TY - THES A1 - Herpich, Catrin T1 - Fibroblast growth factor 21 and its association with nutritional stimuli in older age N2 - Fibroblast growth differentiation factor 21 (FGF21) is known as a pivotal regulator of the glucose and lipid metabolism. As such, it is considered beneficial and has even been labelled a longevity hormone. Nevertheless, recent observational studies have shown that FGF21 is increased in higher age with possible negative effects such as loss of lean and bone mass as well as decreased survival. Hepatic FGF21 secretion can be induced by various nutritional stimuli such as starvation, high carbohydrate and fat intake as well as protein deficiency.. So far it is still unclear whether the FGF21 response to different macronutrients is altered in older age. An altered response would potentially contribute to explain the higher FGF21 concentrations found in older age. In this publication-based doctoral dissertation, a cross-sectional study as well as a dietary challenge were conducted to investigate the influence of nutrition on FGF21 concentrations and response in older age. In a cross-sectional study, FGF21 concentrations were assessed in older patients with and without cachexia anorexia syndrome anorexia syndrome compared to an older community-dwelling control group. Cachexia anorexia syndrome is a multifactorial syndrome frequently occurring in old age or in the context of an underlying disease. It is characterized by a severe involuntary weight loss, loss of appetite (anorexia) and reduced food intake, therefore representing a state of severe nutrient deficiency, in some aspects similar to starvation. The highest FGF21 concentrations were found in patients with cachexia anorexia syndrome. Moreover, FGF21 was positively correlated with weight loss and loss of appetite. In addition, cachexia anorexia syndrome itself was associated with FGF21 independent of sex, age and body mass index. As cachectic patients presumably exhibit protein malnutrition and FGF21 has been proposed a marker for protein insufficiency, the higher levels of FGF21 in patients with cachexia anorexia syndrome might be partly explained by insufficient protein intake. In order to investigate the acute response of FGF21 to different nutritional stimuli, a dietary challenge with a parallel group design was conducted. Here, healthy older (65-85 years) and younger (18-35 years) adults were randomized to one of four test meals: a dextrose drink, a high carbohydrate, high fat or high protein meal. Over the course of four hours, postprandial FGF21 concentrations (dynamics) were assessed and the FGF21 response (incremental area under the curve) to each test meal was examined.. In a sub-group of older and younger women, also the adiponectin response was investigated, as adiponectin is a known mediator of FGF21 effects on glucose and lipid metabolism. The dietary meal challenge revealed that dextrose and high carbohydrate intake result in higher FGF21 concentrations after four hours in older adults. This was partly explained by higher postprandial glucose concentrations in the old. For high fat ingestion no age differences were found. For the first time, acute FGF21 response to high protein intake was shown. Here, protein ingestion resulted in lower FGF21 concentrations in younger compared to older adults. Furthermore, sufficient protein intake, according to age-dependent recommendations, of the previous day, was associated with lower FGF21 concentrations in both age groups. The higher FGF21 response to dextrose ingestion resulted in a higher adiponectin response in older women, independent of fat mass, insulin resistance, triglyceride concentrations, inflammation and oxidative stress. Following the high fat meal, adiponectin concentrations declined in older women. Adiponectin response was not affected by meal composition in younger women. In summary, this thesis showed a positive association of FGF21 and cachexia anorexia syndrome with concomitant anorexia in older patients. Regarding the acute FGF21 response, a higher response following dextrose and carbohydrate ingestion was found in older compared with younger subjects. This might be attributed to a higher glucose response in older age. Furthermore, it was shown that the higher FGF21 response after dextrose ingestion possibly contributes to a higher adiponectin response in older women, independent of potential metabolic and inflammatory confounders. Acute protein ingestion resulted in a significant decrease in FGF21 concentrations. Moreover, protein intake of the previous day was inversely associated with fasting FGF21 concentrations. This might explain why FGF21 concentrations are higher in cachexia anorexia syndrome. These results therefore support the role of FGF21 as a sensor of protein restriction. N2 - Der Fibroblasten Wachstumsfaktor 21 (FGF21) gilt als wichtiger Regulator des Glukose- und Fettstoffwechsels. Es werden ihm verschiedene förderliche Eigenschaften zugeschrieben und er wurde darüber hinaus als Langlebigkeitshormon bezeichnet. Nichtsdestotrotz konnten Beobachtungsstudien zeigen, dass FGF21 Konzentration im Alter erhöht sind und möglicherweise mit negativen Auswirkungen, wie dem Verlust von Muskel- und Knochenmasse sowie einer geringeren Überlebenswahrscheinlichkeit, verbunden sind. FGF21 Sekretion in der Leber kann durch Hungern und verschiedene Makronährstoffe, wie hohe Kohlenhydrat- und Fettaufnahme, sowie einem Proteinmangel, induziert werden. Bisher ist jedoch unklar, ob sich die FGF21 Response auf verschiedene Makronährstoffe zwischen älteren und jüngeren Erwachsenen unterscheidet. Eine veränderte Response, könnte dazu beitragen die höheren FGF21 Konzentrationen im Alter zu erklären. In dieser vorliegenden kumulativen Dissertation wurden eine Querschnittsstudie sowie ein experimenteller Mahlzeitentest durchgeführt, um den Einfluss von Ernährung auf FGF21 Konzentrationen und die FGF21 Response im Alter zu untersuchen. In der Querschnittsstudie wurden FGF21 Konzentration von älteren PatientInnen mit und ohne Kachexie-Anorexie Syndrom sowie einer älteren Kontrollgruppe verglichen. Kachexie-Anorexie Syndrom ist ein multifaktorielles Syndrom, welches häufig im Alter und im Rahmen verschiedener Erkrankungen auftritt. Charakteristisch hierfür ist ein starker ungewollter Gewichtsverlust, Appetitverlust (Anorexie) sowie eine verminderte Nahrungsaufnahme. Daher repräsentiert das Kachexie-Anorexie Syndrom einen Zustand des schwerwiegenden Nährstoffmangels, der mit Unterernährung bei langanhaltenden Hungerphasen vergleichbar ist. Die höchsten FGF21 Konzentrationen wiesen PatientInnen mit Kachexie-Anorexie Syndrom auf. Des Weiteren korrelierte FGF21 positiv mit Gewichts- und Appetitverlust. Zusätzlich war das Kachexie-Anorexie Syndrom unabhängig von Alter, Geschlecht und BMI mit FGF21 assoziiert. Es ist davon auszugehen, dass PatientInnen mit Kachexie-Anorexie Syndrom eine unzureichende Proteinzufuhr aufweisen. Da FGF21 als Marker für Proteinrestriktion gilt, könnten die hohen FGF21 Konzentrationen bei Kachexie-Anorexie Syndrom teilweise durch eine zu geringe Proteinzufuhr erklärt werden. Um die akute Response von FGF21 auf verschiedene Makronährstoffe zu untersuchen, wurde ein Mahlzeitentest mit parallelen Gruppen durchgeführt. Hierfür erhielten ältere (65-85 Jahre) und jüngere (18-35 Jahre) Erwachsene eine von vier verschiedenen Testmahlzeiten (Dextrose Getränk, Kohlenhydrat-, Fett- und Proteinreiche Mahlzeit). Über vier Stunden wurden postprandiale FGF21 Konzentrationen (Dynamik) bestimmt und die FGF21 Response (inkrementelle Fläche unter der Kurve) auf jede Testmahlzeit untersucht. In einer Subgruppe von älteren und jüngeren Frauen wurde außerdem die Adiponektin Response bestimmt, da Adiponektin bekanntermaßen die Effekte von FGF21 auf den Glukose- und Fettstoffwechsel mediiert. Der Mahlzeitentest konnte zeigen, dass Dextrose und die kohlenhydratreiche Mahlzeit bei älteren Erwachsenen zu höheren FGF21 Konzentrationen nach vier Stunden führten. Dies könnte durch die höheren postprandialen Glukose Konzentrationen der Älteren erklärt werden. Die FGF21 Response auf die fettreiche Mahlzeit wies keine Altersunterschiede auf. Zum ersten Mal konnte die akute FGF21 Response auf eine proteinreiche Mahlzeit gezeigt werden. Hierbei führte die Mahlzeit bei jüngeren im Vergleich zu älteren Erwachsenen zu niedrigeren FGF21 Konzentration nach vier Stunden. Des Weiteren, war das Erreichen der altersspezifischen Proteinzufuhr des Vortrags bei beiden Altersgruppen mit niedrigeren nüchtern FGF21 Konzentrationen assoziiert. Bei älteren Frauen führte die höhere FGF21 Response nach Dextrose Aufnahme zu einer höheren Adiponektin Response, unabhängig von Fettmasse, Insulinresistenz, Triglyzeride Konzentrationen, Inflammation und oxidativem Stress. Nach Einnahme der fettreichen Mahlzeit sanken die Adiponektin Konzentrationen bei älteren Frauen, während bei jüngeren Frauen die Adiponektin Response nicht durch die Zusammensetzung der Mahlzeit beeinflusst wurde. Zusammenfassend konnte diese Dissertation eine positive Assoziation von FGF21 mit Kachexie-Anorexie Syndrom bei gleichzeitiger Anorexie bei älteren PatientInnen zeigen. Bezüglich der akuten Response von FGF21 zeigte sich eine höhere Response auf Dextrose und Kohlenhydrat-Aufnahme bei älteren im Vergleich zu jüngeren ProbandInnen. Dies ist vermutlich auf die erhöhte Glukose Response im Alter zurückzuführen. