TY - THES A1 - Klauder, Julia T1 - Makrophagenaktivierung durch Hyperinsulinämie als Auslöser eines Teufelkreises der Entzündung im Kontext des metabolischen Syndroms T1 - Macrophage activation by hyperinsulinemia as a trigger of a vicious cycle of inflammation in the context of the metabolic syndrome N2 - Insulinresistenz ist ein zentraler Bestandteil des metabolischen Syndroms und trägt maßgeblich zur Ausbildung eines Typ-2-Diabetes bei. Eine mögliche Ursache für die Entstehung von Insulinresistenz ist eine chronische unterschwellige Entzündung, welche ihren Ursprung im Fettgewebe übergewichtiger Personen hat. Eingewanderte Makrophagen produzieren vermehrt pro-inflammatorische Mediatoren, wie Zytokine und Prostaglandine, wodurch die Konzentrationen dieser Substanzen sowohl lokal als auch systemisch erhöht sind. Darüber hinaus weisen übergewichtige Personen einen gestörten Fettsäuremetabolismus und eine erhöhte Darmpermeabilität auf. Ein gesteigerter Flux an freien Fettsäuren vom Fettgewebe in andere Organe führt zu einer lokalen Konzentrationssteigerung in diesen Organen. Eine erhöhte Darmpermeabilität erleichtert das Eindringen von Pathogenen und anderer körperfremder Substanzen in den Körper. Ziel dieser Arbeit war es, zu untersuchen, ob hohe Konzentrationen von Insulin, des bakteriellen Bestandteils Lipopolysaccharid (LPS) oder der freien Fettsäure Palmitat eine Entzündungsreaktion in Makrophagen auslösen oder verstärken können und ob diese Entzündungsantwort zur Ausbildung einer Insulinresistenz beitragen kann. Weiterhin sollte untersucht werden, ob Metabolite und Signalsubstanzen, deren Konzentrationen beim metabolischen Syndrom erhöht sind, die Produktion des Prostaglandins (PG) E2 begünstigen können und ob dieses wiederum die Entzündungsreaktion und seine eigene Produktion in Makrophagen regulieren kann. Um den Einfluss dieser Faktoren auf die Produktion pro-inflammatorischer Mediatoren in Makrophagen zu untersuchen, wurden Monozyten-artigen Zelllinien und primäre humane Monozyten, welche aus dem Blut gesunder Probanden isoliert wurden, in Makrophagen differenziert und mit Insulin, LPS, Palmitat und/ oder PGE2 inkubiert. Überdies wurden primäre Hepatozyten der Ratte isoliert und mit Überständen Insulin-stimulierter Makrophagen inkubiert, um zu untersuchen, ob die Entzündungsanwort in Makrophagen an der Ausbildung einer Insulinresistenz in Hepatozyten beteiligt ist. Insulin induzierte die Expression pro-inflammatorischer Zytokine in Makrophagen-artigen Zelllinien wahrscheinlich vorrangig über den Phosphoinositid-3-Kinase (PI3K)-Akt-Signalweg mit anschließender Aktiverung des Transkriptionsfaktors NF-κB (nuclear factor 'kappa-light-chain-enhancer' of activated B-cells). Die dabei ausgeschütteten Zytokine hemmten in primären Hepatozyten der Ratte die Insulin-induzierte Expression der Glukokinase durch Überstände Insulin-stimulierter Makrophagen. Auch LPS oder Palmitat, deren lokale Konzentrationen im Zuge des metabolischen Syndroms erhöht sind, waren in der Lage, die Expression pro-inflammatorischer Zytokine in Makrophagen-artigen Zelllinien zu stimulieren. Während LPS seine Wirkung, laut Literatur, unbestritten über eine Aktivierung des Toll-ähnlichen Rezeptors (toll-like receptor; TLR) 4 vermittelt, scheint Palmitat jedoch weitestgehend TLR4-unabhängig wirken zu können. Vielmehr schien die de novo-Ceramidsynthese eine entscheidene Rolle zu spielen. Darüber hinaus verstärkte Insulin sowohl die LPS- als auch die Palmitat-induzierte Ent-zündungsantwort in beiden Zelllinien. Die in Zelllinien gewonnenen Ergebnisse wurden größtenteils in primären humanen Makrophagen bestätigt. Desweiteren induzierten sowohl Insulin als auch LPS oder Palmitat die Produktion von PGE2 in den untersuchten Makrophagen. Die Daten legen nahe, dass dies auf eine gesteigerte Expression PGE2-synthetisierender Enzyme zurückzuführen ist. PGE2 wiederum hemmte auf der einen Seite die Stimulus-abhängige Expression des pro-inflammatorischen Zytokins Tumornekrosefaktor (TNF) α in U937-Makrophagen. Auf der anderen Seite verstärkte es jedoch die Expression der pro-inflammatorischen Zytokine Interleukin- (IL-) 1β und IL-8. Darüber hinaus verstärkte es die Expression von IL-6-Typ-Zytokinen, welche sowohl pro- als auch anti-inflammatorisch wirken können. Außerdem vestärkte PGE2 die Expression PGE2-synthetisierender Enzyme. Es scheint daher in der Lage zu sein, seine eigene Synthese zu verstärken. Zusammenfassend kann die Freisetzung pro-inflammatorischer Mediatoren aus Makro-phagen im Zuge einer Hyperinsulinämie die Entstehung einer Insulinresistenz begünstigen. Insulin ist daher in der Lage, einen Teufelskreis der immer stärker werdenden