TY - THES A1 - Heinsohn, Natascha T1 - Development of a fiber-based sensor for the molecular detection of pathogens using Legionella as an example T1 - Entwicklung eines Faser-basierten Sensors zur molekularen Detektion von Pathogenen am Beispiel von Legionellen N2 - Fiber-based microfluidics has undergone many innovative developments in recent years, with exciting examples of portable, cost-effective and easy-to-use detection systems already being used in diagnostic and analytical applications. In water samples, Legionella are a serious risk as human pathogens. Infection occurs through inhalation of aerosols containing Legionella cells and can cause severe pneumonia and may even be fatal. In case of Legionella contamination of water-bearing systems or Legionella infection, it is essential to find the source of the contamination as quickly as possible to prevent further infections. In drinking, industrial and wastewater monitoring, the culture-based method is still the most commonly used technique to detect Legionella contamination. In order to improve the laboratory-dependent determination, the long analysis times of 10-14 days as well as the inaccuracy of the measured values in colony forming units (CFU), new innovative ideas are needed. In all areas of application, for example in public, commercial or private facilities, rapid and precise analysis is required, ideally on site. In this PhD thesis, all necessary single steps for a rapid DNA-based detection of Legionella were developed and characterized on a fiber-based miniaturized platform. In the first step, a fast, simple and device-independent chemical lysis of the bacteria and extraction of genomic DNA was established. Subsequently, different materials were investigated with respect to their non-specific DNA retention. Glass fiber filters proved to be particularly suitable, as they allow recovery of the DNA sample from the fiber material in combination with dedicated buffers and exhibit low autofluorescence, which was important for fluorescence-based readout. A fiber-based electrophoresis unit was developed to migrate different oligonucleotides within a fiber matrix by application of an electric field. A particular advantage over lateral flow assays is the targeted movement, even after the fiber is saturated with liquid. For this purpose, the entire process of fiber selection, fiber chip patterning, combination with printed electrodes, and testing of retention and migration of different DNA samples (single-stranded, double-stranded and genomic DNA) was performed. DNA could be pulled across the fiber chip in an electric field of 24 V/cm within 5 minutes, remained intact and could be used for subsequent detection assays e.g., polymerase chain reaction (PCR) or fluorescence in situ hybridization (FISH). Fiber electrophoresis could also be used to separate DNA from other components e.g., proteins or cell lysates or to pull DNA through multiple layers of the glass microfiber. In this way, different fragments experienced a moderate, size-dependent separation. Furthermore, this arrangement offers the possibility that different detection reactions could take place in different layers at a later time. Electric current and potential measurements were collected to investigate the local distribution of the sample during migration. While an increase in current signal at high concentrations indicated the presence of DNA samples, initial experiments with methylene blue stained DNA showed a temporal sequence of signals, indicating sample migration along the chip. For the specific detection of a Legionella DNA, a FISH-based detection with a molecular beacon probe was tested on the glass microfiber. A specific region within the 16S rRNA gene of Legionella spp. served as a target. For this detection, suitable reaction conditions and a readout unit had to be set up first. Subsequently, the sensitivity of the probe was tested with the reverse complementary target sequence and the specificity with several DNA fragments that differed from the target sequence. Compared to other DNA sequences of similar length also found in Legionella pneumophila, only the