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass eine höhere FGF21 Response auf Dextrose bei älteren Frauen mit einer veränderten Adiponektin Response einhergingen, unabhängig von potentiellen metabolischen und inflammatorischen Einflussfaktoren. Eine akute hohe Proteinaufnahme führte zu einem deutlichen Abfall der postprandialen FGF21 Konzentrationen. Zudem bestand eine inverse Assoziation zwischen FGF21 Nüchternkonzentrationen und der Proteinzufuhr des Vortags. Dies könnte zum Teil erklären, warum FGF21 Konzentrationen bei Kachexie-Anorexie Syndrom erhöht sind. Demnach unterstützen diese Ergebnisse auch die Rolle von FGF21 als Sensor für Proteinrestriktion. KW - Ageing KW - FGF21 KW - protein KW - postprandial response Y1 - 2021 ER - TY - THES A1 - Engel, Anika T1 - Endocrine effects of plasticizers and the development of a breast cell-based toxicity screening system N2 - Humans are frequently exposed to a variety of endocrine disrupting chemicals (EDCs), which can cause harmful effects, e.g. disturbance of growth, development and reproduction, and cancer (UBA, 2016). EDCs are often components of synthetically manufactured products. Materials made of plastics, building materials, electronic items, textiles or cosmetic products can be particularly contaminated (Ain et al., 2021). One group of EDCs that has gained increased interest in recent years is phthalates. They are used as plasticizers in plastic materials to which people are daily exposed to. Phthalate plasticizers exert their harmful effects among others via activation of the estrogen receptor α (ERα), the estrogen receptor β (ERβ) and via inhibition of the androgen receptor (AR). Some phthalates have already been classified by the EU as Cancerogenic-, Mutagenic-, Reprotoxic- (CMR) substances and their use in industry has been restricted. After oral ingestion, phthalates are metabolized and are finally excreted with the urine. Numerous toxicological studies exist on phthalates, but mainly with the parent substances, not with their primary and secondary metabolites. In the course of the restriction of phthalates by the EU, the phthalate-free plasticizer di-isononylcyclohexane-1,2-dicarboxylate (DINCH®), was introduced to the market. So far, almost no toxicologically relevant properties have been identified for DINCH®. However, the effects of DINCH® have only been studied in animal experiments and, as with phthalates, almost exclusively with the parent substance. However, toxic effects of a particular compound may be induced by its metabolites and not by the parent compound itself. Therefore, potential endocrine effects of 15 phthalates, 19 phthalate metabolites, DINCH®, and five of its metabolites were investigated using reporter gene assays on the ERα, ERβ, and the AR. In addition, studies of the influence of some selected plasticizers on peroxisome proliferator-activated receptor α (PPARα) and peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ) activity were performed. Furthermore, a H295R steroidogenesis assay was performed to determine the influence of DINCH® and its metabolites on estradiol or testosterone synthesis. Analysis of the experiments shows that the phthalates either stimulated or inhibited ERα and ERβ activity and inhibited AR activity, whereas the phthalate metabolites did not affect the activity of these human hormone receptors. In contrast, metabolites of di-(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) stimulated transactivation of the human PPARα and PPARγ in analogous reporter gene assays, although DEHP itself did not activate these nuclear receptors. Therefore, primary and secondary phthalate metabolites appear to exert different effects at the molecular level compared to the parent compounds. Similarly, the results showed that the phthalate-free plasticizer DINCH® itself did not affect the activity of ERα, ERβ, AR, PPARα and PPARγ, while the DINCH® metabolites were shown to activate all these receptors. In the case of AR, DINCH® metabolites mainly enhanced AR activity stimulated by dihydrotestosterone (DHT). In the H295R steroidogenesis assay, neither DINCH® nor any of its metabolites affected estradiol or testosterone synthesis. Primary and secondary metabolites of DINCH® thus exert different effects at the molecular level than DINCH® itself. However, all these in vitro effects of DINCH® metabolites were observed only at high concentrations, which were about three orders of magnitude higher than the reported DINCH® metabolite concentrations in human urine. Therefore, the in vitro data does not support the assumption that DINCH® or any of the metabolites studied could have significant endocrine effects in vivo at relevant exposure levels in humans. Following the demonstration of direct and indirect endocrine effects of the studied plasticizers, a new effect-based in vitro 3D screening tool for toxicity assays of non-genotoxic carcinogens was developed using estrogen receptor-negative (ER-) MCF10-A cells and estrogen receptor-positive (ER+) MCF-12A cells. This arose from the background that breast cancer is the most common cancer occurring in women and estrogenic substances, such as phthalates, can probably influence the disease. The human mammary epithelial cell lines MCF-10A and MCF-12A form well-differentiated acini-like structures when cultured in three-dimensional Matrigel culture for a period of 20 days. The model should make it possible to detect substance effects on cell differentiation and growth, on mammary cell acini, and to differentiate between estrogenic and non-estrogenic effects at the same time. In the present study, both cell lines were tested for their suitability as an effect-based in vitro assay system for non-genotoxic carcinogens. An Automated Acinus Detection And Morphological Evaluation (ADAME) software solution has been developed for automatic acquisition of acinus images and determination of morphological parameters such as acinus size, lumen size, and acinus roundness. Several test substances were tested for their ability to affect acinus formation and cellular differentiation. Human epithelial growth factor (EGF) stimulated acinus growth for both cell lines, while all trans retinoic acid (RA) inhibited acinar growth. The potent estrogen 17β-estradiol had no effect on acinus formation of MCF-10A cells but resulted in larger MCF-12A acini. Thus, the parallel use of both cell lines together with the developed high content screening and evaluation tool allows the rapid identification of the estrogenic and cancerogenic properties of a given test compound. The morphogenesis of the acini was only slightly affected by the test substances. On the one hand, this suggests a robust test system, on the other hand, it probably cannot detect low-potent estrogenic compounds such as phthalates or DINCH®. The advantage of the robustness of the system, however, may be that vast numbers of "positive" results with questionable biological relevance could be avoided, such as those observed in sensitive reporter gene assays. N2 - Der Mensch ist häufig einer Vielzahl von endokrin wirksamen Chemikalien (EDCs) ausgesetzt, die schädliche Auswirkungen haben können, z. B. Störungen von Wachstum, Entwicklung