der Darmmikrobiota entgegenzuwirken und strebten an, die zugrunde liegenden Mechanismen der probiotischen Wirkungsweise zu identifizieren. Für die Aufklärung der gesundheitsfördernden Mechanismen dieses Bakterienstammes wurden Interleukin-10 defiziente Mäuse verwendet, die spontan eine Darmentzündung entwickeln. Den Mäusen wurde für 3, 8 und 24 Wochen eine NCIMB enthaltende Diät verabreicht. Nach der Fütterung waren keine eindeutigen Unterschiede zwischen den Gruppen hinsichtlich der Genexpression von pro-inflammatorischen Zytokinen und der Zusammensetzung der Darmmikrobiota zu beobachten, obwohl eine geringere Zellzahl des schleimabbauenden Bakteriums Akkermansia muciniphila in den mit NCIMB gefütterten Mäusen nach 8 Wochen festgestellt wurde. Daraus folgt, dass NCIMB nicht in der Lage ist, dem Verlauf der Darmentzündung im IL-10-/--Mausmodell entgegenzuwirken. In der nachfolgenden Studie wurde untersucht, wie die Anwesenheit von A. muciniphila den Ausprägungsgrad einer intestinalen Salmonella enterica Typhimurium (STm) induzierten Darmentzündung beeinflusst. Dafür wurden gnobiotische C3H-Mäuse mit einem mikrobiellen Hintergrund von acht Bakterienspezies (SIHUMI) verwendet. Die gleichzeitige Anwesenheit von A. muciniphila und STm verursachte eine drastische Veränderung der Mikrobiota-Zusammensetzung des SIHUMI-Konsortiums. Diese Ergebnisse zeigen, dass A. muciniphila durch seine Fähigkeit, die Homöostase/Selbstregulation der Schleimbildung zu stören, die STm-induzierte Darmentzündung verschärft. Es kann geschlußfolgert werden, dass eine abweichende Zusammensetzung der Mikrobiota in Kombination mit einem massiven Abbau des Mucus zur schweren intestinalen Entzündung im empfänglichen Wirt beiträgt. KW - IBD KW - probiotics KW - immune response KW - mucus KW - goblet cells KW - chronic and acute inflammation KW - apoptosis KW - commensal KW - cytokines KW - pathogen KW - infection Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-69558 ER -