TY - JOUR A1 - Sabrowski, Wiebke A1 - Dreymann, Nico A1 - Möller, Anja A1 - Czepluch, Denise A1 - Albani, Patricia P. A1 - Theodoridis, Dimitrios A1 - Menger, Marcus M. T1 - The use of high-affinity polyhistidine binders as masking probes for the selection of an NDM-1 specific aptamer JF - Scientific reports N2 - The emergence of carbapenemase-producing multi-drug resistant Enterobacteriaceae poses a dramatic, world-wide health risk. Limited treatment options and a lack of easy-to-use methods for the detection of infections with multi-drug resistant bacteria leave the health-care system with a fast-growing challenge. Aptamers are single stranded DNA or RNA molecules that bind to their targets with high affinity and specificity and can therefore serve as outstanding detection probes. However, an effective aptamer selection process is often hampered by non-specific binding. When selections are carried out against recombinant proteins, purification tags (e.g. polyhistidine) serve as attractive side targets, which may impede protein target binding. In this study, aptamer selection was carried out against N-terminally hexa-histidine tagged New Delhi metallo-ss-lactamase 1. After 14 selection rounds binding to polyhistidine was detected rather than to New Delhi metallo-ss-lactamase 1. Hence, the selection strategy was changed. As one aptamer candidate showed remarkable binding affinity to polyhistidine, it was used as a masking probe and selection was restarted from selection round 10. Finally, after three consecutive selection rounds, an aptamer with specific binding properties to New Delhi metallo-ss-lactamase 1 was identified. This aptamer may serve as a much-needed detection probe for New Delhi metallo-ss-lactamase 1 expressing Enterobacteriaceae. Y1 - 2022 U6 - https://doi.org/10.1038/s41598-022-12062-2 SN - 2045-2322 VL - 12 IS - 1 PB - Macmillan Publishers Limited, part of Springer Nature CY - London ER - TY - JOUR A1 - Dreymann, Nico A1 - Wuensche, Julia A1 - Sabrowski, Wiebke A1 - Moeller, Anja A1 - Czepluch, Denise A1 - Vu Van, Dana A1 - Füssel, Susanne A1 - Menger, Marcus M. T1 - Inhibition of Human Urokinase-Type Plasminogen Activator (uPA) Enzyme Activity and Receptor Binding by DNA Aptamers as Potential Therapeutics through Binding to the Different Forms of uPA JF - International journal of molecular sciences N2 - Urokinase-type plasminogen activator is widely discussed as a marker for cancer prognosis and diagnosis and as a target for cancer therapies. Together with its receptor, uPA plays an important role in tumorigenesis, tumor progression and metastasis. In the present study, systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX) was used to select single-stranded DNA aptamers targeting different forms of human uPA. Selected aptamers allowed the distinction between HMW-uPA and LMW-uPA, and therefore, presumably, have different binding regions. Here, uPAapt-02-FR showed highly affine binding with a K-D of 0.7 nM for HMW-uPA and 21 nM for LMW-uPA and was also able to bind to pro-uPA with a K-D of 14 nM. Furthermore, no cross-reactivity to mouse uPA or tissue-type plasminogen activator (tPA) was measured, demonstrating high specificity. Suppression of the catalytic activity of uPA and inhibition of uPAR-binding could be demonstrated through binding with different aptamers and several of their truncated variants. Since RNA aptamers are already known to inhibit uPA-uPAR binding and other pathological functions of the uPA system, these aptamers represent a novel, promising tool not only for detection of uPA but also for interfering with the pathological functions of the uPA system by additionally inhibiting uPA activity. KW - biomarker KW - cancer KW - cancer therapy KW - DNA aptamer KW - microscale thermophoresis (MST) KW - SELEX KW - surface plasmon resonance spectroscopy (SPR) KW - uPA KW - uPAR KW - urokinase Y1 - 2022 U6 - https://doi.org/10.3390/ijms23094890 SN - 1661-6596 SN - 1422-0067 VL - 23 IS - 9 PB - MDPI CY - Basel ER - TY - THES A1 - Dreymann, Nico T1 - Identification and