und Fortpflanzung sowie Krebs (UBA, 2016). Eine Gruppe von EDCs, die in den letzten Jahren vermehrt an Interesse gewonnen hat, sind die Phthalate. Diese werden als Weichmacher in Kunststoffen verwendet. Einige Phthalate wurden bereits von der EU als Kanzerogene-, Mutagene-, Reproduktionstoxische- (CMR) Stoffe klassifiziert und ihre Verwendung in der Industrie beschränkt. Nach der oralen Aufnahme werden Phthalate metabolisiert und schließlich mit dem Urin ausgeschieden. Für die Phthalate existieren zwar zahlreiche toxikologische Studien, allerdings vorwiegend mit den Ausgangssubstanzen, nicht mit ihren primären und sekundären Metaboliten. Im Zuge der Beschränkung der Phthalate durch die EU wurde der phthalatfreie Weichmacher Diisononylcyclohexan-1,2-dicarboxylat (DINCH®), auf den Markt gebracht. DINCH® werden bisher kaum toxikologisch relevante Eigenschaften zugeordnet. Bislang wurden die Auswirkungen von DINCH® jedoch lediglich in Tierexperimenten untersucht und fast ausschließlich mit der Stamm-Substanz. Aus diesem Grund wurden potentiell endokrine Effekte von 15 Phthalaten, 19 Phthalat-Metaboliten, DINCH® und fünf seiner Metabolite unter Verwendung von Reportergen-Assays auf den ERα, ERβ und den AR untersucht. Zusätzlich wurden Untersuchungen des Einflusses einiger ausgewählter Substanzen auf die Aktivität des Peroxisom-Proliferator-aktivierten Rezeptor α (PPARα) und des Peroxisom-Proliferator-aktivierten Rezeptor γ (PPARγ) durchgeführt. Weiterhin wurde ein H295R-Steroidogenese-Assay durchgeführt, um den Einfluss von DINCH® und seinen Metaboliten auf die Estradiol- oder Testosteronsynthese zu bestimmen. Die Auswertung der Experimente zeigt, dass die Phthalate entweder die ERα- und ERβ-Aktivität stimulierten oder hemmten und die AR-Aktivität hemmten, während die Phthalatmetaboliten keinen Einfluss auf die Aktivität dieser menschlichen Hormonrezeptoren hatten. Im Gegensatz dazu stimulierten die Metaboliten von Di-(2-ethylhexyl) phthalat (DEHP) die Transaktivierung des humanen PPARα und PPARγ in analogen Reportergen-Assays, obwohl DEHP selbst diese Kernrezeptoren nicht aktivierte. Daher scheinen primäre und sekundäre Phthalatmetaboliten im Vergleich zu den Ausgangsverbindungen unterschiedliche Wirkungen auf molekularer Ebene auszuüben. Ebenso zeigten die Ergebnisse, dass der phthaltfreie Weichmacher DINCH® selbst keinen Einfluss auf die Aktivität von ERα, ERβ, AR, PPARα und PPARγ hatte, während die DINCH®-Metaboliten nachweislich alle diese Rezeptoren aktivierten. Im Falle des AR verstärkten die DINCH®-Metaboliten vor allem die durch Dihydrotestosteron (DHT) stimulierte AR-Aktivität. Im H295R-Steroidogenese-Assay beeinflusste weder DINCH® noch einer seiner Metaboliten die Estradiol- oder Testosteronsynthese. Primäre und sekundäre Metabolite von DINCH® üben demnach auf molekularer Ebene andere Effekte aus als DINCH® selbst. Die hier gewonnenen in vitro-Daten unterstützen die Annahme nicht, dass DINCH® oder einer der untersuchten Metaboliten erhebliche endokrine Wirkungen in vivo bei relevanten Expositionsmengen beim Menschen haben könnten. Nachdem endokrine Wirkungen der untersuchten Weichmacher nachgewiesen werden konnten, wurde ein neues wirkungsbasiertes in vitro 3D-Screening-Tool für Toxizitäts-Tests nicht genotoxischer Karzinogene mit östrogenrezeptor-negativen (ER-) MCF10-A-Zellen und östrogenrezeptor-positiven (ER+) MCF-12A-Zellen entwickelt. Dies geschah aus dem Hintergrund, dass Brustkrebs die häufigste Krebsart bei Frauen ist und östrogene Stoffe wie Phthalate die Krankheit vermutlich beeinflussen können. Die humanen Brustepithelzelllinien MCF-10A und MCF-12A bilden gut differenzierte azinusartige Strukturen, wenn sie in dreidimensionaler Matrigel-Kultur über einen Zeitraum von 20 Tagen kultiviert werden. Das Modell sollte es ermöglichen Substanzeffekte auf die Zelldifferenzierung und das Zellwachstum der Brustzell-Azini zu detektieren und dabei gleichzeitig zwischen östrogenen und nicht östrogenen Effekten differenzieren. Eine Softwarelösung zur automatisierten Acinus Detection And Morphological Evaluation (ADAME) wurde zur automatischen Erfassung von Acinus-Bildern und zur Bestimmung morphologischer Parameter wie Azinus-Größe, Lumengröße und Azinus-Rundheit entwickelt. Eine Reihe von Testsubstanzen wurde auf ihre Fähigkeit getestet, die Azinusbildung und die zelluläre Differenzierung zu beeinflussen. Der humane epitheliale Wachstumsfaktor (EGF) stimulierte das Azinuswachstum für beide Zelllinien, während all-trans-Retinsäure (RA) das Azinuswachstum hemmte. Das starke Östrogen 17β-Östradiol hatte keinen Einfluss auf die Azinusbildung von MCF-10A-Azini, führte aber zu größeren MCF-12A-Azini. Die parallele Verwendung beider Zelllinien zusammen mit dem hierbei entwickelten High-Content-Screening- und Evaluierungstool ermöglicht somit die schnelle Identifizierung der östrogenen oder kanzerogenen Eigenschaften einer gegebenen Testverbindung. Die Morphogenese der Azini wurde durch die Testsubstanzen nur geringfügig beeinflusst. Dies spricht einerseits für ein robustes Testsystem, andererseits kann es wahrscheinlich keine niedrigpotenten östrogenen Verbindungen wie Phthalate oder DINCH® erkennen. Der Vorteil der Robustheit des Systems kann jedoch darin liegen, dass eine große Zahl "positiver" Ergebnisse mit fragwürdiger biologischer Relevanz vermieden werden könnte, wie sie bei empfindlichen Reportergen-Assays zu beobachten sind. KW - phthalates KW - 3D breast cell model KW - endocrine disruption Y1 - 2021 U6 - https://doi.org/10.25932/publishup-53117 ER - TY - THES A1 - Wandt, Viktoria Klara Veronika T1 - Trace elements, ageing, and sex BT - impact on genome stability maintenance Y1 - 2021 ER - TY - THES A1 - Reichmann, Robin T1 - Novel applications of machine learning techniques in epidemiology of age-related diseases BT - from multidimensional data modelling to risk prediction Y1 - 2021 ER - TY - THES A1 - Klauder, Julia T1 - Makrophagenaktivierung durch Hyperinsulinämie als Auslöser eines Teufelkreises der Entzündung im Kontext des metabolischen Syndroms T1 - Macrophage activation by hyperinsulinemia as a trigger of a vicious cycle of inflammation in the context of the metabolic syndrome N2 - Insulinresistenz ist ein zentraler Bestandteil des metabolischen Syndroms und trägt maßgeblich zur Ausbildung eines Typ-2-Diabetes bei. Eine mögliche Ursache für die Entstehung von Insulinresistenz ist eine chronische unterschwellige Entzündung, welche ihren Ursprung im Fettgewebe übergewichtiger Personen hat. Eingewanderte Makrophagen produzieren vermehrt pro-inflammatorische Mediatoren, wie Zytokine und Prostaglandine, wodurch die Konzentrationen dieser Substanzen sowohl lokal als auch systemisch erhöht sind. Darüber hinaus weisen übergewichtige Personen einen gestörten Fettsäuremetabolismus und eine erhöhte Darmpermeabilität auf. Ein gesteigerter Flux an freien Fettsäuren vom Fettgewebe in andere Organe führt zu einer lokalen Konzentrationssteigerung in diesen Organen. Eine erhöhte Darmpermeabilität erleichtert das Eindringen von Pathogenen und anderer körperfremder Substanzen in den Körper. Ziel dieser Arbeit war es, zu untersuchen, ob hohe Konzentrationen von Insulin, des bakteriellen Bestandteils Lipopolysaccharid (LPS) oder der freien Fettsäure Palmitat eine Entzündungsreaktion in Makrophagen auslösen oder verstärken können und ob diese Entzündungsantwort zur Ausbildung einer Insulinresistenz beitragen kann. Weiterhin sollte untersucht werden, ob Metabolite und Signalsubstanzen, deren Konzentrationen beim metabolischen Syndrom erhöht sind, die Produktion des Prostaglandins (PG) E2 begünstigen können und ob dieses wiederum die Entzündungsreaktion und seine eigene Produktion in Makrophagen regulieren kann. Um den Einfluss dieser Faktoren auf die Produktion pro-inflammatorischer Mediatoren in Makrophagen zu untersuchen, wurden Monozyten-artigen Zelllinien und primäre humane Monozyten, welche aus dem Blut gesunder Probanden isoliert wurden, in Makrophagen differenziert und mit Insulin, LPS, Palmitat und/ oder PGE2 inkubiert. Überdies wurden primäre Hepatozyten der Ratte isoliert und mit Überständen Insulin-stimulierter Makrophagen inkubiert, um zu untersuchen, ob die Entzündungsanwort in Makrophagen an der Ausbildung einer Insulinresistenz in Hepatozyten beteiligt ist. Insulin induzierte