Insulin-resistenz in Gang zu setzen. Auch Metabolite und Signalsubstanzen, deren Konzentrationen beim metabolischen Syndrom erhöht sind (zum Beispiel LPS, freie Fettsäuren und PGE2), lösten Entzündungsantworten in Makrophagen aus. Das wechselseitige Zusammenspiel von Insulin und diesen Metaboliten und Signalsubstanzen löste eine stärkere Entzündungsantwort in Makrophagen aus als jeder der Einzelkomponenten. Die dadurch freigesetzten Zytokine könnten zur Manifestation einer Insulinresistenz und des metabolischen Syndroms beitragen. N2 - Insulin resistance is a central component of the metabolic syndrome and is a major contributor to the development of type 2 diabetes. One possible cause of insulin resistance is chronic low-grade inflammation, which originates in the adipose tissue of obese individuals. Immigrated macrophages produce increased levels of pro-inflammatory mediators such as cytokines and prostaglandins, resulting in increased concentrations of these substances both locally and systemically. In addition, obese individuals exhibit impaired fatty acid metabolism and increased intestinal permeability. Increased flux of free fatty acids from adipose tissue to other organs results in increased local concentrations in these organs. Increased intestinal permeability facilitates the entry of pathogens and other exogenous substances into the body. The aim of this work was to investigate whether high concentrations of insulin, the bacterial component lipopolysaccharide (LPS), or the free fatty acid palmitate can induce or enhance an inflammatory response in macrophages and whether this inflammatory response can contribute to the development of insulin resistance. Furthermore, to investigate whether metabolites and signaling substances whose concentrations are elevated in the metabolic syndrome can promote the production of prostaglandin (PG) E2 and whether this in turn can regulate the inflammatory response and its own production in macrophages. To investigate the influence of these factors on the production of pro-inflammatory mediators in macrophages, monocyte-like cell lines and primary human monocytes, that were isolated from the blood of healthy volunteers, were differentiated into macrophages and incubated for with insulin, LPS, palmitate and/ or PGE2. In addition, primary rat hepatocytes were isolated and incubated with supernatants of insulin-stimulated macrophages to investigate whether the inflammatory response in macrophages is involved in the development of insulin resistance in hepatocytes. Insulin induced the expression of pro-inflammatory cytokines in macrophage-like cell lines probably primarily via the phosphoinositide 3-kinase (PI3K)-Akt pathway with subsequent activation of the transcription factor NF-κB (nuclear factor 'kappa-light-chain-enhancer' of activated B-cells). The cytokines released in this process inhibited insulin-induced expression of glucokinase by supernatants of insulin-stimulated macrophages in primary rat hepatocytes. Also, LPS or palmitate, whose local concentrations are increased in the course of metabolic syndrome, were able to stimulate the expression of pro-inflammatory cytokines in macrophage-like cell lines. While LPS, according to the literature, undisputedly mediates its effect via activation of toll-like receptor (TLR) 4, palmitate, however, appears to be able to act mainly in a TLR4-independent manner. Rather, de novo ceramide synthesis appeared to play a crucial role. Moreover, insulin enhanced both LPS- and palmitate-induced inflammatory responses in both cell lines. The results obtained in macrophage-like cell lines were largely confirmed in primary human macrophages. Furthermore, both insulin and LPS or palmitate induced PGE2 production in the macrophages studied. The data suggest that this was not due to increased expression of arachidonic acid-synthesizing enzymes but rather to increased expression of PGE2-synthesizing enzymes. On the one hand PGE2 inhibited the stimulus-dependent expression of the pro-inflammatory cytokine tumor necrosis factor (TNF) α in U937 macrophages. However, on the other hand, it enhanced the expression of the pro-inflammatory cytokines interleukin- (IL-) 1β and IL-8. In addition, it enhanced the expression of IL-6-type cytokines, which can be both pro- and anti-inflammatory. In addition, PGE2 enhanced the expression of PGE2-synthesizing enzymes. It therefore appears to be able to enhance its own synthesis. In conclusion, the release of pro-inflammatory mediators from macrophages in the course of hyperinsulinemia may favor the development of insulin resistance. Thus, the hyperinsulinemia might be augmented in a vicious