functional characterization of aptamers targeting human urokinase and NDM-1 for therapeutic and diagnostic applications T1 - Identifizierung und funktionelle Charakterisierung von Aptameren gegen humane Urokinase und NDM-1 für therapeutische und diagnostische Anwendungen N2 - Aptamers are single-stranded DNA (ssDNA) or RNA molecules that can bind specifically and with high affinity to target molecules due to their unique three-dimensional structure. For this reason, they are often compared to antibodies and sometimes even referred to as “chemical antibodies”. They are simple and inexpensive to synthesize, easy to modify, and smaller than conventional antibodies. Enzymes, especially hydrolases, are interesting targets in this context. This class of enzymes is capable of hydrolytically cleaving various macromolecules such as proteins, as well as smaller molecules such as antibiotics. Hence, they play an important role in many biological processes including diseases and their treatment. Hydrolase detection as well as the understanding of their function is therefore of great importance for diagnostics and therapy. Due to their various desirable features compared to antibodies, aptamers are being discussed as alternative agents for analytical and diagnostic use in various applications. The use of aptamers in therapy is also frequently investigated, as the binding of aptamers can have effects on the catalytic activity, protein-protein interactions, or proteolytic cascades. Aptamers are generated by an in vitro selection process. Potential aptamer candidates are selected from a pool of enriched nucleic acid sequences with affinity to the target, and their binding affinity and specificity is investigated. This is one of the most important steps in aptamer generation to obtain specific aptamers with high affinity for use in analytical and diagnostic applications. The binding properties or binding domains and their effects on enzyme functions form the basis for therapeutic applications. In this work, the binding properties of DNA aptamers against two different hydrolases were investigated. In view of their potential utility for analytical methods, aptamers against human urokinase (uPA) and New Delhi metallo-β-lactamase-1 (NDM-1) were evaluated for their binding affinity and specificity using different methods. Using the uPA aptamers, a protocol for measuring the binding kinetics of an aptamer-protein-interaction by surface plasmon resonance spectroscopy (SPR) was developed. Based on the increased expression of uPA in different types of cancer, uPA is discussed as a prognostic and diagnostic tumor marker. As uPA aptamers showed different binding sites on the protein, microtiter plate-based aptamer sandwich assay systems for the detection of uPA were developed. Because of the function of urokinase in cancer cell proliferation and metastasis, uPA is also discussed as a therapeutic target. In this regard, the different binding sites of aptamers showed different effects on uPA function. In vitro experiments demonstrated both inhibition of uPA binding to its receptor as well as the inhibition of uPA catalytic activity for different aptamers. Thus, in addition to their specificity and affinity for their targets, the utility of the aptamers for potential diagnostic and therapeutic applications was demonstrated. First, as an alternative inhibitor of human urokinase for therapeutic purposes, and second, as valuable recognition molecules for the detection of urokinase, as a prognostic and diagnostic marker for cancer, and for NDM-1 to detect resistance to carbapenem antibiotics. N2 - Aptamere sind einzelsträngige DNA- oder RNA-Moleküle, die aufgrund ihrer charakteristischen dreidimensionalen Struktur spezifisch und mit hoher Affinität an Zielmoleküle binden. Häufig werden sie mit Antikörpern verglichen und als „chemische Antikörper“ bezeichnet. Sie sind einfach und kostengünstig zu synthetisieren, leicht zu modifizieren und kleiner als herkömmliche Antikörper. Enzyme, insbesondere Hydrolasen, sind hierbei unter anderem interessante