die Expression pro-inflammatorischer Zytokine in Makrophagen-artigen Zelllinien wahrscheinlich vorrangig über den Phosphoinositid-3-Kinase (PI3K)-Akt-Signalweg mit anschließender Aktiverung des Transkriptionsfaktors NF-κB (nuclear factor 'kappa-light-chain-enhancer' of activated B-cells). Die dabei ausgeschütteten Zytokine hemmten in primären Hepatozyten der Ratte die Insulin-induzierte Expression der Glukokinase durch Überstände Insulin-stimulierter Makrophagen. Auch LPS oder Palmitat, deren lokale Konzentrationen im Zuge des metabolischen Syndroms erhöht sind, waren in der Lage, die Expression pro-inflammatorischer Zytokine in Makrophagen-artigen Zelllinien zu stimulieren. Während LPS seine Wirkung, laut Literatur, unbestritten über eine Aktivierung des Toll-ähnlichen Rezeptors (toll-like receptor; TLR) 4 vermittelt, scheint Palmitat jedoch weitestgehend TLR4-unabhängig wirken zu können. Vielmehr schien die de novo-Ceramidsynthese eine entscheidene Rolle zu spielen. Darüber hinaus verstärkte Insulin sowohl die LPS- als auch die Palmitat-induzierte Ent-zündungsantwort in beiden Zelllinien. Die in Zelllinien gewonnenen Ergebnisse wurden größtenteils in primären humanen Makrophagen bestätigt. Desweiteren induzierten sowohl Insulin als auch LPS oder Palmitat die Produktion von PGE2 in den untersuchten Makrophagen. Die Daten legen nahe, dass dies auf eine gesteigerte Expression PGE2-synthetisierender Enzyme zurückzuführen ist. PGE2 wiederum hemmte auf der einen Seite die Stimulus-abhängige Expression des pro-inflammatorischen Zytokins Tumornekrosefaktor (TNF) α in U937-Makrophagen. Auf der anderen Seite verstärkte es jedoch die Expression der pro-inflammatorischen Zytokine Interleukin- (IL-) 1β und IL-8. Darüber hinaus verstärkte es die Expression von IL-6-Typ-Zytokinen, welche sowohl pro- als auch anti-inflammatorisch wirken können. Außerdem vestärkte PGE2 die Expression PGE2-synthetisierender Enzyme. Es scheint daher in der Lage zu sein, seine eigene Synthese zu verstärken. Zusammenfassend kann die Freisetzung pro-inflammatorischer Mediatoren aus Makro-phagen im Zuge einer Hyperinsulinämie die Entstehung einer Insulinresistenz begünstigen. Insulin ist daher in der Lage, einen Teufelskreis der immer stärker werdenden Insulin-resistenz in Gang zu setzen. Auch Metabolite und Signalsubstanzen, deren Konzentrationen beim metabolischen Syndrom erhöht sind (zum Beispiel LPS, freie Fettsäuren und PGE2), lösten Entzündungsantworten in Makrophagen aus. Das wechselseitige Zusammenspiel von Insulin und diesen Metaboliten und Signalsubstanzen löste eine stärkere Entzündungsantwort in Makrophagen aus als jeder der Einzelkomponenten. Die dadurch freigesetzten Zytokine könnten zur Manifestation einer Insulinresistenz und des metabolischen Syndroms beitragen. N2 - Insulin resistance is a central component of the metabolic syndrome and is a major contributor to the development of type 2 diabetes. One possible cause of insulin resistance is chronic low-grade inflammation, which originates in the adipose tissue of obese individuals. Immigrated macrophages produce increased levels of pro-inflammatory mediators such as cytokines and prostaglandins, resulting in increased concentrations of these substances both locally and systemically. In addition, obese individuals exhibit impaired fatty acid metabolism and increased intestinal permeability. Increased flux of free fatty acids from adipose tissue to other organs results in increased local concentrations in these organs. Increased intestinal permeability facilitates the entry of pathogens and other exogenous substances into the body. The aim of this work was to investigate whether high concentrations of insulin, the bacterial component lipopolysaccharide (LPS), or the free fatty acid palmitate can induce or enhance an inflammatory response in macrophages and whether this inflammatory response can contribute to the development of insulin resistance. Furthermore, to investigate whether metabolites and signaling substances whose concentrations are elevated in the metabolic syndrome can promote the production of prostaglandin (PG) E2 and whether this in turn can regulate the inflammatory response and its own production in macrophages. To investigate the influence of these factors on the production of pro-inflammatory mediators in macrophages, monocyte-like cell lines and primary human monocytes, that were isolated from the blood of healthy volunteers, were differentiated into macrophages and incubated for with insulin, LPS, palmitate and/ or PGE2. In addition, primary rat hepatocytes were isolated and incubated with supernatants of insulin-stimulated macrophages to investigate whether the inflammatory response in macrophages is involved in the development of insulin resistance in hepatocytes. Insulin induced the expression of pro-inflammatory cytokines in macrophage-like cell lines probably primarily via the phosphoinositide 3-kinase (PI3K)-Akt pathway with subsequent activation of the transcription factor NF-κB (nuclear factor 'kappa-light-chain-enhancer' of activated B-cells). The cytokines released in this process inhibited insulin-induced expression of glucokinase by supernatants of insulin-stimulated macrophages in primary rat hepatocytes. Also, LPS or palmitate, whose local concentrations are increased in the course of metabolic syndrome, were able to stimulate the expression of pro-inflammatory cytokines in macrophage-like cell lines. While LPS, according to the literature, undisputedly mediates its effect via activation of toll-like receptor (TLR) 4, palmitate, however, appears to be able to act mainly in a TLR4-independent manner. Rather, de novo ceramide synthesis appeared to play a crucial role. Moreover, insulin enhanced both LPS- and palmitate-induced inflammatory responses in both cell lines. The results obtained in macrophage-like cell lines were largely confirmed in primary human macrophages. Furthermore, both insulin and LPS or palmitate induced PGE2 production in the macrophages studied. The data suggest that this was not due to increased expression of arachidonic acid-synthesizing enzymes but rather to increased expression of PGE2-synthesizing enzymes. On the one hand PGE2 inhibited the stimulus-dependent expression of the pro-inflammatory cytokine tumor necrosis factor (TNF) α in U937 macrophages. However, on the other hand, it enhanced the expression of the pro-inflammatory cytokines interleukin- (IL-) 1β and IL-8. In addition, it enhanced the expression of IL-6-type cytokines, which can be both pro- and anti-inflammatory. In addition, PGE2 enhanced the expression of PGE2-synthesizing enzymes. It therefore appears to be able to enhance its own synthesis. In conclusion, the release of pro-inflammatory mediators from macrophages in the course of hyperinsulinemia may favor the development of insulin resistance. Thus, the hyperinsulinemia might be augmented in a vicious cycle feed forward loop. Metabolites and signaling substances whose concentrations are elevated in the metabolic syndrome (for example, LPS, free fatty acids, and PGE2) also triggered inflammatory responses in macrophages. The synergistic interaction of insulin and these metabolites and signaling substances triggered a stronger inflammatory response in macrophages than any of the individual components. The released cytokines could contribute to the manifestation of insulin resistance and the metabolic syndrome. KW - Metabolisches Syndrom KW - Entzündung KW - Makrophagen KW - Insulin KW - Zytokine KW - Typ-2-Diabetes KW - Prostaglandin KW - inflammation KW - insulin KW - macrophages KW - metabolic syndrom KW - prostaglandine KW - Type-2-diabetes KW - cytokines Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-520199 ER - TY - THES A1 - Saussenthaler, Sophie T1 - The impact of DNA methylation on susceptibility to typ 2 diabetes in NZO mice N2 - The development of type 2 diabetes (T2D) is driven by genetic as well as life style factors. However, even genetically identical female NZO mice on a high-fat diet show a broad variation in T2D onset. The main objective of this study was to elucidate and investigate early epigenetic determinants of type 2 diabetes. Prior to other experiments, early fat content of the liver (<55.2 HU) in combination with blood glucose concentrations (>8.8 