target DNA was specifically detected on the glass microfiber. If a single base exchange is present or if two bases are changed, the probe can no longer distinguish between the DNA targets and non-targets. An analysis with this specificity can be achieved with other methods such as melting point determination, as was also briefly indicated here. The molecular beacon probe could be dried on the glass microfiber and stored at room temperature for more than three months, after which it was still capable of detecting the target sequence. Finally, the feasibility of fiber-based FISH detection for genomic Legionella DNA was tested. Without further processing, the probe was unable to detect its target sequence in the complex genomic DNA. However, after selecting and application of appropriate restriction enzymes, specific detection of Legionella DNA against other aquatic pathogens with similar fragment patterns as Acinetobacter haemolyticus was possible. N2 - Die faserbasierte Mikrofluidik hat in den letzten Jahren viele innovative Entwicklungen erfahren, mit spannenden Beispielen für portable, kostengünstige und einfach zu bedienende Nachweissysteme die bereits in diagnostischen und analytischen Fragestellungen Anwendung finden. In Wasserproben sind Legionellen als Humanpathogene ein ernstzunehmendes Risiko. Eine Infektion erfolgt über das Einatmen legionellenhaltiger Aerosole und kann schwerwiegende Pneumonien hervorrufen oder sogar tödlich verlaufen. Im Falle einer Legionellenkontamination von Wasserführenden Systemen beziehungsweise einer Legionellen-assoziierten Infektion ist es maßbeglich die Quelle der Kontamination möglichst schnell zu finden, um weitere Infektionen zu vermeiden. In der Überwachung von Trink- Prozess- und Abwasser ist die kulturbasierte Methode immer noch die am häufigsten verwendete Technik, um einen Legionellenbefall nachzuweisen. Um Alternativen zu einer laborabhängigen Bestimmung mit ihren langen Analysezeiten von 10-14 Tagen und der ungenauen Messwertausgabe in koloniebildenden Einheiten (KBE) zu finden, bedarf es neuer innovativer Ideen. In allen Anwendungsbereichen, zum Beispiel in öffentlichen, gewerblichen oder privaten Einrichtungen, ist eine schnelle und präzise Analyse erforderlich, idealerweise vor Ort. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden alle notwendigen Einzelschritte für einen schnellen DNA-basierten Nachweis von Legionellen auf einer faserbasierten, miniaturisierten Plattform entwickelt und charakterisiert. Im ersten Schritt wurde eine schnelle, einfache und geräteunabhängige chemische Lyse der Bakterien und Extraktion der genomischen DNA etabliert. Daraufhin wurden verschiedene Materialien hinsichtlich Ihres unspezifischen DNA-Rückhalts untersucht. Glasfaserfilter erwiesen sich als besonders geeignet, da sie in Kombination mit den geeigneten Puffern eine Rückgewinnung der DNA-Probe aus dem Fasermaterial ermöglichen und für eine fluoreszenzbasierte Auslese eine geringe Autofluoreszenz aufweisen. Eine faserbasierte Elektrophoreseeinheit wurde entwickelt, um durch Anlegen eines elektrischen Feldes verschiedene Oligonukleotide innerhalb einer Fasermatrix zu bewegen. Ein besonderer Vorteil gegenüber Lateral-Flow-Tests ist die Möglichkeit der gezielten Bewegung, auch nachdem die Faser mit Flüssigkeit gesättigt ist. Hierfür wurde der gesamte Prozess der Faserauswahl, der Strukturierung der Faserchips, der Kombination mit gedruckten Elektroden und der Prüfung der Retention und Migration verschiedener DNA-Proben (einzelsträngige, doppelsträngige und genomische DNA) bearbeitet. Die DNA konnte in einem elektrischen Feld von 24 V/cm innerhalb von 5 Minuten über den Faserchip gezogen werden, blieb dabei intakt und konnte für nachfolgende Detektionsnachweise z.B. Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) oder Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) genutzt werden. Die Faserelektrophorese konnte außerdem zur Separation der DNA von anderen Komponenten z.B. Proteinen oder Zelllysaten verwendet werden oder um DNA durch mehrere Lagen der Glasfaser zu steuern. Dabei erfuhren verschiedene Fragmente einen moderaten, größenabhängigen Trenneffekt. Außerdem bietet diese Anordnung die Möglichkeit, dass unterschiedliche Nachweisreaktionen zu einem späteren Zeitpunkt in verschiedenen Schichten stattfinden könnten. Strom- und Potentialmessungen wurden erhoben, um die lokale Verteilung der Probe während der Migration zu untersuchen. Während ein Anstieg des Stromsignals bei hohen Konzentrationen die Anwesenheit von DNA-Proben anzeigte, konnten nach ersten Experimenten mit Methylenblau-gefärbter DNA zeitlich aufeinanderfolgende Signale detektiert werden und somit prinzipiell eine Probenmigration nachgewiesen werden. Für den spezifischen Nachweis der Legionellen-DNA wurde ein FISH-basierter Nachweis mit einer molekularen Sonde auf der Glasmikrofaser getestet. Als Ziel für die Sonde diente eine bestimmte Region innerhalb des 16S rRNA-Gens von Legionellen. Für diesen Nachweis mussten zunächst geeignete Reaktionsbedingungen und eine Ausleseeinheit bestimmt werden. Anschließend wurde die Sensitivität der Sonde mit der umgekehrt komplementären Zielsequenz und die Spezifität mit verschiedenen DNA-Fragmenten, die sich von der Zielsequenz unterschieden, getestet. Im Vergleich zu abweichenden DNA-Sequenzen ähnlicher Länge, die auch in Legionella pneumophila vorkommen, wurde nur die Ziel-DNA spezifisch auf der Glasmikrofaser erkannt. Liegt ein einzelner Basenaustausch vor oder werden zwei Basen geändert, so kann die Sonde nicht mehr zwischen der Ziel-DNA und den abweichenden DNA-Fragmenten unterscheiden. Eine Detektion mit dieser Genauigkeit ist mit anderen Methoden wie z.B. der Schmelzpunktbestimmung möglich, wie hier prinzipiell demonstriert wurde. Es wurde ferner gezeigt, dass die Sonde auf der Glasmikrofaser eingetrocknet und über drei Monate bei Raumtemperatur gelagert werden kann und danach immer noch in der Lage ist, die Zielsequenz nachzuweisen. Schließlich wurde die Anwendbarkeit des faserbasierten FISH-Nachweises auch für genomische Legionellen-DNA getestet. Ohne weitere Prozessierung war die Sonde nicht in der Lage ihre Zielsequenz in der komplexen genomischen DNA zu erkennen. Nach der Auswahl und Anwendung geeigneter Restriktionsenzyme war eine spezifische Detektion der Legionellen-DNA gegenüber anderen Wasserkeimen mit ähnlichem Fragmentmuster wie Acinetobacter haemolyticus möglich. KW - Sensor KW - paper-based KW - Legionellen KW - Legionella KW - papier-basiert KW - sensor KW - Detektionssystem KW - detection system KW - Glasfaser KW - glass fiber Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-566833 ER - TY - THES A1 - Inal, Sahika T1 - Responsive polymers for optical sensing applications T1 - Responsive Polymere für optische Sensoren N2 - LCST-type synthetic thermoresponsive polymers can reversibly respond to certain stimuli in aqueous media with a massive change of their physical state. When fluorophores, that are sensitive to such changes, are incorporated into the polymeric structure, the response can be translated into a fluorescence signal. Based on this idea, this thesis presents sensing schemes which transduce the stimuli-induced variations in the solubility of polymer chains with covalently-bound fluorophores into a well-detectable fluorescence output. Benefiting from the principles of different photophysical phenomena, i.e. of fluorescence resonance energy transfer and solvatochromism, such fluorescent copolymers enabled monitoring of stimuli such as the solution temperature and ionic strength, but also of association/disassociation mechanisms with other macromolecules or of biochemical binding events through remarkable changes in their fluorescence properties. For instance, an aqueous ratiometric dual sensor for temperature and salts was developed, relying on the delicate supramolecular assembly of a thermoresponsive copolymer with a thiophene-based conjugated polyelectrolyte. Alternatively, by taking advantage of the sensitivity of solvatochromic fluorophores, an increase in solution temperature or the presence of analytes was signaled as an enhancement of the fluorescence intensity. A simultaneous use of the sensitivity of chains towards the temperature and a specific antibody allowed monitoring of more complex