Zielmoleküle. Diese Klasse von Enzymen ist in der Lage verschiedene Makromoleküle wie z.B. Proteine, aber auch kleinere Moleküle, wie z.B. Antibiotika, hydrolytisch zu spalten. Sie spielen in vielen biologischen Prozessen und somit auch in Erkrankungen und deren Behandlung eine wichtige Rolle. Daher ist ihre Detektion, sowie das Verständnis ihrer Funktion für die Diagnostik und Therapie von hoher Bedeutung. Durch ihre Vorteile gegenüber Antikörpern werden Aptamere als Alternativen für den analytischen und diagnostischen Einsatz in verschiedenen Applikationen diskutiert. Der Einsatz von Aptameren in der Therapie wird ebenfalls häufig untersucht, da die Bindung der Aptamere Auswirkungen auf die katalytische Aktivität, Protein-Protein-Interaktionen oder proteolytische Kaskaden haben kann. Aptamere werden mittels in vitro Selektion generiert. Aus einem Pool angereicherter Nukleinsäuren mit Affinität zum Zielmolekül werden anschließend potentielle Aptamerkandidaten identifiziert und ihre Bindung zum Zielmolekül untersucht. Dies ist einer der wichtigsten Schritte in der Aptamergenerierung, um spezifische Aptamere mit hoher Affinität für den späteren Einsatz in analytischen und diagnostischen Applikationen zu erhalten. Die Bindungseigenschaften einschließlich der Bindedomänen und deren Auswirkungen auf die Funktion des Zielmoleküls stellen die Grundlage für spätere therapeutische Anwendungen dar. In dieser Arbeit wurden die Bindungseigenschaften von DNA Aptameren gegen zwei verschiedene Hydrolasen untersucht. Für den potentiellen Nutzen in analytischen Methoden wurden Aptamere gegen die humane Urokinase (uPA), sowie gegen die New-Delhi metallo β-lactamase-1 (NDM-1) mittels molekularbiologischer Methoden auf deren Bindungsaffinität und Spezifität untersucht. Anhand der uPA-Aptamere wurde ein Protokoll für die Messung der Bindungskinetik einer Aptamer-Protein-Bindung mittels Oberflächenplasmonenresonanz Spektroskopie (SPR) entwickelt. Durch die erhöhte Expression von uPA in vielen Krebserkrankungen, wird dieser als prognostischer und diagnostischer Tumormarker diskutiert. Die in dieser Arbeit untersuchten Aptamere gegen die Urokinase zeigten unterschiedliche Bindestellen, wodurch Aptamer-basierte Sandwich Assay Systeme auf Mikrotiterplattenbasis für die Detektion von uPA etabliert werden konnten. Durch die Funktion der Urokinase in der Zellproliferation und Metastasierung in Krebserkrankungen wird uPA ebenfalls als therapeutisches Zielprotein diskutiert. Hierbei zeigten die unterschiedlichen Bindestellen der Aptamere verschiedene Auswirkungen auf die Funktion von uPA. Mittels in vitro Experimenten konnte die Inhibierung der Bindung von uPA zu ihrem Rezeptor, sowie die Inhibierung der katalytischen Aktivität von uPA mit Hilfe verschiedener Aptamere nachgewiesen werden. Somit wurde für die Aptamere, neben ihrer Spezifität und Affinität zu ihren Zielmolekülen, der Nutzen für potentielle diagnostische und therapeutische Anwendungen gezeigt. Zum einen als alternativer Inhibitor der Urokinase für therapeutische Zwecke, als auch als wertvolle Erkennungsmoleküle für den Nachweis von Urokinase, als prognostischer und diagnostischer Marker für Krebserkrankungen, sowie für NDM-1, zum Nachweis der Resistenz gegen Carbapenem-Antibiotika. KW - DNA-Aptamer KW - protein-aptamer interaction KW - Surface Plasmon Resonance (SPR) KW - Microscale Thermophoresis (MST) KW - aptamer-based sandwich assay KW - cancer biomarker KW - cancer therapy KW - cancer detection KW - Urokinase-type Plasminogen Activator (uPA) KW - antibiotic resistance KW - New Delhi metallo-β-lactamase 1 (NDM-1) KW - DNA-Aptamer KW - Microscale Thermophoresis (MST) KW - Neu-Delhi Metallo-Beta-Laktamase 1 (NDM-1) KW - Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie (SPR-Spektroskopie) KW - Urokinase-Typ Plasminogen Aktivator (uPA) KW - Antibiotikaresistenz KW - Sandwich-Assay auf Basis von Aptameren KW - Krebsbiomarker KW - Krebserkennung KW - Krebstherapie KW - Protein-Aptamer Interaktion Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-612919 ER -