mM) were evaluated as best predictors of diabetes in NZO females. Then, DNA methylome and transcriptome were profiled to identify molecular pathophysiological changes in the liver before diabetes onset. The major finding of this thesis is that alterations in the hepatic DNA methylome precede diabetes onset. Of particular interest were 702 differentially methylated regions (DMRs), of which 506 DMRs had genic localization. These inter-individual DMRs were enriched by fivefold in the KEGG pathway type 2 diabetes mellitus, independent of the level of gene expression, demonstrating an epigenetic predisposition toward diabetes. Interestingly, among the list of hepatic DMRs, eleven DMRs were associated with known imprinted genes in the mouse genome. Thereby, six DMRs (Nap1l5, Mest, Plagl1, Gnas, Grb10 and Slc38a4) localized to imprinting control regions, including five iDMRs that exhibited hypermethylation in livers of diabetes-prone mice. This suggests that gain of DNA methylation in multiple loci of the paternal alleles has unfavourable metabolic consequences for the offspring. Further, the comparative liver transcriptome analysis demonstrated differences in expression levels of 1492 genes related to metabolically relevant pathways, such as citrate cycle and fatty acid metabolism. The integration of hepatic transcriptome and DNA methylome indicated that 449 differentially expressed genes were potentially regulated by DNA methylation, including genes implicated in insulin signaling. In addition, liver transcriptomic profiling of diabetes-resistant and diabetes-prone mice revealed a potential transcriptional dysregulation of 17 hepatokines, in particular Hamp. The hepatic expression of Hamp was decreased by 52% in diabetes-prone mice, on account of an increase in DNA methylation of promoter CpG-118. Hence, HAMP protein levels were lower in mice prone to develop diabetes, which correlated to higher liver triglyceride levels.. In sum, the identified DNA methylation changes appear to collectively favor the initiation and progression of diabetes in female NZO mice. In near future, epigenetic biomarkers are likely to contribute to improved diagnosis for T2D. KW - epigenetics KW - DNA methylation KW - RNAseq KW - fatty liver KW - type 2 diabetes KW - HAMP Y1 - 2021 ER - TY - THES A1 - Schjeide, Brit-Maren T1 - Development and characterization of the MoN-Light BoNT assay to determine the toxicity of botulinum neurotoxin in motor neurons differentiated from CRISPR-modified induced pluripotent stem cells T1 - Entwicklung und Charakterisierung des MoN-Light BoNT-Tests zur Bestimmung der Toxizität von Botulinum-Neurotoxin in Motorneuronen, die aus CRISPR-modifizierten induzierten pluripotenten Stammzellen differenziert wurden N2 - Botulinum neurotoxin (BoNT) is produced by the anaerobic bacterium Clostridium botulinum. It is one of the most potent toxins found in nature and can enter motor neurons (MN) to cleave proteins necessary for neurotransmission, resulting in flaccid paralysis. The toxin has applications in both traditional and esthetic medicine. Since BoNT activity varies between batches despite identical protein concentrations, the activity of each lot must be assessed. The gold standard method is the mouse lethality assay, in which mice are injected with a BoNT dilution series to determine the dose at which half of the animals suffer death from peripheral asphyxia. Ethical concerns surrounding the use of animals in toxicity testing necessitate the creation of alternative model systems to measure the potency of BoNT. Prerequisites of a successful model are that it is human specific; it monitors the complete toxic pathway of BoNT; and it is highly sensitive, at least in the range of the mouse lethality assay. One model system was developed by our group, in which human SIMA neuroblastoma cells were genetically modified to express a reporter protein (GLuc), which is packaged into neurosecretory vesicles, and which, upon cellular depolarization, can be released – or inhibited by BoNT – simultaneously with neurotransmitters. This assay has great potential, but includes the inherent disadvantages that the GLuc sequence was randomly inserted into the genome and the tumor cells only have limited sensitivity and specificity to BoNT. This project aims to improve these deficits, whereby induced pluripotent stem cells (iPSCs) were genetically modified by the CRISPR/Cas9 method to insert the GLuc sequence into the AAVS1 genomic safe harbor locus, precluding genetic disruption through non-specific integrations. Furthermore, GLuc was modified to associate with signal peptides that direct to the lumen of both large dense core vesicles (LDCV), which transport neuropeptides, and synaptic vesicles (SV), which package neurotransmitters. Finally, the modified iPSCs were differentiated into motor neurons (MNs), the true physiological target of BoNT, and hypothetically the most sensitive and specific cells available for the MoN-Light BoNT assay. iPSCs were transfected to incorporate one of three constructs to direct GLuc into LDCVs, one construct to direct GLuc into SVs, and one “no tag” GLuc control construct. The LDCV constructs fused GLuc with the signal peptides for proopiomelanocortin (hPOMC-GLuc), chromogranin-A (CgA-GLuc), and secretogranin II (SgII-GLuc), which are all proteins found in the LDCV lumen. The SV construct comprises a VAMP2-GLuc fusion sequence, exploiting the SV membrane-associated protein synaptobrevin (VAMP2). The no tag GLuc expresses GLuc non-specifically throughout the cell and was created to compare the localization of vesicle-directed GLuc. The clones were characterized to ensure that the GLuc sequence was only incorporated into the AAVS1 safe harbor locus and that the signal peptides directed GLuc to the correct vesicles. The accurate insertion of GLuc was confirmed by PCR with primers flanking the AAVS1 safe harbor locus, capable of simultaneously amplifying wildtype and modified alleles. The PCR amplicons, along with an insert-specific amplicon from candidate clones were Sanger sequenced to confirm the correct genomic region and sequence of the inserted DNA. Off-target integrations were analyzed with the newly developed dc-qcnPCR method, whereby the insert DNA was quantified by qPCR against autosomal and sex-chromosome encoded genes. While the majority of clones had off-target inserts, at least one on-target clone was identified for each construct. Finally, immunofluorescence was utilized to localize GLuc in the selected clones. In iPSCs, the vesicle-directed GLuc should travel through the Golgi apparatus along the neurosecretory pathway, while the no tag GLuc should not follow this pathway. Initial analyses excluded the CgA-GLuc and SgII-GLuc clones due to poor quality protein visualization. The colocalization of GLuc with the Golgi was analyzed by confocal microscopy and quantified. GLuc was strongly colocalized with the Golgi in the hPOMC-GLuc clone (r = 0.85±0.09), moderately in the VAMP2-GLuc clone (r = 0.65±0.01), and, as expected, only weakly in the no tag GLuc clone (r = 0.44±0.10). Confocal microscopy of differentiated MNs was used to analyze the colocalization of GLuc with proteins associated with LDCVs and SVs, SgII in the hPOMC-GLuc clone (r = 0.85±0.08) and synaptophysin in the VAMP2-GLuc clone (r = 0.65±0.07). GLuc was also expressed in the same cells as the MN-associated protein, Islet1. A significant portion of GLuc was found in the correct cell type and compartment. However, in the MoN-Light BoNT assay, the hPOMC-GLuc clone could not be provoked to reliably release GLuc upon cellular depolarization. The depolarization protocol for hPOMC-GLuc must be further optimized to produce reliable and specific release of GLuc upon exposure to a stimulus. On the other hand, the VAMP2-GLuc clone could be provoked to release GLuc upon exposure to the muscarinic and nicotinic agonist carbachol. Furthermore, upon simultaneous exposure to the calcium chelator EGTA, the carbachol-provoked release of GLuc could be significantly repressed, indicating the detection of GLuc was likely associated with vesicular fusion at the presynaptic terminal. The application of the VAMP2-GLuc clone in the MoN-Light BoNT assay must still be verified, but the results thus far indicate that this clone could be