phenomena such as competitive binding of analytes. The use of different thermoresponsive polymers, namely poly(N-isopropylacrylamide) and poly(meth)acrylates bearing oligo(ethylene glycol) side chains, revealed that the responsive polymers differed widely in their ability to perform a particular sensing function. In order to address questions regarding the impact of the chemical structure of the host polymer on the sensing performance, the macromolecular assembly behavior below and above the phase transition temperature was evaluated by a combination of fluorescence and light scattering methods. It was found that although the temperature-triggered changes in the macroscopic absorption characteristics were similar for these polymers, properties such as the degree of hydration or the extent of interchain aggregations differed substantially. Therefore, in addition to the demonstration of strategies for fluorescence-based sensing with thermoresponsive polymers, this work highlights the role of the chemical structure of the two popular thermoresponsive polymers on the fluorescence response. The results are fundamentally important for the rational choice of polymeric materials for a specific sensing strategy. N2 - Als Reaktion auf bestimmte äußere Stimuli ändern bestimmte wasserlösliche Polymere reversibel ihren physikalischen Zustand. Dieser Vorgang kann mithilfe von Fluorophoren, die in die Polymerstrukturen eingebaut werden und deren Fluoreszenzeigenschaften vom Polymer¬zustand abhängen, detektiert werden. Diese Idee ist der Ausgangspunkt der vorliegenden Arbeit, die sich damit beschäftigt, wie äußerlich induzierte Änderungen der Löslichkeit solcher Polymere mit kovalent gebundenen Fluorophoren in Wasser in ein deutlich messbares Fluoreszenzsignal übersetzt werden können. Dazu werden photophysikalische Phänomene wie Fluoreszenz-Resonanz¬energie¬transfer und Solvatochromie ausgenutzt. In Kombination mit einem responsiven Polymergerüst wird es möglich, verschiedene Stimuli wie Lösungs¬temperatur oder Ionenstärke, oder auch Assoziation-Dissoziation Reaktionen mit anderen Makromolekülen oder biochemische Bindungs¬reaktionen über die Änderung von Fluorezenz¬farbe bzw. –Intensität autonom mit bloßem Auge zu detektieren. Unter anderem wurde ein wässriger ratiometrischer Temperatur- und Salzsensor entwickelt, der auf der komplexen supramolekularen Struktur eines thermoresponsiven Copolymers und eines thiophenbasierten konjugierten Polyelektrolyts beruht. Die Anbindung solvato¬chromer Fluorophore erlaubte den empfindlichen Nachweis einer Temperatur¬änderung oder des Vorhandenseins von Analyten. Komplexere Phänomene wie das kompetitive Anbinden von Analyten ließen sich hochempfindlich steuern und auslesen, indem gleichzeitig die Sensitivität dieser Polymeren gegenüber der Temperatur und spezifischen Antikörpern ausgenutzt wurde. Überraschenderweise wiesen die hier untersuchten thermoresponsiven Polymere wie poly-N-isopropylacrylamid (pNIPAm) oder poly-Oligoethylenglykolmethacrylate (pOEGMA) große Unterschiede bzgl. ihrer responsiven optischen Eigenschaften auf. Dies erforderte eine ausführliche Charakterisierung des Fluoreszenz- und Aggregationsverhaltens, unter- und oberhalb des Phasenübergangs, im Bezug auf die chemische Struktur. Ein Ergebnis war, dass alle drei Polymertypen sehr ähnliche temperaturabhängige makroskopische Absorptionseigenschaften aufweisen, während sich die Eigenschaften auf molekularer Ebene, wie der Hydratisierungsgrad oder die intermolekulare Polymerkettenaggregation, bei diesen Polymeren sehr unterschiedlich. Diese Arbeit zeigt damit anhand zweier sehr etablierter thermoresponsiver Polymere, nämlich pNIPAm und pOEGMA, das die chemische Struktur entscheidend für den Einsatz dieser Polymere in fluoreszenzbasierten Sensoren ist. Diese Ergebnisse haben große Bedeutung für die gezielte Entwicklung von Polymermaterialien für fluoreszenzbasierte Assays. KW - Responsive Polymere KW - Fluoreszenz KW - Sensor KW - Konjugierten polyelektrolyt KW - responsive polymer KW - fluorescence KW - sensor KW - conjugated polyelectrolyte Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-70806 ER -