cycle feed forward loop. Metabolites and signaling substances whose concentrations are elevated in the metabolic syndrome (for example, LPS, free fatty acids, and PGE2) also triggered inflammatory responses in macrophages. The synergistic interaction of insulin and these metabolites and signaling substances triggered a stronger inflammatory response in macrophages than any of the individual components. The released cytokines could contribute to the manifestation of insulin resistance and the metabolic syndrome. KW - Metabolisches Syndrom KW - Entzündung KW - Makrophagen KW - Insulin KW - Zytokine KW - Typ-2-Diabetes KW - Prostaglandin KW - inflammation KW - insulin KW - macrophages KW - metabolic syndrom KW - prostaglandine KW - Type-2-diabetes KW - cytokines Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-520199 ER - TY - THES A1 - Schjeide, Brit-Maren T1 - Development and characterization of the MoN-Light BoNT assay to determine the toxicity of botulinum neurotoxin in motor neurons differentiated from CRISPR-modified induced pluripotent stem cells T1 - Entwicklung und Charakterisierung des MoN-Light BoNT-Tests zur Bestimmung der Toxizität von Botulinum-Neurotoxin in Motorneuronen, die aus CRISPR-modifizierten induzierten pluripotenten Stammzellen differenziert wurden N2 - Botulinum neurotoxin (BoNT) is produced by the anaerobic bacterium Clostridium botulinum. It is one of the most potent toxins found in nature and can enter motor neurons (MN) to cleave proteins necessary for neurotransmission, resulting in flaccid paralysis. The toxin has applications in both traditional and esthetic medicine. Since BoNT activity varies between batches despite identical protein concentrations, the activity of each lot must be assessed. The gold standard method is the mouse lethality assay, in which mice are injected with a BoNT dilution series to determine the dose at which half of the animals suffer death from peripheral asphyxia. Ethical concerns surrounding the use of animals in toxicity testing necessitate the creation of alternative model systems to measure the potency of BoNT. Prerequisites of a successful model are that it is human specific; it monitors the complete toxic pathway of BoNT; and it is highly sensitive, at least in the range of the mouse lethality assay. One model system was developed by our group, in which human SIMA neuroblastoma cells were genetically modified to express a reporter protein (GLuc), which is packaged into neurosecretory vesicles, and which, upon cellular depolarization, can be released – or inhibited by BoNT – simultaneously with neurotransmitters. This assay has great potential, but includes the inherent disadvantages that the GLuc sequence was randomly inserted into the genome and the tumor cells only have limited sensitivity and specificity to BoNT. This project aims to improve these deficits, whereby induced pluripotent stem cells (iPSCs) were genetically modified by the CRISPR/Cas9 method to insert the GLuc sequence into the AAVS1 genomic safe harbor locus, precluding genetic disruption through non-specific integrations. Furthermore, GLuc was modified to associate with signal peptides that direct to the lumen of both large dense core vesicles (LDCV), which transport neuropeptides, and synaptic vesicles (SV), which package neurotransmitters. Finally, the modified iPSCs were differentiated into motor neurons (MNs), the true physiological target of BoNT, and hypothetically the most sensitive and specific cells available for the MoN-Light BoNT assay. iPSCs were transfected to incorporate one of three constructs to direct GLuc into LDCVs, one construct to direct GLuc into SVs, and one “no tag” GLuc control construct. The LDCV constructs fused GLuc with the signal peptides for proopiomelanocortin (hPOMC-GLuc), chromogranin-A (CgA-GLuc), and secretogranin II (SgII-GLuc), which are all proteins found in the LDCV lumen. The SV construct comprises a VAMP2-GLuc fusion sequence, exploiting the SV membrane-associated protein synaptobrevin (VAMP2). The no tag GLuc expresses GLuc non-specifically throughout the cell and was created to compare the localization of vesicle-directed GLuc. The clones were characterized to ensure that the GLuc sequence was only incorporated into the AAVS1 safe harbor locus and that the signal peptides directed GLuc to the correct vesicles. The accurate insertion of GLuc was confirmed by PCR with primers flanking the AAVS1 safe harbor locus, capable of simultaneously amplifying wildtype and modified alleles. The PCR amplicons, along with an insert-specific amplicon from candidate clones were Sanger sequenced to confirm the correct genomic region and sequence