appropriate for the application of BoNT toxicity assessment. N2 - Botulinum neurotoxin (BoNT) wird von dem obligat anaeroben Bakterium Clostridium botulinum produziert. Es ist eines der giftigsten natürlich vorkommenden Toxine. Nach Aufnahme in den Körper dringt es in Motorneurone ein und spaltet spezifische Proteine, die für die Freisetzung des Neurotransmitters Acetylcholin notwendig sind. Dadurch kommt es zu einer schlaffen Lähmung der Muskulatur, die zu einer peripheren Asphyxie führt. Trotz seiner hohen Toxizität wird BoNT als Therapeutikum in der klassischen und kosmetischen Medizin genutzt. Da die Aktivität des biosynthetisch gewonnenen Toxins zwischen einzelnen Chargen trotz gleicher Proteinkonzentration stark variiert, muss die Aktivität jeder Präparation getestet werden. Dafür ist der Goldstandard der Mausletalitäts-Test, bei dem den Tieren unterschiedliche Dosen des Toxins injiziert werden und die Dosis ermittelt wird, bei der die Hälfte der Tiere verstirbt. Wegen der damit verbundenen ethischen Probleme wird nach Ersatzverfahren für diesen Tierversuch gesucht. Ein Ersatzverfahren muss folgende Bedingungen erfüllen: Es muss humanspezifisch sein; alle Teilschritte der BoNT-Wirkung messen; und eine hohe Empfindlichkeit haben, die in der gleichen Größenordnung wie der Maus-Letalitätstest liegt. Es wurde bereits ein Testsystem von unserer Gruppe entwickelt, bei dem humane SIMA-Neuroblastomzellen genetisch so modifiziert wurden, dass sie ein Reporterprotein (GLuc) exprimieren. Dieses wurde in neurosekretorische Vesikel verpackt und durch Depolarisation der Zellen gleichzeitig mit Neurotransmittern freigesetzt. Die Freisetzung wurde durch BoNT gehemmt. Obwohl dieser Assay großes Potential hat, wird seine Anwendbarkeit durch inhärente Nachteile eingeschränkt, da die GLuc-Sequenz zufällig in das Genom eingefügt wurde und die Tumorzellen nur eine begrenzte Sensitivität und Spezifität gegenüber BoNT haben. Diese Dissertation hatte zum Ziel, diese Defizite zu verbessern. Zu diesem Zweck wurden induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) durch die CRISPR/Cas9-Methode genetisch modifiziert, um die GLuc-Sequenz in den genomischen Safe-Harbor-Lokus AAVS1 einzufügen, wodurch ausgeschlossen wird, dass durch unspezifische Integrationen ins Genom die Funktion anderer Gene gestört wird. Darüber hinaus wurde GLuc so modifiziert, dass sie mit Signalpeptiden versehen wurde, die sie zum Lumen sowohl von „Large Dense Core“ Vesikeln (LDCV), die Neuropeptide transportieren, als auch von synaptischen Vesikeln (SV), die Neurotransmitter verpacken, führen. Schließlich wurden die modifizierten iPSCs in Motorneurone (MNs) differenziert, der eigentlichen physiologischen Zielstruktur von BoNT, die mutmaßlich am empfindlichsten und spezifischsten auf BoNT reagieren und daher für den MoN-Light BoNT-Assay am geeignetsten sein sollten. iPSCs wurden transfiziert, um eines von drei Konstrukten zu integrieren. 1) ein Konstrukt, das GLuc in LDCVs leitet, 2) ein Konstrukt, das GLuc durch Fusion mit VAMP2 in SVs leitet und 3) ein "no tag" GLuc-Kontrollkonstrukt. Die LDCV-Konstrukte enthielten die Signalpeptide Proopiomelanocortin (hPOMC), Chromogranin-A (CgA) und Secretogranin II (SgII). Die VAMP2-GLuc-Fusion transportiert GLuc in SVs, so dass Neurotransmitter und GLuc gemeinsam und nicht, wie bei den anderen Konstrukten parallel, aus unterschiedlichen Vesikeln freigesetzt werden. Die "no tag GLuc"-Kontrolle wurde erstellt, um die Lokalisation von GLuc, die ohne Sortierungssignal in der Zelle exprimiert wird, mit der GLuc mit Sortierungssignalen für die unterschiedlichen Vesikel zu vergleichen. Die Klone wurden charakterisiert, um sicherzustellen, dass die GLuc-Sequenz ausschließlich in den AAVS1-Safe-Harbor-Lokus eingebaut wurde und dass die Signalpeptide GLuc zu den richtigen Vesikeln leiten. Die korrekte Insertion von GLuc wurde durch PCR mit Primern bestätigt, die den AAVS1-Lokus flankieren und in der Lage sind, gleichzeitig Wildtyp- und modifizierte Allele zu amplifizieren. Mögliche Integrationen außerhalb der Zielregion wurden mit der neu entwickelten dc-qcnPCR analysiert, wobei die Insert-DNA mittels qPCR gegen autosomal und geschlechts-chromosomal kodierte Gene quantifiziert wurde. Auch wenn die Mehrzahl der analysierten Klone Off-Target-Integrationen enthielt, konnte für jedes Konstrukt mindestens ein vollständig On-Target-homozygoter Klon identifiziert werden. Schließlich wurden die GLuc in ausgewählten Klonen durch Immunfluoreszenz lokalisiert. In iPSCs sollte die GLuc mit Sortierungssequenzen für Vesikel durch den Golgi-Apparat entlang des neurosekretorischen Weges wandern, während die „no tag“ GLuc diesem Weg nicht folgen sollte. Anfängliche Analysen schlossen die CgA-GLuc- und SgII-GLuc-Klone aufgrund der schlechten Qualität der Proteinvisualisierung aus. Die Kolokalisation von GLuc mit dem Golgi-Apparat wurde mittels konfokaler Mikroskopie analysiert und quantifiziert. GLuc war im hPOMC-GLuc-Klon sehr stark (r = 0,85±0,09), im VAMP2-GLuc-Klon mäßig (r = 0,65±0,01) und im no tag GLuc-Klon erwartungsgemäß nur schwach (r = 0,44±0,10) mit Golgi-Markern assoziiert. Nach der Differenzierung in MNs wurde die Koexpression von GLuc mit dem MN-assoziierten Protein Islet1 bestätigt. Konfokale Mikroskopie von MNs wurde angewandt, um die Kolokalisation von GLuc mit Proteinen zu quantifizieren, die mit LDCVs und SVs assoziiert sind, nämlich SgII mit der hPOMC-GLuc (r = 0,85±0,08) und Synaptophysin mit VAMP2-GLuc (r = 0,65±0,07). Ein signifikanter Anteil von GLuc wurde im richtigen Zelltyp und Kompartiment gefunden. Im MoN-Light BoNT-Assay wurde die GLuc jedoch nicht zuverlässig durch Depolarisation aus dem hPOMC-GLuc-Klon freigesetzt. Das für die SIMA-hPOMC-Gluc-Zellen entwickelte Depolarisationsprotokoll muss für hPOMC-GLuc weiter optimiert werden, um eine zuverlässige und spezifische Freisetzung von GLuc bei Exposition gegenüber einem Stimulus zu erreichen. Andererseits konnte die GLuc aus dem VAMP2-GLuc-Klon durch Stimulation mit dem muskarinischen und nikotinischen Agonisten Carbachol freigesetzt werden. Die Carbachol-abhängige Freisetzung der GLuc konnte mit dem Calcium-Chelator EGTA unterdrückt werden, was darauf hindeutet, dass die Freisetzung der GLuc wahrscheinlich von der Fusion synaptischer Vesikel am präsynaptischen Terminal abhängig ist. Die Anwendung des VAMP2-GLuc-Klons im MoN-Light BoNT-Assay muss noch verifiziert werden, aber die bisherigen Ergebnisse deuten darauf hin, dass dieser Klon für die Anwendung der BoNT-Toxizitätsbewertung geeignet sein könnte. KW - Induced pluripotent stem cells KW - Alternative to animal testing KW - Botulinum neurotoxin KW - Motor neurons KW - CRISPR/Cas9 KW - induzierte pluripotente Stammzellen KW - alternative zu Tierversuchen KW - Botulinumtoxine KW - Motorneurone KW - CRISPR/Cas9 Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-516278 ER - TY - THES A1 - Burkhardt, Wiebke T1 - Role of dietary sulfonates in the stimulation of gut bacteria promoting intestinal inflammation T1 - Die Rolle nahrungsrelevanter Sulfonate bei der Stimulation von entzündungsfördernden Darmbakterien N2 - The interplay between intestinal microbiota and host has increasingly been recognized as a major factor impacting health. Studies indicate that diet is the most influential determinant affecting the gut microbiota. A diet rich in saturated fat was shown to stimulate the growth of the colitogenic bacterium Bilophila wadsworthia by enhancing the secretion of the bile acid taurocholate (TC). The sulfonated taurine moiety of TC is utilized as a substrate by B. wadsworthia. The resulting overgrowth of B. wadsworthia was accompanied by an increased incidence and severity of colitis in interleukin (IL)-10-deficient mice, which are genetically prone to develop inflammation. Based on these findings, the question arose whether the intake of dietary sulfonates also stimulates the growth of B. wadsworthia and thereby promotes intestinal inflammation in genetically susceptible mice. Dietary sources of sulfonates include green vegetables and cyanobacteria, which contain the sulfolipids sulfoquinovosyl diacylglycerols (SQDG) in considerable amounts. Based on literature reports, the gut commensal Escherichia coli is able to release sulfoquinovose (SQ) from SQDG and in further steps, convert SQ to 2,3-dihydroxypropane-1-sulfonate (DHPS) and dihydroxyacetone phosphate. DHPS may then be utilized as a growth substrate by B. wadsworthia, which results in the formation of sulfide. Both, sulfide formation and a high abundance of B. wadsworthia have been associated with intestinal inflammation. In the present study, conventional IL-10-deficient mice were fed either a diet supplemented with the SQDG-rich cyanobacterium Spirulina (20%, SD) or a control diet. In addition SQ, TC, or water were orally applied to conventional or gnotobiotic IL-10-deficient mice. The gnotobiotic mice harbored a simplified human intestinal microbiota (SIHUMI) either with or without B. wadsworthia. During the intervention period, the body weight of the mice was monitored, the colon permeability was assessed and fecal samples were collected. After the three-week intervention, the animals were examined with regard to inflammatory parameters, microbiota composition and sulfonate concentrations in different intestinal sites. None of the mice treated with the above-mentioned sulfonates showed weight loss or intestinal inflammation. Solely mice fed SD or gavaged with TC displayed a slight immune response. These mice also displayed an altered microbiota composition, which was not observed in mice gavaged with SQ. The abundance of B. wadsworthia was strongly reduced in mice fed SD, while that of mice treated with SQ or TC was in part slightly increased. The intestinal SQ-concentration was elevated in mice orally treated with SD or SQ, whereas neither TC nor taurine concentrations were consistently elevated in mice gavaged with TC. Additional colonization of SIHUMI mice with B. wadsworthia resulted in a mild inflammatory response, but only in mice treated with TC. In general, TC-mediated effects on the immune system and abundance of B. wadsworthia were not as strong as described in the literature. In summary, neither the tested dietary sulfonates nor TC led to bacteria-induced intestinal inflammation in the IL-10-deficient mouse model, which was consistently observed in both conventional and gnotobiotic mice. For humans, this means that foods containing SQDG, such as spinach or Spirulina, do not increase the risk of intestinal inflammation. N2 - Die mikrobielle Lebensgemeinschaft im Darm des Menschen, die intestinale Mikrobiota, übt einen beträchtlichen Einfluss auf die Gesundheit des Wirts aus. Der Wirt wiederum beeinflusst die intestinale Mikrobiota durch seine Ernährung. Bei Mäusen wurde beobachtet, dass eine Ernährung reich an gesättigten Fettsäuren zu Darmentzündung führen kann, wenn die Tiere Interleukin (IL)-10-defizient sind, was sie empfänglich für Entzündungen macht. Durch die fettreiche Ernährung wurde vermehrt die sulfonierte Gallensäure Taurocholat (TC) sekretiert, welche wiederum das Wachstum des entzündungsfördernden Bakteriums Bilophila wadsworthia stimulierte. Aufgrund dieser Beobachtung stellte sich die Frage, ob auch nahrungsrelevante Sulfonate bei IL-10-defizienten Mäusen zu einer bakteriell induzierten Darmentzündung führen können. Bei den in dieser Arbeit untersuchten Sulfonaten handelt es sich um die Sulfolipide Sulfoquinovosyldiacylglycerole (SQDG), welche in den meisten photosynthetischen Organismen wie Pflanzen, Moosen und Cyanobakterien vorkommen. Aus der Literatur ist bekannt, dass SQDG durch das kommensale Darmbakterium Escherichia coli zu Sulfoquinovose (SQ) und in weiteren Schritten zu 2,3-Dihydroxypropan-1-sulfonat (DHPS) und Dihydroxyacetonphosphat gespalten werden kann. DHPS kann von B. wadsworthia wiederum als Wachstumssubstrat verwendet und zu Sulfid reduziert werden. Sowohl für B. wadsworthia als auch für Sulfid wird angenommen, dass sie zur Entstehung von Darmentzündungen beitragen. Um diese Hypothese zu untersuchen, wurden konventionelle IL-10-defiziente Mäuse für drei Wochen mit einem Futter gefüttert, welches das SQDG-reiche Cyanobakterium Spirulina (20%, SD) enthielt. Weiterhin wurde IL-10-defizienten Mäusen mit einer komplexen oder minimalen intestinalen Mikrobiota für drei Wochen SQ oder TC oral verabreicht. Die Tiere mit der minimalen Mikrobiota waren mit einer simplifizierten humanen intestinalen Mikrobiota (SIHUMI) mit oder ohne B. wadsworthia besiedelt. Während der Versuche wurden die Tiere gewogen, Fäzesproben wurden gesammelt und ein Darm-Permeabilitätstest wurde durchgeführt. Nach der dreiwöchigen Intervention wurden Entzündungsparameter, Mikrobiotazusammensetzung und Sulfonatkonzentrationen in den einzelnen Darmabschnitten der Mäuse untersucht. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigten, dass keines der getesteten Sulfonate zu Gewichtsverlust oder Darmentzündung führte. Lediglich die Mäuse, die mit SD gefüttert oder denen TC appliziert wurde, zeigten Anzeichen einer schwachen Immunantwort. Auch wiesen diese Mäuse Veränderungen in der Zusammensetzung der Darmmikrobiota auf, was bei den mit SQ behandelten Mäusen nicht der Fall war. Die Zellzahl von B. wadsworthia war in SD-gefütterten Mäusen deutlich reduziert, während die Zellzahl dieses Bakteriums in den Mäuse, die mit SQ oder TC behandelt wurden, nur teilweise leicht erhöht war. Die SQ-Konzentrationen in den Inhalten einzelner Darmabschnitte waren bei den mit SD oder SQ behandelten Mäusen erhöht. Die Taurin- und TC-Konzentrationen glichen bei mit TC behandelten Mäusen überwiegend denen der Kontrolltiere. Die zusätzliche Besiedlung der SIHUMI-Mäuse mit B. wadsworthia führte nur in Tieren, denen TC appliziert wurde, zu leicht erhöhten Entzündungswerten. Allgemein übte die orale Applikation von TC weniger starke Effekte auf das Entzündungsgeschehen und die Mikrobiotazusammensetzung der Mäuse aus als in der Literatur beschrieben. Die Ergebnisse dieser Studie legen nahe, dass weder das SQDG-reiche Futter noch die orale Applikation von SQ oder TC zu einer bakteriell induzierten Darmentzündung bei IL-10-defizienten Mäusen führt. Für den Menschen bedeutet dies, dass SQDG-haltige Lebensmittel wie Spinat oder Spirulina das Risiko für Darmentzündungen nicht erhöhen. KW - Bilophila wadsworthia KW - Dietary sulfonates KW - Inflammatory bowel disease KW - Bilophila wadsworthia KW - Nahrungssulfonate KW - chronisch-entzündliche Darmerkrankungen Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-513685 ER - TY - THES A1 - Baeseler, Jessica T1 - Trace element effects on longevity and neurodegeneration with focus on C. elegans T1 - Effekte von Spurenelementen auf die Lebensdauer und Neurodegeneration mit Fokus auf C. elegans N2 - The trace elements zinc and manganese are essential for human health, especially due to their enzymatic and protein stabilizing functions. If these elements are ingested in amounts exceeding the requirements, regulatory processes for maintaining their physiological concentrations (homeostasis) can be disturbed. Those homeostatic dysregulations can cause severe health effects including the emergence of neurodegenerative disorders such as Parkinson’s disease (PD). The concentrations of essential trace elements also change during the aging process. However, the relations of cause and consequence between increased manganese and zinc uptake and its influence on the aging process and the emergence of the aging-associated PD are still rarely understood. This doctoral thesis therefore aimed to investigate the influence of a nutritive zinc and/or manganese oversupply on the metal homeostasis during the aging process. For that, the model organism Caenorhabditis elegans (C. elegans) was applied. This nematode suits well as an aging and PD model due to properties such as its short life cycle and its completely sequenced, genetically amenable genome. Different protocols for the propagation of zinc- and/or manganese-supplemented young, middle-aged and aged C. elegans were established. Therefore, wildtypes, as well as genetically modified worm strains modeling inheritable forms of parkinsonism were applied. To identify homeostatic and neurological alterations, the nematodes were investigated with different methods including the analysis of total metal contents via inductively-coupled plasma tandem mass spectrometry, a specific probe-based method for quantifying labile zinc, survival assays, gene expression analysis as well as fluorescence microscopy for the identification and quantification of dopaminergic