of the inserted DNA. Off-target integrations were analyzed with the newly developed dc-qcnPCR method, whereby the insert DNA was quantified by qPCR against autosomal and sex-chromosome encoded genes. While the majority of clones had off-target inserts, at least one on-target clone was identified for each construct. Finally, immunofluorescence was utilized to localize GLuc in the selected clones. In iPSCs, the vesicle-directed GLuc should travel through the Golgi apparatus along the neurosecretory pathway, while the no tag GLuc should not follow this pathway. Initial analyses excluded the CgA-GLuc and SgII-GLuc clones due to poor quality protein visualization. The colocalization of GLuc with the Golgi was analyzed by confocal microscopy and quantified. GLuc was strongly colocalized with the Golgi in the hPOMC-GLuc clone (r = 0.85±0.09), moderately in the VAMP2-GLuc clone (r = 0.65±0.01), and, as expected, only weakly in the no tag GLuc clone (r = 0.44±0.10). Confocal microscopy of differentiated MNs was used to analyze the colocalization of GLuc with proteins associated with LDCVs and SVs, SgII in the hPOMC-GLuc clone (r = 0.85±0.08) and synaptophysin in the VAMP2-GLuc clone (r = 0.65±0.07). GLuc was also expressed in the same cells as the MN-associated protein, Islet1. A significant portion of GLuc was found in the correct cell type and compartment. However, in the MoN-Light BoNT assay, the hPOMC-GLuc clone could not be provoked to reliably release GLuc upon cellular depolarization. The depolarization protocol for hPOMC-GLuc must be further optimized to produce reliable and specific release of GLuc upon exposure to a stimulus. On the other hand, the VAMP2-GLuc clone could be provoked to release GLuc upon exposure to the muscarinic and nicotinic agonist carbachol. Furthermore, upon simultaneous exposure to the calcium chelator EGTA, the carbachol-provoked release of GLuc could be significantly repressed, indicating the detection of GLuc was likely associated with vesicular fusion at the presynaptic terminal. The application of the VAMP2-GLuc clone in the MoN-Light BoNT assay must still be verified, but the results thus far indicate that this clone could be appropriate for the application of BoNT toxicity assessment. N2 - Botulinum neurotoxin (BoNT) wird von dem obligat anaeroben Bakterium Clostridium botulinum produziert. Es ist eines der giftigsten natürlich vorkommenden Toxine. Nach Aufnahme in den Körper dringt es in Motorneurone ein und spaltet spezifische Proteine, die für die Freisetzung des Neurotransmitters Acetylcholin notwendig sind. Dadurch kommt es zu einer schlaffen Lähmung der Muskulatur, die zu einer peripheren Asphyxie führt. Trotz seiner hohen Toxizität wird BoNT als Therapeutikum in der klassischen und kosmetischen Medizin genutzt. Da die Aktivität des biosynthetisch gewonnenen Toxins zwischen einzelnen Chargen trotz gleicher Proteinkonzentration stark variiert, muss die Aktivität jeder Präparation getestet werden. Dafür ist der Goldstandard der Mausletalitäts-Test, bei dem den Tieren unterschiedliche Dosen des Toxins injiziert werden und die Dosis ermittelt wird, bei der die Hälfte der Tiere verstirbt. Wegen der damit verbundenen ethischen Probleme wird nach Ersatzverfahren für diesen Tierversuch gesucht. Ein Ersatzverfahren muss folgende Bedingungen erfüllen: Es muss humanspezifisch sein; alle Teilschritte der BoNT-Wirkung messen; und eine hohe Empfindlichkeit haben, die in der gleichen Größenordnung wie der Maus-Letalitätstest liegt. Es wurde bereits ein Testsystem von unserer Gruppe entwickelt, bei dem humane SIMA-Neuroblastomzellen genetisch so modifiziert wurden, dass sie ein Reporterprotein (GLuc) exprimieren. Dieses wurde in neurosekretorische Vesikel verpackt und durch Depolarisation der Zellen gleichzeitig mit Neurotransmittern freigesetzt. Die Freisetzung wurde durch BoNT gehemmt. Obwohl dieser Assay großes Potential hat, wird seine Anwendbarkeit durch inhärente Nachteile eingeschränkt, da die GLuc-Sequenz zufällig in das Genom eingefügt wurde und die Tumorzellen nur eine begrenzte Sensitivität und Spezifität gegenüber BoNT haben. Diese Dissertation hatte zum Ziel, diese Defizite zu verbessern. Zu diesem Zweck wurden induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) durch die CRISPR/Cas9-Methode genetisch modifiziert, um die GLuc-Sequenz in den genomischen Safe-Harbor-Lokus AAVS1 einzufügen, wodurch ausgeschlossen wird, dass durch unspezifische Integrationen ins Genom die Funktion anderer Gene gestört wird. Darüber hinaus wurde GLuc so modifiziert, dass sie mit Signalpeptiden versehen wurde, die sie zum Lumen sowohl von „Large Dense Core“ Vesikeln (LDCV), die Neuropeptide transportieren, als auch von synaptischen Vesikeln (SV), die Neurotransmitter verpacken, führen. Schließlich wurden die modifizierten iPSCs in Motorneurone (MNs) differenziert, der eigentlichen physiologischen Zielstruktur von BoNT, die mutmaßlich am empfindlichsten und spezifischsten auf BoNT reagieren und daher für den MoN-Light BoNT-Assay am geeignetsten sein sollten. iPSCs wurden transfiziert, um eines von drei Konstrukten zu integrieren. 1) ein Konstrukt, das GLuc in LDCVs leitet, 2) ein Konstrukt, das GLuc durch Fusion mit VAMP2 in SVs leitet und 3) ein "no tag" GLuc-Kontrollkonstrukt. Die LDCV-Konstrukte enthielten die Signalpeptide Proopiomelanocortin (hPOMC), Chromogranin-A (CgA) und Secretogranin II (SgII). Die VAMP2-GLuc-Fusion transportiert GLuc in SVs, so dass Neurotransmitter und GLuc gemeinsam und nicht, wie bei den anderen Konstrukten parallel, aus unterschiedlichen Vesikeln freigesetzt werden. Die "no tag GLuc"-Kontrolle wurde erstellt, um die Lokalisation von GLuc, die ohne Sortierungssignal in der Zelle exprimiert wird, mit der GLuc mit Sortierungssignalen für die unterschiedlichen Vesikel zu vergleichen. Die Klone wurden charakterisiert, um sicherzustellen, dass die GLuc-Sequenz ausschließlich in den AAVS1-Safe-Harbor-Lokus eingebaut wurde und dass die Signalpeptide GLuc zu den richtigen Vesikeln leiten. Die korrekte Insertion von GLuc wurde durch PCR mit Primern bestätigt, die den AAVS1-Lokus flankieren und in der Lage sind, gleichzeitig Wildtyp- und modifizierte Allele zu amplifizieren. Mögliche Integrationen außerhalb der Zielregion wurden mit der neu entwickelten dc-qcnPCR analysiert, wobei die Insert-DNA mittels qPCR gegen autosomal und geschlechts-chromosomal kodierte Gene quantifiziert wurde. Auch wenn die Mehrzahl der analysierten Klone Off-Target-Integrationen enthielt, konnte für jedes Konstrukt mindestens ein vollständig On-Target-homozygoter Klon identifiziert werden. Schließlich wurden die GLuc in ausgewählten Klonen durch Immunfluoreszenz lokalisiert. In iPSCs sollte die GLuc mit Sortierungssequenzen für Vesikel durch den Golgi-Apparat entlang des neurosekretorischen Weges wandern, während die „no tag“ GLuc diesem Weg nicht folgen sollte. Anfängliche Analysen schlossen die CgA-GLuc- und SgII-GLuc-Klone aufgrund der schlechten Qualität der Proteinvisualisierung aus. Die Kolokalisation von GLuc mit dem Golgi-Apparat wurde mittels konfokaler Mikroskopie analysiert und quantifiziert. GLuc war im hPOMC-GLuc-Klon sehr stark (r = 0,85±0,09), im VAMP2-GLuc-Klon mäßig (r = 0,65±0,01) und im no tag GLuc-Klon erwartungsgemäß nur schwach (r = 0,44±0,10) mit Golgi-Markern assoziiert. Nach der Differenzierung in MNs wurde die Koexpression von GLuc mit dem MN-assoziierten Protein Islet1 bestätigt. Konfokale Mikroskopie von MNs wurde angewandt, um die Kolokalisation von GLuc mit Proteinen zu quantifizieren, die mit LDCVs und SVs assoziiert sind, nämlich SgII mit der hPOMC-GLuc (r = 0,85±0,08) und Synaptophysin mit VAMP2-GLuc (r = 0,65±0,07). Ein signifikanter Anteil von GLuc wurde im richtigen Zelltyp und Kompartiment gefunden. Im MoN-Light BoNT-Assay wurde die GLuc jedoch nicht zuverlässig durch Depolarisation aus dem hPOMC-GLuc-Klon freigesetzt. Das für die SIMA-hPOMC-Gluc-Zellen entwickelte Depolarisationsprotokoll muss für hPOMC-GLuc weiter optimiert werden, um eine zuverlässige und spezifische Freisetzung von GLuc bei Exposition gegenüber einem Stimulus zu erreichen. Andererseits konnte die GLuc aus dem VAMP2-GLuc-Klon durch Stimulation mit dem muskarinischen und nikotinischen Agonisten Carbachol freigesetzt werden. Die Carbachol-abhängige Freisetzung der GLuc konnte mit dem Calcium-Chelator EGTA unterdrückt werden, was darauf hindeutet, dass die Freisetzung der GLuc wahrscheinlich von der Fusion synaptischer Vesikel am präsynaptischen Terminal abhängig ist. Die Anwendung des VAMP2-GLuc-Klons im MoN-Light BoNT-Assay muss noch verifiziert werden, aber die bisherigen Ergebnisse deuten darauf hin, dass dieser Klon für die Anwendung der BoNT-Toxizitätsbewertung geeignet sein könnte. KW - Induced pluripotent stem cells KW - Alternative to animal testing KW - Botulinum neurotoxin KW - Motor neurons KW - CRISPR/Cas9 KW - induzierte pluripotente Stammzellen KW - alternative zu Tierversuchen KW - Botulinumtoxine KW - Motorneurone KW - CRISPR/Cas9 Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-516278 ER - TY - THES A1 - Burkhardt, Wiebke T1 - Role of dietary sulfonates in the stimulation of gut bacteria promoting intestinal inflammation T1 - Die Rolle nahrungsrelevanter Sulfonate bei der Stimulation von entzündungsfördernden Darmbakterien N2 - The interplay between intestinal microbiota and host has increasingly been recognized as a major factor impacting health. Studies indicate that diet is the most influential determinant affecting the gut microbiota. A diet rich in saturated fat was shown to stimulate the growth of the colitogenic bacterium Bilophila wadsworthia by enhancing the secretion of the bile acid taurocholate (TC). The sulfonated taurine moiety of TC is utilized as a substrate by B. wadsworthia. The resulting overgrowth of B. wadsworthia was accompanied by an increased incidence and severity of colitis in interleukin (IL)-10-deficient mice, which are genetically prone to develop inflammation. Based on these findings, the question arose whether the intake of dietary sulfonates also stimulates the growth of B. wadsworthia and thereby promotes intestinal inflammation in genetically susceptible mice. Dietary sources of sulfonates include green vegetables and cyanobacteria, which contain the sulfolipids sulfoquinovosyl diacylglycerols (SQDG) in considerable amounts. Based on literature reports, the gut commensal Escherichia coli is able to release sulfoquinovose (SQ) from SQDG and in further steps, convert SQ to 2,3-dihydroxypropane-1-sulfonate (DHPS) and dihydroxyacetone phosphate. DHPS may then be utilized as a growth substrate by B. wadsworthia, which results in the formation of sulfide. Both, sulfide formation and a high abundance of B. wadsworthia have been associated with intestinal inflammation. In the present study, conventional IL-10-deficient mice were fed either a diet supplemented with the SQDG-rich cyanobacterium Spirulina (20%, SD) or a control diet. In addition SQ, TC, or water were orally applied to conventional or gnotobiotic IL-10-deficient mice. The gnotobiotic mice harbored a simplified human intestinal microbiota (SIHUMI) either with or without B. wadsworthia. During the intervention period, the body weight of the mice was monitored, the colon permeability was assessed and fecal samples were collected. After the three-week intervention, the animals were examined with regard to inflammatory parameters, microbiota composition and sulfonate concentrations in different intestinal sites. None of the mice treated with the above-mentioned sulfonates showed weight loss or intestinal inflammation. Solely mice fed SD or gavaged with TC displayed a slight immune response. These mice also displayed an altered microbiota composition, which was not observed in mice gavaged with SQ. The abundance of B. wadsworthia was strongly reduced in mice fed SD, while that of mice treated with SQ or TC was in part slightly increased. The intestinal SQ-concentration was elevated in mice orally treated with SD or SQ, whereas neither TC nor taurine concentrations were consistently elevated in mice gavaged with TC. Additional colonization of SIHUMI mice with B. wadsworthia resulted in a mild inflammatory response, but only in mice treated with TC. In general, TC-mediated effects on the immune system and abundance of B. wadsworthia were not as strong as described in the literature. In summary, neither the tested dietary sulfonates nor TC led to bacteria-induced intestinal inflammation in the IL-10-deficient mouse model, which was consistently observed in both conventional and gnotobiotic mice. For humans, this means that foods containing SQDG, such as spinach or Spirulina, do not increase the risk of intestinal inflammation. N2 - Die mikrobielle Lebensgemeinschaft im Darm des Menschen, die intestinale Mikrobiota, übt einen beträchtlichen Einfluss auf die Gesundheit des Wirts aus. Der Wirt wiederum beeinflusst die intestinale Mikrobiota durch seine Ernährung. Bei Mäusen wurde beobachtet, dass eine Ernährung reich an gesättigten Fettsäuren zu Darmentzündung führen kann, wenn die Tiere Interleukin (IL)-10-defizient sind, was sie empfänglich für Entzündungen macht. Durch die fettreiche Ernährung wurde vermehrt die sulfonierte Gallensäure Taurocholat (TC) sekretiert, welche wiederum das Wachstum des entzündungsfördernden Bakteriums Bilophila wadsworthia stimulierte. Aufgrund dieser Beobachtung stellte sich die Frage, ob auch nahrungsrelevante Sulfonate bei IL-10-defizienten Mäusen zu einer bakteriell induzierten Darmentzündung führen können. Bei den in dieser Arbeit untersuchten Sulfonaten handelt es sich um die Sulfolipide Sulfoquinovosyldiacylglycerole (SQDG), welche in den meisten photosynthetischen Organismen wie Pflanzen, Moosen und Cyanobakterien vorkommen. Aus der Literatur ist bekannt, dass SQDG durch das kommensale Darmbakterium Escherichia coli zu Sulfoquinovose (SQ) und in weiteren Schritten zu 2,3-Dihydroxypropan-1-sulfonat (DHPS) und Dihydroxyacetonphosphat gespalten