neurodegeneration.. During aging, the levels of iron, as well as zinc and manganese increased.. Furthermore, the simultaneous oversupply with zinc and manganese increased the total zinc and manganese contents to a higher extend than the single metal supplementation. In this relation the C. elegans metallothionein 1 (MTL-1) was identified as an important regulator of metal homeostasis. The total zinc content and the concentration of labile zinc were age-dependently, but differently regulated. This elucidates the importance of distinguishing these parameters as two independent biomarkers for the zinc status. Not the metal oversupply, but aging increased the levels of dopaminergic neurodegeneration. Additionally, nearly all these results yielded differences in the aging-dependent regulation of trace element homeostasis between wildtypes and PD models. This confirms that an increased zinc and manganese intake can influence the aging process as well as parkinsonism by altering homeostasis although the underlying mechanisms need to be clarified in further studies. N2 - Die Spurenelemente Zink und Mangan sind vor allem aufgrund ihrer enzymatischen und Protein-stabilisierenden Funktionen essentiell für die menschliche Gesundheit. Werden sie allerdings in Mengen aufgenommen, die den Bedarf übersteigen, können regulatorische Prozesse für die Aufrechterhaltung physiologischer Konzentrationen dieser Metalle (Homöostase) aus dem Gleichgewicht geraten. Das kann ernsthafte gesundheitliche Konsequenzen nach sich ziehen, unter anderem die Entstehung neurodegenerativer Krankheiten, wie zum Beispiel der Parkinson’schen Erkrankung. Auch während des Alterungsprozesses verändern sich die Gehalte an lebensnotwendigen Spurenelementen im Körper. Jedoch sind die Zusammenhänge zwischen Ursache und Wirkung einer erhöhten Aufnahme an Zink und Mangan und deren Einfluss auf den Alterungsprozess und die Entstehung der altersassoziierten Parkinson’schen Erkrankung bisher nur unzureichend verstanden. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde deshalb der Einfluss einer nutritiven Zink- und/oder Manganüberversorgung auf die Metallhomöostase während der Alterung untersucht. Dazu wurde Caenorhabditis elegans (C. elegans) als Modellorganismus verwendet. Diese Fadenwürmer eignen sich aufgrund verschiedener Eigenschaften, wie einem kurzen Lebenszyklus und einem komplett sequenzierten und leicht manipulierbarem Genom, hervorragend als Alters- und Parkinson-Modelle. Es wurden verschiedene Protokolle etabliert, die die Anzucht von Zink- und/oder Mangan-supplementierten jungen, mittelalten bzw. gealterten C. elegans erlaubten. Neben Wildtypen wurden auch Wurmstämme untersucht, die genetische Modifikationen aufweisen, die mit vererbbaren Formen des Parkinsonismus assoziiert werden können. Die Würmer wurden mithilfe verschiedener Methoden, wie der analytischen Bestimmung des Gesamtmetallgehaltes mittels Massenspektrometrie mit induktiv-gekoppeltem Plasma, einer Sonden-spezifischen Methode zur Bestimmung von freiem Zink, Letalitätsassays, Genexpressionsanalysen und der Fluoreszenz-mikroskopischen Untersuchung der dopaminergen Neurodegeneration auf verschiedene Parameter untersucht, die Aufschluss über homöostatische und neurologische Veränderungen geben. Es wurde eine altersbedingte Zunahme von Eisen, sowie Zink und Mangan in den Würmern beobachtet. Weiterhin stellte sich heraus, dass vor allem die simultane Überversorgung mit Zink und Mangan den Gesamtmetallgehalt dieser Metalle in C. elegans in einem Maß steigerte, das das der Einzelmetallsupplementierung überstieg. Dabei konnte vor allem das C. elegans Metallothionein 1 (MTL-1) als wichtiger Faktor in der Regulation der Metallhomöostase identifiziert werden. Außerdem wurde die Wichtigkeit verdeutlicht, zwischen dem Gesamtzinkgehalt und der Konzentration an freiem Zink als Biomarkern für den Zinkstatus eines Organismus zu unterscheiden. Beide Parameter wurden altersabhängig unterschiedlich reguliert. Im Gegensatz zur Alterung, wurde durch die Überversorgung mit Metallen keine zusätzliche Schädigung der dopaminergen Neuronen beobachtet. In nahezu all diesen Ergebnissen verdeutlichten sich weiterhin Unterschiede in der altersabhängigen Regulation der Spurenelementhomöostase zwischen Wildtypen und Parkinson-Modellen. Dies bestätigt die Annahme, dass sich eine erhöhte Aufnahme von Mangan und Zink durch die Beeinflussung der Homöostase sowohl auf die Alterung, als auch den Parkinsonismus auswirken kann, jedoch müssen die mechanistischen Grundlagen dessen in zukünftigen Studien aufgeklärt werden. KW - Caenorhabditis elegans KW - aging KW - trace element KW - zinc KW - manganese KW - Caenorhabditis elegans KW - Alterung KW - Spurenelement KW - Zink KW - Mangan Y1 - 2021 ER - TY - THES A1 - Mancini, Carola T1 - Analysis of the effects of age-related changes of metabolic flux on brown adipocyte formation and function N2 - Brown adipose tissue (BAT) is responsible for non-shivering thermogenesis, thereby allowing mammals to maintain a constant body temperature in a cold environment. Thermogenic capacity of this tissue is due to a high mitochondrial density and expression of uncoupling protein 1 (UCP1), a unique brown adipocyte marker which dissipates the mitochondrial proton gradient to produce heat instead of ATP. BAT is actively involved in whole-body metabolic homeostasis and during aging there is a loss of classical brown adipose tissue with concomitantly reduced browning capacity of white adipose tissue. Therefore, an age-dependent decrease of BAT-related energy expenditure capacity may exacerbate the development of metabolic diseases, including obesity and type 2 diabetes mellitus. Given that direct effects of age-related changes of BAT-metabolic flux have yet to be unraveled, the aim of the current thesis is to investigate potential metabolic mechanisms involved in BAT-dysfunction during aging and to identify suitable metabolic candidates as functional biomarkers of BAT-aging. To this aim, integration of transcriptomic, metabolomic and proteomic data analyses of BAT from young and aged mice was performed, and a group of candidates with age-related changes was revealed. Metabolomic analysis showed age-dependent alterations of metabolic intermediates involved in energy, nucleotide and vitamin metabolism, with major alterations regarding the purine nucleotide pool. These data suggest a potential role of nucleotide intermediates in age-related BAT defects. In addition, the screening of transcriptomic and proteomic data sets from BAT of young and aged mice allowed identification of a 60-kDa lysophospholipase, also known as L-asparaginase (Aspg), whose expression declines during BAT-aging. Involvement of Aspg in brown adipocyte thermogenic function was subsequently analyzed at the molecular level using in vitro approaches and animal models. The findings revealed sensitivity of Aspg expression to β3-adrenergic activation via different metabolic cues, including cold exposure and treatment with β3-adrenergic agonist CL. To further examine ASPG function in BAT, an over-expression model of Aspg in a brown adipocyte cell line was established and showed that these cells were metabolically more active compared to controls, revealing increased expression of the main brown-adipocyte specific marker UCP1, as well as higher lipolysis rates. An in vitro loss-of-function model of Aspg was also functionally analyzed, revealing reduced brown adipogenic characteristics and an impaired lipolysis, thus confirming physiological relevance of Aspg in brown adipocyte function. Characterization of a transgenic mouse model with whole-body inactivation of the Aspg gene (Aspg-KO) allowed investigation of the role of ASPG under in vivo conditions, indicating a mild obesogenic phenotype, hypertrophic white adipocytes, impairment of the early thermogenic response upon cold-stimulation and dysfunctional insulin sensitivity. Taken together, these data show that ASPG may represent a new functional biomarker of BAT-aging that regulates thermogenesis and therefore a potential target for the treatment of age-related metabolic disease. KW - adipose tissue KW - aging KW - nutrients KW - metabolism KW - Fettgewebe KW - Alterung KW - Stoffwechsel KW - Nährstoffe Y1 - 2021 U6 - https://doi.org/10.25932/publishup-51266 ER -