werden kann. DHPS kann von B. wadsworthia wiederum als Wachstumssubstrat verwendet und zu Sulfid reduziert werden. Sowohl für B. wadsworthia als auch für Sulfid wird angenommen, dass sie zur Entstehung von Darmentzündungen beitragen. Um diese Hypothese zu untersuchen, wurden konventionelle IL-10-defiziente Mäuse für drei Wochen mit einem Futter gefüttert, welches das SQDG-reiche Cyanobakterium Spirulina (20%, SD) enthielt. Weiterhin wurde IL-10-defizienten Mäusen mit einer komplexen oder minimalen intestinalen Mikrobiota für drei Wochen SQ oder TC oral verabreicht. Die Tiere mit der minimalen Mikrobiota waren mit einer simplifizierten humanen intestinalen Mikrobiota (SIHUMI) mit oder ohne B. wadsworthia besiedelt. Während der Versuche wurden die Tiere gewogen, Fäzesproben wurden gesammelt und ein Darm-Permeabilitätstest wurde durchgeführt. Nach der dreiwöchigen Intervention wurden Entzündungsparameter, Mikrobiotazusammensetzung und Sulfonatkonzentrationen in den einzelnen Darmabschnitten der Mäuse untersucht. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigten, dass keines der getesteten Sulfonate zu Gewichtsverlust oder Darmentzündung führte. Lediglich die Mäuse, die mit SD gefüttert oder denen TC appliziert wurde, zeigten Anzeichen einer schwachen Immunantwort. Auch wiesen diese Mäuse Veränderungen in der Zusammensetzung der Darmmikrobiota auf, was bei den mit SQ behandelten Mäusen nicht der Fall war. Die Zellzahl von B. wadsworthia war in SD-gefütterten Mäusen deutlich reduziert, während die Zellzahl dieses Bakteriums in den Mäuse, die mit SQ oder TC behandelt wurden, nur teilweise leicht erhöht war. Die SQ-Konzentrationen in den Inhalten einzelner Darmabschnitte waren bei den mit SD oder SQ behandelten Mäusen erhöht. Die Taurin- und TC-Konzentrationen glichen bei mit TC behandelten Mäusen überwiegend denen der Kontrolltiere. Die zusätzliche Besiedlung der SIHUMI-Mäuse mit B. wadsworthia führte nur in Tieren, denen TC appliziert wurde, zu leicht erhöhten Entzündungswerten. Allgemein übte die orale Applikation von TC weniger starke Effekte auf das Entzündungsgeschehen und die Mikrobiotazusammensetzung der Mäuse aus als in der Literatur beschrieben. Die Ergebnisse dieser Studie legen nahe, dass weder das SQDG-reiche Futter noch die orale Applikation von SQ oder TC zu einer bakteriell induzierten Darmentzündung bei IL-10-defizienten Mäusen führt. Für den Menschen bedeutet dies, dass SQDG-haltige Lebensmittel wie Spinat oder Spirulina das Risiko für Darmentzündungen nicht erhöhen. KW - Bilophila wadsworthia KW - Dietary sulfonates KW - Inflammatory bowel disease KW - Bilophila wadsworthia KW - Nahrungssulfonate KW - chronisch-entzündliche Darmerkrankungen Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-513685 ER - TY - THES A1 - Hauffe, Robert T1 - Investigating metabolic consequences of an HSP60 reduction during diet-induced obesity T1 - Metabolische Folgen einer HSP60 Reduktion während des Diät-induzierten Übergewichts N2 - The mitochondrial chaperone complex HSP60/HSP10 facilitates mitochondrial protein homeostasis by folding more than 300 mitochondrial matrix proteins. It has been shown previously that HSP60 is downregulated in brains of type 2 diabetic (T2D) mice and patients, causing mitochondrial dysfunction and insulin resistance. As HSP60 is also decreased in peripheral tissues in T2D animals, this thesis investigated the effect of overall reduced HSP60 in the development of obesity and associated co-morbidities. To this end, both female and male C57Bl/6N control (i.e. without further alterations in their genome, Ctrl) and heterozygous whole-body Hsp60 knock-out (Hsp60+/-) mice, which exhibit a 50 % reduction of HSP60 in all tissues, were fed a normal chow diet (NCD) or a highfat diet (HFD, 60 % calories from fat) for 16 weeks and were subjected to extensive metabolic phenotyping including indirect calorimetry, NMR spectroscopy, insulin, glucose and pyruvate tolerance tests, vena cava insulin injections, as well as histological and molecular analysis. Interestingly, NCD feeding did not result in any striking phenotype, only a mild increase in energy expenditure in Hsp60+/- mice. Exposing mice to a HFD however revealed an increased body weight due to higher muscle mass in female Hsp60+/- mice, with a simultaneous decrease in energy expenditure. Additionally, these mice displayed decreased fasting glycemia. Opposingly, male Hsp60+/- compared to control mice showed lower body weight gain due to decreased fat mass and an increased energy expenditure, strikingly independent of lean mass. Further, only male Hsp60+/- mice display improved HOMA-IR and Matsuda insulin sensitivity indices. Despite the opposite phenotype in regards to body weight development, Hsp60+/- mice of both sexes show a significantly higher cell number, as well as a reduction in adipocyte size in the subcutaneous and gonadal white adipose tissue (sc/gWAT). Curiously, this adipocyte hyperplasia – usually associated with positive aspects of WAT function – is disconnected from metabolic improvements, as the gWAT of male Hsp60+/- mice shows mitochondrial dysfunction, oxidative stress, and insulin resistance. Transcriptomic analysis of gWAT shows an up regulation of genes involved in macroautophagy. Confirmatory, expression of microtubuleassociated protein 1A/1B light chain 3B (LC3), as a protein marker of autophagy, and direct measurement of lysosomal activity is increased in the gWAT of male Hsp60+/- mice. In summary, this thesis revealed a novel gene-nutrient interaction. The reduction of the crucial chaperone HSP60 did not have large effects in mice fed a NCD, but impacted metabolism during DIO in a sex-specific manner, where, despite opposing body weight and body composition phenotypes, both female and male Hsp60+/- mice show signs of protection from high fat diet-induced systemic insulin resistance. N2 - Der mitochondriale Chaperonkomplex HSP60/10 ist für die korrekte Faltung von über 300 mitochondrialen Matrixproteinen verantwortlich. Es wurde bereits gezeigt, dass HSP60 in Gehirnen von Patienten sowie Mäusen mit Typ 2 Diabetes (T2D) reduziert ist, was zu mitochondrialer Dysfunktion und Insulinresistenz führt. HSP60 ist darüber hinaus auch in peripheren Organen von T2D Mäusen reduziert. Die hier vorliegende Arbeit hat daher den Einfluss einer generellen Reduktion von HSP60 auf die Entwicklung von Übergewicht und die damit assoziierten Komorbiditäten untersucht. Hierfür wurden weibliche und männliche C57Bl/6N Kontroll Mäuse (d.h. ohne wietere Veränderung ihres Genoms, Ctrl), sowie C57Bl/6N Mäuse mit einer heterozygoten Deletion von HSP60 (Hsp60+/-) genutzt. Die Hsp60+/- Maus zeigt eine 50 % Reduktion von HSP60 in allen Geweben. Allen Tieren wurde in der Folge entweder eine normale Haltungsdiät (NCD) oder eine 60 % Hochfettdiät (HFD) gefüttert und einer intensiven metabolischen Charakterisierung unterzogen. Dies beinhaltete indirekte Kalorimetrie, NMR Spektroskopie, Insulin, Glukose und Pyruvat Toleranztests, direkte vena cava Insulinapplikation, sowie eingehende histologische und molekulare Untersuchungen. Interessanterweise zeigte die Fütterung mit der NCD keine stark ausgeprägten Phänotypen, lediglich ein leichter Anstieg im Energieverbrauch war zu beobachten. Die Fütterung mit der HFD dagegen führte auf Grund von größerer Muskelmasse zu einem erhöhten Körpergewicht in weiblichen Hsp60+/- Mäusen, was mit gleichzeitig verringertem Energieverbrauch einherging. Zusätzlich war bei diesen Mäusen der gefastete Bluzuckerspiegel verringert. Im Gegensatz dazu zeigten männliche Hsp60+/- Mäuse ein verringertes Körpergewicht, bedingt durch eine geringere Fettmasse sowie erhöhtem Energieverbrauch. Darüber hinaus war bei männlichen Hsp60+/- Mäusen eine Verbesserung der Insulin Sensitivitätsindizes HOMA-IR und Matsuda Index zu verzeichnen. Trotz dieses gegenteiligen Phänotyps zeigten beide Geschlechter eine erhöhte Zellzahl, sowie eine verringerte Zellgröße der Adipozyten im subkutanen und gonadalen weißen Fettgewebe (sc/gWAT (engl: white adipose tissue)). Überraschenderweise ist diese Adipozytenhyperplasie – normalerweise assoziiert mit verbesserter Fettgewebsfunktion – losgelöst von verbesserter WAT Funktion, da das gWAT männlicher Hsp60+/- Mäuse mitochondriale Dysfunktion, oxidativen Stress und Insulinresistenz zeigt. Eine folgende Transkriptomanalyse gab Hinweise auf eine Induktion der Makroautophagie. Bestätigend hierfür ist im gWAT der heterozygoten Mäuse die Expression des Autophagie Markers microtubule-associated protein 1A/1B light chain 3B (LC3), sowie die direkt gemessene lysosomale Aktivität erhöht. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit eine neuartige Gen-Nährstoff Interaktion gezeigt werden. So zeigte die Reduktion des wichtigen Chaperons HSP60 unter NCD Fütterung nur schwache Effekte, während unter Hochfettdiätfütterung der Stoffwechsel geschlechtsspezifisch beinflusst wurde. Obwohl die beiden Geschlechter der Hsp60+/- Mäuse gegenteilige Phänotypen im Bezug auf Körpergewicht und Körperzusammensetzung aufwiesen, zeigen beide Anzeichen eines Schutzes vor Hochfettdiät-induzierter Insulinresistenz. KW - Obesity KW - Adipose tissue KW - Insulin resistance KW - Mitochondria KW - Fettgewebe KW - Insulinresistenz KW - Mitochondrien KW - Adipositas Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-509294 ER -